CN110521720A - 一种超低温冷冻及封闭式保存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种超低温冷冻及封闭式保存方法，其包括如下步骤：1)提供一具有开口的无菌容器；2)将所述无菌容器置于初始冷源中，且所述无菌容器开口的高度高于所述初始冷源的液面层；3)在所述无菌容器中形成液化气体，作为无菌制冷剂；4)将承载在载体上的待冷冻样品置于所述无菌制冷剂中进行玻璃化冷冻；5)密封所述无菌容器，并将所述密封无菌容器与密封在其中的玻璃化冷冻样品一起超低温保存。
Description
技术领域
本发明涉及生物样品保存领域，尤其涉及一种超低温冷冻及封闭式保存方法。
背景技术
医学、生命科学(包括辅助生殖)、食品、化工等领域均需要用到超低温保存。超低温保存需要使用冷源，冷源包括但不限于液氮等常规制冷剂。
以人辅助生殖领域为例，该领域需要进行胚胎、卵子等细胞样本的冷冻保存，液氮是主要的冷源。玻璃化冷冻因为降温速率快(20,000℃/min以上)、复苏存活率高(≥95％)成为目前人胚胎和卵子冷冻的主要方法。然而，玻璃化冷冻技术潜在的污染风险一直困扰着辅助生殖从业人员。在玻璃化冷冻过程中，需要将装载在冷冻载杆上的胚胎样本与液氮等冷源直接接触。这是因为，只有直接接触液氮才能达到超快速降温，从而保证复苏存活率。而市售液氮等冷源在生产、运输以及液氮罐等其他储存罐内长期保存等环节均有可能被细菌、病毒、真菌等病原微生物污染。致病微生物可以耐受低温并在复苏后具有污染和交叉感染风险，所以开放式玻璃化冻存的胚胎具有潜在的污染风险。为了避免污染或交叉污染，封闭式拉细麦管(CPS，closed pulled straws)、麦管套麦管(straw-in-straw)和Rapid-i等封闭式玻璃化冷冻方法被应用于辅助生殖临床，但存活率欠佳，未能广泛使用。CPS、麦管套麦管和Rapid-i等封闭式玻璃化冷冻方法均是将装载胚胎的冷冻载体插入外套管封闭后再投入液氮实现样本冻结，降温速率慢(仅约2,000℃/min左右)，导致解冻存活率低。
中国专利(申请号201720870512.2)提供一种在液氮工厂生产无菌液氮的设备和方法。虽然生产的液氮无菌，但液氮在运输、储存和使用过程中维持无菌的状态极其困难。而且，细菌或病毒感染患者的胚胎还可能在液氮罐内间接将病原传递给其他“健康”胚胎，导致胚胎发生交叉感染。
因此，亟需一种既能快速降温，又能避免冷源对样品污染的保存方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种超低温冷冻及封闭式保存方法，其能够按照开放式载体的操作方法实现生物样本的无菌保存，彻底避免开放式载体玻璃化冷冻的污染或交叉污染风险，并且不影响降温速率、不会降低胚胎存活率。
为了解决上述问题，本发明提供了一种超低温冷冻及封闭式保存方法，其包括如下步骤：
1)提供一具有开口的无菌容器；
2)将所述无菌容器置于初始冷源中，且所述无菌容器开口的高度高于所述初始冷源的液面层；
3)在所述无菌容器中形成液化气体，作为无菌制冷剂；
4)将承载在载体上的待冷冻样品置于所述无菌制冷剂中进行玻璃化冷冻；
5)密封所述无菌容器，并将所述密封无菌容器与密封在其中的玻璃化冷冻样品一起超低温保存。
在一个优选的实施方案中，所述无菌容器的开口高于所述初始冷源所形成的蒸汽层。
在一个更优选的实施方案中，所述初始冷源是液氮、液氦或者其他超低温冷源。
在一个更优选的实施方案中，所述无菌容器是管状容器；在更优选的实施方案中，所述管状容器一端开口；在更优选的实施方案中，所述管状容器具有侧面开口；在更优选的方案中，在需要插入初始冷源液面的一端，由密度较大的材料制得或放置有密度较大的物体，以使该管状容器能插入初始冷源液面以下；在更优选的实施方案中，所述管状容器的主体部分是圆柱形；在更优选的实施方案中，所述管状容器的内径为1mm至30mm，优选1.5mm至20mm，更优选2mm至10mm，更优选为2.5mm至6mm，更优选为3至5mm，更优选为3.5至4.5mm；在更优选的实施方案中，所述管状容器的长度为2cm至40cm，优选5cm至30cm，更优选10cm至29cm，更优选为14cm至28cm，最优选为14cm或28cm。在一个更优选的实施方案中，所述管状容器在密封后的长度不变。
所述无菌容器在使用前预先经过无菌处理，例如，经过高温、紫外线和/或环氧乙烷等处理。所述无菌容器的材质包括但不限于金属、塑料、泡沫、玻璃等。
在另一个优选的实施方案中，所述无菌容器在开口处装有空气无菌滤器，外部气体通过滤器净化后进入该无菌容器中，并在容器外部初始冷源的作用下液化形成无菌冷源。在更优选的实施方案中，所述空气无菌滤器包含0.22μm或0.45μm孔径的滤膜。
在另一个优选的实施方案中，上述步骤5)中的超低温保存是指将所述密封无菌容器与密封在其中的玻璃化冷冻样品一起置于液氮、液氦或其他超低温冷源中保存。
在另一个优选的实施方案中，密封所述开口的方法包括但不限于超声封口、螺旋封口或热封口；在更优选的实施方案中，在密封所述开口前还包括除去空气无菌滤器的步骤。
在另一个优选的实施方案中，在密封所述开口步骤之前还包括去除所述开口处湿气或雾气的步骤。
在另一个优选的实施方案中，所述承载待冷冻样品的载体是冷冻载杆；在更优选的实施方案中，所述冷冻载杆包括样品承载端、手持端和位于所述样品承载端和手持端之间的连接部分。
在另一个优选的实施方案中，所述冷冻样品包括但不限于人类或动物的胚胎、合子、卵子、精子、组织(如卵巢组织、睾丸组织等)等需要长期冷冻保存的细胞或组织。
本发明还提供了用于上述超低温冷冻及封闭式保存方法的套件，其包含：具有一开口的无菌容器；以及可置于所述无菌容器中的冷冻载体，用于承载需要冷冻的样品。
在一个更优选的实施方案中，所述无菌容器是管状容器；在更优选的实施方案中，所述管状容器一端开口；在更优选的实施方案中，所述管状容器具有侧面开口；在更优选的方案中，需要插入初始冷源液面的一端由密度较大的材料制得或放置有密度较大的物体，以使该管状容器能插入初始冷源液面以下，而不易漂浮；在更优选的实施方案中，所述管状容器的主体部分是圆柱形；在更优选的实施方案中，所述管状容器的所述管状容器的内径为1mm至30mm，优选1.5mm至20mm，更优选2mm至10mm，更优选为2.5mm至6mm，更优选为3至5mm，更优选为3.5至4.5mm；在更优选的实施方案中，所述管状容器的长度为所述管状容器的长度为2cm至40cm，优选5cm至30cm，更优选10cm至29cm，更优选为14cm至28cm，最优选为14cm或28cm。在一个更优选的实施方案中，所述管状容器在密封后的长度不变。
在本发明优选实施方案中，所述无菌容器外部的空气为经过其他净化设备净化过的空气，本发明对净化方式不进行限定。在另一个优选的实施方案中，所述无菌容器在开口处装有空气无菌滤器。在更优选的实施方案中，所述空气无菌滤器包含0.22μm或0.45μm孔径的滤膜。
在其中的一个实施方案中，所述管状容器可以被密封。本发明并不对密封方式进行限定。密封方式可以包括但不限于螺旋封口、热封口、超声封口等，只要在冷冻载杆插入外套管后，能够实现开口处的封闭即可。在一优选方案中，所述外套管开口可用超声封口机封口。在另一个优选的实施方案中，所述管状容器的开口位于其中一端，当承载有样品的冷冻载体置于所述内腔中，所述开口被锁合，以使所述外套管密闭；在更优选的实施方案中，在所述开口的内侧壁设置有一内螺纹或者在所述开口的外侧壁设置有一外螺纹，以螺帽与所述内螺纹或者所述外螺纹配合，以密封所述内腔；在更优选的实施方案中，所述开口的侧壁具有至少一朝向所述密封部中心延伸的切口，所述开口的侧壁以所述切口为分界线贴合，以使所述开口被锁合；在更优选的实施方案中，所述开口的侧壁上具有两个朝向所述密封部中心延伸的切口，两个所述切口对称设置，所述开口的侧壁以所述切口为分界线贴合，以使所述开口被锁合。
在另一个优选的实施方案中，所述管状容器的开口位于靠近其中一端的侧面；在更优选的实施方案中，在所述管状容器一端的端面或侧面设置有标贴，用于标记所述冷冻载体承载的样品的信息。
在优选的实施方案中，所述承载待冷冻样品的载体是冷冻载杆；在更优选的实施方案中，所述冷冻载杆包括样品承载端、手持端和位于所述样品承载端和手持端之间的连接部分。
本发明的优点在于：
1)在无菌容器中制得的无菌制冷剂的温度可以达到-195℃，能够满足液氮工作场景所需要的超低温(液氮温度-196℃)；
2)既可以实现“封闭式载体”无菌、无交叉污染风险的长期超低温保存，在玻璃化冷冻时又可以达到“开放式载体”的超快速降温(降温速率≥20,000℃/min)，复苏存活率和“开放式载体”相同(存活率≥95％)；以人第三天胚胎为例，复苏存活率大于99％。
3)玻璃化冷冻完成后，可以将完成冷冻的样品直接密封于外套管内，解冻时从液氮罐内取出外套管，外套管一次性使用，使用后即可丢弃，这样带来的技术效果包括：第一，公知的胚胎冷冻外套管一般放置3根以上冷冻载杆，胚胎解冻(一次解冻一根)后需将外套管重新放回液氮罐，本发明为一次性使用套装，避免了样品取放过程中的再次污染等问题；第二，本发明一次性使用的外套管胚胎解冻后即可丢弃，释放了液氮罐空间，增加了液氮罐的空间使用率2倍以上；第三，本发明套装解冻后丢弃，彻底避免了公知外套管解冻后放回液氮罐内位置放错的情况发生。
4)本发明制备液态空气用于细胞玻璃化冷冻，可以做到即制即用，不受场地、时间和其他制备条件的限制。
在本发明的实施方案中，创造性地将无菌制冷剂的制备、玻璃化冷冻以及超低温储存在同一个容器中进行，并取得了预料不到的技术效果。为实施这一方案，本发明设计了专用于本发明的套件，其包含具有一开口的无菌容器；以及可置于所述无菌容器中的冷冻载体，用于承载需要冷冻的样品；冷冻载体装载胚胎后置于无菌容器内，利用无菌容器内已经制得的无菌液态空气(-195℃)实现玻璃化冻结；再将无菌容器(即外套管)封闭，整体置于液氮罐内长期保存。在本发明中，无菌容器的尺寸是关键的因素之一。如果容器太大，大体积无菌容器制备制冷剂需要的时间久，且更难以保证进入容器的空气是无菌的，从而难以保证制得的无菌制冷剂符合无菌要求。另一方面，如果容器太小不能容纳冷冻载杆也无价值，且太小的无菌容器制备的无菌制冷剂的量达不到要求，也无法实现快速玻璃化冷冻，从而无法实现本发明目的。经过发明人的反复实验验证，得到了本发明实施方案中的尺寸。
本发明超低温冷冻及封闭式保存方法提供一种简单、方便的采用无菌制冷剂冷冻及保存样品的方法。其可应用在辅助生殖领域内生物样本(胚胎、卵子、精子等)的长期超低温无菌保存。另外，其应用并不局限于辅助生殖领域，食品、化工、医学、生命科学等需要用到超低温保存(如液氮保存)或超低温治疗(如冷冻消融)的领域均可使用该方法自制无菌或洁净液态空气。
本发明还提供以本发明的方法制备的无菌液态空气作为冷源实现胚胎长期无菌保存的实施方案，包括如下步骤：将一外套管作为无菌容器，其中，外套管可以是金属材质，如医用不锈钢，开口处设置精密螺旋，装载有胚胎的冷冻载杆投入外套管完成玻璃化冻结后，用对应的精密螺帽拧紧，实现螺旋式封口(内旋或外旋均可)，转移至常规液氮罐内长期保存，即可实现生物样本安全、无菌、无交叉污染的长期保存。所述外套管也可为塑料材质，此时除了螺旋式封口实现封闭外，还可以用超声封口机对开口处封口实现封闭。若封闭前，外套管开口处产生的水汽、雾气等不利于超声封口、热封口或螺旋封口，此时可采用热源靠近或无菌纱布擦拭开口处等方式去除水汽、雾气后再封口。其中，外套管需要封闭后保存在液氮罐内才能确保胚胎与液氮长期彻底隔绝，实现胚胎的无菌冷冻保存。此时尽管液氮罐内的液氮非洁净(市售液氮含有细菌、病毒、真菌等致病微生物)，但是胚胎是在无菌液态空气内玻璃化冻结并封闭后保存在液氮罐内，因此，外部非洁净的液氮并不会影响冻存的胚胎一直处于无菌状态。
更特别的，通过本发明的方法，彻底解决了目前配子和胚胎等生殖样本无菌保存的难题。
附图说明
图1是本发明超低温冷冻及封闭式保存方法的装置的立体示意图；
图2是本发明超低温冷冻及封闭式保存方法的装置的截面示意图；
图3是本发明无菌制冷剂污染测试结果。其中图3A是对照组血平板菌落生长情况；图3B是本发明制得的无菌制冷剂的血平板菌落生长情况。
具体实施方式
下面结合附图1及2对本发明提供的一种超低温冷冻及封闭式保存方法的具体实施方式做详细说明。
实施例1：制备无菌制冷剂
步骤1、提供一容器B。所述容器B为一敞口结构，其中所述容器B的敞口即为第二开口11。所述容器B的尺寸也可根据需求进行选择，本发明对此不进行限定。在本实施例中，所述容器B为长260mm*宽150mm*深115mm无盖泡沫箱。所述容器B内盛放有一初始冷源12。在本实施例中，所述容器B内盛放的所述初始冷源12为市售的液氮。所述初始冷源12具有一液态层12A及一位于所述液态层12A上方的蒸汽层12B，其中，所述蒸汽层12B为液态层12A的液体挥发形成。为了清楚显示两者的区别，在附图中采用不同的阴影线绘示所述液态层12A及所述蒸汽层12B。具体地说，所述容器B的深度是115mm，所述容器B内初始冷源12的液态层12A的深度为90mm，蒸汽层12B的厚度为25mm，即蒸汽层12B的厚度等于容器B的深度与液态层12A的深度之差。
步骤2、提供一无菌容器A，其具有一第一开口10。所述无菌容器A为塑料管，其内底部具有金属配重块；所述容器开口位于顶端。所述管状容器的直径(内径)分别为2.5mm、3.5mm、9.5mm和28mm(见下表1)。塑料管开口处与Millipore 0.22um滤器连接。
步骤3、将所述无菌塑料管(外套管)插在试管架后置于盛有液氮的泡沫盒(容器B)内，利用液氮冷却制得无菌液态空气。在进行的对比实验中，部分塑料管开口10的高度高于所述初始冷源12的蒸汽层12B，即所述开口10突出于所述蒸汽层12B的界面，其并未被所述蒸汽层12B覆盖(即无菌容器A开口处高于容器B的上沿)；而剩余部分塑料管开口10的高度低于所述初始冷源12的蒸汽层12B，但高于所述初始冷源12的液态层12A(即无菌容器A开口处位于液面层12A与容器B上沿之间的蒸汽层12B内)。在该步骤中，所述初始冷源12接触所述塑料管的外侧壁，使得所述塑料管内壁的温度与所述初始冷源12的温度无限接近，所述塑料管内的空气(主要是氮气和氧气)在该温度下会冷凝液化，则随着空气的液化，所述塑料管内会形成负压，外部空气或12B蒸汽层内的氮气会不断进入所述塑料管内，并液化，以形成无菌制冷剂13。其中，所述空气为经过净化的空气。
下表1为使用不同规格塑料管和开口处于不同位置时制得无菌制冷剂的情况。
表1：制备无菌制冷剂
从上表可看出，当塑料管开口在所述蒸汽层内时，制备制冷剂的效率较低，而所述开口高度高于所述蒸汽层时，能够大大提高无菌制冷剂的制备效率。这一效果是预料不到的。通常认为，液氮蒸汽层中仍然含有大量的氮气，如果塑料管的开口位于蒸汽层内，蒸汽层中的氮气能够进入塑料管中，从而更快速地在塑料管内形成制冷剂。然而，上述对比实验结果与此恰好相反。这有可能是因为蒸汽层中的液氮蒸汽阻挡了蒸汽层外部的空气，使得空气不能顺利进入塑料管中，降低了无菌制冷剂的制备效率。
此外，从上表中还可看出，制冷剂的制备效率与塑料管的直径密切相关。直径较小的塑料管能更快地制得深度满足玻璃化冷冻样品所需的制冷剂。更为重要的是，在塑料管放置在液氮中一定时间后，塑料管内的制得的制冷剂的量即达到平衡状态，不再增加。实际应用中，胚胎冷冻放在玻璃化冷冻平衡液内的时间一般为10分钟左右，而3.5mm内径的外套管10分钟即可产生40mm深度的液态空气，足以满足玻璃化冻结之需求。
实施例2：无菌制冷剂成分及温度测定
将实施例1中塑料管中制得的液态空气置于室温下，将气化后的空气导入已抽真空的铝箔袋中，气相色谱仪进样测制得液态空气中氮气的占比。气相色谱仪采用Agilent6890，配TCD检测器，碳分子筛填充柱，2m×2mmID，载气为氮气，载气流速：20mL/min，柱温40℃，运行时间5min。进样方式：气体阀进样，定量管体积1mL，充样时间0.5min，进样时间0.5min。
测定的结果是，制得的液态空气中，氮气含量约85.5％。超低温温度计测得液态空气的温度约-195℃。使用液态空气空作为制冷剂，就可以随时随地以液氮作为冷源，制备无菌制冷剂。
实施例3：无菌制冷剂污染测试
按实施例1所述制备无菌液态空气，用无菌棉签反复多次蘸取液态空气后，将棉签蘸取的标本(实验组)密涂于哥伦比亚血平板上，置35℃，5％CO2培养箱中培养48小时，观察细菌生长情况。取用于制备该无菌液态空气的初始冷源液氮10毫升做对照(对照组)。结果显示，对照组血平板上有黄色和灰白色两种菌落生长(图3A)，而实验组无菌落生长(附图3B)。进一步地，对实验组的两个菌落进行分离纯化，革兰染色和分子鉴定，结果显示黄色菌落细菌镜下为革兰阳性球菌，鉴定为Neomicrococcus aestuarii strain(七叶树新微球菌菌)；灰白色菌落细菌镜下为革兰阴性杆菌，鉴定为Moraxella osloensis(奥斯陆莫拉菌)。
实施例4：冷冻样品
实施例4.1一般步骤
步骤1、根据实施例1，使用液氮作为初始冷源，用内径为3.5mm直径的塑料管制备无菌制冷剂。其中所述塑料管开口高于所述液氮的蒸汽层。
步骤2、将一承载有冷冻样品的载体15投入所述无菌制冷剂13中进行玻璃化冷冻。在附图中采用虚线绘示所述承载有样品的载体15。在本实施例中，所述承载有样品的载体15是冷冻载杆。
步骤3、去除所述无菌容器开口10处的湿气或雾气的步骤。具体地说，制备无菌冷源过程中，在所述开口10处可能会有水汽等沉积，在密封所述开口10之前，需采用热源靠近开口10或无菌纱布擦拭第一开口10处等方式去除水汽，以便于密封所述第一开口10。
步骤4、密封所述无菌容器的开口10，并将密封的所述无菌容器A置于一含有制冷剂的存储罐中存储，以使得样品能够进行长期存储，待需要使用时再取出，解冻后使用。
实施例4.2冷冻胚胎
体外受精治疗中捐赠的(签署知情同意书)异常受精的day3胚胎经ES液(玻璃化冷冻平衡液)和VS液(玻璃化液)处理后，装载于冷冻载杆Strawtop。去除塑料管开口处连接的滤膜过滤器，将装载有胚胎的Strawtop直接投入制得的无菌液态空气中实现玻璃化冻结。采用三组研究，并检测冷冻后胚胎的解冻效果。
方法1：胚胎投入液态空气实现玻璃化冷冻后，即时解冻，观察复苏情况，即1次冷冻/解冻；
方法2：胚胎投入液态空气实现玻璃化冷冻后，即时解冻，存活的胚胎连续冷冻解冻3次观察复苏情况，即3次冷冻/解冻；
方法3：胚胎投入液态空气实现玻璃化冷冻后，用超声封口机将塑料外套管封闭，液氮罐内保存1周后解冻，观察复苏情况。
每组研究均设市售液氮为自制制冷剂(液态空气)的对照组。结果请参见表2，结果显示，以自制无菌液态空气和市售液氮作为制冷剂，三种方法玻璃化冷冻胚胎的存活率均为100％，方法1的卵裂球溶解率分别为1.3％和1.2％；方法2的卵裂球溶解率分别为0.8％和1.8％；方法3的卵裂球溶解率分别为0％和1.0％，不同制冷剂的胚胎存活率和卵裂球溶解率均无统计学差异。所以，采用本发明方法制备的无菌液态空气可以获得和液氮相同的胚胎存活率和卵裂球完整率。
表2液态空气玻璃化冷冻胚胎的存活率和卵裂球溶解率
实施例4.3保存稀少和单个精子
用超薄片(其结构请参见中国专利授权公告号CN 205143336 U)装载稀少/单个精子，液氮蒸汽熏蒸法冷冻，待冷冻液微滴冻结后，去除塑料管开口处连接的滤膜过滤器，将超薄片投入塑料管，超声封口机封闭塑料管，转移至液氮罐长期保存。此时尽管液氮罐内的液氮非洁净(市售液氮含有细菌、病毒、真菌等致病微生物)，但是精子是在无菌液态空气内封闭保存，所以可维持超低温无菌状态。
实施例5无菌容器实施例
实施例5.1 14cm长的无菌容器
所述管状容器总长度14cm，开口处位于离下端(需要插入液面一端)9cm处，开口长度2.5cm；在开口处下方留有用于封口机封闭的1cm长度，开口上方长度2.5cm标记用。在最下端具有1cm长度的金属重物。
开口上方2.5cm的标记部分可为中空或实心结构。为了增加整个管状容器的重量，本实施例采用实心结构，起类似于管底重物的作用，保存在液氮罐内时不容易浮起来。
实施例5.2 28cm长的无菌容器
所述外套管总长度为28cm，离下端(需要插入液面一端)9cm处，开口长度5cm；在开口处下方留有用于封口机封闭的1cm长度，开口上方长度14cm标记用。在最下端具有1cm长度的金属重物。
开口上方14cm的标记部分可为中空或实心结构。为了增加整个管状容器的重量，本实施例采用实心结构，起类似于管底重物的作用，保存在液氮罐内时不容易浮起来。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种超低温冷冻及封闭式保存方法，其包括如下步骤：
1)提供一具有开口的无菌容器；
2)将所述无菌容器置于初始冷源中，且所述无菌容器开口的高度高于所述初始冷源的液面层；
3)在所述无菌容器中形成液化气体，作为无菌制冷剂；
4)将承载在载体上的待冷冻样品置于所述无菌制冷剂中进行玻璃化冷冻；
5)密封所述无菌容器，并将所述密封无菌容器与密封在其中的玻璃化冷冻样品一起超低温保存。
2.根据权利要求1的超低温冷冻及封闭式保存方法，其中所述无菌容器的开口高于所述初始冷源所形成的蒸汽层。
3.根据权利要求1或2的超低温冷冻及封闭式保存方法，其中所述无菌容器是管状容器内径为1mm至30mm，优选1.5mm至20mm，更优选2mm至10mm，更优选为2.5mm至6mm，更优选为3-5mm，更优选为3.5至4.5mm；其长度为2cm至40cm，优选5cm至30cm，更优选10cm至29cm，更优选为14cm至28cm，最优选为14cm或28cm。
4.根据前述任一项权利要求的超低温冷冻及封闭式保存方法，其中所述无菌容器在开口处装有空气无菌滤器，外部空气通过滤器净化后进入该无菌容器中，并在容器外部初始冷源的作用下液化形成无菌冷源。
5.根据前述任一项权利要求的超低温冷冻及封闭式保存方法，其中所述冷冻样品是人类或动物的胚胎、合子、卵子、精子、组织，所述初始冷源是液氮、液氦或者其他超低温冷源。
6.根据前述任一项权利要求的超低温冷冻及封闭式保存方法，其中所述步骤5)中的超低温保存是指将所述密封无菌容器与密封在其中的玻璃化冷冻样品一起置于液氮、液氦或其他超低温冷源中保存。
7.用于根据前述任一项权利要求的超低温冷冻及封闭式保存方法的套件，其包含：具有一开口的无菌容器；以及可置于所述无菌容器中的冷冻载体，用于承载需要冷冻的样品。
8.根据权利要求7的套件，其中所述无菌容器是管状容器，内径为1mm至30mm，优选1.5mm至20mm，更优选2mm至10mm，更优选为2.5mm至6mm，更优选为3-5mm，更优选为3.5至4.5mm；其长度为2cm至40cm，优选5cm至30cm，更优选10cm至29cm，更优选为14cm至28cm，最优选为14cm或28cm。
9.根据权利要求7或8的套件，其中所述无菌容器在开口处装有空气无菌滤器，且所述无菌容器可以被密封。
10.根据权利要求7-9任一项的套件，其中所述承载待冷冻样品的载体是冷冻载杆。
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