WO2023055122A1 - 신생항원 마커 및 글로벌 dna 메틸화 마커를 이용한 면역항암제에 대한 치료 반응성 예측 방법 및 장치 - Google Patents

신생항원 마커 및 글로벌 dna 메틸화 마커를 이용한 면역항암제에 대한 치료 반응성 예측 방법 및 장치 Download PDF

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노승재
신인경
조대연
방효은
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주식회사 펜타메딕스
한국과학기술원
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Definitions

  • Immuno-anticancer drug or immuno-anticancer treatment is a treatment that activates the body's immune system to fight cancer cells, and a high cure rate can be expected in a patient group that responds, providing a new paradigm for anti-cancer treatment.
  • the actual treatment success rate of immuno-anticancer drugs such as anti-PD-1/anti-PD-L1
  • normal cells may also be affected by the increased activity and secretion of immune cells according to the application of immunotherapeutic agents, which may cause side effects.
  • TMB tumor mutation burden
  • PD-L1 PD-L1
  • Korean Patent Registration No. 2278586 discloses that the amount of neoantigens derived from survival-dependent genes can be used to predict the treatment prognosis of cancer patients.
  • Korean Patent Registration No. 2238912 discloses that the global DNA methylation level detected from samples of cancer patients can provide information for predicting responsiveness to immuno-anticancer treatment.
  • the present inventors discovered that simultaneously applying the number of neoantigens derived from cancer cell survival-dependent genes and the global methylation level is a biomarker that can predict the treatment responsiveness of cancer patients to immuno-anticancer agents with remarkably high accuracy.
  • the invention was completed.
  • An object of the present disclosure is to provide a method for predicting the responsiveness of cancer patients to immunotherapy from the amount and global methylation level of neoantigens derived from cancer cell survival-dependent genes.
  • Another object of the present disclosure is to provide a method for predicting a treatment prognosis for immunotherapy of cancer patients from the amount and global methylation level of neoantigens derived from cancer cell survival-dependent genes.
  • Another object of the present disclosure is to provide a device for predicting the responsiveness of cancer patients to immunotherapy from the amount and global methylation level of neoantigens derived from cancer cell survival-dependent genes.
  • One aspect of the present disclosure is
  • Information for predicting the responsiveness of a cancer patient to immuno-anticancer treatment including the step of evaluating the responsiveness of a cancer patient to immuno-anticancer treatment based on the information on the amount of the neoantigen and the information on the global DNA methylation level provide a way to provide
  • the responsiveness to immuno-anticancer treatment is high, and if the global DNA methylation level is low, the resistance to immuno-anticancer treatment is high, and therefore, the responsiveness can be judged to be low. there is. Specifically, the lower the global DNA methylation level, the more the activity of immune cells infiltrating cancer tissue is inhibited, and the expression level of immune response genes expressed in cancer cells is reduced.
  • the amount or number of neoantigens derived from cancer cell survival-dependent genes and the level of global DNA methylation were each found to be significantly correlated with the survival rate of cancer patients in the immunotherapy cohort, and they were integrated for predicting responsiveness to immunotherapy. When applied individually, the treatment response of cancer patients can be predicted with significantly higher accuracy than previously known biomarkers such as TMB or PD-1.
  • the amount of neoantigens derived from the cancer cell survival dependent gene may be the number of neoantigens.
  • the cancer cell survival-dependent gene may be a cancer patient-specific cancer cell survival-dependent gene.
  • the neoantigen derived from the cancer cell survival dependent gene may be selected by the method of screening the neoantigen described in Korean Patent Registration No. 2278586. Specifically, cancer cell survival-dependent genes essential for the survival of cancer cells using a cell survival-dependent prediction model from sequencing data of exomes, transcriptomes, single-cell transcripts, peptidomes, or whole genomes obtained from cancer patients or samples of cancer patients is selected, and a cancer patient-specific neoantigen is obtained by comparing the sequence from the sequencing data obtained from the cancer patient or a sample of the cancer patient with the sequence from the sequencing data obtained from normal cells or normal controls, and obtaining Among the identified neoantigens, a neoantigen derived from the cancer cell survival dependent gene may be selected.
  • the top 100 to 1,000 for example, the top 100 to 500, 200 to 500, 300 to 300, after sorting the cancer cell survival dependent genes according to the necessity for cancer cell survival 500, 400 to 500, or more may be selected, and information on the number of neoantigens derived from them may be used.
  • the number of cancer cell survival-dependent genes to be selected may be determined according to the explanatory power as a biomarker of the number of cancer cell survival-dependent genes and neoantigens derived therefrom.
  • the number of genes for measuring the number of neoantigens as a biomarker is 100 may be smaller, and may be larger than 500 if the level of explanatory power required is high.
  • the amount of the neoantigens derived from the cancer cell survival-dependent genes is the number of neoantigens derived from the top 100, 300, 500, or 1000 cancer cell survival-dependent genes selected by sorting according to the cancer cell survival dependency. It may be the number of antigens.
  • the amount of neoantigens derived from cancer cell survival-dependent genes may be the number of neoantigens derived from the top 30 to 50% cancer cell survival-dependent genes sorted and selected according to cancer cell survival dependency.
  • the explanatory power of biomarkers for immuno-anticancer treatment responsiveness can be expressed as hazard ratio (HR) and p value.
  • HR hazard ratio
  • p value the higher the explanatory power.
  • the neoantigen may be one that has been confirmed to have a CNN-MHC level or a NetMHC level greater than 0.5 in binding affinity to HLA of antigen-presenting cells.
  • CNN-MHC level or NetMHC level indicates the ability of neoantigens to bind to HLA of antigen-presenting cells.
  • the CNN-MHC value is a value obtained by constructing a deep learning model (CNN-MHC model) based on experimental values in which the strength of the bond between each amino acid between the neoantigen and MHC is converted into a matrix form, and is converted into a probability between 0 and 1
  • the NetMHC value is the latest version of the NetMHC tool commonly used for predicting the binding of neoantigens, which is a model learned based on mass spectrometer data, NetMHCPan-4.1. It means (Korean Patent Registration No. 2278586). The higher both numbers are, the higher the probability of combining.
  • the neoantigen may be derived from a cancer cell survival-dependent gene, have high binding affinity to HLA of antigen-presenting cells, bind to MHC, and induce T cell activity.
  • the global DNA methylation level may be measured as an average value of methylation occurring in a plurality of Line-1 (Long Interspersed Nuclear Element-1) factors.
  • the LINE-1 factor may be L1HS or L1PA.
  • the average value of the methylation is microarray, methylation-specific PCR (methylation-specific polymerase chain reaction, MSP), real-time methylation-specific PCR (real time methylation-specific polymerase chain reaction), PCR using methylated DNA-specific binding protein, pi Automated sequencing such as rosequencing, Methylation-Sensitive High-Resolution Melting Analysis (MS-HRM), methylation measurement using methylation-sensitive restriction enzymes, DNA chips and bisulfite sequencing It can be measured by methods such as analysis, but is not limited thereto.
  • MSP methylation-specific polymerase chain reaction
  • MS-HRM Methylation-Sensitive High-Resolution Melting Analysis
  • methylation measurement using methylation-sensitive restriction enzymes DNA chips and bisulfite sequencing It can be measured by methods such as analysis, but is not limited thereto.
  • the global DNA methylation level may be expressed as a methylation score.
  • the methylation score is obtained from the number of sequences in which C is converted to T (C-to-T) at each locus and the number of sequences in which C is maintained, or in the complementary strand thereof, G is It can be calculated from the number of sequences (G-to-A) converted to A and the number of sequences with G intact by the following formula:
  • Methylation score C/(C+T) or G/(G+A).
  • the information on the global DNA methylation level may be an average or median value of methylation scores of genetic loci that may represent a plurality of global LINE-1 methylation, or a value obtained by machine learning-based analysis there is.
  • the step of evaluating the responsiveness of the cancer patient to immuno-anticancer treatment is to set the amount of neoantigen derived from the cancer cell survival-dependent gene and the global methylation level to a cutoff for the amount of neoantigen and It may include comparing with a cutoff for global DNA methylation level.
  • the cutoff for the amount of neoantigen and the cutoff for the global methylation level may be the amount of neoantigen and the global methylation level from a cohort of patients identified as having immunotherapeutic responsiveness, respectively. .
  • the step of evaluating the responsiveness of the cancer patient to immuno-anticancer treatment is that the amount of the neoantigen is less than a cutoff for the amount of the neoantigen, or the global methylation level is the global methylation level. If it is smaller than the cutoff for , the cancer patient is judged to have low immuno-anticancer treatment responsiveness,
  • the cancer patient is judged to have high immuno-anticancer treatment responsiveness
  • the cancer is melanoma, bladder cancer, esophageal cancer, glioma, adrenal cancer, sarcoma, thyroid cancer, colorectal cancer, prostate cancer, head and neck cancer, urothelial cancer, gastric cancer, pancreatic cancer, liver cancer, testicular cancer, ovarian cancer , endometrial cancer, cervical cancer, brain cancer, breast cancer, kidney cancer, or lung cancer.
  • the sample of the cancer patient is blood, plasma, tissue, formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue, cell, saliva, ascites, bronchoalveolar lavage fluid (BALF) ), cerebrospinal fluid, sputum, or urine, but is not limited thereto.
  • FFPE formalin-fixed paraffin-embedded
  • the method for providing information for predicting the responsiveness of a cancer patient to immuno-anticancer treatment may be used for companion diagnosis for selecting a target for immuno-anticancer treatment, or may be used for immuno-anticancer treatment. It can be used to monitor the treatment of cancer patients undergoing treatment.
  • Another aspect of the present disclosure is
  • a memory for storing at least one instruction
  • At least one processor to execute the at least one instruction stored in the memory
  • the processor By executing the at least one instruction, the processor:
  • the amount of the neoantigen derived from the cancer cell survival-dependent gene and the global methylation level are determined as a cutoff for the amount of the neoantigen and a global methylation level, respectively.
  • the cutoff for when both the amount of the neoantigen and the global methylation level are equal to or greater than the cutoff, the cancer patient is judged to have a response to immuno-anticancer treatment, and the cutoff is determined to be responsive to immuno-anticancer treatment. wherein the responsiveness is determined from a cohort of confirmed patients.
  • the information on the amount of neoantigens may be the number of neoantigens selected using a cell survival dependency prediction model and a neoantigen binding affinity prediction model, and the neoantigens are derived from survival dependent genes. derived, binds to HLA of antigen-presenting cells with high affinity (CNN-MHC level > 0.5), and can induce T cell responses.
  • the information on the global DNA methylation level may be an average or median value of methylation scores of genetic loci that may represent a plurality of global LINE-1 methylation, or a value obtained by machine learning-based analysis there is.
  • the methylation score is obtained from the number of sequences in which C is converted to T and the number of sequences in which C is maintained as it is at each locus, or the number of sequences in which G is converted to A in its complementary strand It can be calculated from the number of sequences in which G and G remain intact by the following formula:
  • Methylation score C/(C+T) or G/(G+A).
  • the device predicts the responsiveness to immuno-anticancer treatment based on the information on the amount of neoantigen and the information on the global DNA methylation level to determine the responsiveness to immuno-anticancer treatment as overall survival (OS) ) or progression-free survival (PFS) or overall survival and progression-free survival.
  • OS overall survival
  • PFS progression-free survival
  • the amount of neoantigen derived from a cancer cell survival-dependent gene and the global DNA methylation level are simultaneously applied to predict the responsiveness of cancer patients to immuno-anticancer treatment by applying the amount of neoantigen or the global DNA methylation level, respectively, or TMB It is possible to provide a better prediction of treatment responsiveness to immuno-anticancer treatment of cancer patients than in the case of applying existing biomarkers such as.
  • FIG. 1 shows a decision tree structure for predicting immunotherapeutic response by applying the amount of neoantigens (DeepNeo score) and the global DNA methylation level (iMethyl score) derived from cancer cell survival-dependent genes according to one embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 2 shows the results of a meta-analysis based on overall survival (OS) of predicting immuno-anticancer treatment responsiveness using biomarkers PD-L1, TMB, DeepNeo500, and iMethyl, respectively, and a combination of two of them.
  • OS overall survival
  • HR Hazard ratio
  • p P-value
  • FIG. 3 shows Kaplan-Meier curves showing survival analysis results obtained by applying PD-L1, TMB, iMethyl, and DeepNeo500 shown in FIG. 2 together, and DeepNeo500 and iMethyl together according to an embodiment of the present disclosure.
  • Figure 4 measures the number of neoantigens derived from the genes of the top 100, 300, 500, and 1000 selected panels after sorting according to the essentiality of cancer cell survival-dependent genes according to one embodiment of the present disclosure.
  • OS Overall survival
  • HR Hazard ratio
  • p P-value
  • FIG. 5 shows a Kaplan-Meier curve showing survival analysis results for each of the 8 markers shown in FIG. 4 .
  • cell viability dependent means essential for the proliferation or survival of cells, and is used interchangeably with “essential”.
  • dependent gene refers to a gene essential for cell proliferation or survival, and is used interchangeably with "cell survival dependent gene". More specifically, a dependence gene is a gene whose expression is reduced or eliminated, resulting in reduced proliferation and/or death of a cell, and refers to a gene on which a cell depends for its survival, and which is related to cancer or cancer of various types and/or origins. It may include a universal dependence gene identified as universally essential for the survival of cancer cells and/or a cancer patient-specific dependence gene identified as specifically essential for the survival of cancer cells derived from an individual cancer patient. The dependent gene may refer to a gene that is essentially constitutively expressed in cells and uniformly expressed in all individual cells.
  • neoantigen refers to a peptide that induces an immune response. That is, the neoantigen may be an immunogenic peptide. Neoantigens can be induced by cancer cell-specific mutations and can appear as cancer cell epitopes. An antigen that has at least one alteration that distinguishes it from the corresponding wild-type, parental antigen through mutation in cancer cells or post-translational modifications specific to cancer cells. A neoantigen may include an amino acid sequence or a nucleotide sequence.
  • a mutation is any that results in a frameshift or non-frameshift mutation, an indel, a missense or nonsense, a splice site alteration, a genomic rearrangement or gene fusion, or a de novo ORF. of genomic or expression alterations.
  • neoantigens derived from universal dependence or cancer patient-specific dependence genes are not lost by immune evasion by immunoediting of cancer cells, they are effective therapeutic targets for cancer vaccines tailored to cancer patients that can bring about high immunotherapeutic effects in cancer patients. It can be, and can be an effective diagnostic target as a marker for the prognosis of immunotherapy.
  • the term "amount of neoantigens" or “number of neoantigens” refers to the amount or number of effective neoantigens that can affect responsiveness to immunotherapy, and effective neoantigens mean cell survival. It refers to a neoantigen that is derived from a dependent gene, has a high affinity for MHC of antigen-presenting cells, and can induce a T cell response.
  • binding affinity refers to the binding force between a neoantigenic peptide and the MHC of an antigen-presenting cell, and may be expressed as a CNN-MHC value.
  • CNN-MHC value is a value obtained by building a deep learning model based on experimental values obtained by converting the strength of binding between each amino acid between neoantigen and MHC into a matrix form, and is between 0 and 1 converted into a sigmoid activity function. means the probability of Specifically, immunogenic peptides capable of binding to MHC class I or II proteins may have a CNN-MHC value of 0.5 or higher. In addition, as the CNN-MHC value is closer to 1, MHC class I or II proteins and immunogenic peptides have a stronger binding force.
  • methylation refers to a phenomenon in which a methyl group (-CH 3 ) is covalently attached to the 5th carbon of a cytosine pyrimidine ring constituting DNA. More specifically, “global DNA methylation” in the present disclosure refers to methylation that occurs at cytosines of LINE-1 CpG sites. When methylation occurs, the binding of transcription factors is disrupted accordingly, and expression of specific genes is suppressed. On the contrary, when demethylation or hypomethylation occurs, expression of specific genes may increase.
  • responsive to immuno-anticancer treatment or “therapeutic responsiveness to immuno-anticancer treatment” means that a cancer patient shows the intended effect of immuno-anticancer treatment in response to immuno-anticancer treatment.
  • neoantigens derived from cancer cell survival-dependent genes can be used as biomarkers predicting therapeutic responsiveness to immuno-anticancer agents (Korean Patent No. 2278586).
  • the number of gene-derived neoantigens that are highly essential for cancer cell survival selected using the cell survival dependency prediction model and the neoantigen binding affinity prediction model built by deep learning showed high explanatory power for the prognosis following treatment with immuno-anticancer drugs. , which was named "DeepNeo biomarker".
  • Therapeutic responsiveness of immuno-anticancer drugs was predicted using the number of effective neoantigens derived from the top 100, 300, 500, and 1000 lung cancer cell survival-dependent genes selected as essential for survival of lung cancer cells.
  • the top 100, 300, 500, and 1000 genes of lung cancer cell survival dependency are in vitro data of gene knockout / knockdown through RNAi or CRISPR / Cas9 screening described in Korean Patent No. 2278586 (https: / /depmap.org/portal and https://depmap.sanger.ac.uk/) can be screened through analysis.
  • RNAi knockdown screening data of 127 lung cancer cell line models and CRISPR knockout screening data of 107 lung cancer cell lines were averaged and normalized in the range of -1 to 1 to obtain a universal survival dependency score for each gene of lung cancer cells was calculated. The closer this number is to 1, the more positive dependence, and the closer to -1, the more negative dependence.
  • the top 100, 300, 500, and 1000 genes were selected to form DeepNeo100, DeepNeo300, DeepNeo500, and DeepNeo1000 panels, respectively.
  • the genes that make up the dual DeepNeo1000 panel and their survival dependence scores are shown in Table 1.
  • neoantigens of the patient can be obtained through DeepNeo TCR analysis, which selects neoantigens that have high binding affinity to HLA and can induce T cell activity.
  • the number of effective neoantigens derived from the survival-dependent genes of the DeepNeo100, DeepNeo300, DeepNeo500, and DeepNeo1000 panels composed of genes selected according to the survival-dependent score of 1 was calculated for each score.
  • DeepNeo TCR analysis is a neural network model (CNN) pre-constructed with information of all possible combinations of neoantigens, which are candidate peptides derived from antigens, and patient's MHC information, for example, CNN as described in Korean Patent Registration No. 2278586 -Enter into the MHC model to predict the ability to successfully bind to MHC and consequently induce T cell activity.
  • the DeepNeo score which is the number of effective neoantigens, can be obtained by counting the number of peptide-MHC combinations exceeding 0.5 (MHC binding) and 0.7 (TCR activation) DeepNeo TCR scores and unique somatic mutation sets derived from the peptides.
  • the calculated DeepNeo score is compared with a cutoff, which is the number of effective neoantigens obtained from a cohort of patients for whom therapeutic responsiveness to immunotherapeutic agents has been confirmed, and if higher than this cutoff, “True” means that there is therapeutic responsiveness to immunotherapeutic agents. It was judged as , and if it was lower than this cutoff, it was judged as "False", which means low or no treatment response to the immuno-anticancer agent.
  • the immuno-oncology lung cancer cohort of Samsung Medical Center used to calculate the cutoff consisted of 334 lung cancer patients who were treated with immune checkpoint inhibitors (anti-PD-1 or anti-PD-L1), and the patient information is shown in Table 2. .
  • DeepNeo scores were calculated as described above for the DeepNeo100, DeepNeo300, DeepNeo500, and DeepNeo1000 panels.
  • DeepNeo scores of 1 (DeepNeo100), 3 (DeepNeo300), 4 (DeepNeo500), and 7 (DeepNeo1000) were obtained as median values for each of the DeepNeo100, DeepNeo300, DeepNeo500, and DeepNeo1000 panels, and were applied as cutoffs.
  • the global DNA methylation level measured as the average value of methylation occurring in a plurality of LINE-1 (Long Interspersed Nuclear Element-1: L1) factors correlates with treatment responsiveness to immunotherapeutic agents, and the global DNA methylation level Lower than global DNA methylation levels from a cohort of patients identified as having therapeutic responsiveness to immunotherapeutic agents predicted low therapeutic responsiveness to immunotherapeutic agents.
  • This global DNA methylation level was termed "iMethyl”.
  • NGS sequencing (ampliseq) was performed after bisulfite treatment to obtain the methylation score of each loci, and the average or median value of the 10 methylation scores and The same representative value was calculated as iMethyl score.
  • Ten LINE-1 loci are shown in Table 3 below. Probe IDs of the Illumina Infiniium MethylationEPIC BeadChIP Kit (WG-317-1002) for detecting each locus are indicated.
  • No chromosome target_location Probe ID One 19 42,007,378 cg00789198 2 3 28,100,733 cg12678329 3 19 55,039,730 cg17952114 4 11 24,239,975 ch.11.24196551F 5 11 67,350,491 cg08925882 6 15 100,911,974 cg05128056 7 2 195,939,900 ch.2.195648145F 8 8 12,206,841 cg11996397 9 3 94,226,489 cg01291593 10 11 41,668,951 ch.11.41625527F
  • TRUE was predicted if the treatment responsiveness to immuno-anticancer drugs was higher than the cut-off set through prior cohort analysis known.
  • the iMethyl score can be calculated as a representative value through analysis using the median value, average value, or machine learning method.
  • the methylation score at 10 loci from the lung cancer cohort shown in Table 2 was converted into a z-score by equalizing all patients for each locus, and the average value of 10 normalized methylation scores of each patient was calculated to obtain the patient's iMethyl score can be calculated. Based on the score, the optimal cutoff to predict the response to immuno-anticancer drug treatment was 0.
  • the new The methylation scores of each of the 10 genetic loci from the patient can be averaged and the average value calculated and measured as the iMethyl score. When the score is above the cutoff of 0, it can be predicted that the treatment responsiveness to immuno-anticancer drugs is high.
  • DeepNeo and iMethyl described in 1-1 and 1-2 are biomarkers that can predict treatment responsiveness to immuno-anticancer drugs in cancer patients, respectively.
  • DeepNeo and iMethyl are applied together to evaluate the predictive power of treatment responsiveness to immuno-anticancer drugs in cancer patients. did
  • Figure 1 shows a tree structure for determining immuno-anticancer drug treatment responsiveness by simultaneously applying the DeepNeo score and the iMethyl score.
  • the existing biomarker PD-L1 and TMB Tumor Mutation Burden
  • Table 2 Survival analysis was performed on 123 patients with .
  • the Kaplan-Meier model was Survival analysis was performed using For comparison, analysis results using existing biomarkers PD-L1 and TMB are also shown.
  • a patient group having a DeepNeo500 score of FIG. 3 having a cutoff value of 4 or more has a mortality rate 0.563 times (HR) lower than that of a patient group having a score of less than 4, which is a value calculated with a very significant reliability of 1.75e-05. am.
  • One embodiment of the present disclosure together with PD-L1 and TMB, which are existing biomarkers, for the immuno-anticancer lung cancer cohort of Samsung Seoul Hospital shown in Table 2 to confirm whether the integrated biomarkers are actually effective in predicting the prognosis of immuno-anticancer treatment.
  • the DeepNeo500 score and the iMethyl score were calculated according to . 1) PD-L1, 2) TMB, 3) iMethyl, 4) DeepNeo500, 5) PD-L1+TMB, 6) PD- Overall survival using the Kaplan-Meier model (Overall survival, OS) analysis was performed, and the results are shown in FIGS. 2 and 3, respectively.
  • DeepNeo1000, DeepNeo500, DeepNeo300, and DeepNeo100 showed excellent predictive power in the order, and the predictive power increased when all four DeepNeo scores were analyzed in combination with iMethyl than when analyzed as a single panel.
  • sophisticated immunotherapeutic response prediction is possible by adjusting the panel size for measuring effective neoantigens, and it has better predictive power when integrated with iMethyl.

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Abstract

암세포 생존 의존성 유전자로부터 유래된 신생항원의 양 및 글로벌 DNA 메틸화 수준을 이용하여 암 환자의 면역항암제에 대한 치료 반응성을 예측하는 방법 및 장치에 관한 것이다.

Description

신생항원 마커 및 글로벌 DNA 메틸화 마커를 이용한 면역항암제에 대한 치료 반응성 예측 방법 및 장치
암세포 생존 의존성 유전자로부터 유래된 신생항원의 양 및 글로벌 DNA 메틸화 수준을 이용하여 암 환자의 면역항암제에 대한 치료 반응성을 예측하는 방법 및 장치에 관한 것이다.
면역항암제 또는 면역항암 치료는 인체의 면역체계를 활성화시켜서 암세포 와 싸우게 하는 치료법으로 반응하는 환자군에서는 높은 완치율을 기대할 수 있어서 항암 치료의 새로운 패러다임을 제공하고 있다. 그러나, 면역항암제, 예를 들면, 항-PD-1/항-PD-L1의 실제 치료 성공률은 15-20%에 불과하는 등 면역항암제에 대한 치료 반응성이 높지 않고, 암의 종류나 병기, 환자의 상태에 따라 차이가 크다. 또한, 면역항암제의 적용에 따라 증가된 면역세포들의 활성과 분비 물질에 의해 정상세포들도 영향을 받을 수 있어서 부작용이 있을 수 있다.
이에 따라, 면역항암 치료의 치료 반응성의 다양성을 고려하여, 면역항암제에 대한 치료 반응성을 예측할 수 있는 바이오마커를 이용한 동반진단에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다. TMB(tumor mutation burden), PD-L1 등이 치료 반응성을 예측하기 위한 바이오마커로 알려져 있고, 치료 반응성과 상관관계를 갖는 바이오마커들이 다양하게 보고되고 있다.
한국등록특허 제2278586호는 생존 의존성 유전자로부터 유래된 신생항원의 양이 암환자의 치료 예후를 예측하기 위해 이용될 수 있다는 것을 개시한다.
또한, 한국등록특허 제2238912호는 암환자의 샘플로부터 검출된 글로벌 DNA 메틸화 수준이 면역항암 치료 반응성 예측을 위한 정보를 제공할 수 있다는 것을 개시한다.
그러나, 면역항암제의 치료에 따른 비용 및 낮은 완치율 등을 고려하여, 환자에게 맞춤화된 정밀 치료를 제공하기 위해 보다 정확하게 면역항암제의 치료 반응성을 예측할 수 있는 바이오마커 및 이를 이용한 동반 진단에 대한 요구가 여전히 존재한다.
이에, 본 발명자들은 암세포 생존 의존성 유전자로부터 유래된 신생항원의 개수 및 글로벌 메틸화 수준을 동시에 적용하는 것이 암 환자의 면역항암제에 대한 치료 반응성을 현저하게 높은 정확도로 예측할 수 있는 바이오마커라는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 개시는 암세포 생존 의존성 유전자로부터 유래된 신생항원의 양 및 글로벌 메틸화 수준으로부터 암 환자의 면역치료에 대한 반응성을 예측하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 개시는 또한 암세포 생존 의존성 유전자로부터 유래된 신생항원의 양 및 글로벌 메틸화 수준으로부터 암 환자의 면역 치료에 대한 치료 예후를 예측하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 개시는 또한 암세포 생존 의존성 유전자로부터 유래된 신생항원의 양 및 글로벌 메틸화 수준으로부터 암 환자의 면역치료에 대한 반응성을 예측하는 장치를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 개시의 일 양태는
암 환자의 시료에서 암세포 생존 의존성 유전자로부터 유래된 신생항원의 양에 대한 정보를 수득하는 단계,
상기 시료로부터 글로벌 DNA 메틸화 수준에 대한 정보를 수득하는 단계, 및
상기 신생항원의 양에 대한 정보 및 글로벌 DNA 메틸화 수준에 대한 정보에 기초하여 암 환자의 면역항암 치료에 대한 반응성을 평가하는 단계를 포함하는, 암환자의 면역항암 치료에 대한 반응성을 예측하는 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
암세포 생존 의존성 유전자로부터 유래된 신생항원의 양 또는 개수가 많은 경우 면역항암 치료에 대한 반응성이 높으며, 글로벌 DNA 메틸화 수준이 낮은 경우 면역항암 치료에 대한 저항성이 높고, 따라서, 반응성은 낮은 것으로 판단할 수 있다. 구체적으로, 낮은 글로벌 DNA 메틸화 수준을 가질수록 암 조직에 침투한 면역세포의 활성이 저해되어 있고, 암세포 내에서 발현되는 면역반응 유전자의 발현량이 감소되기 때문이다. 암세포 생존 의존성 유전자로부터 유래된 신생항원의 양 또는 개수 및 글로벌 DNA 메틸화 수준은 각각 면역치료 코호트 암 환자의 생존률과 유의성 있게 상관관계를 갖는 것으로 확인되었고, 이들을 면역항암 치료에 대한 반응성의 예측을 위해 통합적으로 적용하는 경우, 개별적으로 적용하는 경우나, 기존에 알려진 바이오마커인 TMB나 PD-1에 비해 현저하게 높은 정확도로 암 환자의 치료 반응성을 예측할 수 있다.
본 개시의 일 구체예에서, 상기 암세포 생존 의존성 유전자로부터 유래된 신생항원의 양은 신생항원의 개수일 수 있다.
본 개시의 일 구체예에서, 상기 암세포 생존 의존성 유전자는 암환자 특이적 암세포 생존 의존성 유전자일 수 있다.
본 개시의 일 구체예에서, 상기 암세포 생존 의존성 유전자로부터 유래된 신생항원은 한국등록특허 제2278586호에 기재된 신생항원을 스크리닝하는 방법에 의해 선별될 수 있다. 구체적으로, 암 환자 또는 암 환자의 시료로부터 수득된 엑솜, 전사체, 단일세포 전사체, 펩티돔 또는 전체 게놈의 서열분석 데이터로부터 세포 생존 의존성 예측 모델을 이용하여 암세포의 생존에 필수적인 암세포 생존 의존성 유전자를 선별하고, 상기 암 환자 또는 암 환자의 시료로부터 수득된 서열분석 데이터로부터의 서열을 정상 세포 또는 정상 대조군으로부터 수득된 서열분석 데이터로부터의 서열과 비교하여 암환자 특이적 신생항원을 수득하고, 수득된 신생항원 중에서 상기 암세포 생존 의존성 유전자로부터 유래된 신생항원을 선별할 수 있다.
본 개시의 일 구체예에서, 암세포 생존에 대한 필수성에 따라 암세포 생존 의존성 유전자를 정렬한 후 상위 100개 내지 1,000개, 예를 들면, 상위 100개 내지 500개, 200개 내지 500개, 300개 내지 500개, 400개 내지 500개, 또는 그 이상을 선택하고, 이들로부터 유래된 신생항원의 개수에 대한 정보를 이용할 수 있다. 선택하는 암세포 생존 의존성 유전자의 개수는 암세포 생존 의존성 유전자 및 그로부터 유래된 신생항원의 개수의 바이오마커로서의 설명력에 따라 결정될 수 있다. 각각의 암세포 생존 의존성 유전자 및 그로부터 유래된 신생항원의 개수가 암환자의 면역항암제에 대한 치료 반응성의 예측에 대해 높은 설명력을 가질 경우 바이오마커로서 신생항원의 개수를 측정하기 위한 유전자의 수는 100개보다 작을 수 있고, 요구되는 설명력의 수준이 높으면 500개보다 더 클 수 있다.
본 개시의 일 구체예에서, 상기 암세포 생존 의존성 유전자로부터 유래된 신생항원의 양은 암세포 생존 의존성에 따라 정렬하여 선별된 상위 100개, 300개, 500개, 또는 1000개의 암세포 생존 의존성 유전자로부터 유래된 신생항원의 개수일 수 있다.
본 개시의 일 구체예에서, 상기 암세포 생존 의존성 유전자로부터 유래된 신생항원의 양은 암세포 생존 의존성에 따라 정렬하여 선별된 상위 30 내지 50%의 암세포 생존 의존성 유전자로부터 유래된 신생항원의 개수일 수 있다.
면역항암 치료 반응성에 대한 바이오마커의 설명력은 HR(hazard ratio) 및 p 값으로 표시될 수 있다. HR이 낮을수록, p 값이 낮을수록 설명력은 높은 것으로 판단된다.
본 개시의 일 구체예에서, 상기 신생항원은 항원제시세포의 HLA와의 결합력이 CNN-MHC 수치 또는 NetMHC 수치가 0.5 보다 큰 것으로 확인된 것일 수 있다. CNN-MHC 수치 또는 NetMHC 수치는 신생항원이 항원제시세포의 HLA와 결합하는 능력을 나타낸다. CNN-MHC 수치는 신생항원과 MHC 간의 각 아미노산 간의 결합의 강도를 매트릭스 형태로 변환한 실험값들을 기반으로 딥러닝 모델(CNN-MHC 모델)을 구축하여 얻은 수치로, 0과 1 사이의 확률로 변환된 수치를 의미하고, NetMHC 수치는 신생항원의 결합 예측에 일반적으로 사용되는 NetMHC 툴의 최신 버전으로 질량분석기 데이터를 기반으로 학습된 모델인 NetMHCPan-4.1로 계산된 MHC 단백질과 펩타이드 간의 결합 예측 수치를 의미한다(한국등록특허 제2278586호). 두 수치는 모두 높을수록 결합할 확률이 높다는 의미이다.
본 개시의 일 구체예에서, 상기 신생항원은 암세포 생존 의존성 유전자로부터 유래되고, 항원제시세포의 HLA와 결합 친화력이 높아서 MHC에 결합하고, T 세포 활성을 유도할 수 있는 것일 수 있다.
본 개시의 일 구체예에서, 상기 글로벌 DNA 메틸화 수준은 복수의 Line-1(Long Interspersed Nuclear Element-1) 인자에서 발생하는 메틸화의 평균값으로 측정되는 것일 수 있다.
본 개시의 일 구체예에서, 상기 LINE-1 인자는 L1HS 또는 L1PA일 수 있다.
상기 메틸화의 평균값은 마이크로 어레이, 메틸화 특이적 PCR(methylation-specific polymerase chain reaction, MSP), 실시간 메틸화 특이적 PCR(real time methylation-specific polymerase chain reaction), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 파이로시퀀싱, 메틸화 특이적-고해상도 융해곡선 분석 (Methylation-Sensitive High-Resolution Melting Analysis, MS-HRM), 메틸화 민감성 제한 효소를 사용한 메틸화 측정, DNA 칩 및 바이설파이트(bisulfite) 시퀀싱과 같은 자동염기서열분석 등의 방법으로 측정할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 개시의 일 구체예에서, 상기 글로벌 DNA 메틸화 수준은 메틸화 스코어(methylation score)로 표시될 수 있다.
본 개시의 일 구체예에서, 메틸화 스코어는 각 유전좌위에서 C가 T로 변환된 서열(C-to-T)의 갯수와 C가 그대로 유지된 서열의 갯수로부터 또는, 그의 상보적 가닥에서 G가 A로 변환된 서열(G-to-A)의 갯수와 G가 그대로 유지된 서열의 갯수로부터 하기 식에 의해 계산할 수 있다:
메틸화 스코어 = C/(C+T) 또는 G/(G+A).
본 개시의 일 구체예에서, 상기 글로벌 DNA 메틸화 수준에 대한 정보는 복수 개의 글로벌 LINE-1 메틸화를 대표할 수 있는 유전좌위의 메틸화 스코어의 평균 또는 중앙값 또는 머신 러닝에 기반한 분석에 의해 수득된 값일 수 있다.
본 개시의 일 구체예에서, 상기 암 환자의 면역항암 치료에 대한 반응성을 평가하는 단계는 상기 암세포 생존 의존성 유전자로부터 유래된 신생항원의 양 및 상기 글로벌 메틸화 수준을 각각 신생항원의 양에 대한 컷오프 및 글로벌 DNA 메틸화 수준에 대한 컷오프와 비교하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
본 개시의 일 구체예에서, 상기 신생항원의 양에 대한 컷오프 및 글로벌 메틸화 수준에 대한 컷오프는 각각 면역항암 치료 반응성을 갖는 것으로 확인된 환자들의 코호트로부터의 신생항원의 양 및 글로벌 메틸화 수준일 수 있다.
본 개시의 일 구체예에서, 상기 암 환자의 면역항암 치료에 대한 반응성을 평가하는 단계는 상기 신생항원의 양이 상기 신생항원의 양에 대한 컷오프보다 작거나, 상기 글로벌 메틸화 수준이 상기 글로벌 메틸화 수준에 대한 컷오프보다 작은 경우, 상기 암환자는 면역항암 치료 반응성이 낮은 것으로 판단하고,
상기 신생항원의 양이 상기 신생항원에 대한 컷오프와 같거나 그보다 크고, 상기 글로벌 메틸화 수준이 상기 글로벌 메틸화 수준에 대한 컷오프와 같거나 그보다 큰 경우, 상기 암환자는 면역항암 치료 반응성이 높은 것으로 판단하는 것일 수 있다.
본 개시의 일 구체예에서, 상기 암은 흑색종, 방광암, 식도암, 신경교종, 부신암, 육종, 갑상선암, 결장직장암, 전립선암, 두경부암, 요로상피암, 위암, 췌장암, 간암, 고환암, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 뇌암, 유방암, 신장암, 또는 폐암일 수 있다.
본 개시의 일 구체예에서, 상기 암 환자의 시료는 혈액, 혈장, 조직, FFPE(formalin-fixed paraffin-embedded) 조직, 세포, 타액, 복수액 (Ascites), 기관지폐포 세척액 (bronchoalveolar lavage fluid, BALF), 뇌척수액, 객담, 또는 소변일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 개시의 일 구체예에 따른, 암 환자의 면역항암 치료에 대한 반응성을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법은 면역항암 치료의 적용 대상을 선택하기 위한 동반 진단을 위해 이용될 수 있거나, 또는 면역항암 치료를 받는 암 환자의 치료를 모니터링하기 위해 이용될 수 있다.
본 개시의 또 다른 양태는
면역항암 치료에 대한 반응성을 예측하는 장치로서,
적어도 하나의 인스트럭션을 저장하기 위한 메모리; 및
상기 메모리에 저장된 상기 적어도 하나의 인스트럭션을 실행하는 적어도 하나의 프로세서를 포함하고,
상기 프로세서는 상기 적어도 하나의 인스트럭션을 실행함으로써,
암 환자의 시료로부터 암세포 생존 의존성 유전자로부터 유래된 신생항원의 양에 대한 정보를 수득하고,
상기 시료로부터 글로벌 DNA 메틸화 수준에 대한 정보를 수득하며,
상기 신생항원의 양에 대한 정보 및 글로벌 DNA 메틸화 수준에 대한 정보에 기반하여, 상기 암세포 생존 의존성 유전자로부터 유래된 신생항원의 양 및 상기 글로벌 메틸화 수준을 각각 신생항원의 양에 대한 컷오프 및 글로벌 메틸화 수준에 대한 컷오프와 비교하여, 상기 신생항원의 양과 상기 글로벌 메틸화 수준이 모두 컷오프와 같거나 그보다 큰 경우, 상기 암 환자는 면역항암 치료에 대한 반응성을 갖는 것으로 판단하며, 상기 컷오프는 면역항암 치료에 대한 반응성이 확인된 환자들의 코호트로부터 결정된 것인 장치를 제공한다.
본 개시의 일 구체예에서, 상기 신생항원의 양에 대한 정보는 세포 생존 의존성 예측 모델 및 신생항원 결합 친화력 예측 모델을 이용하여 선별된 신생항원의 개수일 수 있고, 상기 신생항원은 생존 의존성 유전자로부터 유래되고, 항원제시세포의 HLA와 높은 친화력으로 결합하고(CNN-MHC 수치 > 0.5), T 세포 반응을 유도할 수 있는 것이다.
본 개시의 일 구체예에서, 상기 글로벌 DNA 메틸화 수준에 대한 정보는 복수 개의 글로벌 LINE-1 메틸화를 대표할 수 있는 유전좌위의 메틸화 점수의 평균 또는 중앙값 또는 머신 러닝에 기반한 분석에 의해 수득된 값일 수 있다.
본 개시의 일 구체예에서, 메틸화 스코어는 각 유전좌위에서 C가 T로 변환된 서열의 갯수와 C가 그대로 유지된 서열의 갯수로부터 또는, 그의 상보적 가닥에서 G가 A로 변환된 서열의 갯수와 G가 그대로 유지된 서열의 갯수로부터 하기 식에 의해 계산할 수 있다:
메틸화 스코어 = C/(C+T) 또는 G/(G+A).
본 개시의 일 구체예에서, 상기 장치는 신생항원의 양에 대한 정보 및 글로벌 DNA 메틸화 수준에 대한 정보에 기반하여, 면역항암 치료에 대한 반응성을 예측하여 면역항암 치료에 대한 반응성을 전체 생존(OS) 또는 무진행 생존(PFS) 또는 전체 생존 및 무진행 생존으로 표시할 수 있다.
본 개시의 일 구체예에 따른 암세포 생존 의존성 유전자로부터 유래된 신생항원의 양과 글로벌 DNA 메틸화 수준을 동시에 적용한 암환자의 면역항암 치료 반응성 예측은 신생항원의 양 또는 글로벌 DNA 메틸화 수준을 각각 적용하거나, TMB와 같은 기존의 바이오마커를 적용하는 경우보다 탁월하게 암환자의 면역항암 치료에 대한 치료 반응성 예측을 제공할 수 있다.
도 1은 본 개시의 일 구체예에 따른 암세포 생존 의존성 유전자로부터 유래된 신생항원의 양(DeepNeo score) 및 글로벌 DNA 메틸화 수준(iMethyl score)을 적용한 면역항암 치료 반응성을 예측하는 결정 트리 구조를 보여준다.
도 2는 바이오마커 PD-L1, TMB, DeepNeo500 및 iMethyl 각각 및 이들 중 2종의 조합을 적용한 면역항암 치료 반응성 예측의 전체 생존 (Overall survival, OS) 기준 메타 분석 결과를 보여준다. 면역항암 치료 반응성 예측에 대한 설명력을 수치로 나타낸 Hazard ratio (HR) 및 P-value (p) 값을 비교한다.
도 3은 도 2에 표시된 PD-L1, TMB, iMethyl 및 DeepNeo500 각각 및 본 개시의 일 구체예에 따른 DeepNeo500과 iMethyl을 함께 적용한 생존 분석 결과를 도시한 Kaplan-Meier 곡선을 보여준다.
도 4는 본 개시의 일 구체예에 따른 암세포 생존 의존성 유전자의 필수성에 따라 정렬한 후 상위 100개, 300개, 500개, 1000개를 선별한 패널의 유전자로부터 유래된 신생항원의 개수를 측정한 DeepNeo100, DeepNeo300, DeepNeo500, DeepNeo1000 스코어와, 이 4가지 스코어를 iMethyl과 각각 조합하여 적용한 총 8가지 마커에 따른 면역항암 치료 반응성 예측의 전체 생존 (Overall survival, OS) 기준 메타 분석 결과를 보여준다. 면역항암 치료 반응성 예측에 대한 설명력을 수치로 나타낸 Hazard ratio (HR) 및 P-value (p) 값을 비교한다.
도 5는 도 4에 표시된 8가지 마커 각각의 생존 분석 결과를 도시한 Kaplan-Meier 곡선을 보여준다.
본 발명은 첨부되는 도면과 함께 하기에 상세하게 기재되는 실시예를 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 실시예에 한정되는 것이 아니라 다양한 형태로 구현될 것이며, 본 실시예는 단지 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항에 의해 정의된다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "세포 생존 의존성"은 세포의 증식 또는 생존에 대한 필수성을 의미하고, "필수성"과 호환적으로 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "의존성 유전자"는 세포의 증식 또는 생존에 필수적인 유전자를 의미하며, "세포 생존 의존성 유전자"와 호환적으로 사용된다. 보다 구체적으로, 의존성 유전자는 그의 발현이 감소되거나 제거되면 세포의 증식 감소 및/또는 사멸을 초래하는 유전자로서, 세포가 그의 생존을 위해 의존하는 유전자를 의미하고, 다양한 종류 및/또는 출처의 암 또는 암세포의 생존에 보편적으로 필수적인 것으로 파악된 보편적 의존성 유전자 및/또는 개별 암환자로부터 유래된 암세포의 생존에 특이적으로 필수적인 것으로 파악된 암환자 특이적 의존성 유전자를 포함할 수 있다. 의존성 유전자는 세포에서 필수적으로 항시성으로 발현되고, 모든 개별 세포에서 균일하게 발현되는 유전자를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "신생항원 (neoantigen)"은 면역반응을 일으키는 펩티드를 의미한다. 즉, 신생항원은 면역원성 펩티드일 수 있다. 신생항원은 암세포 특이적 돌연변이에 의해 유도될 수 있으며, 암세포의 에피토프로 나타날 수 있다. 암세포에서의 돌연변이 또는 암세포에 특이적인 번역 후 변형을 통해 상응하는 야생형, 모(parental) 항원과 구별되게 하는 적어도 하나의 변경을 갖는 항원이다. 신생항원은 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 돌연변이는 프레임쉬프트 또는 비-프레임쉬프트(non-frameshift) 돌연변이, 인델(indel), 치환(missense) 또는 종결(nonsense), 스플라이스 부위 변경, 게놈 재배열 또는 유전자 융합, 또는 신생 ORF를 야기하는 임의의 게놈 또는 발현 변경을 포함할 수 있다.
보편적 의존성 또는 암환자 특이적 의존성 유전자로부터 유래된 신생항원은 암세포의 면역편집에 의한 면역회피에 의해 소실되지 않기 때문에 암환자에서 높은 면역치료 효과를 가져올 수 있는 암환자 맞춤형 암 백신을 위한 유효한 치료 표적이 될 수 있고, 면역 치료의 예후에 대한 마커로서 유효한 진단 표적이 될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "신생항원의 양" 또는 "신생항원의 개수"는 면역항암 치료에 대한 반응성에 영향을 미칠 수 있는 유효한 신생항원의 양 또는 개수를 의미하고, 유효한 신생항원은 세포 생존 의존성 유전자로부터 유래되고, 항원 제시 세포의 MHC와 높은 결합력을 가지며, T 세포 반응을 유발할 수 있는 신생항원을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "결합 친화력"은 신생항원 펩티드와 항원 제시 세포의 MHC 간의 결합력을 의미하고, CNN-MHC 수치로 표현될 수 있다. "CNN-MHC 수치"는 신생항원과 MHC 간의 각 아미노산 간의 결합의 강도를 매트릭스 형태로 변환한 실험값들을 기반으로 딥러닝 모델을 구축하여 얻은 수치이며, 시그모이드 활성함수로 변환된 0과 1 사이의 확률 수치를 의미한다. 구체적으로 MHC 클래스 I 또는 II 단백질과 결합 가능한 면역원성 펩티드는 0.5 이상인 CNN-MHC 수치를 가질 수 있다. 또한, CNN-MHC 수치가 1에 가까울수록 MHC 클래스 I 또는 II 단백질과 면역원성 펩티드는 강한 결합력을 갖는다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "메틸화(methylation)"는 DNA를 구성하는 시토신 피리미딘 고리의 5번째 탄소에 메틸기(-CH3)가 공유결합으로 부착되는 현상을 의미한다. 보다 구체적으로, 본 개시의 "글로벌 DNA 메틸화"는 LINE-1 CpG 부위의 시토신에서 일어나는 메틸화를 의미한다. 메틸화가 일어나는 경우 그에 따라 전사인자의 결합이 방해를 받게 되어 특정 유전자 발현이 억제되고, 반대로 탈메틸화(demethylation) 또는 저메틸화(hypomethylation)가 일어나는 경우에는 특정 유전자 발현이 증가할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "면역항암 치료에 대한 반응성" 또는 "면역항암 치료에 대한 치료 반응성"은 암 환자가 면역항암 치료에 반응하여 면역항암 치료의 의도한 효과를 나타내는 것을 의미한다.
실시예. 암세포 생존 의존성 유전자 유래 신생항원의 양과 글로벌 DNA 메틸화 수준의 면역항암제 치료 반응성 예측
1-1. 암세포 생존 의존성 유전자 유래 신생항원의 양
암세포 생존 의존성 유전자로부터 유래된 신생항원의 양이 면역항암제에 대한 치료 반응성을 예측하는 바이오마커로 이용할 수 있는 것으로 확인되었다 (한국특허 제2278586호). 딥러닝에 의해 구축된 세포 생존 의존성 예측 모델 및 신생항원 결합 친화력 예측 모델을 이용하여 선별된 암세포 생존에 대한 필수성이 높은 유전자 유래 신생항원의 개수가 면역항암제의 치료에 따른 예후에 대한 설명력이 높았고, 이를 "DeepNeo 바이오마커"로 명명하였다.
폐암세포의 생존에 필수적인 것으로 선별된 상위 100개, 300개, 500개, 1000개의 폐암세포 생존 의존성 유전자로부터 유래된 유효신생항원의 개수를 이용하여 면역항암제의 치료 반응성을 예측했다. 구체적으로, 상기 폐암세포 생존 의존성 상위 100개, 300개, 500개, 1000개 유전자는 한국특허 제2278586호에 기재된 RNAi 또는 CRISPR/Cas9 스크리닝을 통한 유전자 넉아웃/넉다운의 인 비트로 데이터 (https://depmap.org/portal 및 https://depmap.sanger.ac.uk/) 분석을 통해 선별할 수 있다. 127개의 폐암 세포주 모델의 RNAi 넉다운 스크리닝 데이터와 107개의 폐암 세포주 CRISPR 넉아웃 스크리닝 데이터 결과값을 평균하고 -1 내지 1의 범위로 평준화 (normalization)하여 폐암세포의 유전자별 보편적 생존 의존도 스코어 (Dependency score)를 산출하였다. 이 수치는 1에 가까울수록 양의 의존도(positive dependency)를, -1에 가까울수록 음의 의존도(negative dependency)를 나타낸다. 생존 의존도 점수 기준으로 상위 100개, 300개, 500개, 1000개의 유전자를 선정하여 각각 DeepNeo100, DeepNeo300, DeepNeo500, DeepNeo1000 패널을 구성하였다. 이중 DeepNeo1000 패널을 구성하는 유전자 및 그의 생존 의존도 스코어가 표 1에 표시된다.
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암환자의 시료로부터 수득된 엑솜의 NGS 서열분석 데이터로부터 HLA와의 결합 친화력이 높고 T 세포 활성을 유도할 수 있는 신생항원을 선별하는 DeepNeo TCR 분석을 통해 환자의 전체 신생항원 리스트를 얻을 수 있으며, 표 1의 생존 의존도 스코어에 따라 선정된 유전자로 구성된 DeepNeo100, DeepNeo300, DeepNeo500, 및DeepNeo1000 패널의 생존 의존성 유전자로부터 유래된 유효 신생항원의 개수를 각각의 스코어로 계산했다.
DeepNeo TCR 분석은 항원으로부터 유래한 후보 펩타이드인 신생항원과 환자의 MHC 정보의 가능한 모든 조합의 정보를 사전에 구축한 신경망 모델 (CNN), 예를 들면, 한국등록특허 제2278586호에 기재된 바와 같은 CNN-MHC 모델에 입력하여 MHC에 성공적으로 결합하고, 결과적으로 T 세포 활성을 유도할 수 있는 능력을 예측한다. DeepNeo TCR 스코어 0.5 (MHC 결합) 및 0.7 (TCR 활성화)을 넘는 펩타이드-MHC 조합 및 그 펩타이드가 유래한 고유한 체세포 변이 세트의 개수를 계수하여, 유효 신생항원의 개수인 DeepNeo 스코어를 얻을 수 있다. 계산된 DeepNeo 스코어를 면역항암제에 대한 치료반응성이 확인된 환자들의 코호트로부터 수득된 유효 신생항원 개수인 컷오프와 비교하여, 이 컷오프보다 높은 경우, 면역항암제에 대한 치료 반응성이 있다는 것을 의미하는 "True"로 판단하고, 이 컷오프보다 낮은 경우에는 면역항암제에 대한 치료 반응성이 낮거나 없다는 것을 의미하는 "False"로 판단했다. 컷오프를 산출하기 위해 이용된 삼성서울병원의 면역항암제 폐암 코호트는 면역관문억제제 (항-PD-1 또는 항-PD-L1) 치료를 받은 334명의 폐암 환자로 구성되었으며 환자 정보가 표 2에 표시된다.
표 2. 기준선 임상 특징
N = 334 모든 환자
　 No.(%)		 CR/PR
N=104
No.(%)		 SD/PD
N=230
No.(%)		 P
value　
연령 중앙값(범위) 61.8 (32 - 85) 62.6 (38 - 85) 61.3 (32 - 84) 0.08
성별 　 　 　 0.003
남성 229(69) 83(80) 146(63) 　
여성 105(31) 21(20) 84(37) 　
TMB 중앙값(범위) 161.5 (19 - 4,089) 229 (37 - 4,089) 144.5 (9 - 3,106) 0.000002
흡연 여부 　 　 　 0.0004
현재 진행/과거 216(65) 82(79) 134(58) 　
흡연이력 없음 118(35) 22(21) 96(42) 　
수행력(Performance status) 　 　 　 0.0499
ECOG 0 & 1 298(89) 99(95) 199(87) 　
ECOG 2 36(11) 5(5) 31(13) 　
조직학 　 　 　 0.915
LUAD 235(70) 72(69) 163(71) 　
LUSC 76(23) 24(23) 52(23) 　
기타 23(7) 8(8) 15(7) 　
면역치료 　 　 　 0.138
항 PD-1 248(74) 83(80) 165(72) 　
항D-L1 86(26) 21(20) 65(28) 　
PD-L1 발현 　 　 　 0.3704
<1% 38(11) 10(10) 28(12)
1-49% 15(4) 4(4) 11(5) 　
≥50% 48(14) 19(18) 29(13) 　
표 2에 표시된 334명의 폐암 코호트에서 체세포 변이를 발굴하고, DeepNeo100, DeepNeo300, DeepNeo500, DeepNeo1000 패널에 대해 전술된 바와 같이 DeepNeo 스코어를 계산하였다. 그 결과 DeepNeo100, DeepNeo300, DeepNeo500, DeepNeo1000 패널 각각에 대해 DeepNeo 스코어 1 (DeepNeo100), 3 (DeepNeo300), 4 (DeepNeo500), 7 (DeepNeo1000)이 중앙값으로 얻어졌고, 이를 컷오프로 적용하였다.
1-2. 글로벌 DNA 메틸화 수준
암환자의 시료로부터 수득된 글로벌 DNA 메틸화 수준이 면역항암제에 대한 치료 반응성의 예측을 반영하는 바이오마커로 이용될 수 있다는 것이 확인되었다(한국특허등록 제2238912호).
구체적으로, 복수 개의 LINE-1(Long Interspersed Nuclear Element-1: L1) 인자에서 발생하는 메틸화의 평균값으로 측정된 글로벌 DNA 메틸화 수준이 면역치료제에 대한 치료 반응성과 상관관계를 갖고, 글로벌 DNA 메틸화 수준이 면역치료제에 대한 치료 반응성을 갖는 것으로 확인된 환자의 코호트로부터의 글로벌 DNA 메틸화 수준보다 낮으면 면역항암제에 대한 치료 반응성이 낮은 것으로 예측되었다. 이러한 글로벌 DNA 메틸화 수준을 "iMethyl"로 명명하였다.
글로벌 L1 메틸화를 대표할 수 있는 10개의 유전좌위(genomic loci)를 대상으로 바이설파이트 처리후 NGS 시퀀싱(ampliseq)을 수행하여 각 유전좌위의 메틸화 스코어를 구하고, 10개의 메틸화 스코어의 평균이나 중앙값과 같은 대표값을 iMethyl 스코어(iMethyl score)로 산출했다. 하기 표 3에 10개의 LINE-1 유전좌위가 표시된다. 각 유전좌위를 검출하기 위한 일루미나 인피니움 메틸레이션에픽 비드칩 (Infinium MethylationEPIC BeadChIP Kit, WG-317-1002)의 프로브 ID를 표시하였다.
No 염색체 표적_위치 프로브 ID
1 19 42,007,378 cg00789198
2 3 28,100,733 cg12678329
3 19 55,039,730 cg17952114
4 11 24,239,975 ch.11.24196551F
5 11 67,350,491 cg08925882
6 15 100,911,974 cg05128056
7 2 195,939,900 ch.2.195648145F
8 8 12,206,841 cg11996397
9 3 94,226,489 cg01291593
10 11 41,668,951 ch.11.41625527F
면역항암제에 대한 치료 반응성이 알려진 선행 코호트 분석을 통해 정해진 컷오프를 기준으로 이보다 높은 경우 TRUE로 예측하였다. 메틸화 스코어는 10개의 유전좌위 각각에서 C가 T로 변환된 서열(C-to-T)의 갯수와 C가 그대로 유지된 서열의 개수로부터 하기 식으로 계산하거나,메틸화 스코어 = C / (C + T)
또는 상보적 가닥의 G가 A로 변환된 서열(G-to-A)의 갯수와 G가 그대로 유지된 서열의 개수로부터 하기 식으로 계산할 수 있다:
메틸화 스코어 = G / (G + A)
10개 유전좌위에서의 메틸화 스코어로부터 중앙값, 평균값, 혹은 기계학습법을 적용한 분석을 통해 하나의 대표값으로 iMethyl 스코어를 산출할 수 있다. 표 2에 표시된 폐암 코호트로부터 10개 유전자위에서의 메틸화 스코어를 각 유전좌위 마다 전체 환자에 대해 평준화하여 z-score 로 변환하고, 각 환자의 평준화된 메틸화 스코어 10개의 평균값을 산출하여 해당 환자의 iMethyl 스코어를 산출할 수 있다. 해당 스코어를 바탕으로 면역항암제 치료 반응성을 예측하는 최적의 컷오프는 0이었다.
또한, 새로운 환자의 iMethyl 스코어로 면역항암제 치료 반응성을 예측하기 위해, 표 2의 폐암 코호트로부터 10개 유전좌위 각각의 메틸화 스코어에 대한 z-score 평준화에 적용되는 평균값과 표준편차 값을 이용하여, 새로운 환자로부터 10개 유전좌위 각각의 메틸화 스코어를 평준화하고 평균값을 산출하여 iMethyl 스코어로 측정할 수 있으며, 해당 스코어가 컷오프 0 이상일 경우 면역항암제에 대한 치료 반응성이 높은 것으로 예측할 수 있다.
1-3. 암 환자의 면역항암제 치료 반응성 예측
1-1 및 1-2에 기재된 DeepNeo 및 iMethyl은 각각 암환자의 면역항암제에 대한 치료 반응성을 예측할 수 있는 바이오마커이다. 개별적으로 적용하여 면역항암제에 대한 치료 반응성을 예측하는 것보다 더 정확하고 유의성 있게 면역항암제에 대한 치료 반응성을 예측하기 위해서 DeepNeo와 iMethyl을 함께 적용하여 암환자의 면역항암제에 대한 치료 반응성의 예측력을 평가하였다.
도 1은 DeepNeo 점수와 iMethyl 점수를 동시에 적용하여 면역항암제 치료 반응성을 결정하는 트리 구조를 도시한다.
통합적용한 바이오마커가 실제로 면역항암치료의 예후를 예측하는데 효과를 보이는지 확인하기 위해 표 2에 표시된 삼성서울병원 면역항암제 폐암 코호트에 속하는 폐암환자 중 기존 바이오마커 PD-L1 및 TMB(Tumor Mutation Burden) 정보가 있는 123명에 대해 생존 분석(Survival analysis)을 실시하였다. 폐암 조직 FFPE(formalin-fixed paraffin-embedded) 검체를 대상으로 1) DeepNeo, 2) iMethyl, 3) DeepNeo+iMethyl 분석을 통해 예측한 결과와 실제 면역항암제 치료 임상 경과 데이터를 바탕으로 Kaplan-Meier 모델을 이용한 생존분석을 수행하였다. 비교를 위해, 기존 바이오마커인 PD-L1 및 TMB를 이용한 분석 결과도 함께 나타내었다.
특정 바이오마커가 면역항암제에 대한 치료 반응성을 예측하는 성능을 측정하기 위해 Cox 비례위험모델 (Cox proportional-hazards model)을 이용한 전체 생존 (Overall survival, OS) 분석을 실시하였으며, 해당 결과를 메타 분석 결과인 forest plot (도 2, 도 4) 및 Kaplan-Meier plot (도 3, 도 5) 으로 나타내었다. Forest plot 에는 각 마커의 예측력을 HR로 95% CI 값과 함께 나타내며, 해당 마커의 컷오프에 따라 분류된 환자군의 수(N)와 p-value 도 함께 나타내었다.
해당 마커의 스코어가 높은 환자군(N_High)이 낮은 환자군(N_Low)에 비해 실제 면역항암 치료 후 생존력이 클수록 낮은 HR 값을 가지며, p-value 가 낮을수록 계산된 HR 값의 신뢰도가 높다는 것을 의미한다. 예를 들어, 도 3의 DeepNeo500 스코어가 컷오프인 4 이상인 값을 가지는 환자군은 4 미만의 스코어를 가지는 환자군보다 0.563배 (HR) 낮은 사망률을 가지며 이는 1.75e-05의 매우 유의한 신뢰도로 계산된 값이다.
통합적용한 바이오마커가 실제로 면역항암치료의 예후를 예측하는데 효과를 보이는지 확인하기 위해 표 2에 표시된 삼성서울병원 면역항암제 폐암 코호트에 대해 기존 바이오마커인 PD-L1 및 TMB와 함께 본 개시의 일 구체예에 따른 DeepNeo500 스코어와 iMethyl 스코어를 각각 산출하였다. 총 4가지 마커 각각에 대한 분석과 이 중 2가지 마커를 조합한 분석을 통해 1) PD-L1, 2) TMB, 3) iMethyl, 4) DeepNeo500, 5) PD-L1+TMB, 6) PD-L1+iMethyl, 7) PD-L1+DeepNeo500, 8) iMethyl+TMB, 9) iMethyl+DeepNeo500 의 마커로부터 예측한 결과와 실제 면역항암제 치료 임상 경과 데이터를 바탕으로 Kaplan-Meier 모델을 이용한 전체 생존 (Overall survival, OS) 분석을 실시하였으며, 그 결과가 각각 도 2 및 도 3에 도시된다.
그 결과, 기존 마커인 PD-L1 및 TMB 대비 개별적으로 iMethyl 및 DeepNeo 마커의 예측 성능이 더 우수한 것으로 나타났으며, 특히 iMethyl과 DeepNeo를 통합할 경우, 개별 마커 혹은 다른 2개 마커의 조합에 비교하여서도 현저하게 우수한 예측력이 있음을 확인하였다.
DeepNeo 스코어의 패널 사이즈 및 iMethyl 과의 통합 여부에 따라 면역항암치료의 예후를 예측하는데 효과를 보이는지 확인하기 위해 표 2에 표시된 삼성서울병원 면역항암제 폐암 코호트에 대해 DeepNeo100, DeepNeo300, DeepNeo500, DeepNeo1000 스코어와 iMethyl 스코어를 각각 산출하였다. 산출된 DeepNeo 스코어 4가지와 각각의 스코어를 iMethyl과 통합한 1) DeepNeo1000, 2) DeepNeo500, 3) DeepNeo300, 4) DeepNeo100, 5) iMethyl+DeepNeo1000, 6) iMethyl+DeepNeo500, 7) iMethyl+DeepNeo300, 8) iMethyl+DeepNeo100의 마커로부터 예측한 결과와 실제 면역항암제 치료 임상 경과 데이터를 바탕으로 Kaplan-Meier 모델을 이용한 전체 생존 (OS) 분석을 실시하였으며, 그 결과가 각각 도 4 및 도 5에 도시된다.
그 결과, DeepNeo 스코어 단독 패널로 분석한 경우 DeepNeo1000, DeepNeo500, DeepNeo300, DeepNeo100 의 순서대로 우수한 예측력을 보였으며, 4가지 DeepNeo 스코어 모두 단독 패널로 분석한 경우보다 iMethyl과 통합하여 분석한 경우 예측력이 증가하였다. 이에 의해, 유효 신생항원을 측정하는 패널 사이즈를 조정하여 정교한 면역치료반응 예측이 가능하며, iMethyl과 통합 분석하는 경우 더욱 우수한 예측력을 가지는 것을 확인하였다.

Claims (13)

  1. 암 환자의 시료에서 암세포 생존 의존성 유전자로부터 유래된 신생항원의 양에 대한 정보를 수득하는 단계,
    상기 시료로부터 글로벌 DNA 메틸화 수준에 대한 정보를 수득하는 단계, 및
    상기 신생항원의 양에 대한 정보 및 글로벌 DNA 메틸화 수준에 대한 정보에 기초하여 암 환자의 면역항암 치료에 대한 반응성을 평가하는 단계를 포함하는, 암환자의 면역항암 치료에 대한 반응성을 예측하는 정보를 제공하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 암세포 생존 의존성 유전자로부터 유래된 신생항원의 양은 신생항원의 개수인 것인 방법.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 암세포 생존 의존성 유전자로부터 유래된 신생항원의 양은 암세포 생존 의존성에 따라 정렬하여 선별된 상위 100개 내지 1000개의 암세포 생존 의존성 유전자로부터 유래된 신생항원의 개수인 것인 방법.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암세포 생존 의존성 유전자로부터 유래된 신생항원의 양은 암세포 생존 의존성에 따라 정렬하여 선별된 상위 100개, 300개, 500개, 또는 1000개의 암세포 생존 의존성 유전자로부터 유래된 신생항원의 개수인 것인 방법.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신생항원은 항원제시세포의 HLA와의 결합력이 CNN-MHC 수치가 0.5 보다 큰 것으로 확인된 것인 방법.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 글로벌 DNA 메틸화 수준은 복수의 Line-1(Long Interpersed Nuclear Element-1) 인자에서 발생하는 메틸화의 평균값으로 측정되는 것인 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 LINE-1 인자는 L1HS 또는 L1PA인 것인 방법.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암 환자의 면역항암 치료에 대한 반응성을 평가하는 단계는 상기 암세포 생존 의존성 유전자로부터 유래된 신생항원의 양 및 상기 글로벌 메틸화 수준을 각각 신생항원의 양에 대한 컷오프 및 글로벌 DNA 메틸화 수준에 대한 컷오프와 비교하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 신생항원의 양에 대한 컷오프 및 글로벌 메틸화 수준에 대한 컷오프는 각각 면역항암 치료 반응성을 갖는 것으로 확인된 환자들의 코호트로부터의 신생항원의 양 및 글로벌 메틸화 수준인 것인 방법.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암 환자의 면역항암 치료에 대한 반응성을 평가하는 단계는 상기 신생항원의 양이 상기 신생항원의 양에 대한 컷오프보다 작거나, 상기 글로벌 메틸화 수준이 상기 글로벌 메틸화 수준에 대한 컷오프보다 작은 경우, 상기 암환자는 면역항암 치료 반응성이 낮은 것으로 판단하고,
    상기 신생항원의 양이 상기 신생항원에 대한 컷오프와 같거나 그보다 크고, 상기 글로벌 메틸화 수준이 상기 글로벌 메틸화 수준에 대한 컷오프와 같거나 그보다 큰 경우, 상기 암환자는 면역항암 치료 반응성이 높은 것으로 판단하는 것인 방법.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 흑색종, 방광암, 식도암, 신경교종, 부신암, 육종, 갑상선암, 결장직장암, 전립선암, 두경부암, 요로상피암, 위암, 췌장암, 간암, 고환암, 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암, 뇌암, 유방암, 신장암, 또는 폐암인 것인 방법.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암 환자의 시료는 혈액, 혈장, 조직, FFPE(formalin-fixed paraffin-embedded) 조직, 세포, 타액, 복수액, 기관지폐포 세척액 (bronchoalveolar lavage fluid, BALF), 뇌척수액, 객담, 또는 소변인 것인 방법.
  13. 면역항암 치료에 대한 반응성을 예측하는 장치로서,
    적어도 하나의 인스트럭션을 저장하기 위한 메모리; 및
    상기 메모리에 저장된 상기 적어도 하나의 인스트럭션을 실행하는 적어도 하나의 프로세서를 포함하고,
    상기 프로세서는 상기 적어도 하나의 인스트럭션을 실행함으로써,
    암 환자의 시료로부터 암세포 생존 의존성 유전자로부터 유래된 신생항원의 양에 대한 정보를 수득하고,
    상기 시료로부터 글로벌 DNA 메틸화 수준에 대한 정보를 수득하며,
    상기 신생항원의 양에 대한 정보 및 글로벌 DNA 메틸화 수준에 대한 정보에 기반하여, 상기 암세포 생존 의존성 유전자로부터 유래된 신생항원의 양 및 상기 글로벌 메틸화 수준을 각각 신생항원의 양에 대한 컷오프 및 글로벌 메틸화 수준에 대한 컷오프와 비교하여, 상기 신생항원의 양과 상기 글로벌 메틸화 수준이 모두 컷오프와 동일하거나 큰 경우, 상기 암 환자는 면역항암 치료에 대한 반응성을 갖는 것으로 판단하며, 상기 컷오프는 면역항암 치료에 대한 반응성이 확인된 환자들의 코호트로부터 결정된 것인 장치.
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