WO2023079962A1

WO2023079962A1 - 免疫分析方法および免疫分析装置

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Publication number: WO2023079962A1
Application number: PCT/JP2022/038984
Authority: WO
Inventors: 俊郎斎藤; 政慶籾山
Original assignee: 株式会社日立ハイテク; マグアレイ，インコーポレイテッド
Priority date: 2021-11-04
Filing date: 2022-10-19
Publication date: 2023-05-11

Abstract

洗浄工程が不要な免疫分析方法および免疫分析装置を提供する。本発明に係る免疫分析方法は、分析対象物質（１）と、前記分析対象物質（１）と特異的に結合する第一捕獲材（２）を有する第一標識分子（３）と、前記分析対象物質（１）と特異的に結合する第二捕獲材（４）を有する磁気微粒子（５）とを同一の溶液中で反応させる第一工程と、前記第一工程で反応させた溶液と、前記第一標識分子（３）と特異的に結合する第二標識分子（７）が表面に固定された磁気センサ（８）とを接触させ、そのまま前記磁気微粒子（５）によって誘起された磁界の強さを前記磁気センサ（８）で検出する第二工程と、を有する。

Description

免疫分析方法および免疫分析装置

　本発明は、免疫分析方法および免疫分析装置に関する。

　試料中の特定の生体物質を定量分析する方法は、生体内の反応・状態を調べる上で必要不可欠なものであり、臨床診断、薬剤の薬効や副作用の評価など幅広く用いられている。分析方法としては、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay、酵素結合免疫吸着法）やＥＣＬ（Electro-Chemical Luminescence、電気化学発光法）が一般的に用いられている。

　また、分析対象物質を特異的に捕獲、標識して分析する分析方法として、抗体を用いたものがある（免疫分析方法）。一般的に、抗体と、タンパクなどの分析対象物質との結合形成は平衡反応であり、結合過程だけでなく解離過程も同時に起こる。そのため、免疫分析方法では、結合過程よりも解離過程が起こり難い抗体、すなわち、解離定数（＝解離速度定数／結合反応速度定数）が小さい抗体を選んで使用するのが一般的である。しかし、分析対象物質によっては、解離定数が十分小さい抗体を選ぶことが困難な場合がある。

　さらに、近年、分析方法に関して、例えば、特許文献１に記載の技術（標的物質の検出方法）が提案されている。特許文献１に記載の技術は、次の（ａ）～（ｅ）の工程を有する。（ａ）は、非特異吸着防止膜を有する基体と、標的物質を特異的に捕捉する第１のリガンド分子を有する粒子と、前記標的物質を特異的に捕捉する部位および光照射により前記非特異吸着防止膜に結合する光照射結合部位を有する第２のリガンド分子と、を用意する工程である。（ｂ）は、反応媒体中で前記第１のリガンド分子および前記第２のリガンド分子を前記標的物質に結合させ、前記第１のリガンド分子を有する粒子と前記標的物質と前記第２のリガンド分子とを含んで構成される複合体を形成する工程である。（ｃ）は、前記複合体をＢ／Ｆ分離によって分離する工程である。（ｄ）は、光照射により、前記複合体に含まれる第２のリガンド分子中の光照射結合部位を前記非特異吸着防止膜に結合させる工程である。（ｅ）は、前記非特異吸着防止膜に固定された粒子の有無または量を検出する工程である。

特開２００９－２８８０６９号公報

　しかしながら、特許文献１に記載の標的物質の検出方法をはじめ、従来の分析方法はいずれも分析対象物質を正確に定量するため、分析の際に未反応の標識材やリガンド分子などを除去する洗浄工程（Ｂ／Ｆ分離工程）を行う必要があった。なお、Ｂ／Ｆ分離とは、Ｂｏｕｎｄ（結合）／Ｆｒｅｅ（遊離）分離のことであり、洗浄工程による洗浄と同義である。これらの工程を行うと、ＥＬＩＳＡなどの分析方法においては、分析対象物質を含む錯体の解離反応を避けることができなかった。また、特許文献１に記載の標的物質の検出方法においては、複合体（サンドイッチ錯体）の解離反応が必然的に生じてしまう。その結果、従来の分析方法はいずれも最終的な発光強度や信号強度などの低下を招き、感度が低下するため、分析対象物質を正確に定量することができなかった。

　さらに、抗体医薬品などのバイオ医薬品服用に伴って産生される抗薬物抗体を検出する場合には薬剤を捕獲材として用いるが、十分小さな解離定数を持つことが担保されない場合が多い。また、がんに罹患した際に産生される自己抗体は、がん特異的マーカとしてがんの早期診断に役立つことが大いに期待されている。がん特異的マーカの検出には、がん由来の組織構成物を自己抗体の捕獲材として用いることになる。しかし、抗原となるがん組織に対する自己抗体の結合力には個人間差が大きく、診断としてみた際の感度が低くなる恐れがある。すなわち、十分小さな解離定数を持たない薬剤や抗体を用いて複合体を形成させた後に洗浄工程を行うと複合体から捕獲材が解離してしまう。その結果、発光強度や信号強度などの低下を招き、感度が低下するため、分析対象物質を正確に定量することができなかった。

　本発明の目的は、洗浄工程が不要な免疫分析方法および免疫分析装置を提供することにある。

　本発明に係る免疫分析方法は、分析対象物質と、前記分析対象物質と特異的に結合する第一捕獲材を有する第一標識分子と、前記分析対象物質と特異的に結合する第二捕獲材を有する磁気微粒子とを同一の溶液中で反応させる第一工程と、前記第一工程で反応させた溶液と、前記第一標識分子と特異的に結合する第二標識分子が表面に固定された磁気センサとを接触させ、そのまま前記磁気微粒子によって誘起された磁界の強さを前記磁気センサで検出する第二工程と、を有する。

　本発明によれば、洗浄工程が不要な免疫分析方法および免疫分析装置を提供できる。

免疫分析方法における第一工程の内容を示す概略図。免疫分析方法における第二工程の内容を示す概略図。免疫分析装置の構成を示す概略構成図。抗原濃度に対する磁気信号強度をプロットしたグラフ（横軸は抗原濃度（ＣＥＡ濃度（ｐＭ））、縦軸は磁気信号強度）。

　次に、適宜図面を参照して一実施形態を説明する。参照する図面において、図１は、免疫分析方法における第一工程の内容を示す概略図である。図２は、免疫分析方法における第二工程の内容を示す概略図である。

［免疫分析方法］
　本実施形態に係る免疫分析方法（以下、「本分析方法」と呼称する場合がある）は、第一工程と、第二工程とを有する。
　図１に示すように、第一工程は、分析対象物質１と、分析対象物質１と特異的に結合する第一捕獲材２を有する第一標識分子３と、分析対象物質１と特異的に結合する第二捕獲材４を有する磁気微粒子５とを同一の溶液中で反応させる工程である。第一工程において溶液中でこれらが反応すると、サンドイッチ錯体６が生成される。
　図２に示すように、次いで行う第二工程は、第一工程で反応させた溶液と、第一標識分子３と特異的に結合する第二標識分子７が表面に固定された磁気センサ８とを接触させ（より詳細には、前記溶液と、磁気センサ８の表面に固定された前記第二標識分子７とを接触させ）、そのまま磁気微粒子５によって誘起された磁界の強さを磁気センサ８で検出する工程である。

　分析対象物質１は、第一捕獲材２および第二捕獲材４と特異的に結合できるものであればどのようなものも対象となる。そのような分析対象物質１として、例えば、ＳＣＣ、ＣＸＡ－１２５、ＣＥＡ、ＳＬＸ、ＣＹＦＲＡ、ＮＳＥ、ＰｒｏＧＲＰ、ＡＦＰ、ＰＩＶＫＡ－ＩＩ、ＣＡ１９－９、ＰＳＡ、ＣＡ－１２５、ＣＡ１５－３、ＮＣＣ－ＳＴ－４３９、ＳＴＮ、Ｅｌａｓｔａｓｅ　Ｉ、βＨＣＧなどの腫瘍マーカが挙げられるが、これらに限定されない。

　第一捕獲材２および第二捕獲材４は、分析対象物質１と特異的に結合するものであることが好ましい。第一捕獲材２および第二捕獲材４は、互いに分析対象物質１に対するエピトープ（認識部位）が異なることが好ましい。第一捕獲材２および第二捕獲材４は、第一捕獲材２、分析対象物質１、第二捕獲材４から構成されるサンドイッチ錯体６（複合体）を形成できるものが好ましい。第一捕獲材２および第二捕獲材４は、例えば、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体の抗原結合断片、単鎖抗体および抗体の結合領域を含む遺伝子構築物であることが好ましい。また、分析対象物質１が、自己抗体の場合には、薬剤や腫瘍組織などの構成物の一部の化合物や組織断片あるいは類似組成物であることが好ましい。

　第一捕獲材２には第一標識分子３を予め修飾しておく。第一標識分子３としては、例えば、ビオチン、ディゴキシゲニンなどを用いることができる。第一捕獲材２への第一標識分子３の修飾は、例えば、アミノ基と選択的に反応することが知られている官能基、例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンアミドとビオチンが炭素鎖で結ばれた市販の化合物を用いることで行うことができる。また、第一捕獲材２への第一標識分子３の修飾は、第一捕獲材２として抗体を用いる場合には、予め抗体のヒンジ部位のジスルフィド結合を還元剤で切断し、生成したスルフヒドリル基とビオチンとマレイミド基とが炭素鎖で結ばれた市販の化合物を用いることで行うことができる。また、第一捕獲材２がスルホヒドリル基を有する場合には、同様に、ビオチンとマレイミド基とが炭素鎖で結ばれた市販の化合物を用いることで、第一標識分子３の修飾を行うことができる。

　第二捕獲材４は、磁気微粒子５の表面に予め固定されている。磁気微粒子５には、フェライトなどの磁性材料微粒子をデキストランなどの高分子や脂質で包み込んだ微粒子を用いることができる。分散性と磁気センサ８による検出性を合わせて考慮すると、磁気微粒子５は超常磁性を有していることが好ましい。磁気微粒子５の粒子径は、分散性、超常磁性、反応速度などの観点で選択することが好ましく、１μｍ以下が適しており、より好ましくは３００ｎｍ以下が適している。第二捕獲材４を磁気微粒子５の表面に固定する方法は、磁気微粒子５の表面被覆材料に大きく依存する。これらを固定する方法としては、例えば、カルボキシメチルデキストランで被覆した磁気微粒子５を用いた場合、磁気微粒子５の表面に存在するカルボキシル基と第二捕獲材４のアミノ基との間で、カルボジイミドをリンキング試薬として用いることが挙げられる。このようにすると、これらの基の結合反応を容易に行うことができ、第二捕獲材４の磁気微粒子５表面への固定を容易に実施することができる。また、これらを固定する方法としては、例えば、脂質で被覆した磁気微粒子５を用いた場合、磁気微粒子５の表面に存在する水酸基と第二捕獲材４のアミノ基との間で臭化シアンをリンキング薬としたカップリング反応を用いることが挙げられる。この場合も前記同様、これらの基の結合反応を容易に行うことができ、第二捕獲材４の磁気微粒子５表面への固定を容易に実施することができる。

　第二工程で用いる磁気センサ８は、その構成によらず、磁気微粒子５を検出できればよい。磁気センサ８としては、例えば、ホール素子、磁気抵抗効果素子、巨大磁気抵抗効果（ＧＭＲ）素子、トンネル磁気抵抗効果素子、スクイッド（超伝導量子干渉計）素子などを用いることができる。磁気センサ８の表面には、第二標識分子７を固定するのに適した表面処理を施すことが好ましい。例えば、磁気センサ８の表面にシリコン酸化膜の薄膜を蒸着しておき、その上にアミノシランなどを用いて吸着力の強い膜を形成しておくことが好ましい。

　磁気センサ８の表面に固定される第二標識分子７は、第一標識分子３と特異的に結合する。つまり、第二標識分子７は、第一標識分子３に応じて適切なものを選択するとよい。例えば、第一標識分子３にビオチンを用いた場合は、第二標識分子７はアビジンまたはストレプトアビジンを選択するとよい。また、例えば、第一標識分子３にディゴキシゲニンを用いた場合は、第二標識分子７はアンチ－ディゴキシゲニン抗体を選択するとよい。

　前述したように、第二工程では、第一工程で反応させた溶液と、第一標識分子３と特異的に結合する第二標識分子７が表面に固定された磁気センサ８とを接触させ、そのまま磁気微粒子５によって誘起された磁界の強さを磁気センサ８で検出する。磁気センサ８は、磁気センサ８の表面に、第二標識分子７、第一標識分子３、第一捕獲材２、分析対象物質１および第二捕獲材４を介して固定された磁気微粒子５の存在量に比例した出力信号を得ることができる。ここで、「そのまま」とは、第一工程で反応させた溶液と磁気センサ８とを接触させた後、洗浄工程（Ｂ／Ｆ分離）を行わずに前記溶液中でそれらを接触させた状態を維持することをいう。つまり、本分析方法は、第一工程において溶液中でサンドイッチ錯体６を形成した後、第二工程で当該溶液を磁気センサ８に接触させ、洗浄工程を行わずに前記溶液中で磁気センサ８の信号を検出するものである。このようにすると、洗浄を行わないので、サンドイッチ錯体６における解離反応が起き難くなり、最終的な発光強度や信号強度などが低下し難くなる。そのため、本分析方法は、感度が低下し難く、分析対象物質１を正確に定量できる。なお、本分析方法が洗浄工程を行わないにも関わらず、分析対象物質１を正確に定量できる理由については後ほど説明する。

　なお、磁気微粒子５による磁界は、外部磁場発生装置１０で磁場を印加することにより発生させることができる。外部磁場発生装置１０は、例えば、同一の二つのコイルを同一の中心軸を持つように配置されたヘルムホルツコイルを用いることができる。

　本分析方法の一例を具体的に説明する。分析対象物質１の分析は以下のように実施できる。
　まず、第一工程では、図１に示すように、バッファー液に分析対象物質１を含む試料と、第一標識分子３を予め修飾しておいた第一捕獲材２と、第二捕獲材４を予め表面に固定した磁気微粒子５とを混合し、混合液９を調製する。バッファー液は、例えば、リン酸バッファーなどのｐＨを７．０などの所定のｐＨになるよう調製されたものを用いることができる。混合液９には、非特異的な反応を抑制するために、ウシ血清アルブミン、マウスＩｇＧなどのブロッキング材を含めてもよい。

　混合液９は、反応容器に入れて室温や３７℃などの所定の温度で３０分や６０分などの所定の時間、反応させる。当該反応には、振とう機などの攪拌手段を用いることが、反応効率を高める上で好ましい。反応終了後、図１に示すように、サンドイッチ錯体６が形成される。

　次に、第二工程では、図２に示すように、サンドイッチ錯体６を含む混合液９を、精製や洗浄することなく、そのまま、第一標識分子３と特異的に結合する第二標識分子７が表面に固定された磁気センサ８に、所定の時間、所定の環境下で接触させる。また、第二工程では、サンドイッチ錯体６を含む混合液９を所定の容器に入れ、そこに磁気センサ８を浸漬することもできる。さらに、第二工程では、磁気センサ８の表面にサンドイッチ錯体６を含む混合液９を液滴として滴下し、十分に湿度が高い環境下に所定の時間静置することもできる。

　なお、前記したように、第一標識分子３と特異的に結合する第二標識分子７の組み合わせには、各々例えば、ビオチンとアビジンまたはストレプトアビジンとの組み合わせや、ディゴキシゲニンとアンチ－ディゴキシゲニン抗体との組み合わせを用いることができる。磁気センサ８の表面に第二標識分子７を固定する方法としては、例えば、磁気センサ８の表面にアミノプロピルシランやポリ（Ｌ－リジン）を予めコートしておき、その上に第二標識分子７を含む溶液を接触させる。このようにすると、物理吸着によって、第二標識分子７が磁気センサ８の表面に固定される。

　本分析方法では、磁気センサ８の表面に固定する第二標識分子７の量は、第一標識分子３の全量の少なくとも１／１０以上とすることが好ましく、１／４以上とすることがより好ましく、１／２以上とすることがさらに好ましい。このようにすると、高感度な検出が可能になる。さらに好ましくは、磁気センサ８の表面に固定された第二標識分子７の量は、第一標識分子３の量よりも多いことである。サンドイッチ錯体６の作製に関わらない未反応の第一捕獲材２も、第一標識分子３と第二標識分子７の結合を介して、磁気センサ８の表面に固定される。第二標識分子７の量が第一標識分子３の量よりも少ないと、サンドイッチ錯体６が磁気センサ８の検出に必要な量を下回る可能性がある。これは、第一標識分子３で修飾された未反応の第一捕獲材２の方が、サンドイッチ錯体６よりも分子サイズとして小さいため、優先的に磁気センサ８の表面に存在する第二標識分子７に捕捉される可能性があるためである。従って、磁気センサ８に固定された第二標識分子７の量は、第一標識分子３の量よりも多いことが、高感度を得るためには好ましい。なお、磁気センサ８の単位面積当たりの固定される第二標識分子７の上限量は、磁気センサ８の面積と第二標識分子７の大きさ（占有面積）とで決まる。例えば、第二標識分子７の長さが一辺約６ｎｍである場合、単位面積１μｍ^２中には、計算上、１０００ｎｍ×１０００ｎｍ÷３６ｎｍ^２＝約２７８００個が上限値となる。

　そして、第二工程では、サンドイッチ錯体６を含む溶液（混合液９）と磁気センサ８とを接触させた後、そのまま、磁気センサ８の表面上に固定された磁気微粒子５の量を算出する。磁気微粒子５の量の算出は、磁気センサ８の出力を読み取るための読み取り装置１１とその出力を演算・記憶するための制御装置１２とを用い、磁気センサ８の表面上に固定された磁気微粒子５の量、すなわち、サンドイッチ錯体６の量を算出する。前述したように、磁気センサ８は、表面に付着した磁気微粒子５の存在量に比例した出力信号を得ることができる。磁気センサ８として巨大磁気抵抗センサを用いた場合は、磁気センサ８とそれに接する磁気微粒子５を含む溶液に磁場を印加する。磁場の印加は、前記した外部磁場発生装置１０で行うことができる。外部磁場発生装置１０は超常磁性を有する磁気微粒子５に磁化を帯びさせ、その誘起された磁界の強さを磁気センサ８で検出する。

　磁界の強さは距離の３乗に比例して減衰する。また、磁気センサ８は、磁気センサ８の表面から凡そ５００ｎｍ以内に存在し、かつ所定時間留まる磁気微粒子５の磁界だけ検出できる。すなわち、サンドイッチ錯体６に含まれない溶液中に分散している未反応の磁気微粒子１３は、たとえ一時５００ｎｍ以内に存在したとしても一所に留まることはないので、磁気センサ８で検出されない。そのため、本分析方法では第二工程において未反応の磁気微粒子１３を洗浄・除去せずとも、サンドイッチ錯体６の量を正確に定量できる。なお、磁気センサ８として巨大磁気抵抗センサを用いた場合には、磁気センサ８の抵抗値を読み取り装置１１で測定し、読み取り装置１１で測定した測定値を制御装置１２に取り込み、演算、データ保管、表示等を実施する。制御装置１２は、一般的なコンピュータや磁気センサ８による測定のために開発された専用の制御機器を用いることができる。

　サンドイッチ錯体６を磁気センサ８で検出するための条件は以下のようになる。
　第一標識分子３を有する第一捕獲材２の分子数をａ、分析対象物質１の分子数をｂ、磁気センサ８の面積をｆ（μｍ^２）、第二標識分子７の分子数をｇ、磁気センサ８がその表面に固定された磁気微粒子５を検出できる最小の磁気微粒子密度をｈ（個／μｍ^２）とする。溶液中におけるサンドイッチ錯体６の形成反応効率は１００％とする。結合速度定数が１０^５～１０^６（Ｍ^－１ｓ^－１）程度の抗体を第一捕獲材２および第二捕獲材４に用い、反応時の捕獲材濃度が１ｎＭ以上であり、反応時間を１時間程度とすることで、サンドイッチ錯体６の形成反応効率を１００％近い高い値にすることは容易にできる。また、磁気センサ８上に固定されるサンドイッチ錯体６の固定密度は、ｂ×ｇ／ａ／ｆで与えられる。この固定密度が磁気センサ８の検出感度（前記最小の磁気微粒子密度ｈ）よりも高くなれば、サンドイッチ錯体６、すなわち分析対象物質１を定量・検出できることになる。

　そのためには、第二標識分子７（分子数ｇ）と第一標識分子３を有する第一捕獲材２（分子数ａ）の比率が、ｇ／ａ＞ｈ×ｆ／ｂ、すなわち、ｂ×ｇ／ａ／ｆ＞ｈを満たすように設定しておけばよい。例えば、分析対象物質１を１０ｆＭの検出感度（分子数ｂ＝１０×１０^－１５×６×１０^２３×４００×１０^－６＝２４×１０^５個）で検出することを考える。反応溶液のボリュームを４００μＬ、磁気センサ８の面積を１００μｍ×１２０μｍ、検出感度（磁気センサ８がその表面に固定された磁気微粒子５を検出できる磁気微粒子密度（個数／磁気センサ８の単位面積））を０．１個／μｍ^２、第一標識分子３を有する第一捕獲材２の濃度を１ｎＭ（分子数ａ＝１×１０^－９×６×１０^２３×４００×１０^－６＝２４×１０^１０個）とすると、第二標識分子７の分子数ｇは、１．２×１０^８個以上あればよい。仮に、第二標識分子７にストレプトアビジン、第一標識分子３にビオチンを用いるとすると、ストレプトアビジンの長さは一辺約６ｎｍであることから、磁気センサ８の面積１００μｍ×１２０μｍ上に固定されるストレプトアビジンの分子数は約３×１０^８個となり、１０ｆＭの検出感度は十分実現できる。

［免疫分析装置］
　次に、図３を参照して、免疫分析装置１００について説明する。なお、既に説明した要素については同一の符号を付し、説明を省略する場合がある。図３は、免疫分析装置１００の構成を示す概略構成図である。
　図３は、水平面であるＸＹ平面に設置された免疫分析装置１００を上（Ｚ方向）から見た平面の構成を示している。Ｘ方向およびＹ方向は水平面を構成する互いに直交する方向であり、ここでは、Ｘ方向は免疫分析装置１００の横幅の方向に対応し、Ｙ方向は免疫分析装置１００の縦幅の方向に対応している。Ｚ方向は、Ｘ方向およびＹ方向に垂直な鉛直方向であり、免疫分析装置１００の高さ方向に対応している。また、これに加えて、図３には、水平面において試薬ディスク１１２の半径方向Ｒと、試薬ディスク１１２の円周方向Ｃとを示している。

　図３に示すように、免疫分析装置１００は、反応部２００と、検出部３００と、洗浄部４００と、入力部５００とを備えている。

　反応部２００は、分析対象物質１と、分析対象物質１と特異的に結合する第一捕獲材２を有する第一標識分子３と、分析対象物質１と特異的に結合する第二捕獲材４を有する磁気微粒子５とを同一の溶液（混合液９）中で反応させる。
　検出部３００は、この溶液と、第一標識分子３と特異的に結合する第二標識分子７が表面に固定された磁気センサ８とを接触させ、そのまま磁気微粒子５によって誘起された磁界の強さを磁気センサ８で検出する。
　洗浄部４００は、反応部２００または検出部３００に近接して設けられ、洗浄液を注入して除去することにより、分析対象物質１と結合していない第一標識分子３および磁気微粒子５を除去する。
　入力部５００は、ユーザが免疫分析装置１００に対して様々な情報の入力や操作を行う入力装置である。免疫分析装置１００が図３に示すような制御コンピュータ１２３を有している場合、入力部５００としてはキーボードやマウスが該当する。また、免疫分析装置１００が画面の表示および情報の入力を直接行うことのできるタッチパネルなどを備えている場合、入力部５００としては当該タッチパネルなどが該当する。

　免疫分析装置１００におけるこれらの要素は、従来の免疫分析装置と同様である。なお、従来の免疫分析装置としては、例えば、国際公開第２０１９／１５９６０９号に記載の自動分析装置が挙げられる。免疫分析装置１００の基本的な構成や動作等は当該公報に記載の自動分析装置を参考にすることができる。

　そして、免疫分析装置１００は、前記した入力部５００に、洗浄部４００に対して洗浄を行わないモードの選択が可能な選択部（図示せず）が設けられている。選択部は、スイッチやボタンなどであってもよく、また、画面の所定の位置に表示されるメニューボタンのようなものであってもよい。
　免疫分析装置１００は、入力部５００で洗浄を行わないモードが選択されたら、洗浄液の注入と除去を行わずに溶液のまま検出部３００で磁気センサ８の信号を検出する。
　つまり、本実施形態に係る免疫分析装置１００は、洗浄工程を行う一般的な免疫分析を実施することができるが、十分小さな解離定数を持たない捕獲材（例、薬剤や抗体、生体組織の組成物など）を用いる場合は、洗浄を行わないモードを選択することにより、洗浄を行わない前記した免疫分析方法を実施することができる。

　免疫分析装置１００の一例について、図３を参照してより具体的に説明する。
　図３に示すように、免疫分析装置１００は、制御コンピュータ１２３、ラック搬送部１２０、ラック搬送ライン１１８、サンプル分注機構１０３、インキュベータ（反応ディスク）１０４、搬送機構１０６、保持部材１０７、反応容器攪拌機構１０８、廃棄孔１０９、試薬ディスク１１２、試薬分注機構１１４、磁気微粒子攪拌装置１１５、反応容器搬送機構１１６、検出ユニット１１７を有する。

　制御コンピュータ１２３は、免疫分析装置１００の分析依頼情報に基づいて各機構を制御して、分析のための各工程を実現する。工程には分注工程や洗浄工程などが含まれる。また、制御コンピュータ１２３は、前記したように、ユーザに対するインタフェースを提供する。つまり、制御コンピュータ１２３が入力部５００に相当する。

　免疫分析装置１００が分析対象とするサンプル（分析対象物質１）はサンプル容器１０２に収容されている。サンプル容器１０２はラック１０１に架設された状態で免疫分析装置１００に搬入される。ラック搬送部１２０は、外部と免疫分析装置１００との間でラック１０１を搬入または搬出する機構である。また、ラック搬送部１２０には、免疫分析装置１００の電源投入指示部１２１および電源切断指示部１２２が備えられている。電源投入指示部１２１および電源切断指示部１２２は、免疫分析装置１００を操作するユーザが入力操作するボタンである。なお、制御コンピュータ１２３の表示部に、電源投入指示部１２１および電源切断指示部１２２に相当するメニューボタンを備えてもよい。

　ラック搬送部１２０により搬入されたラック１０１は、ラック搬送ライン１１８によってサンプル分注機構１０３近傍のサンプル分注位置まで移動される。インキュベータ１０４は、その円周部に複数の反応容器１０５を設置することができる。インキュベータ１０４は、円周方向に設置された反応容器１０５をそれぞれ所定位置に移動させる回転運動を行うことができる。

　搬送機構１０６は、Ｘ、Ｙ、Ｚの３軸の各方向に移動可能である。搬送機構１０６は、サンプル分注チップと反応容器１０５とを搬送する機構である。搬送機構１０６は、サンプル分注チップおよび反応容器１０５を保持する保持部材１０７、反応容器１０５を攪拌する反応容器攪拌機構１０８、サンプル分注チップまたは反応容器１０５を廃棄する廃棄孔１０９、サンプル分注チップ装着位置１１０、およびインキュベータ１０４の所定箇所の範囲を移動する。

　保持部材１０７には、未使用の反応容器１０５および未使用のサンプル分注チップが複数個保持されている。なお、未使用の反応容器１０５の内側の表面に、前記した第二標識分子７が表面に固定された磁気センサ８が設けられている。

　まず、搬送機構１０６は、保持部材１０７の上方に移動し、下降して未使用の反応容器１０５を把持した後に上昇する。そして、搬送機構１０６は、インキュベータ１０４の所定位置の上方に移動した後に下降して、反応容器１０５をインキュベータ１０４の所定位置に設置する。

　次いで、搬送機構１０６は、再び保持部材１０７の上方に移動し、下降して未使用のサンプル分注チップを把持した後に上昇する。そして、搬送機構１０６は、サンプル分注チップ装着位置１１０の上方に移動した後に下降して、サンプル分注チップをサンプル分注チップ装着位置１１０に設置する。サンプル分注チップは、コンタミネーションを防止するため、サンプル分注機構１０３がサンプルを分注する際にノズル（プローブ）の先端に装着され、当該サンプルの分注が終了すると破棄される。

　サンプル分注機構１０３は、水平面での回転動作および鉛直方向（Ｚ方向）の上下移動が可能である。サンプル分注機構１０３は、サンプル分注チップ装着位置１１０の上方まで回転動作により移動した後、下降して、ノズルの先端にサンプル分注チップを圧入して装着する。ノズルの先端にサンプル分注チップを装着したサンプル分注機構１０３は、ラック１０１に載置されているサンプル容器１０２の上方に移動した後、下降して、そのサンプル容器１０２に保持されているサンプルを所定量吸引する。サンプルを吸引したサンプル分注機構１０３は、インキュベータ１０４の上方に移動した後、下降して、インキュベータ１０４に保持されている未使用の反応容器１０５にサンプルを吐出する。サンプルの吐出が終了すると、サンプル分注機構１０３は廃棄孔１０９の上方に移動し、使用済みのサンプル分注チップを廃棄孔１０９から廃棄する。

　試薬ディスク１１２はディスク形状を有し、回転動作を行う。試薬ディスク１１２には複数の試薬ボトル１１３が設置されている。試薬ディスク１１２は、水平面において鉛直方向の中心軸の周りに回転する。これにより、試薬ディスク１１２上に配置されている試薬ボトル１１３が円周方向Ｃに移動し、工程に応じた所定の位置に搬送される。

　試薬ディスク１１２は、例えば３個の容器部１１３ａを１セットとした試薬ボトル１１３が設置可能となっている。なお、容器部１１３ａの個数は３個に限定されない。容器部１１３ａの開口部には開閉可能な蓋が設けられていてもよい。開閉可能な蓋は任意に設定可能である。このような蓋として、例えば、ヒンジによって本体と繋がった態様とすることや、スクリュー型キャップ構造とすることが挙げられる。

　試薬ボトル１１３は、例えば、磁気微粒子５を含む溶液（磁気微粒子溶液）を収容する１つの容器部１１３ａと、試薬を収容する２つの容器部１１３ａとで１セットを構成する。なお、この試薬のうちの１つは前記した第一捕獲材２を有する第一標識分子３を含む溶液である。

　洗浄液を使用する場合、この試薬を収容する２つの容器部１１３ａのうち少なくとも１つに生理食塩水やリン酸バッファーなどの洗浄液を収容させることができる。また、洗浄液を使用する場合、１セットの試薬ボトル１１３における３つの容器部１１３ａのすべてに洗浄液を収容し、洗浄液専用の試薬ボトル１１３とすることもできる。これらのようにすると、装置を小型化することができる。また、洗浄液を用いる場合、洗浄液は試薬ディスク１１２の外に設けられた専用の洗浄液ボトル（図示せず）に収容してもよい。このようにすると、試薬ボトル１１３が洗浄液以外の試薬を収容できるので、より多くのサンプルを分析することができる。

　磁気微粒子溶液とサンプルとを反応させた後、所定の段階で洗浄液を用いて洗浄する一般的な免疫分析を行う場合、サンプル分注機構１０３は、ノズルの先端に未使用のサンプル分注チップを装着し、洗浄液を収容する試薬ボトル１１３または容器部１１３ａから洗浄液を所定量吸引して対象となる反応容器１０５に当該洗浄液を吐出する。そして、洗浄後、サンプル分注機構１０３は、洗浄を行った洗浄液を吸い上げ、図示しない廃液容器に廃棄し、使用済みのサンプル分注チップを廃棄孔１０９から廃棄する。

　なお、試薬ディスク１１２の上部には図示しないカバーが設けられており、ほこり等の侵入が防止されているとともに、試薬ディスク１１２を含む空間部分が所定の温度に保温または保冷されている。すなわち、試薬ディスク１１２を含む空間部分は、保温庫や保冷庫としても機能する。本実施形態では、領域１１３ｂで試薬分注機構１１４または磁気微粒子攪拌装置１１５が試薬ボトル１１３にアクセスするため、カバーにおける当該領域１１３ｂにあたる部分に開口部を設けることが好ましい。容器部１１３ａの開口部に開閉可能な蓋が設けられている場合、カバーにおける当該開口部には、開閉可能な蓋に応じてこれを開閉できる機構（試薬容器蓋開閉機構；図示せず）を設けることが望ましい。これにより容器部１１３ａの蓋の開閉動作と試薬吸引動作との間に行われ得る試薬ディスク１１２の回転動作などが不要となり、分注工程や洗浄工程に要する時間を短くすることができる。

　試薬分注機構１１４は、水平面での回転動作および鉛直方向の上下移動が可能である。試薬分注機構１１４は、領域１１３ｂ（カバーの開口部）の上方に回転動作で移動した後に、下降し、ノズル（プローブ）の先端を容器部１１３ａ内の試薬（洗浄液である場合を含む）に浸漬して、所定量の試薬を吸引する。次いで、試薬分注機構１１４は、上昇した後、インキュベータ１０４の所定位置の上方に回転動作で移動して、反応容器１０５に試薬を吐出する。図３に示すように、試薬分注機構１１４の回転軌道は所定位置の１つの試薬ボトル１１３の複数の開口部の上を通過するように設定されている。

　磁気微粒子攪拌装置１１５もまた、水平面での回転動作および鉛直方向の上下移動が可能である。磁気微粒子溶液を収容する容器の吸引口の位置は位置１１３ｃである。このため、磁気微粒子攪拌装置１１５は、位置１１３ｃの上方に回転動作で移動した後に、下降し、磁気微粒子攪拌装置１１５の先端を、試薬ボトル１１３内の磁気微粒子溶液に浸漬して、攪拌する。そして、磁気微粒子攪拌装置１１５により磁気微粒子溶液の攪拌を行っている間、試薬分注機構１１４により試薬の分注を行うことができる。

　サンプル、試薬、磁気微粒子溶液が吐出された反応容器１０５は、インキュベータ１０４の回転によって所定位置に移動し、搬送機構１０６によって、反応容器攪拌機構１０８へと搬送される。反応容器攪拌機構１０８は、反応容器１０５に回転運動を加えることで、反応容器１０５内のサンプルと試薬とを攪拌して混和する。これにより、反応容器１０５内に反応液（溶液、混合液９）が生成される。

　つまり、免疫分析装置１００における反応容器１０５、インキュベータ１０４、試薬ディスク１１２、試薬ボトル１１３、サンプル分注機構１０３、試薬分注機構１１４、磁気微粒子攪拌装置１１５などが、反応部２００に相当する。
　また、反応容器１０５内の溶液中に分散している、サンドイッチ錯体６に含まれない未反応の磁気微粒子１３や未反応の第一捕獲材２を有する第一標識分子３などを洗浄して除去する場合は、洗浄の際に使用される試薬ボトル１１３や洗浄液ボトル、反応容器１０５、インキュベータ１０４、試薬ディスク１１２、サンプル分注機構１０３、試薬分注機構１１４などが、洗浄部４００に相当する。

　攪拌の終了した反応容器１０５は、搬送機構１０６によって、インキュベータ１０４の所定位置に戻される。反応容器搬送機構１１６は、インキュベータ１０４と検出ユニット１１７との間で反応容器１０５を搬送する。反応容器搬送機構１１６は、反応容器１０５を把持して上昇し、回転動作によって検出ユニット１１７に反応容器１０５を搬送する。その反応容器１０５は、検出ユニット１１７内で分析される。つまり、この検出ユニット１１７が検出部３００に相当する。

　前述したように、免疫分析装置１００は、入力部５００で洗浄を行わないモードが選択された場合、反応部２００で分析対象物質１と、分析対象物質１と特異的に結合する第一捕獲材２を有する第一標識分子３と、分析対象物質１と特異的に結合する第二捕獲材４を有する磁気微粒子５とを同一の溶液中で反応させ（第一工程）、サンドイッチ錯体６を生成させる。その後、免疫分析装置１００は、当該溶液と、第一標識分子３と特異的に結合する第二標識分子７が表面に固定された磁気センサ８とを接触させ、洗浄部４００で洗浄を行わずにそのまま反応容器搬送機構１１６により検出ユニット１１７へ搬送する。なお、「洗浄を行わずに」の一態様として、例えば、サンプル分注機構１０３が、ノズルの先端に未使用のサンプル分注チップを装着して洗浄液を収容する試薬ボトル１１３または容器部１１３ａから洗浄液を所定量吸引し、対象となる反応容器１０５に当該洗浄液を吐出する、という動作をいずれも行わないことが挙げられる。そして、検出ユニット１１７は、外部磁場発生装置１０で磁場を印加し、サンドイッチ錯体６に含まれる磁気微粒子５によって誘起された磁界の強さを磁気センサ８で検出する（第二工程）。

　分析が終了した反応容器１０５は、反応容器搬送機構１１６によってインキュベータ１０４に戻される。その後、反応容器１０５は、搬送機構１０６によって、インキュベータ１０４から廃棄孔１０９の上方に移動し、その廃棄孔１０９から廃棄される。

　以上に説明した構成としているので、本実施形態に係る免疫分析方法および免疫分析装置１００は、洗浄工程が不要である。そのため、本実施形態に係る免疫分析方法および免疫分析装置１００は、十分小さな解離定数を持たない（つまり、結合力が十分に強くない）薬剤や抗体、生体組織の組成物などを用いてサンドイッチ錯体６を形成させた場合であっても、サンドイッチ錯体６から薬剤や抗体などの捕獲材が解離してしまうのを防ぐことができる。従って、本分析方法および免疫分析装置１００は、発光強度や信号強度などの低下を招き難く、高い感度が得られるため、分析対象物質を正確に定量できる。

　次に、本分析方法および免疫分析装置１００の一具体例を説明する。
　本実施例は、腫瘍マーカであるＣＥＡを検出する系を構築して実施した。第一捕獲材２である捕獲抗体には、Ｍｅｄｉｘ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製抗ＣＥＡ抗体５９０９を用いた。ビオチン化キット（同仁化学社製ＬＫ１０）を用いて、捕獲抗体をビオチン化した（ビオチンが第一標識分子３に相当する）。第二捕獲材４である検出抗体には、Ｍｅｄｉｘ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製抗ＣＥＡ抗体５９０５を用いた。磁気微粒子５には、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社の磁気微粒子のラベリングキット（カタログ＃１３０－１０５－８０５）を用い、検出抗体５９０５を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社推奨プロトコールに従い、磁気微粒子５の表面に固定した。磁気センサ８には、ＭａｇＡｒｒａｙ社製ＧＭＲチップを用いた。

　チップの１０ｍｍ角基板の表面に、面積が１００μｍ×１２０μｍの巨大磁気抵抗センサを複数設けてある。センサ表面には、（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製４４０１４０）を蒸着した後、ストレプトアビジン（ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ、Ｓ８８８）のリン酸バッファー溶液を磁気センサ上にスポットすることで、磁気センサ８の表面に第二標識分子７であるストレプトアビジンを固定した。

　ＣＥＡの試料液として、バイオラッド社のＬｙｐｈｏｃｈｅｃｋ　Ｌｖ２を用いた。所定の濃度になるように、標準コントロール血清（Ｒｏｃｈｅ社製ＴＳＨアッセイ用コントロール試薬ｃａｌ１）で希釈して用いた。反応バッファーには、ウシ血清アルブミン１％入りリン酸バッファーを用いた。反応ボリュームは４００μｌとした。ビオチン化捕獲抗体、検出抗体付き磁気微粒子の濃度を各々１ｎＭとし、抗原ＣＥＡ濃度は０ｐＭ、０．１ｐＭ、１ｐＭ、１０ｐＭの４種類を調製した。

　捕獲抗体、抗原、検出抗体付き磁気微粒子を反応チューブに入れ、３７℃、６０分間、攪拌しながら反応させた。反応後直ちに、所定の容器に入れたチップに反応液を注ぎ、そのまま巨大磁気抵抗センサの出力読み出しをＭａｇＡｒｒａｙ製磁気信号測定装置で開始した（つまり、洗浄やＢ／Ｆ分離を行わずに測定を開始した）。同じ操作の実験を独立して４回行った（実験１～実験４）。

　出力信号強度の継時変化をモニターすると、各回の実験はいずれも読み出し直後から信号強度が増加し、凡そ２０～３０分後に信号強度の増加が抑制され、凡そ４０分後以降は信号強度が飽和した。信号強度としては、この飽和値を採用した。ＣＥＡ濃度が０．１ｐＭ、１ｐＭ、１０ｐＭの場合の信号強度から、ＣＥＡ濃度が０ｐＭの信号強度を差し引き、抗原濃度に対する信号強度をプロットした結果を図４に示す。図４に示すように、０．１ｐＭの場合、信号強度のばらつきが大きくなるものの、リニアリティは良好に得られることが分かった。
　このことから、本実施例に示す免疫分析方法は、洗浄工程が不要でありながら、腫瘍マーカであるＣＥＡの定量解析を実現できることが確認された。

　以上、本発明に係る免疫分析方法および免疫分析装置について実施形態および実施例により詳細に説明したが、本発明の主旨はこれに限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、前記した実施形態は本発明を分かり易く説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施形態の構成の一部を他の実施形態の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施形態の構成に他の実施形態の構成を加えることも可能である。また、各実施形態の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。

　１　　　分析対象物質
　２　　　第一捕獲材
　３　　　第一標識分子
　４　　　第二捕獲材
　５　　　磁気微粒子
　７　　　第二標識分子
　８　　　磁気センサ
　１００　免疫分析装置
　２００　反応部
　３００　検出部
　４００　洗浄部
　５００　入力部

Claims

　分析対象物質と、前記分析対象物質と特異的に結合する第一捕獲材を有する第一標識分子と、前記分析対象物質と特異的に結合する第二捕獲材を有する磁気微粒子とを同一の溶液中で反応させる第一工程と、
　前記第一工程で反応させた溶液と、前記第一標識分子と特異的に結合する第二標識分子が表面に固定された磁気センサとを接触させ、そのまま前記磁気微粒子によって誘起された磁界の強さを前記磁気センサで検出する第二工程と、
　を有する、免疫分析方法。
　前記第一標識分子を有する第一捕獲材の分子数をａ、前記分析対象物質の分子数をｂ、前記磁気センサの面積をｆ（μｍ^２）、前記第二標識分子の分子数をｇ、前記磁気センサがその表面に固定された前記磁気微粒子を検出できる最小の磁気微粒子密度をｈ（個／μｍ^２）とし、ｂ×ｇ／ａ／ｆ＞ｈの関係式を満たす、請求項１に記載の免疫分析方法。
　前記磁気微粒子が超常磁性を有し、前記磁気センサが巨大磁気抵抗センサである、請求項１または請求項２に記載の免疫分析方法。
　分析対象物質と、前記分析対象物質と特異的に結合する第一捕獲材を有する第一標識分子と、前記分析対象物質と特異的に結合する第二捕獲材を有する磁気微粒子とを同一の溶液中で反応させる反応部と、
　前記溶液と、前記第一標識分子と特異的に結合する第二標識分子が表面に固定された磁気センサとを接触させ、そのまま前記磁気微粒子によって誘起された磁界の強さを前記磁気センサで検出する検出部と、
　前記反応部または前記検出部に近接して設けられ、洗浄液を注入して除去することにより、前記分析対象物質と結合していない前記第一標識分子および前記磁気微粒子を除去する洗浄部と、
　前記洗浄部に対して洗浄を行わないモードの選択が可能な入力部と、を備え、
　前記入力部で洗浄を行わないモードが選択されたら、前記洗浄液の注入と除去を行わずに前記溶液のまま前記検出部で前記磁気センサの信号を検出する、免疫分析装置。