WO2023058372A1 - 凍結保存容器 - Google Patents

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WO2023058372A1
WO2023058372A1 PCT/JP2022/033005 JP2022033005W WO2023058372A1 WO 2023058372 A1 WO2023058372 A1 WO 2023058372A1 JP 2022033005 W JP2022033005 W JP 2022033005W WO 2023058372 A1 WO2023058372 A1 WO 2023058372A1
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WO
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main body
sperm
cryopreservation
container
cryopreservation container
Prior art date
Application number
PCT/JP2022/033005
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English (en)
French (fr)
Inventor
弘 岡田
徹 向井
久美子 中田
亮二 秋元
Original Assignee
ミツボシプロダクトプラニング株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts

Definitions

  • the present invention relates to a cryopreservation container for cryopreserving collected spermatozoa.
  • AIH Artificial Insemination of Husband
  • IVF In Vitro Fertilization
  • ICSI Intracytoplasmic sperm injection
  • ART assisted reproductive technologies
  • Patent Literature 1 the deterioration and aging of sperm are also suppressed over a long period of time by cryopreserving collected sperm.
  • cryopreservation container by using a refrigerant such as liquid nitrogen to quickly freeze the sperm stored in the cryopreservation container and store it at an extremely low temperature, it is possible to store it without any time limit. Then, when the time comes, the cryopreservation container is thawed and used for fertilization implantation in assisted reproductive medicine. The motility of sperm after thawing affects the success rate of fertility treatment.
  • a refrigerant such as liquid nitrogen
  • the cylindrical cryopreservation container disclosed in Patent Document 1 which has a constant inner cross section in the longitudinal direction, freezes in the vicinity of the container wall surface, but the central part becomes sherbet-like. was found to be low, significantly reducing the number of sperm available for reproductive medicine after thawing.
  • the diameter of the tube of the cryopreservation container increases and the distance from the surface in contact with liquid nitrogen increases, the tendency of deterioration increases.
  • an object of the present invention is to provide a cryopreservation container that has good freezing efficiency and can suppress the decrease in motility of sperm due to cryopreservation.
  • a cryopreservation container of the present invention is a cryopreservation container for cryopreserving collected spermatozoa, the cryopreservation container having a bottom portion and an open top end, and a cylindrical body portion. and a hollow convex portion recessed from the bottom side toward the opening side of the inner space of the body portion.
  • the top portion of the hollow convex portion is positioned in the upper half of the main body portion in the height direction.
  • 70% or more of the liquid capacity of the main body is accommodated at the position of the top of the hollow projection.
  • the main body may be tapered toward the bottom, and the hollow projection may be tapered toward the opening of the main body. Furthermore, it is preferable to set the gap between the inner peripheral surface of the main body and the hollow projection to be larger than the diameter of the tip of the pipette. Further, it is possible to provide a configuration in which an annular raised portion extending downward from the bottom portion of the main body portion is provided, and a lower end opening of the raised portion communicates with an inner space of the hollow convex portion.
  • the cryopreservation container of the present invention configured in this manner is provided with hollow projections that are recessed from the bottom side toward the upper end side with respect to the inner space of the cylindrical main body. That is, the coolant such as liquid nitrogen and the cold air generated therefrom not only come into contact with the outer peripheral surface of the main body, but also enter the inner space of the hollow convex portion, cooling the liquid contained from the center side as well.
  • the freezing efficiency is good, and the entire storage solution such as a cryopreservation solution is evenly frozen in a short period of time, so it is possible to suppress the decrease in sperm motility due to cryopreservation.
  • the top of the hollow convex portion is positioned in the upper half of the main body in the height direction, most of the contained liquid is cooled from the center side of the main body.
  • 70% or more of the liquid capacity of the main body is accommodated at the top position of the hollow convex portion, the decrease in motility of spermatozoa due to cryopreservation can be greatly suppressed.
  • the contained liquid can be easily put into the main body.
  • FIG. 10 is a perspective view illustrating the configuration of the cryopreservation container with the lid attached.
  • Fig. 2 is a perspective view illustrating the configuration of the cryopreservation container with the lid removed.
  • FIG. 4 is an explanatory diagram schematically showing the state of semen collection by a semen collection container;
  • FIG. 10 is an explanatory diagram showing a procedure for recovering spermatozoa from a semen collection container;
  • FIG. 10 is an explanatory diagram showing a procedure for cooling the cryopreservation container;
  • FIG. 10 is an explanatory diagram showing a procedure for recovering the contained liquid from the cryopreservation container after thawing. It is a graph explaining the experiment result which confirmed the change of the sperm motility rate by cryopreservation using several specimens.
  • FIG. 1 is a cross-sectional view illustrating the configuration of a cryopreservation container 1 of this embodiment.
  • 2 and 3 are perspective views illustrating the structure of the cryopreservation container with and without the lid.
  • Infertility can be caused by both women and men, but in the case of male infertility patients, semen test findings are often below the standard value.
  • Tests that men undergo include a standard semen test for the purpose of examining the function of sperm production and an advanced sperm function test 1 for the purpose of examining sperm function.
  • total motility is a test item based on the WHO laboratory manual criteria, and 40% or more is the standard value indicating normal.
  • Other test items men receive include semen volume, sperm concentration, total sperm count, forward motility rate, normal sperm morphology rate, white blood cell count, advanced sperm function test 2 (ORP test (oxidative stress level)), etc. be.
  • Asthenozoospermia means a sperm motility rate of 40% or less and a forward motility rate of 32% or less.
  • Sperm motility in healthy men is usually 60% to 80%, and it is said that fertility declines when this motility decreases.
  • the collected sperm may not be used immediately for assisted reproductive technology, but may be cryopreserved, thawed when the time comes, and used for assisted reproductive technology.
  • the storage period may be long in some cases, but it is preferable to suppress deterioration and aging of the spermatozoa due to cryopreservation as much as possible.
  • cryopreservation container 1 When cryopreserving, a refrigerant such as liquid nitrogen is used to quickly freeze the collected sperm stored in the cryopreservation container 1.
  • the cryopreservation container 1 of the present embodiment as shown in FIG. and a convex portion 21 . Further, an annular raised portion 22 extending downward from the bottom portion 2b of the main body portion 2 is provided.
  • the body part 2 is formed in a cylindrical shape having a bottom part 2b and an upper end opening 2a. More preferably, the body portion 2 is formed in a shape that tapers toward the bottom portion 2b. For example, when the diameter D1 of the opening 2a is about 10 mm, the diameter D2 of the bottom portion 2b is about 9 mm.
  • the lid portion 11 is attached by screwing onto the upper end of the main body portion 2 .
  • a sealing material 12 is interposed between the upper end surface of the body portion 2 and the lid portion 11 .
  • cryopreservation container 1 of the present embodiment is provided with a hollow convex portion 21 that is recessed from the bottom portion 2b side toward the opening 2a side with respect to the inner space of the main body portion 2 .
  • the inner space of the hollow convex portion 21 communicates with the lower end opening of the elevated portion 22, as shown in FIG. That is, the outer peripheral surface and the center (axis center) side of the body portion 2 can be brought into contact with a coolant such as liquid nitrogen or air (cold air) having the same temperature.
  • the hollow convex portion 21 formed so as to protrude from the bottom portion 2b side toward the opening 2a is preferably formed in a conical shape that tapers toward the opening 2a of the main body portion 2. That is, the diameter D3 of the top portion 211 of the hollow convex portion 21 is made smaller than the diameter D4 of the hollow convex portion 21 on the side of the bottom portion 2b.
  • a cryopreservation liquid mixed with sperm is stored in the main body 2 of the cryopreservation container 1 as a storage liquid. That is, the contained liquid is filled from the bottom portion 2b of the body portion 2 into the gap having an annular cross-section between the inner peripheral surface of the body portion 2 and the hollow projection portion 21, and above the top portion 211 of the hollow projection portion 21, the body portion 2 is filled in the inner space having a circular cross section.
  • the diameter D1 of the upper end (opening 2a) is 10.4 mm
  • the diameter D2 of the bottom 2b is 9.3 mm
  • the height H1 including the base portion 22 with a height H2 of 2.0 mm is 28.0 mm
  • the thickness is 0.6 mm.
  • the body portion 2 and the hollow convex portion 21 are molded.
  • the liquid volume V1 at the upper end of the body portion 2 is 1.0 cc
  • the liquid volume V2 at the top portion 211 of the hollow convex portion 21 is 0.7 cc. That is, about 70%, or more than 70% of the liquid volume V1 of the main body 2 can be accommodated at the position of the apex 211 of the hollow projection 21 .
  • the cryopreservation container 1 is provided with a label portion 13 as shown in FIG. 2 in order to prevent sample mix-ups.
  • Information such as patient identification information and collection date is attached to the label portion 13 by printing or a sticker.
  • the semen collection container 3 includes a container body 32 having a reservoir 31 for storing sperm S, and an inner lid 33 for making the reservoir 31 a closed space after semen collection.
  • the container body 32 is integrally formed with a conical inner container 321 for containing the sperm S and a cylindrical outer container 322 for covering the inner container 321 .
  • the upper inlet of the inner container 321 is widened like a funnel, so semen collection is easy.
  • the inner lid 33 is also molded in a truncated cone shape from polypropylene.
  • the inner peripheral surface of the tapered portion (truncated conical portion) of the inner container 321 and the outer peripheral surface of the inner lid 33 have substantially the same shape, and the inclination angle of the tapered portion with respect to the axis of the container body 32 is from 10°. It can be about 30°.
  • the storage part 31 corresponds to the space surrounded by the lower part of the inner container 321 and the bottom surface of the inner lid 33 . That is, the outer peripheral surface of the inner lid 33 is in close contact with the truncated cone-shaped inner peripheral surface above the storage portion 31 formed in the cylindrical shape in the inner container 321 , and the bottom surface of the inner lid 33 is in contact with the storage portion 31 . It becomes the ceiling surface (see Fig. 5).
  • the volume of the reservoir 31 may be formed to be slightly larger than 10cc.
  • the inner peripheral surface of the inner container 321 and the inner surface of the reservoir 31 are mirror-finished so that semen is less likely to adhere to the wall surface and easier to flow down. If the container main body 32 is transparent or translucent, the patient can easily visually confirm that the sperm S is stored in the storage part 31 and the amount of semen collected.
  • the upper edge of the inner lid 33 inserted into the inner container 321 has a screw groove that engages with the screw groove provided on the upper edge of the container body 32.
  • a portion 331 is provided.
  • the inner lid 33 is firmly fixed to the container body 32, and the cylindrical reservoir 31 with the bottom and the inner lid 33 are connected.
  • the sperm S enclosed in the space surrounded by the bottom surface is transported to a medical institution without being exposed to air or leaking.
  • FIG. 5 is an explanatory diagram showing the status of treatment for collecting sperm S from the semen collection container 3.
  • FIG. A collecting portion 311 is provided at the center of the bottom portion of the inner container 321 that serves as the storage portion 31 .
  • the collection part 311 is a circular thin-walled part formed so as to be easily perforated by the needle 51 (cannula) of the syringe 5 for collecting the sperm S.
  • the recovery part 311 is formed to have a diameter of about 1 mm and a thickness of about 0.1 mm, for example, which is thinner than the surroundings.
  • the needle 51 of the syringe 5 is inserted into the collection portion 311 of the storage portion 31 to collect the sperm S stored in the storage portion 31 into the syringe 5 .
  • the inner lid 33 may be left in the fitted state, contact between the sperm S and the outside air can be avoided, and oxidation of the sperm S and entry of dust and the like can be prevented.
  • the sperm S collected by the syringe 5 is washed after being transferred to the Spitz tube. Subsequently, good-quality sperm S are selected and collected using a sperm preparation method such as concentration by centrifugation or the swim up method. It should be noted that these treatments for the collected sperm S can also be performed after thawing after cryopreservation.
  • the collected high-quality sperm S is mixed with cryopreservation solution.
  • it is mixed with a sperm freezing medium.
  • the sperm-containing liquid in which the cryopreservation liquid and the sperm S are mixed in this manner becomes the liquid contained in the cryopreservation container 1 of the present embodiment.
  • the contained liquid is injected using a pipette 4 (see FIG. 7) or the like.
  • the sperm S and the cryopreservation solution can be separately performed and mixed in the main body 2.
  • the body portion 2 accommodates 0.7 cc to 1.0 cc of liquid, using the position of the top portion 211 as a guideline. After housing, the opening 2a of the main body 2 is closed by screwing the cover 11 (see FIG. 2).
  • identification information such as the patient's name and identification number and information such as the date of collection are written before the liquid is injected or after the lid portion 11 is attached. This can prevent mix-up of specimens. Since the label portion 13 is provided using the wide outer peripheral surface of the main body portion 2, a large amount of information can be written.
  • the freezing of the cryopreservation container 1 can be performed for multiple pieces at the same time.
  • six cryopreservation containers 1 can be set in one cane 6 for freezing, and processing for freezing can be performed.
  • FIG. 6 is a diagram schematically showing the cooling process by the vapor phase of liquid nitrogen 71. As shown in FIG.
  • a refrigerant such as liquid nitrogen 71 is stored in a storage box 7 made of Styrofoam or the like, and the cryopreservation container 1 attached to the cane 6 is exposed to the cold air of the liquid nitrogen 71 rising from the storage box 7 at a temperature of about 2°C to 5°C.
  • the liquid containing the sperm S is gradually cooled. By doing so, damage to the sperm S caused by freezing can be reduced.
  • FIG. 6 is only an image diagram and does not show the actual treatment method.
  • simple freezing starts by cooling, it is necessary to set the cane 6 so that the lid portion 11 faces upward, and freeze the liquid in a state in which the liquid is collected from the bottom portion 2b.
  • the cryopreservation container 1 that has been cooled by the vapor phase of liquid nitrogen 71 is attached to the cane 6 for cryopreservation and placed in a lidded nitrogen tank (not shown) in which liquid nitrogen at -196°C is stored. inserted and stored.
  • the liquid nitrogen enters not only the outer peripheral surface of the main body part 2 but also the inner space of the conical hollow convex part 21 provided in the center, so that the contained liquid is frozen efficiently and evenly.
  • the sperm S does not deteriorate or age, so there is no time limit for cryopreservation.
  • the relevant cryopreservation container 1 is selected from the information printed on the label section 13, taken out from the nitrogen tank, and kept at a temperature of about 30°C to 35°C. Soak in lukewarm water and shake to dissolve.
  • the lid 11 is removed, and the tip of the pipette 4 is inserted into the main body 2 as shown in FIG. is collected by sucking up the containing liquid containing
  • the body portion 2 of the cryopreservation container 1 has a shape that tapers toward the bottom portion 2b. Between the inner peripheral surface of 2 and the hollow convex portion 21, a gap is secured through which the tip of the pipette 4 used for collecting the preserved sperm S is passed.
  • the body portion 2 and the hollow convex portion 21 are manufactured so that the gap is about 3 mm to 4 mm.
  • the tip of the pipette 4 can reach the bottom portion 2b of the main body portion 2 to suck up the entire amount of the contained liquid.
  • the liquid containing the sucked sperm S is transferred to a Spitz tube and used for assisted reproductive technology (ART) such as artificial insemination (AIH), in vitro fertilization (IVF), and microinsemination (ICSI).
  • ART assisted reproductive technology
  • AIH artificial insemination
  • IVVF in vitro fertilization
  • ICSI microinsemination
  • the container used as a comparative example is a conventionally used cylindrical storage container, which does not have a configuration corresponding to the hollow convex portion 21 of the cryopreservation container 1 of the present embodiment, and has a constant thickness (diameter). It is a cylindrical container. Specifically, a cylindrical storage container with a height of 29.0 mm and a diameter of 12.0 mm and a liquid capacity of 1.2 cc was used.
  • the cryopreservation container 1 used in Example 1 has a height H1 of 28.0 mm, a top diameter D1 of 10.4 mm, a bottom 2b diameter D2 of 9.3 mm, and a thickness 0.6 mm.
  • the liquid volume V1 of the main body 2 is 1.0 cc at the upper end, but in the experiment, the liquid volume V2 at the top 211 of the hollow projection 21 was used within a range of 0.7 cc.
  • AE sperm motility of pre-frozen specimens
  • AE sperm motility of pre-frozen specimens
  • a to E are injected into the cryopreservation container 1 of Example 1 and the storage container of the comparative example, respectively, subjected to the freezing treatment as described above, and cryopreserved in a nitrogen tank for a certain period of time. After that, take it out and thaw it.
  • FIG. 8 is a bar graph showing the change in sperm motility due to this cryopreservation as a rate of change.
  • the sperm motility of the sperm S cryopreserved in the cryopreservation container 1 of Example 1 has hardly changed compared to before and after freezing. Specifically, the rate of change falls within the range of 92.0% to 96.0%, indicating that the decrease in sperm motility due to cryopreservation is suppressed to 10% or less.
  • the sperm motility of sperm S cryopreserved in the storage container of the comparative example is halved compared to before and after freezing. Specifically, the rate of change is in the range of 51.0% to 60.0%, and a significant decrease in sperm motility is observed in all specimens (AE).
  • the cryopreservation container 1 of Example 1 since the cryopreservation container 1 of Example 1 has the hollow convex portion 21, the entire liquid contained in the main body portion 2 is efficiently and uniformly frozen. It can be inferred that the deterioration of the sperm S at all stages was suppressed.
  • the freezing of the central portion is slower than that of the portion adjacent to the outer peripheral surface of the storage container, and the sherbet-like time is longer. It can be assumed that the deterioration of As a result, the number of sperm that can be used for reproductive medicine after thawing is greatly reduced, as described in the background art above.
  • the cryopreservation container 1 of the present embodiment configured in this manner is provided with a hollow convex portion 21 so as to be depressed from the bottom portion 2b side toward the opening 2a side of the upper end with respect to the inner space of the cylindrical main body portion 2. ing. That is, the coolant such as liquid nitrogen and the cold air generated therefrom not only come into contact with the outer peripheral surface of the main body 2, but also enter the inner space of the hollow convex portion 21 to cool the contained liquid from the center side as well.
  • the freezing efficiency is good, and the entire storage solution such as a cryopreservation solution is evenly frozen in a short period of time, so it is possible to suppress the decrease in sperm motility due to cryopreservation.
  • coolant and cold air can be efficiently taken in from the lower end opening of the elevated portion 22 provided on the bottom portion 2b side of the main body portion 2 toward the inner space of the hollow convex portion 21 .
  • the top portion 211 of the hollow convex portion 21 is positioned in the upper half of the body portion 2 in the height direction, most of the liquid contained therein is cooled from the center side of the body portion 2. .
  • the decrease in sperm motility due to cryopreservation can be significantly reduced. can be reduced to
  • the body portion 2 is formed in a shape that tapers toward the bottom portion 2b and the hollow convex portion 21 is formed in a shape that tapers toward the opening 2a of the body portion 2, the liquid contained in the body portion 2
  • the tip of the pipette 4 can be easily inserted into the gap between the main body 2 and the hollow convex portion 21 when taking out the contained liquid. As a result, the entire amount of the contained liquid can be easily sucked up.
  • the main body 2 is tapered toward the bottom 2b, but the present invention is not limited to this.
  • the hollow convex portion 21 may also have a constant thickness (diameter) in the height direction.

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Abstract

凍結効率が良く、凍結保存による精子の運動性の低下を抑えることができる凍結保存容器を提供する。　採精された精子を凍結保存するための凍結保存容器（１）である。　そして、底部（２ｂ）を有して上端が開口（２ａ）された円筒状の本体部（２）と、本体部の開口を塞ぐための蓋部（１１）と、本体部の内空に対して底部側から開口側に向けて窪むように設けられる中空凸部（２１）とを備えている。　ここで、中空凸部の頂部（２１１）は、本体部の高さ方向の上半部に位置するようにする。例えば、中空凸部の頂部の位置（液体容量V2）で、本体部の液体容量V1の70％以上が収容されるようにする。

Description

凍結保存容器
　本発明は、採精された精子を凍結保存するための凍結保存容器に関するものである。
　人工授精（AIH：Artificial Insemination of Husband）、体外受精（IVF：In Vitro Fertilization）、顕微授精（ICSI：Intracytoplasmic sperm injection）などの生殖補助医療（ART：Assisted Reproductive Technology）では、採精容器によって精子を採取することが行われている。
　通常、医療機関では、精子検査や所定の処置を行うまでの間、患者の精液を採精容器に収容した状態で保管している。一方、特許文献１に開示されているように、採取した精子を凍結保存することによって、長期間にわたって精子の劣化やエイジング（老化）を抑えることも行われている。
　すなわち、液体窒素などの冷媒を使用して、凍結保存容器に収容された精子を急速凍結して極度に低い温度で保存させることで、時間的に制限のない保存が可能となる。そして、時機が到来した際に凍結保存容器ごと解凍し、生殖補助医療における受精着床に使用する。この解凍後の精子の運動性によって、不妊治療の成功率は影響を受けることになる。
特開２００７－１６１３０７号公報
　しかしながら、特許文献１に開示されているような円筒状で内空断面が長さ方向に一定の凍結保存容器は、容器壁面近くの部分では凍結するが、中心部がシャーベット状になるなど凍結効率が低く、解凍後に生殖医療に使用可能な精子数が大幅に減ることが判明した。特に、凍結保存容器の管の直径が大きくなり液体窒素に触れる面との距離が大きくなると、劣化の傾向は強くなる。
　そこで、本発明は、凍結効率が良く、凍結保存による精子の運動性の低下を抑えることができる凍結保存容器を提供することを目的としている。
　前記目的を達成するために、本発明の凍結保存容器は、採精された精子を凍結保存するための凍結保存容器であって、底部を有して上端が開口された円筒状の本体部と、前記本体部の前記開口を塞ぐための蓋部と、前記本体部の内空に対して底部側から開口側に向けて窪むように設けられる中空凸部とを備えていることを特徴とする。
　ここで、前記中空凸部の頂部は、前記本体部の高さ方向の上半部に位置する構成とすることが好ましい。例えば、前記中空凸部の前記頂部の位置で、前記本体部の液体容量の70％以上が収容されるようにする。
　また、前記本体部は前記底部に向けて先細る形状に形成されるとともに、前記中空凸部は前記本体部の前記開口に向けて先細る形状に形成されている構成とすることができる。さらに、前記本体部の内周面と前記中空凸部との隙間はピペットの先端の径よりも大きくなるように設定することが好ましい。そして、前記本体部の前記底部より下方に延びる円環状の高台部を備え、前記高台部の下端開口と前記中空凸部の内空とが連通している構成とすることができる。
　このように構成された本発明の凍結保存容器は、円筒状の本体部の内空に対して底部側から上端側に向けて窪むように中空凸部が設けられている。すなわち、液体窒素などの冷媒やそれにより発生する冷気は、本体部の外周面に接触するだけでなく、中空凸部の内空にも入り込んで、中心側からも収容液を冷却する。
　このため、凍結効率が良く、凍結保存液などの収容液の全体が均等に短時間で凍結されることになって、凍結保存による精子の運動性の低下を抑えることができる。要するに、本体部の底部側に設けられる高台部の下端開口から中空凸部の内空に向けて、冷媒や冷気を効率よく取り込むことができる。
　また、中空凸部の頂部が本体部の高さ方向の上半部に位置する構成であれば、収容液の大半が本体部の中心側から冷却されるようになる。特に、中空凸部の頂部位置で本体部の液体容量の70％以上が収容されるようになっていれば、凍結保存による精子の運動性の低下を大幅に抑えることができる。
　さらに、本体部が底部に向けて先細る形状に形成されるとともに、中空凸部が本体部の開口に向けて先細る形状に形成されていれば、収容液を本体部に入れやすいうえに、収容液を取り出す際に、本体部と中空凸部との隙間にピペットの先端を挿入しやすくなる。
本発明の実施の形態の凍結保存容器の構成を説明する断面図である。 蓋部が装着された状態の凍結保存容器の構成を説明する斜視図である。 蓋部を外した状態の凍結保存容器の構成を説明する斜視図である。 採精容器による採精状況を模式的に示した説明図である。 採精容器から精子を回収する処置を示した説明図である。 凍結保存容器を冷却する処置を示した説明図である。 解凍後の凍結保存容器から収容液を回収する処置を示した説明図である。 複数の検体を使って、凍結保存による精子運動率の変化を確認した実験結果を説明するグラフである。
　以下、本発明の実施の形態について図面を参照して説明する。図１は、本実施の形態の凍結保存容器１の構成を説明する断面図である。また、図２及び図３は、蓋部が装着された状態と外した状態の凍結保存容器の構成を説明する斜視図である。
　不妊原因は、女性側、男性側の双方に原因があり得るが、男性不妊症の患者の場合、精液検査の所見が基準値を下回る場合が多い。男性が受ける検査としては、造精機能を調べる目的の標準精液検査、精子機能を調べる目的の高度精子機能検査1などがある。標準精液検査では、WHOラボマニュアル基準に基づいて総運動率が検査項目となり、40％以上が正常を示す基準値となる。この他にも男性が受ける検査項目には、精液量、精子濃度、総精子数、前進運動率、正常精子形態率、白血球数、高度精子機能検査2（ORP検査（酸化ストレスレベル））などがある。
　そして、精子の運動性が低い場合は、精子無力症と診断される。精子無力症とは、精子運動率が40%以下、前進運動率が32％以下のことをいう。健常男性の精子運動率は、通常60％－80％で、この運動率が低下すると受精能が落ちると言われている。
　一方、採取した精子を、すぐに生殖補助医療に使用せずに凍結保存をし、時機が到来した際に解凍して、生殖補助医療に使用することがある。この凍結保存は、場合によっては保存期間が長期になることもあるが、凍結保存による精子の劣化やエイジング（老化）は極力、抑えられることが好ましい。
　凍結保存をする場合は、液体窒素などの冷媒を使用して、凍結保存容器１に収容された採精された精子を急速凍結させる。本実施の形態の凍結保存容器１は、図１に示すように、円筒状の本体部２と、本体部２の開口２ａを塞ぐための蓋部１１と、本体部２の中心に設けられる中空凸部２１とを備えている。また、本体部２の底部２ｂより下方に延びる円環状の高台部２２が設けられる。
　本体部２は、底部２ｂを有して上端が開口２ａされた円筒状に形成される。さらに好ましくは、本体部２は、底部２ｂに向けて先細る形状に形成される。例えば、開口２ａの直径D1を10mm程度にした場合に、底部２ｂの直径D2を9mm程度にする。
　蓋部１１は、本体部２の上端にねじ込むことで装着される。本体部２の上端面と蓋部１１との間には、シール材１２が介在される。図３に示すような上端部にネジ溝が設けられた本体部２の開口２ａに対して、収容液を収容した後に蓋部１１を装着して開口２ａを塞ぐと、図２に示すような凍結保存が可能な状態になる。
　そして、本実施の形態の凍結保存容器１には、本体部２の内空に対して底部２ｂ側から開口２ａ側に向けて窪むように中空凸部２１が設けられる。中空凸部２１の内空は、図１に示すように、高台部２２の下端開口と連通している。すなわち、本体部２の外周面と中心（軸心）側とを、温度などが同じ状態の液体窒素などの冷媒や空気（冷気）に接触させることができる。
　底部２ｂ側から開口２ａに向けて隆起するように形成される中空凸部２１は、本体部２の開口２ａに向けて先細る円錐状に形成されていることが好ましい。すなわち、中空凸部２１の底部２ｂ側の直径D4より中空凸部２１の頂部２１１の直径D3を小さくする。
　この凍結保存容器１の本体部２には、精子が混和された凍結保存液が収容液として収容される。すなわち収容液は、本体部２の底部２ｂから、本体部２の内周面と中空凸部２１との間の断面環状の隙間に充填され、中空凸部２１の頂部２１１より上方では、本体部２の断面円形の内空に充填される。
　例えば、上端（開口２ａ）の直径D1を10.4mm、底部２ｂの直径D2を9.3mm、高さH2が2.0mmの高台部２２を含めた高さH1が28.0mmで、肉厚が0.6mmの本体部２及び中空凸部２１を成形する。この本体部２の上端での液体容量V1は1.0cc、中空凸部２１の頂部２１１の位置での液体容量V2は0.7ccとなる。すなわち、中空凸部２１の頂部２１１の位置で、本体部２の液体容量V1の約70％、または70％以上の収容液が収容できるようにする。
　凍結保存容器１には、検体の取り違えを防ぐために、図２に示すようなラベル部１３が設けられる。ラベル部１３には、患者の識別情報や採取日などの情報が印字やシールなどによって付与される。
　次に、本実施の形態の凍結保存容器１の使用方法について、採精から順を追って説明する。採精容器３は、図４に示すように、精子Ｓを収容する貯留部３１を有する容器本体３２と、採精後に貯留部３１を密閉空間にするための内蓋３３とを備えている。
　容器本体３２は、精子Ｓを収容する円錐状の内容器３２１と、内容器３２１の周囲を被覆する円筒状の外容器３２２とが一体に成形されている。内容器３２１は、上方の投入口が漏斗状に広がっているので、採精が行いやすい。
　一方、内蓋３３も、ポリプロピレンによって截頭円錐状に成型されている。内容器３２１のテーパー部分（截頭円錐形部分）の内周面と、内蓋３３の外周面とは、ほぼ同じ形状であり、容器本体３２の軸線に対するテーパー部分の傾斜角度は、10°から30°程度にすることができる。
　貯留部３１は、内容器３２１の下部と内蓋３３の底面に囲まれた空間が該当する。すなわち、内容器３２１において円筒状に形成される貯留部３１より上部の截頭円錐状の内周面には、内蓋３３の外周面が密着し、内蓋３３の底面は、貯留部３１の天井面となる（図５参照）。
　ここで、精子（精液）の１回の採精量は、3cc-10cc程度であることから、貯留部３１の容積も、10ccより少し大きくなる程度に形成されていればよい。また、内容器３２１の内周面及び貯留部３１の内面は、精液が壁面に付着しにくく流れ落ちやすくなるように、鏡面加工が施されている。容器本体３２が透明又は半透明であれば、精子Ｓが貯留部３１に収容されていることや採精量を、患者自身が目視で簡単に確認することができる。
　そして、内容器３２１の容積を小さくするように、内容器３２１の内部に挿入される内蓋３３の上縁には、容器本体３２の上縁に設けられたネジ溝と噛み合うネジ溝を有する把持部３３１が設けられる。患者は、採精後に素早く上蓋が付いた状態の内蓋３３を容器本体３２に嵌め合わせて、ねじ込むことで容器本体３２に内蓋３３をしっかりと固定する。こうすることで、採精後の精子Ｓが空気に接触することがなくなり、酸化による精子Ｓの劣化を抑制することができる。
　すなわち、この把持部３３１のネジ溝を、容器本体３２のネジ溝にねじ込むと、容器本体３２に対して内蓋３３がしっかりと固定され、底のある円筒状の貯留部３１と内蓋３３の底面とに囲まれた空間に封入された精子Ｓは、空気に触れたり漏れたりすることなく医療機関まで運搬される。
　図５は、採精容器３から精子Ｓを回収する処置の状況を示した説明図である。貯留部３１となる内容器３２１の底部の中央には、回収部３１１が設けられている。回収部３１１は、精子Ｓを回収するシリンジ５の針５１（カヌラ）によって穿孔しやすいように形成された円形の薄肉部である。回収部３１１は、例えば直径1mm程度で、厚さ0.1mm程度に周囲より薄肉にして形成されている。
　そこで、シリンジ５の針５１を貯留部３１の回収部３１１に挿し込んで、貯留部３１に収容された精子Ｓをシリンジ５に回収する。この際、内蓋３３は嵌めたままの状態で良いので、精子Ｓと外気との接触を避けることができ、精子Ｓの酸化やゴミ等の侵入を防ぐことができる。
　シリンジ５によって回収された精子Ｓは、スピッツ管に移された後に、洗浄処理が行われる。続いて、遠心による濃縮やswim up法などの精子調製法を用いて良質な精子Ｓを選別して回収する。なお、これらの採精された精子Ｓに対する処置は、凍結保存後に解凍してから行うこともできる。
　回収された良質な精子Ｓは、凍結保存液と混和させる。要するに、結晶化した水分が精子Ｓを損傷することを防ぐために、精子凍結保存液（Sperm Freezing medium）と混和させる。
　このようにして凍結保存液と精子Ｓとが混和された精子含有液体が、本実施の形態の凍結保存容器１に収容される収容液となる。図３に示すように蓋部１１が外された本体部２の開口２ａから、ピペット４（図７参照）などを使って収容液を注入する。
　本体部２への注入は、精子Ｓと凍結保存液とを別々に行い、本体部２内で混和させることもできる。本体部２には、頂部２１１の位置を目安にして、0.7ccから1.0ccの収容液が収容される。収容後は、本体部２の開口２ａを、蓋部１１をねじ込むことによって塞ぐ（図２参照）。
　本体部２の側面のラベル部１３には、収容液の注入前、又は蓋部１１を装着した後に、患者の名前や識別番号などの識別情報や採取日などの情報が記入される。これによって検体の取り違えを防ぐことができる。ラベル部１３は、本体部２の広い外周面を利用して設けられるので、多くの情報を記入することができる。
　凍結保存容器１の凍結は、複数本に対して同時に行うことができる。例えば、図６に示すように、１本の凍結用のケーン６に6個の凍結保存容器１をセットして、凍結のための処理を行うことができる。
　凍結処理を行う際には、いきなりマイナス196℃の窒素タンクに凍結保存容器１がセットされたケーン６を投入して凍結させるのではなく、徐々に冷却するのが好ましい。図６は、液体窒素７１の気相による冷却処理を、模式的に示した図である。
　例えば発泡スチロールなどの貯留箱７に液体窒素７１などの冷媒を溜めて、そこから立ち上る液体窒素７１の2℃から5℃程度の冷気に、ケーン６に装着された凍結保存容器１を当てることで、精子Ｓを含む収容液を徐々に冷却する。こうすることで、精子Ｓへの凍結によるダメージを軽減することができる。
　この冷却の際には、本体部２の外周面が冷気によって冷却されるだけでなく、中心に設けられた円錐状の中空凸部２１の内空にも冷気が入り込んで、効率的に収容液を冷却することができる。
　なお、図６はあくまでイメージ図で、実際の処置方法を示しているわけではない。例えば、冷却によって簡易凍結が始まる場合は、蓋部１１が上になるような向きにケーン６をして、収容液が底部２ｂから溜まった状態で凍結させる必要がある。
　液体窒素７１の気相による冷却処理を行った凍結保存容器１は、凍結保存用のケーン６に装着された状態でマイナス196℃の液体窒素が貯留された蓋付きの窒素タンク（図示省略）に投入され、保管される。
　この際も、本体部２の外周面だけでなく、中心に設けられた円錐状の中空凸部２１の内空にも液体窒素が入り込んで、収容液が効率的かつ均等に凍結されることになる。マイナス196℃の極度に低い温度では、精子Ｓが劣化や加齢することがないので、凍結保存には時間的な制限がない。
　凍結保存された精子Ｓを生殖補助医療に使用する時機が到来した際には、ラベル部１３に印字された情報から該当する凍結保存容器１を選んで窒素タンクから取り出し、30℃から35℃程度の微温湯に浸して、振りながら融解させる。
　このようにして凍結保存容器１の収容液を解凍させた後に、蓋部１１を外して、図７に示すように、ピペット４の先端を本体部２の中に挿し込み、保存された精子Ｓを含有する収容液を吸い上げることで採取する。
　凍結保存容器１の本体部２は、底部２ｂに向けて先細りする形状になっているが、中空凸部２１は、本体部２の開口２ａに向けて先細りする形状になっているので、本体部２の内周面と中空凸部２１との間には、保存された精子Ｓの採取に使用されるピペット４の先端を通すだけの隙間が確保されている。例えば、3mmから4mm程度の隙間となるように、本体部２及び中空凸部２１は製作されている。
　このため、ピペット４の先端を本体部２の底部２ｂまで到達させて、収容液の全量を吸い上げることができる。吸い上げられた精子Ｓを含有する収容液は、スピッツ管に移され、人工授精（AIH）、体外受精（IVF）、顕微授精（ICSI）などの生殖補助医療（ART）に使用される。
　続いて、本実施の形態の凍結保存容器１によって凍結保存された精子Ｓが受けた影響を確認するために行った実験について説明する。実験では、凍結前と解凍後の精子Ｓの精子運動率（％）の変化を調べた。
　また、本実施の形態の凍結保存容器１（実施例１）の効果を確認するために、比較例による実験も行った。比較例として使用した容器は、従来から使用されている円筒状の保存容器で、本実施の形態の凍結保存容器１の中空凸部２１に該当する構成がない、一定の太さ（直径）の円筒容器である。詳細には、高さ29.0mm、直径12.0mmの円筒形で、液体容量が1.2ccとなる保存容器を使用した。
　一方、実施例１として使用した凍結保存容器１は、図１を参照しながら説明すると、高さH1が28.0mm、上端の直径D1が10.4mm、底部２ｂの直径D2が9.3mm、肉厚が0.6mmである。本体部２の液体容量V1は上端で1.0ccとなるが、実験では中空凸部２１の頂部２１１の位置となる液体容量V2が0.7ccとなる範囲内で使用した。
　実験には、5体の検体（Ａ－Ｅ）を使用した。凍結前の検体（Ａ－Ｅ）の精子運動率は、58.7％から68.5％であった。これらの検体（Ａ－Ｅ）を、実施例１の凍結保存容器１と、比較例の保存容器にそれぞれ注入し、上述したような凍結処理を施して、一定期間、窒素タンクの中で凍結保存した後に、取り出して解凍した。
　その結果、実施例１の凍結保存容器１で凍結保存した精子Ｓの精子運動率は、56.4％から63.0％であった。一方、比較例の保存容器で凍結保存した精子Ｓの精子運動率は、29.4％から41.1％であった。図８は、この凍結保存による精子運動率の変化を、変化率として示した棒グラフである。
　この棒グラフを見ると分かるように、実施例１の凍結保存容器１で凍結保存した精子Ｓの精子運動率は、凍結前と凍結後で比較して、ほとんど変化していないことがわかる。具体的には、変化率は92.0％から96.0％の範囲に収まり、凍結保存による精子運動率の低下は、10%以下に抑えられていることがわかる。
　これに対して比較例の保存容器で凍結保存した精子Ｓの精子運動率は、凍結前と凍結後で比較して、半減していることがわかる。具体的には、変化率は51.0％から60.0％の範囲となり、いずれの検体（Ａ－Ｅ）についても、大幅な精子運動率の低下がみられる。
　上述したように超低温の窒素タンクで凍結保存している間には、精子Ｓの劣化は生じないと考えられるので、こうした結果となった原因として、凍結に至るまでの状態の変化の違いがあるものと推定できる。
　すなわち、実施例１の凍結保存容器１は、中空凸部２１を有しているため、本体部２に収容された収容液の全体が、効率よく均等に凍結されることになって、凍結に至るまでの段階での精子Ｓの劣化を抑えることができたと推測できる。
　これに対して比較例の保存容器を使用した場合は、保存容器の外周面に隣接する部分に比べて中心部の凍結が遅く、シャーベット状になっている時間が長くなるので、その間に精子Ｓの劣化が進行するものと推測できる。この結果、解凍後に生殖医療に使用可能な精子数が大幅に減ることは、上記背景技術で説明した通りである。
　次に、本実施の形態の凍結保存容器１の作用について説明する。
　このように構成された本実施の形態の凍結保存容器１は、円筒状の本体部２の内空に対して底部２ｂ側から上端の開口２ａ側に向けて窪むように中空凸部２１が設けられている。すなわち、液体窒素などの冷媒やそれにより発生する冷気は、本体部２の外周面に接触するだけでなく、中空凸部２１の内空にも入り込んで、中心側からも収容液を冷却する。
　このため、凍結効率が良く、凍結保存液などの収容液の全体が均等に短時間で凍結されることになって、凍結保存による精子の運動性の低下を抑えることができる。要するに、本体部２の底部２ｂ側に設けられる高台部２２の下端開口から中空凸部２１の内空に向けて、冷媒や冷気を効率よく取り込むことができる。
　また、中空凸部２１の頂部２１１の位置が、本体部２の高さ方向の上半部に位置する構成であれば、収容液の大半が本体部２の中心側から冷却されるようになる。特に、中空凸部２１の頂部２１１の位置で本体部２の液体容量V1の約70％、または70％以上が収容されるようになっていれば、凍結保存による精子の運動性の低下を大幅に抑えることができる。
　さらに、本体部２が底部２ｂに向けて先細る形状に形成されるとともに、中空凸部２１が本体部２の開口２ａに向けて先細る形状に形成されていれば、収容液を本体部２に入れやすいうえに、収容液を取り出す際に、本体部２と中空凸部２１との隙間にピペット４の先端を挿入しやすくなる。これによって、収容液の全量を、容易に吸い上げることができる。
　以上、図面を参照して、本発明の実施の形態を詳述してきたが、具体的な構成は、この実施の形態に限らず、本発明の要旨を逸脱しない程度の設計的変更は、本発明に含まれる。
　例えば、前記実施の形態では、底部２ｂに向けて先細る形状の本体部２について説明したが、これに限定されるものではなく、高さ方向に一定の太さ（直径）の本体部であってもよい。また、中空凸部２１についても、高さ方向に一定の太さ（直径）のものであってもよい。
［関連出願への相互参照］
　本出願は、2021年10月4日に日本国特許庁に出願された特願2021-163667に基づいて優先権を主張し、その全ての開示は完全に本明細書で参照により組み込まれる。

Claims (6)

  1. 　採精された精子を凍結保存するための凍結保存容器であって、
    　底部を有して上端が開口された円筒状の本体部と、
    　前記本体部の前記開口を塞ぐための蓋部と、
    　前記本体部の内空に対して底部側から開口側に向けて窪むように設けられる中空凸部とを備えていることを特徴とする凍結保存容器。
  2. 　前記中空凸部の頂部は、前記本体部の高さ方向の上半部に位置することを特徴とする請求項１に記載の凍結保存容器。
  3. 　前記中空凸部の前記頂部の位置で、前記本体部の液体容量の70％以上が収容されることを特徴とする請求項２に記載の凍結保存容器。
  4. 　前記本体部は前記底部に向けて先細る形状に形成されるとともに、前記中空凸部は前記本体部の前記開口に向けて先細る形状に形成されていることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の凍結保存容器。
  5. 　前記本体部の内周面と前記中空凸部との隙間はピペットの先端の径よりも大きいことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の凍結保存容器。
  6. 　前記本体部の前記底部より下方に延びる円環状の高台部を備え、前記高台部の下端開口と前記中空凸部の内空とが連通していることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載の凍結保存容器。
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