WO2023085242A1 - 抗ウイルス剤 - Google Patents

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WO2023085242A1
WO2023085242A1 PCT/JP2022/041473 JP2022041473W WO2023085242A1 WO 2023085242 A1 WO2023085242 A1 WO 2023085242A1 JP 2022041473 W JP2022041473 W JP 2022041473W WO 2023085242 A1 WO2023085242 A1 WO 2023085242A1
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WO
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group
thiouridine
compound represented
carbon atoms
strain
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PCT/JP2022/041473
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English (en)
French (fr)
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勝実 前仲
彰 松田
洋文 澤
靖子 大場
道仁 佐々木
健太朗 上村
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国立大学法人北海道大学
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7068—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C07H19/067—Pyrimidine radicals with ribosyl as the saccharide radical

Definitions

  • the present invention relates to an antiviral agent that is effective as a therapeutic agent for infectious diseases caused by enveloped viruses whose genes are positive-strand single-stranded RNA, such as coronaviruses and flaviviruses.
  • a coronavirus is an enveloped virus whose gene is a positive single-stranded RNA.
  • Coronaviruses that infect humans include, in addition to viruses that cause common colds, those that cause acute respiratory syndrome.
  • SARS-CoV-1 which is the cause of the severe acute respiratory syndrome (SARS) epidemic in 2003
  • MERS-CoV which is the cause of the Middle East respiratory syndrome (MERS) epidemic in 2013, from 2019
  • SARS-CoV-2 which is the cause of the pandemic novel coronavirus infection COVID-19.
  • there are still few therapeutic drugs for COVID-19 and the development of more effective therapeutic drugs is required.
  • Remdesivir is a therapeutic drug for COVID-19.
  • Remdesivir (GS-5734) is a monophosphoramidate prodrug of GS-441524, an antiviral agent consisting of a nucleic acid compound developed as a treatment for Ebola hemorrhagic fever and Marburg virus infection, and has antiviral properties against single-stranded RNA viruses. Has antiviral activity.
  • GS-441524 is also expected to have a therapeutic effect against COVID-19 (Non-Patent Document 1).
  • the purpose of the present invention is to provide an antiviral agent that is effective as a therapeutic drug for viral infectious diseases including COVID-19.
  • the present inventors used a compound library with a nucleic acid compound as a core possessed by the Research and Education Center for Pharmaceutical Sciences, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Hokkaido University, to create an enveloped virus whose gene is a positive-strand single-stranded RNA.
  • the present invention was completed by screening compounds having antiviral activity against one type of dengue virus and selecting compounds with high antiviral activity.
  • the present invention provides the following antiviral agents and the like. [1] the following general formula (A-1) or (A-2)
  • R 11 is a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or an aryl group;
  • R 12 and R 13 are each independently is an alkyl group or an aryl group having 1 to 6 carbon atoms;
  • R 14 and R 15 each independently represent an alkyl group having 1 to 30 carbon atoms which may be substituted with a phenyl group (when the alkyl group has 2 or more carbon atoms, an ether bond is formed between the carbon atoms or an aryl group
  • the compound represented by the general formula (A-1) or (A-2) is any of the following formulas (A1), (A5), (A6), (A7), and (A8)
  • the compound represented by the general formula (A-1) or (A-2) is a compound represented by any of the following formulas (A2) to (A4): viral agent.
  • a pharmaceutical composition comprising the antiviral agent according to any one of [1] to [5] as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition of [6] above which is used for the treatment or prevention of an infectious disease caused by an enveloped virus whose gene is a positive-strand single-stranded RNA.
  • the antiviral agent according to the present invention contains, as an active ingredient, a nucleic acid compound that has high antiviral activity against enveloped viruses whose genes are positive-strand single-stranded RNA, such as coronaviruses and flaviviruses.
  • the antiviral agent is suitable as an in vivo or ex vivo antiviral agent, and the pharmaceutical composition containing the viral agent as an active ingredient is characterized by an enveloped virus whose gene is a positive-strand single-stranded RNA. It is very useful as a pharmaceutical composition for treating or preventing infectious diseases.
  • FIG. 2 is a diagram showing the measurement results of relative viral RNA amounts when cells infected with each strain of SARS-CoV-2 were treated with 2-thiouridine in Example 2.
  • FIG. 2 is a diagram showing the measurement results of relative viral RNA amounts when cells infected with SARS-CoV-2 Omicron strain were treated with 2-thiouridine in Example 2.
  • FIG. 2 is a diagram showing the measurement results of relative viral RNA amounts when cells infected with SARS-CoV-1 were treated with 2-thiouridine in Example 2.
  • FIG. 2 is a diagram showing the measurement results of relative viral RNA amounts when cells infected with each strain of HCoV were treated with 2-thiouridine in Example 2.
  • FIG. 2 is a diagram showing the measurement results of relative viral RNA amounts when DENV2-infected cells were treated with 2-thiouridine in Example 2.
  • FIG. 2 is a diagram showing the measurement results of relative viral RNA amounts when ZIKV-infected cells were treated with 2-thiouridine in Example 2.
  • FIG. 2 is a diagram showing the measurement results of relative viral RNA amounts when YFV-infected cells were treated with 2-thiouridine in Example 2.
  • FIG. 2 is a diagram showing the measurement results of relative viral RNA amounts when JEV-infected cells were treated with 2-thiouridine in Example 2.
  • FIG. 2 is a diagram showing the measurement results of relative viral RNA amounts when WNV-infected cells were treated with 2-thiouridine in Example 2.
  • FIG. 2 is a diagram showing the measurement results of relative viral RNA amounts when CHIKV-infected cells were treated with 2-thiouridine in Example 2.
  • FIG. 2 is a diagram showing changes over time in the survival rate (%) in each group in which 2-thiouridine was administered to AG129 mice infected with AG129 mouse-adapted DENV2 in Example 3.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of measurement of serum viral RNA levels 3 days after infection in each group in which 2-thiouridine was administered to AG129 mice infected with AG129 mouse-adapted DENV2 in Example 3.
  • virus titers log 10 (TCID 50 )/mL
  • the amount of viral RNA in the lungs log 10 ( It is a figure showing the measurement results of virus copy number)/mL).
  • FIG. 2 is a diagram showing changes over time in the survival rate (%) of a group to which 2-thiouridine was intravenously administered.
  • the amount of viral RNA in the lungs of mice infected with SARS-CoV-2 MA-P10 strain and orally administered 2-thiouridine after virus infection is a diagram showing the measurement results.
  • C yz (where y and z are positive integers satisfying y ⁇ z) means that the number of carbon atoms is y or more and z or less.
  • the antiviral agent according to the present invention comprises a compound represented by the following general formula (A-1) or (A-2), a salt of the compound, or a solvate thereof.
  • R 11 is a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms (C 1-6 alkyl group) or an aryl group.
  • R 11 is a C 1-6 alkyl group
  • the C 1-6 alkyl group may be linear or branched.
  • Examples of C 1-6 alkyl groups include methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, isopentyl, neopentyl, tert- A pentyl group, a hexyl group, and the like can be mentioned.
  • R 11 is a C 1-6 alkyl group
  • the C 1-6 alkyl group may have a substituent.
  • a C 1-6 alkyl group having a substituent means that one or more, preferably 1 to 3, of the hydrogen atoms bonded to the carbon atoms of the C 1-6 alkyl group are other functional groups is a group substituted with
  • the substituents may be the same or different. Examples of the substituent include an aryl group and a heteroaryl group.
  • R 11 is an aryl group
  • the aryl group includes a phenyl group, a naphthyl group, an anthryl group, a 9-fluorenyl group and the like, and a phenyl group is particularly preferred.
  • R 11 When R 11 is an aryl group, the aryl group may have a substituent.
  • a substituted aryl group is a group in which one or more, preferably 1 to 3, of the hydrogen atoms bonded to the carbon atoms of the aryl group are substituted with other functional groups. .
  • the substituents When having two or more substituents, the substituents may be the same or different. Examples of the substituent include a C 1-6 alkyl group, a C 1-6 alkoxy group, and the like. A C 1-6 alkoxy group may be straight or branched. Examples of C 1-6 alkoxy groups include methoxy, ethoxy, propoxy, butoxy, tert-butoxy, pentyloxy, hexyloxy and the like.
  • R 11 is the same as R 11 above.
  • R 1 and R 2 may be the same group or different groups.
  • R 3 is —OR 12 , —SR 13 , or a guanidino group.
  • R 12 and R 13 are C 1-6 alkyl groups or aryl groups.
  • R 12 and R 13 are C 1-6 alkyl groups, the same groups as those for R 11 can be used as the C 1-6 alkyl groups.
  • R 12 and R 13 are aryl groups, the same groups as those for R 11 can be used as the aryl groups.
  • R 14 and R 15 are each independently an alkyl group having 1 to 30 carbon atoms (C 1-30 alkyl group) or an aryl group.
  • R 14 and R 15 are aryl groups, the same groups as those for R 11 can be used as the aryl groups.
  • R 14 and R 15 are C 1-30 alkyl groups
  • the alkyl groups may be linear or branched.
  • Examples of C 1-30 alkyl groups include methyl group, ethyl group , propyl group, isopropyl group, butyl group, isobutyl group, sec-butyl group, tert-butyl group, pentyl group, isopentyl group, neopentyl group, tert-pentyl group, hexyl group, isohexyl group, neohexyl group, heptyl group, octyl group, nonyl group, decyl group, undecyl group, dodecyl group, tridecyl group, tetradecyl group, pentadecyl group, hexadecyl group, heptadecyl group, octadecyl group, nonadecyl group, e
  • R 14 and R 15 are C 1-30 alkyl groups
  • the alkyl groups may have one or more hydrogen atoms bonded to carbon atoms optionally substituted with phenyl groups.
  • R 14 and R 15 are preferably a C 1-30 alkyl group not substituted with a phenyl group or a C 1-30 alkyl group in which one hydrogen atom is substituted with a phenyl group.
  • R 14 and R 15 have 2 or more carbon atoms, that is, when they are alkyl groups having 2 to 30 carbon atoms (C 2-30 alkyl groups), the alkyl groups are ether-bonded oxygen atoms between carbon atoms. It may have atoms.
  • etheric oxygen atom means an oxygen atom that connects carbon atoms, and does not include an oxygen atom in which oxygen atoms are connected in series.
  • R 5 and R 6 are each independently a hydrogen atom or —CO—R 16 .
  • R 16 is a C 1-6 alkyl group or an aryl group. Examples of the C 1-6 alkyl group and aryl group include the same groups as those listed for R 11 .
  • R 4 to R 6 and R 11 in general formulas (1) to (9) are the same as R 4 to R 6 and R 11 in general formula (A-1) or (A-2).
  • the active ingredient of the antiviral agent according to the present invention is also preferably a derivative of the compound represented by general formula (A-1) or (A-2).
  • Derivatives of the compound represented by general formula (A-1) or (A-2) are represented by general formula (A-1) or (A-2) by undergoing enzymatic treatment or the like in vivo. Derivatives in which the compound is produced are preferred.
  • 2-thiouridine (CAS number: 20235-78-3) or a derivative thereof is particularly preferable.
  • Derivatives of 2-thiouridine are preferably derivatives from which 2-thiouridine is produced by enzymatic treatment or the like in vivo.
  • the derivative of 2-thiouridine that can be used as an antiviral agent is more preferably, for example, a derivative obtained by prodrugation, which is performed for pharmaceuticals containing a nucleic acid compound as an active ingredient.
  • a hydroxy group linked directly to a furan ring or via a methylene group is an acyl group, a phosphoric acid derivative substituted with a phosphoric acid group (PO 4 ⁇ ), or the hydroxy group monophosphoramidite derivatives in which is substituted with a monophosphoramidite group, monophosphorothioate derivatives in which the hydroxy group is substituted with a monophosphorothioate group, and the like.
  • compounds (A5) to (A8) are examples of derivatives obtained by acylating the hydroxy group of 2-thiouridine (compound (A1)).
  • the compound represented by general formula (A-1) or (A-2) may form a salt, and an acid or base that forms the salt Examples thereof include mineral acids such as hydrochloric acid and sulfuric acid; organic acids such as acetic acid, succinic acid and citric acid; alkali metals such as sodium and potassium; alkaline earth metals such as calcium and magnesium.
  • the compound represented by formula (A-1) or (A-2) or a salt thereof may be in the form of a solvate such as a hydrate.
  • a compound represented by the general formula (A-1) or (A-2), a salt of the compound, or a solvate thereof (hereinafter collectively referred to as a "nucleic acid compound according to the present invention”) ) has an antiviral effect against viruses, particularly enveloped viruses whose genes are plus-strand single-stranded RNA.
  • enveloped viruses whose genes are positive-strand single-stranded RNA include coronaviruses, flaviviruses, togaviruses, and the like.
  • Coronaviruses for which the nucleic acid compound according to the present invention exhibits antiviral activity include SARS-CoV-1, MERS-CoV, SARS-CoV-2, and the like.
  • Flaviviruses for which the nucleic acid compound according to the present invention exhibits antiviral activity include dengue virus (DENV) that causes dengue fever (dengue hemorrhagic fever), Zika virus (ZIKV) that causes Zika fever (Zika virus infection), Examples include yellow fever virus (YFV) that causes yellow fever, West Nile virus (WNV) that causes West Nile fever (West Nile encephalitis), and Japanese encephalitis virus (JEV) that causes Japanese encephalitis.
  • DEV dengue virus
  • ZIKV Zika virus
  • YFV yellow fever virus
  • WNV West Nile virus
  • JEV Japanese encephalitis virus
  • DENV there are four types of DENV from type 1 to type 4 (DENV1, DENV2, DENV3, and DENV4).
  • Togaviruses for which the nucleic acid compound according to the present invention exhibits antiviral activity include Chikungunya virus (CHIKV), which is the cause of Chikungunya fever.
  • the nucleic acid compound according to the present invention is useful as an active ingredient of a pharmaceutical composition used for treating or preventing viral infections, particularly viral infections caused by enveloped viruses whose genes are plus-strand single-stranded RNA.
  • the pharmaceutical composition containing the nucleic acid compound according to the present invention as an active ingredient is preferably used for treating or preventing infectious diseases caused by coronaviruses, flaviviruses, or togaviruses. 19. Those used for the treatment or prevention of dengue fever, Zika fever, yellow fever, West Nile fever, Japanese encephalitis and chikungunya fever are more preferable.
  • the nucleic acid compound according to the present invention is a low-molecular-weight compound, it has no problems such as immunogenicity.
  • it can be administered orally, and the route of administration is not so limited, so it is particularly useful as an active ingredient of medicines for mammals including humans.
  • nucleic acid compounds according to the present invention When one or more nucleic acid compounds according to the present invention are contained in a pharmaceutical composition, they are mixed with a pharmaceutically acceptable carrier, if necessary, and various dosage forms are adopted depending on the purpose of prevention or treatment. It is possible. Examples of such forms include oral agents, injections, suppositories, ointments, and patches, with oral agents being preferred. Each of these dosage forms can be produced by a conventional formulation method known to those skilled in the art.
  • Pharmaceutically acceptable carriers include excipients, binders, disintegrants, lubricants, and coloring agents in solid preparations; solvents, solubilizers, suspending agents, tonicity agents, buffers in liquid preparations and analgesics, etc. are used.
  • Formulation additives such as preservatives, antioxidants, colorants, sweeteners, stabilizers, etc. may also be used as necessary.
  • the nucleic acid compound of the present invention is added with an excipient and, if necessary, a binder, a disintegrant, a lubricant, a coloring agent, a flavoring agent, etc. Tablets, coated tablets, granules, powders, capsules, etc. can be produced according to the method.
  • a flavoring agent When preparing an oral liquid preparation, a flavoring agent, a buffering agent, a stabilizer, a flavoring agent, etc. are added to the nucleic acid compound according to the present invention, and oral liquid preparations, syrups, elixirs, etc. are produced by conventional methods. be able to.
  • the nucleic acid compound according to the present invention is added with a pH adjusting agent, a buffering agent, a stabilizer, a tonicity agent, a local anesthetic, etc., and injected subcutaneously, intramuscularly, or intravenously by a conventional method. Injections for use can be manufactured.
  • the nucleic acid compound according to the present invention can be prepared by conventional methods after adding pharmaceutical carriers known in the art, such as polyethylene glycol, lanolin, cocoa butter, fatty acid triglycerides, and the like. .
  • pharmaceutical carriers known in the art, such as polyethylene glycol, lanolin, cocoa butter, fatty acid triglycerides, and the like.
  • bases, stabilizers, wetting agents, preservatives and the like that are commonly used for the nucleic acid compound of the present invention are blended, if necessary, and mixed and formulated by conventional methods.
  • the above-mentioned ointments, creams, gels, pastes, etc. may be applied to a conventional support by a conventional method.
  • the content of the nucleic acid compound according to the present invention in each of the preparations described above varies depending on the patient's condition, dosage form, etc., but is generally about 0.001 to 1000 mg for oral preparations and about 0.001 to 1000 mg for injections. 500 mg, about 0.01 to 1000 mg for suppositories.
  • the daily dose of these formulations varies depending on the patient's symptoms, body weight, age, sex, etc., and cannot be determined indiscriminately. 0.01 to 1000 mg is preferable, and it is preferable to administer this amount once a day or in 2 to 3 divided doses.
  • the animal to which the antiviral agent and pharmaceutical composition containing the nucleic acid compound of the present invention as an active ingredient is administered is not particularly limited, and may be a human or a non-human animal.
  • Non-human animals include mammals such as cows, pigs, horses, sheep, goats, monkeys, dogs, cats, rabbits, mice, rats, hamsters and guinea pigs, and birds such as chickens, quails and ducks.
  • SARS-CoV-2 includes hCoV-19/Japan/TY/WK-521/2020 strain (SARS-CoV-2 Wuhan strain), hCoV-19/Japan/QK002 / 2020 strain (SARS-CoV-2 alpha strain), hCoV-19 / Japan / TY8-612 / 2021 strain (SARS-CoV-2 beta strain), hCoV-19 / Japan / TY7-501 / 2021 strain (SARS- CoV-2 gamma strain), hCoV-19/Japan/TY11-927/2021 strain (SARS-CoV-2 delta strain), and hCoV-19/Japan/TY38-873/2021 strain (SARS-CoV-2 Omicron ( BA.1) strain) was used.
  • SARS-CoV-1 the Hanoi strain was used.
  • SARS-CoV-2 was provided by the National Institute of Infectious Diseases, and SARS-CoV-1 was provided by Nagasaki University.
  • coronaviruses that routinely infect humans Human Coronavirus: HCoV
  • alphacoronavirus HCoV-229E strain ATCC: VR-740
  • betacoronavirus HCoV-OC43 strain ATCC: VR-1558
  • DENV1 to DENV4 are D1/hu/PHL/10-07 strain, D2/hu/INDIA/09-74 strain, and D3/hu/Thailand/00-40 strain, respectively.
  • D4/hu/Solomon/08-11 strain was used.
  • MR766 strain was used for ZIKV.
  • YFV used strain 17D-204.
  • NY99 strain was used as WNV.
  • Beijing-1 strain was used as JEV.
  • YFV was provided by Nagasaki University, and other virus strains were provided by the National Institute of Infectious Diseases.
  • CHIKV used the SL10571 strain.
  • the virus strain used was provided by the National Institute of Infectious Diseases.
  • ⁇ Cultured cells> human fetal lung-derived cultured cell line MRC5 cells, Syrian hamster kidney-derived cultured cell line BHK-21 cells, African green monkey kidney-derived cultured cell line VeroE6 cells, genetically modified
  • the ACE2 gene was introduced into the cultured cell line VeroE6/TMPRSS2 cells, in which TMPRSS2 was expressed in VeroE6 cells, and the human embryonic kidney-derived cultured cell line HEK293T cells, and 293T/ACE2 in which ACE2 was constitutively expressed. cells were used.
  • 2% FBS/MEM was used as a culture medium for all cells.
  • 2% FBS/MEM was prepared by adding 2% FBS (fetal bovine serum: manufactured by Gibco) and L-glutamine (manufactured by Wako) to MEM (Minimum Essential Medium: manufactured by Nissui).
  • Example 1 Using a compound library with a nucleic acid compound as the mother nucleus held by the Research and Education Center for Pharmaceutical Sciences, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Hokkaido University, as a test sample, it has the effect of suppressing cell death of flavivirus-infected cells. Compounds were screened. DENV2 was used as flavivirus. As a result, HUP0797 (2-thiouridine) was found to have antiviral activity among the compounds contained in the compound library used.
  • MTT assay was performed by infecting BHK-21 cells with eight flaviviruses (DENV1, DENV2, DENV3, DENV4, ZIKV, YFV, JEV, WNV) to determine antiviral activity, i.e., cells by viral infection. The effect of suppressing death was examined.
  • MTT solution (3-(4,5-dimethyl-2-thiazol)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (manufactured by Nacalai Tesque) dissolved in PBS to 5 ⁇ g/mL) was added to each well at 30 ⁇ L and incubated for 2 hours in a CO 2 incubator. After that, remove 150 ⁇ L of the supernatant from the plate without sucking the cells, and add a cell lysis solution (virus inactivation solution: 500 mL isopropanol, 50 mL Triton X-100, 4 mL hydrochloric acid (12N) 150 ⁇ L of each well was added to each well and mixed with a plate mixer. After that, the 96-well plate was measured for absorbance at two wavelengths of 570 nm/630 nm using an absorbance meter.
  • OD absorbance conc.: drug concentration
  • OD (cell control) Average absorbance of control wells
  • OD (virus control) mean absorbance of virus control wells
  • the EC50 was calculated from the two points A-High (High OD, High conc.) and B-Low (Low OD, Low conc.) sandwiching the 50% OD value on the absorbance and drug concentration curves.
  • MRC5 cells were infected with HCoV-229E strain or HCoV-OC43 strain, BHK-21 cells were infected with CHIKV, and the antiviral activity was examined in the same manner as described above. Table 2 shows the results.
  • 2-thiouridine was confirmed to have antiviral activity against both togavirus CHIKV and coronaviruses HCoV-229E strain and HCoV-OC43 strain. That is, 2-thiouridine had a high antiviral activity against enveloped viruses whose genes consist of a wide range of plus-strand single-stranded RNAs.
  • Example 2 In Example 1, 2-thiouridine, whose antiviral activity was confirmed, was examined for its inhibitory effect on viral RNA replication against coronavirus, flavivirus, and togavirus.
  • SARS-CoV-2 Wuhan strain SARS-CoV-2 alpha strain, SARS-CoV-2 beta strain, SARS-CoV-2 gamma strain, SARS-CoV-2 delta strain, SARS-CoV-2 Omicron strain, and SARS - CoV-1 Hanoi strain infected VeroE6/TMPRSS2 cells.
  • HCoV-229E strain was infected into MRC5 cells.
  • HCoV-OC43 strains, DENV2, ZIKV, YFV, JEV, WNV and CHIKV were infected into VeroE6 cells.
  • a test sample that had been diluted to an appropriate concentration with culture medium was added so as to prepare a 2-fold serial dilution series (50 or 150 ⁇ L/well), followed by a plate mixer.
  • 50 or 150 ⁇ L/well of a virus solution previously diluted with a culture medium to an appropriate concentration was dispensed onto the plate containing the test sample.
  • the plate was then mixed with a plate mixer and incubated in a CO 2 incubator (37°C, 5% CO 2 ) for 24-48 hours.
  • RNA extraction and purification From each well of the plate after culturing, the culture supernatant was removed and an RNA extraction kit (product name: PureLink Pro 96 total RNA Purification Kit or PureLink RNA Mini Kit, Thermo Fisher Scientific) ) was added to each well to collect the cell lysate. After that, total RNA was purified according to the protocol attached to the kit.
  • RNA extraction kit product name: PureLink Pro 96 total RNA Purification Kit or PureLink RNA Mini Kit, Thermo Fisher Scientific
  • the amount of viral RNA in cells to which 2-thiouridine was not added was set to 1.0, and the relative amount of viral RNA in cells treated with 2-thiouridine at each concentration was calculated.
  • the ACTB gene was used as an endogenous control. Measurement results of relative viral RNA amounts in each infected cell are shown in FIGS. 1A to 1D.
  • RNA replication inhibitory effect on other viruses DENV2, ZIKV, YFV, JEV, WNV, and CHIKV were used as the viruses used for infection, and VeroE6 cells were used as the cells to be infected.
  • the inhibitory effect of 2-thiouridine on viral RNA replication for each virus was examined in the same manner as described above, except that viral RNA was extracted from cells 24 hours after virus infection. Measurement results of relative viral RNA amounts in each infected cell are shown in FIGS. 1E to 1J.
  • Example 3 Mice infected with flaviviruses were treated with 2-thiouridine to examine whether therapeutic effects could be obtained.
  • AG129 mice deficient in interferon- ⁇ receptor and interferon- ⁇ receptor, and a virus (AG129 mouse-adapted DENV2) adapted by passing DENV2 in AG129 mice were used.
  • 2-Thiouridine is a 5% DMSO/0.5% MC aqueous solution (2-thiouridine (final concentration 5%) dissolved in 100% dimethyl sulfoxide (DMSO) dissolved in 0.5% methylcellulose). Mice were administered orally as a diluted solution in
  • AG129 mice (7-week-old females) were infected by intraperitoneal injection of 0.1 mL/mouse of AG129 mouse-conditioned DENV2 solution (1 ⁇ 10 2 PFU/mouse).
  • 2-thiouridine was orally administered immediately after infection.
  • mice were observed every day after infection, and individuals that lost 80% of their initial body weight were considered dead. The survival rate (%) results for each group are shown in FIG. 2A. In the Vehicle administration group, all mice died within 10 days after virus infection, whereas in the 50 mg/kg administration group, all mice survived until 12 days after virus infection. All mice in the group survived up to 15 days after virus infection.
  • an infection experiment was conducted by adding 5 animals each to a 50 mg/kg administration group, a 150 mg/kg administration group, and a vehicle administration group, and similarly inoculating AG129 mice with conditioned DENV2. Mice were observed daily after infection and individuals below 70% of initial body weight were considered dead. The mouse individuals shown in FIG. 2A were also reanalyzed as individuals below 70% of the initial body weight as the criteria for considering lethal. Table 3 shows the results of the survival rate (%) of each group obtained by adding newly obtained data to the results of FIG. 2A.
  • 2-thiouridine has a lethality-suppressing effect on dengue virus-infected animals and can be used as an active ingredient in pharmaceuticals for the treatment or prevention of dengue virus infections.
  • Example 4 A structural analogue of 2-thiouridine was synthesized and its antiviral activity against SARS-CoV-2 Wuhan strain was measured.
  • Antiviral activity was measured in the same manner as in Example 1.
  • Table 4 shows the measurement results. Both compounds, like 2-thiouridine, had antiviral activity against SARS-CoV-2 Wuhan strain. Among them, compounds (A2), (A4), and (A6) had a sufficient concentration difference between EC50 and CC50 , and were particularly promising as antiviral agents.
  • Example 5 Using mouse models infected with mouse-adapted strains of SARS-CoV-2 (derived from strain MA-P10 and WK-521), the preventive and therapeutic effects of 2-thiouridine on viral infection were examined. 2-Thiouridine was administered intravenously to mice as a saline diluted solution. In addition, as a solution diluted with 5% DMSO/0.5% MC aqueous solution (aqueous solution in which 2-thiouridine (final concentration 5%) dissolved in 100% DMSO was dissolved in 0.5% methylcellulose), mouse was orally administered to
  • each mouse was intranasally inoculated with the MA-P10 strain (2 ⁇ 10 2 TCID 50 /mouse), and the day after infection, the lungs of each individual were collected and the virus titer in the lungs was measured. Titers and viral RNA levels were determined.
  • the measurement results (mean ⁇ SD) of the viral titer (log 10 (TCID 50 )/mL) in the lungs of each group are shown in FIG.
  • the measurement results (mean ⁇ SD) of are shown in FIG. 3B, respectively.
  • mice given a single intravenous dose of 2-thiouridine 2 hours before virus infection with SARS-CoV-2 showed a dose-dependent decrease in pulmonary viral load. rice field. From the results, it was confirmed that 2-thiouridine has a preventive effect against SARS-CoV-2 virus infection, that is, 2-thiouridine can be expected as a preventive drug against COVID-19.
  • Fig. 4 shows the measurement results of the survival rate.
  • the survival rate was 80% 10 days after infection, whereas the survival rate of the vehicle-administered mice was 0% on day 8 of infection. That is, it was confirmed that the lethal effect of SARS-CoV-2 was suppressed by continuous administration of 2-thiouridine.
  • mice orally administered 2-thiouridine after viral infection with SARS-CoV-2 had significantly reduced intrapulmonary viral titers than mice that did not receive 2-thiouridine.
  • 2-thiouridine can reduce the amount of SARS-CoV-2 virus in the body even when administered after infection. Therefore, 2-thiouridine is expected as a therapeutic agent for SARS-CoV-2 viral infection. It became clear that it was possible.

Abstract

本発明は、下記一般式（Ａ－１）又は（Ａ－２）［式中、Ｒ１はＯ、Ｓ、Ｓｅ、又は＝Ｎ－ＯＲ１１であり；Ｒ２はＯ、Ｓ、Ｓｅ、又は＝Ｎ－ＯＲ１１であり；Ｒ３は－Ｏ－Ｒ１２、－Ｓ－Ｒ１３又はグアニジノ基であり；Ｒ１１はＨ、アルキル基又はアリール基であり；Ｒ１２及びＲ１３はそれぞれ独立して、アルキル基又はアリール基であり；Ｒ４はＨ、－ＣＯ－Ｒ１４、又は－Ｏ－Ｐ（ＯＨ）（＝Ｏ）－Ｏ－Ｒ１５であり；Ｒ１４及びＲ１５はそれぞれ独立して、アルキル基又はアリール基であり；Ｒ５及びＲ６はそれぞれ独立して、Ｈ又は－ＣＯ－Ｒ１６であり；Ｒ１６は、炭素数１～６のアルキル基又はアリール基である。］で表される化合物、前記化合物の塩、又はこれらの溶媒和物からなる、抗ウイルス剤を提供する。

Description

抗ウイルス剤
　本発明は、コロナウイルスやフラビウイルス等のプラス鎖一本鎖ＲＮＡを遺伝子とするエンベロープウイルスによる感染症に対する治療剤として有効な抗ウイルス剤に関する。
　コロナウイルスは、プラス鎖一本鎖ＲＮＡを遺伝子とするエンベロープウイルスである。ヒトに感染するコロナウイルスとしては、一般的な風邪の原因ウイルスの他に、急性呼吸器症候群の原因となるものがある。例えば、２００３年に大流行した重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）の原因であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、２０１３年に大流行した中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）の原因であるＭＥＲＳ－ＣｏＶ、２０１９年から大流行した新型コロナウイルス感染症ＣＯＶＩＤ－１９の原因であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２がある。特に、ＣＯＶＩＤ－１９は未だ治療薬が少なく、より有効な治療薬の開発が求められている。
　ＣＯＶＩＤ－１９の治療薬として、レムデシビルがある。レムデシビル（ＧＳ－５７３４）はＧＳ－４４１５２４のモノホスホルアミデートプロドラッグであり、エボラ出血熱及びマールブルグウイルス感染症の治療薬として開発された核酸化合物からなる抗ウイルス薬であり、一本鎖ＲＮＡウイルスに対する抗ウイルス活性がある。ＧＳ－４４１５２４も、ＣＯＶＩＤ－１９に対する治療効果が期待されている（非特許文献１）。
Yan and Muller, ACS Medicinal Chemistry Letters, 2020, vol.11, p.1361-1366.
　本発明は、ＣＯＶＩＤ－１９を始めとするウイルス感染症疾患の治療薬として有効な抗ウイルス剤を提供することを目的とする。
　本発明者らは、国立大学法人北海道大学薬学研究院創薬科学研究教育センターが保有する核酸化合物を母核とする化合物ライブラリーを用いて、プラス鎖一本鎖ＲＮＡを遺伝子とするエンベロープウイルスの１種であるデングウイルスに対する抗ウイルス活性を有する化合物をスクリーニングし、抗ウイルス活性の高い化合物を選抜することにより、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、以下の、抗ウイルス剤等を提供するものである。
［１］　下記一般式（Ａ－１）又は（Ａ－２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
［式中、Ｒ１は、酸素原子、硫黄原子、セレン原子、又は＝Ｎ－ＯＲ１１であり；Ｒ２は、酸素原子、硫黄原子、セレン原子、又は＝Ｎ－ＯＲ１１であり；Ｒ３は、－Ｏ－Ｒ１２、－Ｓ－Ｒ１３、又はグアニジノ基であり；Ｒ１１は、水素原子、炭素数１～６のアルキル基又はアリール基であり；Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ独立して、炭素数１～６のアルキル基又はアリール基であり；Ｒ４は、水素原子、－ＣＯ－Ｒ１４、又は－Ｏ－Ｐ（ＯＨ）（＝Ｏ）－Ｏ－Ｒ１５であり；Ｒ１４及びＲ１５は、それぞれ独立して、フェニル基で置換されていてもよい炭素数１～３０のアルキル基（当該アルキル基は、炭素原子が２以上の場合に、炭素原子間にエーテル結合性の酸素原子を有していてもよい）又はアリール基であり；Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立して、水素原子又は－ＣＯ－Ｒ１６であり；Ｒ１６は、炭素数１～６のアルキル基又はアリール基である。］
で表される化合物、前記化合物の塩、又はこれらの溶媒和物からなる、抗ウイルス剤。
［２］　前記一般式（Ａ－１）又は（Ａ－２）で表される化合物が、下記一般式（１）～（９）のいずれかで表される化合物である、前記［１］の抗ウイルス剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
［３］　前記一般式（Ａ－１）又は（Ａ－２）で表される化合物が、下記式（Ａ１）、（Ａ５）、（Ａ６）、（Ａ７）、及び（Ａ８）のいずれかで表される化合物である、前記［１］の抗ウイルス剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
［４］　前記一般式（Ａ－１）又は（Ａ－２）で表される化合物が、下記式（Ａ２）～（Ａ４）のいずれかで表される化合物である、前記［１］の抗ウイルス剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
［５］　プラス鎖一本鎖ＲＮＡを遺伝子とするエンベロープウイルスに対する抗ウイルス作用を有する、前記［１］～［４］のいずれかの抗ウイルス剤。
［６］　前記［１］～［５］のいずれかの抗ウイルス剤を有効成分とする、医薬用組成物。
［７］　プラス鎖一本鎖ＲＮＡを遺伝子とするエンベロープウイルスによる感染症の治療又は予防に用いられる、前記［６］の医薬用組成物。
［８］　コロナウイルス、フラビウイルス、又はトガウイルスによる感染症の治療に用いられる、前記［６］の医薬用組成物。
［９］　ＣＯＶＩＤ－１９の治療又は予防に用いられる、前記［６］の医薬用組成物。
［１０］下記式（Ａ４）～（Ａ７）のいずれかで表される化合物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　本発明に係る抗ウイルス剤は、コロナウイルスやフラビウイルスのようなプラス鎖一本鎖ＲＮＡを遺伝子とするエンベロープウイルスに対して高い抗ウイルス活性を有する核酸化合物を有効成分とする。このため、当該抗ウイルス剤は、ｉｎ　ｖｉｖｏ又はｅｘ　ｖｉｖｏにおける抗ウイルス剤として好適であり、当該ウイルス剤を有効成分とする医薬用組成物は、プラス鎖一本鎖ＲＮＡを遺伝子とするエンベロープウイルスによる感染症の治療又は予防のために用いられる医薬用組成物として非常に有用である。
実施例２において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の各株を感染させた細胞を２－チオウリジン処理した場合の相対ウイルスＲＮＡ量の測定結果を示した図である。 実施例２において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オミクロン株を感染させた細胞を２－チオウリジン処理した場合の相対ウイルスＲＮＡ量の測定結果を示した図である。 実施例２において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１を感染させた細胞を２－チオウリジン処理した場合の相対ウイルスＲＮＡ量の測定結果を示した図である。 実施例２において、ＨＣｏＶの各株を感染させた細胞を２－チオウリジン処理した場合の相対ウイルスＲＮＡ量の測定結果を示した図である。 実施例２において、ＤＥＮＶ２を感染させた細胞を２－チオウリジン処理した場合の相対ウイルスＲＮＡ量の測定結果を示した図である。 実施例２において、ＺＩＫＶを感染させた細胞を２－チオウリジン処理した場合の相対ウイルスＲＮＡ量の測定結果を示した図である。 実施例２において、ＹＦＶを感染させた細胞を２－チオウリジン処理した場合の相対ウイルスＲＮＡ量の測定結果を示した図である。 実施例２において、ＪＥＶを感染させた細胞を２－チオウリジン処理した場合の相対ウイルスＲＮＡ量の測定結果を示した図である。 実施例２において、ＷＮＶを感染させた細胞を２－チオウリジン処理した場合の相対ウイルスＲＮＡ量の測定結果を示した図である。 実施例２において、ＣＨＩＫＶを感染させた細胞を２－チオウリジン処理した場合の相対ウイルスＲＮＡ量の測定結果を示した図である。 実施例３において、ＡＧ１２９マウス馴化ＤＥＮＶ２に感染させたＡＧ１２９マウスに２－チオウリジンを投与した各群の生存率（％）の経時的変化を示した図である。 実施例３において、ＡＧ１２９マウス馴化ＤＥＮＶ２に感染させたＡＧ１２９マウスに２－チオウリジンを投与した各群の、感染３日後における血清中ウイルスＲＮＡ量の測定結果を示した図である。 実施例５において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＭＡ－Ｐ１０株に感染させたマウスであって、２－チオウリジンをウイルス感染の２時間前に投与した群の肺内のウイルス力価（ｌｏｇ１０（ＴＣＩＤ５０）／ｍＬ）の測定結果を示した図である。 実施例５において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＭＡ－Ｐ１０株に感染させたマウスであって、ウイルス感染の２時間前に２－チオウリジンを静脈内投与した群の肺内のウイルスＲＮＡ量（ｌｏｇ１０（ウイルスコピー数）／ｍＬ）の測定結果を示した図である。 実施例５において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＭＡ－Ｐ１０株に感染させたマウスであって、ウイルス感染の２時間前とウイルス感染翌日から感染４日後までの期間に１日１回の合計５日間、２－チオウリジンを静脈内投与した群の生存率（％）の経時的変化を示した図である。 実施例５において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＭＡ－Ｐ１０株に感染させたマウスであって、ウイルス感染後に２－チオウリジンを経口投与した群の肺内のウイルスＲＮＡ量（ｌｏｇ１０（ウイルスコピー数）／ｍＬ）の測定結果を示した図である。
　本発明及び本願明細書において、「Ｃｙ－ｚ（ｙ及びｚは、ｙ＜ｚを充たす正の整数である。）」は、炭素数がｙ以上ｚ以下であることを意味する。
　本発明に係る抗ウイルス剤は、下記一般式（Ａ－１）又は（Ａ－２）で表される化合物、前記化合物の塩、又はこれらの溶媒和物からなる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　一般式（Ａ－１）又は（Ａ－２）中、Ｒ１は、酸素原子、硫黄原子、セレン原子、又は＝Ｎ－ＯＲ１１である。Ｒ１１は、水素原子、炭素数１～６のアルキル基（Ｃ１－６アルキル基）又はアリール基である。
　Ｒ１１がＣ１－６アルキル基の場合、当該Ｃ１－６アルキル基としては、直鎖であっても分岐鎖であってもよい。Ｃ１－６アルキル基の例としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ－ペンチル基、ヘキシル基等が挙げられる。
　Ｒ１１がＣ１－６アルキル基の場合、当該Ｃ１－６アルキル基は、置換基を有していてもよい。置換基を有しているＣ１－６アルキル基とは、Ｃ１－６アルキル基の炭素原子に結合している水素原子の１又は複数個、好ましくは１～３個が、他の官能基に置換されている基である。２個以上の置換基を有する場合、置換基同士は互いに同種であってもよく、異種であってよい。当該置換基としては、アリール基、ヘテロアリール基等が挙げられる。
　Ｒ１１がアリール基の場合、当該アリール基としては、フェニル基、ナフチル基、アントリル基、９－フルオレニル基等が挙げられ、フェニル基が特に好ましい。
　Ｒ１１がアリール基の場合、当該アリール基は、置換基を有していてもよい。置換基を有しているアリール基とは、アリール基の炭素原子に結合している水素原子の１又は複数個、好ましくは１～３個が、他の官能基に置換されている基である。２個以上の置換基を有する場合、置換基同士は互いに同種であってもよく、異種であってよい。当該置換基としては、Ｃ１－６アルキル基、Ｃ１－６アルコキシ基等が挙げられる。Ｃ１－６アルコキシ基は、直鎖であっても分岐鎖であってもよい。Ｃ１－６アルコキシ基の例としては、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基等が挙げられる。
　一般式（Ａ－１）又は（Ａ－２）中、Ｒ２は、酸素原子、硫黄原子、セレン原子、又は＝Ｎ－ＯＲ１１である。Ｒ１１は、前記Ｒ１１と同じである。一般式（Ａ－１）中、Ｒ１とＲ２は、互いに同じ基であってもよく、異なる基であってもよい。
　一般式（Ａ－２）中、Ｒ３は、－Ｏ－Ｒ１２、－Ｓ－Ｒ１３、又はグアニジノ基である。Ｒ１２及びＲ１３は、Ｃ１－６アルキル基又はアリール基である。Ｒ１２及びＲ１３がＣ１－６アルキル基の場合、当該Ｃ１－６アルキル基としては、Ｒ１１と同様の基を用いることができる。Ｒ１２及びＲ１３がアリール基の場合、当該アリール基としては、Ｒ１１と同様の基を用いることができる。
　一般式（Ａ－１）又は（Ａ－２）中、Ｒ４は、水素原子、－ＣＯ－Ｒ１４、又は－Ｏ－Ｐ（ＯＨ）（＝Ｏ）－Ｏ－Ｒ１５である。Ｒ１４及びＲ１５は、それぞれ独立して、炭素数１～３０のアルキル基（Ｃ１－３０アルキル基）又はアリール基である。
　Ｒ１４及びＲ１５がアリール基の場合、当該アリール基としては、Ｒ１１と同様の基を用いることができる。
　Ｒ１４及びＲ１５がＣ１－３０アルキル基の場合、当該アルキル基としては、直鎖であっても分岐鎖であってもよい。Ｃ１－３０アルキル基の例としては、Ｃ１－３０アルキル基の例としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ－ペンチル基、ヘキシル基、イソヘキシル基、ネオヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、エイコシル基、ヘンエイコシル基、ドコシル基、トリコシル基、テトラコシル基、ペンタコシル基、ヘキサコシル基、ヘプタコシル基、オクタコシル基、ノナコシル基、トリアコンチル基等が挙げられる。
　Ｒ１４及びＲ１５がＣ１－３０アルキル基の場合、当該アルキル基は、炭素原子に結合する１個以上の水素原子が、フェニル基で置換されていてもよい。Ｒ１４及びＲ１５としては、フェニル基で置換されていないＣ１－３０アルキル基か、１個の水素原子がフェニル基に置換されているＣ１－３０アルキル基が好ましい。
　Ｒ１４及びＲ１５の炭素原子が２以上の場合、すなわち炭素数２～３０のアルキル基（Ｃ２－３０アルキル基）の場合には、当該アルキル基は、炭素原子間にエーテル結合性の酸素原子を有していてもよい。なお、「エーテル結合性の酸素原子」とは、炭素原子間を連結する酸素原子であり、酸素原子同士が直列に連結された酸素原子は含まれない。
　一般式（Ａ－１）又は（Ａ－２）中、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立して、水素原子又は－ＣＯ－Ｒ１６である。Ｒ１６は、Ｃ１－６アルキル基又はアリール基である。Ｃ１－６アルキル基及びアリール基としては、Ｒ１１で挙げられた基と同様のものが挙げられる。
　一般式（Ａ－１）又は（Ａ－２）で表される化合物としては、下記一般式（１）～（９）のいずれかで表される化合物が好ましい。一般式（１）～（９）中、Ｒ４～Ｒ６及びＲ１１は、一般式（Ａ－１）又は（Ａ－２）中のＲ４～Ｒ６及びＲ１１と同じである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　本発明に係る抗ウイルス剤の有効成分としては、一般式（Ａ－１）又は（Ａ－２）で表される化合物の誘導体であることも好ましい。一般式（Ａ－１）又は（Ａ－２）で表される化合物の誘導体としては、生体内で酵素処理等を受けることによって一般式（Ａ－１）又は（Ａ－２）で表される化合物が産生される誘導体が好ましい。
　一般式（Ａ－１）で表される化合物としては、特に、２－チオウリジン（ＣＡＳ番号：２０２３５－７８－３）若しくはその誘導体が好ましい。２－チオウリジンの誘導体としては、生体内で酵素処理等を受けることによって２－チオウリジンが産生される誘導体が好ましい。本発明において、抗ウイルス剤として用いることができる２－チオウリジンの誘導体としては、例えば、核酸化合物を有効成分とする医薬品に対して行われているプロドラック化によって得られる誘導体がより好ましい。具体的には、２－チオウリジン中、フラン環に直接又はメチレン基を介して連結したヒドロキシ基が、アシル基や、リン酸基（ＰＯ４ －）に置換されたリン酸誘導体や、当該ヒドロキシ基がモノホスホルアミダイト基に置換されたモノホスホルアミダイト誘導体、当該ヒドロキシ基がモノホスホロチオエート基に置換されたモノホスホロチオエート誘導体などが挙げられる。例えば、２－チオウリジン（化合物（Ａ１））のヒドロキシ基をアシル化した誘導体として、化合物（Ａ５）～（Ａ８）が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　一般式（Ａ－１）又は（Ａ－２）で表される化合物としては、下記式（Ａ２）～（Ａ４）のいずれかで表される化合物若しくはその誘導体も好ましい。これらの誘導体としては、生体内で酵素処理等を受けることによって式（Ａ２）～（Ａ４）のいずれかで表される化合物が産生される誘導体が好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　一般式（Ａ－１）又は（Ａ－２）で表される化合物としては、下記式（Ａ９）～（Ａ１１）のいずれかで表される化合物若しくはその誘導体も好ましい。これらの誘導体としては、生体内で酵素処理等を受けることによって式（Ａ９）～（Ａ１１）のいずれかで表される化合物が産生される誘導体が好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　本発明に係る抗ウイルス剤の有効成分としては、一般式（Ａ－１）又は（Ａ－２）で表される化合物は、塩を形成していてもよく、その塩を形成する酸又は塩基としては、塩酸、硫酸などの鉱酸；酢酸、コハク酸、クエン酸等の有機酸；ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属；カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属等が挙げられる。また、一般式（Ａ－１）又は（Ａ－２）で表される化合物又はその塩は、水和物等の溶媒和物の形態であってもよい。
　一般式（Ａ－１）又は（Ａ－２）で表される化合物、当該化合物の塩、又はこれらの溶媒和物（以降において、これらをまとめて、「本発明に係る核酸化合物」ということがある。）は、ウイルス、特に、プラス鎖一本鎖ＲＮＡを遺伝子とするエンベロープウイルスに対する抗ウイルス作用を有している。プラス鎖一本鎖ＲＮＡを遺伝子とするエンベロープウイルスとしては、コロナウイルスやフラビウイルス、トガウイルス等が挙げられる。
　本発明に係る核酸化合物が抗ウイルス活性を示すコロナウイルスとしては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２等が挙げられる。本発明に係る核酸化合物が抗ウイルス活性を示すフラビウイルスとしては、デング熱（デング出血熱）の原因であるデングウイルス（ＤＥＮＶ）、ジカ熱（ジカウイルス感染症）の原因であるジカウイルス（ＺＩＫＶ）、黄熱の原因である黄熱ウイルス（ＹＦＶ）、ウエストナイル熱（ウエストナイル脳炎）の原因であるウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）、日本脳炎の原因である日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）等が挙げられる。ＤＥＮＶには、１型から４型までの４種（ＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ２、ＤＥＮＶ３、ＤＥＮＶ４）が存在する。本発明に係る核酸化合物が抗ウイルス活性を示すトガウイルスとしては、チクングニア熱の原因であるチクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）等が挙げられる。
　本発明に係る核酸化合物は、ウイルス感染症、特に、プラス鎖一本鎖ＲＮＡを遺伝子とするエンベロープウイルスのウイルス感染症の治療又は予防に用いられる医薬用組成物の有効成分として有用である。本発明に係る核酸化合物を有効成分とする医薬用組成物は、中でも、コロナウイルス、フラビウイルス、又はトガウイルスによる感染症の治療又は予防に用いられるものが好ましく、特に、ＳＡＲＳ、ＭＥＲＳ、ＣＯＶＩＤ－１９、デング熱、ジカ熱、黄熱、ウエストナイル熱、日本脳炎、チクングニア熱の治療又は予防に用いられるものがより好ましい。
　本発明に係る核酸化合物は、低分子化合物であることから、免疫原性等の問題がない。また、経口投与も可能であり、投与経路もあまり制限されないため、特に、ヒトを含む哺乳類に対する医薬の有効成分として有用である。
　１種又は２種以上の本発明に係る核酸化合物を医薬組成物に含有せしめる場合、必要に応じて薬学的に許容される担体と配合し、予防又は治療目的に応じて各種の投与形態を採用可能である。該形態としては、例えば、経口剤、注射剤、坐剤、軟膏剤、貼付剤等が挙げられるが、経口剤が好ましい。これらの投与形態は、各々当業者に公知慣用の製剤方法により製造できる。 
　薬学的に許容される担体としては、固形製剤における賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤；液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等が用いられる。また、必要に応じて防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、安定化剤等の製剤添加物を用いることもできる。
　経口用固形製剤を調製する場合は、本発明に係る核酸化合物に賦形剤、必要に応じて、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤等を加えた後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等を製造することができる。
　経口用液体製剤を調製する場合は、本発明に係る核酸化合物に、矯味剤、緩衝剤、安定化剤、矯臭剤等を加えて、常法により内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等を製造することができる。
　注射剤を調製する場合は、本発明に係る核酸化合物に、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下、筋肉内及び静脈内用注射剤を製造することができる。
　坐剤を調製する場合は、本発明に係る核酸化合物に当業界において公知の製剤用担体、例えば、ポリエチレングリコール、ラノリン、カカオ脂、脂肪酸トリグリセリド等を加えた後、常法により製造することができる。 
　軟膏剤を調製する場合は、本発明に係る核酸化合物に通常使用される基剤、安定剤、湿潤剤、保存剤等が必要に応じて配合され、常法により混合、製剤化される。 
　貼付剤を調製する場合は、通常の支持体に前記軟膏、クリーム、ゲル、ペースト等を常法により塗布すればよい。 
　前記の各製剤中の本発明に係る核酸化合物の含有量は、患者の症状、その剤形等により一定ではないが、一般に経口剤では約０．００１～１０００ｍｇ、注射剤では約０．００１～５００ｍｇ、坐剤では約０．０１～１０００ｍｇ程度である。
　また、これらの製剤の１日あたりの投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり一概には決定できないが、通常成人（体重６０ｋｇ）１日あたり約０．００５～５０００ｍｇ程度であり、０．０１～１０００ｍｇが好ましく、これを１日１回又は２～３回程度に分けて投与するのが好ましい。
　本発明に係る核酸化合物を有効成分とする抗ウイルス剤及び医薬用組成物が投与される動物は、特に限定されるものではなく、ヒトであってもよく、ヒト以外の動物であってもよい。非ヒト動物としては、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等の哺乳動物や、ニワトリ、ウズラ、カモ等の鳥類等が挙げられる。
　次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
＜コロナウイルス＞
　以降の実験で使用したコロナウイルスのうち、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２としては、ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ／ＷＫ－５２１／２０２０株（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２武漢株）、ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＱＫ００２／２０２０株（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アルファ株）、ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ８－６１２／２０２１株（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ベータ株）、ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ７－５０１／２０２１株（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ガンマ株）、ｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ１１－９２７／２０２１株（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２デルタ株）、及びｈＣｏＶ－１９／Ｊａｐａｎ／ＴＹ３８－８７３／２０２１株（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オミクロン（ＢＡ.１）株）を用いた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１としては、ハノイ株を用いた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、国立感染症研究所より、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１は、国立大学法人長崎大学より分与されたものを用いた。
　ヒトに日常的に感染するコロナウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ：ＨＣｏＶ）として、ＡＴＣＣから入手したアルファコロナウイルスＨＣｏＶ－２２９Ｅ株（ＡＴＣＣ：ＶＲ－７４０）、及びベータコロナウイルスＨＣｏＶ－ＯＣ４３株（ＡＴＣＣ：ＶＲ－１５５８）を用いた。
＜フラビウイルス＞
　以降の実験で使用したフラビウイルスのうち、ＤＥＮＶ１～ＤＥＮＶ４は、それぞれ、Ｄ１／ｈｕ／ＰＨＬ／１０－０７株、Ｄ２／ｈｕ／ＩＮＤＩＡ／０９－７４株、Ｄ３／ｈｕ／Ｔｈａｉｌａｎｄ／００－４０株、Ｄ４／ｈｕ／Ｓｏｌｏｍｏｎ／０８－１１株を用いた。ＺＩＫＶは、ＭＲ７６６株を用いた。ＹＦＶは、１７Ｄ－２０４株を用いた。ＷＮＶは、ＮＹ９９株を用いた。ＪＥＶは、Ｂｅｉｊｉｎｇ－１株を用いた。ＹＦＶは国立大学法人長崎大学より、その他のウイルス株は国立感染症研究所より分与されたものを用いた。
＜トガウイルス＞
　以降の実験で使用したトガウイルスのうち、ＣＨＩＫＶは、ＳＬ１０５７１株を用いた。当該ウイルス株は国立感染症研究所より分与されたものを用いた。
＜培養細胞＞
　以降の実験で、ウイルスを感染させるために、ヒト胎児肺由来の培養細胞株ＭＲＣ５細胞、シリアンハムスター腎臓由来の培養細胞株ＢＨＫ－２１細胞、アフリカミドリザル腎臓由来の培養細胞株ＶｅｒｏＥ６細胞、遺伝子組換えによりＴＭＰＲＳＳ２をＶｅｒｏＥ６細胞に発現させた培養細胞株ＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞、及び、ヒト胚性腎臓由来の培養細胞株ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＡＣＥ２遺伝子を導入して、ＡＣＥ２を恒常的に発現させた２９３Ｔ／ＡＣＥ２細胞を用いた。いずれの細胞についても、培養液として、２％　ＦＢＳ／ＭＥＭを用いた。２％　ＦＢＳ／ＭＥＭは、ＭＥＭ（Minimum Essential Medium：ニッスイ社製）に、２％　ＦＢＳ（ウシ胎児血清：Ｇｉｂｃｏ社製）とＬ－グルタミン（Ｗａｋｏ社製）を添加して調製した。
［実施例１］
　国立大学法人北海道大学薬学研究院創薬科学研究教育センターが保有する核酸化合物を母核とする化合物ライブラリーの化合物を被験試料として、フラビウイルスに感染させた細胞の細胞死を抑制する効果を奏する化合物をスクリーニングした。フラビウイルスとしてＤＥＮＶ２を用いた。
　この結果、使用した化合物ライブラリーに含まれる化合物のうち、ＨＵＰ０７９７（２－チオウリジン）に、抗ウイルス活性があることがわかった。
＜フラビウイルスに対する抗ウイルス活性の測定＞
　２－チオウリジンについて、ＢＨＫ－２１細胞に８種類のフラビウイルス（ＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ２、ＤＥＮＶ３、ＤＥＮＶ４、ＺＩＫＶ、ＹＦＶ、ＪＥＶ、ＷＮＶ）を感染させてＭＴＴアッセイを行い、抗ウイルス活性、すなわちウイルス感染による細胞死抑制効果を調べた。
（１）ウイルス感染とＭＴＴアッセイ
　まず、９６ウェルプレートの各ウェル内で、各化合物で処理した細胞に各種ウイルスを感染させて、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ ＣＯ２）内で、ＤＥＮＶ２は４日間、ＤＥＮＶ１、３、４は５日間、ＺＩＫＶ、ＹＦＶ、ＷＮＶ、ＪＥＶは３日間培養した。
　培養した９６ウェルプレートを、肉眼及び顕微鏡下で観察し、細胞の形態、結晶の有無等を確認した。次いで、ＭＴＴ溶液（3-(4,5-dimethyl-2-thiazol)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide（ナカライテスク社製）を５μｇ／ｍＬになるようにＰＢＳで溶解させた溶液）を、各ウェルに３０μＬずつ添加し、ＣＯ２インキュベーター内で２時間培養した。その後、当該プレートから、細胞を吸わないようにして上清を１５０μＬずつ除き、細胞溶解液（ウイルス不活化液：５００ｍＬのイソプロパノールに、５０ｍＬのＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、４ｍＬの塩酸（１２Ｎ）を入れて調製したもの）を各ウェルに１５０μＬずつ添加し、プレートミキサーで混和した。その後、当該９６ウェルプレートについて、吸光度計を用いて５７０ｎｍ／６３０ｎｍの２波長の吸光度を測定した。
（２）ＥＣ５０の算出
　以下の計算式に基づき、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ　Ｅｘｃｅｌ又は同等の計算処理能力を有するプログラムを使用し、ウイルス感染細胞の５０％細胞死阻害濃度（ＥＣ５０）を算出した。
[EC50] ＝ 10Z
Z ＝ ([50% OD] － [Low OD]) / ([High OD] － [Low OD]) × {log (High conc.) － log (Low conc.)} ＋ log (Low conc.)
 [50% OD] ＝ {OD (cell control) － OD (virus control)} × 0.5 ＋ OD (virus control) 
OD：吸光度
conc.：薬剤濃度
OD (cell control): コントロールのウェルの吸光度の平均値
OD (virus control):ウイルスコントロールのウェルの吸光度の平均値
　ＥＣ５０は、吸光度と薬剤濃度曲線上の５０％ ＯＤ値を挟む２点A-High (High OD, High conc.) とB-Low (Low OD, Low conc.)から計算した。
　結果を表１に示す。表１に示すように、２－チオウリジンは、ＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ２、ＤＥＮＶ３、ＤＥＮＶ４、ＺＩＫＶ、ＹＦＶ、ＷＮＶ、及びＪＥＶに対して、高い抗ウイルス活性があることがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
＜コロナウイルス及びトガウイルスに対する抗ウイルス活性の測定＞
　ＭＲＣ５細胞にＨＣｏＶ－２２９Ｅ株又はＨＣｏＶ－ＯＣ４３株を、ＢＨＫ－２１細胞にＣＨＩＫＶをそれぞれ感染させて、前記と同様にして抗ウイルス活性を調べた。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　表２に示すように、２－チオウリジンは、トガウイルスであるＣＨＩＫＶに対しても、コロナウイルスであるＨＣｏＶ－２２９Ｅ株及びＨＣｏＶ－ＯＣ４３株に対しても抗ウイルス活性を有することが確認された。すなわち、２－チオウリジンは、広範なプラス鎖一本鎖ＲＮＡを遺伝子とするエンベロープウイルスに対して高い抗ウイルス活性を有していた。
［実施例２］
　実施例１において、抗ウイルス活性が確認された２－チオウリジンについて、コロナウイルス、フラビウイルス、及びトガウイルスに対するウイルスＲＮＡ複製抑制効果を調べた。
　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２武漢株、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アルファ株、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ベータ株、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ガンマ株、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２デルタ株、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オミクロン株、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ハノイ株は、ＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞に感染させた。ＨＣｏＶ―２２９Ｅ株は、ＭＲＣ５細胞に感染させた。ＨＣｏＶ―ＯＣ４３株、ＤＥＮＶ２、ＺＩＫＶ、ＹＦＶ、ＪＥＶ、ＷＮＶ、及びＣＨＩＫＶは、ＶｅｒｏＥ６細胞に感染させた。
＜コロナウイルスに対するウイルスＲＮＡ複製抑制効果の確認＞
（１）培養細胞へのウイルス感染
　被験試料（２－チオウリジン）、各種コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２武漢株、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アルファ株、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ベータ株、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ガンマ株、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２デルタ株、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２オミクロン株、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ハノイ株、ＨＣｏＶ―２２９Ｅ株、ＨＣｏＶ―ＯＣ４３株）、及び各種細胞（ＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２、ＭＲＣ５、ＶｅｒｏＥ６）の希釈には、２％　ＦＢＳ／ＭＥＭからなる培養液を用いた。
　まず、９６又は４８ウェルプレートに、適当細胞数に調製した細胞溶液を１００又は３００μＬ／ウェルずつ分注し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ ＣＯ２）で一晩培養した。次いで、このプレート中の細胞を入れた各ウェルに、予め培養液で適度な濃度に希釈した被験試料を、２倍段階希釈系列を作製するように添加し（５０又は１５０μＬ／ウェル）、プレートミキサーで混和した。この被験試料を入れたプレートに、予め培養液で適当な濃度に希釈したウイルス液を５０又は１５０μＬ／ウェルずつ分注した。その後、当該プレートをプレートミキサーで混和し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ ＣＯ２）で２４～４８時間培養した。
（２）ＲＮＡ抽出・精製
　培養後の前記プレートの各ウェルから、培養上清を除去し、ＲＮＡ抽出キット（製品名：ＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｐｒｏ ９６ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、又は、ＰｕｒｅＬｉｎｋ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に付属のＬｙｓｉｓバッファーを各ウェルに添加して細胞溶解液を回収した。その後、当該キットに付属のプロトコルに従って、ｔｏｔａｌ ＲＮＡを精製した。
（３）ウイルスＲＮＡの測定
　精製した各種ウイルスＲＮＡのｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ領域に設計したＰｒｏｂｅ／Ｐｒｉｍｅｒセットを用いて、ｑＲＴ－ＰＣＲ（real-time quantitative reverse transcription PCR）を実施した。ｑＲＴ－ＰＣＲは、市販のキット（製品名：ＥＸＰＲＥＳＳ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ｑＲＴ－ＰＣＲ ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）と、リアルタイムＰＣＲシステム（製品名：ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ７ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて行った。
　ΔΔＣｔ法を用いて、２－チオウリジンを添加しなかった細胞のウイルスＲＮＡ量を１．０として、各濃度の２－チオウリジン処理した細胞における相対ウイルスＲＮＡ量を算出した。この際、内在性コントロールとして、ＡＣＴＢ遺伝子を用いた。各感染細胞における相対ウイルスＲＮＡ量の測定結果を図１Ａ～図１Ｄに示す。
＜その他のウイルスに対するウイルスＲＮＡ複製抑制効果の確認＞
　感染に使用するウイルスとしてＤＥＮＶ２、ＺＩＫＶ、ＹＦＶ、ＪＥＶ、ＷＮＶ、及びＣＨＩＫＶを用い、感染させる細胞をＶｅｒｏＥ６細胞とし、さらに、ＤＥＮＶ２、ＺＩＫＶ、ＹＦＶ及びＪＥＶはウイルス感染から４８時間培養後、ＷＮＶとＣＨＩＫＶはウイルス感染から２４時間後の細胞からウイルスＲＮＡを抽出した以外は、前記と同様にして、各ウイルスに対する２－チオウリジンのウイルスＲＮＡ複製抑制効果を調べた。各感染細胞における相対ウイルスＲＮＡ量の測定結果を図１Ｅ～図１Ｊに示す。
　図１Ａ～図１Ｊに示すように、２－チオウリジンで処理した細胞では、全てのウイルスに感染した細胞におけるウイルスＲＮＡ量が低下していた。これらの結果から、２－チオウリジンは、コロナウイルス、フラビウイルス、及びトガウイルスのウイルスＲＮＡ複製に対する抑制効果を有しており、抗ウイルス活性を有することが確認された。これらの結果から、２－チオウリジンは、プラス鎖一本鎖ＲＮＡを遺伝子とするエンベロープウイルスに対して広範な抗ウイルス活性を有することが示された。
［実施例３］
　フラビウイルスを感染させたマウスを、２－チオウリジン処理し、治療効果が得られるかどうかを調べた。実験には、インターフェロンα受容体とインターフェロンγ受容体を欠損させたＡＧ１２９マウスと、ＤＥＮＶ２をＡＧ１２９マウスで継代して馴化させたウイルス（ＡＧ１２９マウス馴化ＤＥＮＶ２）を用いた。２－チオウリジンは、５％ＤＭＳＯ／０．５％ＭＣ水溶液（１００％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で溶解させた２－チオウリジン（最終濃度５％）を０．５％のメチルセルロースで溶解させた水溶液）で希釈した溶液として、マウスに経口投与した。
　実験開始日の朝に、ＡＧ１２９マウス（７週齢の雌）に、マウス１匹当たり０．１ｍＬのＡＧ１２９マウス馴化ＤＥＮＶ２液（１×１０２ＰＦＵ／マウス）を腹腔内投与して感染させた。ウイルス感染日（感染０日目）から感染後４日目までの５日間、朝と夜の２回、２－チオウリジンを体重当たり５０ｍｇ／ｋｇ（５０ｍｇ／ｋｇ投与群、ｎ＝３）又は１５０ｍｇ／ｋｇ（１５０ｍｇ／ｋｇ投与群、ｎ＝４）で経口投与した。感染０日目には、感染後直ちに、２－チオウリジンの経口投与を行った。対照として、５％ＤＭＳＯ／０．５％ＭＣ水溶液を同様に経口投与した（Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群、ｎ＝４）。
　感染後毎日マウスを観察し、初期体重の８０％を切った個体は致死とみなした。各群の生存率（％）の結果を図２Ａに示す。Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群では、ウイルス感染後１０日内に全てのマウスが致死となったのに対して、５０ｍｇ／ｋｇ投与群ではウイルス感染後１２日までは全てのマウスが生存しており、１５０ｍｇ／ｋｇ投与群ではウイルス感染後１５日までは全てのマウスが生存していた。
　さらに、５０ｍｇ／ｋｇ投与群、１５０ｍｇ／ｋｇ投与群、及びＶｅｈｉｃｌｅ投与群をそれぞれ５匹ずつ追加して、同様にＡＧ１２９マウス馴化ＤＥＮＶ２を接種して感染実験を行った。感染後毎日マウスを観察し、初期体重の７０％を切った個体は致死とみなした。図２Ａに記載されたマウス個体についても、致死とみなす基準を初期体重の７０％を切った個体として、再解析を実施した。図２Ａの結果に、新たに取得したデータを追加して得られた各群の生存率（％）の結果を表３に示す。Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群（ｎ＝９）では、ウイルス感染後１０日内に全てのマウスが致死となったのに対して、５０ｍｇ／ｋｇ投与群（ｎ＝８）及び１５０ｍｇ／ｋｇ投与群（ｎ＝９）では、投与量依存的にウイルスに感染したマウスの生存率が上昇していた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
　また、感染３日後に各個体の血液を採取し、血清中のウイルスＲＮＡ量（ｌｏｇ１０（ＤＥＮＶ２コピー数）／ｍＬ）を測定した（各群ｎ＝５）。測定結果を図２Ｂに示す。５０ｍｇ／ｋｇ投与群及び１５０ｍｇ／ｋｇ投与群では、薬剤なしの媒体のみを投与したＶｅｈｉｃｌｅ投与群よりも、２－チオウリジンの投与量依存的に血中のウイルス量が減少していた（図２Ｂ）。
　これらの結果から、２－チオウリジンは、デングウイルスに感染した動物に対する致死抑制効果を有しており、デングウイルスによる感染症の治療又は予防のための医薬品の有効成分となり得ることが示された。
［実施例４］
　２－チオウリジンの構造類似化合物を合成し、そのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２武漢株に対する抗ウイルス活性を測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
（１）化合物（Ａ２）及び化合物（Ａ３）
　化合物（Ａ２）の２－セレノウリジン（ＣＡＳ番号：４０５５５－２９－１）と、化合物（Ａ３）の１－（（３Ｒ，４ｓ，５Ｒ）－３，４－ジヒドキシ－５－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－２－イル）－２－（メチルチオ）ピリジン－４（１Ｈ）－オン（ＣＡＳ番号：１７５８７５－３２－８）は、常法で合成されたものを用いた。
（２）化合物（Ａ４）
　化合物（Ａ４）の２－ヒドロキシイソシチジンは、以下の通りにして合成した。まず、２，５’－アンヒドロウリジン（ＣＡＳ番号：２２３２９－２０－０）及び塩酸ヒドロキシルアミン（１５３ｍｇ、２．２１ｍｍｏｌ）をメタノール（１０ｍＬ）に懸濁し、トリエチルアミン（３０８μＬ）を加え、７０℃で１時間、マイクロウエーブをかけた。次いで、反応液を室温に戻した後、溶媒を減圧下留去し、残渣をエタノールから結晶化して、化合物（Ａ４）（９７ｍｇ、収率８４．８％）を得た。
ESI-MS m/z 260 (M+H)+
1H-NMR (DMSO-d6)(400 MHz) d,  9.53(s, 1H), 9.36 (s, 1H), 7.84 (d, 1H, J = 8.2 Hz), 5.54 (d, 1H, J = 3.2 Hz), 5.28 (d, 1H, J = 4.4 Hz), 5.12 (t, 1H, J = 5.1, 5.4 Hz), 5.09-5.07 (m, 2H), 3.98-3.92 (m, 2H), 3.80 (ddd, 1H, J = 3.2, 3.7, 5.6 Hz), 3.69 (ddd, 1H, J = 3.2, 5.4, 12.4 Hz), 3.55 (ddd, 1H, J = 2.7, 5.1, 12.4 Hz).
（３）化合物（Ａ５）
　化合物（Ａ５）の２’，３’－Ｏ－イソプロピリデン－５’－Ｏ－プロピニル－２－チオウリジンは、以下の通りにして合成した。まず、２’，３’－Ｏ－イソプロピリデン－２－チオウリジン（ｉｓｏｐ－ｓ２Ｕ）（ＣＡＳ番号：６９８４－５５－０）（２００ｍｇ、０．６７ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）（５ｍＬ）に懸濁し、４－ジメチルアミノピリジン（５ｍｇ）及び無水プロピオン酸（１３０μＬ、１．５等量）を加え、室温で攪拌した。３０分後にメタノール（１ｍＬ）を加え、さらに３０分間攪拌した後、溶媒を減圧下留去し、残渣を酢酸エチル（１０ｍＬ）に溶解し、水（５ｍＬ）、飽和重曹水（５ｍＬ）、水（５ｍＬ）の順に分液した。得られた酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、減圧下留去し、残渣を９８％ ギ酸（２ｍＬ）に溶解させて、６時間室温下で攪拌した。撹拌後の反応液を減圧下濃縮し、水を加えて共沸を３回繰り返してギ酸を除去した。得られた残渣をシリカゲルカラムで精製（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１～１：３（容量比））し、泡状の化合物（Ａ５）（１７９ｍｇ、収率８５％)を得た。
ESI-MS m/z 316 (M+H)+
1H-NMR (DMSO-d6)(400 MHz) δ,  7.75 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 6.56 (d, 1H, J = 3.2 Hz), 6.03 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 5.55 (d, 1H, J = 5.6 Hz), 5.32 (d, 1H, J = 6.0 Hz), 4.24-4.32 (m, 2H), 4.05-4.09 (m, 2H), 3.90 (ddd, 1H, J = 6.0 Hz), 2.38 (q, 2H, J = 7.6 Hz), 1.04 (t, 3H, J = 7.6 Hz).
（４）化合物（Ａ６）
　化合物（Ａ６）の２’，３’－Ｏ－イソプロピリデン－５’－Ｏ－イソブチリル－２－チオリジンは、以下の通りにして合成した。まず、ｉｓｏｐ－ｓ２Ｕ（２００ｍｇ、０．６７ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（５ｍＬ）に懸濁し、４－ジメチルアミノピリジン（５ｍｇ）及び無水イソ酪酸（１７０μＬ、１．５等量）を加え、室温で攪拌した。３０分後にメタノール（１ｍＬ）を加え、さらに３０分間攪拌した後、溶媒を減圧下留去し、残渣を酢酸エチル（１０ｍＬ）に溶解し、水（５ｍＬ）、飽和重曹水（５ｍＬ）、水（５ｍＬ）の順に分液した。得られた酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、減圧下留去し、残渣を９８％ ギ酸（２ｍＬ）に溶解させて、６時間室温下で攪拌した。撹拌後の反応液を減圧下濃縮し、水を加えて共沸を３回繰り返してギ酸を除去した。得られた残渣をシリカゲルカラムで精製（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１～１：３（容量比））し、泡状の化合物（Ａ６）（１９７ｍｇ、収率８９．５％)を得た。
ESI-MS m/z 330 (M+H)+
1H-NMR (DMSO-d6)(400 MHz) δ,  7.74 (d, 1H, J = 8.2 Hz), 6.57 (d, 1H, J = 3.2 Hz), 6.01 (d, 1H, J = 8.2 Hz), 5.56 (d, 1H, J = 5.6 Hz), 5.33 (d, 1H, J = 6.0 Hz), 4.28 (d, 2H, J = 3.6 Hz), 4.06-4.10 (m, 2H), 3.90 (ddd, 1H, J = 6.0 Hz), 2.61 (sept, 1H, J = 7.0 Hz), 1.11 (d, 6H, J = 7.0 Hz).
（５）化合物（Ａ７）
　化合物（Ａ７）の２’，３’，５’トリ－Ｏ－イソブチリル－２－チオウリジンは、以下の通りにして合成した。まず、２－チオウリジン（１３０ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１０ｍＬ）に懸濁し、４－ジメチルアミノピリジン（１０ｍｇ）及び無水イソ酪酸（３７５μＬ、２．４ｍｍｏｌ）を加え、室温で攪拌した。３０分後にメタノール（１ｍＬ）を加え、さらに３０分間攪拌した後、溶媒を減圧下留去し、残渣を酢酸エチル（２０ｍＬ）に溶解し、水（５ｍＬ）、飽和重曹水（５ｍＬ×２）、水（５ｍＬ）の順に分液した。得られた酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、減圧下留去し、泡状の化合物（Ａ７）（２３０ｍｇ、収率９７．９％）を得た。
ESI-MS m/z 471 (M+H)+
1H-NMR (CDCl3)(400 MHz) δ,  9.40 (br s, 1H), 7.72 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 6.86 (d, 1H, J = 4.4 Hz), 6.02 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 5.41 (dd, 1H, J = 4.4, 5.4 Hz), 5.26 (dd, 1H, J = 5.5 Hz), 4.30-4.47 (m, 3H), 2.55-2.66 (m, 3H), 1.18-1.24 (m, 18H).
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
　抗ウイルス活性の測定は、実施例１と同様にして行った。測定結果を表４に示す。いずれの化合物も、２－チオウリジンと同様に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２武漢株に対する抗ウイルス活性を有していた。なかでも、化合物（Ａ２）、（Ａ４）、及び（Ａ６）は、ＥＣ５０とＣＣ５０の濃度差が十分であり、抗ウイルス剤として特に有望であった。
［実施例５］
　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のマウス馴化株（ＭＡ－Ｐ１０株、ＷＫ－５２１株由来）を感染させたマウスモデルを用いて、２－チオウリジンのウイルス感染予防効果及び治療効果を調べた。２－チオウリジンは、生理食塩水で希釈した溶液として、マウスに静脈内投与した。また、５％ＤＭＳＯ／０．５％ＭＣ水溶液（１００％のＤＭＳＯで溶解させた２－チオウリジン（最終濃度５％）を０．５％のメチルセルロースで溶解させた水溶液）で希釈した溶液として、マウスに経口投与した。
（１）２－チオウリジンのウイルス感染予防効果
　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＭＡ－Ｐ１０株感染マウスモデルを用いた増殖評価モデルにより、ウイルス感染前に投与した２－チオウリジンによるマウス肺内ウイルス増殖抑制効果を調べた。
　まず、５週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに、２－チオウリジンを単回静脈内投与（２又は２０ｍｇ／ｋｇ）した（２ｍｇ／ｋｇ投与群と２０ｍｇ／ｋｇ投与群のいずれもｎ＝５）。対照として、生理食塩水を同様に単回静脈内投与した（Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群、ｎ＝５）。
　２－チオウリジン投与から２時間後の各マウスに、ＭＡ－Ｐ１０株（２×１０２ ＴＣＩＤ５０／マウス）を経鼻接種し、感染翌日に各個体の肺を回収して、肺内のウイルス力価及びウイルスＲＮＡ量を測定した。各群の肺内のウイルス力価（ｌｏｇ１０（ＴＣＩＤ５０）／ｍＬ）の測定結果（平均値±ＳＤ）を図３Ａに、肺内のウイルスＲＮＡ量（ｌｏｇ１０（ウイルスコピー数）／ｍＬ）の測定結果（平均値±ＳＤ）を図３Ｂに、それぞれ示す。
　図３に示すように、２－チオウリジンをＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス感染の２時間前に単回静脈内投与したマウスでは、２－チオウリジンの投与量依存的に肺内ウイルス量が減少していた。当該結果から、２－チオウリジンには、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス感染の予防効果があること、すなわち、２－チオウリジンがＣＯＶＩＤ－１９の予防薬として期待できることが確認された。
（２）２－チオウリジンの致死抑制効果
　次に、ＭＡ－Ｐ１０株感染マウスモデルを用いて、２－チオウリジンの致死抑制効果を調べた。
　具体的には、１０匹の３０～５０週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＭＡ－Ｐ１０株）（２×１０２ ＴＣＩＤ５０／マウス）を経鼻接種し、ウイルス感染から１０日間の生存率（％）を調べた。このうち半数の５匹のマウスには、２－チオウリジンを感染２時間前に１回、感染翌日から感染４日後までの期間に１日１回の合計５日間静脈内投与（２０ｍｇ／ｋｇ）した（２０ｍｇ／ｋｇ投与群）。残る５匹のマウスには、２－チオウリジンに代えて生理食塩水を同様に静脈内投与した（Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群）。
　生存率の測定結果を図４に示す。２－チオウリジン投与群では、感染１０日後の生存率が８０％であったのに対して、Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群のマウスの生存率は、感染８日目には０％であった。すなわち、２－チオウリジンを連続投与することによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による致死効果を抑制する結果が得られることが確認された。
（３）２－チオウリジンのウイルス感染症治療効果
　ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＭＡ－Ｐ１０株感染マウスモデルを用いた増殖評価モデルにより、ウイルス感染後に投与した２－チオウリジンによるマウス肺内ウイルス増殖抑制効果を調べた。
　まず、８匹の５週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＭＡ－Ｐ１０株（２×１０２ ＴＣＩＤ５０／マウス）を経鼻接種した。このうちの５匹のマウスには、２－チオウリジンを感染直後から、経口投与（１日２回、１回あたり３００ｍｇ／ｋｇ）した（３００ｍｇ／ｋｇ投与群）。残る３匹のマウスには、２－チオウリジンに代えて５％ＤＭＳＯ／０．５％ＭＣ水溶液を同様に経口投与した（Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群）。この際、感染直後と感染から１２時間後に２－チオウリジンを経口投与し、その後感染から２４時間後に各個体の肺を回収して、肺内のウイルス力価（ｌｏｇ１０（ＴＣＩＤ５０）／ｍＬ）を測定した。各群の測定結果（平均値±ＳＤ）を図５に示す。
　図５に示すように、２－チオウリジンをＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス感染後に経口投与したマウスでは、２－チオウリジンを投与しなかったマウスよりも、肺内ウイルス力価が明らかに減少していた。当該結果から、２－チオウリジンは、感染後の投与によっても体内のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス量を低減できること、このため、２－チオウリジンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス感染症に対する治療薬として期待できることが明らかとなった。

Claims (10)

  1. 　下記一般式（Ａ－１）又は（Ａ－２）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式中、Ｒ１は、酸素原子、硫黄原子、セレン原子、又は＝Ｎ－ＯＲ１１であり；Ｒ２は、酸素原子、硫黄原子、セレン原子、又は＝Ｎ－ＯＲ１１であり；Ｒ３は、－Ｏ－Ｒ１２、－Ｓ－Ｒ１３、又はグアニジノ基であり；Ｒ１１は、水素原子、炭素数１～６のアルキル基又はアリール基であり；Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ独立して、炭素数１～６のアルキル基又はアリール基であり；Ｒ４は、水素原子、－ＣＯ－Ｒ１４、又は－Ｏ－Ｐ（ＯＨ）（＝Ｏ）－Ｏ－Ｒ１５であり；Ｒ１４及びＲ１５は、それぞれ独立して、フェニル基で置換されていてもよい炭素数１～３０のアルキル基（当該アルキル基は、炭素原子が２以上の場合に、炭素原子間にエーテル結合性の酸素原子を有していてもよい）又はアリール基であり；Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立して、水素原子又は－ＣＯ－Ｒ１６であり；Ｒ１６は、炭素数１～６のアルキル基又はアリール基である。］
    で表される化合物、前記化合物の塩、又はこれらの溶媒和物からなる、抗ウイルス剤。
  2. 　前記一般式（Ａ－１）又は（Ａ－２）で表される化合物が、下記一般式（１）～（９）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     のいずれかで表される化合物である、請求項１に記載の抗ウイルス剤。
  3. 　前記一般式（Ａ－１）又は（Ａ－２）で表される化合物が、下記式（Ａ１）、（Ａ５）、（Ａ６）、（Ａ７）、及び（Ａ８）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     のいずれかで表される化合物である、請求項１に記載の抗ウイルス剤。
  4. 　前記一般式（Ａ－１）又は（Ａ－２）で表される化合物が、下記式（Ａ２）～（Ａ４）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     のいずれかで表される化合物である、請求項１に記載の抗ウイルス剤。
  5. 　プラス鎖一本鎖ＲＮＡを遺伝子とするエンベロープウイルスに対する抗ウイルス作用を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗ウイルス剤。
  6. 　請求項１～５のいずれか一項に記載の抗ウイルス剤を有効成分とする、医薬用組成物。
  7. 　プラス鎖一本鎖ＲＮＡを遺伝子とするエンベロープウイルスによる感染症の治療又は予防に用いられる、請求項６に記載の医薬用組成物。
  8. 　コロナウイルス、フラビウイルス、又はトガウイルスによる感染症の治療又は予防に用いられる、請求項６に記載の医薬用組成物。
  9. 　ＣＯＶＩＤ－１９の治療又は予防に用いられる、請求項６に記載の医薬用組成物。
  10. 　下記式（Ａ４）～（Ａ７）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     のいずれかで表される化合物。
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