WO2022210296A1 - オキシトシンシグナル増強剤及びオキシトシン誘発性角化細胞増殖促進剤 - Google Patents

オキシトシンシグナル増強剤及びオキシトシン誘発性角化細胞増殖促進剤 Download PDF

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Definitions

  • the present invention provides an oxytocin signal enhancer and an oxytocin-induced keratinocyte proliferation promoter.
  • Oxytocin is a peptide hormone, also known as the "love hormone” or “happiness hormone”, and it works as a neurohormone, neurotransmitter, or neuroregulator. Its known effects include anti-anxiety, stress relief, bond formation, appetite suppression, and analgesia. Oxytocin receptors are confirmed to be expressed in various tissues throughout the body, such as the central nervous system, uterus, mammary gland, skin, fat, kidney, heart, thymus, and pancreas, and play physiological roles in various parts of the body.
  • Non-Patent Document 1 Non-Patent Document 1
  • Patent Document 2 Regarding the direct action of oxytocin on the skin, it has the effect of improving wrinkles and skin flexibility (Patent Document 2), and increases the production of ingredients that increase elasticity by acting on fibroblasts (Patent Document 3).
  • Patent Document 4 As for the indirect action, it has been reported that an increase in the amount of oxytocin in the body improves the texture of the skin (Patent Document 4). From these findings, it can be speculated that enhancing the action of oxytocin in the skin will bring about skin improvement.
  • Patent Document 2 discloses an oxytocin production accelerator containing rose oil, ethyltrimethylcyclopentenylbutenol, methyltrimethylcyclopentenylpentanol, and hexahydrohexamethylcyclopentabenzopyran.
  • Patent Document 1 discloses that stimulation such as massage increases the amount of skin oxytocin.
  • Patent Document 3 discloses that cinnamon bark extract increases the number of oxytocin receptors in fibroblasts. However, nothing provides a means to amplify the oxytocin response.
  • An object of the present invention is to provide an oxytocin signal enhancer and an oxytocin-induced keratinocyte proliferation promoter.
  • shell ginger leaf extract and/or ginger extract have a high oxytocin signal enhancing effect and oxytocin-induced keratinocyte proliferation promoting effect, and completed the following invention.
  • rice field (1) An oxytocin signal enhancer containing as an active ingredient an shell ginger leaf extract and/or a ginger extract.
  • An oxytocin-induced keratinocyte proliferation-promoting agent containing shell ginger leaf extract and/or ginger extract as active ingredients.
  • a drug containing an oxytocin signal enhancer and/or an oxytocin-induced keratinocyte proliferation promoter can be provided. If the proliferation of oxytocin-induced keratinocytes can be promoted by enhancing the oxytosy signal, it is expected to prevent or improve conditions and diseases in various tissues including the skin.
  • FIG. 1 shows the change in the fluorescence intensity ratio when the Alpinia speciosa leaf extract was added in Experiment 3.
  • FIG. A change in the fluorescence intensity ratio value represents a change in the intracellular calcium ion concentration.
  • the horizontal axis indicates time (seconds), and the vertical axis indicates the fluorescence intensity ratio (f340 nm/f380 nm).
  • the first addition of oxytocin alone was carried out for 2 minutes (1st OT was applied for 2 minutes), and after the reaction due to the addition of 1st OT was completed, the shell ginger leaf extract (extract) was added. Two minutes after the addition of the extract, the second oxytocin addition was performed for 2 minutes (2 nd OT applied for 2 minutes).
  • FIG. 2 is a graph showing changes in the fluorescence intensity ratio when the Alpinia speciosa leaf extract was added in Experiment 3.
  • 3 is a graph showing changes in fluorescence intensity ratio when ginger extract was added in Experiment 3.
  • FIG. 4 is a graph showing changes in fluorescence intensity ratio when shell ginger leaf extract and ginger extract were added in Experiment 3.
  • FIG. 5 is a graph showing changes in the fluorescence intensity ratio when no candidate sample was added in Experiment 3;
  • the amount of change in the fluorescence intensity ratio (f340 nm/f380 nm) in the case of the first addition of oxytocin alone was assumed to be 100% (change due to 1 st OT), and the second addition of oxytocin was performed for 2 minutes without adding the candidate sample.
  • the relative value of the amount of change in the fluorescence intensity ratio ( f340 nm/f380 nm) (change due to 2nd OT) is shown.
  • the present inventors discovered that shell ginger leaf extract and/or ginger extract have a high oxytocin signal enhancing effect and an oxytocin-induced keratinocyte proliferation promoting effect. Based on these findings, the present invention provides an oxytocin signal-enhancing agent and an oxytocin-induced keratinocyte proliferation-promoting agent containing as an active ingredient an Alpinia alba extract and/or a ginger extract. In one aspect, the oxytocin-induced keratinocyte proliferation-promoting effect is achieved through oxytocin signal enhancement.
  • Oxytocin (CAS number: 50-56-6) is a peptide hormone (Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly) consisting of 9 amino acids. It is one of the posterior pituitary hormones.
  • Oxytocin signal enhancement is to enhance the response by oxytocin. You can check it by measuring it (https://www.dojindo.co.jp/technical/beginner/calcium1.pdf). It can be determined by measuring changes in intracellular calcium ion concentration using a microscope capable of measuring fluorescence intensity or a high-throughput calcium imaging method. For example, as described in Examples, when the oxytocin signal enhancer increases the oxytocin signal-enhancing intracellular calcium ion concentration compared to the state in which only oxytocin is applied (control), there is an oxytocin signal-enhancing effect. can be judged.
  • the increase in calcium ion concentration is enhanced with a statistically significant difference (e.g., Student's t-test) with a significance level of 5% when the candidate drug is added, or, e.g., 5% or more, 10% 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, 100% or more, 200% or more, 300% or more, 400% or more, Or it can mean that it is enhanced by 500% or more.
  • Calcium ion influx may be measured by any known technique, such as, but not limited to, another method such as intracellular calcium imaging.
  • Such an oxytocin signal enhancement effect can be measured by various methods including in vivo, in vitro, ex vivo, etc. For example, by administering a test substance to cells such as skin cells such as keratinocytes or fibroblasts, central nerve cells, uterine cells, mammary gland cells, adipocytes, and determining changes in intracellular calcium ion concentration in the cells, oxytocin signals can be detected. Enhancement can be determined. Alternatively, for example, in vivo or ex vivo methods are employed such as measuring changes in intracellular calcium ion concentration in samples such as tissues/models such as skin, central nervous system, uterus, mammary gland, fat after administration to mammals. good too. However, the measuring method is not limited to the above method, and any other method may be adopted.
  • Oxytocin-induced keratinocyte proliferation promotion refers to the promotion of keratinocyte proliferation by oxytocin.
  • the oxytocin-induced keratinocyte proliferation-promoting effect is achieved through enhancement of oxytocin signals.
  • Keratinocyte proliferation can be detected using, for example, proliferation markers such as BrdU, Ki67, MCM2, and PCNA, or using tetrazolium salts (such as MTT) that colorize by utilizing the reduction reaction of living cells.
  • a proliferation marker may be used, for example, using an antibody against the proliferation marker such as a fluorescently-labeled anti-BrdU antibody, and the intensity of the signal emitted from the antibody may be measured.
  • the signal intensity emitted from the antibody against the proliferation marker is higher than the state in which nothing is applied to the cultured epidermal cells or the state in which only oxytocin is applied (control) when an oxytocin signal enhancer is applied.
  • the keratinocyte proliferation effect can be arbitrarily selected from an in vitro method using keratinocytes, an ex vivo method using a skin model or skin tissue, or an in vivo method.
  • the shell ginger leaf extract used in the present invention is an extract obtained from shell ginger leaves.
  • Alpinia zerumbet is a plant belonging to the family Zingiberaceae, genus Alpinia, which is distributed in tropical to subtropical Asia, and grows naturally in Okinawa Prefecture and Kagoshima Prefecture in Japan.
  • Alpinia speciosa leaf extract it is also possible to use a commercially available one as a raw material for cosmetics or a raw material for health foods.
  • Alpinia speciosa leaf extract is known to have a fibroblast proliferation-promoting effect (Patent Document 5), a collagen production-promoting effect (Patent Document 6), and the like.
  • the ginger extract used in the present invention is an extract obtained from the rhizome of ginger.
  • Ginger (Zingiber Officinale Roscoe) is native to tropical Asia and distributed all over the world, and is a plant of the Zingiberaceae family. Ginger extracts that are commercially available as raw materials for cosmetics or health foods can also be used. Ginger extract is known to have antipyretic analgesic, antitumor and other effects.
  • extracts can be easily dried, purified, and extracted from the above plants by known methods, and are readily available commercially. It can be used raw or dried, but it can also be used as an extract, dried product, dried powder, raw material powder, squeezed liquid, etc., and it is possible to appropriately select which form to use. and may be subjected to treatment such as sterilization as necessary.
  • the extraction method of the above extract can be performed, for example, by solvent extraction.
  • solvent extraction the whole or part of the plant is optionally dried and optionally chopped or ground before being treated with an aqueous extractant, water, such as cold water, hot water, or boiling point or below.
  • Hot water, anhydrous or water-containing organic solvents, organic solvents such as ethanol, methanol, ether, 1,3-butylene glycol, propylene glycol, etc. are appropriately selected according to the properties of the raw material and the application of the composition, and the solvent is heated at room temperature. Or it is extracted by heating and using.
  • the extraction method is not limited to solvent extraction, and may be a conventional method known in the art.
  • the form of the above-mentioned extract is not limited to the liquid extract itself, but may be one obtained by diluting or concentrating it by a conventional technique. good too.
  • the extraction solvent used in the present invention is preferably a polar solvent such as water, a lower alcohol, or a liquid polyhydric alcohol. , particularly water, or lower alcohols such as methanol, ethanol or 1,3-butylene glycol are preferred.
  • the lower alcohol may be, for example, a hydrous lower alcohol, in which case the water content is, for example, 0-10 v/v%, 10-40 v/v%, 20-30 v/v%, 30-50 v/v%. , 50 to 80 v/v%, 80 to 99.5 v/v%, and the like.
  • the lower alcohol may be, for example, a C1-C5 lower alcohol.
  • the oxytocin signal-enhancing agent and/or oxytocin-induced keratinocyte proliferation-promoting agent of the present invention can be in any form such as a transdermal agent or an oral agent.
  • transdermal agents are preferred from the viewpoint of enhancing oxytocin signals in the skin.
  • the agent of the present invention can be administered by various administration routes such as transdermal and oral administration. can be appropriately determined according to their types, purposes, forms, usage methods, and the like.
  • the present application also provides a composition containing the agent of the present invention.
  • the composition of the invention may be a cosmetic composition or a food composition.
  • the composition of the present invention may be, for example, a composition for enhancing oxytocin signaling and/or promoting oxytocin-induced keratinocyte proliferation, or improving skin condition via such actions. .
  • the present application aims to enhance the oxytocin signal and/or promote the proliferation of oxytocin-induced keratinocytes by administering the agent or composition of the present invention to a subject, or to treat skin conditions mediated by such actions.
  • a cosmetic method for improvement is also provided.
  • the method of the present invention may be a cosmetic method and not a treatment by a doctor or medical practitioner.
  • the agent or composition of the present invention can be administered by any route such as external administration or oral administration.
  • the form of external administration can be arbitrarily selected, for example, cream, milky lotion, liquid, sheet, spray, gel, and the like.
  • Oral administration forms can be arbitrarily selected, for example, tablets, supplements, beverages, powders, and the like.
  • the cosmetic composition of the present invention may be various cosmetics such as milky lotions, creams, serums, lotions, packs, facial cleansers, soaps, body soaps, shampoos, etc., and may be in the form of liquids, milky lotions, creams, solids, and sheets. It may be in various forms such as a form, spray form, gel form, foam form, and powder form.
  • the food composition of the present invention may be powder, beverage, or tablet, and may be in various forms such as powder, liquid, solid, granules, granules, paste, and gel.
  • the frequency of administration is once every 4 weeks, once every 2 weeks, once a week, once every 3 days, once every 2 days, once a day, twice a day, and 3 times a day. , 4 times a day, 5 times a day, each time administration, etc. can be arbitrarily selected, but are not limited to these.
  • the amount of shell ginger leaf extract and/or ginger extract in the agent or composition of the present invention can be appropriately determined according to their type, purpose, form, method of use, and the like.
  • the amount of shell ginger leaf extract and/or ginger extract is 0.0001 to 100% by weight, 0.0001 to 90% by weight, 0.001 to 50% by weight, 0.01 to 5% by weight, based on the total weight of the agent or composition of the present invention. 0.01-1% by weight, 0.01-0.5% by weight, 0.05-0.2% by weight, 0.1-0.15% by weight, 0.15% by weight, 0.1% by weight, etc., but limited if the effect of the present invention is exhibited not.
  • the agent and composition of the present invention can be produced using a conventional method in a formulation that appropriately combines excipients, carriers and/or diluents and other ingredients according to the dosage form.
  • Additives can be arbitrarily selected and used together as needed. Additives include excipients, colorants, preservatives, thickeners, binders, disintegrants, dispersants, stabilizers, gelling agents, antioxidants, surfactants, preservatives, pH adjusters, etc. As for, known ones can be appropriately selected and used.
  • Experiment 1 Selection of Samples
  • Candidate samples were a 1,3-butylene glycol dilution of shell ginger (trade name: shell ginger extract BG) purchased from Maruzen Pharmaceutical from the cosmetic material library, and ginger purchased from Ichimaru Falcos.
  • 300 types of candidate samples were selected, including naturally-derived and synthetic components such as ethanol-diluted Ginger extract (trade name: ginger extract E) and other plant extracts.
  • the sample was adjusted to 20% by weight using DMSO, and diluted to the following concentrations using extracellular fluid during the experiment. As a control, an extracellular solution containing the same amount of DMSO was used.
  • Experiment 2 Cell Culture Normal human epidermal keratinocytes purchased from Kurabo were used. Addition factors (hydrocortisone 0.67 mg/mL, bovine pituitary extract 0.4%, insulin 10 mg/mL, EGF 0.1 ⁇ g/ mL) (HumediaGG growth factor set, etc. (Kurabo)) was added, and these cells were cultured according to the operating procedure.
  • Experiment 3 Screening for Oxytocin Signal-Enhancing Substances by Calcium Imaging Method Screening for oxytocin signal-enhancing substances was performed by measuring the intracellular calcium ion concentration of the epidermal keratinocytes cultured by the method described above. After attaching cells to a glass chamber surface-treated with collagen, Fura-2AM (Sigma-Aldrich, etc.), a calcium-sensitive fluorescent dye, was added to the extracellular solution (NaCl 150 mM, KCl 5 mM, CaCl 2 1.8 mM, MgCl 2 ).
  • Fura-2AM Sigma-Aldrich, etc.
  • the chamber was placed on the stage of a phase-contrast microscope (manufactured by Olympus), and the cells were irradiated alternately with near-ultraviolet excitation light of 340 nm and 380 nm using ORCA-ER manufactured by Hamamatsu Photonics. Fluorescence intensity was measured by measuring and calculating the fluorescence ratio (510 nm) of the amount of light emitted from one cell according to the excitation wavelength using HCImage analysis software. A 20% solution was prepared using DMSO with the concentration of each sample of the active ingredient being stored as 100% (stored at -40°C). The extracellular solution was used to dissolve the final concentration of 0.1%, and the test solution was freshly prepared.
  • Extracellular fluid containing the same amount of DMSO was used as a control.
  • Oxytocin (CAS number: 50-56-6) was purchased from Peptide Institute, dissolved in ultrapure water, and diluted to a concentration of 1 ⁇ M using extracellular fluid.
  • Fig. 1 shows the state of the reaction when shell ginger leaf extract is added.
  • the amount of change in the fluorescence intensity f340/f380 ratio obtained in response to the first addition of oxytocin alone was taken as 100%, and the second addition of oxytocin after applying or not applying each candidate sample.
  • the addition of oxytocin alone increased the intracellular calcium ion concentration
  • the addition of shell ginger leaf extract and then oxytocin further increased the intracellular calcium ion concentration (Figs. 1 and 2).
  • addition of ginger extract Fig.
  • FIG. 4 shows the results when oxytocin alone was applied twice at the same time points (about 300 seconds and about 700 seconds after the start of measurement) as when the candidate sample was added without adding the candidate drug. There was almost no change in the second oxytocin reaction compared to the first oxytocin reaction.
  • Experiment 4 Oxytocin-Induced Keratinocyte Proliferation Promoting Action by Alpinia speciosa Leaf Extract
  • Alpinia speciosa leaf extract which was determined to have an oxytocin signal enhancement effect in Experiment 3, promotes keratinocyte proliferation through oxytocin signal enhancement.
  • keratinocyte proliferation was measured when stimulated with shell ginger leaf extract in the presence or absence of oxytocin.
  • FIG. 6 is a graph showing the absorbance (A450 nm) when the shell ginger extract was added with or without the addition of oxytocin in Experiment 4.
  • FIG. 6 The addition of oxytocin alone significantly promoted the proliferation of keratinocytes compared to the case of no oxytocin addition (FIG. 6, left).
  • no significant increase in the proliferation of keratinocytes was observed in the absence of oxytocin even when the Alpinia speciosa leaf extract alone was added (the right gray bar in FIG. 6).
  • the Alpinia speciosa leaf extract was added in addition to oxytocin, the proliferation of keratinocytes significantly increased compared to the case of oxytocin alone (open bar on the right in FIG. 6).
  • shell ginger leaf extract has the effect of promoting oxytocin-induced keratinocyte proliferation.
  • results of Experiments 2 and 3 suggest that ginger extract also has the same oxytocin-induced keratinocyte proliferation-promoting effect as shell ginger extract.

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Abstract

新規なオキシトシンシグナル増強剤及びオキシトシン誘発性角化細胞増殖促進剤を提供する。　本発明は、月桃葉エキス及び／又はショウキョウエキスを有効成分として含有するオキシトシンシグナル増強剤及びオキシトシン誘発性角化細胞増殖促進剤を提供する。

Description

オキシトシンシグナル増強剤及びオキシトシン誘発性角化細胞増殖促進剤
　本発明はオキシトシンシグナル増強剤及びオキシトシン誘発性角化細胞増殖促進剤を提供する。
　オキシトシンは「愛情ホルモン」「幸せホルモン」とも呼ばれるペプチドホルモンであり、神経ホルモンあるいは神経伝達物質あるいは神経制御物質として働いている。作用としては抗不安、ストレス緩和、絆形成、摂食抑制、鎮痛などが知られている。オキシトシン受容体は、中枢神経、子宮、乳腺、皮膚、脂肪、腎臓、心臓、胸腺、膵臓等の全身の様々な組織で発現が確認され身体の各所で、生理的役割を果たしている。
　皮膚に着目すると皮膚にもオキシトシンが存在する報告がある（非特許文献１、特許文献１）。そして皮膚へのオキシトシンの直接作用については、シワ及び皮膚柔軟性の改善作用があること（特許文献２）、線維芽細胞に作用することによって弾力を高める成分の産生を増やすこと（特許文献３）、間接作用については生体中のオキシトシン量の増加が肌質感を改善させること（特許文献４）、等が報告されている。これらの発見より、皮膚においてオキシトシンの作用を高めると肌改善をもたらすことが推測できる。
　皮膚のオキシトシンの量を増加させるための様々な手段が探索されている。例えば、特許文献２には、ローズ油、エチルトリメチルシクロペンテニルブテノール、メチルトリメチルシクロペンテニルペンタノール、及びヘキサヒドロヘキサメチルシクロペンタベンゾピランを含有するオキシトシン産生促進剤が開示されている。特許文献１にはマッサージなどの刺激により皮膚オキシトシン量を増加させることが開示されている。特許文献３には、ケイヒエキスにより線維芽細胞におけるオキシトシン受容体の数を増加することが開示されている。しかしながらオキシトシンの反応を増幅させるような手段を提供するものはない。
特開2010-117232号公報 特開2011-98898号公報 特開2020-200240号公報 特開2019-105619号公報 特許第4658290号公報 特許第5822423号公報
Exp Dermatol 2012 Jul;21(7):535-7
　本発明の課題は、オキシトシンシグナル増強剤及びオキシトシン誘発性角化細胞増殖促進剤の提供にある。
　本発明者らは、鋭意研究の結果、月桃葉エキス及び／又はショウキョウエキスに高いオキシトシンシグナル増強効果とオキシトシン誘発性角化細胞増殖促進効果があることを見出し、以下の発明を完成するに至った：
（１）月桃葉エキス及び／又はショウキョウエキスを有効成分として含有する、オキシトシンシグナル増強剤。
（２）月桃葉エキス及び／又はショウキョウエキスを有効成分として含有する、オキシトシン誘発性角化細胞増殖促進剤。
（３）オキシトシンシグナル増強を介し角化細胞増殖を促進する、（２）に記載のオキシトシン誘発性角化細胞増殖促進剤。
　本発明によれば、オキシトシンシグナル増強剤及び／又はオキシトシン誘発性角化細胞増殖促進剤を含有する薬剤を提供することができる。オキシトシシグナルを増強することでオキシトシン誘発性角化細胞の増殖が促進できれば皮膚をはじめとする各種組織における状態や疾患を予防・改善することが期待される。
図１は、実験３において月桃葉エキスを添加した場合の蛍光強度比の変化を示す。蛍光強度比の値の変化は、細胞内カルシウムイオン濃度の変動を表す。横軸は時間(秒)、縦軸は蛍光強度比（f340 nm/f380 nm）を示す。１回目のオキシトシン単独添加を2分間行い（1st OT 2分間適用）、1st OT添加による反応が終了してから月桃葉エキス(エキス)を添加した。エキス添加から2分後に2回目のオキシトシン添加を2分間行った（2nd OT 2分間適用）。 図２は、実験３において月桃葉エキスを添加した場合の蛍光強度比の変化を示すグラフである。１回目のオキシトシン単独添加の場合の蛍光強度比（f340 nm/f380 nm）の変化量を100％（1st OTによる変化）として、月桃葉エキス添加から2分後に2回目のオキシトシン添加を2分行った場合の蛍光強度比（f340 nm/f380 nm）の変化量の相対値（2nd OTによる変化+月桃葉エキス）を示す。 図３は、実験３においてショウキョウエキスを添加した場合の蛍光強度比の変化を示すグラフである。１回目のオキシトシン単独添加の場合の蛍光強度比（f340 nm/f380 nm）の変化量を100％（1st OTによる変化）として、ショウキョウエキス添加から2分後に2回目のオキシトシン添加を2分行った場合の蛍光強度比（f340 nm/f380 nm）の変化量の相対値（2nd OTによる変化+ショウキョウエキス）を示す。 図４は、実験３において月桃葉エキス及びショウキョウエキスを添加した場合の蛍光強度比の変化を示すグラフである。１回目のオキシトシン単独添加の場合の蛍光強度比（f340 nm/f380 nm）の変化量を100％（1st OTによる変化）として、月桃葉エキス及びショウキョウエキス添加から2分後に2回目のオキシトシン添加を2分行った場合の蛍光強度比（f340 nm/f380 nm）の変化量の相対値（2nd OTによる変化+月桃葉エキス+ショウキョウエキス）を示す。 図５は、実験３において候補試料を添加しない場合の蛍光強度比の変化を示すグラフである。１回目のオキシトシン単独添加の場合の蛍光強度比（f340 nm/f380 nm）の変化量を100％（1st OTによる変化）として、候補試料を添加をせずに2回目のオキシトシン添加を2分行った場合の蛍光強度比（f340 nm/f380 nm）の変化量の相対値（2nd OTによる変化）を示す。 図６は、実験４においてオキシトシン無添加（OT無添加）、10-10Mのオキシトシン添加（OT10-10M添加）それぞれの場合において、月桃葉エキスを無添加（エキス無添加）又は0.015重量%の濃度の月桃葉エキスを添加（エキス添加）の場合の角化細胞における細胞増殖を抗BrdU抗体により検出した吸光度（A450nm）として示す。白抜きバーはオキシトシンの添加有（OT(+)）、グレーのバーはオキシトシンの添加無（OT(-)）を示す。縦軸は、それぞれについての吸光度値を示す。横軸はエキス添加の有無を示す。（シェッフェ多重間比較検定、*;P＜0.05, **;P＜0.01）。
　本発明者らは、月桃葉エキス及び／又はショウキョウエキスに高いオキシトシンシグナル増強効果並びにオキシトシン誘発性角化細胞増殖促進効果があることを発見した。本発明はこれらの発見に基づき、月桃葉エキス及び／又はショウキョウエキスを有効成分として含有する、オキシトシンシグナル増強剤及びオキシトシン誘発性角化細胞増殖促進剤を提供する。一態様では、オキシトシン誘発性角化細胞増殖促進作用は、オキシトシンシグナル増強を介して奏される。
　オキシトシン（CAS番号：50-56-6）は、9個のアミノ酸からなるペプチドホルモン(Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly)である。下垂体後葉ホルモンの一つである。
　オキシトシンシグナル増強とは、オキシトシンによる応答を増強させることであり、例えば細胞内カルシウムイオン測定試薬（fura-2, fluo-3,fluo-4,fluo-8等）などを用いて蛍光強度変化を経時的に測定することで調べることができる（https://www.dojindo.co.jp/technical/beginner/calcium1.pdf）。蛍光強度を測定できる顕微鏡やハイスループットカルシウムイメージング法により細胞内カルシウムイオン濃度変化を測定することにより決定することができる。例えば、実施例に記載のように、オキシトシンのみを付与した状態（コントロール）に比べて、オキシトシンシグナル増強剤を付与した場合にオキシトシン誘発細胞内カルシウムイオン濃度が増加する場合、オキシトシンシグナル増強作用があると判断できる。カルシウムイオン濃度の増加は、候補薬剤を添加した場合に、有意水準を5％とした統計学的有意差（例えばスチューデントのｔ検定）をもって亢進していること、あるいは、例えば5％以上、10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以、70％以上、80％以上、90％以上、100％以上、200％以上、300％以上、400％以上、又は500％以上亢進していることを意味し得る。カルシウムイオンの流入は、任意の公知技術、例えば、限定されないものの、細胞内カルシウムイメージング等の別の方法によって測定してもよい。
　このようなオキシトシンシグナル増強作用は、in vivo、in vitro、ex vivo等を含む各種方法で測定できる。例えば、被験物質を角化細胞又は線維芽細胞といった皮膚細胞、中枢神経細胞、子宮細胞、乳腺細胞、脂肪細胞等の細胞に投与し、その細胞における細胞内カルシウムイオン濃度変化を求めることによりオキシトシンシグナル増強作用を決定できる。あるいは、例えば、哺乳動物に投与した後に皮膚、中枢神経、子宮、乳腺、脂肪などの組織／モデルなどの試料における細胞内カルシウムイオン濃度変化を測定するといったin vivoやex vivoの方法を採用してもよい。しかしながら測定方法は上記方法に限定されず、他の任意の方法を採用してもよい。
　オキシトシン誘発性角化細胞増殖促進とは、オキシトシンによる角化細胞増殖を促進すること指す。一態様では、オキシトシン誘発性角化細胞増殖促進作用は、オキシトシンシグナルの増強を介して奏される。角化細胞増殖は、例えば、BrdU、Ki67、MCM2、PCNAといった増殖マーカーを、あるいは、生細胞の還元反応を利用し呈色するテトラゾリウム塩（MTTなど）を用いて検出することができ、これらの増殖マーカーを例えば、蛍光標識抗BrdU抗体といった増殖マーカーに対する抗体を用いて抗体から発せられるシグナル強度を測定してもよい。例えば、角化細胞増殖は、増殖マーカーに対する抗体から発せられるシグナル強度が、培養表皮細胞に何も付与しない状態又はオキシトシンのみを付与した状態（コントロール）に比べて、オキシトシンシグナル増強剤を付与した場合に増加していること、例えば、有意水準を5％とした統計学的有意差（例えばシェッフェ多重間比較検定）をもって亢進していること、あるいは例えば5％以上、10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以、70％以上、80％以上、90％以上、100％以上、200％以上、300％以上、400％以上、又は500％以上亢進していることを意味し得る。角化細胞増殖作用も同様に、角化細胞を用いるin vitroの方法であっても、皮膚モデルや皮膚組織を用いるex vivoの方法、あるいはin vivoの方法など任意に選択できる。
　本発明で用いられる月桃葉エキスは、月桃の葉から得られる抽出物である。月桃（Alpinia zerumbet）は、熱帯から亜熱帯アジアに分布し、国内では沖縄県や鹿児島県に自生するショウガ科アルピニア属の植物である。月桃葉エキスとして、化粧品原料や健康食品素材として市販のものを使用することもできる。月桃葉エキスは、線維芽細胞増殖促進作用（特許文献５）、コラーゲン産生促進作用（特許文献６）等が知られている。
　本発明で用いられるショウキョウエキスは、ショウガの根茎から得られる抽出物である。ショウガ（Zingiber Officinale Roscoe）は、熱帯アジア原産で世界各国に分布し、ショウガ科の植物である。ショウキョウエキスとして、化粧品原料や健康食品素材として市販のものを使用することもできる。ショウキョウエキスは、解熱鎮痛、抗腫瘍等の作用が知られている。
　これらの抽出物は、上記植物から公知の方法により容易に乾燥、精製、抽出ができ、また市販品を容易に入手可能である。生のままでも乾燥したものでも使用することができるが、抽出物、乾燥物、乾燥粉末、原料の粉末物、搾汁液等として用いることもでき、いずれの形態を用いるかは適宜選択することができ、必要に応じて殺菌等の処理を施してもよい。
　上記エキスの抽出方法は例えば溶媒抽出により行うことができる。溶媒抽出の場合には、植物の全体又は部分を必要に応じて乾燥させ、更に必要に応じて細断又は粉砕した後、水性抽出剤、水、例えば冷水、温水、又は沸点若しくはそれより低温の熱水、あるいは無水又は含水有機溶媒、有機溶媒、例えばエタノール、メタノール、エーテル、１，３－ブチレングリコール、プロピレングリコール等を原料の性質や組成物の用途等により好ましい溶媒を適宜選択して常温で又は加熱して用いることにより抽出される。しかしながら、抽出方法は溶媒抽出に限定されず、当業界で知られている常用の手法によってもよく、本発明で用いる抽出物の抽出方法や抽出物の形態は、本発明の効果を損なわない限り任意である。上記抽出物の形態は、抽出液自体だけでなく、常用の手法により適宜希釈又は濃縮したものであってもよく、更に、抽出液を乾燥することによって得られる粉状あるいは塊状の固体であってもよい。
　本発明で用いる抽出物の抽出方法や形態は本発明の効果を損なわない限り、任意であるが、本発明に用いられる抽出溶媒は、水、低級アルコール及び液状多価アルコール等の極性溶媒が好ましく、特に水、あるいはメタノール、エタノール又は１，３－ブチレングリコール等の低級アルコールが好ましい。低級アルコールは、例えば、含水低級アルコールであってもよく、その場合の含水率は、例えば0～10v/v％、10～40v/v％、20～30v/v％、30～50v/v％、50～80v/v％、80～99.5v/v％等であってもよい。低級アルコールは、例えば、Ｃ１～Ｃ５の低級アルコールであってもよい。これらの溶媒は一種でも二種以上を混合して用いても良い。
　本発明のオキシトシンシグナル増強剤及び／又はオキシトシン誘発性角化細胞増殖促進剤（以下、包括的に本発明の剤と称することがある）は、経皮剤又は経口剤といった任意の形態でありうるが、皮膚のオキシトシンシグナルを増強する観点から、経皮剤が好ましい。本発明の剤は、経皮、経口等各種投与経路で投与でき、月桃葉エキス及び／又はショウキョウエキスを本発明の効果が十分発揮されるような量で適用することが好ましく、その配合量は、それらの種類、目的、形態、利用方法などに応じて、適宜決めることができる。
　また、本願は、本発明の剤を含む組成物も提供する。本発明の組成物は、化粧品組成物又は食品組成物であってもよい。本発明の組成物は、例えば、オキシトシンシグナルを増強するため及び／又はオキシトシン誘発性角化細胞の増殖を促進するため、あるいはかかる作用を介した皮膚状態改善のための組成物であってもよい。
　また、本願は、本発明の剤又は組成物を対象に投与することにより、オキシトシンシグナルを増強するため及び／又はオキシトシン誘発性角化細胞の増殖を促進するため、あるいはかかる作用を介した皮膚状態改善のための美容方法も提供する。本発明の方法は、美容を目的とする方法であり、医師や医療従事者による治療ではないことがある。
　本発明の剤又は組成物は、外用投与または経口投与など任意の経路により投与できる。外用投与の形態としては、例えば、クリーム、乳液、液体、シート、スプレー、ゲルなど任意に選択することができる。経口投与の形態としては、例えば、錠剤、サプリメント、飲料、粉末など任意に選択することができる。
　本発明の化粧品組成物は、乳液、クリーム、美容液、ローション、パック、洗顔料、石鹸、ボディソープ、シャンプー等の各種化粧品であってもよく、液状、乳液状、クリーム状、固形状、シート状、スプレー状、ゲル状、泡状、パウダー状等の様々な形態であり得る。また、本発明の食品組成物は、粉末、飲料、または錠剤であってもよく、粉末状、液状、固形状、顆粒状、粒状、ペースト状、ゲル状等の様々な形態であり得る。
　また、投与頻度は、４週間に１回、２週間に１回、１週間に１回、３日に１回、２日に１回、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、都度投与等任意に選択できるがこれらに限定されない。
　本発明の剤又は組成物における月桃葉エキス及び／又はショウキョウエキスの配合量は、それらの種類、目的、形態、利用方法などに応じて、適宜決めることができる。例えば、月桃葉エキス及び／又はショウキョウエキスの配合量は、本発明剤又は組成物の総重量当たり0.0001～100重量％、0.0001～90重量％、0.001～50重量％、0.01～5重量％、0.01～1重量％、0.01～0.5重量％、0.05～0.2重量％、0.1～0.15重量％、0.15重量％、0.1重量％、等とすることができるが、本発明の効果が発揮されれば限定されない。
　本発明の剤及び組成物は、その剤形に応じ、賦形剤、担体及び/又は希釈剤等及び他の成分と適宜組み合わせた処方で、常法を用いて製造することができる。必要に応じて添加剤を任意に選択し併用することができる。添加剤としては賦形剤、着色剤、保存剤、増粘剤、結合剤、崩壊剤、分散剤、安定化剤、ゲル化剤、酸化防止剤、界面活性剤、保存剤、ｐＨ調整剤等については、公知のものを適宜選択して使用できる。
　次に実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。
　実施例：
　以下の実験１～３を行った。
　実験１：試料の選択
　候補試料として、化粧品素材ライブラリーの中から丸善製薬から購入した月桃葉の１，３－ブチレングリコール希釈物（商品名：月桃葉エキスBG）、一丸ファルコスより購入したショウキョウのエタノール希釈物（商品名；ショウキョウエキスE）、その他植物の抽出物といった天然由来成分や合成成分を含め、３００種類の候補試料を選択した。試料はDMSOを用いて２０重量％となるように調整し、実験時に細胞外液を用いて下記の濃度に希釈した。対照としてDMSOが同程度含まれる濃度の細胞外液を用いた。
　実験２：細胞の培養
　クラボウより購入した正常ヒト表皮角化細胞を用いた。無血清基礎培地（Epilife（Thermo Fisher Scientific社）又はHumedia KG2（クラボウ社））に、添加因子（ハイドロコルチゾン0.67 mg/mL、ウシ脳下垂体エキス0.4%、インスリン 10 mg/mL、EGF 0.1 μg/mL）(HumediaGG増殖因子セットなど（クラボウ）)を加え、操作手順書に従いこれらの細胞を培養した。
　実験３：カルシウムイメージング法によるオキシトシンシグナル増強物質のスクリーニング
　上述の方法で培養した表皮角化細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を測定することによりオキシトシンシグナル増強物質のスクリーニングを行った。コラーゲンで表面処理したガラスチャンバーに細胞を付着させた後に、カルシウム感受性蛍光色素であるFura-2AM(Sigma-aldrich社等)を細胞外液（NaCl 150 mM, KCl 5 mM, CaCl2 1.8 mM, MgCl2 1.2 mM, D-glucose 10 mM, HEPES 25 mMを超純水に溶かし、NaOHでpHを7.4に調整した水溶液）に溶解し、細胞にウエル内で5μMとなるように添加した。添加後室温で60分間インキュベーションを行い、細胞内へ蛍光色素の取込みを行った。取込み終了後、細胞に非特異的に結合した蛍光色素を細胞外液で洗浄後、新しい細胞外液を添加し15分間静置した。静置後、チャンバーを位相差顕微鏡（オリンパス社製）のステージ上に載せ、浜松ホトニクス社製ORCA-ERを用いて340 nmおよび380 nmの近紫外励起光を交互に細胞を照射し、各々の励起波長に応じ一つの細胞から放出される光量の蛍光比（510 nm）をHCImage解析ソフトにより、測定・算出することで蛍光強度を測定した。保存している原体各試料濃度を100%としDMSOを用いて20%溶液を作製した(-40℃保存)。最終濃度が0.1％となるように細胞外液を用いて溶解し、試験溶液を用事調整した。対照として同量のDMSOを含む細胞外液を用いた。オキシトシン（CAS番号：50-56-6）は、ペプチド研究所より購入し、超純水で溶解後、細胞外液を用いて、濃度1μMに希釈した。
　測定開始前より細胞を播種したチャンバーにペリスタポンプを用いて細胞外液を還流した。ベースラインが安定したことを確認後、オキシトシン濃度が1μMとなるように調整した溶液を細胞に2分間適用した（1回目のオキシトシンの反応:1st OT）。測定開始から約300秒後小さなオキシトシンによる蛍光強度比（f340/f380）の増加反応が見られた。反応が収まった時点で（測定開始から約500秒後）、候補試料は0.1重量%となるよう（複数の試料を添加した場合はそれぞれ0.1重量%ずつ添加）同様にペリスタポンプを用いて適用した。候補試料の適用開始から2分後（測定開始から約700秒後）、再度オキシトシンを1μMとなるよう2分間還流適用した（2回目のオキシトシンの反応：2nd OT）。
　月桃葉エキスを添加した場合の反応の様子を図１に示す。上記カルシウムイメージング法で得られた結果について、１回目オキシトシン単独添加による応答で得られた蛍光強度f340/f380比の変化量を100%とし、各候補試料適用後又は非適用後２回目のオキシトシン添加により得られた応答を％換算して算出した結果を図２～５に示す。データは、平均値±標準偏差で表記した（N=33～152）。オキシトシンの単独添加により細胞内カルシウムイオン濃度が増加し、月桃葉エキスを添加の上オキシトシンを添加すると細胞内カルシウムイオン濃度が更に上昇した（図１、２）。同様に、ショウキョウエキス（図３）、並びにショウキョウエキスと月桃葉エキスの両方添加した場合でも同様に細胞内カルシウムイオン濃度が非常に上昇した（図４）。オキシトシンの単独添加による蛍光強度比（細胞内カルシウムイオン濃度の増減を示す）に対し、月桃葉エキスの添加により２７５％（図２）、ショウキョウエキスの添加により１８３％（図３）、月桃葉エキスおよびショウキョウエキスの両方の添加により３８８％(図４)と増加が観察された。一方、候補薬剤の添加をせずにオキシトシンのみを候補試料を添加した場合と同じ時点（測定開始から約300秒後および約700秒後）に２回適用した場合の結果を図５に示す。１回目のオキシトシンによる反応に対して、２回目のオキシトシンによる反応はほとんど変化がなかった。
　以上の結果により、月桃葉エキスおよびショウキョウエキスにはオキシトシンによるシグナルを増強する効果があることが示唆される。
　実験４：月桃葉エキスによるオキシトシン誘発性角化細胞増殖促進作用
　次に、実験３でオキシトシンシグナル増強作用があると判断された月桃葉エキスがオキシトシンシグナル増強を介して角化細胞増殖を促進することを確認するために、オキシトシン存在又は非存在下で月桃葉エキスで刺激した場合の角化細胞増殖を測定した。
　正常ヒト表皮角化細胞（クラボウ）は、実験２の方法でEpilife培地(Thermo Fisher Scientific社)を用い、細胞培養ディッシュにて37℃、5% CO2条件下で継代培養した。
　上記培養表皮角化細胞を、コラーゲンコートした96穴マイクロプレートにて増殖因子なしの基礎培地中で２４時間培養後に10-10Mの濃度のオキシトシン（CAS番号：50-56-6）を加え又は加えずに、実験１で調製した月桃葉エキスを0.15重量%の濃度で加え又は加えずに、さらに７２～９６時間培養した。その後、細胞増殖ELISA BrdUキット(Roche, Cell Proliferation ELISA, BrdU (colorimetric, No. 11 647 229 001))を用いて、蛍光標識抗BrdU抗体からの蛍光をマイクロプレートリーダ（ARVO, PerkinElmer, 2030 Multilabel reader ARVO（商標）X3）により検出し吸光度（A450nm）を測定することにより細胞増殖を測定した。
　結果を図６に示す。図６は、実験４においてオキシトシン添加有又は無の状態で月桃葉エキスを添加した場合の吸光度（A450nm）を示すグラフである。オキシトシン単独を添加するとオキシトシン無添加の場合に比べて有意に角化細胞の増殖が促進された（図６左）。一方、月桃葉エキスのみを加えてもオキシトシンの添加無では角化細胞の増殖に有意な増加はみられなかった（図６右グレーのバー）。しかしながら、オキシトシンに加えて月桃葉エキスを加えると角化細胞の増殖はオキシトシン単独の場合に比べて更に有意に増加した（図６右白抜きのバー）。
　以上の結果により、月桃葉エキスにはオキシトシン誘発性角化細胞増殖を促進する効果があることが示唆される。また、実験２，３の結果よりショウキョウエキスについても月桃葉エキスと同様のオキシトシン誘発性角化細胞増殖促進効果があることも示唆される。

Claims (3)

  1. 　月桃葉エキス及び／又はショウキョウエキスを有効成分として含有する、オキシトシンシグナル増強剤。
  2. 　月桃葉エキス及び／又はショウキョウエキスを有効成分として含有する、オキシトシン誘発性角化細胞増殖促進剤。
  3. 　オキシトシンシグナル増強を介し角化細胞増殖を促進する、請求項２に記載のオキシトシン誘発性角化細胞増殖促進剤。
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