WO2022270865A1 - 이산화탄소 발생형 나노소재 - Google Patents

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WO2022270865A1
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integer
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polyethylene glycol
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이근용
김충구
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한양대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to carbon dioxide generating nanomaterials.
  • Reduction of subcutaneous fat present under the epidermis and dermis of the skin is one of the most important areas of cosmetic treatment, and various treatment methods are used for the purpose of such cosmetic treatment.
  • Procedures for reducing subcutaneous fat include liposuction, in which a cannula is inserted into the subcutaneous fat to suck in the fat, freezing, which cools and necrozes the subcutaneous fat by attaching a cooling pad to the skin surface, and high-frequency or ultrasonic waves are applied to the subcutaneous fat tissue.
  • Thermal heating procedure that removes subcutaneous fat by irradiation and heating
  • Carboxytherapy procedure that removes fat by slowly injecting carbon dioxide (CO2) into subcutaneous fat with an injection needle to promote blood circulation and lymph circulation in adipose tissue
  • CO2 carbon dioxide
  • mesotherapy procedure that injects drugs for obesity treatment into subcutaneous fat.
  • Liposuction which is known to be the most effective among procedures, has disadvantages in terms of pain and future management during the procedure. Typically, there is bleeding during liposuction, and it is accompanied by pain during the procedure. This causes pain even after the procedure, and depending on the individual, there may be cases where you need to take painkillers. In addition, a compression garment must be worn for more than a week after suction surgery, and maintenance is required for about a month after the procedure.
  • Korean Patent Publication No. 10-2011-0119640 uses an invasive procedure in which a probe cooled by circulating a refrigerant inside is inserted into subcutaneous fat.
  • the procedure time is shorter than that of the non-invasive cooling procedure, it has the disadvantage of requiring a considerably longer procedure time to prevent necrosis of subcutaneous fat by cooling.
  • carboxytherapy is a procedure that intensively treats areas where fat is excessively accumulated.
  • mesotherapy and carboxytherapy were performed simultaneously to increase fat removal efficiency.
  • the above patent uses a separate syringe needle for each procedure, and thus has a disadvantage in that the internal structure is complicated and separate incisions are made by each needle.
  • Belkyra is a drug that has been approved as a lipolysis supplement and kills fat cells by destroying the cell membrane of local fat cells.
  • Belkyra has a disadvantage that it is limitedly available only for double chin surgery.
  • these drugs non-specifically destroy cell membranes, they have a great effect on surrounding cells, not just fat cells, and may have side effects on surrounding tissues, so it is currently reported that the risk of breast cancer or colorectal cancer increases.
  • the present invention is intended to provide a local lipolysis supplement or diet beauty product that can be manufactured as an injectable preparation and decomposes local fat.
  • the present invention is capable of generating a large amount of carbon dioxide, and to provide a polyethylene glycol-based micelle into which a peptide is introduced to improve cell penetration.
  • the present invention provides a carbon dioxide foam-type micelle containing at least one compound selected from the group consisting of a compound represented by Formula 1 below and a compound represented by Formula 2 below.
  • R 1 is hydrogen, a C1 to 5 alkyl group, an amine group, a C1 to 5 alkylamine group, a carboxyl group, or a C1 to 5 alkylcarboxyl group;
  • p is an integer from 12 to 227;
  • n is an integer from 2 to 14;
  • n is an integer from 1 to 3;
  • l is an integer of 4.
  • the present invention also relates to polyethylene glycol having a hydroxyl group, which is at least one compound selected from the group consisting of a compound represented by the following formula (1) and a compound represented by the following formula (2) by mixing polyethylene glycol and alkyl chloroformate into which a hydroxyl group is introduced. synthesizing a derivative; and
  • the present invention also provides a composition for fat reduction comprising the carbon dioxide foaming micelles described above.
  • Carbon dioxide foamed micelles according to the present invention are locally administered and deposited on fat cells to generate carbon dioxide, thereby decomposing fat through killing fat cells.
  • the present invention uses a material with high biocompatibility and manufactures micelles in which a multi-arm structure capable of generating a large amount of carbon dioxide is introduced, a larger amount of carbon dioxide can be foamed than conventional polyethylene glycol-based micelles.
  • the micelles according to the present invention can be applied to areas such as the chin, thighs, arms, and stomach, which are generally treated frequently.
  • the carbon dioxide foamed micelles according to the present invention can be manufactured as an injectable formulation, and applied to the field of diet beauty and obesity treatment to decompose local fat through the death of local fat, a local lipolysis supplement, formulation corrector, or diet It can be used as a beauty product and the like.
  • FIG. 1 is a schematic view showing the accumulation of carbon dioxide foam-type micelles in adipocytes and fat reduction through gas foaming according to an example of the present invention.
  • FIG. 2 is a photograph showing the result of measuring the gas generation time of a polyethylene glycol derivative having a hydroxyl group introduced according to an example of the present invention.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of cytotoxicity evaluation of micelles into which peptides prepared according to an example of the present invention are introduced.
  • 5 is a graph showing the results of evaluating the fat cell killing effect according to the concentration of micelles and the combination of peptides.
  • FIG. 6 is a graph showing the in vivo efficacy evaluation results of micelles prepared according to an example of the present invention.
  • Figure 7 is a photograph showing the results of tissue staining of micelles prepared according to an example of the present invention.
  • FIG. 8 is a photograph and a graph showing the result of confirming the residual amount of micelles introduced with peptides of micelles prepared according to an example of the present invention.
  • Carbon dioxide foaming micelles (hereinafter, micelles) according to the present invention are selected from the group consisting of a compound represented by Formula 1 (hereinafter, a compound of Formula 1) and a compound represented by Formula 2 (hereinafter, a compound of Formula 2) It includes one or more compounds that are
  • R 1 is hydrogen, a C1 to 5 alkyl group, an amine group, a C1 to 5 alkylamine group, a carboxyl group, or a C1 to 5 alkylcarboxyl group;
  • p is an integer from 12 to 227;
  • n is an integer from 2 to 14;
  • n is an integer from 1 to 3;
  • l is an integer of 4.
  • the term 'micelle' generally refers to a compound having a spherical structure composed of low molecular weight substances having amphiphilic properties, for example, both hydrophilic and hydrophobic groups.
  • the micelles have thermodynamically stable properties. When a water-insoluble (hydrophobic) drug is dissolved and added to the compound having the micelle structure, the drug exists inside the micelle.
  • the compound may be referred to as a polyethylene glycol derivative.
  • the micelles have a carbonate bond between alkyl chloroformate present in the hydrophobic core and hydrophilic polyethylene glycol located on the surface (or shell). Therefore, in the polyethylene glycol derivative, the alkyl chloroformate portion is located inside the micelles, and the polyethylene glycol portion is located on the surface.
  • the polyethylene glycol derivative constituting the carbon dioxide foaming micelles according to the present invention includes two or more carbonate groups in its structure, and in aqueous conditions, the carbonate groups of the micelles are broken due to hydrolysis to generate carbon dioxide gas. Can cause. As a result, carbon dioxide may be generated in the micelles.
  • q may be an integer of 4 to 10, an integer of 4 to 8, an integer of 6 to 10, or an integer of 8 to 10, n may be an integer of 3 to 10, m is It may be an integer from 2 to 3 or an integer of 3.
  • the compound of formula 1 may contain a plurality of, specifically three alkyl chloroformate moieties.
  • the micelles of the present invention can foam a larger amount of carbon dioxide compared to conventional micelles.
  • the foaming amount of carbon dioxide can be increased in proportion to the number of carbonate groups, and the death rate of fat cells can be improved.
  • the compound of Formula 1 can be expressed as a tri-arm polyethylene glycol derivative.
  • q may be an integer of 4 to 10, an integer of 4 to 8, an integer of 6 to 10, or an integer of 8 to 10, and n may be an integer of 3 to 10, 1 may be an integer of 4.
  • the compound of Formula 2 may include 5 alkyl chloroformate moieties.
  • the micelles of the present invention can foam a larger amount of carbon dioxide compared to conventional micelles.
  • the compound of formula 2 can be expressed as a penta-arm polyethylene glycol derivative.
  • the compound of Formula 1 or Formula 2 may be prepared from polyethylene glycol having a molecular weight of 2,000 to 7,000 Da (g/mol) or 3,000 to 7,000 Da.
  • the diameter of the micelles may be 150 to 500 nm, or 200 to 400 nm. If the diameter is small, the desired effect of killing fat cells cannot be obtained, and if the diameter is too large, it is inappropriate to apply for injection into the body, so it is good to adjust the diameter within the above range.
  • the compound of Formula 1 may be a compound represented by Formula 3 below.
  • the compound of Formula 2 may be a compound represented by Formula 4 below.
  • Carbon dioxide foamed micelles according to the present invention can destroy fat cells by carbon dioxide generated by hydrolysis.
  • the carbon dioxide foaming micelle according to the present invention further comprises a compound represented by Formula 5 (hereinafter, a compound of Formula 5) together with at least one compound selected from the group consisting of the compound of Formula 1 and the compound of Formula 2. can do.
  • a compound represented by Formula 5 hereinafter, a compound of Formula 5
  • p is an integer from 12 to 227;
  • q is an integer from 2 to 14;
  • n is an integer from 0 to 5;
  • L is an r9 (arginine) peptide.
  • q of the compound of Formula 5 may be an integer of 4 to 10, an integer of 4 to 8, an integer of 6 to 10, or an integer of 8 to 10, and n may be an integer of 1 to 3.
  • the compound of Formula 5 may have a structure in which a peptide is bound to the surface of micelles.
  • the peptide may bind to the terminal portion of polyethylene glycol present on the surface of the micelle to form a strong bond.
  • the carboxyl group of the peptide and the terminal amine group of polyethylene glycol may form a bond. Due to the peptide, the micelles of the present invention may have targeting properties.
  • the peptide may be an r9 (arginine) peptide, and the cell permeability of micelles may be improved through the r9 peptide.
  • the compound of Formula 5 may be a compound represented by Formula 6 below.
  • p and q may be the same as p and q of the compound of Formula 5.
  • the weight ratio of at least one compound selected from the group consisting of a compound of Formula 1 and a compound of Formula 2 and a compound of Formula 5 may be 99:1 to 96:4.
  • the present invention relates to a method for preparing the carbon dioxide foam-type micelles described above.
  • the carbon dioxide foaming micelle according to the present invention is obtained by mixing polyethylene glycol into which a hydroxyl group has been introduced and alkyl chloroformate, and polyethylene glycol into which a hydroxyl group is introduced, which is at least one compound selected from the group consisting of a compound of Formula 1 and a compound of Formula 2 below synthesizing a derivative (first step); and
  • R 1 is hydrogen, a C1 to 5 alkyl group, an amine group, a C1 to 5 alkylamine group, a carboxyl group, or a C1 to 5 alkylcarboxyl group;
  • p is an integer from 12 to 227;
  • n is an integer from 2 to 14;
  • n is an integer from 1 to 3;
  • l is an integer of 4.
  • Step 1 Synthesis of a polyethylene glycol derivative into which a hydroxyl group has been introduced
  • polyethylene glycol into which a hydroxyl group is introduced may be prepared first.
  • the polyethylene glycol into which the hydroxyl group is introduced may be prepared by reacting polyethylene glycol with a compound containing a hydroxyl group. At this time, the reaction may be a CDI reaction or an EDC / NHS reaction.
  • polyethylene glycol may have a molecular weight of 2,000 to 7,000 Da (g/mol) or 3,000 to 7,000 Da, but is not limited thereto. If outside the above range, the micelle itself is unstable and there is a risk that bubbles may be generated within a short time. In particular, when the molecular weight is less than 2,000 Da, there is a concern that the formation of micelles does not proceed.
  • the polyethylene glycol derivative into which a hydroxyl group is introduced may be prepared by mixing polyethylene glycol into which a hydroxyl group is introduced and an alkyl chloroformate.
  • a hydroxyl group-introduced polyethylene glycol solution and an alkyl chloroformate solution are prepared by dissolving each of hydroxyl group-introduced polyethylene glycol and alkyl chloroformate in acetonitrile.
  • An alkyl chloroformate solution was added to the prepared polyethylene glycol solution into which a hydroxyl group was introduced, followed by stirring. Pyridine is added to the stirred mixture and then reacted to prepare polyethylene glycol-alkyl carbonate having a hydroxyl group introduced therein.
  • the alkyl chloroformate may be an aliphatic compound, and may be a chloroformate having an alkyl group having 4 to 10 carbon atoms, 4 to 8 carbon atoms, 6 to 10 carbon atoms, or 8 to 10 carbon atoms.
  • butyl chloroformate, octyl chloroformate or dodecyl chloroformate may be used as the alkyl chloroformate, but is not limited thereto.
  • the hydroxyl group-introduced polyethylene glycol solution may be prepared by dissolving 0.05 to 0.8 mmol of hydroxyl group-introduced polyethylene glycol in 2 to 6 ml of acetonitrile, and the alkyl chloroformate solution is prepared by dissolving 1 to 0.8 mmol of hydroxyl group-introduced polyethylene glycol. It can be prepared by dissolving 3 mmol in 3 to 7 ml of acetonitrile.
  • stirring may be performed for 2 to 10 minutes, 3 to 8 minutes, 4 to 6 minutes, or 5 minutes.
  • nitrogen gas may flow during the stirring. Since the reactants are vulnerable to moisture in the air, in the present invention, by flowing nitrogen gas having low reactivity, the reaction can be induced to be stably performed.
  • Such a polyethylene glycol derivative into which a hydroxyl group is introduced is a polyethylene glycol-alkyl carbonate into which a hydroxyl group is introduced.
  • the compound of Formula 3 which is a polyethylene glycol derivative having a hydroxyl group introduced thereto, may be prepared according to Reaction Scheme 3 below.
  • the compound of Chemical Formula 4 which is a polyethylene glycol derivative into which a hydroxyl group is introduced, may be prepared according to Reaction Scheme 4 below.
  • the polyethylene glycol derivative having a hydroxyl group introduced in step 1 can be prepared into micelles through solvent evaporation.
  • micelles may be prepared by dissolving a polyethylene glycol derivative into which a hydroxyl group is introduced in an organic solvent, performing a solvent evaporation method in which the solvent is volatilized, and then redispersed in a hydrophilic solution.
  • a polyethylene glycol derivative into which a hydroxyl group is introduced may be dissolved in an organic solvent.
  • the organic solvent may be a commonly used organic solvent, for example, acetonitrile, methylene chloride, chloroform and methanol.
  • the organic solvent may be a mixed solvent of methylene chloride and acetonitrile, a mixed solvent of methylene chloride and chloroform, or a mixed solvent of methylene chloride and methanol.
  • the mixed solvent used in the present invention may have a ratio of methylene chloride and other solvents of 3 to 1:1 to 3.
  • Coating can be performed on the glass wall for about 5 to 10 minutes at ° C.
  • a concentrator to perform the coating, it is possible to induce the coating to be made uniformly on the glass wall surface.
  • the solvent evaporation method using nitrogen since the solvent is evaporated manually, additional efforts are required to constantly adjust the rotation speed and rotation angle.
  • by performing coating using a concentrator continuous and uniform It has the advantage that one coating is possible.
  • the hydrophilic solution may include PBS and distilled water.
  • micelles when producing micelle particles using the solvent evaporation method, can be prepared using the compound of Formula 5 together with a polyethylene glycol derivative into which a hydroxyl group is introduced.
  • p is an integer from 12 to 227;
  • q is an integer from 2 to 14;
  • n is an integer from 0 to 5;
  • L is an r9 (arginine) peptide.
  • Step 2 of the present invention is to dissolve a polyethylene glycol derivative having a hydroxyl group and a compound represented by Formula 5 below in one or two or more mixed solvents selected from acetonitrile, methylene chloride, chloroform and methanol, and then evaporating the solvent. micelles can be synthesized.
  • the compound of Formula 5 is prepared by mixing polyethylene glycol and alkyl chloroformate to synthesize a polyethylene glycol derivative (hereinafter, step a); and
  • step b of synthesizing a polyethylene glycol derivative to which an r9 (arginine) peptide is coupled to the polyethylene glycol derivative.
  • step a Production of polyethylene glycol derivatives
  • step a may be performed in the same manner as step 1, except that polyethylene glycol is used instead of polyethylene glycol into which a hydroxyl group is introduced.
  • step b Synthesis of polyethylene glycol derivatives incorporating peptides
  • a compound having an amino group and a peptide are reacted with EDC/NHS to produce polyethylene glycol to which the peptide is bound.
  • the compound having an amino group may be aminoethylene glycol, and the peptide may be an r9 (arginine) peptide.
  • the molar ratio between the compound having an amino group and the peptide may be 1:0.1 to 1:10, or 1:0.5 to 1:3, and a polyethylene glycol derivative to which the peptide is bonded may be prepared through an EDC/NHS reaction.
  • the polyethylene glycol into which the peptide is introduced after preparing the polyethylene glycol into which the peptide is introduced, it is dialyzed, and impurities and unreacted substances may be removed through a filter.
  • step c Production of micelle particles using solvent evaporation using polyethylene glycol derivatives with hydroxyl groups and polyethylene glycol derivatives with peptides introduced
  • the polyethylene glycol derivative having a hydroxyl group introduced in step 1 and the polyethylene glycol derivative having a peptide introduced in step b may be prepared as micelles through solvent evaporation.
  • micelles may be prepared by dissolving a polyethylene glycol derivative into which a hydroxyl group and a polyethylene glycol derivative into which a peptide is introduced are dissolved in an organic solvent, performing a solvent evaporation method in which the solvent is volatilized, and then redispersed in a hydrophilic solution.
  • the molar ratio of at least one compound selected from the group consisting of a compound of Formula 1 and a compound of Formula 2 and a compound of Formula 3 may be 99:1 to 96:4.
  • a polyethylene glycol derivative into which a hydroxyl group is introduced and a polyethylene glycol derivative into which a peptide is introduced may be dissolved in an organic solvent.
  • the organic solvent may be a commonly used organic solvent, for example, acetonitrile, methylene chloride, chloroform and methanol.
  • the organic solvent may be a mixed solvent of methylene chloride and acetonitrile, a mixed solvent of methylene chloride and chloroform, or a mixed solvent of methylene chloride and methanol.
  • the mixed solvent used in the present invention may have a ratio of methylene chloride and other solvents of 3 to 1:1 to 3.
  • the coating may proceed on the glass wall for about 5 to 10 minutes at °C, 30 to 40 °C or 37 °C.
  • the coating may be uniformly applied to the glass wall surface by performing the coating using a concentrator. In the case of the solvent evaporation method using nitrogen, since the solvent is evaporated manually, additional effort is required to constantly adjust the rotation speed and rotation angle. It has the advantage that one coating is possible.
  • the hydrophilic solution may include PBS and distilled water.
  • the present invention relates to a composition for fat reduction comprising the above-mentioned carbon dioxide foam micelles.
  • the carbon dioxide foaming micelle according to the present invention includes a carbonate group in its structure, and in aqueous conditions, the carbonate group of the micelle is cut off due to hydrolysis, causing a reaction to generate carbon dioxide gas. Therefore, the carbon dioxide foam micelles of the present invention are topically administered in the form of nanoparticles and are deposited in fat cells to generate gas. Cell damage by the generated carbon dioxide causes necrosis of fat cells, and through this, fat can be reduced (FIG. 1).
  • the cell hitting may be generated after the micelles are endocytosed by adjusting the structure of the carbon dioxide foaming micelles and controlling the generation amount and generation time of the carbon dioxide generated.
  • composition for reducing fat according to the present invention may include micelles containing at least one compound selected from the group consisting of the compound of Formula 1 and the compound of Formula 2 described above.
  • R 1 is hydrogen, a C1 to 5 alkyl group, an amine group, a C1 to 5 alkylamine group, a carboxyl group, or a C1 to 5 alkylcarboxyl group;
  • p is an integer from 12 to 227;
  • n is an integer from 2 to 14;
  • n is an integer from 1 to 3;
  • l is an integer of 4.
  • the fat reduction composition according to the present invention may include micelles containing at least one compound selected from the group consisting of the compound of Formula 1 and the compound of Formula 2 described above, and a compound of Formula 5 below.
  • p is an integer from 12 to 227;
  • q is an integer from 2 to 14;
  • n is an integer from 0 to 5;
  • L is an r9 (arginine) peptide.
  • the ratio of one or more compounds selected from the group consisting of a compound of Formula 1 and a compound of Formula 2 to a compound of Formula 5 may be 99:1 to 96:4.
  • the content of carbon dioxide foamed micelles in the composition for reducing fat may vary depending on the application site and the like, and may be, for example, 0.01 to 1.0 parts by weight or 0.1 to 0.5 parts by weight based on the total weight of the composition.
  • the composition for reducing fat according to the present invention can be used for topical or intravenous injection, and can be applied to areas such as the chin, thighs, arms, and stomach, which are generally treated frequently.
  • composition for fat reduction according to the present invention may be used as a supplement for local lipolysis, a formulation correction agent, or a diet beauty product.
  • Polyethylene glycol was purchased from Sigma Aldrich and used.
  • the usable polyethylene glycol has a number average molecular weight (Mn) of 550 to 20,000, of which polyethylene glycol having a number average molecular weight of 2,000 or 5,000 is preferable for preparing carbon dioxide foamed micelles, and was used in this experiment.
  • alkyl chloroformate a chain aliphatic compound, octyl chloroformate (Sigma Aldrich) was used.
  • An mPEG-tri arm (PEG-T) was prepared by introducing three hydroxyl groups into polyethylene glycol.
  • the prepared polyethylene glycol into which three hydroxyl groups are introduced can be expressed as PEG mw -tri arm (PEG mw -T).
  • PEG mw -T and alkyl chloroformate prepared in Preparation Example 1 were dissolved in acetonitrile, respectively. Specifically, a polyethylene glycol solution was prepared by dissolving 0.5 mmol of PEG mw -T in 4 ml of acetonitrile, and an alkyl chloroformate solution was prepared by adding 2 mmol of alkyl chloroformate to 5 ml of acetonitrile.
  • the mixture was stirred for 5 minutes. During the stirring, nitrogen gas having low reactivity was flowed. After adding 2.5 mmol of pyridine to the stirred mixture, the mixture was reacted at 0° C. for 30 minutes. After the reaction was completed, the mixture was stirred at room temperature for 24 hours to complete the synthesis.
  • the synthesized solution was precipitated in diethyl ether, filtered through a filter, and then dried in a vacuum dryer for 3 to 7 days to obtain a synthetic polymer, a polyethylene glycol derivative, that is, polyethylene glycol-alkyl carbonate.
  • polyethylene glycol derivatives that is, polyethylene glycol-alkyl carbonates
  • the number average molecular weight of polyethylene glycol is 5000 and octyl chloroformate is used, it can be expressed as PEG 5000 -octylcarbonate or PEG 5000 -OC.
  • the prepared polyethylene glycol derivative into which three hydroxyl groups are introduced can be expressed as PEG mw -tri arm-octylcarbonate (PEG mw -T-OC).
  • Sodium Gluconate was dissolved in 0.1M MES/0.3M NaCl buffer. After 10 minutes, 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide was added, after another 10 minutes, sulfo-N-hydroxysuccinimide was added, and after another 10 minutes, methoxypolyethylene glycolamine was added. The mixture was added and reacted for one day to synthesize a polyethylene glycol derivative into which 5 hydroxyl groups were introduced through the EDC/NHS reaction.
  • the prepared polyethylene glycol into which five hydroxyl groups are introduced can be expressed as PEGmw-penta arm (PEGmw-P).
  • a polyethylene glycol solution was prepared by dissolving 0.1 mmol of PEG mw -P prepared in Preparation Example 2-1 in 4 ml of acetonitrile.
  • An alkyl chloroformate solution was prepared by adding 2 mmol of alkyl chloroformate to 5 ml of acetonitrile.
  • the solution was precipitated in diethyl ether, and the supernatant except for the precipitate was removed by centrifugation. After repeating this process 5 times, the precipitate was dried in a freeze dryer for 3 days to obtain a synthetic polymer, polyethylene glycol derivative, that is, polyethylene glycol-alkyl carbonate.
  • the prepared polyethylene glycol derivative into which five hydroxyl groups were introduced can be expressed as PEG mw -penta arm-octylcarbonate (PEG mw -P-OC).
  • a polyethylene glycol derivative was prepared by the method of Preparation Example 1-2, except that polyethylene glycol was used instead of PEG mw -T.
  • the prepared polyethylene glycol derivative can be expressed as PEG mw -octylcarbonate (PEG mw -OC).
  • an amino polyethylene glycol derivative having an amino group and a peptide were reacted with EDC/NHS at a molar ratio of 1:1 to prepare a polyethylene glycol derivative to which the peptide was bonded. Thereafter, dialysis was performed for 4 days, impurities and unreacted substances were removed through a filter, and lyophilization was performed.
  • the polyethylene glycol derivative into which the prepared peptide is introduced can be expressed as r9-PEG mw -octylcarbonate (r9-PEG mw -OC).
  • the micelles were prepared by solvent evaporation using a mixed solvent containing methylene chloride and acetonitrile in a ratio of 2:1.
  • a concentrator N- 1300 was used to coat the glass wall at 180 rpm and 37° C. for about 5 to 10 minutes in a vacuum, and the glass surface was coated with derivative particles (solvent evaporation).
  • Self-assembly was performed by adding a hydrophilic solution (including PBS and distilled water) after solvent evaporation, and micelles were prepared.
  • a hydrophilic solution including PBS and distilled water
  • PEG mw -OC micelles Prepare micelles using PEG mw -OC.
  • PEG mw - T-OC micelles Prepare micelles using PEG mw - T-OC.
  • PEG mw -P-OC micelles Preparation of micelles using PEG mw -P-OC.
  • r9-PEG mw -OC micelles Prepare micelles using PEG mw -OC and r9-PEG mw -OC.
  • r9-PEG mw -T-OC micelles Prepare micelles using PEG mw -T-OC and r9-PEG mw -OC.
  • the mixing ratio (weight ratio) of PEG mw -OC and r9-PEG mw -OC is 50:1.
  • the mixing ratio (weight ratio) of PEG mw -T-OC and r9-PEG mw -OC is 50:1.
  • Table 1 in the present invention shows the amount of hydroxyl group increase according to the molecular weight of polyethylene glycol.
  • the cell killing effect according to the amount of the cell penetrating peptide (r9 peptide) introduced into the micelle surface was confirmed.
  • the r9-PEG mw -OC micelle prepared in Preparation Example 5 was used, and at this time, the amount of polyethylene glycol derivative into which the peptide was introduced was 0% to 4% relative to the total weight (weight) of the derivative (r9- PEG mw -OC/PEG mw -OC).
  • the killing ability was performed according to the MTS assay method.
  • the appropriate concentration of the peptide derivative varies depending on the molecular weight of polyethylene glycol, and when using a derivative with a molecular weight of 2,000, it is 2-4%, and when using a derivative with a molecular weight of 5,000, it is 1-4% relative to the weight of the derivative.
  • the apoptosis of adipocytes in the non-gas group was analyzed.
  • the micelles prepared in Preparation Example 5 were treated at a concentration of 0.1 to 0.5 wt% to evaluate the cell killing ability.
  • PEG mw -OC micelles PEG 5000 -octylcarbonate micelle
  • PEG mw -T-OC micelles PEG 5000 -triarm-octylcarbonate micelle
  • r9-PEG mw -OC micelles r9-PEG 5000 -octylcarbonate micelle
  • the cell killing ability of r9-PEG mw -T-OC micelles was evaluated.
  • the highest apoptosis was confirmed in micelles in which the carbon dioxide foaming amount was increased by introducing a hydroxyl group into polyethylene glycol, and higher cell death was confirmed compared to the group in which no hydroxyl group was introduced.
  • Obesity induced rats were induced through high-fat feeding for about 10 weeks for micelle administration. After a single administration of micelles at a concentration of 25 mg/kg to the left fat pad of obese mice weighing 40 g or more, the body weight was observed for 3 weeks, and then the fat pad at the site of administration and the fat pad on the opposite side (non-administration) were extracted. Thus, the weight ratio confirmed the treatment effect.
  • carbon dioxide foamed micelles according to the present invention r9-PEG 5000 -T-OA micelles; r9-PEG5000-tri arm-octylamine micelles
  • the non-gas group r9-PEG 5000 -T-OA micelles
  • H&E Hematocyline & Eosin
  • Residuality of the micelles in PEGmw-T-OC micelles and r9-PEGmw-T-OC micelles was confirmed by a biodistribution test using a fluorescently labeled drug.
  • topical administration was performed in the left fat pad as in the above method for administering the therapeutic effect, and the amount of micelles remaining 24 or 48 hours after administration was relatively compared by checking the fluorescence intensity.
  • r9-PEG 5000 -T-OC micelles Compared to PEG 5000 -T-OC micelles to which no peptide was introduced, r9-PEG 5000 -T-OC micelles remained at the site of administration for a longer period of time using fluorescently labeled micelles.
  • the micelles may be continuously hydrolyzed.
  • the micelles to which no peptides have been introduced rapidly move to the liver and kidneys, which later enter the liver and kidney cells to foam gas and cause side effects. Therefore, the side effects can be minimized by introducing the peptides as in the present invention. there is.
  • the carbon dioxide foamed micelles according to the present invention can be manufactured as an injectable preparation, and applied to the field of diet beauty and obesity treatment to decompose local fat through the destruction of local fat, a local lipolysis supplement, formulation correction agent, or diet beauty product etc. can be used.

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Abstract

본 발명은 이산화탄소 발포형 마이셀에 관한 것이다. 본 발명에서는 생체친화성이 높은 재료를 이용하고 다량의 이산화탄소의 발생이 가능한 멀티-암 구조가 도입된 마이셀을 제조하므로, 기존 폴리에틸렌글리콜 기반 마이셀 보다 보다 더 많은 양의 이산화탄소 발포가 가능하다. 또한, 본 발명에서는 리간드(펩타이드)를 사용하여 세포 내 침투가 향상되므로, 지방세포로의 표적이 가능하고, 주변 조직 및 세포에 대한 영향을 최소화할 수 있다. 본 발명에 따른 이산화탄소 발포형 마이셀은 주사 가능한 제제로 제작 가능하고, 국소 지방을 분해하는 국소 지방 분해 보완재 또는 다이어트 미용 제품으로 적용될 수 있다.

Description

이산화탄소 발생형 나노소재
본 발명은 이산화탄소 발생형 나노소재에 관한 것이다.
피부의 표피와 진피 아래에 존재하는 피하지방의 감소는 미용 처리의 가장 중요한 분야 중 하나이며, 이러한 미용 처리의 목적을 위해 다양한 시술 방법이 사용되고 있다.
피하지방 감소를 위한 시술로는 피하지방에 캐뉼라(cannula)를 삽입하여 지방을 흡입하는 지방 흡입술, 냉각 패드를 피부표면에 부착하여 피하지방을 냉각 괴사시키는 냉동 시술, 고주파 또는 초음파를 피하지방 조직에 조사하여 가열에 의해 피하지방을 제거하는 열적 가열 시술, 이산화탄소(CO2)를 주사바늘로 피하지방에 서서히 주입하여 지방조직의 혈류 순환 및 림프 순환을 촉진함으로써 지방을 제거하는 카복시테라피(Carboxytherapy) 시술, 피하지방에 비만 치료용 약물을 주입하는 메조테라피(Mesotherapy) 시술 등이 있다.
시술 중 가장 효과가 높다고 알려진 지방 흡입술은 시술시 동반되는 고통 및 향후 관리에서 단점을 가진다. 대표적으로 지방 흡입시 출혈이 있으며, 시술 시 통증을 동반한다. 이는 시술 이후에도 통증을 유발하여 개개인에 따라 진통제를 복용해야하는 경우도 생기게 된다. 이와 더불어 흡입 수술 이후 압박복을 일주일 이상 착용해야하며, 시술 후 한달 정도의 관리를 필요로 한다.
또한, 냉동 시술은 시술이 간편하지만 시술 효과가 낮은 단점을 가진다. 한국 공개특허 제10-2011-0119640호에서는 냉매를 내부로 순환시켜 냉각되는 프로브를 피하지방에 삽입하는 침습적 시술을 사용하였다. 하지만, 침습적 냉각 시술을 사용할 경우 시술 시간이 비침습적 냉각 시술보다 단축되기는 하지만, 냉각에 의한 피하지방의 괴사를 방지하기위해 상당히 긴 시술 시간을 요하는 단점을 가진다.
한편, 카복시테라피는 지방이 과도하게 축적된 부위를 집중적으로 치료하는 시술로서, 한국 등록특허 제10-0772961에서는 메조테라피 시술과 카복시테라피 시술을 모수 수행하여 지방 제거 효율을 높였다. 그러나, 상기 특허는 각 시술에 대해 별도의 주사기 바늘을 사용하고 있어, 내부 구조가 복잡하고 각각의 바늘에 의해 별도의 절개창이 생기는 단점을 가진다.
현재 식품의약품안전처의 허가가 완료된 국소 지방분해 보완재는 용도가 매우 한정적이고, 현재 시중에서는 오프라벨 시술이 빈번하게 시행되고 있는 실정이다. 이러한 오프라벨 시술은 안전성 및 유효성에 대한 근거가 부족하고, 비급여 영역이기 때문에 안전 사용관리의 사각지대에 놓여있으며, 제도적인 관리가 미흡하다.
지방 분해 보완재로 허가를 받은 약물로 국소 지방세포의 세포막을 파괴함으로써 지방세포를 사멸시키는 벨카이라가 있다. 그러나, 벨카이라는 이중 턱 시술에만 한정적으로 이용 가능하다는 단점을 가진다. 또한, 이러한 약물은 비특이적으로 세포막을 파괴하므로 지방세포만이 아닌 주변 세포에 대한 영향이 커서, 주변 조직에 부작용을 미칠 수 있기 때문에 현재 유방함 또는 대장암의 위험성이 증가한다고 보고되고 있다.
본 발명은 전술한 문제점을 해결하기 위하여, 주사 가능한 제제로 제작이 가능하고, 국소 지방을 분해하는 국소 지방 분해 보완재 또는 다이어트 미용 제품을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 다량의 이산화탄소 발생이 가능하고, 세포 침투를 향상시키기 위하여 펩타이드가 도입된 폴리에틸렌글리콜 기반의 마이셀을 제공하고자 한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표현되는 화합물 및 하기 화학식 2로 표현되는 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함하는 이산화탄소 발포형 마이셀을 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2022008764-appb-img-000001
[화학식 2]
Figure PCTKR2022008764-appb-img-000002
상기 화학식 1 또는 화학식 2에서,
R1은 수소, C1 내지 5의 알킬기, 아민기, C1 내지 5의 알킬아민기, 카르복실기 또는 C1 내지 5의 알킬카르복실기이고,
p는 12 내지 227의 정수이며,
n은 2 내지 14의 정수이고,
m은 1 내지 3의 정수이며,
l은 4의 정수이다.
본 발명은 또한, 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜 및 알킬 클로로포메이트를 혼합하여 하기 화학식 1로 표현되는 화합물 및 하기 화학식 2로 표현되는 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물인 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜 유도체를 합성하는 단계; 및
상기 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜 유도체를 아세토니트릴, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름 및 메탄올에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합용매에 용해시킨 후 용매를 증발시켜 마이셀을 합성하는 단계;를 포함하는 이산화탄소 발포형 마이셀의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 전술한 이산화탄소 발포형 마이셀을 포함하는 지방 감소용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 이산화탄소 발포형 마이셀은 국소 투여되어 지방세포 부위에 침적되어 이산화탄소를 발생시킴으로써, 지방세포를 사멸을 통해 지방을 분해시킬 수 있다.
특히, 본 발명에서는 생체친화성이 높은 재료를 이용하고 다량의 이산화탄소의 발생이 가능한 멀티-암 구조가 도입된 마이셀을 제조하므로, 기존 폴리에틸렌글리콜 기반 마이셀 보다 보다 더 많은 양의 이산화탄소 발포가 가능하다.
또한, 본 발명에서는 리간드(펩타이드)를 사용하여 세포 내 침투가 향상되므로, 지방세포로의 표적이 가능하고, 주변 조직 및 세포에 대한 영향을 최소화할 수 있다. 이를 틍해 약물에 대한 부작용을 최소화 할 수 있고, 더욱 안전한 시술이 가능한 제품 개발이 가능하다. 본 발명에 따른 마이셀은 일반적으로 시술 빈도가 높은 턱, 허벅지, 팔, 배 등의 부위에 적용이 가능하다.
또한, 본 발명에 따른 이산화탄소 발포형 마이셀은 주사 가능한 제제로 제작가능하고, 다이어트 미용 분야 및 비만치료제 분야에 적용되어 국소 지방의 사멸을 통해 국소 지방을 분해하는 국소 지방 분해 보완재, 제형 교정제 또는 다이어트 미용 제품 등으로 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일례에 따른 이산화탄소 발포형 마이셀의 지방세포에의 축적 및 기체 발포를 통한 지방 감소를 보여주는 모식도이다.
도 2은 본 발명의 일례에 따라 제조된 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜 유도체의 기체 발생 시간을 측정한 결과를 나타내는 사진이다.
도 3은 본 발명의 일례에 따라 제조된 펩타이드가 도입된 마이셀의 세포독성 평가 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 기체 미발포 그룹의 지방세포 사멸효과 평가 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 마이셀 농도 및 펩타이드 조합에 따른 지방세포 사멸효과 평가 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일례에 따라 제조된 마이셀의 생체 내 효능 평가 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일례에 따라 제조된 마이셀의 투여 조직 염색 결과를 나타내는 사진이다.
도 8은 본 발명의 일례에 따라 제조된 마이셀의 펩타이드 도입 마이셀의 잔여량 확인 결과를 나타내는 사진 및 그래프이다.
이하, 본 발명의 이산화탄소 발포형 마이셀을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에 따른 이산화탄소 발포형 마이셀(이하, 마이셀)은 하기 화학식 1로 표현되는 화합물(이하, 화학식 1의 화합물) 및 하기 화학식 2로 표현되는 화합물(이하, 화학식 2의 화합물)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2022008764-appb-img-000003
[화학식 2]
Figure PCTKR2022008764-appb-img-000004
상기 화학식 1 또는 화학식 2에서,
R1은 수소, C1 내지 5의 알킬기, 아민기, C1 내지 5의 알킬아민기, 카르복실기 또는 C1 내지 5의 알킬카르복실기이고,
p는 12 내지 227의 정수이며,
n은 2 내지 14의 정수이고,
m은 1 내지 3의 정수이며,
l은 4의 정수이다.
본 발명에서 용어 '마이셀(micelle)'은 일반적으로 양친성, 예컨대 친수성기와 소수성기를 동시에 갖는 저분자량의 물질들이 이루는 구형의 구조의 화합물을 의미한다. 상기 마이셀은 열역학적으로 안정한 특성을 가진다. 상기 마이셀 구조를 갖는 화합물에 비수용성(소수성) 약물을 녹여 투입하는 경우 상기 약물은 마이셀 내부에 존재하게 된다.
본 발명의 마이셀은 알킬 클로로포메이트가 폴리에틸렌글리콜의 하이드록시기와 컨쥬게이트 되어 카보네이트기(-O-(C=O)-O-)가 형성된 화합물을 포함한다. 본 발명에서는 상기 화합물을 폴리에틸렌글리콜 유도체라 표현할 수 있다.
구체적으로, 상기 마이셀은 소수성 코어(core)에 존재하는 알킬 클로로포메이트와 표면(또는 쉘, shell)에 위치하는 친수성 폴리에틸렌글리콜 간의 카보네이트 결합을 가진다. 따라서, 폴리에티렌글리콜 유도체에서 알킬 클로로포메이트 부분은 마이셀의 내부에 위치하고, 폴리에틸렌글리콜 부분은 표면에 위치하고 있는 형태를 가진다.
본 발명에 따른 이산화탄소 발포형 마이셀을 구성하는 폴리에틸렌글리콜 유도체는 그 구조 내에 둘 이상의 카보네이트기를 포함하며, 수용성 조건에서 상기 마이셀의 카보네이트기는 가수분해로 인해 끊어지면서 이산화탄소 기체를 생성하는 반응을 일으킬 수 있다. 이에 의해, 상기 마이셀에서 이산화탄소가 발생할 수 있다.
일 구체예에서, 화학식 1의 화합물에서 q는 4 내지 10의 정수, 4 내지 8의 정수, 6 내지 10의 정수 또는 8 내지 10의 정수일 수 있고, n은 3 내지 10의 정수일 수 있으며, m은 2 내지 3의 정수 또는 3의 정수일 수 있다.
일 구체예에서, 화학식 1의 화합물은 복수 개, 구체적으로 3 개의 알킬 클로로포메이트 부분을 포함할 수 있다. 이를 통해, 본 발명의 마이셀은 기존의 마이셀과 비교하여 더 많은 양의 이산화탄소의 발포가 가능하다. 상기 이산화탄소의 발포량은 카보네이트기의 수에 비례적으로 향상될 수 있으며, 지방세포 사멸율의 향상이 가능하다.
본 발명에서는 m의 수에 따라, 상기 m이 3일 경우 화학식 1의 화합물을 tri-arm 폴리에틸렌글리콜 유도체로 표현할 수 있다.
또한, 일 구체예에서, 화학식 2의 화합물에서 q는 4 내지 10의 정수, 4 내지 8의 정수, 6 내지 10의 정수 또는 8 내지 10의 정수일 수 있고, n은 3 내지 10의 정수일 수 있으며, 1은 4의 정수일 수 있다.
일 구체예에서, 화학식 2의 화합물은 5 개의 알킬 클로로포메이트 부분을 포함할 수 있다. 이를 통해, 본 발명의 마이셀은 기존의 마이셀과 비교하여 더 많은 양의 이산화탄소의 발포가 가능하다.
본 발명에서는 l의 수에 따라, 상기 l이 4일 경우 화학식 2의 화합물을 penta-arm 폴리에틸렌글리콜 유도체로 표현할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 화학식 1의 화합물 또는 화학식 2의 화합물은 분자량이 2,000 내지 7,000 Da(g/mol) 또는 3,000 내지 7,000 Da인 폴리에틸렌글리콜로부터 제조될 수 있다.
일 구체예서, 상기 마이셀의 직경은 150 내지 500 nm, 또는 200 내지 400 nm 일 수 있다. 직경이 작으면 목적하는 지방세포 사멸 효과를 얻을 수 없으며, 너무 크면 체내 주입용으로 적용하기 부적절하므로 직경을 상기 범위로 조절하는 것이 좋다.
일 구체예에서, 화학식 1의 화합물은 하기 화학식 3으로 표현되는 화합물일 수 있다.
[화학식 3]
Figure PCTKR2022008764-appb-img-000005
또한, 일 구체예에서, 화학식 2의 화합물은 하기 화학식 4로 표현되는 화합물일 수 있다.
[화학식 4]
Figure PCTKR2022008764-appb-img-000006
본 발명에 따른 이산화탄소 발포형 마이셀은 가수분해에 의해 발생된 이산화탄소에 의해 지방세포가 파괴될 수 있다.
본 발명에 따른 이산화탄소 발포형 마이셀은 전술한 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물과 함께 하기 화학식 5로 표현되는 화합물(이하, 화학식 5의 화합물)을 추가로 포함할 수 있다.
[화학식 5]
Figure PCTKR2022008764-appb-img-000007
상기 화학식 5에서,
p는 12 내지 227의 정수이고,
q는 2 내지 14의 정수이며
n은 0 내지 5의 정수이고,
L은 r9(arginine) 펩타이드이다.
일 구체예에서, 상기 화학식 5의 화합물의 q는 4 내지 10의 정수, 4 내지 8의 정수, 6 내지 10의 정수 또는 8 내지 10의 정수일 수 있으며, n은 1 내지 3의 정수일 수 있다.
일 구체예에서, 화학식 5의 화합물은 마이셀의 표면에 펩타이드가 결합된 구조를 가질 수 있다. 상기 펩타이드는 마이셀 표면에 존재하는 폴리에틸렌글리콜의 말단 부위에 결합하여 강한 결합을 형성할 수 있는데, 일 구체예에서, 펩타이드의 카르복실기와 폴리에틸렌글리콜의 말단의 아민기가 결합을 형성할 수 있다. 상기 펩타이드에 의해, 본 발명의 마이셀은 표적지향성을 가질 수 있다.
일 구체예에서, 펩타이드는 r9(arginine) 펩타이드일 수 있으며, r9 펩타이드를 통해 마이셀의 세포 투과율을 향상시킬 수 있다.
일 구체예에서, 화학식 5의 화합물은 하기 화학식 6으로 표현되는 화합물일 수 있다.
[화학식 6]
Figure PCTKR2022008764-appb-img-000008
상기 화학식 6에서, p 및 q은 화학식 5의 화합물의 p 및 q와 같을 수 있다.
일 구체예에서, 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물과 화학식 5의 화합물의 중량 비율은 99:1 내지 96:4일 수 있다.
또한, 본 발명은 전술한 이산화탄소 발포형 마이셀의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 이산화탄소 발포형 마이셀은 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜 및 알킬 클로로포메이트를 혼합하여 하기 화학식 1의 화합물 및 하기 화학식 2의 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물인 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜 유도체를 합성하는 단계(제1 단계); 및
상기 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜 유도체를 아세토니트릴, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름 및 메탄올에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합용매에 용해시킨 후 용매를 증발시켜 마이셀을 합성하는 단계(제2 단계)를 통해 제조될 수 있다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2022008764-appb-img-000009
[화학식 2]
Figure PCTKR2022008764-appb-img-000010
상기 화학식 1 또는 화학식 2에서,
R1은 수소, C1 내지 5의 알킬기, 아민기, C1 내지 5의 알킬아민기, 카르복실기 또는 C1 내지 5의 알킬카르복실기이고,
p는 12 내지 227의 정수이며,
n은 2 내지 14의 정수이고,
m은 1 내지 3의 정수이며,
l은 4의 정수이다.
이하, 본 발명의 이산화탄소 발포형 마이셀 제조방법을 상세히 살펴본다.
단계 1. 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜 유도체 합성
폴리에틸렌글리콜 유도체의 합성에 앞서, 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜을 먼저 제조할 수 있다.
상기 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜은 폴리에틸렌글리콜을 수산기를 포함하는 화합물과 반응시켜 제조할 수 있다. 이때, 반응은 CDI 반응 또는 EDC/NHS 반응일 수 있다.
일 구체예에서, 폴리에틸렌글리콜은 이에 제한되는 것은 아니나, 분자량이 2,000 내지 7,000 Da(g/mol) 또는 3,000 내지 7,000 Da일 수 있다. 상기 범위를 벗어날 경우, 마이셀 자체가 불안정하여 기포가 빠른 시간 내에 발생될 우려가 있다. 특히, 분자량이 2,000 Da 미만일 경우 마이셀이 형성이 진행되지 않을 우려가 있다.
일 구체예에서, 폴리에틸렌글리콜에 3 개의 수산기를 도입할 경우, 하기 반응식 1에 따라 제조할 수 있다.
[반응식 1]
Figure PCTKR2022008764-appb-img-000011
또한, 일 구체예에서, 폴리에틸렌글리콜에 5 개의 수산기를 도입할 경우, 하기 반응식 2에 따라 제조할 수 있다.
[반응식 2]
Figure PCTKR2022008764-appb-img-000012
본 발명에서 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜 유도체는 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜 및 알킬 클로로포메이트를 혼합하여 제조할 수 있다.
우선, 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜과 알킬 클로로포메이트 각각을 아세토니트릴에 용해시켜 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜 용액 및 알킬 클로로포메이트 용액을 준비한다. 준비된 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜 용액에 알킬 클로로포메이트 용액을 첨가한 후 교반한다. 상기 교반이 완료된 혼합물에 피리딘을 첨가한 후 반응시켜 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜-알킬 카보네이트를 제조한다.
일 구체예에서, 알킬 클로로포메이트는 지방족 화합물일 수 있으며, 탄소수 4 내지 10, 탄소수 4 내지 8, 탄소수 6 내지 10 또는 탄소수 8 내지 10의 알킬기를 가지는 클로로포메이트일 수 있다. 예를들어, 알킬 클로로포메이트로 부틸 클로로포메이트, 옥틸 클로로포메이트 또는 도데실 클로로포메이트가 사용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에서, 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜 용액은 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜 0.05 내지 0.8 mmol을 아세토니트릴 2 내지 6 ml에 용해시켜 준비될 수 있고, 알킬 클로로포메이트 용액은 알킬 클로로포메이트 1 내지 3 mmol을 아세토니트릴 3 내지 7 ml에 용해시켜 준비될 수 있다.
일 구체예에서, 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜 용액에 알킬 클로로포메이트 용액을 첨가한 뒤, 2 내지 10 분, 3 내지 8 분, 4 내지 6 분 또는 5 분 동안 교반을 수행할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 교반시 질소 가스를 흘려줄 수 있다. 반응물은 대기 중의 수분에 취약하므로, 본 발명에서는 반응성이 낮은 질소 가스를 흘려줌으로써, 반응이 안정적으로 이루어질 수 있도록 유도할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 교반이 완료된 혼합물에 피리딘 0.5 내지 3.5 mmol을 첨가한 후, 0 내지 5℃ 에서 20 내지 40 분간 반응시킨 뒤, 상온에서 24 시간 반응시켜 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜 유도체를 제조할 수 있다.
이러한, 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜 유도체는 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜-알킬 카보네이트이다.
일 구체예에서, 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜 유도체인 화학식 3의 화합물은 하기 반응식 3에 따라 제조될 수 있다.
[반응식 3]
Figure PCTKR2022008764-appb-img-000013
또한, 일 구체예에서, 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜 유도체인 화학식 4 의 화합물은 하기 반응식 4에 따라 제조될 수 있다.
[반응식 4]
Figure PCTKR2022008764-appb-img-000014
단계 2. 용매증발법을 이용한 마이셀 입자 제조
단계 1에서 제조된 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜 유도체를 용매증발법을 통하여 마이셀로 제조할 수 있다.
구체적으로, 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜 유도체를 유기용매에 녹이고, 용매를 휘발시키는 용매증발법을 수행한 후, 친수성 용액에 재분산 시켜 마이셀을 제조할 수 있다.
일 구체예에서, 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜 유도체 5 내지 15 mg을 유기용매에 녹일 수 있다. 상기 유기용매는 통상적으로 사용되는 유기용매일 수 있으며 예를들면, 아세토니트릴, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름 및 메탄올일 수 있다.
또한, 유기용매는 메틸렌 클로라이드 및 아세토니트릴의 혼합용매, 메틸렌 클로라이드 및 클로로포름의 혼합용매, 메틸렌 클로라이드 및 메탄올의 혼합용매일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 혼합용매는 메틸렌 클로라이드와 다른 용매의 비율이 3 내지 1 : 1 내지 3 일 수 있다.
일 구체예에서, 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜 유도체를 유기용매에 녹인 후, 농축기를 이용하여 진공속에서 100 내지 300 rpm, 150 내지 200 rpm 또는 180 rpm, 25 내지 45℃, 30 내지 40℃ 또는 37℃에서 약 5 내지 10 분 간 유리 벽면에 코팅을 진행할 수 있다. 본 발명에서는 농축기를 이용하여 코팅을 진행함으로써, 유리 벽면에 코팅이 균일하게 이루어지도록 유도할 수 있다. 질소를 이용한 용매 증발법의 경우, 수작업을 통해 용매를 증발시키므로, 회전 속도 및 회전 각도를 일정하게 조절하기 위한 추가의 노력이 필요하나, 본 발명에서는 농축기를 이용하여 코팅을 수행함으로써, 계속적이며 균일한 코팅이 가능하다는 장점을 가진다.
또한, 일 구체예에서, 친수성 용액은 PBS 및 증류수를 포함할 수 있다.
본 발명에서는 용매증발법을 이용한 마이셀 입자 제조 시, 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜 유도체와 함께 화학식 5의 화합물을 사용하여 마이셀을 제조할 수 있다.
[화학식 5]
Figure PCTKR2022008764-appb-img-000015
상기 화학식 5에서,
p는 12 내지 227의 정수이고,
q는 2 내지 14의 정수이며
n은 0 내지 5의 정수이고,
L은 r9(arginine) 펩타이드이다.
즉. 본 발명의 단계 2는 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜 유도체 및 하기 화학식 5으로 표현되는 화합물을 아세토니트릴, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름 및 메탄올에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합용매에 용해시킨 후 용매를 증발시켜 마이셀을 합성할 수 있다.
본 발명에서, 화학식 5의 화합물은 폴리에틸렌글리콜 및 알킬 클로로포메이트를 혼합하여 폴리에틸렌글리콜 유도체를 합성하는 단계(이하, 단계 a); 및
상기 폴리에틸렌글리콜 유도체에 r9(arginine) 펩타이드를 결합시켜 펩타이드가 결합된 폴리에틸렌글리콜 유도체를 합성하는 단계(이하, 단계 b)를 통해 제조할 수 있다.
단계 a. 폴리에틸렌글리콜 유도체 제조
일 구체예에서, 단계 a는 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜 대신 폴리에틸렌글리콜을 사용한 것을 제외하고는 단계 1과 같은 방법으로 수행될 수 있다.
단계 b. 펩티아드가 도입된 폴리에틸렌글리콜 유도체 합성
상기 단계 a.에서 제조된 폴리에틸렌글리콜 유도체에 펩타이드를 도입하여 지방 세포로의 표적 지향성을 향상시킬 수 있다.
아미노기를 가지는 화합물과 펩타이드를 EDC/NHS 반응시켜, 펩타이드가 결합된 폴리에틸렌글리콜을 제조한다.
일 구체예에서, 아미노기를 가지는 화합물은 아미노에틸렌 글리콜(aminopolyethylene glycol)일 수 있으며, 펩타이드는 r9(arginine) 펩타이드일 수 있다.
일 구체예에서, 아미노기를 가지는 화합물과 펩타이드의 몰비는 1:0.1 내지 1:10, 또는 1:0.5 내지 1:3일 수 있으며, EDC/NHS 반응을 통해 펩타이드가 결합된 폴리에틸렌글리콜 유도체를 제조할 수 있다.
일 구체예에서, 펩타이드가 도입된 폴리에틸렌글리콜을 제조한 후, 투석하고, 필터를 통해 불순물 및 미반응 물질을 제거할 수 있다.
단계 c. 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜 유도체 및 펩타이드가 도입된 폴리에틸렌글리콜 유도체를 사용한 용매증발법을 이용한 마이셀 입자 제조
단계 1에서 제조된 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜 유도체 및 단계 b에서 제조된 펩타이드가 도입된 폴리에틸렌글리콜 유도체를 용매증발법을 통하여 마이셀로 제조할 수 있다.
구체적으로, 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜 유도체 및 펩타이드가 도입된 폴리에틸렌글리콜 유도체를 유기용매에 녹이고, 용매를 휘발시키는 용매증발법을 수행한 후, 친수성 용액에 재분산 시켜 마이셀을 제조할 수 있다.
일 구체예에서, 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물, 및 화학식 3의 화합물의 몰 비율은 99:1 내지 96:4일 수 있다.
일 구체예에서, 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜 유도체 및 펩타이드가 도입된 폴리에틸렌글리콜 유도체 5 내지 15 mg을 유기용매에 녹일 수 있다. 상기 유기용매는 통상적으로 사용되는 유기용매일 수 있으며 예를들면, 아세토니트릴, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름 및 메탄올일 수 있다.
또한, 유기용매는 메틸렌 클로라이드 및 아세토니트릴의 혼합용매, 메틸렌 클로라이드 및 클로로포름의 혼합용매, 메틸렌 클로라이드 및 메탄올의 혼합용매일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 혼합용매는 메틸렌 클로라이드와 다른 용매의 비율이 3 내지 1 : 1 내지 3 일 수 있다.
일 구체예에서, 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜 유도체 및 펩타이드가 도입된 폴리에틸렌글리콜 유도체를 유기용매에 녹인 후, 농축기를 이용하여 진공속에서 100 내지 300 rpm, 150 내지 200 rpm 또는 180 rpm, 25 내지 45℃, 30 내지 40℃ 또는 37℃에서 약 5 내지 10 분 간 유리 벽면에 코팅을 진행할 수 있다. 본 발명에서는 농축기를 이용하여 코팅을 진행함으로써, 유리 벽면에 코팅이 균일하게 이루어지도록 유도할 수 있다. 질소를 이용한 용매 증발법의 경우, 수작업을 통해 용매를 증발시키므로, 회전 속도 및 회전 각도를 일정하게 조절하기 위한 추가의 노력이 필요하나, 본 발명에서는 농축기를 이용하여 코팅을 수행함으로써, 계속적이며 균일한 코팅이 가능하다는 장점을 가진다.
또한, 일 구체예에서, 친수성 용액은 PBS 및 증류수를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 전술한 이산화탄소 발포형 마이셀을 포함하는 지방 감소용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 이산화탄소 발포형 마이셀은 그 구조 내에 카보네이트기를 포함하며, 수용성 조건에서 상기 마이셀의 카보네이트기는 가수분해로 인해 끊어지면서 이산화탄소 기체를 생성하는 반응을 일으키게 된다. 따라서, 본 발명의 이산화탄소 발포형 마이셀은 나노입자의 형태로 국소 투여되고 지방 세포에 침적되어 기체가 발생한다. 상기 발생된 이산화탄소에 의한 세포 타격을 통해 지방세포의 괴사가 일어나고, 이를 통해 지방을 감소시킬 수 있다(도 1).
상기 세포 타격은 이산화탄소 발포형 마이셀의 구조를 조절하여, 생성되는 이산화탄소의 발생량과 발생 시간을 조절하여, 상기 마이셀이 세포 내 이입된 후 발생시킬 수 있다.
본 발명에 따른 지방 감소용 조성물은 전술한 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함하는 마이셀을 포함할 수 있다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2022008764-appb-img-000016
[화학식 2]
Figure PCTKR2022008764-appb-img-000017
상기 화학식 1 또는 화학식 2에서,
R1은 수소, C1 내지 5의 알킬기, 아민기, C1 내지 5의 알킬아민기, 카르복실기 또는 C1 내지 5의 알킬카르복실기이고,
p는 12 내지 227의 정수이며,
n은 2 내지 14의 정수이고,
m은 1 내지 3의 정수이며,
l은 4의 정수이다.
또한, 본 발명에 따른 지방 감소용 조성물은 전술한 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물, 및 하기 화학식 5의 화합물을 포함하는 마이셀을 포함할 수 있다.
[화학식 5]
Figure PCTKR2022008764-appb-img-000018
상기 화학식 5에서,
p는 12 내지 227의 정수이고,
q는 2 내지 14의 정수이며
n은 0 내지 5의 정수이고,
L은 r9(arginine) 펩타이드이다.
일 구체예에서, 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물과 화학식 5의 화합물의 비율은 99:1 내지 96:4일 수 있다.
일 구체예에서, 지방 감소용 조성물에서 이산화탄소 발포형 마이셀의 함량은 적용 부위 등에 따라 달라질 수 있으며, 예를 들어, 조성물 전체 중량 대비 0.01 내지 1.0 중량부 또는 0.1 내지 0.5 중량부일 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명에 따른 지방 감소용 조성물은 국소 또는 정맥 주사용으로 사용될 수 있으며, 일반적으로 시술 빈도가 높은 턱, 허벅지, 팔, 배 등의 부위에 적용이 가능하다.
일 구체예에서, 본 발명에 따른 지방 감소용 조성물은 국소 지방 분해 보완재, 제형 교정제 또는 다이어트 미용 제품 등으로 사용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
<참고> 실험 재료
폴리에틸렌글리콜은 Sigma Aldrich로부터 구입하여 사용하였다. 사용 가능한 폴리에틸렌글리콜의 수평균 분자량(Mn)은 550 내지 20,000이고, 이 중 수평균 분자량이 2,000 또는 5,000인 폴리에틸렌글리콜이 이산화탄소 발포형 마이셀 제조에 바람직하여, 이를 본 실험에 사용하였다.
알킬 클로로포메이트로서 사슬형 지방족 화합물인 옥틸 클로로포메이트(Sigma Aldrich)를 사용하였다.
실시예
제조예 1-1. 3 개의 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜 합성
폴리에틸렌글리콜에 3 개의 수산기를 도입하여, mPEG-tri arm(PEG-T)을 제조하였다.
구체적으로, 50 mM의 폴리에틸렌글리콜을 다이옥산에 녹인 후, 0.5 M의 카보닐이미다졸(Carbonylimidazole)를 첨가하였다. 37℃에서 2 시간 동안 반응시킨 후, 1000MWCO의 투석막을 사용하여 미반응 및 불순물을 분리하였다. 분리 후 동결건조 시 이미다졸 카바메이트 중간체가 생성된다.
이후 pH가 9 내지 10인 Sodium carbonate 버퍼에 중간체와 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(tris(hydroxymethyl)aminomethane)를 첨가한 후 1000MWCO의 투석막을 사용하여 미반응 및 불순물을 분리하였다.
그리고, 하기 반응식 1과 같이, 폴리에틸렌글리콜에 수산기를 도입하였다.
[반응식 1]
Figure PCTKR2022008764-appb-img-000019
제조된 3 개의 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜을 PEGmw-tri arm(PEGmw-T)으로 표현할 수 있다.
제조예 1-2. 3 개의 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜 유도체 합성
제조예 1에서 제조한 PEGmw-T과 알킬 클로로포메이트를 아세토니트릴에 각각 용해시켰다. 구체적으로, PEGmw-T 0.5 mmol을 아세토니트릴 4 ml에 용해시켜 폴리에틸렌글리콜 용액을 준비하였고, 알킬 클로로포메이트 2 mmol을 아세토니트릴 5 ml에 첨가하여 알킬 클로로포메이트 용액을 준비하였다.
준비된 폴리에틸렌글리콜 용액에 알킬 클로로포메이트 용액을 첨가한 후, 5 분간 교반하였다. 상기 교반 시 반응성이 낮은 질소 가스를 흘려주었다. 상기 교반이 완료된 혼합물에 피리딘 2.5 mmol을 첨가한 후 0℃에서 30분간 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 상온에서 24시간 교반하여 합성을 완료하였다.
상기 합성이 완료된 용액을 디에틸에테르에 침전시킨 후, 필터를 통해 여과한 다음, 진공 건조기에서 3 내지 7일 동안 건조시켜 합성 고분자인 폴리에틸렌글리콜 유도체, 즉, 폴리에틸렌글리콜-알킬 카보네이트를 수득하였다.
폴리에틸렌글리콜의 수평균 분자량 및 알킬 클로로포메이트의 알킬의 종류에 따라 다른 종류의 폴리에틸렌글리콜 유도체, 즉, 폴리에틸렌글리콜-알킬 카보네이트가 제조될 수 있다. 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜의 수평균 분자량이 5000이고, 옥틸 클로로포메이트를 사용할 경우 PEG5000-octylcarbonate 또는 PEG5000-OC로 표현할 수 있다.
또한. 제조된 3 개의 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜 유도체를 PEGmw-tri arm-octylcarbonate(PEGmw-T-OC)로 표현할 수 있다.
제조예 2-1. 5 개의 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜 합성
Sodium Gluconate를 0.1M MES/0.3M NaCl buffer에 녹였다. 10 분 후 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드를 첨가하고, 다시 10 분 후 설포-N-하이드록시석신이미드를 첨가하며, 다시 10 분 후 메톡시폴리에틸렌글리콜아민을 첨가하여 하루 동안 반응을 두어, EDC/NHS 반응을 통해 통해 5 개의 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜 유도체를 합성하였다.
그 후, 3 일간 1000MWCO의 투석막을 통하여 미반응 및 불순물을 분리하고, 동결건조를 수행하였다.
[반응식 2]
Figure PCTKR2022008764-appb-img-000020
제조된 5개의 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜을 PEGmw-penta arm(PEGmw-P)로 표현할 수 있다.
제조예 2-2. 5 개의 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜 유도체 합성
제조예 2-1에서 제조한 PEGmw-P 0.1 mmol을 아세토니트릴 4 ml에 용해시켜 폴리에틸렌글리콜 용액을 준비하였다. 알킬 클로로포메이트 2 mmol을 아세토니트릴 5 ml에 첨가하여 알킬 클로로포메이트 용액을 준비하였다.
먼저 폴리에틸렌글리콜 용액에 반응성이 낮은 질소 가스를 흘려주고 20분 후 알킬클로로포메이트 용액을 첨가하여 5분간 교반하였다. 교반이 완료된 혼합물에 피리딘 1 mmol을 첨가한 후에 0℃에서 30분간 반응시켰다. 이후 24시간을 상온에서 교반시켜 반응을 완료하였다.
상기 반응이 완료된 용액을 디에틸에테르에 침전시킨 후, 원심분리를 통해 침전물을 제외한 상층액을 제거하였다. 해당 과정을 5회 반복 후 침전물을 동결건조기에 3일간 건조시켜 합성 고분자인 폴리에틸렌글리콜 유도체를, 즉 폴리에틸렌글리콜-알킬 카보네이트를 수득하였다.
제조된 5 개의 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜 유도체를 PEGmw-penta arm-octylcarbonate(PEGmw-P-OC)로 표현할 수 있다.
제조예 3. 폴리에틸렌글리콜 유도체 합성
PEGmw-T 대신 폴리에틸렌글리콜을 사용한 것을 제외하고는, 제조예 1-2의 제조 방법으로 폴리에틸렌글리콜 유도체를 제조하였다.
제조된 폴리에틸렌글리콜 유도체를 PEGmw-octylcarbonate(PEGmw-OC)로 표현할 수 있다.
제조예 4. 펩타이드가 도입된 폴리에틸렌글리콜 유도체 합성
제조예 3에서 제조된 폴리에틸렌글리콜 유도체에 펩타이드의 도입은 하기와 같이 수행하였다.
먼저, 아미노기를 가지는 아미노폴리에틸렌글리콜 유도체와 펩타이드를 몰비 1:1의 비율로 EDC/NHS 반응시켜, 펩타이드가 결합된 폴리에틸렌글리콜 유도체를 제조하였다. 그 후, 4일간 투석하고, 필터를 통해 불순물 및 미반응 물질을 제거한 후, 동결건조를 수행하였다.
제조된 펩타이드가 도입된 폴리에틸렌글리콜 유도체를 r9-PEGmw-octylcarbonate(r9-PEGmw-OC)로 표현할 수 있다.
제조예 5. 용매증발법을 이용한 마이셀 입자 제조
마이셀은 메틸렌 클로라이드 및 아세토니트릴을 2:1의 비율로 포함하는 혼합용매를 이용한 용매증발법으로 제조하였다.
전술한 제조예 1-2 또는 제조예 2-2에서 제조된 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜 유도체 및/또는 제조예 4에서 제조된 펩타이드가 도입된 폴리에틸렌글리콜 유도체를 혼합용매에 녹인 후, 농축기(N-1300)를 이용하여 진공속에서 180 rpm, 37℃에서 약 5 내지 10 분간 유리 벽면에 코팅을 진행하였으며, 유리 표면에 유도체 입자가 코팅되었다(용매 증발).
용매 증발 후 친수성 용액(PBS 및 증류수 포함)를 넣음으로써 자가 조립이 수행되며, 마이셀을 제조하였다.
본 제조예에서는 마이셀의 제조에 사용된 유도체에 따라 하기와 같이 표현할 수 있다.
PEGmw-OC 마이셀: PEGmw-OC를 사용하여 마이셀을 제조.
PEGmw- T-OC 마이셀: PEGmw- T-OC를 사용하여 마이셀을 제조.
PEGmw-P-OC 마이셸: PEGmw-P-OC를 사용하여 마이셸을 제조.
r9-PEGmw-OC 마이셀: PEGmw-OC 및 r9-PEGmw-OC를 사용하여 마이셀을 제조.
r9-PEGmw- T-OC 마이셀: PEGmw- T-OC 및 r9-PEGmw-OC를 사용하여 마이셀을 제조.
후술할 실험예 5 내지 7에서 사용되는 r9-PEGmw-OC 마이셀에서, PEGmw-OC 및 r9-PEGmw-OC의 혼합 비율(중량비)은 50:1이다.
또한, 후술할 실험예 5 내지 7에서 사용되는 r9-PEGmw-T-OC 마이셀에서, PEGmw- T-OC 및 r9-PEGmw-OC의 혼합 비율(중량비)은 50:1이다.
실험예 1. 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜(PEG-T) 합성 확인
제조예 1-1에서 제조된 3 개의 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜(PEGmw-T)의 합성을 확인하였다. 상기 합성은 핵자기공명분석법을 이용하여 분자량을 측정하여 확인하였다.
[표 1]
Figure PCTKR2022008764-appb-img-000021
본 발명에서 표 1은 폴리에틸렌글리콜의 분자량에 따른 수산기 증가량을 나타낸다.
상기 표 1에 나타난 바와 같이, 폴리에틸렌글리콜에 수산긴 도입한 후 분자량을 측정한 결과, 분자량이 2,000인 폴리에틸렌글리콜을 사용한 경우 2.3 배, 5,000인 폴리에틸렌글리콜을 사용한 경우 1.9 배 분자량이 증가한 것을 확인할 수 있다. 이를 통해, 폴리에틸렌글리콜에 수산기가 도입된 것을 확인할 수 있다.
실험예 2. 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜 유도체(PEG-T 유도체)의 기체 발생 시간 확인
제조예 1-2에서 제조된 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜 유도체에서 기체 발생 시간을 확인하였다. 상기 기체 발생은 초음파 기기(SONON 300L)를 통해 확인하였다. 실험군으로 본 발명에 따른 PEGmw-T 유도체인 PEG2000-T-OC(mPEG2000-triarm-Octylcarbonate) 및 PEG5000-T-OC(mPEG5000-triarm-Octylcarbonate)을 사용하였으며, 대조군으로 제조예 3의 폴리에틸렌글리콜 유도체인 PEG2000-OC(mPEG2000-Octylcarbonate) 및 PEG5000-OC(mPEG5000-Octylcarbonate)을 사용하였다.
구체적으로, 실험군 및 대조군의 N 기체 발생 속도를 확인하였다.
분석 결과, 수산기의 도입 여부 및 분자량에 따라 이산화탄소 발포 시간이 달라짐을 확인할 수 있다. 폴리에틸렌글리콜의 분자량이 2,000 일 경우 이산화탄소 발포가 더 빠르게 일어나는 경향을 확인하였으며, 폴리에틸렌글리콜의 분자량이 5,000 일 경우 수산기 도입 여부에 따른 큰 차이는 없는 것을 확인할 수 있다(도 2)
실험예 3. 펩타이드가 도입된 마이셀의 지방세포 사멸능 분석
마이셀 표면에 도입된 세포 투과 펩타이드(r9 펩타이드)의 도입량에 따른 세포 사멸 효과를 확인하였다.
상기 실험예에서는 제조예 5에서 제조된 r9-PEGmw-OC 마이셀을 사용했으며, 이때, 펩타이드가 도입된 폴리에틸렌글리콜 유도체의 사용량은 전체 유도체 중량(무게) 대비 0% 내지 4%로 하였다(r9-PEGmw-OC/PEGmw-OC).
상기 사멸능은 MTS assay 방식을 따라 수행하였다.
구체적으로, 3T3-l1 세포를 96-well 플레이트에 2x103 cell/plate로 분주 후, 2 내지 3 주간 분화를 진행하였다. 그 후 유도체의 농도는 0.2 wt%로 하여 처리하고, 24 시간 뒤 PBS를 이용하여 1회 세척하였다. MTS 용액 처리후 1시간 뒤 흡광도를 분석하였다.
그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 펩타이드의 도입량에 따라 경향성 있는 세포 사멸효과가 나타남을 확인할 수 있다.
지방세포 사멸을 위한 마이셀 제조에 있어 적정 펩타이드 유도체 농도는 폴리에틸렌글리콜의 분자량에 따라 다르게 나타나며, 분자량 2,000인 유도체 이용 시 2-4%이며, 분자량 5,000인 유도체 이용 시 유도체 무게 대비 1-4%임을 확인할 수 있다.
실험예 4. 기체 미발포 그룹의 지방세포 사멸
기체 미발포 그룹의 지방세포 사멸을 분석하였다.
분석은 실험예 2의 방법에 따라 실시하였으며, 폴리에틸렌글리콜 기반의 기체 미발포형 마이셀로, PEG5000-octylamine micelle, r9-PEG5000-octylamine micelle 및 r9-PEG5000-tri arm-octylamine micelle을 사용하였다.
그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타나 바와 같이, 기체를 발포하지 않으면 세포 사멸이 나타나지 않음을 확인할 수 있다. 세포 생존율은 모든 그룹, 모든 농도에서 최소 90% 이상의 세포 생존율이 확인되었다.
실험예 5. 펩타이드 도입 및 마이셀 농도에 따른 지방세포 사멸
제조예 5에서 제조된 마이셀에 대하여, 상기 마이셀을 0.1 내지 0.5wt% 농도로 처리하여 세포 사멸능을 평가하였다.
구체적으로, PEGmw-OC 마이셀(PEG5000-octylcarbonate micelle), PEGmw-T-OC 마이셀(PEG5000-triarm-octylcarbonate micelle), r9-PEGmw-OC 마이셀(r9-PEG5000-octylcarbonate micelle) 및 r9-PEGmw-T-OC 마이셀(r9-PEG5000-triarm-octylcarbonate micelle)의 세포 사멸능을 평가하였다.
그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 분자량 5,000인 폴리에틸렌 기반의 이산화탄소 발포형 마이셀의 농도에 따른 세포 사멸을 분화된 지방세포에서 확인한 결과, 펩타이드가 도입되지 않는 그룹은 세포 사멸이 거의 나타나지 않았으며 높은 세포 생존율을 보이는 것을 확인할 수 있다. 구체적으로, 최소 83% 이상의 세포 생존율이 확인이 되었되었다.
폴리에틸렌글리콜에 수산기를 도입하여 이산화탄소 발포량을 증가시킨 마이셀에서 가장 높은 세포사멸이 확인 되었으며, 추가로 수산기 도입하지 않는 그룹에 비하여 높은 세포사멸이 확인되었다.
실험예 6. 생체 내 효능 확인
비만 유도 쥐의 지방조직에 마이셀을 투입한 후, 투여하지 않은 지방조직과 대비하여 무게 변화를 관찰하였다.
비만 유도 쥐는 마이셀 투여를 위해 10 주 가량 고지방 급이를 통하여 유도되었다. 40 g 이상의 비만 유도 쥐를 이용하여 왼쪽 지방 패드에 마이셀을 25 mg/kg의 농도로 단회 투여 후, 3 주간 몸무게 관찰한 후, 투여 한 곳의 지방패드 및 반대쪽(투여하지 않은) 지방패드를 추출하여 그 무게비로 하여금 치료 효과를 확인하였다.
그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 기체 미발포 그룹(r9-PEG5000-T-OA 마이셀; r9-PEG5000-tri arm-octylamine micelles)과 비교하여 본 발명에 따른 이산화탄소 발포형 마이셀(r9-PEG5000-T-OC 마이셀; r9-PEG5000-tri arm-octylcarbonate micelles)이 상대적으로 지방 패드의 무게가 감소한 것을 확인할 수 있다.
또한, 비만 치료제로서의 효능을 확인하기 위하여, 지방 조직을 적출하여 염색하고 조직학적인 분석을 실행하였다. 조직학적 분석 방법은 Hematocyline & Eosin (H&E) 염색법을 이용하였다.
그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, 기체 미발포 그룹(r9-PEG5000-T-OA 마이셀)에 비교하여 기 본 발명에 따른 이산화탄소 발포형 마이셀(r9-PEG5000-T-OC 마이셀)에서 세포 사멸 및 조직 감소를 확인할 수 있다(검은색 화살표: 주사 투여 부위).
실험예 7. 펩타이드 도입 마이셀의 잔여량 확인
형광 표지 약물을 통한 체내분포평가시험(Biodistribution)의 방법으로 PEGmw-T-OC 마이셀 및 r9-PEGmw-T-OC 마이셀에서의 상기 마이셀의 잔류를 확인하였다.
투여 방법은 상기의 치료효과 투여를 위한 방식과 같이 왼쪽 지방패드에 국소 투여를 진행하였고, 투여 후 24 시간 혹은 48 시간 뒤에 잔류하는 마이셀의 양을 형광 세기 확인을 통하여 상대적으로 비교를 하였다.
그 결과를 도 8에 나타내었다.
r9-PEG5000-T-OC 마이셀은 펩타이드가 도입되지 않은 PEG5000-T-OC 마이셀과 비교하여 투여 부위에 더 오랫동안 잔류함을 형광 지표된 마이셀을 이용하여 확인할 수 있다.
해당 마이셀은 가수분해가 계속적으로 진행될 수 있다. 펩타이드가 도입되지 않은 마이셀은 빠르게 간과, 신장으로 이동을 하게 되는데, 이는 차후 간 세포 및 신장 세포에 이입되어 기체를 발포하고 부작용을 일으킬 수 있으므로, 본 발명과 같이 펩타이드 도입하여 해당 부작용을 최소화 시킬 수 있다.
본 발명에 따른 이산화탄소 발포형 마이셀은 주사 가능한 제제로 제작가능하고, 다이어트 미용 분야 및 비만치료제 분야에 적용되어 국소 지방의 사멸을 통해 국소 지방을 분해하는 국소 지방 분해 보완재, 제형 교정제 또는 다이어트 미용 제품 등으로 사용될 수 있다.

Claims (14)

  1. 하기 화학식 1로 표현되는 화합물 및 하기 화학식 2로 표현되는 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함하는 이산화탄소 발포형 마이셀:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2022008764-appb-img-000022
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2022008764-appb-img-000023
    상기 화학식 1 또는 화학식 2에서,
    R1은 수소, C1 내지 5의 알킬기, 아민기, C1 내지 5의 알킬아민기, 카르복실기 또는 C1 내지 5의 알킬카르복실기이고,
    p는 12 내지 227의 정수이며,
    n은 2 내지 14의 정수이고,
    m은 1 내지 3의 정수이며,
    l은 4의 정수이다.
  2. 제1항에 있어서,
    마이셀은 직경이 150 내지 500 nm인 이산화탄소 발포형 마이셀.
  3. 제1항에 있어서,
    화학식 1로 표현되는 화합물은 하기 화학식 3으로 표현되는 화합물이고,
    화학식 2로 표현되는 화합물은 하기 화학식 4로 표현되는 화합물인 이산화탄소 발포형 마이셀:
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2022008764-appb-img-000024
    [화학식 4]
    Figure PCTKR2022008764-appb-img-000025
  4. 제1항에 있어서,
    화학식 1로 표현되는 화합물 및 화학식 2로 표현되는 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물의 가수분해에 의해 발생된 이산화탄소에 의해 지방세포가 파괴되는 것인 이산화탄소 발포형 마이셀.
  5. 제1항에 있어서,
    하기 화학식 5로 표현되는 화합물을 추가로 포함하는 것인 이산화탄소 발포형 마이셀:
    [화학식 5]
    Figure PCTKR2022008764-appb-img-000026
    상기 화학식 5에서,
    p는 12 내지 227의 정수이고,
    q는 2 내지 14의 정수이며
    n은 0 내지 5의 정수이고,
    L은 r9(arginine) 펩타이드이다.
  6. 제5항에 있어서,
    화학식 5로 표현되는 화합물은 하기 화학식 6으로 표현되는 화합물인 이산화탄소 발포형 마이셀:
    [화학식 6]
    Figure PCTKR2022008764-appb-img-000027
    상기 화학식 6에서,
    p는 12 내지 227의 정수이고,
    q는 2 내지 14의 정수이다.
  7. 제5항에 있어서,
    화학식 1로 표현되는 화합물 및 화학식 2로 표현되는 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물, 및 화학식 3으로 표현되는 화합물의 중량 비율은 99:1 내지 96:4인 이산화탄소 발포형 마이셀.
  8. 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜 및 알킬 클로로포메이트를 혼합하여 하기 화학식 1로 표현되는 화합물 및 하기 화학식 2로 표현되는 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물인 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜 유도체를 합성하는 단계(제1 단계); 및
    상기 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜 유도체를 아세토니트릴, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름 및 메탄올에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합용매에 용해시킨 후 용매를 증발시켜 마이셀을 합성하는 단계(제2 단계);를 포함하는 이산화탄소 발포형 마이셀의 제조 방법:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2022008764-appb-img-000028
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2022008764-appb-img-000029
    상기 화학식 1 또는 화학식 2에서,
    R1은 수소, C1 내지 5의 알킬기, 아민기, C1 내지 5의 알킬아민기, 카르복실기 또는 C1 내지 5의 알킬카르복실기이고,
    p는 12 내지 227의 정수이며,
    n은 2 내지 14의 정수이고,
    m은 1 내지 3의 정수이며,
    l은 4의 정수이다.
  9. 제8항에 있어서,
    혼합용매는 메틸렌 클로라이드와 아세토니트릴의 혼합용매이고,
    혼합비율은 3 내지 1 : 1 내지 3인 이산화탄소 발포형 마이셀의 제조 방법.
  10. 제8항에 있어서,
    폴리에틸렌글리콜의 분자량(Mn)은 2,000 내지 7,000인 이산화탄소 발포형 마이셀의 제조 방법.
  11. 제8항에 있어서,
    제2 단계는 수산기가 도입된 폴리에틸렌글리콜 유도체 및 하기 화학식 5로 표현되는 화합물을 아세토니트릴, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름 및 메탄올에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합용매에 용해시킨 후 용매를 증발시켜 마이셀을 합성하며,
    하기 화학식 5로 표현되는 화합물은 폴리에틸렌글리콜 및 알킬 클로로포메이트를 혼합하여 폴리에틸렌글리콜 유도체를 합성하는 단계; 및
    상기 폴리에틸렌글리콜 유도체에 r9(arginine) 펩타이드를 결합시켜 펩타이드가 결합된 폴리에틸렌글리콜 유도체를 합성하는 단계를 통해 제조되는 것인 이산화탄소 발포형 마이셀의 제조 방법:
    [화학식 5]
    Figure PCTKR2022008764-appb-img-000030
    상기 화학식 5에서,
    p는 12 내지 227의 정수이고,
    q는 2 내지 14의 정수이며
    n은 0 내지 5의 정수이고,
    L은 r9(arginine) 펩타이드이다.
  12. 제1항에 따른 이산화탄소 발포형 마이셀을 포함하는 지방 감소용 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    지방 감소용 조성물은 하기 화학식 1로 표현되는 화합물 및 하기 화학식 2로 표현되는 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물, 및 하기 화학식 5로 표현되는 화합물을 포함하는 이산화탄소 발포형 마이셀을 포함하는 것인 지방 감소용 조성물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2022008764-appb-img-000031
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2022008764-appb-img-000032
    [화학식 5]
    Figure PCTKR2022008764-appb-img-000033
    상기 화학식 1 또는 화학식 2에서,
    R1은 수소, C1 내지 5의 알킬기, 아민기, C1 내지 5의 알킬아민기, 카르복실기 또는 C1 내지 5의 알킬카르복실기이고,
    p는 12 내지 227의 정수이며,
    n은 2 내지 14의 정수이고,
    m은 1 내지 3의 정수이며,
    l은 4의 정수이고,
    상기 화학식 5에서,
    p는 12 내지 227의 정수이고,
    q는 2 내지 14의 정수이며
    n은 0 내지 5의 정수이고,
    L은 r9(arginine) 펩타이드이다.
  14. 제12항에 있어서,
    국소 또는 정맥 주사용으로 사용되는 것인 지방 감소용 조성물.
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