WO2022154472A1 - Cd55에 대한 신규 항체 및 이의 용도 - Google Patents

Cd55에 대한 신규 항체 및 이의 용도 Download PDF

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WO2022154472A1
WO2022154472A1 PCT/KR2022/000551 KR2022000551W WO2022154472A1 WO 2022154472 A1 WO2022154472 A1 WO 2022154472A1 KR 2022000551 W KR2022000551 W KR 2022000551W WO 2022154472 A1 WO2022154472 A1 WO 2022154472A1
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antibody
antigen
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acid sequence
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PCT/KR2022/000551
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이지철
박혜인
민성원
권형선
정상택
임재청
도소희
조은하
이소영
정성희
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에스지메디칼 주식회사
고려대학교 산학협력단
한국원자력연구원
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    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
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    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
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    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Definitions

  • the present invention relates to a novel antibody or antigen-binding fragment thereof specifically recognizing CD55 and a composition for preventing, treating and/or diagnosing cancer using the same.
  • the global anticancer drug market has grown at a CAGR of 10 - 13% over the past decade, and is expected to reach a total of $200 billion by 2022.
  • CAGR 10 - 13% over the past decade, and is expected to reach a total of $200 billion by 2022.
  • 1 in 5 men and 1 in 6 women worldwide will experience cancer at least once in their lifetime, and 1 in 8 men and 1 in 11 women will die from cancer.
  • the morbidity and mortality rates are continuously increasing.
  • the global anticancer drug market is undergoing a paradigm shift from first-generation chemotherapy to second-generation targeted anticancer drugs and third-generation immune anticancer drugs.
  • targeted anticancer treatment technologies that selectively attack only cancer cells without damaging normally rapidly dividing cells are being actively studied.
  • Development consists of two steps: the selection of a receptor specifically expressed on the cancer cell and the development of a targeting compound that binds to the receptor, which allows for the selective targeting of the cancer cell.
  • CD55 decay-accelerating factor, DAF
  • DAF decay-accelerating factor
  • solid cancers with high CD55 expression show low therapeutic reactivity to various anticancer drugs whose mechanism of action is complement dependent cytotoxicity (CDC).
  • CDC complement dependent cytotoxicity
  • Patent Document 1 Republic of Korea Registration No. 10-1800774
  • the present inventors have dedicated themselves to developing an excellent CD55 inhibitor that can efficiently restore the immune mechanism inhibited by CD55 by specifically recognizing the CD55 protein, a receptor that suppresses the complement immune mechanism, and specifically inhibiting its activity. research efforts were made. As a result, it was found that complement-mediated cell lysis activity against cancer cells was significantly restored due to significantly increased CD55 binding and inhibitory power when using an antibody substituted with some amino acids of the key antigen recognition site in the variable region. By doing so, the present invention was completed.
  • an object of the present invention is an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to CD55; and to provide a composition for preventing or treating and/or diagnosing cancer comprising the same.
  • Another object of the present invention is to provide a bispecific antibody comprising an antigen-binding fragment of an antibody that specifically binds to CD55 and an antigen-binding fragment of an antibody that specifically binds to CD20.
  • the present invention provides an HCDR1 region having an amino acid sequence represented by the following general formula (1); HCDR2 region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; And it provides an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to CD55, comprising a heavy chain variable region comprising an HCDR3 region having an amino acid sequence represented by the following general formula 2:
  • X 1 is Ala or Val
  • X 2 is selected from the group consisting of Val, Ala, Ile, Leu, Phe and Met.
  • the present inventors have dedicated themselves to developing an excellent CD55 inhibitor that can efficiently restore the immune mechanism inhibited by CD55 by specifically recognizing the CD55 protein, a receptor that suppresses the complement immune mechanism, and specifically inhibiting its activity. research efforts were made. As a result, it was found that complement-mediated cell lysis activity against cancer cells was significantly restored due to significantly increased CD55 binding and inhibitory power when using an antibody substituted with some amino acids of the key antigen recognition site in the variable region. did.
  • antibody refers to a protein molecule serving as a receptor that specifically recognizes an antigen, including immunoglobulin molecules having immunological reactivity with a specific antigen, and includes polyclonal antibodies and monoclonal antibodies. include all
  • Antibodies include antigen-binding fragments (antibody fragments) of antibody molecules as well as full-length antibody forms.
  • a complete antibody has a structure having two full-length light chains and two full-length heavy chains, and each light chain is linked to a heavy chain by a disulfide bond.
  • the heavy chain constant region has gamma ( ⁇ ), mu ( ⁇ ), alpha ( ⁇ ), delta ( ⁇ ) and epsilon ( ⁇ ) types and subclasses gamma 1 ( ⁇ 1), gamma 2 ( ⁇ 2), gamma 3 ( ⁇ 3). ), gamma 4 ( ⁇ 4), alpha 1 ( ⁇ 1) and alpha 2 ( ⁇ 2).
  • the constant region of the light chain has a kappa ( ⁇ ) and a lambda ( ⁇ ) type.
  • the term “antigen-binding fragment of an antibody” refers to a fragment that specifically recognizes an antigen within an entire antibody molecule and retains an antigen-antibody-binding function, and includes a single-domain antibody (sdAb), a single-chain antibody (scFv). ), Fab, F(ab'), F(ab')2 and Fv, and the like.
  • fragment examples include a monovalent fragment consisting of VL, VH, CL and CH1 domains (Fab fragment); a bivalent fragment comprising two Fab fragments linked by a disulfide bridge at the hinge region (F(ab')2 fragment); Fd fragment consisting of VH and CH1 domains; an Fv fragment consisting of the VL and VH domains of one arm of an antibody, and a disulfide-linked Fv (sdFv); a dAb fragment consisting of a VH domain; and separate complementarity determining regions (CDRs) or combinations of two or more separate CDRs optionally followed by a linker.
  • Fab fragment monovalent fragment consisting of VL, VH, CL and CH1 domains
  • F(ab')2 fragment bivalent fragment comprising two Fab fragments linked by a disulfide bridge at the hinge region
  • Fd fragment consisting of VH and CH1 domains
  • an Fv fragment consisting of the VL and VH domains of one arm of
  • the scFv may be linked by a linker such that the VL and VH regions are paired to form a single protein chain forming a monovalent molecule.
  • Such single-chain antibodies are also included in antibody fragments.
  • the antibody or fragment of the antibody may be a tetrameric antibody comprising two heavy chain molecules and two light chain molecules; antibody light chain monomers; antibody heavy chain monomers; antibody light chain dimers, antibody heavy chain dimers; Intrabody; monovalent antibody; camel antibody; and single-domain antibodies (sdAbs).
  • Fv is a minimal antibody fragment having only a heavy chain variable region and a light chain variable region, and recombinant technology for generating Fv fragments is described in PCT International Patent Application Publications WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 and WO 88/09344.
  • a double-chain Fv two-chain Fv
  • the heavy chain variable region and the light chain variable region are connected by a non-covalent bond
  • a single-chain Fv single-chain Fv
  • the heavy chain variable region and the single chain variable region are generally shared through a peptide linker.
  • Such antibody fragments can be obtained using proteolytic enzymes (for example, by restriction digestion of the entire antibody with papain to obtain Fab, and by digestion with pepsin to obtain F(ab')2 fragments), gene It can also be produced through recombinant technology.
  • the term “heavy chain” refers to a variable region domain V H comprising an amino acid sequence having sufficient variable region sequence to confer specificity to an antigen and a full length comprising three constant region domains C H1 , C H2 and C H3 . both heavy chains and fragments thereof.
  • the term “light chain” refers to both a full-length light chain including a variable region domain V L and a constant region domain CL including an amino acid sequence having a sufficient variable region sequence to confer specificity to an antigen and a fragment thereof. do.
  • CDR complementarity determining region
  • the scope of the antibody or antibody fragment of the present invention includes variants having conservative amino acid substitutions in the CDR regions, and to the extent that CD55 can be specifically recognized, variants to the amino acid sequences set forth in the accompanying sequence listing are included. can For example, additional changes may be made to the amino acid sequence of the antibody in order to further improve the half-life, biocompatibility, and other biological properties in addition to the binding affinity of the antibody. Considering the variation having such biological equivalent activity, it is construed that the antibody or nucleic acid molecule encoding the same of the present invention includes a sequence showing substantial identity to the sequence listed in the sequence listing.
  • the substantial identity is at least 61% when the aligned sequence is analyzed using an algorithm commonly used in the art after aligning the sequence of the present invention and any other sequences as much as possible.
  • homology according to one specific example, 70% homology, according to another specific example, 80% homology, according to another specific example, 90% homology.
  • Alignment methods for sequence comparison are known in the art. Various methods and algorithms for alignment are described in Smith and Waterman, Adv. Appl. Math . (1981) 2:482 Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio . (1970) 48:443; Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol .
  • affinity refers to the binding strength between an antibody or antigen-binding fragment thereof and an antigen, and may also be expressed as “binding strength”.
  • X 1 in Formula 1 is Ala.
  • X 2 of Formula 2 is Val.
  • the heavy chain variable region of the present invention comprises at least one framework region (FR) selected from the group consisting of the following HFR1 to HFR4:
  • HFR1 EVQLY 1 ESGGGLVQPGGSLRLSCY 2 AY 3 GFTFS (Y 1 is Val or Ala, Y 2 is Val or Ala, Y 3 is Ser or Arg)
  • HFR2 WVRQY 4 PGKGLEWVS (Y 4 is Ala or Ser)
  • HFR3 RY 5 TISRDNSKNTLYLQMNY 6 LRAEDTAVYYCAK (Y 5 is Ala or Thr and Y 6 is Ser or Asn)
  • the heavy chain variable region of the present invention has an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 19 to 22.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention comprises an LCDR1 region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; LCDR2 region having an amino acid sequence represented by the following general formula 3; and a light chain variable region comprising an LCDR3 region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3:
  • X 3 is Asn or Asp.
  • X 3 is Asp.
  • the light chain variable region of the present invention comprises one or more framework regions (FR) selected from the group consisting of the following LFR1 to LFR4:
  • LFR1 SYELTQPPSVSVSPGQTASITC
  • LFR2 WY 7 QQKPGQSPVTVIY (Y 7 is Phe or Tyr) (F or Y)
  • HFR3 GIPERFSGSKSGNTATLTISGTQAMDEADYYC
  • HFR4 FGGGTKLTVL
  • the light chain variable region of the present invention has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or 18.
  • the present invention provides an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to CD55, comprising the following light chain variable region and heavy chain variable region:
  • the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 5 is the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 5; Or, in the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 5, the 5th amino acid sequence V(Val) is substituted with A(Ala), the 23rd amino acid sequence A(Ala) is substituted with V(Val), the 25th amino acid sequence S(Ser) is substituted with R(Arg), 35th amino acid sequence A(Ala) is substituted with V(Val), 40th amino acid sequence A(Ala) is substituted with S(Ser), 68th amino acid
  • the sequence A(Ala) is substituted with T(Thr), the 85th amino acid sequence S(Ser) is substituted with N(Asn), and the 101st amino acid sequence G(Gly) is V(Val), L(Leu) , I(Ile), F(Phe), M(Met), or a heavy chain variable region comprising one or more substitutions selected from the group consisting of substitutions with A(Ala).
  • the present invention provides a nucleic acid molecule encoding the aforementioned antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention.
  • nucleic acid molecule has a meaning comprehensively including DNA (gDNA and cDNA) and RNA molecules, and nucleotides, which are the basic structural units in nucleic acid molecules, include natural nucleotides as well as analogs with modified sugar or base sites. (analogue) (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlman and Peyman, Chemical Reviews, (1990) 90:543-584).
  • sequence of the nucleic acid molecule encoding the heavy and light chain variable regions of the present invention may be modified. Such modifications include additions, deletions, or non-conservative or conservative substitutions of nucleotides.
  • the nucleic acid molecule of the present invention is construed to include a nucleotide sequence exhibiting substantial identity to the above-described nucleotide sequence.
  • the substantial identity is at least 80% when the nucleotide sequence of the present invention and any other sequences are aligned as much as possible, and the aligned sequence is analyzed using an algorithm commonly used in the art. of homology, in one specific example, at least 90% homology, in another specific example, at least 95% homology.
  • the present invention provides a composition for preventing or treating cancer comprising the above-described antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for preventing or treating cancer, comprising administering to a subject a pharmaceutically effective amount of the aforementioned antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention.
  • the present invention provides for use in therapy of the aforementioned antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention.
  • prevention refers to inhibiting the occurrence of a disease or disease in a subject who has not been diagnosed as possessing the disease or disease, but is likely to be afflicted with the disease or disease.
  • the term “treatment” refers to (a) inhibiting the development of a disease, disorder or condition; (b) alleviation of the disease, condition or condition; or (c) eliminating the disease, condition or symptom.
  • the composition of the present invention When the composition of the present invention is administered to a subject, it restores the complement immune mechanism by inhibiting the activity of the CD55 receptor and inhibits the proliferation of cancer cells to inhibit cancer progression, or to eliminate or alleviate symptoms thereof. Therefore, the composition of the present invention may be a composition for cancer treatment by itself, or is administered with other pharmacological components, for example, a therapeutic agent having CDC (complement dependent cytotoxicity) as a mechanism of action to improve its therapeutic responsiveness. It can also be applied as an adjuvant. Accordingly, as used herein, the term “treatment” or “therapeutic agent” includes the meaning of “therapeutic adjuvant” or “therapeutic adjuvant”.
  • administering refers to administering a therapeutically effective amount of the composition of the present invention directly to a subject so that the same amount is formed in the subject's body.
  • the term "therapeutically effective amount” means the content of the composition in which the pharmacological component in the composition is sufficient to provide a therapeutic or prophylactic effect to an individual to whom the pharmaceutical composition of the present invention is administered, and thus " prophylactically effective amount”.
  • the term "subject” includes, without limitation, a human, mouse, rat, guinea pig, dog, cat, horse, cow, pig, monkey, chimpanzee, baboon or rhesus monkey. Specifically, the subject of the present invention is a human.
  • the composition further comprises at least one pharmacological component selected from the group consisting of an anti-CD20 antibody and a tyrosine kinase inhibitor.
  • the anti-CD20 antibody is Rituximab.
  • the tyrosine kinase inhibitor is selected from the group consisting of imatinib (Imatinib) and gefitinib (gefitinib).
  • the cancer that can be prevented or treated by the composition of the present invention is a cancer that is CD55 positive.
  • CD55-positive cancer refers to a carcinoma composed of cancer cells expressing the CD55 receptor, and specifically refers to a cancer in which CD55 is expressed enough to measurably inhibit complement immune activity in a subject. Accordingly, the term “CD55 positive cancer” is meant to include "CD55 overexpressing cancer”. According to the present invention, the composition of the present invention can eliminate drug resistance and enhance treatment sensitivity in various carcinomas in which resistance to a therapeutic agent is induced due to overexpression of CD55.
  • CD55 positive cancers include, for example, melanoma, lymphoma, lung cancer, thyroid cancer, breast cancer, colorectal cancer, prostate cancer, head and neck cancer, stomach cancer, liver cancer, bladder cancer, kidney cancer, cervical cancer, pancreatic cancer, leukemia, bone marrow cancer, ovarian cancer, uterine cancer all solid and hematological cancers expressing CD55, including, but not limited to, cervical cancer, sarcoma, cholangiocarcinoma and endometrial cell carcinoma.
  • the present invention provides a composition for diagnosis of cancer comprising the above-described antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention as an active ingredient.
  • diagnosis includes determination of an individual's susceptibility to a particular disease, determination of whether an individual currently has a particular disease, and determination of the prognosis of a subject with a particular disease. do.
  • the CD55 receptor is a typical cancer diagnostic marker showing a high expression level in cancer tissues compared to normal tissues, and the antibody of the present invention that specifically binds to CD55 can accurately determine the presence of a tumor in a biological sample.
  • the antibody of the present invention accurately measures the expression level of CD55 in the tumor through various immunoassay methods to predict the therapeutic sensitivity of the tumor to the CDC drug, thereby establishing a customized treatment strategy according to the nature of the cancer at an early stage. can be usefully used for
  • diagnosis composition refers to an integrated mixture or equipment comprising the antibody of the present invention as a means for measuring the expression level of CD55 protein in order to determine whether a subject has cancer or predict treatment sensitivity to a CDC drug. (device), which may be expressed as a “diagnostic kit”.
  • biological sample means tissue, cells, whole blood, serum, plasma, saliva, urine, lymph, spinal fluid, tissue autopsy sample (brain, skin, lymph node, spinal cord, etc.), cell culture supernatant, ruptured eukaryotic cells and Bacterial expression systems include, but are not limited to.
  • the detection of CD55 protein in a biological sample may be performed by a colormetric method, an electrochemical method, a fluorimetric method, a luminometry, a particle counting method, a visual assessment or Detection of antigen-antibody complex formation using a scintillation counting method can be performed.
  • the term “detection” refers to a series of processes for determining whether an antigen-antibody complex is formed. Detection can be carried out using various labels including enzymes, fluorescent substances, ligands, luminescent substances, microparticles, or radioactive isotopes.
  • Enzymes used as detection labels include, for example, acetylcholinesterase, alkaline phosphatase, ⁇ -D-galactosidase, horseradish peroxidase and ⁇ -latamase, and the fluorescent substance is fluoro Contains resinein, Eu 3+ , Eu 3+ chelate or cryptate, etc., as ligands, including biotin derivatives, etc., as luminescent materials, including acridinium esters and isoluminol derivatives, and the like, and as microparticles. colloidal gold and colored latex, and the like, and radioactive isotopes may include 57 Co, 3 H, 125 I and 125 I-Bonton Hunter reagents.
  • the antigen-antibody complex can be detected using enzyme immunosorbent assay (ELISA).
  • ELISA enzyme immunosorbent assay
  • the antibody of the present invention may have a detection label, and when it does not have a detection label, the antibody of the present invention can be captured and confirmed by treating another antibody having a detection label.
  • the present invention provides a bispecific antibody or a functional fragment thereof comprising the antigen-binding fragment of the present invention described above and an antigen-binding fragment of an antibody that specifically binds to CD20.
  • bispecific antibody refers to an antibody comprising two different antigen-binding regions defined by different amino acid sequences. Typically, the two antigen binding regions comprised in a bispecific antibody are each specific for a different antigen or epitope.
  • the bispecific antibody of the present invention is a single antibody (CD20 x CD55) molecule in which the aforementioned CD55-specific antigen-binding fragment of the present invention and another antigen-binding fragment that specifically recognizes CD20 are bound.
  • the antigen-binding fragment of the anti-CD55 antibody contained in the bispecific antibody is in the form of scFv.
  • the antigen-binding fragment of the antibody that specifically binds to CD55 includes scFv.
  • the antigen-binding fragment of the antibody that specifically binds to CD55 is in the form of VL-linker-VH-CH2-CH3.
  • the antigen-binding fragment of the anti-CD20 antibody contained in the bispecific antibody is in the form of Fab.
  • the antigen-binding fragment of the antibody that specifically binds to CD20 includes Fab.
  • the antigen-binding fragment of the antibody that specifically binds to CD20 is in the form of VL-CK-linker-VH-CH1-CH2-CH3.
  • the antibody that specifically binds to CD20 is Rituximab (Rituximab).
  • the bispecific antibody of the present invention may comprise an Fc region consisting of first and second subunits capable of stably associating.
  • the term “Fc region” refers to the C-terminal region of an antibody heavy chain containing at least a portion of the constant region of a full-length antibody, and includes both a wild-type sequence Fc region and a mutant Fc region.
  • the Fc region of an IgG comprises an IgG CH2 and an IgG CH3 domain.
  • the CH3 region of a bispecific antibody of the invention has a wild-type or mutant CH3 domain (eg, an introduced “overhang” (“knob”) on one chain thereof and an introduced “cavity” corresponding to its other chain). (“hole”).
  • the bispecific antibody of the present invention may use a knob-into-hole method to prevent unwanted pairing of CD20 X CD55 heavy chains with each other.
  • the “knob-into-hole” method [US 5,731,168; US 7,695,936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996); Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)] described a protrusion at the interface of a first polypeptide (“knob ”) and a cavity (“hole”) corresponding to the interface of the second polypeptide.
  • the overhang is constructed by substituting a smaller amino acid side chain from the interface of the first polypeptide with a larger side chain (eg, tyrosine or tryptophan).
  • a larger amino acid side chain eg, tyrosine or tryptophan
  • a smaller side chain eg, alanine or threonine
  • the bispecific antibody of the present invention comprises an antigen-binding fragment of an anti-CD55 antibody in the form of VL-linker-VH-CH2-CH3 and VL-CK-linker-VH-CH1-CH2-CH3 It may be a form to which an antigen-binding fragment of an anti-CD20 antibody is bound.
  • the bispecific antibody of the present invention is composed of 10 to 100, more specifically 15 to 60 Gly and Ser in order to prevent unwanted pairing of CD20 X CD55 heavy chains.
  • a linker may be used.
  • the bispecific antibody of the present invention comprises CD55-scFv-knob (VL-linker20-VH-CH2-CH3) and CD20-Fab-hole (VL-CK-linker40-VH-CH1-CH2-CH3). It may be in a combined form.
  • Linker20 includes 20 Glys or Sers, and examples thereof include, but are not limited to, Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Ser.
  • linker40 includes 20 Gly or Ser, for example, Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser may include, but is not limited thereto.
  • the present invention provides an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to CD55; And it provides a composition for prophylactic treatment and/or diagnosis of cancer comprising the same.
  • the antibody of the present invention can be used as an effective therapeutic composition for various CD55-mediated diseases by showing high binding and inhibitory power to the CD55 protein that promotes tumor growth by suppressing the complement immune mechanism.
  • the antibody of the present invention is effective for fundamentally eliminating drug resistance and remarkably improving treatment responsiveness in various diseases in which resistance to therapeutic agents with complement dependent cytotoxicity (CDC) as a mechanism of action is induced due to overexpression of CD55 It can be usefully used as a therapeutic adjuvant.
  • CDC complement dependent cytotoxicity
  • 1 is a diagram showing the results of ELISA analysis of the affinity of 4-1H and G4-1H to CD55.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of ELISA analysis of the affinity for CD55 of an antibody prepared by screening from a library in which a random mutation is introduced in the gene of the G4-1H variable region.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of ELISA analysis of the affinity for CD55 of an antibody prepared by substituting a hydrophobic amino acid for a key region to improve binding.
  • FIG. 5a is a result of a FACS assay comparing the expression levels of CD20 and CD55 in Ramos and Ramos-RR.
  • Figure 5b is a result of a FACS assay analyzing the killing effect of Ramos-RR cells by the combined treatment of rituximab and EP-10H antibody.
  • FIG. 6a is a result of a FACS assay comparing CD55 expression levels in K562 and K562-IR.
  • Figure 6b is a FACS assay result analyzing the killing effect of 562-IR cells by the combined treatment of imatinib and EP-10H antibody.
  • FIG. 7a is a result of a FACS assay comparing CD55 expression levels in PC9 and PC9-GR.
  • Figure 7b is a FACS assay result analyzing the killing effect of PC9-GR cells by the combined treatment of imatinib and EP-10H antibody.
  • FIG. 8 is a diagram showing an antibody schematic diagram comparing the diabody type reported by SBU and Macor, which is a CD20 X CD55 diabody of the present invention.
  • FIG. 10 shows the results of an ELISA assay measuring the affinity of the CD20 X CD55 diabody to CD20 ( FIG. 10A ) and CD55 ( FIG. 10B ), respectively.
  • FIG. 11a shows the results of a FACS assay analyzing the killing effect of BJAB cells by the CD20 X CD55 diabody.
  • FIG. 11b is a comparison result of BJAB cell death rates when treated with rituximab alone, rituximab and EP-10H antibody in combination, and CD20 X CD55 dual antibody treatment.
  • 12A shows the results of a FACS assay analyzing the killing effect of Ramos cells by the CD20 X CD55 double antibody.
  • 12B is a comparison result of Ramos cell death rates when treated with rituximab alone, rituximab and EP-10H antibody in combination, and CD20 X CD55 dual antibody treatment.
  • 13A shows the results of a FACS assay analyzing the killing effect of Ramos-RR cells by the CD20 X CD55 double antibody.
  • 13B is a comparison result of Ramos-RR cell death rates when rituximab alone, rituximab and EP-10H antibody combined, and CD20 X CD55 dual antibody treatment were performed.
  • the amino acid residue numbering of antibody domains is determined by the Kabat EU numbering system, Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, commonly used in the art. according to the EU index number as in NIH Publication No. 91-3242, 1991).
  • the J gene of the light chain variable region was fixed with FGGGTKLTVL with reference to US2010-0056386, and the J gene of the heavy chain variable region was fixed with WGQGTTVTVSS with reference to US2014-0206849.
  • the humanized 4-1H antibody was named G4-1H, and its base sequence is shown in Table 1.
  • underlined text is a CDR region
  • bold text indicates an amino acid substituted with the parent antibody (4-1H).
  • the DNA of the variable region of the G4-1H antibody prepared in Example 1 was synthesized in the form of scFv (Cosmogenetech, Korea), and converted into a full-length IgG by PCR.
  • scFv Cosmogenetech, Korea
  • fragments of the variable and constant regions of the heavy and light chains from a pUC vector (Cosmogenetech, Korea) containing scFv were obtained through PCR using the V H , C H and V L , C K primer combinations of Table 2 below.
  • PCR was performed using the HC and LC primer combinations shown in Table 2 below using the variable and constant regions of the obtained antibody, and as a result, the heavy and light chains of G4-1H were obtained.
  • the heavy chain was ligated with Eco RI and Not I (New England Biolab, UK) enzymes and pCMV vector (ThermoFisher Scientific, USA), a vector for expression of animal cells treated with the same restriction enzyme.
  • the light chain was treated using Xba I (New England Biolab, UK) enzyme and ligated into the pCMV vector treated with the same restriction enzyme.
  • the ligation-completed plasmid was transformed by applying heat shock to DH5 ⁇ competent cells (New England Biolab, UK), and the obtained colonies were mass-cultured to obtain a plasmid.
  • the plasmids of the heavy and light chains converted into complete antibodies were transduced into Expi293F cells (Invitrogen, USA) using polyethyleneimine (PEI) (Polysciences, USA) and 150 mM NaCl, and in Freestyle 293 expression medium (Invitrogen, USA). Suspended culture for 7 days in Erlenmeyer flasks at 37° C., 8% CO 2 and 55% humidity conditions. After centrifuging the expression cell culture solution at 4,000 rpm for 10 minutes, the supernatant was taken and filtered through a 0.22 ⁇ m filter. The filtered supernatant was induced to bind to 1 ml of MabSelect sure (GE Healthcare, USA) resin at 4°C.
  • PKI polyethyleneimine
  • Freestyle 293 expression medium Invitrogen, USA
  • the bound resin was washed with 10 cv (column volume) of 20mM diphosphate and 500mM sodium chloride (pH 7.0) solution, and then the bound antibody was eluted using 100 mM citric acid (pH 3.0) solution, and then 1M Tris-HCL (pH 9.0) was neutralized.
  • the size and purity of the light and heavy chains of the purified antibody were finally confirmed through SDS-PAGE after buffer exchange with pH 7.2 - 7.4 PBS using the Slide-A-Lyzer Dialysis cassette (ThermoFisher Scientific, USA). As a result, it was possible to confirm the molecular weight and high purity consistent with the theoretical calculated values.
  • the binding ability of the G4-1H monoclonal antibody prepared in Example 2 to CD55 was confirmed by indirect ELISA.
  • indirect ELISA recombinant human CD55 (R&D Systems, USA) was diluted at 1 ⁇ g/ml in 50 ⁇ l of PBS, placed in a 96-well immune plate (Corning, USA), and stored at 4° C. for adsorption overnight.
  • Anti-human immunoglobulin Fc-HRP antibody (Jackson Immunoresearch, USA) was diluted 1:3,000 and treated at 50 ⁇ l per well, followed by reaction at room temperature for 1 hour. After the reaction, after washing 3 times with a buffer containing 0.5% Tween 20 (Amresco, USA), 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) (ThermoFisher Scientific, USA) 50 ⁇ l each and allowed to develop color for 10 minutes.
  • TMB 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine
  • G4-1H showed a lower affinity for CD55 than 4-1H (FIG. 1).
  • Example 4 Construction of a library in which random mutations are introduced in the gene of the variable region
  • a library was constructed in which random mutations were introduced into the variable region gene of the G4-1H antibody through an error prone PCR process. Specifically, scFv sequencing primer 1 and primer 2, polymerase without proofreading function (Takara, Japan), polymerase buffer, dATP, dTTP, dCTP, and dGTP were added to pComb3x vector containing G4-1H scFv, and salt concentration and manganese were added. The mutation frequency was controlled by adjusting the amount.
  • Error prone PCR was performed by repeating the procedure of 30 times of pre-heating at 94 ° C for 5 minutes, double helix separation at 91 ° C for 1 minute, primer binding at 55 ° C for 1 minute, and DNA synthesis reaction at 72 ° C for 3 minutes. A DNA synthesis reaction was performed at °C for 5 minutes.
  • the purified PCR product and the phagemid vector, pComb3x vector, were digested using Sfi I (New England Biolab, UK) restriction enzyme, ligated, and then transformed into ER2738 E. coli and cultured.
  • Clones having improved affinity for CD55 compared to G4-1H and 4-1H were selected through biopanning using the library prepared in Example 4 above.
  • 192 clones selected from the plates of the 3rd and 4th biopanning products were placed in a 96 deep well plate with 100 ⁇ g/ml carbenicillin, 70 ⁇ g/ml kanamycin and VCSM13 helper phage, and incubated overnight at 37° C. was induced to proliferate in the expressed phage.
  • the culture medium obtained above was centrifuged to obtain a medium supernatant containing phage, put it in an ELISA plate coated with recombinant human CD55 (R&D Systems 2009-CD/CF, USA), and incubated at 37 for 2 hours, and HRP was conjugated Anti-M13 antibody (Merck, USA) was used as a secondary antibody, and the antibody binding to CD55 was confirmed by ELISA.
  • HRP was conjugated Anti-M13 antibody (Merck, USA) was used as a secondary antibody, and the antibody binding to CD55 was confirmed by ELISA.
  • Using the phage of the 4-1H clone as a control 5 clones with higher binding affinity were selected.
  • the antibody of Example 6 showed a higher affinity for CD55 compared to 4-1H ( FIG. 2 ).
  • EP-1E, EP-1F, 3R-2-1H and EP-10H showed similar affinities, and EP-9B showed higher affinity than 4-1H but lower than other antibodies.
  • Antibodies having a higher affinity for CD55 compared to 4-1H can be very usefully used for diagnosing various cancers or preparing pharmaceutical therapeutic compositions.
  • variable region and constant region of the heavy chain were obtained by PCR using the HC1 and HC2 primer combinations in Table 4 from the pCMV vector containing the heavy chain variable region of EP-10H.
  • the heavy chain variable region and constant region obtained through PCR were subjected to overlap PCR using HC3 forward primer and HC2 reverse primer to obtain VH-CH1-CH2-CH3 form.
  • the heavy chain thus obtained was digested using Eco RI and Not I (New England Biolab, UK) restriction enzymes, and was ligated to pCMV vector (ThermoFisher Scientific, USA), which is a vector for expression of animal cells treated with the same restriction enzyme.
  • the ligation-completed plasmid was transformed by applying heat shock to DH5 ⁇ Escherichia coli (New England Biolab, UK), followed by mass culture to obtain a plasmid.
  • Example 9 Affinity analysis for CD55 of a complete antibody prepared by substituting a key region for improving binding affinity
  • Example 8 The affinity of the antibody prepared in Example 8 to CD55 was confirmed by indirect ELISA. Indirect ELISA was performed in the same manner as in Example 3 described above.
  • the antibody prepared by substituting a hydrophobic amino acid for the binding affinity core showed a higher affinity for CD55 than 4-1H (FIG. 3).
  • 10H(A), 10H(I), 10H(L), 10H(F) and 10H(M) showed lower affinity than EP-10H. This means that the substitution of G with V at the H100A position represents the most efficient result for improving the binding force.
  • BJAB is complement-resistant, due to the expression of CD55 (Golay, et al., Blood , 95(12):3900-8, 2000). For this reason, the responsiveness to rituximab, which is the main treatment mechanism for complement dependent cytotoxicity (CDC), is low.
  • CDC complement dependent cytotoxicity
  • apoptotic cells were identified with Attune NxT (ThermoFisher Scientific, USA), which is a FACS analysis equipment, and CDC was observed (FIG. 4).
  • Attune NxT ThermoFisher Scientific, USA
  • BJAB cells had low reactivity to rituximab, but their effect was increased when co-administered with anti-CD55 antibodies (4-1H and EP-10H), and the width of the increased effect was similar to that of rituximab.
  • the combination of rituximab and EP-10H was greater than that in combination with 4-1H.
  • Ramos was a rituximab-responsive B-cell lymphoma cell line, and an experiment was performed as follows to confirm CD55 expression in Ramos-RR, a rituximab-resistant cell line prepared using Ramos.
  • the fluorescently stained cells were washed with PBS and then suspended in 400 ⁇ l of PBS and analyzed using Attune NxT (ThermoFisher Scientific, USA), which is a FACS analysis equipment, and the results are shown in FIG. 5a.
  • Attune NxT ThermoFisher Scientific, USA
  • K562 is a leukemia cell line that is responsive to imatinib, a tyrosine kinase inhibitor.
  • CD55 expression in K562-IR, an imatinib-resistant cell line prepared using K562 was confirmed in the same manner as in Experimental Example 10-2a. As a result, it was confirmed that the CD55 expression of K562-IR was increased compared to that of K562 (FIG. 6a). This means that CD55 is involved in drug resistance of imatinib.
  • each of EP-10H was diluted with RPMI medium to a concentration of 10 ⁇ g/ml, treated with a final 500 ⁇ l, and cultured at 37° C., 5% CO 2 conditions for 24 hours. Thereafter, apoptotic cells were analyzed with Attune NxT, a FACS analysis equipment, using 7-AAD and FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit (FIG. 6b).
  • Imatinib is a long-term drug widely used for the treatment of leukemia, and a strategy to overcome drug resistance that may be induced by long-term administration is urgently needed. Accordingly, the strategy of overcoming the resistance of imatinib using EP-10H is expected to be very effective in treating leukemia.
  • PC9 is a non-small cell lung cancer (NSCLC) cell line that is responsive to the tyrosine kinase inhibitor gefitinib.
  • NSCLC non-small cell lung cancer
  • NSCLC cell lines PC9 and CD55 overexpressed PC9-GR which exhibits resistance to gefitinib, were aliquoted into 1 x 10 5 per well in a 12-well cell culture plate, and then cultured at 37° C. and 5% CO 2 conditions. 24 hours after dispensing, 5 ⁇ g/ml of gefitinib, and 5 ⁇ g/ml of gefitinib and 4-1H or EP-10H, respectively, were diluted with RPMI medium to 5 ⁇ g/ml to confirm the effect of co-administration, and the final 500 ⁇ l After treatment, it was cultured again at 37° C., 5% CO 2 conditions for 24 hours. Thereafter, apoptotic cells were analyzed with Attune NxT, a FACS analysis equipment, using 7-AAD and FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit (FIG. 7b).
  • Gefitinib is an effective drug for NSCLC for which there are not many therapeutic agents, and when drug resistance develops in a situation where there are not many other therapeutic options, it is difficult to select a second drug, so a strategy to overcome this drug resistance is urgently needed.
  • the strategy of overcoming resistance to gefitinib using EP-10H is expected to be very effective in treating NSCLC.
  • Example 10 the combined effect of EP-10H and various drugs was confirmed. Based on the results of the combination effect with rituximab confirmed in Experimental Examples 10-1 and 2 of Example 10, a method of using two antibodies targeting different antigens in combination, and a method of using one antibody to simultaneously target two antigens In order to compare the cancer cell killing ability of the double antibody, a CD20 x CD55 double antibody was prepared using rituximab and EP-10H.
  • the SBU-type CD20 X CD55 diabody used a knob-into-hole technique to prevent undesirable binding of heavy chains to each other, and a linker composed of Gly and Ser was used to prevent erroneous binding between light chains. Cloning was carried out in the form of CD55-scFv-knob (VL-linker20-VH-CH2-CH3) and CD20-Fab-hole (VL-CK-linker40-VH-CH1-CH2-CH3), respectively, and CD55-scFv-knob In the case of EP-10H prepared in Example 6 was used as a template, and PCR was performed using the primer combinations in Table 8.
  • the amplified genome was treated with Bss HII and Xba I (New England Biolab, UK) enzymes, and was ligated to pMAZ vector, a vector for expression of animal cells treated with the same restriction enzyme.
  • the ligation-completed plasmid was transformed by applying heat shock to DH5 ⁇ competent cells (New England Biolab, UK), and the obtained colonies were mass-cultured to obtain a plasmid.
  • CD20-Fab-hole VL-CK-linker40-VH-CH1-CH2-CH3
  • PCR was performed using the primer combinations in Table 9 based on the rituximab sequence published in the Drug Data Bank.
  • the amplified genome was treated with Bss HII and Xba I enzymes, and was ligated to pMAZ vector, a vector for expression of animal cells treated with the same restriction enzyme.
  • the ligation-completed plasmid was transformed by applying heat shock to a DH5 ⁇ competent cell (New England Biolab, UK), and the obtained colonies were mass-cultured to obtain a plasmid and sequence analysis (Table 10) was completed.
  • the SBU of the present invention uses a linker composed of Gly and Ser to prevent erroneous binding of light chains, so that double antibody expression is possible with two types of DNA.
  • the supernatant was taken and filtered through a 0.22 ⁇ m filter. The filtered supernatant was induced to bind to 1 ml of KappaSelect (GE Healthcare, USA) resin at 4°C.
  • the bound resin was washed with a PBS solution of 10 cv (column volume), and then the bound antibody was eluted using a 100 mM glycine-HCl (pH 2.7) solution, and then neutralized with 1 M Tris-HCL (pH 9.0). .
  • the size and purity of the light and heavy chains of the purified antibody were confirmed through SDS-PAGE. As a result, molecular weight and high purity consistent with the theoretical calculated values were confirmed (FIG. 9).
  • the SBU-type diabody is a hetero form in which the CD20 binding site is Fab and the CD55 binding site is scFv.
  • Knob-knob homodimer or knob monomer known to be most likely to be generated during dual antibody purification when purified with protein L using the C kappa portion of the Fab (Giese, et al., Biotechnol Prog , 34(2)397-404) It is possible to suppress the production of , and only the heterodimer in the desired form can be obtained.
  • the CD20 X CD55 diabody which can be used as a treatment for hematologic cancers in which CD20 is overexpressed
  • the CD20 X CD55 diabody in the form of SBU which has a higher affinity for CD20, will be more effective.
  • the apoptosis ability of the CD20 X CD55 double antibody was confirmed by the method of Experimental Example 10-1.
  • 20 ⁇ g/ml of rituximab for 5x10 5 BJAB cells per sample, 20 ⁇ g/ml of EP-10H and rituximab, respectively, to confirm the effect of co-administration, and the CD20 X CD55 diabody, the form disclosed in the prior literature written by Macor and SBU forms were diluted with RPMI medium supplemented with 20% complement sera human (Sigma, USA) at a concentration of 20 ⁇ g/ml, respectively, and the final 100 ⁇ l was treated. Others were performed in the same manner as in Experimental Example 10-1.
  • the CD20 X CD55 diabody showed a significant difference in apoptosis compared to the control treated with complement sera human only, and SBU showed a significant difference in cell death compared to rituximab. showed apoptosis ( FIGS. 11A and 11B ).
  • the apoptosis ability of the CD20 X CD55 dual antibody was confirmed in the Ramos cell line by the method of Experimental Example 11-4 ( FIGS. 12A and 12B ).
  • the CD20 X CD55 double antibody showed a significant difference in apoptosis compared to rituximab.
  • the SBU of the present invention showed superior apoptosis ability than the dual antibody of Macor.
  • CD20 X CD55 diabody can exhibit more effective anticancer effects than rituximab in rituximab-responsive carcinoma, and that SBU can be applied as an effective therapeutic agent among CD20 x CD55 diabodies in CD20-expressing hematologic cancers. do.
  • the apoptosis ability of the CD20 X CD55 dual antibody was confirmed in the Ramos-RR cell line by the method of Experimental Example 11-4 ( FIGS. 13a and 13b ).
  • the CD20 X CD55 dual antibody showed a significant difference in apoptosis compared to rituximab.
  • the SBU of the present invention showed a significantly superior apoptosis activity than the Macor double antibody among the diabodies.
  • CDC activation was analyzed by taking the supernatant treated with rituximab and CD20 X CD55 dual antibody in the form of SBU before flow cytometry analysis of the Ramos-RR cell pellet (FIG. 14).
  • the CDC mechanism is a reaction that occurs through the binding of C1q to an antibody, and activation analysis is possible at an intermediate stage in the entire CDC process based on the production of C4d, a by-product thereof.

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Abstract

본 발명은 CD55에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 및 이를 포함하는 암의 예방 치료 및/또는 진단용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 항체는 보체 면역기전을 억제하여 종양의 증식을 촉진하는 CD55 단백질에 대해 높은 결합력 및 억제력을 보임으로써 CD55로 매개되는 다양한 질환의 효율적인 치료 조성물로 이용될 수 있다. 또한 본 발명의 항체는 CD55의 과발현으로 인해 CDC(complement dependent cytotoxicity)를 작용기전으로 하는 치료제에 대한 내성이 유도된 다양한 질환에서 약물의 내성을 근원적으로 제거하고 치료 반응성을 현저히 개선시키는 효율적인 치료 보조제로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

CD55에 대한 신규 항체 및 이의 용도
본 발명은 CD55를 특이적으로 인식하는 신규 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 이를 이용한 암의 예방, 치료 및/또는 진단용 조성물에 관한 것이다.
전세계 항암제 시장은 지난 10년 간 연평균 10 - 13%의 성장률을 보여 왔으며, 2022년에는 총 2,000억 달러에 달할 것으로 예상된다. 2020년 현재 전세계 남성은 5명 중 1명, 여성은 6명 중 1명이 평생 1회 이상의 암 발병을 경험하고 있으며, 남성 8명 중 1명과 여성 11명 중 1명이 암으로 사망하고 있을 만큼 암의 유병률과 사망률은 지속적으로 증가하고 있다.
전 세계 항암제 시장은 1세대 화학요법을 시작으로 2세대 표적 항암제와 3세대 면역 항암제까지 패러다임 전환이 이루어지고 있다. 초창기 단순한 암의 축소·억제를 목적으로 하던 치료 방법에서 벗어나 정상적으로 빠르게 분열하는 세포에 대한 손상이 가해지지 않고 암세포만을 선택적으로 공격하는 표적 항암 치료 기술이 활발하게 연구되고 있으며, 이러한 표적 항암치료 기술의 개발은 암세포를 선택적으로 표적화할 수 있도록 하는, 암세포에서 특이적으로 발현되는 수용체의 선별과 수용체와 결합하는 표적화 화합물의 개발의 두 단계로 이루어진다.
한편, CD55(Decay-accelerating factor, DAF)는 보체 면역기전을 억제하는 수용체로서 대장암, 폐암, 위암, 유방암, 난소암, 백혈병, 두경부암 등의 다양한 고형암에서 고발현되어 체내의 보체 면역체계가 암세포를 사멸시키는 것을 억제함으로써 암세포의 증식을 촉진한다. 따라서 CD55는 표적 항암치료의 타겟 분자로서 활발하게 연구되어오고 있다.
특히 CD55가 고발현되는 고형암에서는 보체 의존성 세포독성(complement dependent cytotoxicity, CDC)을 작용기전으로 하는 다양한 항암제에 대해 낮은 치료 반응성을 보이기 때문에, CD55에 보다 높은 친화도와 특이성으로 결합하여 이의 활성을 효율적으로 억제할 수 있는 우수한 항체 치료제의 개발이 요구되고 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
특허문헌 1. 대한민국 등록 제10-1800774호
본 발명자들은 보체 면역기전을 억제하는 수용체인 CD55 단백질을 특이적으로 인식하고, 이의 활성을 특이적으로 억제함으로써 CD55에 의해 저해된 면역기전을 효율적으로 복구할 수 있는 우수한 CD55 억제제를 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 가변영역 내 핵심 항원인식부위의 일부 아미노산을 치환한 항체를 이용할 경우 현저히 증가된 CD55 결합력 및 억제력으로 인해 암세포 등에 대한 보체매개 세포용해(complement-mediated cell lysis) 활성이 유의하게 회복됨을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 CD55에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 및 이를 포함하는 암의 예방 또는 치료 및/또는 진단용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 CD55에 특이적으로 결합하는 항체의 항원 결합 단편 및 CD20에 특이적으로 결합하는 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 이중특이적 항체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 HCDR1 영역; 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 가지는 HCDR2 영역; 및 하기 일반식 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 HCDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는, CD55에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다:
일반식 1
D-R-G-M-X1;
일반식 2
N-A-X2-A-G-G-W-H-A-A-Y-I-D-A,
상기 일반식 1에서 X1은 Ala 또는 Val이며, 상기 일반식 2에서 X2는 Val, Ala, Ile, Leu, Phe 및 Met로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명자들은 보체 면역기전을 억제하는 수용체인 CD55 단백질을 특이적으로 인식하고, 이의 활성을 특이적으로 억제함으로써 CD55에 의해 저해된 면역기전을 효율적으로 복구할 수 있는 우수한 CD55 억제제를 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 가변영역 내 핵심 항원인식부위의 일부 아미노산을 치환한 항체를 이용할 경우 현저히 증가된 CD55 결합력 및 억제력으로 인해 암세포 등에 대한 보체매개 세포용해(complement-mediated cell lysis) 활성이 유의하게 회복됨을 발견하였다.
본 명세서에서 용어 "항체(antibody)"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 의미하며 다클론항체 및 단클론항체를 모두 포함한다.
항체는 완전한 전장(full-length) 항체 형태뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편(항체 단편)을 포함한다. 완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조로서 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
본 명세서에서 용어 "항체의 항원 결합 단편"은 전체 항체 분자 내에서 항원을 특이적으로 인식하고 항원-항체 결합 기능을 보유하는 단편을 의미하며, 단일-도메인 항체(sdAb), 단일쇄 항체(scFv), Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 단편의 예로는, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편(Fab 단편); 힌지 영역에서 이황화물 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편(F(ab')2 단편); VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; 항체의 하나의 암(arm)의 VL 및 VH 도메인, 및 이황화물-연결된 Fv(sdFv)로 구성된 Fv 단편; VH 도메인으로 구성된 dAb 단편; 및 분리된 상보성 결정 영역(CDR) 또는 링커에 의해 선택적으로 이어질 수 있는 둘 이상의 분리된 CDR의 조합을 포함한다. 또한, scFv는 VL과 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성한 단일 단백질 사슬을 이루도록 링커에 의해 이어질 수 있다. 이러한 단일쇄 항체도 항체의 단편에 포함된다. 또한, 상기 항체 또는 항체의 단편은 2개의 중쇄 분자와 2개의 경쇄 분자를 포함하는 테트라머 항체; 항체 경쇄 모노머; 항체 중쇄 모노머; 항체 경쇄 다이머, 항체 중쇄 다이머; 인트라바디; 1가 항체; 낙타 항체; 및 단일-도메인 항체(sdAb)를 포함한다.
Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 PCT 국제 공개특허출원 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 단쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수도 있다.
본 명세서에서 용어 "중쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3 개의 불변영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한, 본 명세서 용어 "경쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.
본 명세서에서, 용어 "CDR(complementarity determining region)"은 면역글로블린의 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다(Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)). 중쇄(HCDR11, HCDR2 및 HCDR3) 및 경쇄(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)에는 각각 3개의 CDR이 포함되어 있으며, 이들 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공한다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편의 범위에는 CDR 영역에 보존적 아미노산 치환을 갖는 변이체가 포함되며, CD55를 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서 첨부한 서열목록에 기재된 아미노산 서열에 대한 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 외에 반감기, 생체 적합성 기타 생물학적 특성을 보다 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 항체 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인 하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인 된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 일 특정예에 따르면 70%의 상동성, 다른 특정예에 따르면 80%의 상동성, 또 다른 특정예에 따르면 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. (1981) 2:482 Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. (1970) 48:443; Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. (1988) 24: 307-31; Higgins and Sharp, Gene (1988) 73:237-44; Higgins and Sharp, CABIOS (1989) 5:151-3; Corpet et al. Nuc. Acids Res. (1988) 16:10881-90; Huang et al. Comp. Appl. BioSci. (1992) 8:155-65 및 Pearson et al. Meth. Mol. Biol. (1994) 24:307-31에 개시되어 있다.
본 명세서에서 용어 "친화도(affinity)"는 항체 또는 이의 항원결합 단편과 항원 간의 결합 강도를 의미하며, 이에 "결합력"으로도 표현될 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 일반식 1의 X1은 Ala이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 일반식 2의 X2는 Val이다.
보다 구체적으로는, 본 발명의 중쇄 가변영역은 다음의 HFR1 내지 HFR4 로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프레임워크 영역(FR)을 포함한다:
HFR1: EVQLY1ESGGGLVQPGGSLRLSCY2AY3GFTFS (Y1은 Val 또는 Ala이고, Y2는 Val 또는 Ala이며, Y3는 Ser 또는 Arg이다)
HFR2: WVRQY4PGKGLEWVS (Y4는 Ala 또는 Ser이다)
HFR3: RY5TISRDNSKNTLYLQMNY6LRAEDTAVYYCAK (Y5는 Ala 또는 Thr이고 Y6는 Ser 또는 Asn이다)
HFR4: WGQGTTVTVSS
보다 더 구체적으로는, 본 발명의 중쇄 가변영역은 서열목록 19 내지 22로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가진다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 가지는 LCDR1 영역; 하기 일반식 3으로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 LCDR2 영역; 및 서열목록 제3서열의 아미노산 서열을 가지는 LCDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변영역을 추가적으로 포함한다:
일반식 3
W-N-X3-K-R-P-S,
상기 일반식 3에서 X3는 Asn 또는 Asp이다.
보다 구체적으로는, 상기 X3는 Asp이다.
보다 구체적으로는, 본 발명의 경쇄 가변영역은 다음의 LFR1 내지 LFR4 로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프레임워크 영역(FR)을 포함한다:
LFR1: SYELTQPPSVSVSPGQTASITC
LFR2: WY7QQKPGQSPVTVIY (Y7은 Phe 또는 Tyr이다)(F 또는 Y)
HFR3: GIPERFSGSKSGNTATLTISGTQAMDEADYYC
HFR4: FGGGTKLTVL
보다 더 구체적으로는, 본 발명의 경쇄 가변영역은 서열목록 4 또는 18의 아미노산 서열을 가진다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역을 포함하는, CD55에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다:
a) 서열목록 제4서열의 경쇄 가변영역; 또는 상기 서열목록 제4서열의 경쇄 가변영역에서 32번째 아미노산 서열인 Y(Tyr)가 F(Phe)로 치환 및 48번째 아미노산 서열인 D(Asp)가 N(Asn)으로 치환으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 치환을 포함하는 경쇄 가변영역, 및
b) 서열목록 제5서열의 중쇄 가변영역; 또는 상기 서열목록 제5서열의 중쇄 가변영역에서 5번째 아미노산 서열인 V(Val)가 A(Ala)로 치환, 23번째 아미노산 서열인 A(Ala)가 V(Val)로 치환, 25번째 아미노산 서열인 S(Ser)가 R(Arg)로 치환, 35번째 아미노산 서열인 A(Ala)가 V(Val)로 치환, 40번째 아미노산 서열인 A(Ala)가 S(Ser)로 치환, 68번째 아미노산 서열인 A(Ala)가 T(Thr)로 치환, 85번째 아미노산 서열인 S(Ser)가 N(Asn)로 치환 및 101번째 아미노산 서열인 G(Gly)가 V(Val), L(Leu), I(Ile), F(Phe), M(Met) 또는 A(Ala)로 치환으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 치환을 포함하는 중쇄 가변영역.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 전술한 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산분자를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "핵산 분자"는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, (1990) 90:543-584). 본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자의 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
본 발명의 핵산 분자는 상기한 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인 된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 일 특정예에서는 최소 90%의 상동성, 다른 특정예에서는 최소 95%의 상동성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 전술한 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 전술한 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약제학적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 전술한 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 치료용도(for use in therapy)를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "예방"은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸릴 가능성이 있는 대상체에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 용어 "치료"는 (a) 질환, 질병 또는 증상의 발전의 억제; (b) 질환, 질병 또는 증상의 경감; 또는 (c) 질환, 질병 또는 증상을 제거하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물을 대상체에 투여하면 CD55 수용체의 활성을 억제함으로써 보체 면역기전을 회복하고 암세포의 증식을 억제하여 암의 진행을 저해하거나, 이로 인한 증상을 제거하거나 또는 경감시키는 역할을 한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 그 자체로 암 치료용 조성물이 될 수도 있고, 혹은 다른 약리성분, 예를 들어 CDC(complement dependent cytotoxicity)를 작용기전으로 하는 치료제와 함께 투여되어 이의 치료 반응성을 향상시키는 치료 보조제로 적용될 수도 있다. 이에, 본 명세서에서 용어 "치료" 또는 "치료제"는 "치료 보조" 또는 "치료 보조제"의 의미를 포함한다.
본 명세서에서 용어 "투여" 또는 "투여하다"는 본 발명의 조성물의 치료적 유효량을 대상체에 직접적으로 투여함으로써 대상체의 체내에서 동일한 양이 형성되도록 하는 것을 말한다.
본 발명에서 용어 "치료적 유효량"은 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하고자 하는 개체에게 조성물 내의 약리성분이 치료적 또는 예방적 효과를 제공하기에 충분한 정도로 함유된 조성물의 함량을 의미하며, 이에 "예방적 유효량"을 포함하는 의미이다.
본 명세서에서 용어 "대상체"는 제한없이 인간, 마우스, 래트, 기니아 피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 원숭이, 침팬지, 비비 또는 붉은털 원숭이를 포함한다. 구체적으로는, 본 발명의 대상체는 인간이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 조성물은 항-CD20 항체 및 티로신 키나아제 억제제로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 약리성분을 추가적으로 포함한다.
보다 구체적으로는, 상기 항-CD20 항체는 리툭시맙(Rituximab)이다.
보다 구체적으로는, 상기 티로신 키나아제 억제제는 이마티닙(Imatinib) 및 게피티닙(gefitinib)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물로 예방 또는 치료될 수 있는 암은 CD55 양성인 암이다.
본 명세서에서 용어 "CD55 양성 암"은 CD55 수용체를 발현하는 암세포로 구성된 암종을 의미하며, 구체적으로는 대상체 내에서의 보체 면역활성이 측정 가능할 정도로 저해될 만큼 CD55가 발현되는 암을 의미한다. 이에, 용어 "CD55 양성 암"은 "CD55 과발현 암"을 포함하는 의미이다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 조성물은 CD55의 과발현으로 인해 치료제에 대한 내성이 유도된 다양한 암종에서 약물의 내성을 제거하고 치료 민감성을 증진시킬 수 있다.
CD55 양성 암은 예를 들어 흑색종, 림프종, 폐암, 갑상선암, 유방암, 대장암, 전립선암, 두경부암, 위암, 간장암, 방광암, 신장암, 자궁경부암, 췌장암, 백혈병, 골수암, 난소암, 자궁경부암, 육종, 담관암 및 자궁내막세포암을 포함하나, 이에 제한되지 않고 CD55를 발현하는 모든 고형암 및 혈액암을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 전술한 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 암의 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 항체 또는 그의 항원결합 단편과 대상이 되는 암에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 명세서에서 용어 "진단"은 특정 질환에 대한 개체의 감수성(susceptibility)의 판정, 특정 질환을 현재 개체가 가지고 있는 지 여부의 판정, 및 특정 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)의 판정을 포함한다.
CD55 수용체는 정상 조직에 비해 암 조직에서 높은 발현 수준을 보이는 전형적인 암 진단 마커로서, CD55에 특이적으로 결합하는 본 발명의 항체는 생물학적 시료 내 종양의 존재를 정확하게 판정할 수 있다. 아울러, 본 발명의 항체는 다양한 면역 어세이 방법을 통해 종양 내 CD55의 발현 수준을 정확히 측정하여 해당 종양의 CDC 약물에 대한 치료 민감성을 예측함으로써, 암의 성격에 따른 맞춤형 치료 전략을 조기에 수립하는 데에 유용하게 이용될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "진단용 조성물"은 대상체의 암 발병 여부를 판단하거나 CDC 약물에 대한 치료 민감성을 예측하기 위해 CD55 단백질의 발현량 측정수단으로서 본 발명의 항체를 포함하는 통합적인 혼합물(mixture) 또는 장비(device)를 의미하며, 이에 "진단용 키트"로 표현될 수도 있다.
본 명세서에서 용어 "생물학적 시료"란 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇨, 림프액, 척수액, 조직 부검 시료(뇌, 피부, 림프절, 척수 등), 세포 배양 상등액, 파열된 진핵세포 및 세균 발현계를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
생물학적 시료에서 CD55 단백질의 검출은, 비색법(colormetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 또는 섬광계수법(scintillation counting method)을 이용한 항원-항체 복합체 형성의 검출을 통하여 수행할 수 있다. 본 명세서에서 용어 "검출"은 항원-항체 복합체의 형성 여부를 판정하기 위한 일련의 과정을 의미한다. 검출은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자 또는 방사성 동위원소를 포함하는 다양한 표지체를 사용하여 실시할 수 있다.
검출 표지체로서 사용되는 효소는 예를 들어 아세틸콜린에스테라제, 알칼라인 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제 및 β-라타마제를 포함하며, 형광물로는 플루오레세인, Eu3+, Eu3+ 킬레이트 또는 크립테이트 등을 포함하고, 리간드로는 바이오틴 유도체 등을 포함하며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르 및 이소루미놀 유도체 등을 포함하고, 미소입자로는 콜로이드 금 및 착색된 라텍스 등을 포함하며, 방사성 동위원소로는 57Co, 3H, 125I 및 125I-볼톤(Bonton) 헌터(Hunter) 시약 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 항원-항체 복합체를 효소면역흡착법(ELISA) 을 이용하여 검출할 수 있다. 본 발명의 항체는 검출 표지를 가질 수 있으며, 검출표지를 가지지 않을 경우는 본 발명의 항체를 포획할 수 있고 검출 표지를 가지는 또 다른 항체를 처리하여 확인할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 전술한 본 발명의 항원 결합 단편 및 CD20에 특이적으로 결합하는 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 이중특이적 항체 또는 이의 기능적 단편을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "이중특이적 항체"는 상이한 아미노산 서열에 의해 정의되는 상이한 2개의 항원-결합 영역을 포함하는 항체를 의미한다. 전형적으로, 이중특이적 항체에 포함된 2개의 항원 결합 영역은 각각 상이한 항원 또는 에피토프에 대해 특이적이다.
본 발명의 이중특이적 항체는 전술한 본 발명의 CD55 특이적인 항원 결합 단편과 CD20를 특이적으로 인식하는 또 다른 항원 결합 단편이 결합된 하나의 항체(CD20 x CD55) 분자로서, 본 발명에 따르면, 각각의 항-CD55 항체(예를 들어 후술하는 실시예의 EP-10H)와 항-CD20 항체(예를 들어 리툭시맙)를 병용 투여한 경우에 비하여 리툭시맙 저항성 종양에 대해 더 우수한 치료 효과를 보인다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 이중특이적 항체에 포함된 항-CD55 항체의 항원 결합 단편은 scFv 형태이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 CD55에 특이적으로 결합하는 항체의 항원 결합 단편은 scFv를 포함하는 것이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 CD55에 특이적으로 결합하는 항체의 항원 결합 단편은 VL-링커-VH-CH2-CH3 형태인 것이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 이중특이적 항체에 포함된 항-CD20 항체의 항원 결합 단편은 Fab 형태이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 CD20에 특이적으로 결합하는 항체의 항원 결합 단편은 Fab를 포함하는 것이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 CD20에 특이적으로 결합하는 항체의 항원 결합 단편은 VL-CK-링커-VH-CH1-CH2-CH3 형태인 것이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 CD20에 특이적으로 결합하는 항체는 리툭시맙(Rituximab)이다.
본 발명의 이중특이적 항체는 안정하게 회합할 수 있는 제 1 및 제 2 서브유닛으로 이루어진 Fc 영역을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 용어 "Fc 영역"은 전장 항체의 불변 영역 중 적어도 일부분을 함유하는 항체 중쇄의 C-말단 영역을 의미하며, 이는 야생형 서열 Fc 영역과 변이체 Fc 영역을 모두 포함한다. IgG의 Fc 영역은 IgG CH2 및 IgG CH3 도메인을 포함한다. 본 발명의 이중특이적 항체의 CH3 영역은 야생형 또는 변이체 CH3 도메인(예를 들어, 그의 한 쇄에 도입된 "돌출부"("놉") 및 그의 다른 쇄에 상응하는 도입된 "공동(cavity)"("홀")을 갖는 CH3 도메인일 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 이중특이적 항체는 CD20 X CD55의 중쇄끼리의 원치 않는 쌍의 결합을 막기 위해 놉-인투 홀(knob-into-hole)방법을 사용할 수 있다. "놉-인투-홀" 방법[US 5,731,168; US7,695,936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996); Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)]은 이종이량체 생성을 촉진하고 동종이량체 생성을 저해하기 위해 돌출부가 공동에 위치할 수 있도록, 제 1 폴리펩타이드의 계면에 돌출부("놉") 및 제 2 폴리펩타이드의 계면에 상응하는 공동("홀")을 도입한다. 돌출부는 제 1 폴리펩타이드의 계면으로부터 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄(예, 티로신 또는 트립토판)로 치환시킴으로써 구성된다. 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 측쇄(예, 알라닌 또는 트레오닌)로 치환시킴으로써, 돌출부와 동일하거나 유사한 크기의 상호보완적 공동이 제 2 폴리펩타이드의 계면에 생성된다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 이중특이적 항체는 VL-linker-VH-CH2-CH3 형태의 항-CD55 항체의 항원 결합 단편 및 VL-CK-linker-VH-CH1-CH2-CH3 형태의 항-CD20 항체의 항원 결합 단편이 결합된 형태일 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 이중특이적 항체는 CD20 X CD55의 중쇄끼리의 원치 않는 쌍의 결합을 막기 위해 10 내지 100개, 보다 구체적으로는 15 내지 60개의 Gly과 Ser으로 구성된 링커를 사용할 수 있다.
구체적으로는, 본 발명의 이중특이적 항체는 CD55-scFv-knob(VL-linker20-VH-CH2-CH3)과 CD20-Fab-hole(VL-CK-linker40-VH-CH1-CH2-CH3)이 결합된 형태일 수 있다.
linker20은 상기 Gly 또는 Ser을 20개 포함하는 것으로, 이의 예로는 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
linker40은 상기 Gly 또는 Ser을 20개 포함하는 것으로, 이의 예로는 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Ser을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 CD55에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 및 이를 포함하는 암의 예방 치료 및/또는 진단용 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명의 항체는 보체 면역기전을 억제하여 종양의 증식을 촉진하는 CD55 단백질에 대해 높은 결합력 및 억제력을 보임으로써 CD55로 매개되는 다양한 질환의 효율적인 치료 조성물로 이용될 수 있다.
(c) 또한 본 발명의 항체는 CD55의 과발현으로 인해 CDC(complement dependent cytotoxicity)를 작용기전으로 하는 치료제에 대한 내성이 유도된 다양한 질환에서 약물의 내성을 근원적으로 제거하고 치료 반응성을 현저히 개선시키는 효율적인 치료 보조제로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 4-1H와 G4-1H의 CD55에 대한 친화도를 측정한 ELISA 분석 결과를 보여주는 그림이다.
도 2는 G4-1H 가변영역의 유전자에 무작위 돌연변이가 도입된 라이브러리로부터 선별하여 제작한 항체의 CD55에 대한 친화도를 측정한 ELISA 분석 결과를 보여주는 그림이다.
도 3은 결합력 향상 핵심 부위를 소수성 아미노산으로 치환하여 제작한 항체의 CD55에 대한 친화도를 측정한 ELISA 분석 결과를 보여주는 그림이다.
도 4는 리툭시맙과 EP-10H 병용처리에 의한 BJAB 세포의 사멸 효과를 분석한 FACS 어세이 결과이다.
도 5a는 Ramos와 Ramos-RR에서 CD20 및 CD55의 발현량을 비교 분석한 FACS어세이 결과이다. 도 5b는 리툭시맙과 EP-10H 항체의 병용처리에 의한 Ramos-RR 세포의 사멸 효과를 분석한 FACS 어세이 결과이다.
도 6a는 K562와 K562-IR에서 CD55 발현량을 비교 분석한 FACS 어세이 결과이다. 도 6b는 이마티닙과 EP-10H 항체의 병용처리에 의한 562-IR 세포의 사멸 효과를 분석한 FACS 어세이 결과이다.
도 7a는 PC9과 PC9-GR에서 CD55 발현량을 비교 분석한 FACS 어세이 결과이다. 도 7b는 이마티닙과 EP-10H 항체의 병용처리에 의한 PC9-GR 세포의 사멸 효과를 분석한 FACS 어세이 결과이다.
도 8은 본 발명의 CD20 X CD55 이중항체인 SBU와 Macor가 보고한 이중항체 형태를 비교한 항체 모식도를 보여주는 그림이다.
도 9는 본 발명의 SBU 형태의 CD20 X CD55 이중항체에 대한 SDS-PAGE 분석결과를 나타낸다.
도 10은 CD20 X CD55 이중항체의 CD20(도 10a) 및 CD55(도 10b)에 대한 친화도를 측정한 ELISA 분석 결과를 각각 보여준다.
도 11a는 CD20 X CD55 이중항체에 의한 BJAB 세포의 사멸 효과를 분석한 FACS 어세이 결과를 나타낸다. 도 11b는 리툭시맙 단독처리, 리툭시맙과 EP-10H 항체의 병용처리 및 CD20 X CD55 이중항체 처리 시의 각각의 BJAB 세포 사멸률을 비교한 결과이다.
도 12a는 CD20 X CD55 이중항체에 의한 Ramos 세포의 사멸 효과를 분석한 FACS 어세이 결과를 나타낸다. 도 12b는 리툭시맙 단독처리, 리툭시맙과 EP-10H 항체의 병용처리 및 CD20 X CD55 이중항체 처리 시의 각각의 Ramos 세포 사멸률을 비교한 결과이다.
도 13a는 CD20 X CD55 이중항체에 의한 Ramos-RR 세포의 사멸 효과를 분석한 FACS 어세이 결과를 나타낸다. 도 13b는 리툭시맙 단독처리, 리툭시맙과 EP-10H 항체의 병용처리 및 CD20 X CD55 이중항체 처리 시의 각각의 Ramos-RR 세포 사멸률을 비교한 결과이다.
도 14는 Ramos-RR 세포에 리툭시맙, SBU 형태의 CD20 X CD55 이중항체를 처리한 상등액 내의 C4d 생산량을 확인한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 4-1H의 인간화
대한민국 출원 제10-2016-0132333호에 개시된 4-1H의 면역원성을 감소시키기 위하여 다음과 같은 방법으로 인간화를 수행하였다:
4-1H의 인간화를 위해, 4-1H의 경쇄 가변영역 내 3개의 FR(LFR1, LFR2, LFR3)을 IGLV3-1*01의 FR로 치환하였고 중쇄 가변영역 내 3개의 FR(HFR1, HFR2, HFR3)을 IGHV3-23D*02의 FR로 치환하였다. 그 후, 아미노산의 물리화학적 성질의 유사성 또는 비유사성을 고려하여 특정한 아미노산을 모항체(4-1H)의 아미노산으로 다시 치환하였다. 모항체(4-1H)로 다시 치환된 아미노산은 경쇄 가변영역에서 L46T, N66K이고, 중쇄 가변영역에서 F68A이었다. 항체 도메인의 아미노산 잔기 번호는 당업계에서 통상적으로 사용되는 카밧 EU 넘버링 시스템(Kabat EU numbering system, Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 1991에서와 같은 EU 지수번호에 따름)에 따라 넘버링하였다. 경쇄 가변영역의 J gene은 US2010-0056386을 참고하여 FGGGTKLTVL로 고정하였고, 중쇄 가변영역의 J gene은 US2014-0206849를 참고하여 WGQGTTVTVSS로 고정하였다. 인간화 4-1H 항체를 G4-1H로 명명하였고, 그 염기서열을 표 1에 표시하였다.
경쇄 가변영역
G4-1H
(VL)		 SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGGGGSYGWYQQKPGQSPVTVIYWNDKRPSGIPERFSGSKSGNTATLTISGTQAMDEADYYCGGWDSSTYAIFGGGTKLTVL 서열번호 4
중쇄 가변영역
G4-1H
(VH)		 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDRGMAWVRQAPGKGLEWVSGISSSGRYTYYAPAVKGRATISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNAGAGGWHAAYIDAWGQGTTVTVSS 서열번호 5
G4-1H의 중쇄 및 경쇄 가변영역 아미노산 서열
상기 표에서 밑줄친 글씨는 CDR 영역이고, 볼드체는 모항체 (4-1H)로 다시 치환된 아미노산을 나타낸다.
실시예 2: G4-1H 클론의 완전 항체 전환 및 발현/정제
실시예 1에서 제작한 G4-1H 항체의 가변영역의 DNA를 scFv 형태로 합성하고 (Cosmogenetech, 한국), PCR을 통해 완전 항체(full-length IgG)로 전환하였다. 먼저 scFv를 포함하는 pUC 벡터(Cosmogenetech, 한국)로부터 중쇄 및 경쇄의 가변영역과 불변 영역의 절편을 하기 표 2의 VH, CH 및 VL, CK 프라이머 조합을 이용해서 PCR을 통하여 수득하였다. 수득한 항체의 가변영역과 불변영역을 이용하여 하기 표 2의 HC 및 LC 프라이머 조합을 사용하여 PCR을 수행하였고, 그 결과 G4-1H의 중쇄와 경쇄를 확보하였다. 중쇄는 EcoRI과 NotI(New England Biolab, 영국) 효소를 처리하였고 마찬가지로 동일한 제한효소로 처리된 동물세포 발현용 벡터인 pCMV 벡터(ThermoFisher Scientific, 미국)에 라이게이션하였다. 또한 경쇄는 XbaI (New England Biolab, 영국) 효소를 사용하여 처리하였으며 마찬가지로 동일한 제한효소로 처리된 pCMV 벡터에 라이게이션 하였다. 라이게이션이 완료된 플라스미드는 DH5α competent cell(New England Biolab, 영국)에 열충격을 가하여 형질전환하였고, 확보한 콜로니를 대량 배양하여 플라스미드를 수득하였다.
프라이머 서열 서열번호
VH 정방향 CTT CCT GTC AGT AAC TAC AGG TGT CCA CTC CCA GGT GCA ACT GCA GCA GTC 6
역방향 CCA GCG TGA CCG TAT CCA GCG CCT CCA CCA AGG GCC CCA 7
CH 정방향 GCC TCC ACC AAG GGC CC 8
역방향 TCC CCC GGC AAG TGA GCG GCC GCT CAC 9
HC 정방향 CAG AAT TCA CTC TAA CCA TGG AAT GGA GCT GGG TCT TTC TCT TCT TCC TGT CAG TAA CTA CAG 10
역방향 TCC CCC GGC AAG TGA GCG GCC GCT CAC 9
VL 정방향 GGT CTT TGT ATA CAT GTT GCT GTG GTT GTC TGG TGT TGA AGG AAG CTA CGA GCT GAC AC 11
역방향 CAA GCT CAC CGT CTT GCG GAC CGT GGC C 12
CK 정방향 CGG ACC GTG GCC GCC CCC TC 13
역방향 CGG GGC GAG TGC TAG TTC TAG AAC TA 14
LC 정방향 GGG AAT TCT AGA GGA TCG AAC CCT TTG CAA GCT TCG GCA CGA GCA GAC CAG CAT GGG CAT CAA GAT GGA GAC ACA TTC TCA GGT CTT TGT ATA CAT GTT G 15
역방향 CGG GGC GAG TGC TAG TTC TAG AAC TA 14
G4-1H 완전항체 클로닝에 사용된 프라이머
완전항체로 전환시킨 중쇄와 경쇄 각각의 플라스미드를 폴리에틸렌이민(PEI)(Polysciences, 미국)과 150 mM NaCl을 이용하여 Expi293F 세포(Invitrogen, 미국)에 형질도입하고 Freestyle 293 발현배지(Invitrogen, 미국)에서 37℃, 8% CO2 및 55% 습도 조건으로 Erlenmeyer 플라스크에서 7일간 부유배양하였다. 발현 세포 배양액을 4,000rpm로 10분 간 원심분리한 후, 상등액을 취해 0.22μm 필터로 여과하였다. 여과된 상등액은 4℃에서 MabSelect sure(GE Healthcare, 미국) 레진 1 ml에 결합을 유도하였다. 결합된 레진은 10 cv(column volume)의 20mM 제이인산나트륨과 500mM 염화나트륨(pH 7.0) 용액으로 세척 후, 100 mM 시트르산(pH 3.0) 용액을 사용하여 결합된 항체를 용출한 후, 1M Tris-HCL(pH 9.0)으로 중화하였다. Slide-A-Lyzer Dialysis 카세트(ThermoFisher Scientific, 미국)를 이용하여 pH 7.2 - 7.4 PBS로 완충액 교환을 진행 후 SDS-PAGE를 통해 정제된 항체의 경쇄와 중쇄의 크기 및 순도를 최종적으로 확인하였으며, 그 결과 이론적 계산치와 일치하는 분자량과 높은 순도를 확인할 수 있었다.
실시예 3: CD55에 대한 4-1H와 G4-1H의 친화도 분석
상기 실시예 2에서 제작한 G4-1H 단클론 항체의 CD55에 대한 결합력을 간접 ELISA로 확인하였다. 간접 ELISA는 50μl의 PBS에 1μg/ml로 재조합 인간 CD55 (R&D Systems, 미국)를 희석하여 96웰 면역 플레이트(Corning, 미국)에 넣고, 4℃에서 보관하여 밤새 흡착시켰다. 3% 우혈청 알부민(Millipore, 미국)이 포함된 완충용액으로 상온에서 1시간 반응시킨 후, 0.5% Tween 20(Amresco, 미국)이 포함된 완충용액으로 3회 세척하고, 순차적 농도(0.0001, 0.0003, 0.001, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10nM)로 희석한 각각의 항체를 웰 당 50μl씩 처리하였다. 항원에 항체가 결합할 수 있도록 상온에서 2시간 반응시킨 후, 0.5% Tween 20 (Amresco, 미국)이 포함된 완충용액으로 3회 세척하였다. 항-인간 면역글로불린 Fc-HRP 항체(Jackson Immunoresearch, 미국)를 1:3,000으로 희석하여 웰당 50μl씩 처리한 후, 상온에서 1시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 0.5% Tween 20 (Amresco, 미국)이 포함된 완충용액으로 3회 세척한 후, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)(ThermoFisher Scientific, 미국) 50μl씩 넣고 10분간 발색 시켰다. 분광 광도계(Biotek, 미국)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정한 결과, G4-1H는 4-1H에 비하여 CD55에 대하여 낮은 친화력을 나타냈다(도 1).
실시예 4: 가변영역의 유전자에 무작위 돌연변이가 도입된 라이브러리 제작
G4-1H의 CD55에 대한 친화도를 개선시키기 위하여 G4-1H 항체의 가변영역 유전자에 Error prone PCR 과정을 통해 무작위 돌연변이가 도입된 라이브러리를 구축하였다. 구체적으로, G4-1H scFv를 포함하는 pComb3x 벡터에 scFv 시퀀싱 프라이머 1과 프라이머 2, 교정 기능이 없는 중합효소(Takara, 일본), 중합효소 완충액, dATP, dTTP, dCTP, dGTP를 넣고 염 농도와 망간 양을 조절하여 변이 빈도를 조절하였다. Error prone PCR은 94℃에서 5분간 사전 예열, 91℃에서 1분간 이중 나선 분리, 55℃에서 1분간 프라이머 결합, 72℃에서 3분간 DNA 합성반응의 절차를 30회 반복하여 수행하였고, 마지막으로 72℃에서 5분간 DNA 합성 반응을 수행하였다. 정제된 PCR 산물과 파지미드 벡터인 pComb3x 벡터를 SfiI(New England Biolab, 영국) 제한 효소를 사용하여 절단 후 이를 라이게이션하고, ER2738 대장균에 형질전환한 다음 배양하였다.
scFv 시퀀싱 프라이머
1 ACA CTT TAT GCT TCC GGC 서열번호 16
2 CAA AAT CAC CGG AAC CAG AG 서열번호 17
Error prone PCR에 사용된 프라이머
실시예 5: 4-1H에 비하여 CD55에 대한 친화도가 개선된 클론의 선별
상기 실시예 4에서 제작한 라이브러리를 이용한 바이오패닝(biopanning)을 통하여 G4-1H 및 4-1H 보다 CD55에 대한 친화도가 개선된 클론을 선별하였다.
먼저, 마그네틱 비드(Invitrogen, 미국)에 재조합 인간 CD55(R&D Systems 2009-CD/CF, 미국) 2.5μg을 접합시켰다. 파아지 라이브러리와 마그네틱 비드에 접합된 CD55를 상온에서 2시간 동안 반응시킴으로써 CD55에 친화력을 가진 파아지를 결합시킨 후, 이를 4-1H 항체와 상온에서 30분 반응시켜 4-1H와 경쟁시켰다. 0.5% Tween 20(Amresco, 미국)이 포함된 완충용액으로 세척하고, 산성 용액을 이용하여 용출하였다. 용출된 파아지는 다음 라운드 패닝(panning)을 위해 대장균 ER2738에 감염시켜 밤새 배양하여 증식시켰다. 이러한 과정을 4차례 반복하며 바이오패닝을 진행하였다. 1차에서 1회, 2-3차에서 3회, 4차에서 5회 세척하여 패닝 횟수가 증가할수록 세척 횟수를 증가시켜 결합력이 높은 파아지를 축적하였다.
3차와 4차 바이오패닝 결과물의 플레이트로부터 선별된 192개의 클론을 96 딥웰(deep well) 플레이트에서 100μg/ml 카베니실린, 70μg/ml 가나마이신 및 VCSM13 헬퍼 파아지를 넣고 37℃에서 밤새 배양하여 항체가 발현된 파아지의 증식을 유도하였다. 상기에서 수득한 배양액을 원심분리를 통해 파아지를 포함한 배지 상등액을 얻어 재조합 인간 CD55(R&D Systems 2009-CD/CF, 미국)가 코팅되어 있는 ELISA 플레이트에 넣고 37에서 2시간 동안 배양하였으며, HRP가 접합되어 있는 항-M13 항체(Merck, 미국)를 이차항체로 이용하여 CD55에 결합하는 항체를 ELISA로 확인하였다. 대조군으로 4-1H 클론의 파아지를 사용하여, 이보다 결합력이 높은 5개의 클론을 선별하였다.
실시예 6: 선별된 클론의 완전 항체 전환 및 발현/정제
EP-1E, EP-1F, EP-9B, 3R-2-1H 및 EP-10H를 전장(full-length)의 완전 IgG 형태로 만들기 위한 클로닝을 진행하였다. 상기 EP-1E, EP-1F, EP-9B, 3R-2-1H 및 EP-10H은 하기 표 4의 CDR 서열을 가진다.
아미노산 서열번호
EP-1E
경쇄 가변영역		 SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGGGGSYGWFQQKPGQSPVTVIYWN N KRPSGIPERFSGSKSGNTATLTISGTQAMDEADYYCGGWDSSTYAIFGGGTKLTVL 18
EP-1E
중쇄 가변영역		 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDRGMAWVRQAPGKGLEWVSGISSSGRYTYYAPAVKGRATISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNA V AGGWHAAYIDAWGQGTTVTVSS 19
EP-1F
경쇄 가변영역		 SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGGGGSYGWYQQKPGQSPVTVIYWNDKRPSGIPERFSGSKSGNTATLTISGTQAMDEADYYCGGWDSSTYAIFGGGTKLTVL 4
EP-1F
중쇄 가변영역		 EVQLAESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDRGMAWVRQAPGKGLEWVSGISSSGRYTYYAPAVKGRATISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNA V AGGWHAAYIDAWGQGTTVTVSS 20
EP-9B
경쇄 가변영역		 SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGGGGSYGWYQQKPGQSPVTVIYWNDKRPSGIPERFSGSKSGNTATLTISGTQAMDEADYYCGGWDSSTYAIFGGGTKLTVL 4
EP-9B
중쇄 가변영역		 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDRGM V WVRQSPGKGLEWVSGISSSGRYTYYAPAVKGRATISRDNSKNTLYLQMNNLRAEDTAVYYCAKNA V AGGWHAAYIDAWGQGTTVTVSS 21
3R-2-1H
경쇄 가변영역		 SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGGGGSYGWYQQKPGQSPVTVIYWNDKRPSGIPERFSGSKSGNTATLTISGTQAMDEADYYCGGWDSSTYAIFGGGTKLTVL 4
3R-2-1H
중쇄 가변영역		 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVARGFTFSDRGMAWVRQAPGKGLEWVSGISSSGRYTYYAPAVKGRTTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNA V AGGWHAAYIDAWGQGTTVTVSS 22
EP-10H
경쇄 가변영역		 SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGGGGSYGWYQQKPGQSPVTVIYWNDKRPSGIPERFSGSKSGNTATLTISGTQAMDEADYYCGGWDSSTYAIFGGGTKLTVL 4
EP-10H
중쇄 가변영역		 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDRGMAWVRQAPGKGLEWVSGISSSGRYTYYAPAVKGRATISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNA V AGGWHAAYIDAWGQGTTVTVSS 19
선별된 클론의 경쇄 및 중쇄 가변영역의 아미노산 서열
상기 표에서 밑줄친 부분은 CDR 영역을, 볼드체는 G4-1H와 서로 다른 아미노산을 각각 나타낸다. 상기 실시예 5에서 선별된 항체인 EP-1E, EP-1F, EP-9B, 3R-2-1H 및 EP-10H는 scFv 형태이므로 이들을 완전항체로 전환하였으며, 완전항체 전환 및 발현/정제는 전술한 실시예 2와 동일한 방법으로 수행하였다.
프라이머 서열 서열번호
VL 정방향 GGT CTT TGT ATA CAT GTT GCT GTG GTT GTC TGG TGT TGA AGG AAG CTA CGA GCT GAC AC 11
역방향 CAA GCT CAC CGT CTT GCG GAC CGT GGC C 12
CK 정방향 CGG ACC GTG GCC GCC CCC TC 13
역방향 CGG GGC GAG TGC TAG TTC TAG AAC TA 14
LC 정방향 GGG AAT TCT AGA GGA TCG AAC CCT TTG CAA GCT TCG GCA CGA GCA GAC CAG CAT GGG CAT CAA GAT GGA GAC ACA TTC TCA GGT CTT TGT ATA CAT GTT G 15
역방향 CGG GGC GAG TGC TAG TTC TAG AAC TA 14
VH 정방향 CTT CCT GTC AGT AAC TAC AGG TGT CCA CTC CGA GGT CCA GCT GGT C 23
역방향 GTG ACC GTG TCC AGC GCC TCC ACC AAG GG 24
CH 정방향 GCC TCC ACC AAG GGC CC 8
역방향 TCC CCC GGC AAG TGA GCG GCC GCT CAC 9
HC 정방향 CAG AAT TCA CTC TAA CCA TGG AAT GGA GCT GGG TCT TTC TCT TCT TCC TGT CAG TAA CTA CAG 10
역방향 TCC CCC GGC AAG TGA GCG GCC GCT CAC 9
선별된 클론의 완전항체 클로닝에 사용된 프라이머
실시예 7: 선별하여 제작한 완전항체의 CD55에 대한 친화도 분석
상시 실시예 6에서 제작한 항체의 CD55에 대한 친화도를 간접 ELISA로 확인하였다. 간접 ELISA는 전술한 실시예 3과 동일한 방법으로 수행하였다.
ELISA 결과 실시예 6의 항체는 4-1H에 비하여 높은 CD55에 대한 친화도를 나타냈다(도 2). EP-1E, EP-1F, 3R-2-1H 및 EP-10H는 비슷한 친화도를 나타냈고, EP-9B는 4-1H 보다는 높지만 다른 항체보다 낮은 친화도를 나타냈다. 4-1H에 비하여 CD55에 대한 친화도가 높은 항체들은 각종 암 진단이나 약학적 치료 조성물 제조에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
실시예 8: 결합력 향상 핵심 부위의 아미노산 치환
표 4에 기재된 클론들은 모두 G4-1H에서 카밧 EU 넘버링 시스템에 따른 H100A위치의 G가 V로 치환되었다. 이 부분은 항체의 항원 결합에 중요한 HCDR3 영역에 포함된다. 본 발명자들은 이 부위를 결합력 향상을 위한 핵심 부위로 파악하였고 그 부위를 V 이외의 소수성 아미노산으로 치환하기 위해 클로닝을 진행하였다. H100A 위치만 G4-1H와 다른 EP-10H를 기본 백본으로 하여 제작한 10H(A), 10H(I), 10H(L), 10H(F) 및 10H(M)은 하기의 CDR 서열을 갖는다(표 6).
아미노산 서열번호
10H(A) 중쇄 가변영역 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDRGMAWVRQAPGKGLEWVSGISSSGRYTYYAPAVKGRATISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNAAAGGWHAAYIDAWGQGTTVTVSS 25
10H(I) 중쇄 가변영역 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDRGMAWVRQAPGKGLEWVSGISSSGRYTYYAPAVKGRATISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNAIAGGWHAAYIDAWGQGTTVTVSS 26
10H(L) 중쇄 가변영역 EVQLAESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDRGMAWVRQAPGKGLEWVSGISSSGRYTYYAPAVKGRATISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNALAGGWHAAYIDAWGQGTTVTVSS 27
10H(F) 중쇄 가변영역 EVQLAESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDRGMAWVRQAPGKGLEWVSGISSSGRYTYYAPAVKGRATISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNAFAGGWHAAYIDAWGQGTTVTVSS 28
10H(M) 중쇄 가변영역 EVQLAESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDRGMAWVRQAPGKGLEWVSGISSSGRYTYYAPAVKGRATISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNAMAGGWHAAYIDAWGQGTTVTVSS 29
동물세포 발현용 벡터인 pCMV 벡터(ThermoFisher Scientific, 미국)에 클로닝된 완전 IgG 형태인 EP-10H의 중쇄 가변영역 중 G4-1H와 다른 돌연변이가 일어난 중쇄의 상보성 결정 영역의 아미노산을 소수성 아미노산으로 치환하였다.
먼저 EP-10H의 중쇄 가변영역을 포함하는 pCMV 벡터로부터 표 4의 HC1, HC2 프라이머 조합을 이용하여 중쇄의 가변영역과 불변영역을 PCR을 통해 수득하였다. PCR을 통해 얻어진 중쇄 가변영역과 불변영역을 HC3 정방향 프라이머와 HC2 역방향 프라이머를 사용하여 overlap PCR 과정을 거쳐 VH-CH1-CH2-CH3 형태를 얻었다. 이렇게 얻은 중쇄는 EcoRI과 NotI(New England Biolab, 영국) 제한효소를 사용하여 절단하였으며 마찬가지로 동일한 제한효소로 처리된 동물세포 발현용 벡터인 pCMV 벡터(ThermoFisher Scientific, 미국)에 라이게이션하였다. 라이게이션이 완료된 플라스미드는 DH5α 대장균(New England Biolab, 영국)에 열충격을 가하여 형질전환을 한 후 대량 배양하여 플라스미드를 얻었다.
프라이머 서열 서열번호
HC1 정방향 CTT CCT GTC AGT AAC TAC AGG TGT CCA CTC CGA GGT CCA GCT GGT C 23
역방향 GTA CTA CTG CGC CAA G 30
HC2 정방향1 GTA CTA CTG CGC CAA GAA CGC CGC GGC CGG GGG GTG GCA CGC 31
정방향2 GTA CTA CTG CGC CAA GAA CGC CAT TGC CGG GGG GTG GCA CGC 32
정방향3 GTA CTA CTG CGC CAA GAA CGC CCT GGC CGG GGG GTG GCA CGC 33
정방향4 GTA CTA CTG CGC CAA GAA CGC CAT GGC CGG GGG GTG GCA CGC 34
정방향5 GTA CTA CTG CGC CAA GAA CGC CTT TGC CGG GGG GTG GCA CGC 35
역방향 TCC CCC GGC AAG TGA GCG GCC GCT CAC 9
HC3 정방향 CAG AAT TCA CTC TAA CCA TGG AAT GGA GCT GGG TCT TTC TCT TCT TCC TGT CAG TAA CTA CAG 10
역방향 TCC CCC GGC AAG TGA GCG GCC GCT CAC 9
결합력 향상 핵심부위의 아미노산 치환을 위해 사용한 프라이머
클로닝을 완료한 후, EP-10H 경쇄 플라스미드와 표 6의 중쇄 플라스미드를 이용한 완전항체의 발현/정제는 전술한 실시예 2와 동일한 방법으로 수행하였다.
실시예 9: 결합력 향상 핵심 부위를 치환하여 제작한 완전항체의 CD55에 대한 친화도 분석
상기 실시예 8에서 제작한 항체의 CD55에 대한 친화도를 간접 ELISA로 확인하였다. 간접 ELISA는 전술한 실시예 3과 동일한 방법으로 수행하였다.
ELISA 분석 결과 결합력 핵심부위를 소수성 아미노산으로 치환하여 제작한 항체는 4-1H에 비하여 높은 CD55에 대한 친화도를 나타냈다(도 3). 그러나 10H(A), 10H(I), 10H(L), 10H(F) 및 10H(M)는 EP-10H보다 낮은 친화도를 나타냈다. 이는 H100A 위치에서 G가 V로 치환되는 것이 결합력 향상에 가장 효율적인 결과를 나타냄을 의미한다.
실시예 10: CD55가 과발현된 약제 내성 암세포주에서 EP-10H의 치료 효과
실험예 10-1: 버킷 림프종 세포주 BJAB에서 리툭시맙과 EP-10H의 병용 효과
BJAB은 보체-저항성을 가지며, 이는 CD55의 발현에 기인한다(Golay, et al., Blood, 95(12):3900-8, 2000). 이러한 이유로 CDC(complement dependent cytotoxicity)가 주된 치료 기작인 리툭시맙에 대한 반응성이 낮다. B 세포 림프종 중 악성으로 알려진 버킷 림프종에 대한 리툭시맙의 치료효과 개선 가능성을 확인하기 위하여 버킷 림프종 세포주인 BJAB에서 EP-10H와의 병용을 통한 세포 사멸능을 확인하였다. 샘플 당 5x105개의 BJAB 세포에 리툭시맙을 20μg/ml, 그리고 병용 투여 효과 확인을 위하여 4-1H 또는 EP-10H와 리툭시맙을 각각 50μg/ml과 20 μg/ml 농도가 되도록 50% complement sera human(Sigma, 미국)이 첨가된 RPMI 배지로 희석하여 최종 100μl를 처리한 후, 37℃, 5% CO2 조건에서 1시간 동안 배양하였다. 그 후, FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit with 7-AAD(BioLegend, 미국)를 이용하여 FACS 분석 장비인 Attune NxT(ThermoFisher Scientific, 미국)로 사멸 세포를 확인하여 CDC를 관찰하였다(도 4). 종래 보고된 바와 같이 BJAB 세포는 리툭시맙에 대한 반응성이 낮았으나, 항 CD55 항체(4-1H 및 EP-10H)와 병용 투여시 그 효과가 증가되었으며, 증가된 효과의 폭은 리툭시맙과 4-1H를 조합한 경우에 비하여 리툭시맙과 EP-10H가 조합된 경우가 더 컸다. 이러한 결과는 CD55의 발현이 리툭시맙의 CDC 효과를 저해하는데, 항체를 이용하여 CD55를 억제할 경우 저해된 효과가 회복됨을 의미하며, 이러한 효과는 CD55에 대한 친화도가 더 우수한 EP-10H에 의하여 보다 현저하게 발휘됨을 보여준다.
실험예 10-2a: 리툭시맙 내성 세포주인 Ramos-RR에서 CD55의 발현 확인
Ramos는 리툭시맙 반응성 B 세포 림프종 세포주로 Ramos를 이용하여 제작한 리툭시맙 내성 세포주인 Ramos-RR에서 CD55 발현을 확인하기 위하여 하기와 같이 실험을 진행하였다.
샘플 당 5x105개의 Ramos 및 Ramos-RR을 10 μg/ml 농도의 EP-10H 단클론 항체가 포함되거나 포함되지 않은 PBS로 현탁하고, 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양액을 4,000 rpm에서 5분간 원심분리 후, PBS 100 μl로 세척하고 4,000 rpm에서 5분간 다시 원심분리 하였다. PBS를 이용하여 1:100의 비율로 희석한 Goat 항-human IgG 항체, Alexa Fluor 488 (ThermoFisher Scientific, 미국)을 세포에 처리하고 차광한 상태로 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 형광 염색된 세포를 PBS로 세척 후 PBS 400 μl로 현탁하고 FACS 분석 장비인 Attune NxT(ThermoFisher Scientific, 미국)를 이용하여 분석하고 그 결과를 도 5a에 나타내었다.
그 결과 Ramos에 비하여 Ramos-RR의 CD55 발현이 증가함을 확인할 수 있었다. 이는 리툭시맙의 약제 내성에 CD55가 관여함을 의미한다.
실험예 10-2b: 리툭시맙 내성 세포주인 Ramos-RR에 대한 리툭시맙과 EP-10H의 병용 효과
CD55가 과발현되어 리툭시맙에 대한 내성을 나타내는 Ramos-RR에서 실험예 10-1의 방법으로 리툭시맙과 EP-10H의 병용투여를 세포 사멸능을 확인하였다(도 5b). 리툭시맙은 Ramos에서 세포사멸을 유도한 반면, Ramos-RR에서는 세포사멸 유도 정도가 Ramos에 비하여 낮았다. 그러나 EP-10H와 4-1H의 병용은 Ramos-RR에서 세포사멸을 증가시켰으며, BJAB에서와 마찬가지로 EP-10H와의 병용이 4-1H와의 병용에 비하여 리툭시맙의 세포사멸능을 더욱 현저히 증가시켰다. 이러한 결과는 B 세포 림프종에서 원발암(BJAB 세포주는 원발암 세포주임) 뿐 아니라 기존의 치료법에 내성을 획득한 암종에서도 EP-10H가 치료 효과를 나타낼 수 있음을 보여준다.
실험예 10-3a: 이마티닙 내성 세포주인 K562-IR에서 CD55의 발현 확인
K562는 티로신 키나아제 억제제인 이마티닙(Imatinib)에 반응성을 가지는 백혈병 세포주이다. K562를 이용하여 제작한 이마티닙 내성 세포주인 K562-IR에서 CD55 발현을 실험예 10-2a과 동일한 방법으로 확인하였다. 그 결과 K562에 비하여 K562-IR의 CD55 발현이 증가함을 확인할 수 있었다(도 6a). 이는 이마티닙의 약제 내성에 CD55가 관여함을 의미한다.
실험예 10-3b: K562-IR 세포주에서 이마티닙과 EP-10H의 병용 효과 확인
K562와 CD55가 과발현되어 이마티닙에 대한 내성을 나타내는 K562-IR를 12 웰 세포배양 플레이트에 웰당 2 x 105개로 분주한 직후, 이마티닙을 2μM, 그리고 병용투여 효과를 확인하기 위해 이마티닙 2μM과 4-1H 또는 EP-10H를 각각 10μg/ml 농도가 되도록 RPMI 배지로 희석하여 최종 500μl를 처리하고 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 7-AAD와 FITC Annexin V Apoptosis 검출 킷을 이용하여 FACS 분석 장비인 Attune NxT로 사멸세포를 분석하였다(도 6b).
이마티닙은 K562 세포주에서 세포사멸을 유도한 반면 K562-IR에서는 효과를 나타내지 못하였으나, EP-10H 또는 4-1H와 병용투여하자 K562-IR에서 세포사멸을 유도하였다. 또한 EP-10H와 이마티닙의 병용이 4-1H와 이마티닙의 병용에 비하여 더 큰 세포사멸 효과를 나타냈다. 이러한 결과는 티로신 키나아제 억제제인 이마티닙의 내성의 원인이 CD55임을 실험예 10-3a의 결과와 더불어 입증하며, EP-10H를 이용한 CD55의 저해는 이마티닙의 내성을 극복하는 효과적인 전략임을 의미한다. 이마티닙은 백혈병 치료에 널리 사용되는 장기 복용 약물로서, 장기 복용에 따라 유도될 수 있는 약물의 내성 극복 전략이 절실히 필요하다. 이에, EP-10H를 이용한 이마티닙의 내성 극복 전략은 백혈병 치료에 매우 효과적일 것으로 기대된다.
실험예 10-4a: 게피티닙 내성 세포주인 PC9-GR에서 CD55의 발현 확인
PC9는 티로신 키나아제 억제제인 게피티닙(gefitinib)에 대한 반응성을 가지는 비소세포폐암(NSCLC) 세포주이다. PC9을 이용하여 제작한 게피티닙 내성세포주인 PC9-GR에서 CD55 발현을 실험예 10-2a의 방법으로 확인한 결과 PC9에 비하여 PC9-GR의 CD55 발현이 증가함을 확인할 수 있었다(도 7a). 이는 게피티닙의 약제 내성에 CD55가 관여함을 의미한다.
실험예 10-4b: PC9-GR에서 게피티닙과 EP-10H의 병용 효과 확인
NSCLC 세포주인 PC9과 CD55가 과발현되어 게피티닙에 대한 내성을 나타내는 PC9-GR을 12웰 세포배양 플레이트에 웰 당 1 x 105개로 분주한 후, 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 분주 24시간 뒤에 게피티닙을 5μg/ml, 그리고 병용투여 효과를 확인하기 위해 게피티닙 5μg/ml과 4-1H 또는 EP-10H를 각각 5μg/ml 농도가 되도록 RPMI 배지로 희석하여 최종 500μl를 처리한 후, 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 다시 배양하였다. 그 후, 7-AAD와 FITC Annexin V Apoptosis 검출 킷을 이용하여 FACS 분석 장비인 Attune NxT로 사멸세포를 분석하였다(도 7b).
게피티닙은 NSCLC 세포주인 PC9 세포주에서 세포사멸을 유도한 반면 PC9-GR에서는 효과를 나타내지 못하였으나, EP-10H 또는 4-1H와 게피티닙의 병용은 PC9-GR에서 세포사멸을 유도하였다. 또한 EP-10H와 게피티닙의 병용이 4-1H와 게피티닙의 병용에 비하여 더 큰 세포사멸 효과를 나타냈다. 이러한 결과는 표적항암제 중 티로신 키나아제 억제제인 게피티닙의 내성의 원인이 CD55임을 실험예 10-4a의 결과와 더불어 입증하며, EP-10H를 이용한 CD55의 저해는 게피티닙의 내성을 극복하는 효과적인 전략임을 의미한다. 게피티닙은 치료제가 많지 않은 NSCLC에 효과적인 약물로서, 치료제의 다른 옵션이 많지 않은 상황에서 약물의 내성이 나타나면 2차 약물의 선택이 어렵기 때문이 약물의 내성을 극복하는 전략이 절실히 필요하다. EP-10H를 이용한 게피티닙의 내성 극복 전략은 NSCLC 치료에 매우 효과적일 것으로 기대된다.
실시예 11: EP-10H를 이용한 이중항체 제작 및 효능 확인
실시예 10에서 EP-10H와 다양한 약물의 병용효과를 확인하였다. 실시예 10의 실험예 10-1, 2에서 확인한 리툭시맙과 병용효과 결과를 바탕으로, 서로 다른 항원을 타겟하는 두개의 항체를 병용하는 방법과 하나의 항체로 두개의 항원을 동시에 타겟할 수 있는 이중항체의 암세포 사멸능을 비교하기 위하여 리툭시맙과 EP-10H를 이용하여 CD20 x CD55 이중항체를 제작하였고, 이중항체의 암세포 사멸 능력을 병용투여와 비교하여 확인하였다.
실험예 11-1. 동물 세포 발현을 위한 이중항체 (CD20 X CD55) 클로닝
본 발명에서는 종래 보고된 CD20과 CD55를 동시에 타겟 하는 이중항체(Macor, et al., Leukemia, 29(2):406-14, 2014)와는 상이한 신규 이중항체를 개발하였으므로, 본 발명자들은 이중항체 형태에 따른 효능을 비교하기 위해 리툭시맙과 EP-10H의 유전자를 이용하여 CD20과 CD55를 동시에 타겟하는 이중항체를 클로닝하였다. 본 발명에서 제작된 이중항체는 SBU(SpecificBi-functionalUnit)라고 명명하였다(도 8).
SBU 형태의 CD20 X CD55 이중항체는 중쇄끼리의 원하지 않는 pair와 결합하는 것을 막기 위해 knob-into-hole 기법을 사용하였으며, 경쇄끼리의 잘못된 결합을 막기 위해서는 Gly과 Ser으로 구성된 링커를 사용하였다. CD55-scFv-knob (VL-linker20-VH-CH2-CH3)과 CD20-Fab-hole(VL-CK-linker40-VH-CH1-CH2-CH3) 형태로 각각 클로닝을 진행하였으며, CD55-scFv-knob의 경우에는 실시예 6에서 제작한 EP-10H를 주형으로 사용하고 표 8의 프라이머 조합을 이용하여 PCR을 수행하였다. 증폭된 유전체는 BssHII 와 XbaI(New England Biolab, 영국) 효소를 처리하였고, 마찬가지로 동일한 제한효소로 처리된 동물세포 발현용 벡터인 pMAZ 벡터에 라이게이션하였다. 라이게이션이 완료된 플라스미드는 DH5α competent cell(New England Biolab, 영국)에 열충격을 가하여 형질전환하였고, 확보한 콜로니를 대량 배양하여 플라스미드를 수득하였다.
CD20-Fab-hole(VL-CK-linker40-VH-CH1-CH2-CH3) 형태의 제작을 위해 Drug Data Bank에 공개된 리툭시맙 서열을 토대로 표 9의 프라이머 조합을 이용해서 PCR을 수행하였다. 증폭된 유전체는 BssHII와 XbaI 효소를 처리하였고, 마찬가지로 동일한 제한효소로 처리된 동물세포 발현용 벡터인 pMAZ 벡터에 라이게이션하였다. 라이게이션이 완료된 플라스미드는 DH5α competent cell(New England Biolab, 영국)에 열충격을 가하여 형질전환하였고, 확보한 콜로니를 대량 배양하여 플라스미드를 수득하여 서열 분석(표 10)을 완료하였다.
프라이머 서열 서열번호
VL 정방향 CAG CGC GCA CTC CAG CTA CGA GCT GAC ACA GCC 36
역방향 GAC CAA GCT CAC CGT CTT GGG CGG AGG CGG GAG TGG TGG TGG CGG TAG CGG TGG AGG AGG C 37
VH 정방향 GTG GAG GAG GCA GTG GAT CTG GCG GCT CTG AGG TCC AGC TGG TCG 38
역방향 GGC ACA ACC GTG ACC GTG TCC AGC GGC GGC TCA GAC AAA ACT CAC AC 39
CH 정방향 CGT GTC CAG CGG CGG CTC AGA CAA AAC TCA CAC ATG C 40
역방향 CTC TCC CTG TCC CCG GGT AAA TGA CTA GAA CTA 41
CD55-scFv-knob 클로닝에 사용된 프라이머
프라이머 서열 서열번호
VL-CK 정방향 CGC AGC GAG CGC GCA CTC CCA GAT TGT CCT GTC TCA GTC TCC TGC 42
역방향 CGG CCG CCG TGC GAG ATC TTT TGA TTT CCA GTT TAG TTC CGC CG 43
VH 정방향 CAA GTC CAA CTG CAA CAA CCG GG 44
역방향 GGA AGA CCG ATG GGC CCT TGA AGC TAG CGG CGG AAA CCG TTG TGC CAG AG 45
CH 정방향 GCA AGC TTC AAG GGC 46
역방향 CTC TCC CTG TCC CCG GGT AAA TGA CTA GAA CTA 41
CD20-Fab-hole 클로닝에 사용된 프라이머
CD55-
scFv-knob		 SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGGGGSYGWYQQKPGQSPVTVIYWNDKRPSGIPERFSGSKSGNTATLTISGTQAMDEADYYCGGWDSSTYAIFGGGTKLTVLGGGGSGGGGSGGGGSGSGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDRGMAWVRQAPGKGLEWVSGISSSGRYTYYAPAVKGRATISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNAVAGGWHAAYIDAWGQGTTVTVSSGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 서열번호
47
CD20-Fab-hole QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKRSRTAAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGSGGSGGGGSGGGGSGGGGSGSGSSQVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAASFKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 서열번호 48
SBU 형태의 CD55-scFv-knob과 CD20-Fab-hole의 가변영역 아미노산 서열
실험예 11-2. 동물세포에서 발현 및 정제
상기 실험예 11-1에서 제작한 DNA의 발현은 전술한 실시예 2와 동일한 방법으로 수행하였다. SBU 형태의 CD20 X CD55 이중항체는 서열번호 47, 48 각각의 플라스미드를 폴리에틸렌이민(PEI)(Polysciences, 미국)과 150 mM NaCl을 이용하여 HEK293F 세포(Invitrogen, 미국)에 형질도입하고 Freestyle 293 발현 배지(Invitrogen, 미국)에서 37℃의 온도, 8% CO2 및 55% 습도 조건으로 7일간 배양하였다. SBU와 유사한 형태의 이중항체가 보고가 되었으나(Moore, et al., A robust heterodimeric Fc platform engineered for efficient development of bispecific antibodies of multiple formats. Methods, 154:38-50), 상기 문헌에 개시된 이중항체의 경우 발현 시 3종의 DNA가 필요하다. 3종의 DNA가 필요한 종래의 이중 항체 제조방법과 달리, 본 발명의 SBU는 경쇄끼리의 잘못된 결합을 막기 위해 Gly과 Ser으로 구성된 링커를 사용함으로써 2종의 DNA로 이중항체 발현이 가능하다. 발현 세포 배양액을 4,000 rpm으로 10분간 원심분리한 후, 상등액을 취해 0.22μm 필터를 통해 여과하였다. 여과된 상등액은 4℃에서 KappaSelect(GE Healthcare, 미국) 레진 1 ml에 결합을 유도하였다. 결합된 레진은 10 cv(column volume)의 PBS 용액으로 세척 후, 100 mM glycine-HCl(pH 2.7) 용액을 사용하여 결합된 항체를 용출한 후, 1 M Tris-HCL (pH 9.0)으로 중화하였다. pH 7.2-7.4 PBS로 완충액 교환을 진행 후 SDS-PAGE를 통해 정제된 항체의 경쇄와 중쇄의 크기 및 순도를 확인하였고 그 결과 이론적 계산치와 일치하는 분자량과 높은 순도를 확인할 수 있었다(도 9). SBU 형태의 이중항체는 CD20 결합부위가 Fab이고 CD55 결합부위가 scFv인 헤테로 형태이다. Fab의 C kappa 부분을 이용하여 protein L로 정제를 하면 이중항체 정제 시 생성 가능성이 가장 높다고 알려진 knob-knob 호모다이머 또는 knob 모노머 (Giese, et al., Biotechnol Prog, 34(2)397-404)의 생성을 억제하고 원하는 형태인 헤테로다이머만 얻을 수 있다.
실험예 11-3. ELISA를 통한 이중항체의 결합력 확인
상시 실험예 11-2에서 제작한 CD20 X CD55 이중항체가 타겟하는 각각의 항원인 CD20 및 CD55에 대한 친화도를 간접 ELISA로 확인하였다. 간접 ELISA는 상기 실시예 3의 방법으로 수행하였으며, CD20와 CD55에 모두 우수한 결합력을 나타냈다 (도 10a 및 10b). 특히 SBU 형태의 CD20 X CD55 이중항체는 CD20에 대하여 Macor 가 저술한 선행 문헌에 개시된 형태의 CD20 X CD55 이중항체보다 높은 친화도를 나타냈고, CD55에 대하여 Macor가 저술한 선행 문헌에 개시된 형태인 CD20 X CD55 이중항체와 비슷한 친화도를 나타냈다. CD20이 과발현되는 혈액암 치료제로 사용 가능한 CD20 X CD55 이중항체는 CD20에 대한 친화도가 더 높은 SBU 형태의 CD20 X CD55 이중항체가 더 효과적일 것이다.
실험예 11-4. BJAB에서 CD20 X CD55 이중항체의 세포 사멸능 확인
상기 실험예 10-1의 방법으로 CD20 X CD55 이중항체의 세포사멸능을 확인하였다. 샘플 당 5x105개의 BJAB 세포에 리툭시맙을 20μg/ml, 병용투여 효과 확인을 위하여 EP-10H와 리툭시맙 각각 20μg/ml, 그리고 CD20 X CD55 이중항체 중 Macor가 저술한 선행 문헌에 개시된 형태와 SBU 형태를 각각 20μg/ml 농도로 20% complement sera human (Sigma, 미국)이 첨가된 RPMI 배지로 희석하여 최종 100μl를 처리하였다. 그 외는 실험예 10-1과 동일한 방법으로 수행하였다.
그 결과, 리툭시맙에 반응성이 낮은 BJAB 세포에서 CD20 X CD55 이중항체는 complement sera human만 처리한 control 대비 유의적인 차이의 세포사멸능을 나타냈으며, SBU는 특히 리툭시맙 대비 유의적인 차이의 세포사멸능을 나타냈다(도 11a 및 11b). 이러한 결과는 서로 다른 항원을 타겟하는 두개의 항체를 병용투여 하는 것에 비해 두 항원을 동시에 타겟할 수 있는 하나의 이중항체가 암세포에 대한 CDC 유도에 보다 효과적이며, 대표적인 CD20 X CD55 이중항체인 Macor 이중항체보다도 본 발명의 SBU가 암세포에 대한 CDC 유도에 보다 적합함을 의미한다. 또한 SBU 형태의 CD20 X CD55 이중항체는 B 세포 림프종 중 악성으로 알려진 버킷 림프종의 효과적인 치료제가 될 수 있다.
실험예 11-5. Ramos에서 CD20 X CD55 이중항체의 세포 사멸능 확인
상기 실험예 11-4의 방법으로 Ramos 세포주에서 CD20 X CD55 이중항체의 세포사멸능을 확인하였다(도 12a 및 12b). 그 결과, 리툭시맙 반응성 Ramos 세포에서 CD20 X CD55 이중항체는 리툭시맙 대비 유의적인 차이의 세포사멸능을 나타냈다. 또한 Macor의 이중항체보다 본 발명의 SBU가 우수한 세포사멸능을 나타냈다. 이러한 결과는 CD20 X CD55 이중항체는 리툭시맙 반응성 암종에서 리툭시맙 보다 효과적인 항암 효과를 나타낼 수 있으며, CD20이 발현된 혈액암에서 SBU는 CD20 X CD55 이중항체 중 효과적인 치료제로 적용될 수 있음을 의미한다.
실험예 11-6. Ramos-RR에서 CD20 X CD55 이중항체의 세포 사멸능 확인
상기 실험예 11-4의 방법으로 Ramos-RR 세포주에서 CD20 X CD55 이중항체의 세포사멸능을 확인하였다(도 13a 및 13b). 그 결과, 리툭시맙에 반응성을 나타내지 않는 Ramos-RR 세포에서 CD20 X CD55 이중항체는 리툭시맙 대비 유의적인 차이의 세포사멸능을 나타냈다. BJAB 세포주의 결과와 동일하게 이중항체 중에서도 Macor의 이중항체보다 본 발명의 SBU가 월등히 우수한 세포사멸능을 나타냈다. 이러한 결과는 SBU 형태의 CD20 X CD55 이중항체는 CD20이 발현된 혈액암 중에서 리툭시맙 내성을 나타내는 암종에 효과적인 치료제로 적용될 수 있음을 의미한다.
실험예 11-7. SBU 형태의 CD20 X CD55 이중항체의 CDC 활성화 분석
상기 실험예 11-5에서 Ramos-RR 세포 펠렛의 유세포 분석 전 리툭시맙과 SBU 형태의 CD20 X CD55 이중항체를 처리한 상등액을 취하여 CDC 활성화를 분석하였다(도 14). CDC 기작은 C1q가 항체와 결합을 하는 것을 매개로 일어나는 반응으로써, 그의 부산물인 C4d의 생산량을 토대로 전체 CDC 과정 중의 중간단계에서 활성화 분석이 가능하다. 각각의 상등액에서 C4d 생산량을 확인할 수 있는 ELISA kit (Quidel, 미국)를 통하여 분석하였을 때, SBU 형태의 CD20 X CD55 이중항체를 처리한 상등액에서 리툭시맙을 처리한 상등액에 비하여 많은 C4d가 생산되었고 그 차이는 유의적이었다. 이러한 결과는 SBU CD20 X CD55 이중항체의 우수한 세포 사멸능은 CDC 활성화 기작에 의한 것임을 분명히 보여준다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (21)

  1. 하기 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 HCDR1 영역; 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 가지는 HCDR2 영역; 및 하기 일반식 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 HCDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는, CD55에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    일반식 1
    D-R-G-M-X1;
    일반식 2
    N-A-X2-A-G-G-W-H-A-A-Y-I-D-A,
    상기 일반식 1에서 X1은 Ala 또는 Val이며, 상기 일반식 2에서 X2는 Val, Ala, Ile, Leu, Phe 및 Met로 구성된 군으로부터 선택된다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 X1은 Ala인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 X2는 Val인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 가지는 LCDR1 영역; 하기 일반식 3으로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 LCDR2 영역; 및 서열목록 제3서열의 아미노산 서열을 가지는 LCDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변영역을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    일반식 3
    W-N-X3-K-R-P-S,
    상기 일반식 3에서 X3는 Asn 또는 Asp이다.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 X3는 Asp인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 하기의 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역을 포함하는, CD55에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    a) 서열목록 제4서열의 경쇄 가변영역; 또는 상기 서열목록 제4서열의 경쇄 가변영역에서 32번째 아미노산 서열인 Y(Tyr)가 F(Phe)로 치환 및 48번째 아미노산 서열인 D(Asp)가 N(Asn)으로 치환으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 치환을 포함하는 경쇄 가변영역, 및
    b) 서열목록 제5서열의 중쇄 가변영역; 또는 상기 서열목록 제5서열의 중쇄 가변영역에서 5번째 아미노산 서열인 V(Val)가 A(Ala)로 치환, 23번째 아미노산 서열인 A(Ala)가 V(Val)로 치환, 25번째 아미노산 서열인 S(Ser)가 R(Arg)로 치환, 35번째 아미노산 서열인 A(Ala)가 V(Val)로 치환, 40번째 아미노산 서열인 A(Ala)가 S(Ser)로 치환, 68번째 아미노산 서열인 A(Ala)가 T(Thr)로 치환, 85번째 아미노산 서열인 S(Ser)가 N(Asn)로 치환 및 101번째 아미노산 서열인 G(Gly)가 V(Val), L(Leu), I(Ile), F(Phe), M(Met) 또는 A(Ala)로 치환으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 치환을 포함하는 중쇄 가변영역.
  7. 제 1 항 또는 제 6 항에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 scFv, Fab 단편, F(ab') 단편, F(ab')2 단편 또는 Fv 단편인 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산분자.
  9. 제 1 항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 조성물은 항-CD20 항체 및 티로신 키나아제 억제제로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 약리성분을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 항-CD20 항체는 리툭시맙(Rituximab)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제 10 항에 있어서, 상기 티로신 키나아제 억제제는 이마티닙(Imatinib) 및 게피티닙(gefitinib)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 억제제인 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제 9 항에 있어서, 상기 암은 CD55 양성인 암인 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 암의 진단용 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 암은 CD55 양성인 암인 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제 1 항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 CD55에 특이적으로 결합하는 항체의 항원 결합 단편 및 CD20에 특이적으로 결합하는 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 이중특이적 항체 또는 이의 기능적 단편.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 CD20에 특이적으로 결합하는 항체는 리툭시맙(Rituximab)인 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 또는 이의 기능적 단편.
  18. 제 16 항에 있어서 상기 CD55에 특이적으로 결합하는 항체의 항원 결합 단편은 scFv를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 또는 이의 기능적 단편.
  19. 제 16 항에 있어서 상기 CD55에 특이적으로 결합하는 항체의 항원 결합 단편은 VL-링커-VH-CH2-CH3 형태인 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 또는 이의 기능적 단편.
  20. 제 16 항에 있어서 상기 CD20에 특이적으로 결합하는 항체의 항원 결합 단편은 Fab를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 또는 이의 기능적 단편.
  21. 제 16 항에 있어서 상기 CD20에 특이적으로 결합하는 항체의 항원 결합 단편은 VL-CK-링커-VH-CH1-CH2-CH3 형태인 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체 또는 이의 기능적 단편.
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