WO2021246471A1 - 高難度配列の効率的ペプチド縮合法 - Google Patents

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WO2021246471A1
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peptide
compound
resin
fmoc
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浩太郎 岩崎
学 和田本
淳一 椎名
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中外製薬株式会社
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    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a peptide compound using a condensation reaction.
  • Patent Document 1 cyclization of peptides and N-alkylation of constituent amino acids, especially N-methylation, contribute to improvement of membrane permeability and metabolic stability (Non-Patent Documents 2 and 3), and intracellular. Findings and discussions on drug-like cyclic peptide structures, which are the key to migration and development of oral preparations, have been reported, and the importance of these structures in peptide drug discovery is increasing (Patent Document 1).
  • Peptide synthesis is achieved by elongating to the desired sequence by forming an amide bond. More specific methods include a liquid phase method and a solid phase method (Non-Patent Document 4).
  • the solid-phase method uses an atomic group linked to a polymer resin (resin for solid-phase synthesis) as a linker.
  • 3) Cleavage of peptide from resin for solid-phase synthesis (resin removal step), and consists of (Non-Patent Documents 5 and 6).
  • the solid-phase method is a two-layer reaction of a solid and a liquid, which comprises a step of contacting a solid solid-phase synthesis resin to which a target substance is bound with a liquid reaction solution in which a deprotection reaction and a reagent for a condensation reaction are dissolved. It is done in the system. Since the target peptide is bound to the solid-phase synthesis resin, only a cleaning operation of the solid-phase synthesis resin is incorporated between each step, and the solid-phase synthesis resin to which the target peptide is bound is excessive. Since it is possible to separate the reagent and impurities derived from the reagent, sequential elongation can be easily carried out.
  • Fmoc group and Boc group are widely used as the protecting group for the amino group at the N-terminal of the amino acid main chain used in the solid phase method.
  • resins for solid-phase synthesis are roughly classified by atomic groups that serve as linkers bonded to polymers used in the resins, and resins for solid-phase synthesis to which linker atomic groups containing trityl groups and benzyl groups are bonded are widely used. More specifically, CTC resin, Wang resin, SASRIN resin, Rink Amide resin and the like are typical.
  • the resin removal step is mainly carried out under acidic conditions, but the ease of resin removal is determined by the stability of the linker atomic group to acid.
  • the resin removal reaction of a peptide from a CTC resin capable of binding a peptide using a trityl group as a linker can also be carried out with a weakly acidic reagent.
  • strong acid conditions are applied to the resin removal reaction of the peptide from Wang resin, which can bind the peptide using a benzyl group as a linker (Non-Patent Document 6).
  • the amino group of the amino acid or the peptide and the carboxyl group of the amino acid in which the newly introduced N-terminal amino group is protected are dehydrated regardless of the solid phase method or the liquid phase method. It consists of repeating a condensation step of condensing and a deprotection step of removing the newly introduced protective group of the amino group at the N-terminal. If the condensation reaction is not achieved and / or the competition for side reactions accumulates in this repeating step, the peptide having the target sequence is defective or added with an amino acid, and the peptide has the target sequence. Yield and / or purity may decrease.
  • Non-Patent Document 6 there is a report that it is better to apply the same conditions again than to prolong the reaction as a countermeasure against the unachieved reaction of the condensation reaction.
  • the unreacted N-terminal amino group for which the desired condensation reaction has not been achieved is deleted by reacting with the newly introduced N-terminal amino group protected amino acid (also referred to as the amino acid in the following sequence).
  • the body may arise.
  • an acylating agent exemplified by acetic anhydride or benzoyl chloride is reacted in the presence of pyridine to generate an unreacted N-terminal amino group in which the desired condensation reaction has not been achieved. Capping with an acylating agent can prevent undesired sequence elongation (Non-Patent Document 6).
  • the peptide when CTC resin is used, the peptide can be de-resined under mild weak acid conditions.
  • peptides with protecting groups that are easily removed under acidic conditions can be selectively deresinized without deprotecting the protecting groups, and are protected by the desired protecting groups. It is useful for the production of the peptide (Non-Patent Document 7).
  • the peptide in the solid-phase synthesis of the peptide using the CTC resin, the peptide can be removed from the CTC resin under mild conditions.
  • Non-Patent Document 8 Gly, Pro, and Leu are exemplified as amino acids supported on CTC resin, and the stability of the amino acid-supported CTC resin during the condensation reaction with Fmoc-Gly-OH is shown for each of them. It is being investigated.
  • Non-Patent Document 9 the condensation conditions of DIC / K-Oxyma significantly improved the yield compared to DIC / Oxyma, and the partial sequence of myelin basic protein (MBP) was obtained with the same or higher purity. There is a report that it was given (Non-Patent Document 9).
  • the solid-phase peptide synthesis method using K-Oxyma is concerned about the increase in the epimerization rate at the time of scale-up and the decrease in purity in view of the lengthening of the reagent charging time associated with the scale-up.
  • TOTU is used as a DIC substitute reagent (Non-Patent Document 10), but since it requires a reaction under basic conditions, there is a possibility of epimerization. Furthermore, since TOTU is an expensive reagent, it causes an increase in manufacturing cost and is not preferable. Further, in this document, in addition to the decrease in yield due to premature cleavage, the case of decrease in purity due to the by-product of an overstretched product is also described. That is, when Gly-OCTC in which Gly was supported on a resin for solid-phase synthesis was used as a starting material and an extension reaction of Fmoc amino acid was carried out using DIC / HOBt, a by-product having the sequence of Gly-Gly-OCTC was produced. It is stated that it was obtained. It is considered that this by-product was obtained by deresinating the Gly residue carried on the CTC resin during the extension reaction of the second amino acid and condensing it with the unreacted Gly-OCTC.
  • Non-Patent Document 11 A method of using Oxyma as an additive for the amino acid condensation reaction is known. It has been described that when Oxyma is used as an additive, epimerization can be suppressed and the acylation rate is improved (Non-Patent Document 11).
  • Patent Documents 1, 2, 3, 4, 5, and 6, which will be described later, and Non-Patent Document 12 various condensing agents and additives are used in the production of peptides by a condensation reaction.
  • these documents do not describe the problems in the peptide condensation reaction, which are exemplified in the premium cleavage.
  • Patent Document 1 relates to a novel peptide cyclization method, a novel peptide, and a library containing them, which provides an effective drug discovery method for tough targets, which has been difficult in the past.
  • reagents are used in a specific ratio, but there is no description that the reaction conditions are set for the purpose of solving the problem peculiar to the condensation reaction of the peptide exemplified in the premium cleavage.
  • Patent Document 2 a solid-phase synthesis method for peptides using CTC resin is carried out.
  • the past production methods were affected by the atypical conformation associated with peptide chain elongation, which led to the progress of side reactions, and the improvement of the production method to solve this problem. Is only mentioned.
  • the amino acids that make up the peptide do not contain unnatural amino acids such as N-substituted amino acids, there are descriptions of defects such as the failure to reach the condensation reaction due to a special amino acid structure, and issues related to defects in the condensation reaction. There is no description to solve the problem.
  • Patent Document 3 solid-phase synthesis of a peptide using Rink's amide resin was previously subjected to a pretreatment step (also referred to as preactivation) for converting a C-terminal amino acid into an active ester, and then a pretreatment step was performed.
  • the method is to add a resin for solid phase synthesis to the reaction solution.
  • Patent Document 3 merely describes the production of a peptide having a specific sequence (AMG416 or a salt thereof), and is exemplified by a condensation reaction between amino acids having a large steric hindrance, which is an extension reaction of a low-reactivity amino acid. The improvement of is not disclosed.
  • Patent Document 4 describes the improvement of the de-Fmocification reaction. However, the problems peculiar to the condensation reaction of peptides exemplified by premium cleavage are not described. In addition, since the amino acids used in this document are excessively required, they are not suitable for producing peptides containing unnatural amino acids represented by N-substituted amino acids, which are difficult to obtain as compared with natural amino acids.
  • Patent Document 5 a gentle deresining process method that avoids damage to peptides containing N-substituted amino acids that are unstable to acid in solid-phase synthesis and a side chain functional group protecting group that is not removed in this deresinating step Is described.
  • the problems peculiar to the condensation reaction of peptides exemplified by premium cleavage are not described.
  • Patent Document 6 describes a method for treating a deprotecting agent in the deprotecting step of solid-phase synthesis.
  • the problems peculiar to the condensation reaction of peptides exemplified by premium cleavage are not described.
  • Non-Patent Document 12 describes a solid-phase method using an alternative solvent having high environmental friendliness without using DMF or DCM, which are generally used in the solid-phase method.
  • the condensation reaction of amino acids with large steric hindrance, such as N-substituted amino acids, ⁇ , ⁇ -di-substituted amino acids, or ⁇ -branched amino acids is not described.
  • the present inventors applied the condensation reaction conditions of the solid-phase method, which are widely used in conventional peptide synthesis, to the production of peptide compounds containing unnatural amino acids using CTC resin. Faced with the problems of significant yield and purity reduction. Such defects during the condensation reaction include not only the condensation reaction between natural ⁇ -amino acids described in Non-Patent Documents 8, 9 and 10, but also N-substituted amino acids and amino acids having a branch at the ⁇ position of the side chain ( ⁇ ). -It was found to be remarkable in the sequence, which is exemplified by (also called a branched amino acid), which has a large steric disorder and poor reactivity of the condensation reaction.
  • the present invention can suppress premature cleavage in the solid-phase synthesis method of peptides, especially in the step of condensation reaction, and can also suppress side reactions such as unreached reaction and competition for epimerization, and can be easily obtained.
  • the present inventors mainly condense a second amino acid with a first amino acid in which an N-substituted amino acid is carried on a solid-phase synthesis resin to obtain a two-residue peptide.
  • the obtained 1-residue + 1-residue synthesis was enthusiastically investigated.
  • DIC carbodiimide compound exemplified by DIC
  • Oxyma an N-hydroxy compound exemplified by Oxyma
  • the amino acids to be introduced, the condensing agent, and the additive are used. It is a general-purpose condition to use the same equality ratio.
  • a sequence in which the amidation reaction is difficult to proceed due to a large steric disorder specifically, an N-substituted amino acid, an ⁇ , ⁇ -di-substituted amino acid, a ⁇ -branched amino acid, or an amino acid having a bulky side chain is condensed.
  • an N-substituted amino acid, an ⁇ , ⁇ -di-substituted amino acid, a ⁇ -branched amino acid, or an amino acid having a bulky side chain is condensed.
  • the method of the present invention can produce a peptide compound having a target sequence in one aspect thereof. Furthermore, it has been found that the method of the present invention can carry out the desired condensation reaction in high yield in one aspect thereof. Furthermore, it has been found that the method of the present invention can suppress a side reaction exemplified by epimerization in one aspect thereof. Furthermore, it has been found that the method of the present invention can obtain the desired peptide compound in high yield and high purity because the amidation reaction proceeds at a sufficient conversion rate in one aspect thereof.
  • the additive is effective to change the molar ratio of the additive to the amino acid or peptide added to the N-terminus (ie, the second amino acid or peptide), especially the amino acid or peptide added to the N-terminus.
  • the N-terminus ie, the second amino acid or peptide
  • it is better to use less additives than peptides.
  • it is also effective to change the molar ratio of the condensing agent, and it is particularly good to use an excessive amount of the condensing agent for the amino acid or peptide added to the N-terminal.
  • changing the molar ratio of both the condensing agent and the additive is more effective.
  • the amidation reaction proceeds at a sufficient conversion rate not only in the condensation of an amino acid or peptide having a large steric disorder but also in the condensation reaction of an amino acid or peptide having a small steric disorder, and the yield and purity are high. It has been found that the desired peptide compound can be obtained.
  • the present invention includes the following in a specific non-limiting aspect.
  • a method for producing a peptide compound which comprises a step of condensing a first amino acid or peptide and a second amino acid or peptide in the presence of an additive and a condensing agent to obtain a condensate. The method described above, wherein the number of moles of the additive is less than the number of moles of the second amino acid or peptide.
  • the molar ratio of the additive to the second amino acid or peptide is 0.8 or less.
  • the molar ratio of the second amino acid or peptide to the first amino acid or peptide is 1 to 2, and the molar ratio of the additive to the second amino acid or peptide is 0.7 or less, [1] to [. 5]
  • the molar ratio of the second amino acid or peptide to the first amino acid or peptide (first molar ratio) is 2 or more, and the molar ratio of the additive to the second amino acid or peptide is the first.
  • P 11 is hydrogen or C 1 -C 6 alkyl
  • R 12 is hydrogen, CONR 12A R 12B , COOR 12c , C 1 -C 6 alkyl, C 3 -C 8 cycloalkyl, C 7 -C 14 aralkyl, 5-10 membered heteroaryl C 1- C 6 alkyl, protected 5-10 membered heteroaryl C 1 -C 6 alkyl, C 1 -C 6 hydroxyalkyl, protected C 1 -C 6 hydroxyalkyl, C 1 -C 6 carboxy Alkyl, Protected C 1- C 6 Carboxyalkyl, C 1 -C 6 Aminoalkyl, Protected C 1 -C 6 Aminoalkyl, C 1 -C 6 Alkthio C 1 -C 6 Alkyl, or P 11 and R 12 Formed a 4- to 7-membered saturated heterocycle with the nitrogen atom to which P 11 is bonded and the carbon atom to which R 12 is bonded.
  • Q 12 is hydrogen, or C 1- C 6 alkyl and R 12A and R 12B are independently C 1- C 4 alkyl, or R 12A and R 12B are nitrogen atoms to which they are attached. Together with form a 4- to 8-membered ring, which may contain one or more additional heteroatoms, L 11 is single bond or -CH 2-
  • R 13 means the bonding point with the resin for solid phase synthesis, and the first peptide.
  • R 13 means the binding point with the adjacent amino acid.
  • the first amino acid, or the N-terminal amino acid of the first peptide, and / or the C-terminal amino acid of the first peptide are MeAsp-pip, MeAsp-aze, MeAsp-pyrro, MeAsp-mor, MeAsp.
  • the second amino acid, or the C-terminal amino acid of the second peptide has an ⁇ , ⁇ -di-substituted amino acid, ⁇ -branched amino acid, N-alkyl amino acid, or other side chain having 2 or more carbon atoms.
  • R 23 means the binding point with the protective group of the amino group
  • the amino acid at the C-terminal of the second peptide is the amino acid of the formula (2A).
  • R 23 means a binding point with an adjacent amino acid.
  • ⁇ -branched amino acids are MeVal, D-MeVal, Val, Ile, MeIle, MeChg, Chg, MeGly (cPent), Gly (cPent), MeGly (cBu), Gly (cBu), MeGly (cPr), The method according to [30], which is Gly (cPr), MeThr (tBu), or Thr (tBu).
  • R 25 means a binding point with an adjacent amino acid.
  • ⁇ , ⁇ -di-substituted amino acids are Aib, (Me) Abu, (Me) Leu, (Me) Algly, (Me) Phe, (Me) Phe (3-I), 1-ACPrC, cVal, The method according to [32], which is cLeu, cHex, or Athpc. [34] The method according to any one of [1] to [33], wherein the second amino acid or the C-terminal amino acid of the second peptide is an N-alkyl amino acid.
  • N-alkyl amino acids are MeAsp-pip, MeAsp-aze, MeAsp-pyrro, MeAsp-mor, MeAsp-mor (26-bicyc), MeAsp-OtBu, D-3-MeAbu, bMeAla, MeGly, MeAla, MeLeu, MePhe, Aze (2), Pro, MeAsp-NMe2, MeVal, MeIle, MeChg, MeGly (cPent), MeGly (cBu), MeGly (cPr), MeThr (tBu), D-MeVal, MeTrp (Boc), The method according to [34], which is MeThr (Bzl), MeGlu (OtBu), MeLys (Boc), or MeMet.
  • a peptide compound containing a sequence having poor reactivity in a condensation reaction can be efficiently produced. Specifically, it is possible to improve the productivity including the improvement of the yield and the purity of the peptide compound. That is, in one aspect of the method of the present invention, not only the inhibitory effect of premature cleavage, but also a peptide compound containing an amino acid sequence in which the condensation reaction is not achieved when the conventional method is applied, and an amino acid sequence in which epimerization is antagonized. Since a peptide compound containing the above can also be produced, the yield and / or purity of the peptide compound can be improved.
  • side reactions can be minimized even if the condensation reaction is prolonged, and / or the amino acid or peptide added to the N-terminal is used in the minimum amount. Since the reaction can be completed, the amount used can be reduced. In the method of the present invention, the reaction is completed even if the amount of the reagent is reduced, so that it is not necessary to use an excessive amount of the reagent or to carry out double coupling in which the same conditions are repeated, unlike the conventional method. As a result, the amount of reagent can be minimized even when amino acids and peptides that are difficult to amidate are used. This is a particularly suitable method for the synthesis of peptide compounds containing expensive and rare unnatural amino acid residues.
  • the method of the present invention reduces the solvent at the time of condensation, has a large reaction promoting effect when the reaction is carried out at a high concentration, and can reduce the amount of amino acids used, as compared with the conventional method.
  • the amount of solvent required for cleaning the reagent after condensation can be reduced.
  • the present invention solves a problem peculiar to the condensation reaction of an amino acid or peptide carried on a trityl resin (for example, CTC resin) and an amino acid or peptide to be extended, which is exemplified by the condensation reaction of a peptide exemplified by premium cleavage.
  • a trityl resin for example, CTC resin
  • an amino acid or peptide to be extended which is exemplified by the condensation reaction of a peptide exemplified by premium cleavage.
  • the amino acid or peptide carried on the resin can be sufficiently consumed, the starting material can be efficiently converted into the target product.
  • MeAsp (OH) -pip is an amino acid having the following structure in which the Fmoc group is removed from Fmoc-MeAsp (OH) -pip in the table below.
  • the structure of the amino acid residue MeAsp-pip is also obvious to those skilled in the art.
  • halogen atom examples include F, Cl, Br or I.
  • alkyl is a monovalent group derived from an aliphatic hydrocarbon by removing one arbitrary hydrogen atom, and refers to a hetero atom (an atom other than carbon and a hydrogen atom) in the skeleton. ) Or unsaturated carbon-carbon bonds and have a subset of hydrocarbyl or hydrocarbon group structures containing hydrogen and carbon atoms.
  • Alkyl includes not only linear ones but also branched chain ones. Specifically, the alkyl is an alkyl having 1 to 20 carbon atoms (C 1 -C 20 , hereinafter "C p -C q " means that the number of carbon atoms is p to q).
  • C 1- C 10 alkyl more preferably C 1- C 6 alkyl.
  • alkyl specifically, methyl, ethyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl, s-butyl, t-butyl, isobutyl (2-methylpropyl), n-pentyl, s-pentyl (1-pentyl).
  • Methylbutyl t-pentyl (1,1-dimethylpropyl), neopentyl (2,2-dimethylpropyl), isopentyl (3-methylbutyl), 3-pentyl (1-ethylpropyl), 1,2-dimethylpropyl, 2 -Methylbutyl, n-hexyl, 1,1,2-trimethylpropyl, 1,2,2-trimethylpropyl, 1,1,2,2-tetramethylpropyl, 1,1-dimethylbutyl, 1,2-dimethylbutyl , 1,3-Dimethylbutyl, 2,2-dimethylbutyl, 2,3-dimethylbutyl, 3,3-dimethylbutyl, 1-ethylbutyl, 2-ethylbutyl and the like.
  • alkenyl is a monovalent group having at least one double bond (two adjacent SP 2 carbon atoms). Depending on the double bond and the arrangement of the substitutions (if any), the geometry of the double bond can be an entomen (E) or tuzanmen (Z), cis or trans arrangement.
  • Alkenyl includes not only linear ones but also branched chain ones. Examples of the alkenyl include C 2- C 10 alkenyl and more preferably C 2- C 6 alkenyl, and specific examples thereof include vinyl, allyl, 1-propenyl, 2-propenyl, 1-butenyl and 2-butenyl. (Including cis and trans), 3-butenyl, pentenyl, 3-methyl-2-butenyl, hexenyl and the like can be mentioned.
  • alkynyl is a monovalent group having at least one triple bond (two adjacent SP carbon atoms). Alkynes include not only linear ones but also branched chain ones.
  • the alkynyl is preferably C 2- C 10 alkynyl, more preferably C 2- C 6 alkynyl, and specifically, for example, ethynyl, 1-propynyl, propargyl, 3-butynyl, pentynyl, hexynyl, 3-phenyl.
  • cycloalkyl means a saturated or partially saturated cyclic monovalent aliphatic hydrocarbon group, and includes a monocyclic ring, a bicyclo ring, and a spiro ring.
  • Preferred examples of the cycloalkyl include C 3- C 8 cycloalkyl, and specific examples thereof include cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, bicyclo [2.2.1] heptyl, and spiro [. 3.3] Heptyl and the like.
  • aryl means a monovalent aromatic hydrocarbon ring, preferably C 6- C 10 aryl. Specific examples of the aryl include phenyl, naphthyl (eg, 1-naphthyl, 2-naphthyl) and the like.
  • heterocyclyl means a non-aromatic cyclic monovalent group containing 1 to 5 heteroatoms in addition to a carbon atom.
  • the heterocyclyl may have double and / or triple bonds in the ring, and the carbon atom in the ring may be oxidized to form a carbonyl, which may be a monocyclic or fused ring.
  • the number of atoms constituting the ring is preferably 4 to 10 (4 to 10-membered heterocyclyl), more preferably 4 to 7 (4 to 7-membered heterocyclyl).
  • heterocyclyl examples include azetidinyl, oxetanyl, dihydrofuryl, tetrahydrofuryl, dihydropyranyl, tetrahydropyranyl, tetrahydropyranyl, tetrahydropyrimidyl, morpholinyl, thiomorpholinyl, pyrrolidinyl, piperidinyl, piperazinyl, pyrazoridinyl, and imidazolinyl.
  • heteroaryl means an aromatic cyclic monovalent group containing 1 to 5 heteroatoms in addition to a carbon atom.
  • the ring may be a single ring, a fused ring with another ring, or may be partially saturated.
  • the number of atoms constituting the ring is preferably 5 to 10 (5 to 10-membered heteroaryl), and more preferably 5 to 7 (5 to 7-membered heteroaryl).
  • heteroaryl examples include frills, thienyl, pyrrolyl, imidazolyl, pyrazolyl, thiazolyl, isothiazolyl, oxazolyl, isooxazolyl, oxadiazolyl, thiadiazolyl, triazolyl, tetrazolyl, pyridyl, pyrimidyl, pyridadinyl, pyrazinyl, triazinyl, benzofuranyl, and benzothienyl.
  • alkoxy means an oxy group to which the "alkyl” of the above definition is bonded, and C 1- C 6 alkoxy is preferable. Specific examples of the alkoxy include methoxy, ethoxy, 1-propoxy, 2-propoxy, n-butoxy, i-butoxy, s-butoxy, t-butoxy, pentyloxy, 3-methylbutoxy and the like.
  • alkylthio means a thio group to which the "alkyl” as defined above is attached, preferably C 1- C 6 alkylthio.
  • Specific examples of the alkoxy include methylthio, ethylthio, 1-propylthio, 2-propylthio, n-butylthio, i-butylthio, s-butylthio, t-butylthio and the like.
  • amino means -NH 2 in a narrow sense and -NRR'in a broad sense, where R and R'are independent of hydrogen, alkyl, alkenyl, alkynyl, cyclo. Selected from alkyl, heterocyclyl, aryl, or heteroaryl, or R and R'form a ring together with the nitrogen atom to which they are attached.
  • Preferred aminos include -NH 2 , mono-C 1- C 6 alkyl aminos, di C 1- C 6 alkyl aminos, 4- to 8-membered cyclic aminos and the like.
  • acyl alkanoyl
  • alkyl preferably C 1- C 6 acyl, more preferably C 2 -C 4 Acyl is mentioned.
  • Specific examples of the acyl include formyl, acetyl, propionyl, butanoyl and the like.
  • cycloalkoxy means an oxy group to which the "cycloalkyl” as defined above is bound, and preferably C 3- C 8 cycloalkoxy. Specific examples of cycloalkoxy include cyclopropoxy, cyclobutoxy, cyclopentyloxy and the like.
  • alkylsulfonyl means a sulfonyl group to which the "alkyl” as defined above is attached, preferably C 1- C 6 alkyl sulfonyl. Specific examples of the alkyl sulfonyl include methyl sulfonyl and the like.
  • hydroxyalkyl means a group in which one or more hydrogens of the above-defined “alkyl” are substituted with hydroxyl groups, and C 1- C 6 hydroxyalkyl is preferable.
  • Specific examples of the hydroxyalkyl include hydroxymethyl, 1-hydroxyethyl, 2-hydroxyethyl, 2-hydroxy-2-methylpropyl, 5-hydroxypentyl and the like.
  • carboxyalkyl means one or more hydrogen-substituted groups of "alkyl” as defined above, preferably C 1- C 6 carboxyalkyl. Specific examples of the carboxyalkyl include carboxymethyl, 1-carboxyethyl, 2-carboxyethyl and the like.
  • protected carboxylalkyl means a group in which the carboxyl group contained in the above-defined “carboxyalkyl” is protected by an arbitrary protecting group.
  • a protective group for a carboxyl group a methyl group, an ethyl group, a t-Bu group, a benzyl group, a trityl group, a cumyl group, a methoxytrityl group, a 2- (trimethylsilyl) ethyl group, 2,2,2-trichloro Examples thereof include an ethyl group and an allyl group.
  • aminoalkyl means a group in which one or more hydrogens of the above-defined “alkyl” are substituted with the above-defined “amino", preferably C 1- C 6 aminoalkyl.
  • Specific examples of the aminoalkyl include 1-pyridylmethyl, 2- (1-piperidyl) ethyl, 3- (1-piperidyl) propyl, 4-aminobutyl and the like.
  • protected aminoalkyl means a group in which the amino group contained in the above-defined “aminoalkyl” is protected by an arbitrary protecting group.
  • amino-protecting groups include Fmoc, Boc, Cbz, Alloc, Teoc, trifluoroacetyl, pentafluoropropionyl, phthaloyl, tosyl, 2-nitrobenzenesulfonyl, 4-nitrobenzenesulfonyl, 2,4-dinitrobenzenesulfonyl. And so on.
  • haloalkyl means a group in which one or more hydrogens of "alkyl” as defined above are substituted with halogen, preferably C 1- C 6 haloalkyl, preferably C 1- C 6 fluoroalkyl. Is more preferable.
  • haloalkyl for example, difluoromethyl, trifluoromethyl, 2,2-difluoroethyl, 2,2,2-trifluoroethyl, 3,3-difluoropropyl, 4,4-difluorobutyl, 5,5 -For example, difluoropentyl.
  • alkoxyalkyl means a group in which one or more hydrogens of "alkyl” in the above definition are substituted with “alkoxy” in the above definition, and C 1 -C 6 alkoxy C 1- C. 6- alkyl is preferred, with C 1- C 6 alkoxy C 1- C 2 alkyl being more preferred.
  • Specific examples of alkoxyalkyl include methoxymethyl, ethoxymethyl, 1-propoxymethyl, 2-propoxymethyl, n-butoxymethyl, i-butoxymethyl, s-butoxymethyl, t-butoxymethyl, and pentyloxymethyl. Examples thereof include 3-methylbutoxymethyl, 1-methoxyethyl, 2-methoxyethyl and 2-ethoxyethyl.
  • alkylthioalkyl means a group in which one or more hydrogens of "alkyl” as defined above are substituted with “alkylthio” as defined above, C 1- C 6 alkylthio C 1- C. 6- alkyl is preferred, and C 1- C 6- alkylthio C 1- C 2 alkyl is more preferred.
  • alkylthioalkyl for example, methylthiomethyl, ethylthiomethyl, 1-propylthiomethyl, 2-propylthiomethyl, n-butylthiomethyl, i-butylthiomethyl, s-butylthiomethyl, t-butyl
  • alkylthioalkyl for example, methylthiomethyl, ethylthiomethyl, 1-propylthiomethyl, 2-propylthiomethyl, n-butylthiomethyl, i-butylthiomethyl, s-butylthiomethyl, t-butyl
  • alkylthioalkyl for example, methylthiomethyl, ethylthiomethyl, 1-propylthiomethyl, 2-propylthiomethyl, n-butylthiomethyl, i-butylthiomethyl, s-butylthiomethyl, t-butyl
  • examples thereof include thiomethyl, 1-methylthioeth
  • haloalkoxy means a group in which one or more hydrogens of "alkoxy” as defined above are substituted with halogen, and C 1- C 6 haloalkoxy is preferable.
  • Specific examples of the haloalkoxy include difluoromethoxy, trifluoromethoxy, 2,2-difluoroethoxy, 2,2,2-trifluoroethoxy and the like.
  • haloacyl means a group in which a carbonyl group is bonded to the "haloalkyl", preferably C 2- C 6 haloacyl, more preferably C 2- C 4 haloacyl.
  • haloacyl include trifluoroacetyl, trichloroacetyl, pentafluoropropionyl, 2,3,3,3-tetrafluoro-2- (trifluoromethyl) propionyl, 3,3,3-trifluoro-2-. (Trifluoromethyl) propionyl and the like are exemplified.
  • cycloalkylalkyl means a group in which one or more hydrogens of "alkyl” as defined above are substituted with “cycloalkyl” as defined above, C 3- C 8 cycloalkyl C. 1- C 6 alkyl is preferred, C 3 -C 6 cycloalkyl C 1 -C 2 alkyl is more preferred. Specific examples of the cycloalkylalkyl include cyclopropylmethyl, cyclobutylmethyl, cyclopentylmethyl, cyclohexylmethyl and the like.
  • cycloalkoxyalkyl means a group in which one or more hydrogens of "alkyl” as defined above are substituted with “cycloalkoxy” as defined above, and C 3- C 8 cycloalkoxy C.
  • 1- C 6 alkyl is preferred, and C 3 -C 6 cycloalkoxy C 1- C 2 alkyl is more preferred.
  • Specific examples of the cycloalkoxyalkyl include cyclopropoxymethyl and cyclobutoxymethyl.
  • alkylsulfonylalkyl means a group in which one or more hydrogens of "alkyl” as defined above are substituted with “alkylsulphonyl” as defined above, C 1- C 6 alkylsulfonylC. 1- C 6 alkyl is preferred, C 1 -C 6 alkyl sulfonyl C 1 -C 2 alkyl is more preferred. Specific examples of the alkylsulfonylalkyl include methylsulfonylmethyl and 2- (methylsulfonyl) ethyl.
  • aralkyl (arylalkyl) means a group in which at least one hydrogen atom of "alkyl” as defined above is substituted with "aryl” as defined above, preferably C 7- C 14 aralkyl. , C 7 -C 10 Aralkill is more preferred.
  • Specific examples of the aralkyl include benzyl, phenethyl, 3-phenylpropyl and the like.
  • heteroarylalkyl means a group in which at least one hydrogen atom of "alkyl” as defined above is substituted with “heteroaryl” as defined above, and a 5- to 10-membered heteroaryl C 1-.
  • C 6 alkyl is preferred, and 5-10 membered heteroaryl C 1- C 2 alkyl is more preferred.
  • Specific examples of the heteroarylalkyl include 3-thienylmethyl, 4-thiazolylmethyl, 2-pyridylmethyl, 3-pyridylmethyl, 4-pyridylmethyl, 2- (2-pyridyl) ethyl, and 2- (3-pyridyl).
  • protected heteroarylalkyl means a group in which one or more functional groups contained in the "heteroarylalkyl” as defined above, for example, an amino group is protected by any protecting group. do.
  • protecting group include Fmoc, Boc, Cbz, Alloc, Teoc, trifluoroacetyl, pentafluoropropionyl, phthaloyl, tosyl, 2-nitrobenzenesulfonyl, 4-nitrobenzenesulfonyl, 2,4-dinitrobenzenesulfonyl and the like. Be done.
  • the "carboxyl group protecting group” includes an alkyl ester type protecting group, a benzyl ester type protecting group, a substituted alkyl ester type protecting group and the like. Specifically, as a protective group for a carboxyl group, a methyl group, an ethyl group, a t-Bu group, a benzyl group, a trityl group, a cumyl group, a methoxytrityl group, a 2- (trimethylsilyl) ethyl group, 2,2,2-trichloro Examples thereof include an ethyl group and an allyl group.
  • amino group protecting group includes a carbamate type protecting group, an amide type protecting group, an imide type protecting group, a sulfonamide type protecting group and the like.
  • amino-protecting groups include Fmoc, Boc, Cbz, Alloc, Teoc, trifluoroacetyl, pentafluoropropionyl, phthaloyl, tosyl, 2-nitrobenzenesulfonyl, 4-nitrobenzenesulfonyl, 2,4-dinitrobenzenesulfonyl. Etc. are exemplified.
  • the "alicyclic ring” in the present specification means a non-aromatic hydrocarbon ring.
  • the alicyclic ring may have an unsaturated bond in the ring or may be a polycyclic ring having two or more rings. Further, the carbon atoms constituting the ring may be oxidized to form a carbonyl.
  • the alicyclic ring is preferably a 3- to 8-membered alicyclic ring, and specific examples thereof include a cyclopropane ring, a cyclobutane ring, a cyclopentane ring, a cyclohexane ring, a cycloheptane ring, a cyclooctane ring, and a bicyclo [. 2.2.1] Heptane ring and the like can be mentioned.
  • saturated heterocycle means a non-aromatic heterocycle containing 1 to 5 heteroatoms in addition to a carbon atom and no double or triple bonds in the ring. do.
  • the saturated heterocycle may be a monocyclic ring, or may form a fused ring with another ring, for example, an aromatic ring such as a benzene ring.
  • the saturated heterocycle preferably includes a 4- to 7-membered saturated heterocycle, and specific examples thereof include an azetidine ring, an oxazolidine ring, a tetrahydrofuran ring, a tetrahydropyran ring, a morpholine ring, a thiomorpholin ring, a pyrrolidine ring, and 4-oxo.
  • peptide refers to a peptide in which one or more natural and / or unnatural amino acids are linked by an amide bond and / or an ester bond.
  • the peptide is preferably a peptide containing 1 to 15 amino acid residues, and more preferably a peptide consisting of 5 to 12 amino acid residues.
  • the "peptide compound” in the present specification is not particularly limited as long as it is a peptide compound in which a natural amino acid and / or an unnatural amino acid is linked by an amide bond or an ester bond, but is preferably 5 to 30 residues, more preferably 8. It is a peptide compound having up to 15 residues, more preferably 9 to 13 residues.
  • the peptide compound synthesized in the present invention preferably contains at least 3 N-substituted amino acids in one peptide, and more preferably contains at least 5 or more N-substituted amino acids. These N-substituted amino acids may be present continuously or discontinuously in the peptide compound.
  • the peptide compound in the present invention may be linear or cyclic, and a cyclic peptide compound is preferable.
  • cyclic peptide compound in the present specification is a cyclic peptide compound that can be obtained by cyclizing the N-terminal side group and the C-terminal side group of the linear peptide compound. Cycling is carbon-nitrogen bond cyclization such as amide bond, carbon-oxygen bond cyclization such as ester bond or ether bond, carbon-sulfur cyclization such as thioether bond, carbon-carbon bond. It may be in any form, such as cyclization by cyclization by, or cyclization by construction of a heterocycle.
  • cyclization via a covalent bond such as an amide bond or a carbon-carbon bond is preferable, and cyclization via an amide bond between the carboxyl group of the side chain and the amino group of the N-terminal main chain is more preferable.
  • the positions of the carboxyl group, amino group and the like used for cyclization may be those on the main chain or those on the side chains, and are not particularly limited as long as they are in cyclizable positions.
  • Cyclication of a peptide compound means forming a cyclic moiety containing 4 or more amino acid residues.
  • the number of amino acids contained in the cyclic portion of the cyclic peptide compound in the present specification is not particularly limited, but 4 to 20 residues, 5 to 15 residues, and 6 to 13 residues are exemplified.
  • Methods for converting linear peptide compounds to cyclic peptide compounds include Comprehensive Organic Transformations, A Guide to Functional Group Preparations, 3rd Edition, (R. C. Larock), or March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and It can be carried out by performing an intramolecular bond-forming reaction by the method described in Structure, 7th Edition, (M.B. Smith, J.
  • the bond formation reaction used C (O) -N bonds formed from carboxylic acids and amines, COC bonds using oxygen atoms, C (O) -O bonds, C (S) -O bonds, and sulfur atoms.
  • C (O) -S bond, C (S) -S bond, CSSC bond, CSC bond, CS (O) -C bond, CS (O2) -C bond, CNC bond using nitrogen atom, C NC Examples thereof include a bond, an NC (O) -N bond, an NC (S) N bond, and a C (S) -N bond.
  • reaction such as Suzuki reaction, Heck reaction, Sonogashira reaction and the like, which are catalyzed by transition metals to form C-C bonds.
  • An oxidation reaction or a reduction reaction is exemplified as a functional group conversion reaction further carried out after the bond formation reaction. Specifically, a reaction of oxidizing a sulfur atom to a sulfoxide group or a sulfone group is exemplified. Further, among carbon-carbon bonds, a reduction reaction in which a triple bond or a double bond is reduced to a double bond or a single bond is exemplified.
  • a peptide bond forms a closed ring structure, but the side chains of the two amino acids, the side chain and the main chain, etc. form a covalent bond between the two amino acids. May be done.
  • one or more means one or two or more numbers.
  • the term means the number from one to the maximum number of substituents that group allows. Specific examples of "one or more” include 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, and / or larger numbers.
  • the "resin for solid phase synthesis” is not particularly limited as long as it can be used for the synthesis of peptide compounds by the solid phase method.
  • Specific examples of such a resin for solid phase synthesis include CTC resin, NovaSyn TGT resin (TGT resin), Wang resin, SASRIN resin, trityl chloride resin (Trt resin), and 4-methyltrityl chloride resin (Mtt).
  • Resin ), 4-methoxytrityl chloride resin (Mmt resin), etc., which can be removed under acidic conditions.
  • the resin can be appropriately selected according to the functional group of the amino acid used.
  • a carboxyl group main chain carboxyl group or side chain carboxyl group represented by Asp or Glu
  • a hydroxy group on the aromatic ring phenol group represented by Tyr
  • trityl chloride resin Trt resin
  • CTC resin 2-chlorotrityl chloride resin
  • an aliphatic hydroxy group fatty alcohol group typified by Ser or Thr
  • the resin is trityl chloride resin (Trt resin), 2-chlorotrityl chloride resin (CTC resin) or It is preferable to use 4-methyltrityl chloride resin (Mtt resin).
  • a resin may be described as a resin.
  • the type of polymer constituting the resin is also not particularly limited. In the case of a resin composed of polystyrene, either 100-200 mesh or 200-400 mesh may be used.
  • the cross-linking rate is also not particularly limited, but 1% DVB (divinylbenzene) cross-linking is preferable.
  • examples of the type of polymer constituting the resin include TentaGel (registered trademark) and ChemMatrix (registered trademark).
  • the substituent includes, for example, alkyl, alkoxy, fluoroalkyl, fluoroalkoxy, oxo, aminocarbonyl, alkylsulfonyl, alkyl.
  • substituents include sulfonylamino, cycloalkyl, aryl, heteroaryl, heterocyclyl, arylalkyl, heteroarylalkyl, halogen, nitro, amino, monoalkylamino, dialkylamino, cyano, carboxyl, alkoxycarbonyl, formyl and the like.
  • substituents may be added to each of these, and these substituents are also not limited, and any substitution including, for example, a halogen atom, an oxygen atom, a sulfur atom, a nitrogen atom, a boron atom, a silicon atom, or a phosphorus atom.
  • a halogen atom an oxygen atom, a sulfur atom, a nitrogen atom, a boron atom, a silicon atom, or a phosphorus atom.
  • One or two or more may be freely selected independently from the group. That is, examples thereof include alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, aralkyl, cycloalkyl, etc., which may be substituted.
  • the compounds described herein can be salts thereof or solvates thereof.
  • Salts of the compounds include, for example, hydrochloride; hydrobromide; hydroiodide; phosphate; phosphonate; sulfate; methanesulfonate, p-toluenesulfonate and other sulfonates.
  • Carborates such as acetate, citrate, malate, tartrate, succinate, salicylate; or alkali metal salts such as sodium and potassium salts; alkaline earth such as magnesium and calcium salts Metallic salts; include ammonium salts such as ammonium salts, alkylammonium salts, dialkylammonium salts, trialkylammonium salts, tetraalkylammonium salts and the like. These salts are produced, for example, by contacting the compound with an acid or base.
  • the solvate of a compound is a phenomenon in which a solute molecule attracts a solvent molecule in a solution to form one molecular group, and if the solvent is water, it is called a hydrate.
  • the compounds described herein are solvents with an organic solvent such as alcohol (eg, methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, etc.), dimethylformamide, or diglyme, or a single solvent selected from water and the like. It may be a Japanese product or a solvent product with a plurality of solvents.
  • amino acid in the present specification includes natural amino acids and unnatural amino acids (sometimes referred to as amino acid derivatives). Further, in the present specification, “amino acid” may mean an amino acid residue.
  • amino acid means Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, His, Glu, Asp, Gln, Asn, Cys, Met, Lys, Arg, Pro. Point to.
  • the unnatural amino acid is not particularly limited, and examples thereof include ⁇ -amino acids, D-type amino acids, N-substituted amino acids, ⁇ , ⁇ -di-substituted amino acids, amino acids having different side chains from natural amino acids, and hydroxycarboxylic acids. .. As the amino acids in the present specification, any configuration is allowed.
  • the selection of the side chain of the amino acid is not particularly limited, but in addition to the hydrogen atom, for example, an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, an aryl group, a heteroaryl group, an aralkyl group, a heteroaralkyl group, a cycloalkyl group, or a spiro bond. It is freely selected from the cycloalkyl groups. Substituents may be added to each, and these substituents are not limited, and any substituent including, for example, a halogen atom, an O atom, an S atom, an N atom, a B atom, a Si atom, or a P atom.
  • One or two or more may be freely selected independently from the above. That is, an alkyl group, an alkoxy group, an alkoxyalkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, an aryl group, a heteroaryl group, an aralkyl group, a cycloalkyl group, etc., which may be substituted, or an oxo, aminocarbonyl, a halogen atom, etc. Illustrated.
  • the amino acid herein may be a compound having a carboxyl group and an amino group in the same molecule (even in this case, imino acids such as proline and hydroxyproline are also amino acids. included).
  • halogen-derived substituent examples include fluoro (-F), chloro (-Cl), bromo (-Br), and iodine (-I).
  • oxy examples include alkoxy, cycloalkoxy, alkenyloxy, alkynyloxy, aryloxy, heteroaryloxy, aralkyloxy and the like.
  • Examples of carbonyloxy include alkylcarbonyloxy, cycloalkylcarbonyloxy, alkenylcarbonyloxy, alkynylcarbonyloxy, arylcarbonyloxy, heteroarylcarbonyloxy, aralkylcarbonyloxy and the like.
  • Examples of carbonylthio include alkylcarbonylthio, cycloalkylcarbonylthio, alkenylcarbonylthio, alkynylcarbonylthio, arylcarbonylthio, heteroarylcarbonylthio, aralkylcarbonylthio and the like.
  • Examples of carbonylamino include alkylcarbonylamino, cycloalkylcarbonylamino, alkenylcarbonylamino, alkynylcarbonylamino, arylcarbonylamino, heteroarylcarbonylamino, aralkylcarbonylamino and the like.
  • sulfonylamino examples include alkylsulfonylamino, cycloalkylsulfonylamino, alkenylsulfonylamino, alkynylsulfonylamino, arylsulfonylamino, heteroarylsulfonylamino, aralkylsulfonylamino and the like.
  • aminosulfonyl examples include alkylaminosulfonyl, cycloalkylaminosulfonyl, alkenylaminosulfonyl, alkynylaminosulfonyl, arylaminosulfonyl, heteroarylaminosulfonyl, aralkylaminosulfonyl and the like.
  • groups in which the H atom bonded to the N atom in -SO 2- NHR is further substituted with alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, and aralkyl can be mentioned.
  • sulfamoylamino examples include alkylsulfamoylamino, cycloalkylsulfamoylamino, alkenyl sulfamoylamino, alkynylsulfamoylamino, arylsulfamoylamino, hetero.
  • Aryl sulfamoyl amino, aralkyl sulfamoyl amino and the like can be mentioned.
  • the two H atoms bonded to the N atom in -NH-SO 2- NHR are substituents independently selected from the group consisting of alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, and aralkyl. It may be substituted, and these two substituents may form a ring.
  • thio As an example of thio (-S-R), it is selected from among alkylthio, cycloalkylthio, alkenylthio, alkynylthio, arylthio, heteroarylthio, aralkylthio and the like.
  • sulfinyl examples include alkylsulfinyl, cycloalkylsulfinyl, alkenylsulfinyl, alkynylsulfinyl, arylsulfinyl, heteroarylsulfinyl, aralkylsulfinyl and the like.
  • sulfonyls examples include alkylsulfonyls, cycloalkylsulfonyls, alkenylsulfonyls, alkynylsulfonyls, arylsulfonyls, heteroarylsulfonyls, aralkylsulfonyls and the like.
  • secondary amino examples include alkylamino, cycloalkylamino, alkenylamino, alkynylamino, arylamino, heteroarylamino, aralkylamino and the like.
  • tertiary aminos are independently selected from alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, aralkyl, etc., such as alkyl (aralkyl) amino.
  • Amino groups having any two substituents may be mentioned, and these any two substituents may form a ring.
  • the three substituents R, R', and R'' on the N atom are alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl. , Heteroaryl, groups independently selected from aralkyl, for example, alkyl (aralkyl) (aryl) amidino and the like.
  • substituted guanidinos include R, R', R', and R''' as alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl. , Aryl, Heteroaryl, and groups independently selected from alkynes, or groups in which these groups form a ring, and the like can be mentioned.
  • aminocarbonylamino examples include R, R', and R'' of hydrogen atom, alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, aralkyl. Examples thereof include groups independently selected from the above, or groups forming a ring.
  • substituent derived from the B atom examples include boron (-BR (R')) and dioxyboryl (-B (OR) (OR')). These two substituents R and R'are independently selected from alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, aralkyl, etc., or they may form a ring. .. Specific examples thereof include a cyclic boryl group, and more specific examples thereof include a pinacholate boryl group, a neopentane diolat boryl group, and a catecholate boryl group.
  • substituent on the nitrogen atom of the N-substituted amino acid in the present specification include alkyl, C 1- C 6 alkyl, C 1 -C 4 alkyl, methyl, C 7- C 14 aralkyl, benzyl, and phenethyl. Illustrated.
  • the main chain amino group of an amino acid may be unsubstituted (-NH 2 ) or substituted (ie, -NHR, where R may have a substituent, alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl. , Heteroaryl, aralkyl, cycloalkyl, and a carbon chain bonded to an N atom such as proline and a carbon atom at the ⁇ -position may form a ring).
  • Amino acids in which such a main chain amino group is substituted may be referred to as "N-substituted amino acids" in the present specification.
  • N-substituted amino acid in the present specification, N-alkyl amino acid, NC 1- C 6 alkyl amino acid, NC 1 -C 4 alkyl amino acid, N-methyl amino acid, NC 7 -C 14 aralkyl amino acid, N- Examples thereof include, but are not limited to, benzyl amino acid and N-phenethyl amino acid.
  • amino acid includes all isotopes corresponding to each.
  • An isotope of an “amino acid” is one in which at least one atom is replaced by an atom having the same atomic number (number of protons) but a different mass number (sum of the numbers of protons and neutrons).
  • isotopes included in the "amino acids" of the present specification include hydrogen atom, carbon atom, nitrogen atom, oxygen atom, phosphorus atom, sulfur atom, fluorine atom, chlorine atom, etc., respectively, 2 H, 3 Includes H, 13 C, 14 C, 15 N, 17 O, 18 O, 32 P, 35 S, 18 F, 36 Cl, etc.
  • the term "about”, when used in combination with a numerical value, means a value range of + 10% and -10% of the numerical value.
  • the meaning of the terms “and / or” includes any combination of “and” and “or” as appropriate. Specifically, for example, “A, B, and / or C” includes the following seven variations; (i) A, (ii) B, (iii) C, (iv) A and B, (v) A and C, (vi) B and C, (vii) A, B, and C.
  • the present invention is a method for producing a peptide compound, which comprises a step of condensing a first amino acid or peptide and a second amino acid or peptide in the presence of an additive and a condensing agent to obtain a condensate.
  • the peptide compound obtained by the production method of the present invention may be an intermediate or a final product of an amino acid or peptide extension step by a solid phase method or a liquid phase method.
  • the extension step can be performed a plurality of times depending on the length of the amino acid sequence of the desired peptide compound, and the condensation step according to the present invention is included at least once in the extension step and may be included a plurality of times.
  • a method known in the present technology can be used for the condensation step other than the condensation step according to the present invention.
  • the condensate obtained by the condensation step of the present invention can be a peptide compound having a desired sequence.
  • the condensate obtained by the condensation step of the present invention has a partial structure of the peptide compound. Included in it.
  • the "first amino acid” may be a natural amino acid or an unnatural amino acid.
  • the "first peptide" may be composed of only natural amino acids, only unnatural amino acids, or any combination of natural and unnatural amino acids.
  • the first amino acid or first peptide is preferably an amino acid, more preferably an unnatural amino acid.
  • the first amino acid or first peptide may be an amino acid or peptide in which the backbone amino group is not protected.
  • the unprotected backbone amino group is preferably at the N-terminus of the first amino acid or first peptide.
  • the first amino acid or the C-terminal amino acid of the first peptide is supported on a solid-phase synthesis resin (resin).
  • a solid-phase synthesis resin resin
  • the N-terminal and / or C-terminal amino acids of the first amino acid or the first peptide are unnatural amino acids, especially N-substituted amino acids such as N-alkyl amino acids, due to the premature cleavage, the conventional method.
  • the desired condensation reaction may not proceed sufficiently. This is remarkable when a trityl-based atomic group is used as a resin linker that binds a resin for solid-phase synthesis to an amino acid. Even in such a case, the condensation reaction can be efficiently promoted by using the method of the present invention.
  • the N-alkyl amino acid when the N-terminal and / or C-terminal amino acid of the first amino acid or the first peptide is an N-alkyl amino acid, the N-alkyl amino acid may have a side chain different from that of a natural amino acid. Examples thereof include ⁇ , ⁇ , ⁇ amino acids, and N-alkyl ⁇ amino acids are preferably exemplified.
  • N-terminal amino acid of the first amino acid or the first peptide and / or the C-terminal amino acid of the first peptide include those having the following formula (1).
  • R 11 is hydrogen.
  • R 11 means a binding point with an adjacent amino acid, and the amino acid of the formula (1) is usually the relevant amino acid. Form an amide bond with an adjacent amino acid at the site.
  • P 11 is hydrogen or C 1 -C 6 alkyl
  • R 12 is hydrogen, CONR 12A R 12B , COOR 12c , C 1 -C 6 alkyl, C 3 -C 8 Cycloalkyl, C 7- C 14 aralkyl, 5-10 membered heteroaryl C 1- C 6 alkyl, protected 5-10 membered heteroaryl C 1 -C 6 alkyl, C 1 -C 6 hydroxyalkyl, protected C 1 -C 6 Hydroxyalkyl, C 1- C 6 Carboxyalkyl, Protected C 1 -C 6 Carboxyalkyl, C 1 -C 6 Aminoalkyl, Protected C 1 -C 6 Aminoalkyl, C 1 -C 6 Alkthio C 1 -C 6 Alkyl Is.
  • R 12 is CONR 12A R 12B , then R 12A and R 12B are independently C 1- C 4 alkyl (preferably methyl, ethyl), or R 12A and R 12B are bound to them.
  • a 4- to 8-membered ring preferably a piperidine ring, an azetidine ring, a pyrrolidine ring, a morpholine ring, or 3- Oxa-8-azabicyclo [3.2.1] octane ring is formed.
  • R 12 is COOR 12C , then R 12C is allyl, t-butyl, or benzyl.
  • R 12 is C 1- C 6 alkyl, then R 12 is preferably methyl, isopropyl, or isobutyl.
  • R 12 is C 3- C 8 cycloalkyl, then R 12 is preferably cyclopentyl, or cyclohexyl.
  • R 12 is C 7- C 14 aralkyl, then R 12 is preferably benzyl or phenethyl.
  • R 12 is a 5- to 10-membered heteroaryl C 1- C 6 alkyl, preferably R 12 is a 5- to 10-membered heteroarylmethyl or a 5- to 10-membered heteroarylethyl. Further, when R 12 is a protected 5- to 10-membered heteroaryl C 1- C 6 alkyl, it is preferable that R 12 has a functional group contained in the above-mentioned group, for example, an amino group protected by a Boc group. ..
  • R 12 is C 1- C 6 hydroxyalkyl
  • R 12 is preferably hydroxymethyl, 1-hydroxyethyl, 2-hydroxyethyl, more preferably 1-hydroxyethyl.
  • R 12 is a protected C 1 -C 6 hydroxyalkyl
  • R 12 is a protecting group of the group described above is a hydroxyl group, for example, preferably those that are protected by the Bzl group and tBu group.
  • R 12 is C 1- C 6 carboxyalkyl
  • R 12 is preferably carboxymethyl, 1-carboxyethyl, 2-carboxyethyl, more preferably 2-carboxyethyl.
  • R 12 is a protecting group of the group is a carboxyl group described above, for example, preferably those that are protected by the Bzl group and tBu group.
  • R 12 is C 1- C 6 aminoalkyl
  • R 12 is preferably 4-aminobutyl.
  • R 12 is preferably one in which the above-mentioned group is protected by an amino protecting group, for example, a Boc group.
  • R 12 is C 1- C 6 alkylthio C 1- C 6 alkyl, then R 12 is preferably 2-methylthioethyl.
  • P 11 and R 12 combine with the nitrogen atom to which P 11 is attached and the carbon atom to which R 12 is attached to form a 4- to 7-membered saturated heterocycle.
  • a 4- to 7-membered saturated heterocycle an azetidine ring, a pyrrolidine ring, a piperidine ring, a piperazine ring, and a morpholine ring are preferable.
  • Q 12 is hydrogen, or C 1- C 6 alkyl, preferably hydrogen or methyl.
  • L 11 is a single bond or -CH 2- .
  • R 13 means the binding point with the resin for solid phase synthesis.
  • R 13 means the binding point with the adjacent amino acid, and the amino acid of the formula (1) is usually used as the amino acid. It forms an amide bond with an adjacent amino acid at the site.
  • N-terminal and / or C-terminal amino acids of the first amino acid or the first peptide for example, MeAsp-pip, MeAsp-aze, MeAsp-pyrro, MeAsp-mor, MeAsp-mor (26- bicyc), MeAsp-OtBu, MeAsp-NMe2, MeVal, MeGly, MeAla, MeLeu, D-3-MeAbu, bMeAla, MeIle, MeGly (cPent), MeChg, MePhe, MeTrp (Boc), MeThr (Bzl), MeGlu ( OtBu), MeLys (Boc), MeMet, Aze (2), Aib, etc.
  • the first amino acid or peptide is solid-phased at a high carrying amount (for example, 0.5 mmol / g or more based on the Fmoc quantification method) so that the peptide may be shed from the resin by the conventional method. Even when it is supported on a synthetic resin, a condensate can be obtained while maintaining the amount of support. Therefore, in the method of the present invention, the amount of the first amino acid or peptide supported on the resin for solid phase synthesis is an arbitrary amount, for example, 0.2 mmol / g or more and 0.8 mmol / g or less based on the Fmoc quantification method. It can be used, and the reaction can be efficiently advanced even with a high loading amount of 0.3 mmol / g or more, and further 0.5 mmol / g or more.
  • a high carrying amount for example, 0.5 mmol / g or more based on the Fmoc quantification method
  • the "second amino acid” may be a natural amino acid or an unnatural amino acid.
  • the second amino acid or peptide may be an amino acid or peptide in which the backbone carboxyl group is not protected.
  • the unprotected backbone carboxyl group is preferably located at the C-terminus of the second amino acid or peptide.
  • the "second peptide" may be composed of only natural amino acids, only unnatural amino acids, or any combination of natural and unnatural amino acids.
  • the C-terminal amino acid of the second amino acid or second peptide is an unnatural amino acid, particularly an N-substituted amino acid such as an N-alkyl amino acid, or an amino acid having two or more carbon atoms in its side chain (eg,).
  • an N-substituted amino acid such as an N-alkyl amino acid
  • an amino acid having two or more carbon atoms in its side chain eg, the condensation reaction may not proceed sufficiently by the conventional method. Even in such a case, efficient condensation is possible by using the method of the present invention.
  • the amino group of the second amino acid or peptide is preferably protected by a protecting group.
  • a protecting group include those described above as "protecting groups for amino groups", and specific examples thereof include protecting groups having an Fmoc skeleton, Cbz, Boc, Teoc, and Alloc.
  • the "protecting group having an Fmoc skeleton” means a Fmoc group or a group in which an arbitrary substituent is introduced at an arbitrary position in the constituent skeleton of the Fmoc group.
  • Specific examples of the protecting group having such an Fmoc skeleton include a protecting group represented by the following formula.
  • R 1 to R 8 are independently selected from the group consisting of hydrogen, C 1- C 8 alkyl, C 1 -C 8 fluoroalkyl, halogen, sulfo, and trimethylsilyl.
  • R 9 to R 10 are independently hydrogen or methyl).
  • a protective group having an Fmoc skeleton for example, a 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) group, a 2,7-di-tert-butyl-Fmoc (Fmoc (2,7tb)) group, 1 -Methyl-Fmoc (Fmoc (1Me)) group, 2-fluoro-Fmoc (Fmoc (2F)) group, 2,7-dibromo-Fmoc (Fmoc (2,7Br)) group, 2-monoisooctyl-Fmoc ( mio-Fmoc) group, 2,7-diisooctyl-Fmoc (dio-Fmoc) group, 2,7- (3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8) -Tridecafluorooctyl) -Fmoc (tdf-Fmoc) group, 2,7-
  • amino acid at the C-terminal of the second amino acid or the second peptide is a ⁇ -branched amino acid
  • specific examples of the ⁇ -branched amino acid include those having the following formula (2A).
  • formula (2A) is hydrogen or C 1 -C 6 alkyl. If P 21 is C 1- C 6 alkyl, it is preferably methyl.
  • R 21 and R 22 are independently C 1- C 4 alkyl, C 1 -C 6 alkoxy, or C 1 -C 6 alkoxy C 1 -C 6 alkyl, respectively. , R 21 and R 22 together with the carbon to which they bind form a 3- to 8-membered alicyclic ring. If R 21 and R 22 are C 1- C 4 alkyl, C 1 -C 6 alkoxy, or C 1 -C 6 alkoxy C 1 -C 6 alkyl, then R 21 and R 22 are preferably methyl, ethyl, tert. -Butoxy, preferred combinations of R 21 and R 22 include methyl and methyl, methyl and ethyl, methyl and tert-butoxy.
  • the 3- to 8-membered alicyclic ring is preferably a cyclopropane ring, a cyclobutane ring, a cyclopentane ring, or a cyclohexane ring. ..
  • R 23 means the binding point of the amino group with the protecting group.
  • R 23 means the binding point with the adjacent amino acid, and usually the amino acid of the formula (2A) is It forms an amide bond with an adjacent amino acid at the site.
  • ⁇ -branched amino acids of such a second amino acid or the C-terminal amino acid of the second peptide MeVal, D-MeVal, Val, Ile, MeIle, MeChg, Chg, MeGly (cPent) , Gly (cPent), MeGly (cBu), Gly (cBu), MeGly (cPr), Gly (cPr), MeThr (tBu), Thr (tBu) and the like.
  • the amino acid at the C-terminal of the second amino acid or the second peptide is an ⁇ , ⁇ -di-substituted amino acid
  • the ⁇ , ⁇ -di-substituted amino acid specifically has the following formula (2B). Can be mentioned.
  • P 22 is hydrogen or C 1 -C 6 alkyl, preferably hydrogen when P 22 is C 1 -C 6 alkyl.
  • R 23 and R 24 are selected independently of C 1- C 6 alkyl, C 2 -C 6 alkenyl, or optionally substituted C 7 -C 14 aralkyl, or R 23 and R 24 together with the carbon atoms to which they are attached form a 3- to 8-membered alicyclic ring or a 4- to 7-membered saturated heterocycle. If R 23 and R 24 are C 1- C 6 alkyl, preferably methyl, ethyl, or isopropyl, and if R 23 and R 24 are C 2- C 6 alkenyl, they are preferably allyl, R.
  • R 23 and R 24 are C 7- C 14 aralkyls, they are preferably benzyls that may be substituted with halogen.
  • the combination of R 23 and R 24 is preferably benzyl, which may be substituted with methyl and methyl, methyl and ethyl, methyl and isopropyl, methyl and isobutyl, methyl and allyl, and methyl and halogen.
  • R 23 and R 24 form a 3- to 8-membered alicyclic ring together with the carbon atom to which they are bonded, the cyclopropane ring, cyclobutane ring, and cyclo are preferable as the alicyclic ring.
  • R 25 means the bonding point with the protecting group of the amino group.
  • R 25 means the binding point with the adjacent amino acid, and usually the amino acid of the formula (2B) is It forms an amide bond with an adjacent amino acid at the site.
  • Aib (Me) Abu, (Me) Leu, (Me) Algly, as ⁇ , ⁇ -di-substituted amino acids of the C-terminal amino acid of the second amino acid or the second peptide.
  • Examples thereof include (Me) Phe, (Me) Phe (3-I), 1-ACPrC, cVal, cLeu, cHex, and Athpc.
  • the second amino acid, or the C-terminal amino acid of the second peptide is an N-alkyl amino acid, specifically MeAsp-pip, MeAsp-aze, MeAsp-pyrro, MeAsp-mor, MeAsp.
  • MeAsp-OtBu D-3-MeAbu
  • bMeAla MeGly, MeAla, MeLeu, MePhe
  • Pro MeAsp-NMe2
  • MeVal, MeIle MeChg, MeGly (cPent), MeGly (cBu), MeGly (cPr), MeThr (tBu), D-MeVal, MeTrp (Boc), MeThr (Bzl), MeGlu (OtBu), MeLys (Boc), MeMet, etc., preferably MeVal or MeIle can be mentioned.
  • the second amino acid, or the C-terminal amino acid of the second peptide has two or more carbon atoms in its side chain and corresponds to a ⁇ -branched amino acid or an ⁇ , ⁇ -di-substituted amino acid.
  • Lys (Z), Glu (OBzl), or Ser (tBu) corresponds to an amino acid having two or more carbon atoms in the side chain.
  • the second amino acid or peptide is used in an equal amount or an excess amount with respect to the first amino acid or peptide.
  • the molar ratio of the second amino acid or peptide to the first amino acid or peptide is the lower limit selected from the group consisting of 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0 and 9.0.
  • the molar ratio of the second amino acid or peptide to the first amino acid or peptide is preferably 1.5 or more, more preferably 2 or more.
  • the molar ratio of the second amino acid or peptide to the first amino acid or peptide is preferably 8 or less, more preferably 4 or less.
  • the molar ratio of the second amino acid or peptide to the first amino acid or peptide is most preferably about 2.
  • Examples of the additive used for the condensation reaction of the present invention include Oxyma, HOBt, HOOBt, HOAt and the like.
  • the additive is used in a number of moles smaller than the number of moles of the second amino acid or peptide.
  • the molar ratio of the additive to the second amino acid or peptide is less than 1.
  • the molar ratio is preferably 0.8 or less, for example 0.1 to 0.8.
  • the molar ratio of the additive to the second amino acid or peptide is the lower limit selected from the group consisting of 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6 and 0.7, and 0.2, It can be a range that can be specified by a combination with an upper limit selected from the group consisting of 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7 and 0.8.
  • the molar ratio of the additive to the second amino acid or peptide is more preferably 0.3-0.7.
  • the molar ratio of the additive to the second amino acid or peptide is preferably 0.7 or less. .. Specifically, when the molar ratio of the second amino acid or peptide to the first amino acid or peptide is 1 to 2, the molar ratio of the additive to the second amino acid or peptide is in the range of 0.7 or less and in the range of 0.6 or less. , 0.5 or less range, 0.4 or less range, 0.3 or less range, 0.2 or less range or 0.1 or less range.
  • the molar ratio of the second amino acid or peptide to the first amino acid or peptide is 1-2
  • the molar ratio of the additive to the second amino acid or peptide is 0.1, 0.2, 0.3, 0.4.
  • a range that can be specified by a combination of a lower limit selected from the group consisting of, 0.5, and 0.6, and an upper limit selected from the group consisting of 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, and 0.7. can.
  • the second amino acid or peptide if the molar ratio of the second amino acid or peptide to the first amino acid or peptide (this molar ratio is sometimes referred to as the "first molar ratio") is 2 or greater, the second amino acid.
  • the molar ratio of the additive to the peptide is preferably "(first molar ratio) -1" or less. Specifically, when the molar ratio of the second amino acid or peptide to the first amino acid or peptide is 2 or more, the molar ratio of the additive to the second amino acid or peptide is (1st to the first amino acid or peptide).
  • the molar ratio of the second amino acid or peptide to the first amino acid or peptide is 2 or more
  • the molar ratio of the additive to the second amino acid or peptide is (to the first amino acid or peptide).
  • the molar ratio of the additive to the first amino acid or peptide can be 0.5-2.0.
  • the molar ratio of the additive to the first amino acid or peptide is from 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, and 1.9.
  • It can be used in a molar ratio in the range that can be specified by.
  • the molar ratio of the additive to the first amino acid or peptide is particularly preferably about 1.
  • Examples of the condensing agent used in the condensation reaction of the present invention include DIC, DCC, EDCI, EDCI / HCl and the like.
  • the condensing agent is used in an amount equal to or greater than the number of moles of the second amino acid or peptide.
  • the molar ratio of the condensing agent to the second amino acid or peptide can be in the range of 1 or more, 2 or more, 3 or more, or 4 or more.
  • the molar ratio of the condensing agent to the second amino acid or peptide is 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4,
  • the lower limit selected from the group consisting of 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9 and 4.0, and 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5.
  • 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0 , 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, and 5.0 can be the range that can be specified by the combination with the upper limit selected from the group.
  • Preferred ranges for the molar ratio of the condensing agent to the second amino acid or peptide include 1.0 to 5.0, 1.2 to 4.0, 1.2 to 4.0, 1.2 to 3.0 and 2.0 to 3.0.
  • the condensing agent is used in equal or excess amounts with respect to the first amino acid or peptide.
  • the molar ratio of the condensing agent to the first amino acid or peptide is in the range of 1.0 or more, 1.1 or more, 1.2 or more, 1.3 or more, 1.4 or more, 1.5 or more, 1.6 or more range, 1.7 or more range, 1.8 or more range, 1.9 or more range, 2.0 or more range, 2.1 or more range, 2.2 or more range, 2.3 or more range, 2.4 or more range, 2.5 or more range, 2.6 or higher range, 2.7 or higher range, 2.8 or higher range, 2.9 or higher range, 3.0 or higher range, 3.1 or higher range, 3.2 or higher range, 3.3 or higher range, 3.4 or higher range, 3.5 or higher range, 3.6 or higher range, 3.7 or higher range, 3.8 or higher range, 3.9 or higher range, 4.0 or higher range, 4.1 or higher range, 4.2 or higher range, 4.3 or higher
  • the molar ratio of the condensing agent to the first amino acid or peptide is 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, Lower limit selected from the group consisting of 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5
  • the molar ratio of the condensing agent to the first amino acid or peptide is preferably 1.3 or more, more preferably 2.0 or more.
  • the molar ratio of the condensing agent to the first amino acid or peptide is preferably 10 or less, more preferably 8.0 or less.
  • the molar ratio of the condensing agent to the first amino acid or peptide is most preferably about 4.
  • the molar ratio of condensing agent and additive to the second amino acid or peptide is The molar ratio of the condensing agent to the second amino acid or peptide is the lower limit selected from the values 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, and 2.0, as well as 2.0, 2.1, It can be a range that can be specified by a combination with an upper limit selected from values consisting of 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, and 3.0.
  • the lower limit of the molar ratio of the additive to the second amino acid or peptide selected from values consisting of 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, and 0.5.
  • the molar ratio of the second amino acid or peptide, condensing agent, and additive to the first amino acid or peptide is.
  • the molar ratio of the second amino acid or peptide to the first amino acid or peptide is 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, A lower limit selected from values consisting of 2.7, 2.8, 2.9 and 3.0, as well as 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7.
  • the molar ratio of the condensing agent to the first amino acid or peptide is the lower limit selected from the values 1.0, 2.0, 3.0 and 4.0 and the upper limit selected from the values 5.0, 6.0, 7.0, 8.0 and 9.0. It can be a range that can be specified by the combination,
  • the molar ratio of the additive to the first amino acid or peptide is the lower limit selected from values consisting of 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 and 1.0, as well as 1.1, 1.2, 1.3, 1.4.
  • the condensation reaction of the present invention can be carried out at a reaction temperature of 0 to 100 ° C, preferably 5 to 60 ° C, more preferably 10 to 40 ° C.
  • the condensation reaction of the present invention can be carried out in a reaction time of 10 minutes to 1 week, preferably 10 minutes to 3 days, more preferably 1 hour to 2 days.
  • the additive is Oxyma and the condensing agent is DIC, DCC, EDCI, or EDCI / HCl.
  • the additive is Oxyma and the condensing agent is DIC.
  • the condensation reaction of the present invention can be carried out in a suitable solvent.
  • an aprotic solvent can be used, and examples thereof include an amide solvent, an ester solvent, an ether solvent, an alkylnitrile solvent, and a urea solvent.
  • Amide solvents include DMF, DMA, and NMP.
  • Examples of the ester solvent include ethyl acetate and dimethyl carbonate.
  • Examples of the ether solvent include tetrahydrofuran, 2-methyltetrahydrofuran and the like.
  • the alkylnitrile-based solvent include acetonitrile.
  • the urea solvent include DMI and TMU.
  • the method of the present invention can be applied to both the solid phase method and the liquid phase method.
  • the method of the present invention can be carried out by contacting the first amino acid or peptide bound to the resin with the second amino acid or peptide, the condensing agent, and the additive.
  • the order in which the second amino acid or peptide, the condensing agent, and the additive are brought into contact with the first amino acid or peptide is arbitrary, and the second amino acid or peptide, the condensing agent, with respect to the first amino acid or peptide.
  • the additives may be brought into contact at the same time or in sequence.
  • the first amino acid or peptide may be contacted with a premixed mixture of all or any of the second amino acid or peptide, condensing agent, and additive.
  • a mixture thereof with a suitable solvent may be used.
  • the method of the present invention may be carried out using a solid phase synthesizer.
  • the method of the invention can be carried out by mixing a first amino acid or peptide bound to a resin with a second amino acid or peptide, a condensing agent and an additive in a suitable solvent.
  • a pretreatment the solid-phase synthesis resin is swollen by contact with an appropriate solvent to efficiently proceed with the desired condensation reaction. Can be done.
  • the amount of the solvent used in this pretreatment can be any amount as long as the swollen resin is immersed in the solvent. For example, when DMF is used as the solvent, 3v / w to 15v / w.
  • the solvent amount is described as 4v / w, it means that the solvent amount is 4 ml with respect to 1 g of the resin weight.
  • the reaction solution is discharged from the solid-phase synthesizer, and the remaining solid-phase synthesis resin is washed with an appropriate solvent to discharge excess reagents and by-products, and the solid-phase synthesis resin is discharged.
  • the target peptide compound bound to can be obtained.
  • the solvent suitable for washing and / or swelling the solid-phase synthesis resin include amide-based and solvent alcohol-based solvents, and DMF or 2-propanol is preferable. These solvents may be used multiple times or may be used alternately.
  • the swollen solid-phase synthetic resin can be shrunk as needed, for which washing with an alcohol-based solvent or an ether-based solvent is used. Methanol is preferable as the alcohol solvent, and MTBE is preferable as the ether solvent.
  • any resin can be used because the yield of the condensation reaction and the purity of the condensate can be improved as compared with the conventional method even when the premature cleavage does not occur at the same time.
  • resin linkers in which premature cleavage can occur include those classified as acid-sensitive "H ( ⁇ 5% TFA in CH 2 Cl 2 )" described in the Novabiochem solid phase synthesis handbook, and resins having such resin linkers are exemplified.
  • resin linkers such as 2-chlorotrityl chloride resin (CTC resin), TGT resin, trityl chloride resin (Trt resin), 4-methyltrityl chloride resin (Mtt resin), 4-methoxytrityl chloride resin (Mmt resin).
  • resin linkers for solid phase synthesis in which trityl-based atomic groups are used such resins are sometimes referred to as "trityl-based resins"
  • the present invention is particularly useful when such resins are used. ..
  • the type of polymer constituting the resin is not particularly limited, but a resin composed of polystyrene is preferable. Further, a solid-phase synthesis resin having a particle size of about 100-200 mesh or 200-400 mesh can be preferably used.
  • the cross-linking rate of the resin is not particularly limited, but 1% DVB (divinylbenzene) cross-linking is preferable.
  • Examples of the type of polymer constituting the resin include TentaGel (registered trademark) and ChemMatrix (registered trademark).
  • a mixture of a second amino acid or peptide, a condensing agent, and an additive premixed in a solvent may be previously prepared and used in the condensation reaction.
  • the mixing time is not particularly limited, but is preferably 0 minutes to 2 hours, more preferably 0 minutes to 1 hour, and even more preferably 30 minutes.
  • Stirring or shaking the resin using an automatic synthesizer can be important in allowing the resin to fully permeate the reaction solution and allow the reaction to proceed as desired.
  • the stirring speed, shaking speed, and frequency thereof are not particularly limited, but excessive stirring may cause physical damage to the resin. Therefore, for example, stirring at 60 rpm may be performed every hour for about 2 minutes. Further, if the penetration is sufficient, it is not always necessary to stir or shake.
  • the method of the present invention may further include a step of removing the resin for solid phase synthesis, for which a method known in the art can be used.
  • the peptide compound extended to the desired sequence can be desorbed from the resin and isolated.
  • the method of the invention may further include a step of removing the protecting group, for which methods known in the art can be used.
  • the methods described in "Greene's,” Protective Groups in Organic Synthesis “(5th edition, John Wiley & Sons 2014)" can be mentioned, and these may be appropriately used according to the reaction conditions.
  • the amino group of the second amino acid or the amino group of the N-terminal amino acid of the second peptide is protected by a protective group
  • the following condensation is carried out by removing the protective group. You can prepare for the reaction.
  • the protecting group may be removed at the same time as the condensation reaction or may be removed separately from the condensation reaction.
  • the invention uses the methods of the invention to obtain linear peptide compounds, followed by Comprehensive Organic Transformations, A Guide to Functional Group Preparations, 3rd Edition (R.C. Larock), or March's Advanced Organic. Cycling the N-terminal side group and the C-terminal side group by a known method described in Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 7th Edition (M.B. Smith, J. March), etc.
  • the present invention also relates to a method for producing a cyclic peptide compound.
  • the present invention also relates to a method for suppressing premature cleavage using the method of the present invention.
  • 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide was added dropwise at 12.2 mL (69.5 mmol, 1.1 eq) at 0 ° C. over 10 minutes using a dropping funnel. After the dropping, the dropping funnel was washed twice with 1.25 mL of N, N-dimethylformamide. Five hours after the start of the reaction, 269 mL of 2-MeTHF was added, and then 135 mL of a 0.5 mol / L hydrochloric acid aqueous solution was added over 10 minutes. After draining the aqueous layer, 135 mL of a 5% aqueous sodium carbonate solution was added to the organic layer.
  • the flask was immersed in an ice bath and TMSOTf was added with a 0.79 mL (4.4 mmol, 1.4 eq) syringe when the internal temperature reached 1 ° C.
  • the temperature was raised to room temperature 5 minutes after the completion of the dropping, and 1 hour later, it was confirmed by HPLC (method Aa) that the reaction rate was 100%.
  • the reaction vessel was immersed in an ice bath again, and when the internal temperature reached 5 ° C., 15 mL of a 5% aqueous sodium carbonate solution was added. After adding the aqueous sodium carbonate solution, the reaction solution was stirred for several minutes, and then the stirring was stopped.
  • the reaction vessel was transferred to a 50 mL separatory funnel, separated into layers, and then the aqueous layer was separated. The resulting aqueous layer was washed with 15 mL of MTBE. After adding 15 mL of MTBE to the separated aqueous layer, 1.1 mL of phosphoric acid (mass fraction of 85% or more) was added. After shaking the solution with a separating funnel, the solution was separated and the organic layer was separated. After adding magnesium sulfate to the obtained organic layer, magnesium sulfate was filtered. 1.5 mL of heptane was added to the filtrate, and the mixture was concentrated under reduced pressure to obtain 1.42 g (compound 3) of a white solid (content not measured).
  • Cl-Trt (2-Cl) resin (1.25 to 1.60 mmol / g, 100-200 mesh, 1% DVB) was purchased from Watanabe Chemical Industry Co., Ltd. or SUNRESIN.
  • the polymer or resin moiety when the solid phase support and the compound are bonded, the polymer or resin moiety may be indicated by ⁇ .
  • the chemical structure of the linker which is the reaction site, may be indicated by connecting to ⁇ .
  • the 2-chlorotrityl group of the solid phase support forms an ester bond with the side chain carboxy group of MeAsp.
  • pip means a piperidino group, and in the above structure, the C-terminal carboxy group forms an amide bond with piperidine.
  • the amount of solvent at the time of performing a solid-phase reaction may be expressed as a double amount (v / w).
  • the standard for double the amount is the mass of Cl-Trt (2-Cl) resin in the loading step.
  • 40 mL of dichloromethane is added to 3.97 g of Cl-Trt (2-Cl) resin.
  • 40 / 3.97 ⁇ 10 v / w is the resin intermediate obtained in the loading step.
  • the reaction solution after the de-resin reaction using the dry resin obtained after elongation is measured by LC to confirm the purity of the compound carried on the resin for solid-phase synthesis. did.
  • the specific procedure is shown. Approximately 20 mg of the stretched dry resin was placed in a 5 mL disposable syringe with a filter, dichloromethane was aspirated with a 1 mL disposable syringe, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 15 minutes. Dichloromethane was discharged, 0.20 mL of dichloromethane containing 1% TFA was added, and the mixture was shaken at room temperature for 30 seconds. The solution was drained into a 1 mL vial. An LC sample solution was prepared by diluting 40 ⁇ L of the effluent with 960 ⁇ L of acetonitrile.
  • the Fmoc quantitative value (mmol / g) and the dry resin weight (g) are used.
  • the amount of substance (mmol) of the target substance was calculated from the product of LC purity (area%), and the yield of the solid phase condensation reaction was evaluated.
  • the specific procedure of Fmoc quantification is shown. About 20 mg of the dry resin was weighed in a 100 mL volumetric flask, and then an N, N-dimethylformamide solution containing 20% piperidine was added to make a volumetric flask. The solution was shaken for 45 minutes at room temperature.
  • Fmoc quantification method (Example 2-2 to Example 2-11) About 10 mg of commercially available Fmoc-Gly-OH was weighed in a 10 mL volumetric flask, and then DMF (4 ml) was added. After shaking at room temperature for 30 minutes, DBU (40 ⁇ L) was added and the solution was shaken at room temperature for 15 minutes. Then, DMF was added and the volume was increased to 10 mL. A sample solution was prepared from 30 ⁇ L of the solution supernatant and 4 ml of DMF solution, and LC data was obtained (5 ⁇ L injection). Calibration curves were created at each wavelength of 294 nm and 304 nm from the acquired data.
  • Example 1 Example 2-1 and Examples 2-12 to 2-31, Fmoc amino acids, DIC, and Oxyma were added to the amino acids of the solid-phase synthesis resin in an amount of 2 equivalents and 4 equivalents, respectively. Amino acids were extended by using 1 equivalent (Example Condition A).
  • the target product (Compound 7) could be obtained in high yield.
  • the production of the overextended form (Compound 8) and the epimer form (Compound 6) was 2.3 A% and 0.4 A%, respectively.
  • N-dimethylformamide After draining N, N-dimethylformamide, 1.1 mL (8 v / w) of N, N-dimethylformamide solution containing 20% piperidine was added, and the mixture was shaken at room temperature for 15 minutes. After draining the reaction solution, 1.1 mL (8 v / w) of N, N-dimethylformamide solution containing 20% piperidine was added again, and the mixture was shaken at room temperature for 15 minutes. After draining the reaction solution, it was washed 8 times with 1.3 mL (10 v / w) of N, N-dimethylformamide.
  • the target product (Compound 10) could be obtained in high yield.
  • the production of the overextended form (Compound 11) and the epimer form (Compound 7) was 1.9 A% and 0.1 A%, respectively.
  • the resin (100 mg) carrying the Fmoc amino acid or peptide prepared in Solid-Phase Raw Material Synthesis 1 to 4 was placed in a solid-phase reaction vessel equipped with a filter (frit) and set in a peptide synthesizer.
  • the resin was swollen by adding DCM (1.2 mL) and allowing it to stand for 30 minutes, and then the solution was drained from the frit.
  • Solution 1 and solution 2 were set in the peptide synthesizer, and automatic synthesis by the peptide synthesizer was started.
  • a DMF solution of DBU (2% v / v, 0.7 mL) was added to a solid-phase reaction vessel containing resin, and the Fmoc group was removed at room temperature. The reaction was carried out for 4.5 minutes for the deprotection of the first residue, and the reaction was carried out for 10 minutes for the deprotection of the second and subsequent residues, and then the solution was discharged from the frit. DMF (0.7 mL) was added thereto, and after allowing to stand for 5 minutes, the solution was discharged from the frit. This resin cleaning process was repeated three more times.
  • solution 1 (0.3 mL) and solution 2 (0.36 mL) were mixed with the mixing vial of the synthesizer (Fmoc amino acid: condensing agent: additive mixing ratio of about 1.6: 2: 1) and then converted into a resin.
  • the solution was added, the solid phase reaction vessel was heated to 40 ° C. or 50 ° C., and the reaction was carried out for 2.5 hours or 10 hours to carry out a condensation reaction between the amino group on the resin and the Fmoc amino acid, and then the solution was discharged from the frit.
  • the resin was then washed 3 times with DMF (0.7 mL). Following this Fmoc group removal reaction, the Fmoc amino acid condensation reaction was set as one cycle, and this cycle was repeated to extend the peptide.
  • the obtained resin was washed 4 times with DMF (0.7 mL), then washed 4 times with DCM (0.7 mL), and air-dried at room temperature for 48 hours.
  • a part of the obtained resin (about 10 mg) was placed in a reaction vessel, and the carrying ratio of the peptide on the resin was calculated according to the above Fmoc quantification method.
  • a part of the obtained resin (about 20 mg) is placed in a reaction vessel, and a TFE / DCM solution (1/1, 1 mL) containing or not containing 0.75% (v / v) DIPEA is added.
  • the peptide was cut out by shaking at room temperature for 2 hours. After the reaction, the cutout solution was analyzed by LCMS.
  • the theoretical Fmoc quantification value (mmol / g) after the extension reaction is calculated as follows.
  • Theoretical Fmoc quantified value after elongation reaction (mmol / g) Fmoc quantified value of raw material resin (mmol / g) ⁇ Weight of raw material resin (g) ⁇ Weight of resin when 100% of target product is produced (g) ) (Equation 2)
  • the weight (g) of the amino acid or peptide component on the raw material resin is calculated as follows.
  • Weight of amino acid or peptide component on raw material resin (g) Quantitative value of Fmoc of raw material resin (mmol / g) x Weight of raw material resin (g) x Molecular weight of amino acid or peptide component on raw material resin (g / g / mol) x 0.001 (mol / mmol) (Equation 4)
  • the recovery rate is calculated by the following equation.
  • Recovery rate Actual Fmoc quantified value after extension reaction (mmol / g) ⁇ (1 ⁇ Fmoc quantified value of raw material resin (mmol / g) --Molecular weight of amino acid or peptide component on raw material resin (g / mol) ⁇ 0.001 (mol / mmol) + molecular weight (g / mol) of the peptide component of the target substance ⁇ 0.001 (mol / mmol))
  • Synthesis of compound 27 under condition 1 Synthetic method using amino acid-bearing resin (Compound 4) (Fmoc-MeAsp (O-Trt (2-Cl) resin) -pip) (100 mg, 0.455 mmol / g) prepared in Solid-Phase Raw Material Synthesis 1 as a starting material. According to 1, extension of Fmoc-MeVal-OH (HOAt, 40 ° C., 2.5 hours) and then extension of Fmoc-Ile-OH (HOAt, 40 ° C., 2.5 hours) were carried out to synthesize compound 27.
  • Synthetic method using amino acid-bearing resin Compound 4) (Fmoc-MeAsp (O-Trt (2-Cl) resin) -pip) (100 mg, 0.455 mmol / g) prepared in Solid-Phase Raw Material Synthesis 1 as a starting material. According to 1, extension of Fmoc-MeVal-OH (HOAt, 40
  • Synthesis of compound 27 under condition 2 Synthetic method using amino acid-bearing resin (Compound 4) (Fmoc-MeAsp (O-Trt (2-Cl) resin) -pip) (100 mg, 0.455 mmol / g) prepared in Solid-Phase Raw Material Synthesis 1 as a starting material. According to 1, extension of Fmoc-MeVal-OH (Oxyma, 50 ° C., 10 hours) and then extension of Fmoc-Ile-OH (HOAt, 40 ° C., 2.5 hours) were carried out to synthesize compound 27.
  • Synthesis of compound 28 under condition 1 Synthetic method using amino acid-bearing resin (Compound 4) (Fmoc-MeAsp (O-Trt (2-Cl) resin) -pip) (100 mg, 0.455 mmol / g) prepared in Solid-Phase Raw Material Synthesis 1 as a starting material. According to 1, extension of Fmoc-MeIle-OH (HOAt, 40 ° C., 2.5 hours) and then extension of Fmoc-Ile-OH (HOAt, 40 ° C., 2.5 hours) were carried out to synthesize compound 28.
  • Synthetic method using amino acid-bearing resin Compound 4) (Fmoc-MeAsp (O-Trt (2-Cl) resin) -pip) (100 mg, 0.455 mmol / g) prepared in Solid-Phase Raw Material Synthesis 1 as a starting material. According to 1, extension of Fmoc-MeIle-OH (HOAt
  • Synthesis of compound 28 under condition 2 Synthetic method using amino acid-bearing resin (Compound 4) (Fmoc-MeAsp (O-Trt (2-Cl) resin) -pip) (100 mg, 0.455 mmol / g) prepared in Solid-Phase Raw Material Synthesis 1 as a starting material. According to 1, extension of Fmoc-MeIle-OH (Oxyma, 50 ° C., 10 hours) and then extension of Fmoc-Ile-OH (HOAt, 40 ° C., 2.5 hours) were carried out to synthesize compound 28.
  • Synthetic method using amino acid-bearing resin Compound 4) (Fmoc-MeAsp (O-Trt (2-Cl) resin) -pip) (100 mg, 0.455 mmol / g) prepared in Solid-Phase Raw Material Synthesis 1 as a starting material. According to 1, extension of Fmoc-MeIle-OH (O
  • Synthesis of compound 29 under condition 1 Synthetic method using amino acid-bearing resin (Compound 4) (Fmoc-MeAsp (O-Trt (2-Cl) resin) -pip) (100 mg, 0.455 mmol / g) prepared in Solid-Phase Raw Material Synthesis 1 as a starting material. According to 1, extension of Fmoc-MeGly (cPent) -OH (HOAt, 40 ° C., 2.5 hours) and then extension of Fmoc-Ile-OH (HOAt, 40 ° C., 2.5 hours) were carried out to synthesize compound 29.
  • synthesis method 1 Synthetic method using amino acid-bearing resin (Compound 4) (Fmoc-MeAsp (O-Trt (2-Cl) resin) -pip) (100 mg, 0.455 mmol / g) prepared in Solid-Phase Raw Material Synthesis 1 as a starting material. According to 1, extension of Fmoc
  • Synthesis of compound 29 under condition 2 Synthetic method using amino acid-bearing resin (Compound 4) (Fmoc-MeAsp (O-Trt (2-Cl) resin) -pip) (100 mg, 0.455 mmol / g) prepared in Solid-Phase Raw Material Synthesis 1 as a starting material. According to 1, Fmoc-MeGly (cPent) -OH was extended (Oxyma, 50 ° C., 10 hours), and then Fmoc-Ile-OH was extended (HOAt, 40 ° C., 2.5 hours) to synthesize compound 29.
  • Synthesis of compound 30 under condition 1 Synthetic method using amino acid-bearing resin (Compound 4) (Fmoc-MeAsp (O-Trt (2-Cl) resin) -pip) (100 mg, 0.455 mmol / g) prepared in Solid-Phase Raw Material Synthesis 1 as a starting material. According to 1, extension of Fmoc-MeChg-OH (HOAt, 40 ° C., 2.5 hours) and then extension of Fmoc-Ile-OH (HOAt, 40 ° C., 2.5 hours) were carried out to synthesize compound 30.
  • Synthetic method using amino acid-bearing resin Compound 4) (Fmoc-MeAsp (O-Trt (2-Cl) resin) -pip) (100 mg, 0.455 mmol / g) prepared in Solid-Phase Raw Material Synthesis 1 as a starting material. According to 1, extension of Fmoc-MeChg-OH (HOAt
  • Synthesis of compound 30 under condition 2 Synthetic method using amino acid-bearing resin (Compound 4) (Fmoc-MeAsp (O-Trt (2-Cl) resin) -pip) (100 mg, 0.455 mmol / g) prepared in Solid-Phase Raw Material Synthesis 1 as a starting material. According to 1, extension of Fmoc-MeChg-OH (Oxyma, 50 ° C., 10 hours) and then extension of Fmoc-Ile-OH (HOAt, 40 ° C., 2.5 hours) were carried out to synthesize compound 30.
  • Synthesis of compound 31 under condition 1 Synthetic method using amino acid-bearing resin (Compound 4) (Fmoc-MeAsp (O-Trt (2-Cl) resin) -pip) (100 mg, 0.455 mmol / g) prepared in Solid-Phase Raw Material Synthesis 1 as a starting material. According to 1, extension of Fmoc-MeLeu-OH (HOAt, 40 ° C., 2.5 hours) and then extension of Fmoc-Ile-OH (HOAt, 40 ° C., 2.5 hours) were carried out to synthesize compound 31.
  • Synthetic method using amino acid-bearing resin Compound 4) (Fmoc-MeAsp (O-Trt (2-Cl) resin) -pip) (100 mg, 0.455 mmol / g) prepared in Solid-Phase Raw Material Synthesis 1 as a starting material. According to 1, extension of Fmoc-MeLeu-OH (HOAt
  • Synthesis of compound 31 under condition 2 Synthetic method using amino acid-bearing resin (Compound 4) (Fmoc-MeAsp (O-Trt (2-Cl) resin) -pip) (100 mg, 0.455 mmol / g) prepared in Solid-Phase Raw Material Synthesis 1 as a starting material. According to 1, extension of Fmoc-MeLeu-OH (Oxyma, 50 ° C., 10 hours) and then extension of Fmoc-Ile-OH (HOAt, 40 ° C., 2.5 hours) were carried out to synthesize compound 31.
  • Synthesis of compound 32 under condition 1 Synthetic method using amino acid-supported resin (Compound 22) (Fmoc-MeAsp (O-Trt (2-Cl) resin) -NMe2) (100 mg, 0.442 mmol / g) prepared in Solid-Phase Raw Material Synthesis 2 as a starting material. According to 1, extension of Fmoc-MeGly (cPent) -OH (HOAt, 40 ° C., 2.5 hours) and then extension of Fmoc-Ile-OH (HOAt, 40 ° C., 2.5 hours) were carried out to synthesize compound 32.
  • synthesis method 1 Synthetic method using amino acid-supported resin (Compound 22) (Fmoc-MeAsp (O-Trt (2-Cl) resin) -NMe2) (100 mg, 0.442 mmol / g) prepared in Solid-Phase Raw Material Synthesis 2 as a starting material. According to 1, extension of Fmoc-MeGly (
  • Synthesis of compound 32 under condition 2 Synthetic method using amino acid-bearing resin (Compound 22) (Fmoc-MeAsp (O-Trt (2-Cl) resin) -NMe2) (100 mg, 0.442 mmol / g) prepared in Solid-Phase Raw Material Synthesis 2 as a starting material. According to 1, Fmoc-MeGly (cPent) -OH was extended (Oxyma, 50 ° C., 10 hours), and then Fmoc-Ile-OH was extended (HOAt, 40 ° C., 2.5 hours) to synthesize compound 32.
  • synthesis method 1 Synthetic method using amino acid-bearing resin (Compound 22) (Fmoc-MeAsp (O-Trt (2-Cl) resin) -NMe2) (100 mg, 0.442 mmol / g) prepared in Solid-Phase Raw Material Synthesis 2 as a starting material. According to 1, Fmoc-MeGly
  • Synthesis of compound 33 under condition 1 Synthetic method using amino acid-supported resin (Compound 22) (Fmoc-MeAsp (O-Trt (2-Cl) resin) -NMe2) (100 mg, 0.442 mmol / g) prepared in Solid-Phase Raw Material Synthesis 2 as a starting material. According to 1, extension of Fmoc-MeLeu-OH (HOAt, 40 ° C., 2.5 hours) and then extension of Fmoc-Ile-OH (HOAt, 40 ° C., 2.5 hours) were carried out to synthesize compound 33.
  • synthesis method 1 Synthetic method using amino acid-supported resin (Compound 22) (Fmoc-MeAsp (O-Trt (2-Cl) resin) -NMe2) (100 mg, 0.442 mmol / g) prepared in Solid-Phase Raw Material Synthesis 2 as a starting material. According to 1, extension of Fmoc-MeLeu-OH (HOAt,
  • Synthesis of compound 33 under condition 2 Synthetic method using amino acid-bearing resin (Compound 22) (Fmoc-MeAsp (O-Trt (2-Cl) resin) -NMe2) (100 mg, 0.442 mmol / g) prepared in Solid-Phase Raw Material Synthesis 2 as a starting material. According to 1, extension of Fmoc-MeLeu-OH (Oxyma, 50 ° C., 10 hours) and then extension of Fmoc-Ile-OH (HOAt, 40 ° C., 2.5 hours) were carried out to synthesize compound 33.
  • synthesis method 1 Synthetic method using amino acid-bearing resin (Compound 22) (Fmoc-MeAsp (O-Trt (2-Cl) resin) -NMe2) (100 mg, 0.442 mmol / g) prepared in Solid-Phase Raw Material Synthesis 2 as a starting material. According to 1, extension of Fmoc-MeLeu-
  • Synthesis of compound 34 under condition 1 Synthesis using amino acid-supported resin (Compound 24) (Fmoc-D-3-MeAbu-O-Trt (2-Cl) resin) (100 mg, 0.369 mmol / g) prepared in Solid-Phase Raw Material Synthesis 3 as a starting material. According to Method 1, extension of Fmoc-MeVal-OH (HOAt, 40 ° C., 2.5 hours) and then extension of Fmoc-Ile-OH (HOAt, 40 ° C., 2.5 hours) were carried out to synthesize compound 34.
  • synthesis method 1 Synthesis using amino acid-supported resin (Compound 24) (Fmoc-D-3-MeAbu-O-Trt (2-Cl) resin) (100 mg, 0.369 mmol / g) prepared in Solid-Phase Raw Material Synthesis 3 as a starting material. According to Method 1, extension of Fmoc-MeVal-OH (HOAt, 40 ° C., 2.5 hours
  • Synthesis of compound 34 under condition 2 Synthesis of compound 34 under condition 2 (synthesis method 1) Synthesis using amino acid-bearing resin (Compound 24) (Fmoc-D-3-MeAbu-O-Trt (2-Cl) resin) (100 mg, 0.369 mmol / g) prepared in Solid-Phase Raw Material Synthesis 3 as a starting material. According to Method 1, extension of Fmoc-MeVal-OH (Oxyma, 50 ° C., 10 hours) and then extension of Fmoc-Ile-OH (HOAt, 40 ° C., 2.5 hours) were carried out to synthesize compound 34.
  • synthesis method 1 Synthesis using amino acid-bearing resin (Compound 24) (Fmoc-D-3-MeAbu-O-Trt (2-Cl) resin) (100 mg, 0.369 mmol / g) prepared in Solid-Phase Raw Material Synthesis 3 as a starting material. According to Method 1, extension of Fmoc-
  • Synthesis of compound 35 under condition 1 Synthesis using amino acid-supported resin (Compound 24) (Fmoc-D-3-MeAbu-O-Trt (2-Cl) resin) (100 mg, 0.369 mmol / g) prepared in Solid-Phase Raw Material Synthesis 3 as a starting material.
  • Method 1 extension of Fmoc-MeChg-OH (HOAt, 40 ° C., 2.5 hours) and then extension of Fmoc-Ile-OH (HOAt, 40 ° C., 2.5 hours) were carried out to synthesize compound 35.
  • Synthesis of compound 35 under condition 2 Synthesis using amino acid-bearing resin (Compound 24) (Fmoc-D-3-MeAbu-O-Trt (2-Cl) resin) (100 mg, 0.369 mmol / g) prepared in Solid-Phase Raw Material Synthesis 3 as a starting material.
  • Compound 35 was synthesized by stretching Fmoc-MeChg-OH (Oxyma, 50 ° C., 10 hours) and then stretching Fmoc-Ile-OH (HOAt, 40 ° C., 2.5 hours) according to Method 1.
  • Synthesis of compound 36 under condition 1 (synthesis method 1) Using the amino acid-supported resin (Compound 26) (Fmoc-MeGly-O-Trt (2-Cl) resin) (100 mg, 0.573 mmol / g) prepared in Solid-Phase Raw Material Synthesis 4 as a starting material, according to Synthesis Method 1, The extension of Fmoc-MeVal-OH (HOAt, 40 ° C., 2.5 hours) was followed by the extension of Fmoc-Ile-OH (HOAt, 40 ° C., 2.5 hours) to synthesize compound 36.
  • synthesis method 1 Using the amino acid-supported resin (Compound 26) (Fmoc-MeGly-O-Trt (2-Cl) resin) (100 mg, 0.573 mmol / g) prepared in Solid-Phase Raw Material Synthesis 4 as a starting material, according to Synthesis Method 1, The extension of Fmoc-MeVal-OH (HOAt, 40 ° C.
  • Synthesis of compound 36 under condition 2 Synthesis method 1 using amino acid-bearing resin (Compound 26) (Fmoc-MeGly- (O-Trt (2-Cl) resin)) (100 mg, 0.573 mmol / g) prepared in Solid-Phase Raw Material Synthesis 4 as a starting material.
  • Fmoc-MeVal-OH was extended (Oxyma, 50 ° C., 10 hours), and then Fmoc-Ile-OH was extended (HOAt, 40 ° C., 2.5 hours) to synthesize compound 36.
  • N-dimethylformamide After draining N, N-dimethylformamide, 1.3 mL (8 v / w) of N, N-dimethylformamide solution containing 20% piperidine was added, and the mixture was shaken at room temperature for 15 minutes. After draining the reaction solution, 1.3 ml (8 v / w) of N, N-dimethylformamide solution containing 20% piperidine was added again, and the mixture was shaken at room temperature for 15 minutes. After draining the reaction solution, the reaction solution was washed 8 times with 1.6 mL (10 v / w) of N, N-dimethylformamide.
  • Glycine capping was carried out to confirm the residual ratio of starting materials. That is, about 10 mg of the dried resin subjected to the condensation reaction was weighed in a 5 mL disposable syringe equipped with a filter, 1 mL of N, N-dimethylformamide was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 15 minutes. After discharging N, N-dimethylformamide, weigh the reaction cocktail (Fmoc-Gly-OH about 70 mg and HATU about 0.11 g in a vial, suspend in 0.45 mL of N, N-dimethylformamide, and then N, 45 ⁇ L of N-diisopropylethylamine was added and shaken for 1 minute.
  • reaction cocktail Fmoc-Gly-OH about 70 mg and HATU about 0.11 g in a vial
  • N-dimethylformamide After draining N, N-dimethylformamide, 1.3 mL (8 v / w) of N, N-dimethylformamide solution containing 20% piperidine was added, and the mixture was shaken at room temperature for 15 minutes. After draining the reaction solution, 1.3 mL (8 v / w) of N, N-dimethylformamide solution containing 20% piperidine was added again, and the mixture was shaken at room temperature for 15 minutes. After draining the reaction solution, the reaction solution was washed 8 times with 1.6 mL (10 v / w) of N, N-dimethylformamide.
  • Example Condition A Using the same method as in Example Condition A, it was confirmed that the starting material residual rate was 0% in Reference Example Condition A as well.
  • reaction time was shortened from 18 hours to 1 hour.
  • Example condition A suppressed premium cleavage as compared with Reference Example condition A, and gave a 2-residue peptide in a good yield.
  • the inhibitory effect in the case of N-Me ⁇ amino acid was remarkable.
  • Example 2-31 Search experiment of reagent equivalent range that produces inhibitory effect of premature cleavage Based on the above [1 residue + 1 residue condensation experiment] (Example condition A), the result of performing the same reaction by changing the reagent equivalent is as follows. Shown in.
  • Example 2-1 to 2-31 an amino acid or peptide having an N-terminal at the N-terminal under the condition that 1 equivalent or more of DIC is used with respect to the Fmoc amino acid and 1 equivalent or less of the additive is used.
  • the recovery rate when extending to the third residue was over 53%, and the highest was over 90%.
  • the yield and purity of Example Condition A were equal to or higher than those.
  • N-dimethylformamide After draining N, N-dimethylformamide, 1.1 mL (8 v / w) of N, N-dimethylformamide solution containing 20% piperidine was added, and the mixture was shaken at room temperature for 15 minutes. After draining the reaction solution, 1.1 mL (8 v / w) of N, N-dimethylformamide solution containing 20% piperidine was added again, and the mixture was shaken at room temperature for 15 minutes. After draining the reaction solution, it was washed 8 times with 1.3 mL (10 v / w) of N, N-dimethylformamide.
  • Glycine capping was carried out to confirm the residual ratio of starting materials. That is, about 10 mg of the resin obtained by filtering the reaction solution after the condensation reaction was transferred as an N, N-dimethylformamide suspension to a 5 mL disposable syringe equipped with a filter. After discharging N, N-dimethylformamide, the cells were washed 3 times with 1 mL of N, N-dimethylformamide.
  • Reaction cocktail (Weigh about 70 mg of Fmoc-Gly-OH and about 0.11 g of HATU in a vial, suspend in 0.45 mL of N, N-dimethylformamide, and then add 45 ⁇ L of N, N-diisopropylethylamine 1 The pale yellow uniform solution shaken for 1 minute) was aspirated with a disposable syringe and shaken at room temperature for 1 hour. After draining the reaction solution, the reaction was washed 6 times with 1 mL of N, N-dimethylformamide and then 4 times with 1 mL of dichloromethane, and then the resin removal reaction was carried out.
  • Residual starting material from the sum of LC A% of Gly-cap compound (Compound 13), epimer compound (Compound 6), target substance (Compound 7), over-extended compound (Compound 8), and over-extended compound (Compound 9).
  • the rate was calculated as 1.3% (1.3 ⁇ (1.3 + 79.9 + 13.4 + 2.3)).
  • N-dimethylformamide After draining N, N-dimethylformamide, 1.1 mL (8 v / w) of N, N-dimethylformamide solution containing 20% piperidine was added, and the mixture was shaken at room temperature for 15 minutes. After draining the reaction solution, 1.1 mL (8 v / w) of N, N-dimethylformamide solution containing 20% piperidine was added again, and the mixture was shaken at room temperature for 15 minutes. After draining the reaction solution, it was washed 8 times with 1.3 mL (10 v / w) of N, N-dimethylformamide.
  • the amount of solvent at the time of solid-phase reaction may be expressed as a double amount (v / w).
  • the standard of double the amount in this reference example is the mass of the dry resin (Compound 14), and 0.80 mL of N, N-dimethylformamide is used for 100 mg of the dry resin.
  • This solution was transferred to the reaction solution of Fmoc-c Leu-OH and shaken at room temperature for 2 hours.
  • the reaction solution was transferred to a disposable syringe equipped with a filter, and the reaction solution and the resin were separated by filtration. After washing the resin twice alternately with N, N-dimethylformamide 0.80 mL (8 v / w) and isopropanol 0.80 mL (8 v / w), N, N-dimethylformamide 0.80 mL (8 v / w) ) Twice, finally with MTBE 0.80 mL (8 v / w), and ventilated to dry at room temperature.
  • the obtained dry resin (Compound 16) was immersed in 1 mL of a dichloromethane solution of 1% TFA to carry out a resin removal reaction. From the LC A% of the Gly-cap compound (Compound 17) and the target product (Compound 18), the conversion rate was calculated to be 75% (68.9 ⁇ (23.5 + 68.9)).
  • the present invention provides a method for efficiently producing a peptide compound containing a sequence having poor reactivity so that the condensation reaction is not achieved when the conventional method is applied.

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Abstract

N末端に追加されるアミノ酸またはペプチドに対して添加剤を少なく用いることにより、立体障害の大きなアミノ酸を含む場合でも効率的に縮合反応を進行させることができ、高収率、高純度で目的とするペプチド化合物が得られることを見出した。

Description

高難度配列の効率的ペプチド縮合法
　本発明は、縮合反応を使用したペプチド化合物の製造方法に関する。
　ペプチドはアミノ酸が多数連結した分子であり、生物が生命活動を営む上で不可欠な役割を果たしている。生物学、化学の発展に伴いペプチドの理解が深まるとともに、新規医薬の創出を志向した天然ペプチドの利活用や、ペプチドの人工デザインによる機能性ペプチドの研究、開発が盛んに行われている（非特許文献1）。とりわけ、ペプチドの環化や、構成アミノ酸のN-アルキル化、特にN-メチル化が、膜透過性や代謝安定性向上に寄与することや（非特許文献2、非特許文献3）、細胞内移行や経口剤の開発の鍵となるドラッグライクな環状ペプチド構造の知見や考察が報告され、ペプチド創薬における該構造の重要性の認知度が高まりつつある（特許文献1）。
　ペプチドの合成は、アミド結合の形成により、望みの配列へと伸長することで達成される。より具体的な方法として、液相法と固相法が挙げられる（非特許文献4）。
　このうち固相法は、ポリマー樹脂（固相合成用樹脂）に連結された原子団をリンカーとして、
1）アミノ酸もしくはペプチドのC末端のカルボキシル基との共有結合の形成（担持工程）、
2）担持アミノ酸もしくはペプチドのN末端アミノ基の脱保護反応に続く、次の配列のアミノ酸との縮合反応、および所望の配列に至るまでのこれら脱保護反応、および縮合反応の繰り返し（伸長工程）、
3）固相合成用樹脂からのペプチドの切断（脱樹脂工程）、とからなる（非特許文献5、6）。
　固相法は、目的物が結合した固体の固相合成用樹脂と、脱保護反応、および縮合反応用試薬が溶解した液体の反応液を接触させる工程を含む、固体と液体の二層の反応系で行われる。目的物のペプチドが固相合成用樹脂に結合しているため、各工程間では、固相合成用樹脂の洗浄操作を組み入れるのみで、目的物のペプチドが結合した固相合成用樹脂から、過剰の試薬、および試薬由来の不純物を分離することが可能なため、簡便に逐次的な伸長が実施できる。
　固相法で用いられるアミノ酸主鎖N末端のアミノ基の保護基としては、Fmoc基やBoc基が汎用される。
　一方、固相合成用樹脂は、樹脂に用いられるポリマーに結合したリンカーとなる原子団により大別され、トリチル基やベンジル基を含むリンカー原子団が結合した固相合成用樹脂が汎用される。より具体的には、CTCレジン、Wangレジン、SASRINレジン、あるいはRink Amideレジンなどが代表的である。脱樹脂工程は主として酸性条件で実施されるが、リンカー原子団の、酸に対する安定性に応じて脱樹脂の容易さが決定される。例えば、トリチル基をリンカーとしてペプチドを結合させることができるCTCレジンからのペプチドの脱樹脂反応は、弱酸性試薬でも実施可能である。一方、ベンジル基をリンカーとしてペプチドを結合させることができるWangレジンからのペプチドの脱樹脂反応は、強酸条件が適用される（非特許文献6）。
　既述のようにペプチドの伸長工程は、固相法、液相法によらず、アミノ酸もしくはペプチドのアミノ基と、新たに導入するN末端のアミノ基が保護されたアミノ酸のカルボキシル基とを脱水縮合する縮合工程と、新たに導入したN末端のアミノ基の保護基を除去する脱保護工程の繰り返しからなる。この繰り返し工程で、縮合反応の未達、および／または副反応の競合が累積すると、目的とするアミノ酸配列のペプチドから、アミノ酸が欠損、または付加した不純物が副生し、目的の配列を持つペプチドの収率、および／または純度が低下することがある。
　固相法の縮合反応時に起こりやすい副反応としては、縮合反応の未達に加え、カルボン酸の活性化や反応溶液の液性に起因するカルボキシル基α位のエピメリ化、N末端のグアニル化、あるいは脱N-Fmoc化やこれらの併発が報告されている（非特許文献6）。このうち、縮合反応の反応未達の対策としては、反応を長時間化させることより、再度同じ条件に付す方が良いという報告がある（非特許文献6）。また、所望の縮合反応が達成されていない未反応のN末端のアミノ基が、新たに導入するN末端のアミノ基が保護されたアミノ酸（次の配列のアミノ酸とも呼ぶ）と反応することにより欠損体が生じる場合がある。この欠損体の生成を防ぐため、無水酢酸あるいは塩化ベンゾイルに例示されるアシル化剤を、ピリジン存在下で反応させることにより、所望の縮合反応が達成されていない未反応のN末端のアミノ基をアシル化剤でキャッピングし、望みでない配列の伸長を阻止することができる（非特許文献6）。
　既述のようにCTCレジンを用いると、温和な弱酸条件下でペプチドの脱樹脂反応が可能である。CTCレジンを用いたペプチドの製造では、酸性下で除去されやすい保護基をもつペプチドを、当該保護基が脱保護されることなく選択的に脱樹脂化が可能であり、所望の保護基で保護されたペプチドの製造に有用である（非特許文献7）。一方で、CTCレジンを用いたペプチドの固相合成では、ペプチドがCTCレジンから温和な条件で脱樹脂され得る。そのため、縮合反応条件下で、CTCレジンに担持されたアミノ酸、またはペプチドと、レジンのリンカーとの共有結合が切断され、目的とするペプチドの収率が低下する（premature cleavage、もしくはPremature peptide release、premature acidolytic cleavageとも呼ばれる）ことが報告されている（非特許文献8）。本文献ではCTCレジンに担持されているアミノ酸としてGly、Pro、Leuが例示されており、それぞれに対し、Fmoc-Gly-OHとの縮合反応中における、アミノ酸が担持されたCTCレジンの安定性が調査されている。その結果、縮合剤としてN,N’-ジイソプロピルカルボジイミドと、添加剤としてHOAt、Oxyma、もしくはHOBtを組み合わせた縮合反応を実施した場合に、程度の差こそあれ、担持アミノ酸や添加剤の種類によらず収率が低下すること、および収率低下が経時的に増大することが確認されている。
　CTCレジンを用いた固相合成法について、DIC/K-Oxymaの縮合条件は、DIC/Oxymaに比べ、大幅に収率を改善し、同等以上の純度でmyelin basic protein (MBP)の部分配列を与えた、との報告がある（非特許文献9）。
　しかしながら、DIC/K-Oxymaを用いた縮合反応は、アミノ酸と縮合剤から得られる活性エステルを生成させるための前処理時間が数分異なるだけでC末端カルボニル基α位のエピメリ化が大幅に進行したと記載されている。したがって、K-Oxymaを用いたペプチドの固相合成法は、スケールアップに伴う試薬の投入時間の長時間化を鑑みると、スケールアップ時のエピメリ化率の増大に加え、純度の低下も懸念される。
　DIC代用試薬にTOTUが用いられる（非特許文献10）が、塩基性条件下での反応が必要であることから、エピメリ化の可能性がある。さらに、TOTUは、高価な試薬であるため、製造費用を押し上げる要因となり、好ましくない。また、本文献には、premature cleavageによる収率低下に加え、過剰伸長体の副生による純度低下の事例も記載されている。すなわちGlyを固相合成用樹脂に担持させたGly-OCTCを出発原料とし、DIC/HOBtを用いたFmocアミノ酸の伸長反応を実施した際に、Gly-Gly-OCTCの配列をもつ副生成物が得られたと記載されている。この副生物は、2残基目アミノ酸の伸長反応時に、CTCレジンに担持されているGly残基が脱樹脂され、未反応のGly-OCTCと縮合して得られたものと考えられる。
　また、CTCレジンに結合したGlyに対して、2残基目のアミノ酸を伸長することにより、CTCレジン上のペプチドの酸に対する安定性が増すと記載されているが、非特許文献8に記載されている時間延長に伴って収率が低下するという記載と相反している。すなわち、premature cleavageの有効な解決法はいまだ知られていないということができる。以上のことから、CTCレジンを用いた最初の伸長、すなわちジペプチド合成では、収率の低下と担持アミノ酸残基が余剰に取り込まれた過剰伸長体副生による純度低下が課題である。
　アミノ酸の縮合反応に添加剤として、Oxymaを用いる方法は知られている。添加剤としてOxymaを用いると、エピメリ化が抑制できること、アシル化速度が改善することが記載されている（非特許文献11）。
　後述する特許文献1、2、3、4、5、および6や、非特許文献12では、縮合反応によるペプチドの製造において、様々な縮合剤および添加剤が用いられている。しかし、これらの文献には、premature cleavageに例示される、ペプチドの縮合反応における課題については記載されていない。
　特許文献1は従来創薬困難であったtough targetに対する有効な創薬手法を提供する、ペプチドの新規環化法と新規ペプチドやそれらを含むライブラリーに関する。この文献には特定の比率で試薬を使用した実施例があるが、premature cleavageに例示されるペプチドの縮合反応に特有の課題を解決する目的で反応条件が設定されたとの記述はない。
　特許文献2では、CTCレジンを用いたペプチドの固相合成法を実施している。文献中には、過去の製造方法ではペプチド鎖伸長に伴う非典型的な立体配座を取ることが影響し、副反応が進行したこと、およびこの問題の解決のために製造法を改良したことが記載されているのみである。また、ペプチドを構成するアミノ酸にはN置換アミノ酸に代表される非天然アミノ酸は含まれないため、特殊なアミノ酸構造に起因する縮合反応の未達などの不具合に関する記述や、縮合反応の不具合に関する課題を解決するための記載はない。
　特許文献3では、Rink’s amide resinを用いたペプチドの固相合成を、あらかじめC末端アミノ酸を活性エステルに変換する前処理工程（プレアクティベーションとも呼ぶ）を実施し、その後、前処理工程を行った反応液に固相合成用樹脂を加える方法で行っている。しかしながら、特許文献3には、特定配列のペプチド（AMG416もしくはその塩）の製造が記載されているにすぎず、立体障害の大きなアミノ酸同士の縮合反応に例示される、低反応性アミノ酸の伸長反応の改良が開示されたものではない。
　特許文献4は脱Fmoc化反応の改良に関して記載されている。しかし、premature cleavageに例示されるペプチドの縮合反応に特有の課題については記載されてない。また、この文献では使用するアミノ酸が大過剰に必要であるため、天然アミノ酸と比較して入手が困難なN置換アミノ酸に代表される非天然アミノ酸を含むペプチドの製造に適していない。
　特許文献5では、固相合成において酸に対して不安定なN置換アミノ酸を含むペプチドの損傷を回避した穏やかな脱樹脂工程法と、本脱樹脂工程で除去されない、側鎖官能基の保護基について記載されている。しかし、premature cleavageに例示されるペプチドの縮合反応に特有の課題については記載されていない。
　特許文献6では、固相合成の脱保護工程における、脱保護剤の処理方法に関して記載されている。しかし、premature cleavageに例示されるペプチドの縮合反応に特有の課題については記載されていない。
　非特許文献12には、固相法で汎用されるDMFやDCMを用いず、環境調和性の高い代替溶媒を使用した固相法について記載されている。しかし、N置換アミノ酸、α，α-ジ置換アミノ酸、またはβ-分岐アミノ酸に例示される立体障害の大きなアミノ酸の縮合反応は記載されていない。
　以上のように、ペプチドの製造において、縮合反応の収率や、副反応によるペプチド純度の低下は知られていたが、premature cleavageに例示されるペプチドの縮合反応に特有の課題が最近になって知られるようになってきた。従前では、固相合成用樹脂にGly、Pro、およびLeuが担持された場合、縮合反応中に、アミノ酸と固相合成用樹脂との結合が開裂すること、さらに、固相合成用樹脂にGlyが担持された、Gly-OCTCに対し、保護基が導入された天然アミノ酸を縮合させる場合に、目的のアミノ酸配列とは異なる配列を持つ過剰伸長体が得られることが知られているのみであった。
WO2013100132 WO2011006644 WO2015154031 WO2017070512 WO2018225851 WO2019117274
Future Med. Chem., 2009, 1, 1289-1310. Acc Chem. Res., 2008, 41, 1331-1342. Angew. Chem. Int. Ed., 2013, 52, 254-269. Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic Chemistry: Building Blocks, Catalysis and Coupling Chemistry, Volume 3, 2011. Amino Acids, 2018, 50, 39-68. Solid phase peptide synthesis (Bachem社発行) [2020年5月28日検索]、インターネット<URL: https://www.bachem.com/fileadmin/user_upload/pdf/Catalogs_Brochures/Solid_Phase_Peptide_Synthesis.pdf> QSAR Comb. Sci., 2007, 26, 1027-1035. ACS Comb. Sci., 2013, 15, 229-234. Eur. J. Org. Chem. 2013, 6372-6378. Side reactions in Peptide Synthesis, 2015, 1-31, Academic Press. Chem. Eur. J. 2009, 15, 9394-9403. Green. Chem., 2019, 21, 2594-2600.
　本発明者らは、従来のペプチド合成で汎用されている固相法の縮合反応条件を、CTCレジンを用いる非天然アミノ酸を含むペプチド化合物の製造に適用したところ、縮合反応の未達、premature cleavageによる大幅な収率、純度低下という課題に直面した。このような縮合反応時の不具合は、非特許文献8、9、10に記載の天然αアミノ酸どうしの縮合反応だけでなく、N置換アミノ酸や、側鎖のβ位での分岐を有するアミノ酸（β-分岐アミノ酸とも呼ぶ）に例示される、立体障害が大きく、縮合反応の反応性に乏しい配列において、顕著であることを見出した。本発明は、ペプチドの固相合成法の、とくに縮合反応の工程において、premature cleavageを抑制し、かつ反応の未達、エピメリ化の競合などの副反応も抑制可能であり、さらには容易に入手可能な縮合剤と添加剤を用い、希少性の高さゆえ使用量を削減することが好ましい非天然アミノ酸にも適用可能な縮合条件で、高純度のペプチド化合物を高収率で製造する方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するため、主にN置換アミノ酸を固相合成用樹脂に担持させた第一のアミノ酸に対し、第二のアミノ酸を縮合させて、2残基のペプチドを得る、1残基＋1残基合成を鋭意検討した。ペプチド合成に汎用される縮合剤であるDICに例示されるカルボジイミド化合物と、添加剤であるOxymaに例示されるN-ヒドロキシ化合物を用いた縮合反応では、導入するアミノ酸、縮合剤、および添加剤を同じ当量比で用いることが汎用条件とされている。しかし、この汎用条件では、premature cleavageに例示されるペプチドの縮合反応に特有の課題を解決することができなかった。かかる課題を解決すべく鋭意研究を行い、本発明者らは、第一のアミノ酸もしくはペプチド、および/または第二のアミノ酸もしくはペプチドに対する縮合剤、および添加剤の各々の当量比の変更を検討したところ、premature cleavageに例示されるペプチドの縮合反応に特有の課題を解決する方法を見出した。
　すなわち、立体障害が大きいために、アミド化反応が進行しにくい配列、具体的にはN置換アミノ酸、α，α-ジ置換アミノ酸、β-分岐アミノ酸、または側鎖がかさ高いアミノ酸を縮合させて、アミノ酸を伸長する縮合反応で、第一のアミノ酸もしくはペプチド、および／または第二のアミノ酸もしくはペプチドに基づき、計算されたモル比の縮合剤、および添加剤を用いる方法を見出した。本発明の方法はその一局面において、premature cleavageに例示されるペプチドの縮合反応に特有の課題を解決することを見出した。さらに、本発明の方法はその一局面において、目的の配列を持つペプチド化合物が製造可能であることを見出した。さらに、本発明の方法はその一局面において、目的の縮合反応を高収率で行うことができることを見出した。さらに、本発明の方法はその一局面において、エピメリ化に例示される、副反応を抑制できることを見出した。さらに、本発明の方法はその一局面において、アミド化反応が十分な変換率で進行するために、高収率、高純度で目的とするペプチド化合物が得られることを見出した。
　具体的には、N末端に追加されるアミノ酸またはペプチド（すなわち、第二のアミノ酸またはペプチド）に対する、添加剤のモル比を変更することが効果的であり、特にN末端に追加されるアミノ酸またはペプチドに対して添加剤を少なく用いることが良いことを見出した。さらに、縮合剤のモル比を変更することも効果的であり、特にN末端に追加されるアミノ酸またはペプチドに対して縮合剤を過剰に用いることが良いことを見出した。さらに、縮合剤と添加剤の双方のモル比を変更することが、より効果的であることを見出した。本発明の方法は、立体障害の大きなアミノ酸またはペプチドの縮合のみならず、立体障害の小さなアミノ酸またはペプチドの縮合反応でも、アミド化反応が十分な変換率で進行し、高収率、高純度で目的とするペプチド化合物が得られることを見出した。
　すなわち本発明は、非限定の具体的な一態様において以下を包含する。
〔１〕第一のアミノ酸またはペプチドと、第二のアミノ酸またはペプチドとを、添加剤および縮合剤の存在下で縮合させて縮合体を得る工程を含む、ペプチド化合物を製造する方法であって、
　添加剤のモル数が、第二のアミノ酸またはペプチドのモル数よりも少ない、前記方法。
〔２〕第二のアミノ酸またはペプチドに対する添加剤のモル比が0.8以下である、〔1〕に記載の方法。
〔３〕第二のアミノ酸またはペプチドに対する縮合剤のモル比が1.0以上である、〔1〕または〔2〕記載の方法。
〔４〕第二のアミノ酸またはペプチドに対する縮合剤のモル比が1.2～4.0である、〔1〕～〔3〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕第一のアミノ酸またはペプチドに対する第二のアミノ酸またはペプチドのモル比が10以下である、〔1〕～〔4〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕第一のアミノ酸またはペプチドに対する第二のアミノ酸またはペプチドのモル比が1～2であって、第二のアミノ酸またはペプチドに対する添加剤のモル比が0.7以下である、〔1〕～〔5〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕第一のアミノ酸またはペプチドに対する第二のアミノ酸またはペプチドのモル比（第1のモル比）が2以上であって、第二のアミノ酸またはペプチドに対する添加剤のモル比が、第1のモル比－1以下である、〔1〕～〔6〕のいずれかに記載の方法。
〔８〕第一のアミノ酸またはペプチドに対する添加剤のモル比が2.0以下である、〔1〕～〔7〕のいずれかに記載の方法。
〔９〕第一のアミノ酸またはペプチドに対する縮合剤のモル比が1.3以上である、〔1〕～〔8〕のいずれかに記載の方法。
〔１０〕第二のアミノ酸またはペプチド、縮合剤、および添加剤のモル比が、第二のアミノ酸またはペプチド：縮合剤：添加剤＝約2：約4～6：約1である、〔1〕に記載の方法。
〔１１〕第一のアミノ酸またはペプチド、第二のアミノ酸またはペプチド、縮合剤、および添加剤のモル比が、第一のアミノ酸またはペプチド：第二のアミノ酸またはペプチド：縮合剤：添加剤＝約1：約2：約4：約1、約1：約2.4：約7.2：約1.2、または約1：約3：約6：約1.5である、〔1〕に記載の方法。
〔１２〕添加剤が、Oxyma、HOBt、HOOBt、またはHOAtである、〔1〕～〔11〕のいずれかに記載の方法。
〔１３〕縮合剤が、DIC、DCC、EDCI、またはEDCI・HClである、〔1〕～〔12〕のいずれかに記載の方法。
〔１４〕添加剤がOxymaである、〔1〕～〔13〕のいずれかに記載の方法。
〔１５〕前記ペプチド化合物が前記縮合体であるか、あるいは、前記ペプチド化合物がその構造中に前記縮合体を含む、〔1〕～〔14〕のいずれかに記載の方法。
〔１６〕固相法で行われる、〔1〕～〔15〕のいずれかに記載の方法。
〔１７〕第一のアミノ酸またはペプチドが、固相合成用樹脂に担持されている、〔1〕～〔16〕のいずれかに記載の方法。
〔１８〕固相合成用樹脂が、トリチル系樹脂である、〔17〕に記載の方法。
〔１９〕トリチル系樹脂が、CTCレジン、Mmtレジン、またはMttレジンである、〔18〕に記載の方法。
〔２０〕第二のアミノ酸またはペプチドのアミノ基が、保護基で保護されている、〔1〕～〔19〕のいずれかに記載の方法。
〔２１〕保護基が、Fmoc骨格を有する保護基である、〔20〕に記載の方法。
〔２２〕前記工程が、DMF、NMP、DMI、テトラヒドロフラン、2-メチルテトラヒドロフラン、酢酸エチル、ジメチルカーボネート、およびアセトニトリルからなる群から選択される溶媒中で行われる、〔1〕～〔21〕のいずれかに記載の製造方法。
〔２３〕固相合成用樹脂を除去する工程をさらに含む、〔17〕～〔22〕のいずれかに記載の方法。
〔２４〕保護基を除去する工程をさらに含む、〔20〕～〔23〕のいずれかに記載の方法。
〔２５〕第一のアミノ酸、または第一のペプチドのN末端のアミノ酸、および／もしくは第一のペプチドのC末端のアミノ酸が、N-アルキルアミノ酸である、〔1〕～〔24〕のいずれかに記載の方法。
〔２６〕第一のアミノ酸、または第一のペプチドのC末端のアミノ酸が、N-アルキルβアミノ酸である、〔24〕に記載の方法。
〔２７〕第一のアミノ酸、または第一のペプチドのN末端のアミノ酸、および／もしくは第一のペプチドのC末端のアミノ酸が以下の式で表される、〔25〕に記載の方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
式中、
　第一のアミノ酸、または第一のペプチドのN末端のアミノ酸が、式（1）で表されるアミノ酸である場合、R11は水素であり、第一のペプチドのC末端のアミノ酸が、式（1）で表されるアミノ酸である場合、R11は隣接するアミノ酸との結合点を意味し、
　P11は水素またはC1-C6アルキルであり、かつR12は水素、CONR12AR12B、COOR12c、C1-C6アルキル、C3-C8シクロアルキル、C7-C14アラルキル、5～10員ヘテロアリールC1-C6アルキル、保護5～10員ヘテロアリールC1-C6アルキル、C1-C6ヒドロキシアルキル、保護C1-C6ヒドロキシアルキル、C1-C6カルボキシアルキル、保護C1-C6カルボキシアルキル、C1-C6アミノアルキル、保護C1-C6アミノアルキル、C1-C6アルキルチオC1-C6アルキルであるか、あるいは
　P11およびR12は、P11が結合している窒素原子およびR12が結合している炭素原子と一緒になって４～７員飽和複素環を形成し、
　Q12は水素、またはC1-C6アルキルであり
　R12AおよびR12Bは、独立して、C1-C4アルキルであるか、あるいは
　R12AおよびR12Bはそれらが結合している窒素原子と一緒になって、1つまたは複数の追加のヘテロ原子を含んでいてもよい4～8員環を形成し、
　L11は単結合または-CH2-であり、
　第一のアミノ酸、または第一のペプチドのC末端のアミノ酸が、式（1）で表されるアミノ酸である場合、R13は固相合成用樹脂との結合点を意味し、第一のペプチドのN末端のアミノ酸が、式（1）で表されるアミノ酸である場合、R13は隣接するアミノ酸との結合点を意味する。
〔２８〕第一のアミノ酸、または第一のペプチドのN末端のアミノ酸、および／もしくは第一のペプチドのC末端のアミノ酸が、MeAsp-pip、MeAsp-aze、MeAsp-pyrro、MeAsp-mor、MeAsp-mor(26-bicyc)、MeAsp-OtBu、MeAsp-NMe2、MeVal、MeGly、MeAla、MeLeu、D-3-MeAbu、bMeAla、MeIle、MeGly(cPent)、MeChg、MePhe、MeTrp(Boc)、MeThr(Bzl)、MeGlu(OtBu)、MeLys(Boc)、MeMet、Aze(2)、またはAibである、〔27〕に記載の方法。
〔２９〕第二のアミノ酸、または第二のペプチドのC末端のアミノ酸が、α，α-ジ置換アミノ酸、β-分岐アミノ酸、N-アルキルアミノ酸、またはその他の炭素数2以上の側鎖を有するアミノ酸である、〔1〕～〔28〕のいずれかに記載の方法。
〔３０〕β-分岐アミノ酸が、以下の式で表される、〔29〕に記載の方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
式中、
　P21は水素またはC1-C6アルキルであり、
　R21およびR22はそれぞれ独立して、C1-C4アルキル、C1-C6アルコキシ、またはC1-C6アルコキシC1-C6アルキルであるか、あるいは、R21およびR22はこれらが結合する炭素と一緒になって、3～8員脂環式環を形成し、
　第二のアミノ酸が、式（2A）で表されるアミノ酸である場合、R23はアミノ基の保護基との結合点を意味し、第二のペプチドのC末端のアミノ酸が、式（2A）で表されるアミノ酸である場合、R23は隣接するアミノ酸との結合点を意味する。
〔３１〕β-分岐アミノ酸が、MeVal、D-MeVal、Val、Ile、MeIle、MeChg、Chg、MeGly(cPent)、Gly(cPent)、MeGly(cBu)、Gly(cBu)、MeGly(cPr)、Gly(cPr)、MeThr(tBu)、またはThr(tBu)である、〔30〕に記載の方法。
〔３２〕α，α-ジ置換アミノ酸が、以下の式で表される、〔29〕に記載の方法：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
式中、
　P22は水素またはC1-C6アルキルであり、
　R23およびR24は、C1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、または置換されていてもよいC7-C14アラルキルから独立して選択されるか、あるいは
　R23およびR24は、それらが結合している炭素原子と一緒になって3～8員脂環式環または4～7員飽和複素環を形成し、
　第二のアミノ酸が、式（2B）で表されるアミノ酸である場合、R25はアミノ基の保護基との結合点を意味し、第二のペプチドのC末端のアミノ酸が、式（2B）で表されるアミノ酸である場合、R25は隣接するアミノ酸との結合点を意味する。
〔３３〕α，α-ジ置換アミノ酸が、Aib、(Me)Abu、(Me)Leu、(Me)Algly、(Me)Phe、(Me)Phe(3-I)、1-ACPrC、cVal、cLeu、cHex、またはAthpcである、〔32〕に記載の方法。
〔３４〕第二のアミノ酸、または第二のペプチドのC末端のアミノ酸が、N-アルキルアミノ酸である、〔1〕～〔33〕のいずれかに記載の方法。
〔３５〕N-アルキルアミノ酸が、MeAsp-pip、MeAsp-aze、MeAsp-pyrro、MeAsp-mor、MeAsp-mor(26-bicyc)、MeAsp-OtBu、D-3-MeAbu、bMeAla、MeGly、MeAla、MeLeu、MePhe、Aze(2)、Pro、MeAsp-NMe2、MeVal、MeIle、MeChg、MeGly(cPent)、MeGly(cBu)、MeGly(cPr)、MeThr(tBu)、D-MeVal、MeTrp(Boc)、MeThr(Bzl)、MeGlu(OtBu)、MeLys(Boc)、またはMeMetである、〔34〕に記載の方法。
〔３６〕その他の炭素数2以上の側鎖を有するアミノ酸が、Lys(Z)、Glu(OBzl)、またはSer(tBu)である、〔29〕に記載の方法。
〔３７〕〔1〕～〔36〕のいずれかに記載の方法によってペプチド化合物を得る工程、および
　該ペプチド化合物を環化する工程
を含む、環状ペプチド化合物の製造方法。
　本発明により、縮合反応の反応性に乏しい配列を含むペプチド化合物を効率よく製造することができる。具体的には、ペプチド化合物の収率、純度の向上を含めた生産性を向上させることができる。すなわち、本発明の方法は、その一局面において、premature cleavageの抑制効果はもとより、従来法を適用した場合に縮合反応が未達となるアミノ酸配列を含むペプチド化合物や、エピメリ化が拮抗するアミノ酸配列を含むペプチド化合物であっても製造することができるため、ペプチド化合物の収率、および／または純度を向上させることができる。また、本発明の方法は、その一局面において、縮合反応が長時間化しても副反応を最小限に抑制できるため、および／またはN末端に追加されるアミノ酸またはペプチドを最低限の量で用いて反応を完結させることができるため、その使用量を低減することができる。本発明の方法では、試薬の量を低減しても反応が完結するため、従来法とは異なり過剰量の試薬を用いたり、同一条件を繰り返すダブルカップリングを実施する必要がない。その結果、アミド化の難度が高いアミノ酸やペプチドを用いる場合でも、試薬の量を最小限に抑えることができる。これは、高価で希少な非天然アミノ酸残基を含むペプチド化合物の合成には特に適した方法である。また、一局面において、本発明の方法は従来法に比べて、縮合時の溶媒を削減し、高濃度で反応を実施した場合の反応促進効果が大きく、使用するアミノ酸量も削減できるため、縮合時はもちろん、縮合後の試薬洗浄に必要な溶媒量も削減することができる。
　さらには、従来法で最適化された量を上回って、種々の固相合成用樹脂にアミノ酸を担持させた場合、従来法では縮合反応が完結しなかったり、副反応が顕著となることが知られている。しかしながら、そのような量を用いた場合にあっても、本発明の一態様を適用すれば反応を完結させることができる。従って、一回の固相法による製造で産生可能なペプチドの量を増加させることができる。
　本発明は、トリチル系樹脂（例えば、CTCレジン）に担持されたアミノ酸またはペプチドと、伸長させるアミノ酸またはペプチドとの縮合反応を、premature cleavageに例示されるペプチドの縮合反応に特有の課題を解決しつつ、樹脂に担持されたアミノ酸またはペプチドを十分に消費させて行うことができるため、出発原料を目的物に効率的に変換させることができる。
　本明細書において使用される略語を以下に記す。
A%：area%
Alloc：アリルオキシカルボニル
Aze：アゼチジノ
Boc：tert-ブトキシカルボニル
Cbz: ベンジルオキシカルボニル
COMU：(1-シアノ-2-エトキシ-2-オキソエチリデンアミノオキシ)ジメチルアミノ-モルホリノ-カルベニウムヘキサフルオロリン酸塩
CTC：2-クロロトリチル
CTCレジン：Cl-Trt(2-Cl)レジン
DCC：N,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド
DCM：ジクロロメタン
DIC：N,N’-ジイソプロピルカルボジイミド
DMA：N,N-ジメチルアセトアミド
DMF：N,N-ジメチルホルムアミド
DMI：1,3-ジメチル-2-イミダゾリジノン
EDCI：1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド
Fmoc：9-フルオレニルメチルオキシカルボニル
HATU：O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩
HMDS：1,1,1,3,3,3-ヘキサメチルジシラザン
HOAt：1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール
HOBt：1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
HPLC：高速液体クロマトグラフィー
iPr2NEt：N,N-ジイソプロピルエチルアミン
K-Oxyma：(ヒドロキシイミノ)シアノ酢酸エチル、カリウム塩
MeCN：アセトニトリル
MeOH：メタノール
2-MeTHF：２－メチルテトラヒドロフラン
Mmtレジン：4-メトキシトリチルクロリドレジン
Mor：モルホリノ
MTBE：メチルtert-ブチルエーテル
Mttレジン：4-メチルトリチルクロリドレジン
NMP：N-メチル-2-ピロリドン
Oxyma：(ヒドロキシイミノ)シアノ酢酸エチル
PDA：フォトダイオードアレー検出器
Pip：ピペリジノ
Pyrro：ピロリジノ
t-Bu：t-ブチル
Teoc：2-(トリメチルシリル)エトキシカルボニル
TFA：トリフルオロ酢酸
TMSOTf：トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル
TMU：テトラメチル尿素
TOTU：O-[(エトキシカルボニル)シアノメチレンアミノ]-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート
　本明細書において使用されるβ-分岐アミノ酸、α，α-ジ置換アミノ酸、およびN-アルキルアミノ酸の略称とその構造との関係を以下に示す。なお、以下の表では各アミノ酸はFmoc基でアミノ基が保護された形で列挙されているが、Fmoc基が除去されて遊離のアミノ基を有する各アミノ酸やその残基の略称とそれらの構造との関係も以下の表から把握できる。具体的には、例えば、MeAsp(OH)-pipが、下記表のFmoc-MeAsp(OH)-pipからFmoc基が除去された以下の構造を有するアミノ酸であることは当業者に自明であり、そのアミノ酸残基であるMeAsp-pipの構造も当業者に自明である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
（官能基等の定義）
　本明細書における「ハロゲン原子」としては、F、Cl、BrまたはIが例示される。
　本明細書において「アルキル」とは、脂肪族炭化水素から任意の水素原子を1個除いて誘導される1価の基であり、骨格中にヘテロ原子（炭素及び水素原子以外の原子をいう。）または不飽和の炭素-炭素結合を含有せず、水素及び炭素原子を含有するヒドロカルビルまたは炭化水素基構造の部分集合を有する。アルキルは直鎖状のものだけでなく、分枝鎖状のものも含む。アルキルとして具体的には、炭素原子数1～20（C1-C20、以下「Cp-Cq」とは炭素原子数がp～q個であることを意味する）のアルキルであり、好ましくはC1-C10アルキル、より好ましくはC1-C6アルキルが挙げられる。アルキルとして、具体的には、メチル、エチル、n-プロピル、i-プロピル、n-ブチル、s-ブチル、t-ブチル、イソブチル（2-メチルプロピル）、n-ペンチル、s-ペンチル（1-メチルブチル）、t-ペンチル（1，1-ジメチルプロピル）、ネオペンチル（2，2-ジメチルプロピル）、イソペンチル（3-メチルブチル）、3-ペンチル（1-エチルプロピル）、1，2-ジメチルプロピル、2-メチルブチル、n-ヘキシル、1，1，2-トリメチルプロピル、1，2，2-トリメチルプロピル、1，1，2，2-テトラメチルプロピル、1，1-ジメチルブチル、1，2-ジメチルブチル、1，3-ジメチルブチル、2，2-ジメチルブチル、2，3-ジメチルブチル、3，3-ジメチルブチル、1-エチルブチル、2-エチルブチル等が挙げられる。
　本明細書において「アルケニル」とは、少なくとも1個の二重結合（2個の隣接SP2炭素原子）を有する1価の基である。二重結合および置換分（存在する場合）の配置によって、二重結合の幾何学的形態は、エントゲーゲン（E）またはツザンメン（Z）、シスまたはトランス配置をとることができる。アルケニルは、直鎖状のものだけでなく、分枝鎖状ものも含む。アルケニルとして好ましくはC2-C10アルケニル、より好ましくはC2-C6アルケニルが挙げられ、具体的には、たとえば、ビニル、アリル、1-プロペニル、2-プロペニル、1-ブテニル、2-ブテニル（シス、トランスを含む）、3-ブテニル、ペンテニル、3-メチル-2-ブテニル、ヘキセニルなどが挙げられる。
　本明細書において「アルキニル」とは、少なくとも1個の三重結合（2個の隣接SP炭素原子）を有する、1価の基である。アルキニルは、直鎖状のものだけでなく、分枝鎖状のものも含む。アルキニルとして好ましくはC2-C10アルキニル、より好ましくはC2-C6アルキニルが挙げられ、具体的には、たとえば、エチニル、1-プロピニル、プロパルギル、3-ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、3-フェニル-2-プロピニル、3-（2'-フルオロフェニル）-2-プロピニル、2-ヒドロキシ-2-プロピニル、3-（3-フルオロフェニル）-2-プロピニル、3-メチル-（5-フェニル）-4-ペンチニルなどが挙げられる。
　本明細書において「シクロアルキル」とは、飽和または部分的に飽和した環状の1価の脂肪族炭化水素基を意味し、単環、ビシクロ環、スピロ環を含む。シクロアルキルとして好ましくはC3-C8シクロアルキルが挙げられ、具体的には、たとえば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、ビシクロ［2．2．1］ヘプチル、スピロ［3．3］ヘプチルなどが挙げられる。
　本明細書において「アリール」とは1価の芳香族炭化水素環を意味し、好ましくはC6-C10アリールが挙げられる。アリールとして具体的には、たとえば、フェニル、ナフチル（たとえば、1-ナフチル、2-ナフチル）などが挙げられる。
　本明細書において「ヘテロシクリル」とは、炭素原子に加えて1～5個のヘテロ原子を含有する、非芳香族の環状の1価の基を意味する。ヘテロシクリルは、環中に二重およびまたは三重結合を有していてもよく、環中の炭素原子は酸化されてカルボニルを形成してもよく、単環でも縮合環でもよい。環を構成する原子の数は好ましくは4～10であり（4～10員ヘテロシクリル）、より好ましくは4～7である（4～7員ヘテロシクリル）。ヘテロシクリルとしては具体的には、たとえば、アゼチジニル、オキセタニル、ジヒドロフリル、テトラヒドロフリル、ジヒドロピラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジル、テトラヒドロピリミジル、モルホリニル、チオモルホリニル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、1，2-チアジナン、チアジアゾリジニル、アゼチジニル、オキサゾリドン、ベンゾジオキサニル、ベンゾオキサゾリル、ジオキソラニル、ジオキサニル、テトラヒドロピロロ[1,2-c]イミダゾール、チエタニル、3，6-ジアザビシクロ［3．1．1］ヘプタニル、2，5-ジアザビシクロ［2．2．1］ヘプタニル、3-オキサ-8-アザビシクロ[3．2．1]オクタニル、スルタム、2-オキサスピロ[3．3]ヘプチルなどが挙げられる。
　本明細書において「ヘテロアリール」とは、炭素原子に加えて1～5個のヘテロ原子を含有する、芳香族性の環状の1価の基を意味する。環は単環でも、他の環との縮合環でもよく、部分的に飽和されていてもよい。環を構成する原子の数は好ましくは5～10（5～10員ヘテロアリール）であり、より好ましくは5～7（5～7員ヘテロアリール）である。ヘテロアリールとして具体的には、たとえば、フリル、チエニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピリミジル、ピリダジニル、ピラジニル、トリアジニル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾイミダゾリル、インドリル、イソインドリル、インダゾリル、キノリル、イソキノリル、シンノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、ベンゾジオキソリル、インドリジニル、イミダゾピリジルなどが挙げられる。
　本明細書において「アルコキシ」とは、前記定義の「アルキル」が結合したオキシ基を意味し、好ましくはC1-C6アルコキシが挙げられる。アルコキシとして具体的には、たとえば、メトキシ、エトキシ、1-プロポキシ、2-プロポキシ、n-ブトキシ、i-ブトキシ、s-ブトキシ、t-ブトキシ、ペンチルオキシ、3-メチルブトキシなどが挙げられる。
　本明細書において「アルキルチオ」とは、前記定義の「アルキル」が結合したチオ基を意味し、好ましくはC1-C6アルキルチオが挙げられる。アルコキシとして具体的には、たとえば、メチルチオ、エチルチオ、1-プロピルチオ、2-プロピルチオ、n-ブチルチオ、i-ブチルチオ、s-ブチルチオ、t-ブチルチオなどが挙げられる。
　本明細書において「アミノ」とは、狭義には－ＮＨ２を意味し、広義には－ＮＲＲ’を意味し、ここでＲおよびＲ’は独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールから選択されるか、あるいはＲおよびＲ’はそれらが結合している窒素原子と一緒になって環を形成する。アミノとして好ましくは、－ＮＨ２、モノＣ１－Ｃ６アルキルアミノ、ジＣ１－Ｃ６アルキルアミノ、４～８員環状アミノなどが挙げられる。
　本明細書における「アシル（アルカノイル）」は、水素または前記「アルキル」にカルボニル基が結合した基であることを意味し、好ましくは、C1-C6アシル、より好ましくはC2-C4アシルが挙げられる。アシルとして、具体的には、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブタノイルなどが例示される。
　本明細書において「シクロアルコキシ」とは、前記定義の「シクロアルキル」が結合したオキシ基を意味し、好ましくはC3-C8シクロアルコキシが挙げられる。シクロアルコキシとして具体的には、たとえば、シクロプロポキシ、シクロブトキシ、シクロペンチルオキシなどが挙げられる。
　本明細書において「アルキルスルホニル」とは、前記定義の「アルキル」が結合したスルホニル基を意味し、好ましくはC1-C6アルキルスルホニルが挙げられる。アルキルスルホニルとして具体的には、たとえば、メチルスルホニルなどが挙げられる。
　本明細書における「ヒドロキシアルキル」とは、前記定義の「アルキル」の1つ、または複数の水素が水酸基で置換された基を意味し、C1-C6ヒドロキシアルキルが好ましい。ヒドロキシアルキルとして具体的には、たとえば、ヒドロキシメチル、1-ヒドロキシエチル、2-ヒドロキシエチル、2-ヒドロキシ-2-メチルプロピル、5-ヒドロキシペンチルなどが挙げられる。
　本明細書における「カルボキシアルキル」とは、前記定義の「アルキル」の1つ、または複数の水素がカルボキシル基で置換された基を意味し、C1-C6カルボキシアルキルが好ましい。カルボキシアルキルとして具体的には、たとえば、カルボキシメチル、1-カルボキシエチル、2-カルボキシエチルなどが挙げられる。
　本明細書において「保護カルボキシアルキル」とは、前記定義の「カルボキシアルキル」に含まれているカルボキシル基が任意の保護基で保護されている基を意味する。カルボキシル基の保護基として具体的には、メチル基、エチル基、t-Bu基、ベンジル基、トリチル基、クミル基、メトキシトリチル基、2-（トリメチルシリル）エチル基、2，2，2-トリクロロエチル基、アリル基などが挙げられる。
　本明細書における「アミノアルキル」とは、前記定義の「アルキル」の１つまたは複数の水素が前記定義の「アミノ」で置換された基を意味し、C1-C6アミノアルキルが好ましい。アミノアルキルとして具体的には、たとえば、１－ピリジルメチル、２－（１－ピペリジル）エチル、３－（１－ピペリジル）プロピル、４－アミノブチルなどが挙げられる。
　本明細書において「保護アミノアルキル」とは、前記定義の「アミノアルキル」に含まれているアミノ基が任意の保護基で保護されている基を意味する。アミノ基の保護基として具体的には、Fmoc、Boc、Cbz、Alloc、Teoc、トリフルオロアセチル、ペンタフルオロプロピオニル、フタロイル、トシル、2-ニトロベンゼンスルホニル、4-ニトロベンゼンスルホニル、2，4-ジニトロベンゼンスルホニルなどが挙げられる。
　本明細書における「ハロアルキル」とは、前記定義の「アルキル」の1つまたは複数の水素がハロゲンで置換された基を意味し、C1-C6ハロアルキルが好ましく、C1-C6フルオロアルキルがより好ましい。ハロアルキルとして具体的には、たとえば、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、2，2-ジフルオロエチル、2，2，2-トリフルオロエチル、3，3-ジフルオロプロピル、4，4-ジフルオロブチル、5，5-ジフルオロペンチルなどが挙げられる。
　本明細書における「アルコキシアルキル」とは、前記定義の「アルキル」の1つまたは複数の水素が前記定義の「アルコキシ」で置換された基を意味し、C1-C6アルコキシC1-C6アルキルが好ましく、C1-C6アルコキシC1-C2アルキルがより好ましい。アルコキシアルキルとして具体的には、たとえば、メトキシメチル、エトキシメチル、1-プロポキシメチル、2-プロポキシメチル、n-ブトキシメチル、i-ブトキシメチル、s-ブトキシメチル、t-ブトキシメチル、ペンチルオキシメチル、3-メチルブトキシメチル、1-メトキシエチル、2-メトキシエチル、2-エトキシエチルなどが挙げられる。
　本明細書における「アルキルチオアルキル」とは、前記定義の「アルキル」の1つまたは複数の水素が前記定義の「アルキルチオ」で置換された基を意味し、C1-C6アルキルチオC1-C6アルキルが好ましく、C1-C6アルキルチオC1-C2アルキルがより好ましい。アルキルチオアルキルとして具体的には、たとえば、メチルチオメチル、エチルチオメチル、1-プロピルチオメチル、2-プロピルチオメチル、n-ブチルチオメチル、i-ブチルチオメチル、s-ブチルチオメチル、t-ブチルチオメチル、1－メチルチオエチル、2－エチルチオエチルなどが挙げられる。
　本明細書における「ハロアルコキシ」とは、前記定義の「アルコキシ」の1つまたは複数の水素がハロゲンで置換された基を意味し、C1-C6ハロアルコキシが好ましい。ハロアルコキシとして具体的には、たとえば、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメトキシ、2，2-ジフルオロエトキシ、2，2，2-トリフルオロエトキシなどが挙げられる。
　本明細書における「ハロアシル（ハロアルカノイル）」は、前記「ハロアルキル」にカルボニル基が結合した基であることを意味し、好ましくは、C2-C6ハロアシル、より好ましくはC2-C4ハロアシルが挙げられる。ハロアシルとして、具体的には、トリフルオロアセチル、トリクロロアセチル、ペンタフルオロプロピオニル、2,3,3,3-テトラフルオロ-2-(トリフルオロメチル)プロピオニル、3,3,3-トリフルオロ-2-(トリフルオロメチル)プロピオニルなどが例示される。
　本明細書における「シクロアルキルアルキル」とは、前記定義の「アルキル」の1つまたは複数の水素が前記定義の「シクロアルキル」で置換された基を意味し、C3-C8シクロアルキルC1-C6アルキルが好ましく、C3-C6シクロアルキルC1-C2アルキルがより好ましい。シクロアルキルアルキルとして具体的には、たとえば、シクロプロピルメチル、シクロブチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチルなどが挙げられる。
　本明細書における「シクロアルコキシアルキル」とは、前記定義の「アルキル」の1つまたは複数の水素が前記定義の「シクロアルコキシ」で置換された基を意味し、C3-C8シクロアルコキシC1-C6アルキルが好ましく、C3-C6シクロアルコキシC1-C2アルキルがより好ましい。シクロアルコキシアルキルとして具体的には、たとえば、シクロプロポキシメチル、シクロブトキシメチルなどが挙げられる。
　本明細書における「アルキルスルホニルアルキル」とは、前記定義の「アルキル」の1つまたは複数の水素が前記定義の「アルキルスルホニル」で置換された基を意味し、C1-C6アルキルスルホニルC1-C6アルキルが好ましく、C1-C6アルキルスルホニルC1-C2アルキルがより好ましい。アルキルスルホニルアルキルとして具体的には、たとえば、メチルスルホニルメチル、2-（メチルスルホニル）エチルなどが挙げられる。
　本明細書において「アラルキル（アリールアルキル）」とは、前記定義の「アルキル」の少なくとも一つの水素原子が前記定義の「アリール」で置換された基を意味し、C7-C14アラルキルが好ましく、C7-C10アラルキルがより好ましい。アラルキルとして具体的には、たとえば、ベンジル、フェネチル、3-フェニルプロピルなどが挙げられる。
　本明細書において「ヘテロアリールアルキル」とは、前記定義の「アルキル」の少なくとも一つの水素原子が前記定義の「ヘテロアリール」で置換された基を意味し、5～10員ヘテロアリールC1-C6アルキルが好ましく、5～10員ヘテロアリールC1-C2アルキルがより好ましい。ヘテロアリールアルキルとして具体的には、たとえば、3-チエニルメチル、4-チアゾリルメチル、2-ピリジルメチル、3-ピリジルメチル、4-ピリジルメチル、2-（2-ピリジル）エチル、2-（3-ピリジル）エチル、2-（4-ピリジル）エチル、2-（6-キノリル）エチル、2-（7-キノリル）エチル、2-（6-インドリル）エチル、2-（5-インドリル）エチル、2-（5-ベンゾフラニル）エチルなどが挙げられる。
　本明細書において「保護ヘテロアリールアルキル」とは、前記定義の「ヘテロアリールアルキル」に含まれている１つまたは複数の官能基、例えば、アミノ基が任意の保護基で保護された基を意味する。保護基として具体的には、Fmoc、Boc、Cbz、Alloc、Teoc、トリフルオロアセチル、ペンタフルオロプロピオニル、フタロイル、トシル、2-ニトロベンゼンスルホニル、4-ニトロベンゼンスルホニル、2，4-ジニトロベンゼンスルホニルなどが挙げられる。
　本明細書において「カルボキシル基の保護基」には、アルキルエステル型の保護基、ベンジルエステル型の保護基、置換されたアルキルエステル型の保護基などが挙げられる。カルボキシル基の保護基として具体的には、メチル基、エチル基、t-Bu基、ベンジル基、トリチル基、クミル基、メトキシトリチル基、2-（トリメチルシリル）エチル基、2，2，2-トリクロロエチル基、アリル基などが例示される。
　本明細書において「アミノ基の保護基」には、カルバメート型の保護基、アミド型の保護基、イミド型の保護基、スルホンアミド型の保護基などが挙げられる。アミノ基の保護基として具体的には、Fmoc、Boc、Cbz、Alloc、Teoc、トリフルオロアセチル、ペンタフルオロプロピオニル、フタロイル、トシル、2-ニトロベンゼンスルホニル、4-ニトロベンゼンスルホニル、2，4-ジニトロベンゼンスルホニルなどが例示される。
　本明細書における「脂環式環」は、非芳香族炭化水素環を意味する。脂環式環は、環中に不飽和結合を有してもよく、2個以上の環を有する多環性の環でもよい。また環を構成する炭素原子は酸化されてカルボニルを形成してもよい。脂環式環として好ましくは3～8員脂環式環が挙げられ、具体的には、たとえば、シクロプロパン環、シクロブタン環、シクロペンタン環、シクロヘキサン環、シクロヘプタン環、シクロオクタン環、ビシクロ［2．2．1］ヘプタン環などが挙げられる。
　本明細書における「飽和複素環」は、炭素原子に加えて1～5個のヘテロ原子を含有し、環中に二重結合および／または三重結合を含まない、非芳香族の複素環を意味する。飽和複素環は単環でもよく、他の環、例えば、ベンゼン環などの芳香環と縮合環を形成してもよい。飽和複素環として好ましくは4～7員飽和複素環が挙げられ、具体的には、たとえば、アゼチジン環、オキセタン環、テトラヒドロフラン環、テトラヒドロピラン環、モルホリン環、チオモルホリン環、ピロリジン環、4-オキソピロリジン環、ピペリジン環、4-オキソピペリジン環、ピペラジン環、ピラゾリジン環、イミダゾリジン環、オキサゾリジジン環、イソオキサゾリジン環、チアゾリジン環、イソチアゾリジン環、チアジアゾリジン環、サゾリドン環、ジオキソラン環、ジオキサン環、チエタン環、オクタヒドロインドール環、インドリン環などが挙げられる。
　本明細書において、「ペプチド」とは、1つまたはそれ以上の天然アミノ酸および／または非天然アミノ酸がアミド結合および／またはエステル結合により連結されているペプチドをいう。ペプチドとして好ましくは、1～15のアミノ酸残基を含むペプチドであり、より好ましくは5～12のアミノ酸残基からなるペプチドである。
　本明細書における「ペプチド化合物」は、天然アミノ酸および／または非天然アミノ酸がアミド結合あるいはエステル結合によって連結されるペプチド化合物であれば特に限定されないが、好ましくは5～30残基、より好ましくは8～15残基、さらに好ましくは9～13残基のペプチド化合物である。本発明において合成されるペプチド化合物は、1つのペプチド中に少なくとも3つのN置換アミノ酸を含むことが好ましく、少なくとも5つ以上のN置換アミノ酸を含むことがより好ましい。これらのN置換アミノ酸は、ペプチド化合物中に連続して存在していても、不連続に存在していてもよい。本発明におけるペプチド化合物は、直鎖状でも環状でもよく、環状ペプチド化合物が好ましい。
　本明細書における「環状ペプチド化合物」は、直鎖ペプチド化合物のN末端側の基とC末端側の基とを環化することにより得ることができる環状のペプチド化合物である。環化は、アミド結合のような炭素-窒素結合による環化、エステル結合やエーテル結合のような炭素-酸素結合による環化、チオエーテル結合のような炭素-硫黄結合による環化、炭素-炭素結合による環化、あるいは複素環構築による環化など、どのような形態であってもよい。これらのうちでは、アミド結合あるいは炭素-炭素結合などの共有結合を介した環化が好ましく、側鎖のカルボキシル基とN末端の主鎖のアミノ基によるアミド結合を介した環化がより好ましい。環化に用いられるカルボキシル基やアミノ基等の位置は、主鎖上のものでも、側鎖上のものでもよく、環化可能な位置にあれば、特に制限されない。
　ペプチド化合物の「環化」とは、4以上のアミノ酸残基を含む環状部を形成することを意味する。本明細書における環状ペプチド化合物の環状部に含まれるアミノ酸の数は特に限定されないが、4～20残基、5～15残基、6～13残基が例示される。直鎖状のペプチド化合物を環状ペプチド化合物に変換する方法は、Comprehensive Organic Transformations、A Guide to Functional Group Preparations, 3rd Edition、(R. C. Larock著）、またはMarch's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure、7th Edition、(M. B. Smith, J. March著）などに記載の方法により、分子内で結合形成反応を行うことにより実施することができる。結合形成反応の後に、さらに官能基変換反応を行うこともできる。結合形成反応は、カルボン酸とアミンから形成されるC(O)-N結合、酸素原子を利用したC-O-C結合、C(O)-O結合、C(S)-O結合、硫黄原子を利用したC(O)-S結合、C(S)-S結合、C-S-S-C結合、C-S-C結合、C-S(O)-C結合、C-S(O2)-C結合、窒素原子を利用した、C-N-C結合、C=N-C結合、N-C(O)-N結合、N-C(S)N結合、C(S)-N結合などが例示される。さらに、鈴木反応、Heck反応、Sonogashira反応等の遷移金属を触媒としたC-C結合の形成反応などが挙げられる。結合形成反応の後に、さらに行う官能基変換反応として、酸化反応または還元反応が例示される。具体的には硫黄原子を酸化して、スルホキシド基やスルホン基に変換する反応が例示される。また、炭素-炭素結合のうち、三重結合や二重結合を還元して、二重結合または単結合に変換する還元反応が例示される。2つのアミノ酸がアミノ酸の主鎖において結合すると、ペプチド結合により閉環構造が形成されるが、2つのアミノ酸の側鎖同士、側鎖と主鎖の結合等により、2つのアミノ酸間の共有結合が形成されてもよい。
　本明細書において「1つまたは複数の」とは、1つまたは2つ以上の数を意味する。「1つまたは複数の」が、ある基の置換基に関連する文脈で用いられる場合、この用語は、1つからその基が許容する置換基の最大数までの数を意味する。「1つまたは複数の」として具体的には、たとえば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、および／またはそれより大きい数が挙げられる。
　本明細書において「固相合成用樹脂」は、固相法によるペプチド化合物の合成に用いることができるものであれば、特に限定されない。このような固相合成用樹脂として、具体的には、例えば、CTCレジン、NovaSyn TGTレジン（TGTレジン）、Wangレジン、SASRINレジン、トリチルクロリドレジン（Trtレジン）、4-メチルトリチルクロリドレジン（Mttレジン）、4-メトキシトリチルクロリドレジン（Mmtレジン）などの酸性条件で除去可能なものが挙げられる。樹脂は、用いられるアミノ酸の官能基に合わせて適宜選択することができる。例えば、アミノ酸の官能基としてカルボキシル基（主鎖カルボキシル基、もしくは、AspやGluに代表される側鎖カルボキシル基）、又は、芳香環上のヒドロキシ基（Tyrに代表されるフェノール基）を用いる場合には、樹脂として、トリチルクロリドレジン（Trtレジン）もしくは2-クロロトリチルクロリドレジン（CTCレジン）を用いることが好ましい。アミノ酸の官能基として脂肪族ヒドロキシ基（SerやThrに代表される脂肪族アルコール基）を用いる場合には、樹脂として、トリチルクロリドレジン（Trtレジン）、2-クロロトリチルクロリドレジン（CTCレジン）もしくは4-メチルトリチルクロリドレジン（Mttレジン）を用いることが好ましい。なお、本明細書中にて、樹脂をレジンと記載する場合もある。
　樹脂を構成するポリマーの種類についても特に限定されない。ポリスチレンで構成される樹脂の場合には、100-200meshもしくは200-400meshのいずれを用いても良い。また、架橋率についても特に限定されないが、1% DVB（ジビニルベンゼン）架橋のものが好ましい。また、樹脂を構成するポリマーの種類として、TentaGel（登録商標）、またはChemMatrix（登録商標）が挙げられる。
　本明細書に記載の化合物の製造において、定義した基が実施方法の条件下で望まない化学的変換を受けてしまう場合、例えば、官能基の保護、脱保護等の手段を用いることにより、該化合物を製造することができる。ここで保護基の選択および脱着操作は、例えば、「Greene’s,“Protective Groups in Organic Synthesis”（第5版，John Wiley & Sons 2014）」に記載の方法を挙げることができ、これらを反応条件に応じて適宜用いればよい。また、必要に応じて置換基導入等の反応工程の順序を変えることもできる。
　本明細書において、「置換されていてもよい」という修飾語句が付与されている場合、その置換基としては、例えば、アルキル、アルコキシ、フルオロアルキル、フルオロアルコキシ、オキソ、アミノカルボニル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ハロゲン、ニトロ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、シアノ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、ホルミルなどが例示される。
　さらにこれらそれぞれに置換基が付与されていてもよく、それら置換基も制限されず、例えば、ハロゲン原子、酸素原子、硫黄原子、窒素原子、ホウ素原子、ケイ素原子、又はリン原子を含む任意の置換基の中から独立して1つ又は2つ以上自由に選択されてよい。すなわち、置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、シクロアルキルなどが例示される。
　本明細書に記載の化合物は、その塩またはそれらの溶媒和物であることができる。化合物の塩には、例えば、塩酸塩；臭化水素酸塩；ヨウ化水素酸塩；リン酸塩；ホスホン酸塩；硫酸塩；メタンスルホン酸塩、p-トルエンスルホン酸塩などのスルホン酸塩；酢酸塩、クエン酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、サリチル酸塩などのカルボン酸塩；または、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩、アルキルアンモニウム塩、ジアルキルアンモニウム塩、トリアルキルアンモニウム塩、テトラアルキルアンモニウム塩などのアンモニウム塩などが含まれる。これらの塩は、例えば、化合物と、酸または塩基とを接触させることにより製造される。化合物の溶媒和物とは、溶液中で溶質分子が溶媒分子を引き付けて、一つの分子集団をつくる現象をいい、溶媒が水であれば水和物と言う。本明細書に記載の化合物は、アルコール（例えば、メタノール、エタノール、1-プロパノール、2-プロパノールなど）、ジメチルホルムアミド、またはジグリムなどの有機溶媒、または水などから選択される単独の溶媒との溶媒和物でも、複数の溶媒との溶媒和物でもよい。
　本明細書における「アミノ酸」には、天然アミノ酸、及び非天然アミノ酸（アミノ酸誘導体ということがある）が含まれる。また本明細書において「アミノ酸」はアミノ酸残基を意味することがある。本明細書における「天然アミノ酸」とは、Gly、Ala、Ser、Thr、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、His、Glu、Asp、Gln、Asn、Cys、Met、Lys、Arg、Proを指す。非天然アミノ酸（アミノ酸誘導体）は特に限定されないが、β-アミノ酸、D型アミノ酸、N置換アミノ酸、α，α-ジ置換アミノ酸、側鎖が天然アミノ酸と異なるアミノ酸、ヒドロキシカルボン酸などが例示される。本明細書におけるアミノ酸としては、任意の立体配置が許容される。アミノ酸の側鎖の選択は特に制限を設けないが、水素原子の他にも例えばアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基、ヘテロアラルキル基、シクロアルキル基、スピロ結合したシクロアルキル基から自由に選択される。それぞれには置換基が付与されていてもよく、それら置換基も制限されず、例えば、ハロゲン原子、O原子、S原子、N原子、B原子、Si原子、又はP原子を含む任意の置換基の中から独立して1つ又は2つ以上自由に選択されてよい。すなわち、置換されていてもよいアルキル基、アルコキシ基、アルコキシアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基、シクロアルキル基など、または、オキソ、アミノカルボニル、ハロゲン原子などが例示される。非限定の一態様において、本明細書におけるアミノ酸は、同一分子内にカルボキシル基とアミノ基を有する化合物であってよい（この場合であっても、プロリン、ヒドロキシプロリンのようなイミノ酸もアミノ酸に含まれる）。
　ハロゲン由来の置換基としては、フルオロ（-F）、クロロ（-Cl）、ブロモ（-Br）、ヨウド（-I）などが挙げられる。
　O原子由来の置換基としては、ヒドロキシ（-OH）、オキシ（-OR）、カルボニル（-C＝O-R）、カルボキシル（-CO2H）、オキシカルボニル（-C＝O-OR）、カルボニルオキシ（-O-C＝O-R）、チオカルボニル（-C＝O-SR）、カルボニルチオ基（-S-C＝O-R）、アミノカルボニル（-C＝O-NHR）、カルボニルアミノ（-NH-C＝O-R）、オキシカルボニルアミノ（-NH-C＝O-OR）、スルホニルアミノ（-NH-SO2-R）、アミノスルホニル（-SO2-NHR）、スルファモイルアミノ（-NH-SO2-NHR）、チオカルボキシル（-C（＝O）-SH）、カルボキシルカルボニル（-C（＝O）-CO2H）が挙げられる。
　オキシ（-OR）の例としては、アルコキシ、シクロアルコキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アラルキルオキシなどが挙げられる。
　カルボニル（-C＝O-R）の例としては、ホルミル（-C＝O-H）、アルキルカルボニル、シクロアルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルキニルカルボニル、アリールカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、アラルキルカルボニルなどが挙げられる。
　オキシカルボニル（-C＝O-OR）の例としては、アルキルオキシカルボニル、シクロアルキルオキシカルボニル、アルケニルオキシカルボニル、アルキニルオキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシカルボニル、アラルキルオキシカルボニルなどが挙げられる。
　カルボニルオキシ（-O-C＝O-R）の例としては、アルキルカルボニルオキシ、シクロアルキルカルボニルオキシ、アルケニルカルボニルオキシ、アルキニルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、ヘテロアリールカルボニルオキシ、アラルキルカルボニルオキシなどが挙げられる。
　チオカルボニル（-C＝O-SR）の例としては、アルキルチオカルボニル、シクロアルキルチオカルボニル、アルケニルチオカルボニル、アルキニルチオカルボニル、アリールチオカルボニル、ヘテロアリールチオカルボニル、アラルキルチオカルボニルなどが挙げられる。
　カルボニルチオ（-S-C＝O-R）の例としては、アルキルカルボニルチオ、シクロアルキルカルボニルチオ、アルケニルカルボニルチオ、アルキニルカルボニルチオ、アリールカルボニルチオ、ヘテロアリールカルボニルチオ、アラルキルカルボニルチオなどが挙げられる。
　アミノカルボニル（-C＝O-NHR）の例としては、アルキルアミノカルボニル、シクロアルキルアミノカルボニル、アルケニルアミノカルボニル、アルキニルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、ヘテロアリールアミノカルボニル、アラルキルアミノカルボニルなどが挙げられる。これらに加えて、-C＝O-NHR中のN原子と結合したH原子が、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された基が挙げられる。
　カルボニルアミノ（-NH-C＝O-R）の例としては、アルキルカルボニルアミノ、シクロアルキルカルボニルアミノ、アルケニルカルボニルアミノ、アルキニルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、ヘテロアリールカルボニルアミノ、アラルキルカルボニルアミノなどが挙げられる。これらに加えて-NH-C＝O-R中のN原子と結合したH原子が、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された基が挙げられる。
　オキシカルボニルアミノ（-NH-C＝O-OR）の例としては、アルコキシカルボニルアミノ、シクロアルコキシカルボニルアミノ、アルケニルオキシカルボニルアミノ、アルキニルオキシカルボニルアミノ、アリールオキシカルボニルアミノ、ヘテロアリールオキシカルボニルアミノ、アラルキルオキシカルボニルアミノなどが挙げられる。これらに加えて、-NH-C＝O-OR中のN原子と結合したH原子がアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された基が挙げられる。
　スルホニルアミノ（-NH-SO2-R）の例としては、アルキルスルホニルアミノ、シクロアルキルスルホニルアミノ、アルケニルスルホニルアミノ、アルキニルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、ヘテロアリールスルホニルアミノ、アラルキルスルホニルアミノなどが挙げられる。これらに加えて、-NH-SO2-R中のN原子と結合したH原子がアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された基が挙げられる。
　アミノスルホニル（-SO2-NHR）の例としては、アルキルアミノスルホニル、シクロアルキルアミノスルホニル、アルケニルアミノスルホニル、アルキニルアミノスルホニル、アリールアミノスルホニル、ヘテロアリールアミノスルホニル、アラルキルアミノスルホニルなどが挙げられる。これらに加えて、-SO2-NHR中のN原子と結合したH原子がアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された基が挙げられる。
　スルファモイルアミノ（-NH-SO2-NHR）の例としては、アルキルスルファモイルアミノ、シクロアルキルスルファモイルアミノ、アルケニルスルファモイルアミノ、アルキニルスルファモイルアミノ、アリールスルファモイルアミノ、ヘテロアリールスルファモイルアミノ、アラルキルスルファモイルアミノなどが挙げられる。さらに、-NH-SO2-NHR中のN原子と結合した2つのH原子はアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、およびアラルキルからなる群より独立して選択される置換基で置換されていてもよく、またこれらの2つの置換基は環を形成しても良い。
　S原子由来の置換基として、チオール（-SH）、チオ（-S-R）、スルフィニル（-S＝O-R）、スルホニル（-S（O）2-R）、スルホ（-SO3H）、ペンタフルオロスルファニル（-SF5）が挙げられる。
　チオ（-S-R）の例としては、アルキルチオ、シクロアルキルチオ、アルケニルチオ、アルキニルチオ、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、アラルキルチオなどの中から選択される。
　スルフィニル（-S＝O-R）の例としては、アルキルスルフィニル、シクロアルキルスルフィニル、アルケニルスルフィニル、アルキニルスルフィニル、アリールスルフィニル、ヘテロアリールスルフィニル、アラルキルスルフィニルなどが挙げられる。
　スルホニル（-S（O）2-R）の例としては、アルキルスルホニル、シクロアルキルスルホニル、アルケニルスルホニル、アルキニルスルホニル、アリールスルホニル、ヘテロアリールスルホニル、アラルキルスルホニルなどが挙げられる。
　N原子由来の置換基として、アジド（-N3、「アジド基」ともいう）、シアノ（-CN）、1級アミノ（-NH2）、2級アミノ（-NH-R）、3級アミノ（-NR（R'））、アミジノ（-C（＝NH）-NH2）、置換アミジノ（-C（＝NR）-NR'R''）、グアニジノ（-NH-C（＝NH）-NH2）、置換グアニジノ（-NR-C（＝NR'''）-NR'R''）、アミノカルボニルアミノ（-NR-CO-NR'R''）が挙げられる。
　2級アミノ（-NH-R）の例としては、アルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、アルケニルアミノ、アルキニルアミノ、アリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、アラルキルアミノなどが挙げられる。
　3級アミノ（-NR（R'））の例としては、例えばアルキル（アラルキル）アミノなど、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルなどの中からそれぞれ独立して選択される、任意の2つの置換基を有するアミノ基が挙げられ、これらの任意の2つの置換基は環を形成しても良い。
　置換アミジノ（-C（＝NR）-NR'R''）の例としては、N原子上の3つの置換基R、R'、およびR''が、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルの中からそれぞれ独立して選択された基、例えばアルキル（アラルキル）（アリール）アミジノなどが挙げられる。
　置換グアニジノ（-NR-C（＝NR'''）-NR'R''）の例としては、R、R'、R''、およびR'''が、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルの中からそれぞれ独立して選択された基、あるいはこれらが環を形成した基などが挙げられる。
　アミノカルボニルアミノ（-NR-CO-NR'R''）の例としては、R、R'、およびR''が、水素原子、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルの中からそれぞれ独立して選択された基、あるいはこれらは環を形成した基などが挙げられる。
　B原子由来の置換基として、ボリル（-BR（R'））やジオキシボリル（-B（OR）（OR'））などが挙げられる。これらの2つの置換基RおよびR'は、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルなどの中からそれぞれ独立して選択されるか、あるいはこれらは環を形成してもよい。具体的には、環状ボリル基が挙げられ、さらに具体的には、ピナコラートボリル基、ネオペンタンジオラートボリル基、カテコラートボリル基などが挙げられる。
　本明細書におけるN置換アミノ酸の窒素原子上の置換基として具体的には、アルキル、C1-C6アルキル、C1-C4アルキル、メチル、C7-C14アラルキル、ベンジル、フェネチルなどが例示される。
　アミノ酸の主鎖アミノ基は、非置換（-NH2）でも、置換されていてもよい（即ち、-NHR。ここで、Rは置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、シクロアルキルを示し、またプロリンのようにN原子に結合した炭素鎖とα位の炭素原子とが環を形成していてもよい。）。このような主鎖アミノ基が置換されているアミノ酸を、本明細書において「N置換アミノ酸」と称する場合がある。本明細書における「N置換アミノ酸」としては、好ましくはN-アルキルアミノ酸、N-C1-C6アルキルアミノ酸、N-C1-C4アルキルアミノ酸、N-メチルアミノ酸、N-C7-C14アラルキルアミノ酸、N-ベンジルアミノ酸、N-フェネチルアミノ酸が例示されるが、これらに限定されるものではない。
　本明細書における「アミノ酸」にはそれぞれに対応する全ての同位体を含む。「アミノ酸」の同位体は、少なくとも1つの原子が、原子番号（陽子数）が同じで、質量数（陽子と中性子の数の和）が異なる原子で置換されたものである。本明細書の「アミノ酸」に含まれる同位体の例としては、水素原子、炭素原子、窒素原子、酸素原子、リン原子、硫黄原子、フッ素原子、塩素原子などがあり、それぞれ、2H、3H、13C、14C、15N、17O、18O、32P、35S、18F、36Cl等が含まれる。
　本明細書において、数値範囲を示す「～」とはその両端の値を含み、例えば、「A～B」は、A以上であり、かつB以下である数値範囲を意味する。
　本明細書において、「約」という用語は、数値と組み合わせて使用される場合、その数値の＋10％および－10％の値範囲を意味する。
　本明細書において、「および/または」との用語の意義は、「および」と「または」が適宜組み合わされたあらゆる組合せを含む。具体的には、例えば、「A、B、および/またはC」には、以下の７通りのバリエーションが含まれる；
(i) A、(ii) B、(iii) C、(iv) AおよびB、(v) AおよびC、(vi) BおよびC、(vii) A、B、およびC。
（製造方法）
　本発明は、第一のアミノ酸またはペプチドと、第二のアミノ酸またはペプチドとを、添加剤および縮合剤の存在下で縮合させて縮合体を得る工程を含む、ペプチド化合物を製造する方法であって、添加剤のモル数が、第二のアミノ酸またはペプチドのモル数よりも少ない方法に関する。
　ある態様において、本発明の製造方法により得られるペプチド化合物は、固相法または液相法によるアミノ酸ないしはペプチドの伸長工程の中間体でも最終産物でもよい。伸長工程は、所望のペプチド化合物のアミノ酸配列の長さに応じて複数回行うことができ、本発明による縮合工程は、かかる伸長工程中に少なくとも１回含まれ、複数回含まれてもよい。伸長工程中、本発明による縮合工程以外の縮合工程には本技術分野に公知の方法を用いることができる。
　ある態様において、本発明の縮合工程が、伸長工程の最終工程に用いられる場合、本発明の縮合工程により得られた縮合体が、所望の配列を有するペプチド化合物となり得る。一方、本発明の縮合工程に加えて公知の方法によりさらなる伸長が行われ、所望の配列を有するペプチド化合物が得られる場合、本発明の縮合工程により得られた縮合体は、ペプチド化合物の部分構造としてその中に含まれる。
　本発明において、「第一のアミノ酸」は、天然アミノ酸でも非天然アミノ酸でもよい。
　本発明において、「第一のペプチド」は、天然アミノ酸のみから構成されていても、非天然アミノ酸のみから構成されていても、天然および非天然アミノ酸の任意の組み合わせから構成されていてもよい。
　ある態様において、第一のアミノ酸または第一のペプチドは、アミノ酸であることが好ましく、非天然のアミノ酸であることがより好ましい。
　ある態様において、第一のアミノ酸または第一のペプチドは、主鎖アミノ基が保護されていないアミノ酸またはペプチドであってもよい。保護されていない主鎖アミノ基は、第一のアミノ酸または第一のペプチドのN末端にあることが好ましい。
　本発明の縮合反応に固相法が用いられる場合、第一のアミノ酸または第一のペプチドのC末端のアミノ酸は、固相合成用樹脂（レジン）に担持されている。この場合、第一のアミノ酸または第一のペプチドのN末端および/もしくはC末端のアミノ酸が、非天然アミノ酸、とりわけN-アルキルアミノ酸などのN置換アミノ酸であると、premature cleavageに起因して、従来法では目的の縮合反応が十分に進行しない場合がある。これは、固相合成用樹脂とアミノ酸とを結合する樹脂リンカーにトリチル系の原子団が用いられている場合に顕著である。このような場合でも、本発明の方法を用いることで効率的に縮合反応を進行させることが可能である。
　ある態様において、第一のアミノ酸または第一のペプチドのN末端および/もしくはC末端のアミノ酸がN-アルキルアミノ酸である場合、N-アルキルアミノ酸としては、側鎖が天然アミノ酸とは異なるものや、α、β、またはγアミノ酸などが挙げられ、N-アルキルβアミノ酸が好ましく例示される。
　第一のアミノ酸または第一のペプチドのN末端のアミノ酸および／もしくは第一のペプチドのC末端のアミノ酸として、具体的には、以下の式（1）を有するものが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
　第一のアミノ酸または第一のペプチドのN末端のアミノ酸が、式（1）で表されるアミノ酸である場合、R11は水素である。一方、第一のペプチドのC末端のアミノ酸が式（1）で表されるアミノ酸である場合、R11は隣接するアミノ酸との結合点を意味し、通常、式（1）のアミノ酸は、当該部位において隣接するアミノ酸とアミド結合を形成する。
　ある態様において、式（1）中、P11は水素またはC1-C6アルキルであり、かつR12は水素、CONR12AR12B、COOR12c、C1-C6アルキル、C3-C8シクロアルキル、C7-C14アラルキル、5～10員ヘテロアリールC1-C6アルキル、保護5～10員ヘテロアリールC1-C6アルキル、C1-C6ヒドロキシアルキル、保護C1-C6ヒドロキシアルキル、C1-C6カルボキシアルキル、保護C1-C6カルボキシアルキル、C1-C6アミノアルキル、保護C1-C6アミノアルキル、C1-C6アルキルチオC1-C6アルキルである。
　P11は、水素またはメチルが好ましく、メチルがより好ましい。
　R12がCONR12AR12Bである場合、R12AおよびR12Bは、独立して、C1-C4アルキル（好ましくは、メチル、エチル）であるか、またはR12AおよびR12Bはそれらが結合している窒素原子と一緒になって、1つまたは複数の追加のヘテロ原子を含んでいてもよい4～8員環（好ましくは、ピペリジン環、アゼチジン環、ピロリジン環、モルホリン環、または3-オキサ-8-アザビシクロ[3.2.1]オクタン環）を形成する。
　R12がCOOR12Cである場合、R12Cは、アリル、t-ブチル、またはベンジルである。
　R12がC1-C6アルキルである場合、好ましくは、R12はメチル、イソプロピル、またはイソブチルである。
　R12がC3-C8シクロアルキルである場合、好ましくは、R12はシクロペンチル、またはシクロヘキシルである。
　R12がC7-C14アラルキルである場合、好ましくは、R12はベンジルまたはフェネチルである。
　R12が5～10員ヘテロアリールC1-C6アルキルである場合、好ましくは、R12は5～10員ヘテロアリールメチルまたは5～10員ヘテロアリールエチルである。また、R12が保護5～10員ヘテロアリールC1-C6アルキルである場合、R12は、前述の基に含まれる官能基、例えばアミノ基が、Boc基で保護されているものが好ましい。
　R12がC1-C6ヒドロキシアルキルである場合、好ましくは、R12はヒドロキシメチル、１－ヒドロキシエチル、２－ヒドロキシエチルであり、１－ヒドロキシエチルがより好ましい。また、R12が保護C1-C6ヒドロキシアルキルである場合、R12は、前述の基が水酸基の保護基、例えば、Bzl基やtBu基で保護されているものが好ましい。
　R12がC1-C6カルボキシアルキルである場合、好ましくは、R12はカルボキシメチル、１－カルボキシエチル、２－カルボキシエチルであり、２－カルボキシエチルがより好ましい。また、R12が保護C1-C6カルボキシアルキルである場合、R12は、前述の基がカルボキシル基の保護基、例えば、Bzl基やtBu基で保護されているものが好ましい。
　R12がC1-C6アミノアルキルである場合、好ましくは、R12は４－アミノブチルである。また、R12が保護C1-C6アミノアルキルである場合、R12は、前述の基がアミノ基の保護基、例えば、Boc基で保護されているものが好ましい。
　R12がC1-C6アルキルチオC1-C6アルキルである場合、好ましくは、R12は２－メチルチオエチルである。
　ある態様において、P11およびR12は、P11が結合している窒素原子およびR12が結合している炭素原子と一緒になって４～７員飽和複素環を形成する。４～７員飽和複素環としてアゼチジン環、ピロリジン環、ピペリジン環、ピペラジン環、モルホリン環が好ましい。
　式（1）中、Q12は水素、またはC1-C6アルキルであり、好ましくは水素またはメチルである。
　式（1）中、L11は単結合または-CH2-である。
　第一のアミノ酸または第一のペプチドのC末端のアミノ酸が、式（1）中で表されるアミノ酸である場合、R13は固相合成用樹脂との結合点を意味する。一方、第一のペプチドのN末端のアミノ酸が、式（1）で表されるアミノ酸である場合、R13は隣接するアミノ酸との結合点を意味し、通常、式（1）のアミノ酸は、当該部位において隣接するアミノ酸とアミド結合を形成する。
　第一のアミノ酸または第一のペプチドのN末端および/もしくはC末端のアミノ酸としてより具体的には、例えば、MeAsp-pip、MeAsp-aze、MeAsp-pyrro、MeAsp-mor、MeAsp-mor(26-bicyc)、MeAsp-OtBu、MeAsp-NMe2、MeVal、MeGly、MeAla、MeLeu、D-3-MeAbu、bMeAla、MeIle、MeGly(cPent)、MeChg、MePhe、MeTrp(Boc)、MeThr(Bzl)、MeGlu(OtBu)、MeLys(Boc)、MeMet、Aze(2)、Aibなどが挙げられる。
　本発明の縮合工程によれば、従来法ではペプチドの樹脂からの脱落が生じるような高い担持量（例えば、Fmoc定量法に基づき0.5 mmol/g以上）で、第一のアミノ酸またはペプチドを固相合成樹脂に担持した場合でも、その担持量を維持したまま縮合体を得ることができる。
　したがって、本発明の方法では、第一のアミノ酸またはペプチドの固相合成用樹脂に対する担持量として、任意の量、例えばFmoc定量法に基づき、0.2 mmol/g以上、0.8 mmol/g以下の量を用いることができ、0.3 mmol/g以上、さらには0.5 mmol/g以上の高い担持量でも反応を効率的に進行させることができる。
　本発明において、「第二のアミノ酸」は、天然アミノ酸でも非天然アミノ酸でもよい。
　ある態様において、第二のアミノ酸またはペプチドは、主鎖カルボキシル基が保護されていないアミノ酸またはペプチドであってもよい。保護されていない主鎖カルボキシル基は、第二のアミノ酸またはペプチドのC末端にあることが好ましい。
　本発明において、「第二のペプチド」は、天然アミノ酸のみから構成されていても、非天然アミノ酸のみから構成されていても、天然および非天然アミノ酸の任意の組み合わせから構成されていてもよい。
　ある態様において、第二のアミノ酸または第二のペプチドのC末端のアミノ酸が非天然アミノ酸、とりわけN-アルキルアミノ酸などのN置換アミノ酸や、その側鎖の炭素数が2個以上のアミノ酸（例えば、α，α-ジ置換アミノ酸やβ-分岐アミノ酸）である場合などは、従来法では縮合反応が十分に進行しない場合がある。このような場合でも、本発明の方法を用いることで効率的な縮合が可能である。
　本発明において、第二のアミノ酸またはペプチドのアミノ基は、保護基で保護されていることが好ましい。このような保護基としては「アミノ基の保護基」として前述したものが挙げられ、具体的には例えば、Fmoc骨格を有する保護基、Cbz、Boc、Teoc、およびAllocなどが挙げられる。
　本発明において「Fmoc骨格を有する保護基」とは、Fmoc基またはFmoc基の構成骨格の任意の位置に任意の置換基が導入された基を意味する。このようなFmoc骨格を有する保護基として、具体的には下記式で表される保護基が挙げられる
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
（式中、
　R1～R8は、独立して、水素、C1-C8アルキル、C1-C8フルオロアルキル、ハロゲン、スルホ、およびトリメチルシリルからなる群より選択され、
　R9～R10は、独立して、水素またはメチルである）。
　Fmoc骨格を有する保護基としてより具体的には、例えば、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル（Fmoc）基、2,7-ジ-tert-ブチル-Fmoc (Fmoc（2,7tb）)基、1-メチル-Fmoc (Fmoc(1Me))基、2-フルオロ-Fmoc (Fmoc(2F))基、2,7-ジブロモ-Fmoc (Fmoc(2，7Br))基、2-モノイソオクチル-Fmoc (mio-Fmoc)基、2,7-ジイソオクチル-Fmoc (dio-Fmoc)基、2,7-(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-トリデカフルオロオクチル)-Fmoc (tdf-Fmoc)基、2,7-ビス（トリメチルシリル）-Fmoc（Fmoc(2TMS)）基、(2-スルホ-9H-フルオレン-9-イル)メトキシカルボニル基（Fmoc(2so3h)）、[(1S)-1-(9H-フルオレン-9-イル)エトキシ]カルボニル基（sm-Fmoc）、および[(1R)-1-(9H-フルオレン-9-イル)エトキシ]カルボニル基(rm-Fmoc)などが挙げられる。
　第二のアミノ酸、または第二のペプチドのC末端のアミノ酸がβ-分岐アミノ酸である場合、β-分岐アミノ酸として、具体的には、以下の式（2A）を有するものが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
　式（2A）中、は水素またはC1-C6アルキルである。P21がC1-C6アルキルである場合、好ましくはメチルである。
　式（2A）中、R21およびR22は、それぞれ独立して、C1-C4アルキル、C1-C6アルコキシ、またはC1-C6アルコキシC1-C6アルキルであるか、あるいは、R21およびR22はそれらが結合する炭素と一緒になって、3～8員脂環式環を形成する。R21およびR22がC1-C4アルキル、C1-C6アルコキシ、またはC1-C6アルコキシC1-C6アルキルである場合、R21およびR22として好ましくはメチル、エチル、tert-ブトキシであり、R21およびR22の好ましい組み合わせとしては、メチルとメチル、メチルとエチル、メチルとtert-ブトキシが挙げられる。
　R21およびR22が一緒になって3～8員脂環式環を形成する場合、3～8員脂環式環として好ましくはシクロプロパン環、シクロブタン環、シクロペンタン環、またはシクロヘキサン環である。
　第二のアミノ酸が、式（2A）で表されるアミノ酸である場合、R23はアミノ基の保護基との結合点を意味する。一方、第二のペプチドのC末端のアミノ酸が、式（2A）で表されるアミノ酸である場合、R23は隣接するアミノ酸との結合点を意味し、通常、式（2A）のアミノ酸は、当該部位において隣接するアミノ酸とアミド結合を形成する。
　このような第二のアミノ酸、または第二のペプチドのC末端のアミノ酸のβ-分岐アミノ酸としてより具体的には、MeVal、D-MeVal、Val、Ile、MeIle、MeChg、Chg、MeGly(cPent)、Gly(cPent)、MeGly(cBu)、Gly(cBu)、MeGly(cPr)、Gly(cPr)、MeThr(tBu)、およびThr(tBu)などが挙げられる。
　第二のアミノ酸、または第二のペプチドのC末端のアミノ酸がα，α-ジ置換アミノ酸である場合、α，α-ジ置換アミノ酸として、具体的には、以下の式（2B）を有するものが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000010
　式（2B）中、P22は水素またはC1-C6アルキルであり、P22がC1-C6アルキルである場合、好ましくは水素である。
　式（2B）中、R23およびR24は、C1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、または置換されていてもよいC7-C14アラルキルから独立して選択されるか、あるいはR23およびR24は、それらが結合している炭素原子と一緒になって3～8員脂環式環または4～7員飽和複素環を形成する。
　R23およびR24がC1-C6アルキルである場合、好ましくはメチル、エチル、またはイソプロピルであり、R23およびR24がC2-C6アルケニルである場合、好ましくはアリルであり、R23およびR24がC7-C14アラルキルである場合、好ましくはハロゲンで置換されていてもよいベンジルである。R23およびR24の組み合わせは、メチルとメチル、メチルとエチル、メチルとイソプロピル、メチルとイソブチル、メチルとアリル、メチルとハロゲンで置換されていてもよいベンジルが好ましい。
　またR23およびR24は、それらが結合している炭素原子と一緒になって3～8員脂環式環を形成する場合、脂環式環として好ましくは、シクロプロパン環、シクロブタン環、シクロペンタン環、またはシクロヘキサン環であり、R23およびR24は、それらが結合している炭素原子と一緒になって4～7員飽和複素環を形成する場合、飽和複素環として好ましくはテトラヒドロピラン環である。
　第二のアミノ酸が、式（2B）で表されるアミノ酸である場合、R25はアミノ基の保護基との結合点を意味する。一方、第二のペプチドのC末端のアミノ酸が、式（2B）で表されるアミノ酸である場合、R25は隣接するアミノ酸との結合点を意味し、通常、式（2B）のアミノ酸は、当該部位において隣接するアミノ酸とアミド結合を形成する。
　このような第二のアミノ酸、または第二のペプチドのC末端のアミノ酸のα，α-ジ置換アミノ酸としてより具体的には、Aib、(Me)Abu、(Me)Leu、(Me)Algly、(Me)Phe、(Me)Phe(3-I)、1-ACPrC、cVal、cLeu、cHex、Athpcなどが挙げられる。
　ある態様において、第二のアミノ酸、または第二のペプチドのC末端のアミノ酸は、N-アルキルアミノ酸であり、具体的には、MeAsp-pip、MeAsp-aze、MeAsp-pyrro、MeAsp-mor、MeAsp-mor(26-bicyc)、MeAsp-OtBu、D-3-MeAbu、bMeAla、MeGly、MeAla、MeLeu、MePhe、Aze(2)、Pro、MeAsp-NMe2、MeVal、MeIle、MeChg、MeGly(cPent)、MeGly(cBu)、MeGly(cPr)、MeThr(tBu)、D-MeVal、MeTrp(Boc)、MeThr(Bzl)、MeGlu(OtBu)、MeLys(Boc)、またはMeMetなどが挙げられ、好ましくはMeValまたはMeIleが挙げられる。
　ある態様において、第二のアミノ酸、または第二のペプチドのC末端のアミノ酸は、その側鎖の炭素数が２個以上であって、β－分岐アミノ酸あるいはα，α－ジ置換アミノ酸には該当しないアミノ酸であり得る。例えば、Lys(Z)、Glu(OBzl)、またはSer(tBu)は、側鎖の炭素数が２個以上のアミノ酸に該当する。
　本発明において、第二のアミノ酸またはペプチドは、第一のアミノ酸またはペプチドに対して等量もしくは過剰量で用いられる。具体的には、第一のアミノ酸またはペプチドに対する第二のアミノ酸またはペプチドのモル比は、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0および9.0からなる群より選択される下限、および、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，7.0、8.0、9.0および10.0からなる群より選択される上限との組み合わせによって特定することが可能な範囲とすることができる。なお、本明細書において「下限」とは、「以上」および「より多い」の両方の意味を含み、「上限」とは、「以下」および「より少ない」の両方の意味を含む。第一のアミノ酸またはペプチドに対する、第二のアミノ酸またはペプチドのモル比は、1.5以上であることが好ましく、2以上であることがより好ましい。また、第一のアミノ酸またはペプチドに対する、第二のアミノ酸またはペプチドのモル比は、8以下であることが好ましく、4以下であることがより好ましい。第一のアミノ酸またはペプチドに対する第二のアミノ酸またはペプチドのモル比は、約2であることが最も好ましい。
　本発明の縮合反応に用いられる添加剤としては、Oxyma、HOBt、HOOBt、またはHOAtなどが挙げられる。
　本発明において、添加剤は、第二のアミノ酸またはペプチドのモル数よりも少ないモル数で用いられる。言い換えると、本発明において、第二のアミノ酸またはペプチドに対する添加剤のモル比は1未満である。該モル比は、0.8以下、例えば0.1～0.8であることが好ましい。この場合、該モル比としては、例えば、第二のアミノ酸またはペプチドに対する添加剤のモル比は、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6および0.7からなる群より選択される下限、並びに0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7および0.8からなる群より選択される上限との組み合わせによって特定することが可能な範囲とすることができる。第二のアミノ酸またはペプチドに対する添加剤のモル比は、0.3～0.7であることがより好ましい。
　ある態様において、第一のアミノ酸またはペプチドに対する第二のアミノ酸またはペプチドのモル比が1～2である場合には、第二のアミノ酸またはペプチドに対する添加剤のモル比は0.7以下であることが好ましい。具体的には、第一のアミノ酸またはペプチドに対する第二のアミノ酸またはペプチドのモル比が1～2の場合、第二のアミノ酸またはペプチドに対する添加剤のモル比を0.7以下の範囲、0.6以下の範囲、0.5以下の範囲、0.4以下の範囲、0.3以下の範囲、0.2以下の範囲または0.1以下の範囲とすることができる。
　あるいは本発明においては、第一のアミノ酸またはペプチドに対する第二のアミノ酸またはペプチドのモル比が1～2の場合、第二のアミノ酸またはペプチドに対する添加剤のモル比は、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、および0.6からなる群より選択される下限、並びに0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、および0.7からなる群より選択される上限との組み合わせによって特定することが可能な範囲とすることができる。
　別の態様において、第一のアミノ酸またはペプチドに対する第二のアミノ酸またはペプチドのモル比（このモル比を「第1のモル比」ということがある）が2以上の場合には、第二のアミノ酸またはペプチドに対する添加剤のモル比は、「（第1のモル比）-1」以下であることが好ましい。具体的には、第一のアミノ酸またはペプチドに対する第二のアミノ酸またはペプチドのモル比が2以上の場合、第二のアミノ酸またはペプチドに対する添加剤のモル比を、（第一のアミノ酸またはペプチドに対する第二のアミノ酸またはペプチドのモル比）－1以下の範囲、（第一のアミノ酸またはペプチドに対する第二のアミノ酸またはペプチドのモル比）－2以下の範囲、（第一のアミノ酸またはペプチドに対する第二のアミノ酸またはペプチドのモル比）－3以下の範囲、（第一のアミノ酸またはペプチドに対する第二のアミノ酸またはペプチドのモル比）－4以下の範囲、（第一のアミノ酸またはペプチドに対する第二のアミノ酸またはペプチドのモル比）－5以下の範囲、（第一のアミノ酸またはペプチドに対する第二のアミノ酸またはペプチドのモル比）－6以下の範囲、（第一のアミノ酸またはペプチドに対する第二のアミノ酸またはペプチドのモル比）－7以下の範囲、（第一のアミノ酸またはペプチドに対する第二のアミノ酸またはペプチドのモル比）－8以下の範囲、または（第一のアミノ酸またはペプチドに対する第二のアミノ酸またはペプチドのモル比）－9以下の範囲とすることができる。
　あるいは本発明においては、第一のアミノ酸またはペプチドに対する第二のアミノ酸またはペプチドのモル比が2以上の場合、第二のアミノ酸またはペプチドに対する添加剤のモル比は、（第一のアミノ酸またはペプチドに対する第二のアミノ酸またはペプチドのモル比）－9、（第一のアミノ酸またはペプチドに対する第二のアミノ酸またはペプチドのモル比）－8、（第一のアミノ酸またはペプチドに対する第二のアミノ酸またはペプチドのモル比）－7、（第一のアミノ酸またはペプチドに対する第二のアミノ酸またはペプチドのモル比）－6、（第一のアミノ酸またはペプチドに対する第二のアミノ酸またはペプチドのモル比）－5、（第一のアミノ酸またはペプチドに対する第二のアミノ酸またはペプチドのモル比）－4、（第一のアミノ酸またはペプチドに対する第二のアミノ酸またはペプチドのモル比）－3および（第一のアミノ酸またはペプチドに対する第二のアミノ酸またはペプチドのモル比）－2からなる群より選択される下限、および（第一のアミノ酸またはペプチドに対する第二のアミノ酸またはペプチドのモル比）－8、（第一のアミノ酸またはペプチドに対する第二のアミノ酸またはペプチドのモル比）－7、（第一のアミノ酸またはペプチドに対する第二のアミノ酸またはペプチドのモル比）－6、（第一のアミノ酸またはペプチドに対する第二のアミノ酸またはペプチドのモル比）－5、（第一のアミノ酸またはペプチドに対する第二のアミノ酸またはペプチドのモル比）－4、（第一のアミノ酸またはペプチドに対する第二のアミノ酸またはペプチドのモル比）－3、（第一のアミノ酸またはペプチドに対する第二のアミノ酸またはペプチドのモル比）－2および（第一のアミノ酸またはペプチドに対する第二のアミノ酸またはペプチドのモル比）－1からなる群より選択される上限との組み合わせによって特定することが可能な範囲とすることができる。
　ある態様において、第一のアミノ酸またはペプチドに対する、添加剤のモル比は、0.5～2.0であることができる。具体的には、第一のアミノ酸またはペプチドに対する添加剤のモル比は、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、および1.9からなる値より選択される下限、並びに0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、および2.0からなる値より選択される上限との組み合わせによって特定することが可能な範囲のモル比で使用することができる。第一のアミノ酸またはペプチドに対する、添加剤のモル比は、約1であることが特に好ましい。
　本発明の縮合反応に用いられる縮合剤としては、DIC、DCC、EDCI、EDCI・HClなどが挙げられる。
　本発明において、縮合剤は、第二のアミノ酸またはペプチドのモル数と等量であるか、それよりも多いモル数で用いられる。具体的には、本発明において、第二のアミノ酸またはペプチドに対する縮合剤のモル比は、1以上の範囲、2以上の範囲、3以上の範囲または4以上の範囲とすることができる。より具体的には、第二のアミノ酸またはペプチドに対する縮合剤のモル比は、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4，2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4，3.5、3.6、3.7、3.8、3.9および4.0からなる群より選択される下限、並びに1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4，3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4，4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、および5.0からなる群より選択される上限との組み合わせによって特定することが可能な範囲とすることができる。第二のアミノ酸またはペプチドに対する縮合剤のモル比の好ましい範囲としては、1.0～5.0、1.2～4.0、1.2～4.0、1.2～3.0、2.0～3.0が挙げられる。
　ある態様において、縮合剤は、第一のアミノ酸またはペプチドに対して等量または過剰量で用いられる。具体的には例えば、第一のアミノ酸またはペプチドに対する縮合剤のモル比は、1.0以上の範囲、1.1以上の範囲、1.2以上の範囲、1.3以上の範囲、1.4以上の範囲、1.5以上の範囲、1.6以上の範囲、1.7以上の範囲、1.8以上の範囲、1.9以上の範囲、2.0以上の範囲、2.1以上の範囲、2.2以上の範囲、2.3以上の範囲、2.4以上の範囲，2.5以上の範囲、2.6以上の範囲、2.7以上の範囲、2.8以上の範囲、2.9以上の範囲、3.0以上の範囲、3.1以上の範囲、3.2以上の範囲、3.3以上の範囲、3.4以上の範囲，3.5以上の範囲、3.6以上の範囲、3.7以上の範囲、3.8以上の範囲、3.9以上の範囲、4.0以上の範囲、4.1以上の範囲、4.2以上の範囲、4.3以上の範囲、4.4以上の範囲，4.5以上の範囲、4.6以上の範囲、4.7以上の範囲、4.8以上の範囲、4.9以上の範囲、5.0以上の範囲、5.1以上の範囲、5.2以上の範囲、5.3以上の範囲、5.4以上の範囲，5.5以上の範囲、5.6以上の範囲、5.7以上の範囲、5.8以上の範囲、5.9以上の範囲、6.0以上の範囲、6.1以上の範囲、6.2以上の範囲、6.3以上の範囲、6.4以上の範囲、6.5以上の範囲、6.6以上の範囲、6.7以上の範囲、6.8以上の範囲、6.9以上の範囲、7.0以上の範囲、7.1以上の範囲、7.2以上の範囲、7.3以上の範囲、7.4以上の範囲、7.5以上の範囲、7.6以上の範囲、7.7以上の範囲、7.8以上の範囲、7.9以上の範囲、8.0以上の範囲、8.1以上の範囲、8.2以上の範囲、8.3以上の範囲、8.4以上の範囲、8.5以上の範囲、8.6以上の範囲、8.7以上の範囲、8.8以上の範囲、8.9以上の範囲、9.0以上の範囲、9.1以上の範囲、9.2以上の範囲、9.3以上の範囲、9.4以上の範囲、9.5以上の範囲、9.6以上の範囲、9.7以上の範囲、9.8以上の範囲、または9.9以上の範囲とすることができる。
　あるいは本発明においては、第一のアミノ酸またはペプチドに対する縮合剤のモル比は、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4，2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4，3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4，4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4，5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4，6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4，7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4，8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、および9.0からなる群より選択される下限、並びに2.1、2.2、2.3、2.4，2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4，3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4，4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4，5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4，6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4，7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4，8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4，9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、および10.0からなる群より選択される上限との組み合わせによって特定することが可能な範囲とすることができる。
　第一のアミノ酸またはペプチドに対する縮合剤のモル比は、1.3以上であることが好ましく、2.0以上であることがより好ましい。また、第一のアミノ酸またはペプチドに対する縮合剤のモル比は、10以下であることが好ましく、8.0以下であることがより好ましい。第一のアミノ酸またはペプチドに対する縮合剤のモル比としては、約4であることが最も好ましい。
　本発明においては、第二のアミノ酸またはペプチドに対する縮合剤および添加剤のモル比は、
　第二のアミノ酸またはペプチドに対する縮合剤のモル比を、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、および2.0からなる値より選択される下限、並びに2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、および3.0からなる値より選択される上限との組み合わせによって特定することが可能な範囲とすることができ、
　第二のアミノ酸またはペプチドに対する添加剤のモル比を、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、および0.5からなる値より選択される下限、並びに0.6、0.7、0.8、0.9および1.0からなる値より選択される上限との組み合わせによって特定することが可能な範囲とすることができる。
　第二のアミノ酸またはペプチドに対する縮合剤および添加剤のモル比として、好ましくは、第二のアミノ酸またはペプチド：縮合剤：添加剤＝約2：約4～6：約1である。
　本発明においては、第一のアミノ酸またはペプチドに対する第二のアミノ酸またはペプチド、縮合剤、および添加剤のモル比は、
　第一のアミノ酸またはペプチドに対する第二のアミノ酸またはペプチドのモル比を、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9および3.0からなる値より選択される下限、並びに2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4，3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、および4.0からなる値より選択される上限との組み合わせによって特定することが可能な範囲とすることができ、
　第一のアミノ酸またはペプチドに対する縮合剤のモル比を、1.0、2.0、3.0および4.0からなる値より選択される下限、並びに5.0、6.0、7.0、8.0および9.0からなる値より選択される上限との組み合わせによって特定することが可能な範囲とすることができ、
　第一のアミノ酸またはペプチドに対する添加剤のモル比を、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9および1.0からなる値より選択される下限、並びに1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9および3.0からなる値より選択される上限との組み合わせによって特定することが可能な範囲とすることができる。
　第一のアミノ酸またはペプチド、第二のアミノ酸またはペプチド、縮合剤、および添加剤のモル比として好ましくは、第一のアミノ酸またはペプチド：第二のアミノ酸またはペプチド：縮合剤：添加剤＝約1：約2：約4：約1、第一のアミノ酸またはペプチド：第二のアミノ酸またはペプチド：縮合剤：添加剤＝、約1：約2.4：約7.2：約1.2、または第一のアミノ酸またはペプチド：第二のアミノ酸またはペプチド：縮合剤：添加剤＝約1：約3：約6：約1.5であり、より好ましくは第一のアミノ酸またはペプチド：第二のアミノ酸またはペプチド：縮合剤：添加剤＝約1：約2：約4：約1である。
　本発明の縮合反応は、0～100℃、好ましくは5～60℃、より好ましくは10～40℃の反応温度で行うことができる。
　本発明の縮合反応は、10分～1週間、好ましくは10分～3日、より好ましくは1時間～2日間の反応時間で行うことができる。
　本発明において、添加剤がOxymaであり、かつ縮合剤がDIC、DCC、EDCI、またはEDCI・HClであることが好ましい。
　本発明において、添加剤がOxymaであり、かつ縮合剤がDICであることがより好ましい。
　本発明の縮合反応は、適当な溶媒中で行うことができる。溶媒は、非プロトン性溶媒を用いることができ、アミド系溶媒、エステル系溶媒、エーテル系溶媒、アルキルニトリル系溶媒、および尿素系溶媒などが挙げられる。アミド系溶媒として、DMF、DMA、およびNMPが挙げられる。エステル系溶媒として、酢酸エチル、およびジメチルカーボネートなどが挙げられる。エーテル系溶媒として、テトラヒドロフラン、および2-メチルテトラヒドロフランなどが挙げられる。アルキルニトリル系溶媒として、アセトニトリルなどが挙げられる。尿素系溶媒として、DMI、およびTMUなどが挙げられる。
　本発明の方法は、固相法にも液相法にも適用できる。
　固相法により行う場合には、本発明の方法は、樹脂に結合した第一のアミノ酸またはペプチドに、第二のアミノ酸またはペプチド、縮合剤、および添加剤を接触させることにより行うことができる。第一のアミノ酸またはペプチドに、第二のアミノ酸またはペプチド、縮合剤、および添加剤を接触させる順番は、任意であり、第一のアミノ酸またはペプチドに対し、第二のアミノ酸またはペプチド、縮合剤、および添加剤を同時に接触させても、順次接触させてもよい。第一のアミノ酸またはペプチドに、第二のアミノ酸またはペプチド、縮合剤、および添加剤の全て、あるいはいずれかを事前に混合させたものを接触させてもよい。第一のアミノ酸またはペプチドに、第二のアミノ酸またはペプチド、縮合剤、および添加剤を接触させる際に、これらを適当な溶媒と混合させたものを用いてもよい。
　本発明の方法は、固相合成装置を用いて行ってもよい。ある態様において、本発明の方法は、樹脂に結合した第一のアミノ酸またはペプチドに、第二のアミノ酸またはペプチド、縮合剤および添加剤を適当な溶媒中で混合することによって行うことができる。固相合成用樹脂とこれらの試薬類とを混合する際、その前処理として、適当な溶媒との接触により、固相合成用樹脂を膨潤させることで、目的の縮合反応を効率よく進行させることができる。この前処理で用いられる溶媒の量は、膨潤したレジンが溶媒に浸ってさえすれば任意の量を用いることができ、例えば、溶媒としてDMFを用いた場合には、3v/w～15v/w、好ましくは、4v/w～10v/w、より好ましくは4v/w～8v/wの量を用いることができる。溶媒量が4v/wと記載されているものは、樹脂重量1gに対する溶媒量が4mlであることを表す。
　反応終了後は、固相合成装置から反応液を排出し、残留した固相合成用樹脂を適当な溶媒で洗浄することで、過剰な試薬や副生成物を排出して、固相合成用樹脂に結合している目的のペプチド化合物を取得することができる。固相合成用樹脂を洗浄、および/または膨潤させるために適した溶媒としては、アミド系や溶媒アルコール系溶媒が例示され、DMFまたは2-プロパノールが好ましい。これらの溶媒は、複数回使用しても、交互に使用してもよい。膨潤した固相合成用樹脂は、必要に応じで収縮させることができ、それにはアルコール系溶媒、またはエーテル系の溶媒による洗浄が用いられる。アルコール系溶媒としては、メタノールが好ましく、エーテル系の溶媒としてはMTBEが好ましい。
　本発明はpremature cleavageが併発しない場合であっても、従前法に比べて縮合反応の収率や縮合体の純度を向上できることから、任意の樹脂を用いることができる。premature cleavageが起こり得る樹脂リンカーとしてはNovabiochem固相合成ハンドブックに記載の酸感受性「H(＜5%TFA in CH2Cl2)」に分類されるものが例示され、そのような樹脂リンカーを備える樹脂として、2-クロロトリチルクロリドレジン（CTCレジン）、TGTレジン、トリチルクロリドレジン（Trtレジン）、4-メチルトリチルクロリドレジン（Mttレジン）、4-メトキシトリチルクロリドレジン（Mmtレジン）などの樹脂リンカーにトリチル系の原子団が用いられている固相合成用樹脂（このような樹脂を「トリチル系樹脂」ということがある）が挙げられ、このような樹脂を用いる場合に本発明は特に有益である。
　本発明に用いられる固相合成用樹脂について、それを構成するポリマーの種類は特に限定されないが、ポリスチレンで構成された樹脂が好ましい。また、固相合成用樹脂の粒子サイズは、100-200mesh、または200-400mesh程度のものを好ましく用いることができる。樹脂の架橋率についても特に限定されないが、1% DVB（ジビニルベンゼン）架橋のものが好ましい。樹脂を構成するポリマーの種類としては、TentaGel（登録商標）やChemMatrix（登録商標）などが挙げられる。
　ある態様において、縮合反応を行う前に第二のアミノ酸またはペプチド、縮合剤、および添加剤を溶媒中で事前に混合した混合物を予め調製し、縮合反応に用いてもよい。混合時間は特に限定されないが、好ましくは0分～2時間であり、より好ましくは0分～1時間であり、さらに好ましくは30分である。
　自動合成装置を用いた樹脂の撹拌や振盪は、樹脂を反応溶液に十分浸透させて、望みどおりに反応を進行させる上で重要であり得る。撹拌速度、振盪速度、それらの頻度は特に限定されないが、過度の撹拌は樹脂の物理的損傷を引き起こす恐れがあるため、例えば60rpmの撹拌を1時間毎に2分間程度実施する例があげられる。また、浸透が十分であれば撹拌や振盪は必ずしも行う必要はない。
　ある態様において、本発明の方法は、固相合成用樹脂を除去する工程をさらに含んでもよく、これには本技術分野に公知の方法を用いることができる。所望の配列まで伸長させたペプチド化合物を樹脂から脱離させ、単離することができる。
　ある態様において、本発明の方法は、保護基を除去する工程をさらに含んでもよく、これには本技術分野に公知の方法を用いることができる。例えば、「Greene’s,“Protective Groups in Organic Synthesis”（第5版，John Wiley & Sons 2014）」に記載の方法を挙げることができ、これらを反応条件に応じて適宜用いればよい。具体的には、第二のアミノ酸のアミノ基、または第二のペプチドのN末端のアミノ酸のアミノ基が保護基で保護されている場合には、該保護基を除去することで、次の縮合反応に備えることができる。保護基は縮合反応と同時に除去されても、縮合反応とは別個に除去されてもよい。
　ある態様において、本発明は、本発明の方法を用いて直鎖ペプチド化合物を得、次いで、Comprehensive Organic Transformations、A Guide to Functional Group Preparations, 3rd Edition (R. C. Larock著)、またはMarch's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure、7th Edition (M. B. Smith, J. March著)などに記載された公知の手法によりそのN末端側の基とC末端側の基とを環化することにより、環状ペプチド化合物を製造する方法にも関する。
　ある態様において、本発明は、本発明の方法を用いたpremature cleavageの抑制方法にも関する。
　なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
　以下の実施例はWatersのHPLC method A-Dのいずれか一つ以上で分析した。
分析：WatersのHPLC(反応変換率、純度)
HPLC method A
Instrument: ACQUITY UPLC H-Class
Column: Ascentis Express C18 (2.7 μm, 4.6 mm x 50 mm), Supelco
Column temperature: 35 deg.
Eluent: A) 0.05% TFA/water, B) 0.05% TFA/MeCN
Gradient (B): 5% (0 min.) → 100% (4 min.) → 100% (4.5 min.) → 5% (4.6 min.) → 5% (6 min.)
Flow rate: 1.0 mL/min
Detection: PDA 210 nm (200-400 nm PDA total)
Injection volume: A-a) 0.30 μL, A-b) 1.0 μL, A-c) 2.0 μL
Sample preparation:
A-a) 5 μL of supernatant / 995 μL MeCN for loading evaluation
A-b) 5 μL of supernatant / 995 μL MeCN for loading evaluation
A-c) 40 μL of supernatant / 960 μL MeCN for Gly-cap evaluation
HPLC method B
Instrument: ACQUITY UPLC H-Class
Column: CAPCELL Core ADME (2.7 μm, 2.1 mm x 50 mm)
Column temperature: 50 deg.
Eluent: A) 0.05% TFA/water, B) 0.05% TFA/MeCN
Gradient (B): 30% (0 min.) → 70% (20.0 min.) → 100% (20.1 min.) → 100% (22.0 min.) → 30% (22.1 min.) → 30% (24.0 min.)
Flow rate: 0.3 mL/min
Detection: PDA 210 nm (200-400 nm PDA total)
Injection volume: 1.0 μL
Sample preparation: 40 μL of supernatant / 960 μL MeCN
HPLC method C
Instrument: ACQUITY UPLC H-Class
Column: ACQUITY UPLC CSH Fluoro-Phenyl (1.7 μm, 2.1 mm x 150 mm)
Column temperature: 35 deg.
Eluent: A) 0.1% formic acid/water, B) 0.1% formic acid/MeCN
Gradient (B): 5% (0 min.) → 100% (15.0 min.) → 100% (18.0 min.) → 5% (18.01 min.) → 5% (20.0 min.)
Flow rate: 0.3 mL/min
Detection: PDA 254 nm (200-380 nm PDA total)
Injection volume: 2.0 μL
Sample preparation: 0.37 mg/ml
HPLC method D
Instrument: ACQUITY UPLC H-Class
Column: Bioshell A160 peptide (2.7 μm, 2.1 mm x 150 mm)
Column temperature: 40 deg.
Eluent: A) 0.05% TFA/water, B) 0.05% TFA/MeCN
Gradient (B): 20% (0 min.) → 60% (20 min.) → 100% (20.1 min.) → 100% (22.0 min.) → 100% (22.1 min.) → 20% (24 min.)
Flow rate: 0.5 mL/min
Detection: PDA 254 nm
Injection volume: 2.0 μL
Sample preparation: 5 μL of supernatant / 1000 μL MeCN
HPLC method E
Instrument: Acquity UPLC/SQD2
Column: Ascentis Express C18
Column temperature: 35 deg.
Eluent: A) 0.1% FA/water, B) 0.1% FA/acetonitrile
Gradient (B): 5% (0 min.) → 100% (1.0 min.) → 100% (1.4 min.)
Flow rate: 1.0 mL/min
Detection: PDA 210-400 nm(total)
HPLC method F
Instrument: Acquity UPLC/SQD2
Column: Ascentis Express C18
Column temperature: 35 deg.
Eluent: A) 0.1% FA/water, B) 0.1% FA/acetonitrile
Gradient (B): 5% (0 min.) → 100% (4.5 min.) → 100% (5.0 min.)
Flow rate: 1.0 mL/min
Detection: PDA 210-400 nm(total)
HPLC method G
Instrument: Acquity UPLC/SQD2
Column: Ascentis Express C18
Column temperature: 35 deg.
Eluent: A) 10mM AA/water, B) methanol
Gradient (B): 50% (0 min.) → 100% (4.5 min.) → 100% (5.0 min.)
Flow rate: 1.0 mL/min 
Detection: PDA 210-400 nm(total)
HPLC method H
Instrument: ACQUITY UPLC H-Class
Column: Ascentis Express RP-amide (2.7 μm, 2.1 mm x 50 mm), Supelco
Column temperature: 35 deg.
Eluent: A) 0.05% TFA/water, B) 0.05% TFA/MeCN
Gradient (B): 5% (0 min.) → 100% (4 min.) → 100% (4.5 min.) → 5% (4.6 min.) → 5% (6 min.)
Flow rate: 0.5 mL/min
Detection: PDA 210 nm (200-400 nm PDA total)
Injection volume: E-a) 0.50 μL, E-b) 0.50 μL, E-c) 1.0 μL
Sample preparation:
E-a) 5 μL of supernatant / 960 μL MeCN for Gly-cap evaluation or purity evaluation
HPLC method I
Instrument: ACQUITY UPLC H-Class
Column: Ascentis Express RP-amide (2.7 μm, 2.1 mm x 50 mm), Supelco
Column temperature: 50 deg.
Eluent: A) 0.05% TFA/water, B) 0.05% TFA/MeCN
Gradient (B): 5% (0 min.) → 70% (20 min.) → 70% (21 min.) → 100% (22 min.) → 100% (22.1 min.) → 5% (22.6 min.) → 5% (24.0 min.)
Flow rate: 0.5 mL/min
Detection: PDA 210 nm (200-400 nm PDA total)
Injection volume: 0.50 or 1.0 μL
Sample preparation: 40 μL of supernatant / 960 μL MeCN
HPLC method J
Instrument: ACQUITY UPLC H-Class
Column: ACQUITY UPLC CSH Fluoro-Phenyl (1.7 μm, 2.1 mm x 150 mm)
Column temperature: 40 deg.
Eluent: A) 0.05% TFA/water, B) 0.05% TFA/MeCN
Gradient (B): 20% (0 min.) → 100% (20 min.) → 20% (20.1 min.) → 12% (24.0 min.)
Flow rate: 0.3 mL/min
Detection: PDA 254 nm (200-400 nm PDA total)
Injection volume: 1.0 μL
Sample preparation: 40 μL of supernatant / 960 μL MeCN
　以下のFmocアミノ酸は市販品を購入した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000012
[液相合成実験]
[出発原料合成]
（出発原料合成１）
Fmoc-MeAsp(OtBu)-pip (化合物2)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000013
　500 mLの3径フラスコにFmoc-MeAsp(OtBu)-OH (化合物1)を26.9 g （63.2 mmol, 1.0 eq）、ピペリジン塩酸塩を9.23 g (75.9 mmol, 1.2 eq)、Oxymaを10.8 g (69.5 mmol, 1.1 eq)、N,N-ジメチルホルムアミドを135 mL加え、撹拌した。滴下漏斗を用いて1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドを12.2 mL (69.5 mmol, 1.1 eq)、0 ℃で10分間かけて滴下した。滴下後、N,N-ジメチルホルムアミド1.25 mLを用いて滴下漏斗を二度洗浄した。反応開始5時間後、2-MeTHF 269 mLを加えた後、10分かけて0.5 mol/L塩酸水溶液 135 mLを加えた。水層を排出した後、有機層に5%炭酸ナトリウム水溶液135 mLを加えた。水層を排出した後、有機層に10%塩化ナトリウム水溶液135 mLを加えた。水層を排出した後、有機層を室温で一晩保管した。約60 mlの有機溶媒を減圧留去後、濃縮液に室温で酢酸エチルを81 mL加えた。撹拌しながらヘプタンを323 mL加えた。外温を0 ℃に設定し、1時間20分後、ヘプタンを161 ml加えた。桐山ロートを用い結晶を濾別洗浄後、得た結晶を外温40 ℃で減圧乾燥し白色固体28.2 g (化合物2)を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
（出発原料合成２）
Fmoc-MeAsp(OH)-pip (化合物3)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000016
　100 mLの3径ナスフラスコにFmoc-MeAsp(OtBu)-pip (化合物2)を1.58 g (3.20 mmol, 1.0 eq)秤量後、窒素雰囲気下で2-MeTHFを9.5 mLシリンジで加え撹拌し、HMDSを1.0 mL (4.8 mmol, 1.5 eq)シリンジで加えた。フラスコを氷浴に浸し、内温が1℃となった時にTMSOTfを0.79 mL (4.4 mmol, 1.4 eq)シリンジで加えた。滴下終了5分後に室温へと昇温し、1時間後、HPLC(method A-a)で反応率が100%であることを確認した。反応容器を再び氷浴に浸し、内温が5℃に達した時に5%炭酸ナトリウム水溶液を15 mL加えた。炭酸ナトリウム水溶液を加え終えてから数分間反応溶液を撹拌後、撹拌を停止した。反応容器を50 mL分液漏斗に移し分層後、水層を分取した。得た水層をMTBE 15 mLで洗浄した。分取した水層にMTBEを15 mL加えた後、リン酸(質量分率85%以上)を1.1 mL加えた。分液漏斗で溶液を振盪後、分層し有機層を分取した。得た有機層に硫酸マグネシウムを加えた後、硫酸マグネシウムを濾過した。濾液にヘプタンを1.5 mL加え、減圧濃縮を行い白色固体1.42 g (化合物3)を得た(含量未測定)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
（出発原料合成３）
Fmoc-MeAsp(OH)-NMe2 (化合物21)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000019
　窒素気流下にて、反応容器にEDCI（16.9 g, 88.0 mmol）、およびDMF（144 mL）を加え、0℃に冷却した。0℃にてHOBt（10.9 g, 80.6 mmol）、およびWO2018/225864に記載の方法に従って合成した化合物19（30.0 g, 73.3 mmol）のDCM/DMF（60 mL/60 mL）に溶かした溶液を順に加え、0℃にて30分間撹拌した。0℃にてジメチルアミン（2 mol/L THF溶液, 40.5 mL, 80.6 mmol）を滴下後、0℃にて30分間撹拌した。反応液に酢酸エチル（300 mL）を加え、有機層を1 mol/L塩酸水溶液（240 mL）で2回、水（300 mL）で2回、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液／水（1/1, 300 mL）で2回、飽和塩化ナトリウム水溶液／水（1/1, 300 mL）で順に洗浄後、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥剤を濾過後、濾液を減圧濃縮し、化合物20を淡褐色無定形晶として32.7 g（収率102%）得た。
LCMS(ESI) m/z = 437.2 (M+H)+ 
保持時間：0.86分（分析条件 HPLC METHOD E）
　化合物20（32.0 g, 73.3 mmol）を出発原料とし、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウムとDCMを混合し、次いで、フェニルシランを滴下後、室温にて反応液を30分間撹拌した。目的物の抽出操作を行い、目的物を含む溶液を濃縮乾固することで、化合物21を淡褐色無定形晶として25.1 g（収率 86%）得た。
LCMS(ESI) m/z = 397.2 (M+H)+ 
保持時間：0.68分（分析条件 HPLC METHOD E）
　Cl-Trt(2-Cl) レジン（1.25～1.60 mmol/g, 100-200 mesh, 1%DVB）は渡辺化学工業株式会社、またはSUNRESIN社から購入した。
[固相合成実験]
　本明細書では、固相支持体と化合物が結合した場合、ポリマーや樹脂部位を●で表記する場合がある。また、固相支持体部位との反応点を明確にさせる目的で、●に接続させて反応部位であるリンカーの化学構造を表記させる場合がある。例えば、下記の構造(Fmoc-MeAsp(O-Trt(2-Cl)-resin)pip (化合物3)では、固相支持体の2-クロロトリチル基がMeAspの側鎖カルボキシ基とエステル結合を形成している。なお、pipとはピペリジノ基を意味し、上記の構造では、C末端のカルボキシ基がピペリジンとアミド結合を形成している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000020
[1残基+1残基縮合実験]
　本明細書では、固相反応実施時の溶媒量を倍量(v/w)で表記する場合がある。倍量の基準は、担持工程のCl-Trt(2-Cl) レジンの質量であり、例えば固相原料合成1において、3.97 gのCl-Trt(2-Cl) レジンに対し、ジクロロメタンを40 mL用いた場合、40/3.97 ≒ 10 v/wとなる。また、1残基+1残基縮合実験では、担持工程で得られた樹脂中間体を小分けして使用した。1残基+1残基縮合実験時の溶媒量は4 v/wであるが、これを体積換算すると、4 （mL/g） x 小分け樹脂 (g) ÷ 担持後の樹脂 (g) x 担持工程原料樹脂 (g) = 4 (mL/g) x 小分け樹脂 (g) / 5.79 x 3.97 mLに相当する。
　本明細書では、固相縮合反応の純度評価として伸長後に得られた乾燥樹脂を用いた脱樹脂反応後の反応液をLCで測定し、固相合成用樹脂に担持された化合物の純度を確認した。具体的な手順を示す。伸長後の乾燥樹脂約20 mgをフィルター付き5 mLディスポーザブルシリンジに入れ、ジクロロメタンを1 mLディスポーザブルシリンジで吸引し室温で15分間静置した。ジクロロメタンを排出し、1%TFAを含むジクロロメタンを0.20 mL加え、室温で30秒間振盪した。溶液を1 mLバイアルに排出した。排出液40 μLをアセトニトリル960 μLで希釈し、LCサンプル液を調製した。
　本明細書の実施例２－２～実施例２－１１以外（実施例２－１、実施例２－１２～２－３１）では、Fmoc定量値(mmol/g)、乾燥樹脂重量(g)、およびLC純度(面積%)の積から目的物の物質量(mmol)を算出し、固相縮合反応の収率を評価した。Fmoc定量の具体的な手順を示す。乾燥樹脂約20 mgを100 mLメスフラスコに秤量した後、20%ピペリジンを含むN,N-ジメチルホルムアミド溶液を加えメスアップした。この溶液を45分間室温で振盪した。分光光度計(UV3900-01)を用いて溶液の吸光度(波長289.80 nm、係数ε=6089)を測定し、樹脂に担持されたFmoc基を有する化合物の単位重量当たりの物質量を以下の式から算出した(Fmoc定量)。
測定溶液のモル濃度(mol/L) = 吸光度 ÷ ε
Fmoc定量値(mmol/g) = 測定溶液のモル濃度(mol/L) ÷ 測定用樹脂(g) × 100 (mL)
　本明細書の実施例２－２～実施例２－１１では以下のFmoc定量法を用いた：
Fmoc定量法（実施例２－２～実施例２－１１）
　市販のFmoc-Gly-OH約10 mgを10 mLメスフラスコに秤量した後、DMF (4 ml)を加えた。30分間室温で振盪した後、DBU (40 μL)を加え、この溶液を15分間室温で振盪した。 その後、DMFを加え10 mLになるようにメスアップした。溶液上清30 μLと4 mlのDMF溶液からサンプル液を調製し、LCデータを取得した(5 μL injection)。取得データから294 nmおよび304 nmの各波長で検量線を作成した。
　反応後の樹脂約10 mgを10 mLメスフラスコに秤量した後、DMF (4 ml)を加えた。30分間室温で振盪した後、DBU (40 μl)を加え、この溶液を15分間室温で振盪した。 その後、DMFを加え10 mLになるようにメスアップした。溶液上清 80 μlと920 μlのDMF溶液からサンプル液を調製し、LCデータを取得した(5 μl injection)。各波長に対し取得データの面積と作成した検量線から樹脂に担持されたFmoc基を有する化合物の単位重量当たりの物質量を算出し、その平均値をFmoc定量値とした。
[出発原料合成]
（固相原料合成１）
Fmoc-MeAsp(OH)-pip (化合物3)のTrt(2-Cl)レジンへの担持
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000021
　固相反応用カラムにCl-Trt(2-Cl)レジンを3.97 g （1.36 mmol/g, 5.40 mmol, 1.7 eq）秤量し、ジクロロメタンを40 mL (10 v/w)加え30分間室温で静置させた。ジクロロメタンを排出後、Fmoc-MeAsp(OH)-pip (化合物3)を1.40 g (3.20 mmol, 1.0 eq)およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン1.6 mL (9.0 mmol, 2.8 eq)をジクロロメタン30 mL (7.5 v/w)に溶解させた溶液を室温にて反応用カラムに加えた後、室温で2時間振盪させた。反応溶液を排出後、メタノール3.2 mL (0.8 v/w)とN,N-ジイソプロピルエチルアミン1.6 mL (0.4 v/w)をN,N-ジメチルホルムアミド27 mL (6.8 v/w)に溶解させた溶液を室温にて反応用カラムに加えた。室温で2時間振盪させた後、反応溶液を排出した。樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド40 mL (10 v/w)で4回、次に2-プロパノール40 mL (10 v/w)で2回、続いてメタノール40 mL (10 v/w)で4回洗浄した後、終夜室温にて減圧乾燥し、5.79 gの乾燥樹脂(化合物4)を得た。得られた樹脂を100 mLメスフラスコに19.4 mg量り取り、20%ピペリジンを含むN,N-ジメチルホルムアミド溶液でメスアップし45分室温で振盪した。分光光度計を用いて溶液の吸光度からFmoc定量を行い、得られたFmoc定量値と乾燥樹脂の質量とLC A%から収率を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
 *脱t-Bu化工程を含む2段階収率((化合物2)は含量100%として計算)
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
 *担持前後の純度変化を確認するために脱樹脂された化合物3を分析
（固相原料合成２）
Fmoc-MeAsp(OH)-NMe2 (化合物21)のTrt(2-Cl)レジンへの担持
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000024
　フィルター付きの反応容器にCl-Trt(2-Cl)レジン（1.60 mmol/g, 8.83 g, 14.1 mmol）とDCM（90 mL）を入れ、室温にて20分間振盪した。窒素圧をかけてDCMを除いた後、化合物21（2.80 g, 7.06 mmol）、メタノール（2.29 mL, 56.5mmol）、DIPEA（5.91 mL, 33.9 mmol）、およびDCM（64 mL）の混合液を反応容器に添加し、室温にて60分間振盪した。窒素圧をかけて反応液を除いた後、メタノール（9.17 mL, 226 mmol）、DIPEA（5.91 mL, 33.9 mmol）、およびDCM(64 mL）の混合液を反応容器に添加し、室温にて90分間振盪した。窒素圧をかけて反応液を除いた後、DCM（90 mL）を入れ5分間振盪した後に窒素圧をかけて反応液を除いた。このDCMを用いたレジンの洗浄操作を2回繰り返し、得られたレジンを減圧下で一晩乾燥させ、化合物22を10.4 g得た。乾燥レジン（11.04 mg）を用い、Fmoc定量法により担持率を算出すると、0.442 mmol/gであった（294 nmにおけるUVarea値：4990.63、304 nmにおけるUVarea値：4516.89）。
（固相原料合成３）
Fmoc-D-3-MeAbu-OH (化合物23)のTrt(2-Cl)レジンへの担持
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000025
　フィルター付きの反応容器にCl-Trt(2-Cl)レジン（1.60 mmol/g, 25.0 g, 40.0 mmol）とDCM（125 mL）を入れ、室温にて20分間振盪した。窒素圧をかけてDCMを除いた後、Fmoc-D-3-MeAbu-OH（化合物23，3.60 g, 10.6 mmol）、メタノール（0.859 mL, 21.2 mmol）およびDIPEA（12.3 mL, 70.7 mmol）にDCMを加えて合計145 mLに調製した混合液を反応容器に添加し、室温にて30分間振盪した。窒素圧をかけて反応液を除いた後、メタノール（12.5 mL, 143 mmol）およびDIPEA（12.5 mL, 71.8 mmol）にDCMを加えて合計250 mLに調製した混合液を反応容器に添加し、室温にて90分間振盪した。窒素圧をかけて反応液を除いた後、DCM（180 mL）を入れ5分間振盪した後に窒素圧をかけて反応液を除いた。このDCMを用いたレジンの洗浄操作を3回繰り返し、得られたレジンを減圧下で一晩乾燥させ、化合物24を28.3 g得た。乾燥レジン（10.36 mg）を用い、Fmoc定量法により担持率を算出すると、0.369 mmol/gであった（294 nmにおけるUVarea値：3920.38、304 nmにおけるUVarea値：3530.84）。
（固相原料合成４）
Fmoc-MeGly-OH (化合物25)のTrt(2-Cl)レジンへの担持
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000026
　フィルター付きの反応容器にCl-Trt(2-Cl)レジン（1.60 mmol/g, 12.3 g, 19.7 mmol）とDCM（125 mL）を入れ、室温にて20分間振盪した。窒素圧をかけてDCMを除いた後、商業的供給業者から購入したFmoc-MeGly-OH（3.07 g, 9.87 mmol）、DIPEA（8.25 mL, 47.4 mmol）、およびDCM（110 mL）の混合液を反応容器に添加し、室温にて60分間振盪した。窒素圧をかけて反応液を除いた後、メタノール（12.8 mL, 316 mmol）、DIPEA（8.25 mL, 47.4 mmol）、およびDCM（110 mL）の混合液を反応容器に添加し、室温にて90分間振盪した。窒素圧をかけて反応液を除いた後、DCM（180 mL）を入れ5分間振盪した後に窒素圧をかけて反応液を除いた。このDCMを用いたレジンの洗浄操作を2回繰り返し、得られたレジンを減圧下で一晩乾燥させ、化合物26を22.2 g得た。乾燥レジン（10.00 mg）を用い、Fmoc定量法により担持率を算出すると、0.573 mmol/gであった（294 nmにおけるUVarea値：5879.66、304 nmにおけるUVarea値：5289.40）。
（固相原料合成５）
Fmoc-MeLeu-OH (化合物37)のTrt(2-Cl)レジンへの担持
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000027
　固相反応用カラムにCl-Trt(2-Cl)レジンを1.01 g （1.13 mmol/g, 1.14 mmol, 1.4 eq）秤量し、ジクロロメタンを10 mL (10 v/w)加え30分間室温で静置させた。ジクロロメタンを排出後、Fmoc-MeLeu-OH (化合物1)を0.29 g (0.79 mmol, 1.0 eq)およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン0.40 mL (2.3 mmol, 2.9 eq)をジクロロメタン8.0 mL (8 v/w)に溶解させた溶液を室温にて反応用カラムに加えた後、室温で2時間振盪させた。反応溶液を排出後、メタノール0.80 mL (0.8 v/w)とN,N-ジイソプロピルエチルアミン0.40 mL (0.4 v/w)をN,N-ジメチルホルムアミド 6.8 mL (6.8 v/w)に溶解させた溶液を室温にて反応用カラムに加えた。室温で2時間振盪させた後、反応溶液を排出した。樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド 10 mL (10 v/w)で4回、次に2-プロパノール10 mL (10 v/w)で2回、続いてメタノール10 mL (10 v/w)で4回洗浄した後、終夜室温にて減圧乾燥し、1.27 gの乾燥樹脂 (化合物38)を得た。得られた樹脂を100 mLメスフラスコに17.7 mg量り取り、20%ピペリジンを含むN,N-ジメチルホルムアミド溶液でメスアップし45分室温で振盪した。分光光度計を用いて溶液の吸光度からFmoc定量を行い、得られたFmoc定量値と乾燥樹脂の質量とLC A%から収率を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
　上記と同様の反応条件に付し、下記の市販アミノ酸をCTCレジンに担持した結果を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
　実施例１、実施例２－１、および実施例２－１２～実施例２－３１では、固相合成用樹脂のアミノ酸に対し、Fmocアミノ酸、DIC、およびOxymaをそれぞれ、２当量、４当量、１当量用いることによりアミノ酸を伸長させた（実施例条件Ａ）。
[実施例１]
（1残基+1残基縮合実験）
Fmoc-MeVal-MeAsp（OCTC）-pip (化合物5)の合成（レジンのアミノ酸に対し、Fmocアミノ酸：DIC：添加剤（Oxyma）＝２：４：１の反応条件：以降、実施例条件Ａと呼ぶ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000031
　固相反応用カラムに乾燥樹脂 (化合物4)を3.01 g (0.525 mmol/g, 1.57 mmol, 1.0 eq)秤量し、N,N-ジメチルホルムアミドを21 mL (10 v/w)加え30分間室温で静置させた。N,N-ジメチルホルムアミドを排出後、20%ピペリジンを含むN,N-ジメチルホルムアミド溶液を17 mL (8 v/w)を加え室温で15分間振盪させた。反応溶液を排出後、20%ピペリジンを含むN,N-ジメチルホルムアミド溶液を17 ml (8 v/w)を再び加え室温で15分間振盪させた。反応溶液を排出後、N,N-ジメチルホルムアミド 21 mL (10 v/w)で8回洗浄した。次にバイアルにFmoc-MeVal-OH 1.12 g (3.16 mmol, 2.0 eq)とOxyma 0.226 g (1.58 mmol, 1.0 eq)を秤量し、N,N-ジメチルホルムアミドを 8.2 mL (4 v/w)を加え溶解させ、本溶液を固相合成用カラムに加えた。続けてDIC を0.99 mL (6.3 mmol, 4.0 eq)加え、密封後室温にて6時間振盪させた。反応溶液を排出後、N,N-ジメチルホルムアミド 21 mL (10 v/w) で4回、次に2-プロパノール21 mL (10 v/w)で2回、続いてメタノール21 mL (10 v/w)で4回洗浄した後、終夜室温にて減圧乾燥し、2.78 gの乾燥樹脂 (化合物5)を得た。得られた樹脂を100 mLメスフラスコに23.2 mg秤量し、20%ピペリジンを含むN,N-ジメチルホルムアミド溶液でメスアップし45分室温で振盪した。分光光度計を用いて溶液の吸光度からFmoc定量を行い、得られたFmoc定量値と乾燥樹脂の質量とLC A%から収率を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000032
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000033
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000034
　目的物 （化合物７）を高収率で得ることができた。過剰伸長体 （化合物８）およびエピマー体 (化合物6)の生成はそれぞれ2.3 A%、0.4 A%だった。
[実施例２－１]
Fmoc-D-MeVal-MeAsp（OCTC）-pip (化合物10)の合成（実施例条件Ａによる合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000035
　フィルター付きの5 mLディスポーザブルシリンジに乾燥樹脂 (化合物4)を0.195 g (0.525 mmol/g, 0.101 mmol, 1.0 eq)秤量し、N,N-ジメチルホルムアミドを1.3 mL (10 v/w)加え30分間室温で静置させた。N,N-ジメチルホルムアミドを排出後、20%ピペリジンを含むN,N-ジメチルホルムアミド溶液を1.1 mL (8 v/w)を加え室温で15分間振盪させた。反応溶液を排出後、20%ピペリジンを含むN,N-ジメチルホルムアミド溶液を1.1 mL (8 v/w)再び加え室温で15分間振盪させた。反応溶液を排出後、N,N-ジメチルホルムアミド 1.3 mL (10 v/w)で8回洗浄した。次にバイアルにFmoc-D-MeVal-OH 72 mg (0.21 mmol, 2.0 eq)とOxyma 15 mg (0.11 mmol, 1.0 eq)を秤量し、N,N-ジメチルホルムアミド を0.54 mL (4 v/w)加え溶解させ、この溶液をディスポーザブルシリンジで吸引した。続いてDIC を66 μL (0.42 mmol, 4 eq)加え、密封後室温にて6時間振盪させた。反応溶液を排出後、N,N-ジメチルホルムアミド 1.3 mL (10 v/w) で4回、次に2-プロパノール1.3 mL (10 v/w)で2回、続いてメタノール1.3 mL (10 v/w)で4回洗浄した後、終夜室温にて減圧乾燥し、0.188 gの乾燥樹脂 (化合物10)を得た。得られた樹脂を100 mLメスフラスコに22.6 mg秤量し、20%ピペリジンを含むN,N-ジメチルホルムアミド溶液でメスアップし45分室温で振盪した。分光光度計を用いて溶液の吸光度からFmoc定量を行い、得られたFmoc定量値と乾燥樹脂の質量とLC A%から収率を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000036
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000037
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000038
　目的物（化合物10）を高収率で得ることができた。過剰伸長体（化合物11）およびエピマー体(化合物7)の生成はそれぞれ1.9 A%、0.1 A%であった。
　実施例２－２～実施例２－１１にて記載する固相反応によるペプチド合成は、ペプチド合成機（Multipep RS; Intavis社製）を用いて、Fmoc法により行った。操作の詳細な手順については合成機に付属のマニュアルに従った。
　実施例２－２～実施例２－１１における詳細な合成条件は以下の合成法1に示した。
合成法1
　目的とするペプチドを構成するFmocアミノ酸（第二のアミノ酸）、添加剤としてHOAtもしくはOxyma、およびNMPを用いて、Fmocアミノ酸の濃度が0.6 mol/Lに、添加剤の濃度が0.375 mol/Lとなるように溶解させて溶液1を調製した。Fmocアミノ酸が難溶の場合、20～30%（v/v）となるようDMSOを添加して溶液1を調製した。また、DICが10%（v/v）となるようにDMFと混合し、溶液2を調製した。固相原料合成１～４にて調製したFmocアミノ酸もしくはペプチドが担持されたレジン（100 mg）をフィルター（フリット）付の固相反応容器に入れてペプチド合成機にセットした。DCM（1.2 mL）を加えて30分間静置することでレジンの膨潤を行った後、溶液をフリットから排出した。溶液１および溶液２をペプチド合成機にセットし、ペプチド合成機による自動合成を開始した。
　レジンを含む固相反応容器にDBUのDMF溶液（2%v/v, 0.7 mL）を添加し、室温にてFmoc基の除去反応を行った。1残基目の脱保護においては4.5分間反応させ、2残基目以降の脱保護においては10分間反応させた後、溶液をフリットから排出した。そこにDMF(0.7 mL)を加え、5分静置後、溶液をフリットから排出した。このレジンの洗浄工程を更に3回繰り返した。続いて、溶液1（0.3 mL）と溶液2（0.36 mL）を合成機のmixing vialで混合（Fmocアミノ酸：縮合剤：添加剤の混合比は約１．６：２：１）した後にレジンに添加し、固相反応容器を40℃もしくは50℃まで加温し、2.5時間もしくは10時間反応することでレジン上のアミノ基とFmocアミノ酸の縮合反応を行った後、溶液をフリットから排出した。次いでレジンをDMF（0.7 mL）で3回洗浄した。このFmoc基の除去反応に次ぐFmocアミノ酸の縮合反応を1サイクルとし、このサイクルを繰り返しペプチドを伸長させた。
　ペプチド伸長完了後、得られたレジンをDMF（0.7 mL）で4回洗浄後、DCM（0.7 mL）で4回洗浄し、48時間室温にて自然乾燥した。得られたレジンの一部（10 mg程度）を反応容器に入れ、上記のFmoc定量法に従いレジン上のペプチドの担持率を算出した。また、得られたレジンの一部（20 mg程度）を反応容器に入れ、0.75%（v/v）のDIPEAを含む、もしくは含まないTFE/DCM溶液（1/1, 1 mL）を加えて室温にて2時間振盪し、ペプチドの切り出し反応を行った。反応後、切り出し溶液をLCMSにて分析した。
　[実施例２－２]～[実施例２－１１]に示すトリペプチドを、ペプチド合成機を用いた固相反応により、以下の2条件で合成した際の回収率、および純度を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000039
　実施例２－１～実施例２－３０における回収率の定義、および算出方法は以下の回収率算出法に示した。
回収率算出法
　実施例2では回収率を以下のように定義した。回収率が高いほど、premature cleavageは抑制されたことになる。
　回収率 = 伸長反応後の実際のFmoc定量値（mmol/g） ÷ 伸長反応後の理論的なFmoc定量値（mmol/g）（式1）
　伸長反応後の理論的なFmoc定量値（mmol/g）は以下のように算出される。
　伸長反応後の理論的なFmoc定量値（mmol/g）= 原料レジンのFmoc定量値（mmol/g） × 原料レジンの重量（g） ÷ 目的物が100%生成した場合のレジンの重量（g）（式2）
　目的物が100%生成した場合のレジンの重量（g）は以下のように算出される。
　目的物が100%生成した場合のレジンの重量（g） = 原料レジンの重量（g） - 原料レジン上のアミノ酸、もしくはペプチド成分の重量（g） + 目的物が100%生成した場合のレジン上のペプチド成分の重量（g）（式3）
　原料レジン上のアミノ酸、もしくはペプチド成分の重量（g）は以下のように算出される。
　原料レジン上のアミノ酸、もしくはペプチド成分の重量（g） = 原料レジンのFmoc定量値（mmol/g） × 原料レジンの重量（g） × 原料レジンの上のアミノ酸、もしくはペプチド成分の分子量（g/mol） × 0.001（mol/mmol）（式4）
　目的物が100%生成した場合のレジン上のペプチド成分の重量（g）は以下のように算出される。
　目的物が100%生成した場合のレジン上のペプチド成分の重量（g） = 原料レジンのFmoc定量値（mmol/g） × 原料レジンの重量（g） × 目的物のペプチド成分の分子量（g/mol） × 0.001（mol/mmol）（式5）
　式2に式3、式4、および式5を代入すると
　伸長反応後の理論的なFmoc定量値（mmol/g） = 原料レジンのFmoc定量値（mmol/g） ÷ （1 - 原料レジンのFmoc定量値（mmol/g） × 原料レジンの上のアミノ酸、もしくはペプチド成分の分子量（g/mol） × 0.001（mol/mmol） + 原料レジンのFmoc定量値（mmol/g） × 目的物のペプチド成分の分子量（g/mol） × 0.001（mol/mmol）） = 1 ÷ （1 ÷ 原料レジンのFmoc定量値（mmol/g） - 原料レジンの上のアミノ酸、もしくはペプチド成分の分子量（g/mol） × 0.001（mol/mmol） + 目的物のペプチド成分の分子量（g/mol） × 0.001（mol/mmol））（式6）
　式1に式6を代入すると、回収率は以下の式により算出される。
　回収率 = 伸長反応後の実際のFmoc定量値（mmol/g） × （1 ÷ 原料レジンのFmoc定量値（mmol/g） - 原料レジンの上のアミノ酸、もしくはペプチド成分の分子量（g/mol） × 0.001（mol/mmol） + 目的物のペプチド成分の分子量（g/mol） × 0.001（mol/mmol））
[実施例２－２]
Fmoc-Ile-MeVal-MeAsp(O-Trt(2-Cl)resin)-pip（化合物27）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000040
条件1による化合物27の合成（合成法1）
　固相原料合成１にて調製したアミノ酸担持レジン（化合物4）（Fmoc-MeAsp(O-Trt(2-Cl)resin)-pip）（100 mg, 0.455 mmol/g）を出発原料とし、合成法1に従い、Fmoc-MeVal-OHの伸長（HOAt、40℃、2.5時間）、次いでFmoc-Ile-OHの伸長（HOAt、40℃、2.5時間）を行い、化合物27を合成した。乾燥レジン（10.45 mg）を用い、Fmoc定量法により担持率を算出すると、0.292 mmol/gであった（294 nmにおけるUVarea値：3046.82、304 nmにおけるUVarea値：2746.87）。
　回収率は回収率算出法に従い、以下の式で算出した。
　回収率 = 0.292 × (1 ÷ 0.455 - 436.51 × 0.001 + 662.83 × 0.001) = 70.8%
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000041
　また切り出し反応液をLCMSで分析したところ、化合物27の脱樹脂体の純度は61.6 area%であり、エピマー体（化合物27a）が6.5 area%、過剰伸長体（化合物27b）が2.4 area%、欠損体（化合物27c）が29.5 area%観測された。
分析条件：HPLC method G
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000042
条件2による化合物27の合成（合成法1）
　固相原料合成１にて調製したアミノ酸担持レジン（化合物4）（Fmoc-MeAsp(O-Trt(2-Cl)resin)-pip）（100 mg, 0.455 mmol/g）を出発原料とし、合成法1に従い、Fmoc-MeVal-OHの伸長（Oxyma、50℃、10時間）、次いでFmoc-Ile-OHの伸長（HOAt、40℃、2.5時間）を行い、化合物27を合成した。乾燥レジン（10.89 mg）を用い、Fmoc定量法により担持率を算出すると、0.332 mmol/gであった（294 nmにおけるUVarea値：3612.81、304 nmにおけるUVarea値：3267.35）。
　回収率は回収率算出法に従い、以下の式で算出される。
　回収率 = 0.332 × (1 ÷ 0.455 - 436.51 × 0.001 + 662.83 × 0.001) = 80.5%
　また切り出し反応液をLCMSで分析したところ、化合物27の脱樹脂体の純度は93.7 area%であり、エピマー体（化合物27a）が2.6 area%、過剰伸長体（化合物27b）が3.7 area%観測された。
分析条件：HPLC method G
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000043
　以上の結果を下表にまとめる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000044
[実施例２－３]
Fmoc-Ile-MeIle-MeAsp(O-Trt(2-Cl)resin)-pip（化合物28）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000045
条件1による化合物28の合成（合成法1）
　固相原料合成１にて調製したアミノ酸担持レジン（化合物4）（Fmoc-MeAsp(O-Trt(2-Cl)resin)-pip）（100 mg, 0.455 mmol/g）を出発原料とし、合成法1に従い、Fmoc-MeIle-OHの伸長（HOAt、40℃、2.5時間）、次いでFmoc-Ile-OHの伸長（HOAt、40℃、2.5時間）を行い、化合物28を合成した。乾燥レジン（10.81 mg）を用い、Fmoc定量法により担持率を算出すると、0.326 mmol/gであった（294 nmにおけるUVarea値：3524.40、304 nmにおけるUVarea値：3171.55）。
　回収率は回収率算出法に従い、以下の式で算出した。
　回収率 = 0.326 × (1 ÷ 0.455 - 436.51 × 0.001 + 676.86 × 0.001) = 79.5%
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000046
　また切り出し反応液をLCMSで分析したところ、化合物28の脱樹脂体の純度は58.0 area%であり、エピマー体（化合物28a）が1.4 area%、過剰伸長体（化合物28b）が1.8 area%、欠損体（化合物27c）が38.8 area%観測された。
分析条件：HPLC method G
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000047
条件2による化合物28の合成（合成法1）
　固相原料合成１にて調製したアミノ酸担持レジン（化合物4）（Fmoc-MeAsp(O-Trt(2-Cl)resin)-pip）（100 mg, 0.455 mmol/g）を出発原料とし、合成法1に従い、Fmoc-MeIle-OHの伸長（Oxyma、50℃、10時間）、次いでFmoc-Ile-OHの伸長（HOAt、40℃、2.5時間）を行い、化合物28を合成した。乾燥レジン（10.41 mg）を用い、Fmoc定量法により担持率を算出すると、0.330 mmol/gであった（294 nmにおけるUVarea値：3437.60、304 nmにおけるUVarea値：3100.91）。
　回収率は回収率算出法に従い、以下の式で算出した。
　回収率 = 0.330 × (1 ÷ 0.455 - 436.51 × 0.001 + 676.86 × 0.001) = 80.5%
　また切り出し反応液をLCMSで分析したところ、化合物28の脱樹脂体の純度は95.2 area%であり、エピマー体（化合物28a）が1.4 area%、過剰伸長体（化合物28b）が3.4 area%観測された。
分析条件：HPLC method G
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000048
　以上の結果を下表にまとめる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000049
[実施例２－４]
Fmoc-Ile-MeGly(cPent)-MeAsp(O-Trt(2-Cl)resin)-pip（化合物29）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000050
条件1による化合物29の合成（合成法1）
　固相原料合成１にて調製したアミノ酸担持レジン（化合物4）（Fmoc-MeAsp(O-Trt(2-Cl)resin)-pip）（100 mg, 0.455 mmol/g）を出発原料とし、合成法1に従い、Fmoc-MeGly(cPent)-OHの伸長（HOAt、40℃、2.5時間）、次いでFmoc-Ile-OHの伸長（HOAt、40℃、2.5時間）を行い、化合物29を合成した。乾燥レジン（10.05 mg）を用い、Fmoc定量法により担持率を算出すると、0.320 mmol/gであった（294 nmにおけるUVarea値：3216.77、304 nmにおけるUVarea値：2905.18）。
　回収率は回収率算出法に従い、以下の式で算出した。
　回収率 = 0.320 × (1 ÷ 0.455 - 436.51 × 0.001 + 688.87 × 0.001) = 78.4%
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000051
　また切り出し反応液をLCMSで分析したところ、化合物29の脱樹脂体の純度は83.9 area%であり、エピマー体（化合物29a）が1.2 area%、過剰伸長体（化合物29b）が3.9 area%、欠損体（化合物27c）が11.0 area%観測された。
分析条件：HPLC method G
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000052
条件2による化合物29の合成（合成法1）
　固相原料合成１にて調製したアミノ酸担持レジン（化合物4）（Fmoc-MeAsp(O-Trt(2-Cl)resin)-pip）（100 mg, 0.455 mmol/g）を出発原料とし、合成法1に従い、Fmoc-MeGly(cPent)-OHの伸長（Oxyma、50℃、10時間）、次いでFmoc-Ile-OHの伸長（HOAt、40℃、2.5時間）を行い、化合物29を合成した。乾燥レジン（9.45 mg）を用い、Fmoc定量法により担持率を算出すると、0.232 mmol/gであった（294 nmにおけるUVarea値：2194.45、304 nmにおけるUVarea値：1975.12）。
　回収率は回収率算出法に従い、以下の式で算出した。
　回収率 = 0.232 × (1 ÷ 0.455 - 436.51 × 0.001 + 688.87 × 0.001) = 56.8%
　また切り出し反応液をLCMSで分析したところ、化合物29の脱樹脂体の純度は91.4 area%であり、エピマー体（化合物29a）が0.1 area%、過剰伸長体（化合物29b）が8.5 area%観測された。
分析条件：HPLC method G
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000053
　以上の結果を下表にまとめる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000054
[実施例２－５]
Fmoc-Ile-MeChg-MeAsp(O-Trt(2-Cl)resin)-pip（化合物30）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000055
条件1による化合物30の合成（合成法1）
　固相原料合成１にて調製したアミノ酸担持レジン（化合物4）（Fmoc-MeAsp(O-Trt(2-Cl)resin)-pip）（100 mg, 0.455 mmol/g）を出発原料とし、合成法1に従い、Fmoc-MeChg-OHの伸長（HOAt、40℃、2.5時間）、次いでFmoc-Ile-OHの伸長（HOAt、40℃、2.5時間）を行い、化合物30を合成した。乾燥レジン（9.68 mg）を用い、Fmoc定量法により担持率を算出すると、0.314 mmol/gであった（294 nmにおけるUVarea値：3037.14、304 nmにおけるUVarea値：2743.09）。
　回収率は回収率算出法に従い、以下の式で算出した。
　回収率 = 0.314 × (1 ÷ 0.455 - 436.51 × 0.001 + 702.89 × 0.001) = 77.4%
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000056
　また切り出し反応液をLCMSで分析したところ、化合物30の脱樹脂体の純度は74.1 area%であり、エピマー体（化合物30a）が2.3 area%、過剰伸長体（化合物30b）が4.0 area%、欠損体（化合物27c）が19.5 area%観測された。
分析条件：HPLC method G
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000057
条件2による化合物30の合成（合成法1）
　固相原料合成１にて調製したアミノ酸担持レジン（化合物4）（Fmoc-MeAsp(O-Trt(2-Cl)resin)-pip）（100 mg, 0.455 mmol/g）を出発原料とし、合成法1に従い、Fmoc-MeChg-OHの伸長（Oxyma、50℃、10時間）、次いでFmoc-Ile-OHの伸長（HOAt、40℃、2.5時間）を行い、化合物30を合成した。乾燥レジン（9.91 mg）を用い、Fmoc定量法により担持率を算出すると、0.226 mmol/gであった（294 nmにおけるUVarea値：2235.50、304 nmにおけるUVarea値：2016.81）。
　回収率は回収率算出法に従い、以下の式で算出した。
　回収率 = 0.226 × (1 ÷ 0.455 - 436.51 × 0.001 + 702.89 × 0.001) = 55.7%
　また切り出し反応液をLCMSで分析したところ、化合物30の脱樹脂体の純度は91.7 area%であり、エピマー体（化合物30a）が0.6 area%、過剰伸長体（化合物30b）が7.7 area%観測された。
分析条件：HPLC method G
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000058
　以上の結果を下表にまとめる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000059
[実施例２－６]
Fmoc-Ile-MeLeu-MeAsp(O-Trt(2-Cl)resin)-pip（化合物31）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000060
条件1による化合物31の合成（合成法1）
　固相原料合成１にて調製したアミノ酸担持レジン（化合物4）（Fmoc-MeAsp(O-Trt(2-Cl)resin)-pip）（100 mg, 0.455 mmol/g）を出発原料とし、合成法1に従い、Fmoc-MeLeu-OHの伸長（HOAt、40℃、2.5時間）、次いでFmoc-Ile-OHの伸長（HOAt、40℃、2.5時間）を行い、化合物31を合成した。乾燥レジン（10.74 mg）を用い、Fmoc定量法により担持率を算出すると、0.369 mmol/gであった（294 nmにおけるUVarea値：3953.19、304 nmにおけるUVarea値：3570.96）。
　回収率は回収率算出法に従い、以下の式で算出した。
　回収率 = 0.369 × (1 ÷ 0.455 - 436.51 × 0.001 + 676.86 × 0.001) = 90.0%
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000061
　また切り出し反応液をLCMSで分析したところ、化合物31の脱樹脂体の純度は98.3 area%であり、エピマー体（化合物31a）が0.1 area%、過剰伸長体（化合物31b）が1.6 area%観測された。本基質では条件1においても欠損体（化合物27c）は観測されなかった。
分析条件：HPLC method G
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000062
条件2による化合物31の合成（合成法1）
　固相原料合成１にて調製したアミノ酸担持レジン（化合物4）（Fmoc-MeAsp(O-Trt(2-Cl)resin)-pip）（100 mg, 0.455 mmol/g）を出発原料とし、合成法1に従い、Fmoc-MeLeu-OHの伸長（Oxyma、50℃、10時間）、次いでFmoc-Ile-OHの伸長（HOAt、40℃、2.5時間）を行い、化合物31を合成した。乾燥レジン（10.73 mg）を用い、Fmoc定量法により担持率を算出すると、0.337 mmol/gであった（294 nmにおけるUVarea値：3610.72、304 nmにおけるUVarea値：3254.78）。
　回収率は回収率算出法に従い、以下の式で算出した。
　回収率 = 0.337 × (1 ÷ 0.455 - 436.51 × 0.001 + 676.86 × 0.001) = 82.2%
　また切り出し反応液をLCMSで分析したところ、化合物31の脱樹脂体の純度は97.7 area%であり、エピマー体（化合物31a）が0.1 area%、過剰伸長体（化合物31b）が2.2 area%観測された。
分析条件：HPLC method G
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000063
　以上の結果を下表にまとめる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000064
[実施例２－７]
Fmoc-Ile-MeGly(cPent)-MeAsp(O-Trt(2-Cl)resin)-NMe2（化合物32）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000065
条件1による化合物32の合成（合成法1）
　固相原料合成２にて調製したアミノ酸担持レジン（化合物22）（Fmoc-MeAsp(O-Trt(2-Cl)resin)-NMe2）（100 mg, 0.442 mmol/g）を出発原料とし、合成法1に従い、Fmoc-MeGly(cPent)-OHの伸長（HOAt、40℃、2.5時間）、次いでFmoc-Ile-OHの伸長（HOAt、40℃、2.5時間）を行い、化合物32を合成した。乾燥レジン（10.73 mg）を用い、Fmoc定量法により担持率を算出すると、0.304 mmol/gであった（294 nmにおけるUVarea値：3263.10、304 nmにおけるUVarea値：2945.28）。
　回収率は回収率算出法に従い、以下の式で算出した。
　回収率 = 0.304 × (1 ÷ 0.442 - 396.44 × 0.001 + 648.80 × 0.001) = 76.5%
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000066
　また切り出し反応液をLCMSで分析したところ、化合物32の脱樹脂体の純度は76.3 area%であり、エピマー体（化合物32a）が1.2 area%、過剰伸長体（化合物32b）が5.6 area%、欠損体（化合物32c）が16.9 area%観測された。
分析条件：HPLC METHOD E
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000067
条件2による化合物32の合成（合成法1）
　固相原料合成２にて調製したアミノ酸担持レジン（化合物22）（Fmoc-MeAsp(O-Trt(2-Cl)resin)-NMe2）（100 mg, 0.442 mmol/g）を出発原料とし、合成法1に従い、Fmoc-MeGly(cPent)-OHの伸長（Oxyma、50℃、10時間）、次いでFmoc-Ile-OHの伸長（HOAt、40℃、2.5時間）を行い、化合物32を合成した。乾燥レジン（10.60 mg）を用い、Fmoc定量法により担持率を算出すると、0.211 mmol/gであった（294 nmにおけるUVarea値：2239.56、304 nmにおけるUVarea値：2018.13）。
　回収率は回収率算出法に従い、以下の式で算出した。
　回収率 = 0.211 × (1 ÷ 0.442 - 396.44 × 0.001 + 648.80 × 0.001) = 53.1%
　また切り出し反応液をLCMSで分析したところ、化合物32の脱樹脂体の純度は85.9 area%であり、過剰伸長体（化合物32a）が14.1 area%観測された。
分析条件：HPLC METHOD E
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000068
　以上の結果を下表にまとめる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000069
[実施例２－８]
Fmoc-Ile-MeLeu-MeAsp(O-Trt(2-Cl)resin)-NMe2（化合物33）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000070
条件1による化合物33の合成（合成法1）
　固相原料合成２にて調製したアミノ酸担持レジン（化合物22）（Fmoc-MeAsp(O-Trt(2-Cl)resin)-NMe2）（100 mg, 0.442 mmol/g）を出発原料とし、合成法1に従い、Fmoc-MeLeu-OHの伸長（HOAt、40℃、2.5時間）、次いでFmoc-Ile-OHの伸長（HOAt、40℃、2.5時間）を行い、化合物33を合成した。乾燥レジン（10.15 mg）を用い、Fmoc定量法により担持率を算出すると、0.371 mmol/gであった（294 nmにおけるUVarea値：3770.57、304 nmにおけるUVarea値：3391.62）。
　回収率は回収率算出法に従い、以下の式で算出した。
　回収率 = 0.371 × (1 ÷ 0.442 - 396.44 × 0.001 + 636.79 × 0.001) = 92.9%
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000071
　また切り出し反応液をLCMSで分析したところ、化合物33の脱樹脂体の純度は97.9 area%であり、過剰伸長体（化合物33b）が2.1 area%観測された。本基質では条件1においても欠損体（化合物32c）は観測されなかった。
分析条件：HPLC METHOD E
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000072
条件2による化合物33の合成（合成法1）
　固相原料合成２にて調製したアミノ酸担持レジン（化合物22）（Fmoc-MeAsp(O-Trt(2-Cl)resin)-NMe2）（100 mg, 0.442 mmol/g）を出発原料とし、合成法1に従い、Fmoc-MeLeu-OHの伸長（Oxyma、50℃、10時間）、次いでFmoc-Ile-OHの伸長（HOAt、40℃、2.5時間）を行い、化合物33を合成した。乾燥レジン（10.73 mg）を用い、Fmoc定量法により担持率を算出すると、0.334 mmol/gであった（294 nmにおけるUVarea値：3587.19、304 nmにおけるUVarea値：3234.07）。
　回収率は回収率算出法に従い、以下の式で算出した。
　回収率 = 0.334 × (1 ÷ 0.442 - 396.44 × 0.001 + 636.79 × 0.001) = 83.6%
　また切り出し反応液をLCMSで分析したところ、化合物33の脱樹脂体の純度は96.6 area%であり、過剰伸長体（化合物33b）が3.4 area%観測された。
分析条件：HPLC METHOD E
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000073
　以上の結果を下表にまとめる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000074
[実施例２－９]
Fmoc-Ile-MeVal-D-3-MeAbu-O-Trt(2-Cl)resin（化合物34）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000075
条件1による化合物34の合成（合成法1）
　固相原料合成３にて調製したアミノ酸担持レジン（化合物24）（Fmoc-D-3-MeAbu-O-Trt(2-Cl)resin）（100 mg, 0.369 mmol/g）を出発原料とし、合成法1に従い、Fmoc-MeVal-OHの伸長（HOAt、40℃、2.5時間）、次いでFmoc-Ile-OHの伸長（HOAt、40℃、2.5時間）を行い、化合物34を合成した。乾燥レジン（10.62 mg）を用い、Fmoc定量法により担持率を算出すると、0.295 mmol/gであった（294 nmにおけるUVarea値：3138.26、304 nmにおけるUVarea値：2821.05）。
　回収率は回収率算出法に従い、以下の式で算出した。
　回収率 = 0.295 × (1 ÷ 0.369 - 339.39 × 0.001 + 565.71 × 0.001) = 86.6%
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000076
　また切り出し反応液をLCMSで分析したところ、化合物34の脱樹脂体の純度は99.1 area%であり、過剰伸長体（化合物34b）が1.0 area%観測された。本基質では条件1においても欠損体（化合物34c）は観測されなかった。
分析条件：HPLC method G
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000077
条件2による化合物34の合成（合成法1）
　固相原料合成３にて調製したアミノ酸担持レジン（化合物24）（Fmoc-D-3-MeAbu-O-Trt(2-Cl)resin）（100 mg, 0.369 mmol/g）を出発原料とし、合成法1に従い、Fmoc-MeVal-OHの伸長（Oxyma、50℃、10時間）、次いでFmoc-Ile-OHの伸長（HOAt、40℃、2.5時間）を行い、化合物34を合成した。乾燥レジン（10.44 mg）を用い、Fmoc定量法により担持率を算出すると、0.284 mmol/gであった（294 nmにおけるUVarea値：2964.86、304 nmにおけるUVarea値：2667.78）。
　回収率は回収率算出法に従い、以下の式で算出した。
　回収率 = 0.284 × (1 ÷ 0.369 - 339.39 × 0.001 + 565.71 × 0.001) = 83.4%
　また切り出し反応液をLCMSで分析したところ、化合物34の脱樹脂体の純度は98.1 area%であり、過剰伸長体（化合物34b）が1.9 area%観測された。
分析条件：HPLC method G
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000078
　以上の結果を下表にまとめる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000079
[実施例２－１０]
Fmoc-Ile-MeChg-D-3-MeAbu-O-Trt(2-Cl)resin（化合物35）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000080
条件1による化合物35の合成（合成法1）
　固相原料合成３にて調製したアミノ酸担持レジン（化合物24）（Fmoc-D-3-MeAbu-O-Trt(2-Cl)resin）（100 mg, 0.369 mmol/g）を出発原料とし、合成法1に従い、Fmoc-MeChg-OHの伸長（HOAt、40℃、2.5時間）、次いでFmoc-Ile-OHの伸長（HOAt、40℃、2.5時間）を行い、化合物35を合成した。乾燥レジン（10.20 mg）を用い、Fmoc定量法により担持率を算出すると、0.293 mmol/gであった（294 nmにおけるUVarea値：2987.04、304 nmにおけるUVarea値：2692.68）。
　回収率は回収率算出法に従い、以下の式で算出した。
　回収率 = 0.293 × (1 ÷ 0.369 - 339.39 × 0.001 + 605.78 × 0.001) = 87.2%
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000081
　また切り出し反応液をLCMSで分析したところ、化合物35の脱樹脂体の純度は92.8 area%であり、過剰伸長体（化合物35b）が3.4 area%、欠損体（化合物34c）が3.8 area%観測された。
分析条件：HPLC method F
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000082
条件2による化合物35の合成（合成法1）
　固相原料合成３にて調製したアミノ酸担持レジン（化合物24）（Fmoc-D-3-MeAbu-O-Trt(2-Cl)resin）（100 mg, 0.369 mmol/g）を出発原料とし、合成法1に従い、Fmoc-MeChg-OHの伸長（Oxyma、50℃、10時間）、次いでFmoc-Ile-OHの伸長（HOAt、40℃、2.5時間）を行い、化合物35を合成した。乾燥レジン（9.56 mg）を用い、Fmoc定量法により担持率を算出すると、0.217 mmol/gであった（294 nmにおけるUVarea値：2072.81、304 nmにおけるUVarea値：1864.82）。
　回収率は回収率算出法に従い、以下の式で算出した。
　回収率 = 0.217 × (1 ÷ 0.369 - 339.39 × 0.001 + 605.78 × 0.001) = 64.6%
　また切り出し反応液をLCMSで分析したところ、化合物35の脱樹脂体の純度は94.5 area%であり、過剰伸長体（化合物35b）が5.5 area%観測された。
分析条件：HPLC method F
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000083
　以上の結果を下表にまとめる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000084
[実施例２－１１]
Fmoc-Ile-MeVal-MeGly-O-Trt(2-Cl)resin（化合物36）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000085
条件1による化合物36の合成（合成法1）
　固相原料合成４にて調製したアミノ酸担持レジン（化合物26）（Fmoc-MeGly-O-Trt(2-Cl)resin）（100 mg, 0.573 mmol/g）を出発原料とし、合成法1に従い、Fmoc-MeVal-OHの伸長（HOAt、40℃、2.5時間）、次いでFmoc-Ile-OHの伸長（HOAt、40℃、2.5時間）を行い、化合物36を合成した。乾燥レジン（10.20 mg）を用い、Fmoc定量法により担持率を算出すると、0.326 mmol/gであった（294 nmにおけるUVarea値：3322.12、304 nmにおけるUVarea値：3002.34）。
　回収率は回収率算出法に従い、以下の式で算出した。
　回収率 = 0.326 × (1 ÷ 0.573 - 311.34 × 0.001 + 537.66 × 0.001) = 64.3%
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000086
　また切り出し反応液をLCMSで分析したところ、化合物36の脱樹脂体の純度は95.6 area%であり、過剰伸長体（化合物36b）が4.4 area%観測された。本基質では条件1においても欠損体（化合物36c）は観測されなかった。
分析条件：HPLC METHOD E
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000087
条件2による化合物36の合成（合成法1）
　固相原料合成４にて調製したアミノ酸担持レジン（化合物26）（Fmoc-MeGly-(O-Trt(2-Cl)resin)）（100 mg, 0.573 mmol/g）を出発原料とし、合成法1に従い、Fmoc-MeVal-OHの伸長（Oxyma、50℃、10時間）、次いでFmoc-Ile-OHの伸長（HOAt、40℃、2.5時間）を行い、化合物36を合成した。乾燥レジン（10.69 mg）を用い、Fmoc定量法により担持率を算出すると、0.331 mmol/gであった（294 nmにおけるUVarea値：3542.66、304 nmにおけるUVarea値：3189.92）。
　回収率は回収率算出法に従い、以下の式で算出した。
　回収率 = 0.331 × (1 ÷ 0.573 - 311.34 × 0.001 + 537.66 × 0.001) = 65.3%
　また切り出し反応液をLCMSで分析したところ、化合物36の脱樹脂体の純度は93.9 area%であり、過剰伸長体（化合物36b）が6.1 area%観測された。
分析条件：HPLC METHOD E
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000088
　以上の結果を下表にまとめる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000089
　多様な配列で実施例条件Ａのpremature cleavage抑制効果検証
[実施例２－１２]
Fmoc-MeVal-MeLeu-OCTC (化合物39)の合成（実施例条件Ａによる合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000090
　フィルター付きの5 mLディスポーザブルシリンジに乾燥樹脂 (化合物38)を0.195 g (0.650 mmol/g, 0.127 mmol, 1.0 eq)秤量し、N,N-ジメチルホルムアミドを1.6 mL (10 v/w)加え30分間室温で静置させた。N,N-ジメチルホルムアミドを排出後、20%ピペリジンを含むN,N-ジメチルホルムアミド溶液を1.3 mL (8 v/w)を加え室温で15分間振盪させた。反応溶液を排出後、20%ピペリジンを含むN,N-ジメチルホルムアミド溶液を1.3 ml (8 v/w)を再び加え室温で15分間振盪させた。反応溶液を排出後、N,N-ジメチルホルムアミド 1.6 mL (10 v/w)で8回洗浄した。次にバイアルにFmoc-MeVal-OH 90 mg (0.25 mmol, 2.0 eq)とOxyma 18 mg (0.13 mmol, 1.0 eq)を秤量し、N,N-ジメチルホルムアミドを 0.62 mL (4 v/w)を加え溶解させた。この溶液にDIC を80 μL (0.51 mmol, 4.0 eq)加えた後、直ぐにディスポーザブルシリンジで吸引し、密封後室温にて18時間振盪させた。反応溶液を排出後、N,N-ジメチルホルムアミド 1.6 mL (10 v/w) で4回、次に2-プロパノール1.6 mL (10 v/w)で2回、続いてメタノール1.6 mL (10 v/w)で4回洗浄した後、終夜室温にて減圧乾燥し、0.201 gの乾燥樹脂 (化合物39)を得た。得られた樹脂を100 mLメスフラスコに16.7 mg秤量し、20%ピペリジンを含むN,N-ジメチルホルムアミド溶液でメスアップし45分室温で振盪した。分光光度計を用いて溶液の吸光度からFmoc定量を行い、得られたFmoc定量値と乾燥樹脂の質量とLC A%から収率を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000091
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000092
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000093
　また、出発原料残存率を確認するためにGlycine cappingを実施した。すなわち、縮合反応を行った乾燥樹脂約10 mgをフィルター付きの5 mLディスポーザブルシリンジに秤量したのち、N,N-ジメチルホルムアミド 1 mLを加え室温で15分静置した。 N,N-ジメチルホルムアミドを排出後、反応用カクテル(バイアルにFmoc-Gly-OH 約70 mgとHATU約0.11 gを秤量し、N,N-ジメチルホルムアミド 0.45 mLに懸濁させた後、N,N-ジイソプロピルエチルアミンを45 μL加えて1分間振盪した淡黄色の均一溶液)をディスポーザブルシリンジで吸引し、室温で1時間振盪させた。反応溶液を排出後、N,N-ジメチルホルムアミド 1 mLで6回、次にジクロロメタン1 mLで4回洗浄後、脱樹脂反応を行った。Gly-cap体 (化合物40)と、目的物 (化合物39)、エピマー体 (化合物39a)、過剰伸長体 (化合物39b)のLC A%の和とから出発原料残存率を0% (0 ÷ (0 + 98.6 + 0 + 0))と算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000094
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000095
　脱樹脂体（化合物39）を良好な収率で得ることができた。過剰伸長体（化合物39b）およびエピマー体 (化合物39a)の生成は確認されなかった。
［参照例４］
Chem. Eur. J., 2009, 15, 9394-9403に記載の反応条件（レジンのアミノ酸に対し、Fmocアミノ酸：DIC：添加剤（Oxyma）＝２：２：２の反応条件：以降、参照例条件Ａと呼ぶ）によるFmoc-MeVal-MeLeu-OCTC (化合物39)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000096
　フィルター付きの5 mLディスポーザブルシリンジに乾燥樹脂 (化合物38)を0.204 g (0.650 mmol/g, 0.133 mmol, 1.0 eq)秤量し、N,N-ジメチルホルムアミドを1.6 mL (10 v/w)加え30分間室温で静置させた。N,N-ジメチルホルムアミドを排出後、20%ピペリジンを含むN,N-ジメチルホルムアミド溶液を1.3 mL (8 v/w)を加え室温で15分間振盪させた。反応溶液を排出後、20%ピペリジンを含むN,N-ジメチルホルムアミド溶液を1.3 mL (8 v/w)再び加え室温で15分間振盪させた。反応溶液を排出後、N,N-ジメチルホルムアミド 1.6 mL (10 v/w)で8回洗浄した。次にバイアルにFmoc-MeVal-OH 96 mg (0.26 mmol, 2.0 eq)とOxyma 38 mg (0.26 mmol, 2.0 eq)を秤量し、N,N-ジメチルホルムアミド を0.65 mL (4 v/w)加え溶解させた。続いてDIC を42 μl (0.26 mmol, 2.0 eq)バイアルに室温で加えた後、容器を密閉し2分間室温で振盪した。この溶液をディスポーザブルシリンジで吸引し、密封後室温にて18時間振盪させた。反応溶液を排出後、N,N-ジメチルホルムアミド 1.6 mL (10 v/w) で4回、次に2-プロパノール1.6 mL (10 v/w)で2回、続いてメタノール1.6 mL (10 v/w)で4回洗浄した後、終夜室温にて減圧乾燥し、0.181 gの乾燥樹脂 (化合物3)を得た。得られた樹脂を100 mLメスフラスコに19.0 mg秤量し、20%ピペリジンを含むN,N-ジメチルホルムアミド溶液でメスアップし45分室温で振盪した。分光光度計を用いて溶液の吸光度からFmoc定量を行い、得られたFmoc定量値と乾燥樹脂の質量とLC A%から収率を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000097
　実施例条件Ａと同様の手法を用い、参照例条件Ａでも出発原料残存率0%を確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000098
 　上記の参照例条件Ａの反応条件では、目的物の収率、純度ともに低下することが分かった。
　上記1残基+1残基縮合実験もとに、以下の配列を実施例条件Ａと参照例条件Ａ下で合成した。
[実施例２－１３]
Fmoc-D-MeVal-MeLeu-OCTC (化合物41)の合成（実施例条件Ａによる合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000099
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000100
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000101
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000102
[実施例２－１４]
Fmoc-Lys(Z)-MeVal-OCTC (化合物43)の合成（実施例条件Ａおよび参照例条件Ａによる合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000103
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000104
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000105
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000106
[実施例２－１５]
Fmoc-MeVal-MeAla-OCTC (化合物45)の合成（実施例条件Ａおよび参照例条件Ａによる合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000107
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000108
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000109
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000110
[実施例２－１６]
Fmoc-MeVal-MeGly-OCTC (化合物47)の合成（実施例条件Ａおよび参照例条件Ａによる合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000111
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000112
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000113
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000114
[実施例２－１７]
Fmoc-MeVal-MePhe-OCTC (化合物49)の合成（実施例条件Ａおよび参照例条件Ａによる合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000115
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000116
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000117
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000118
[実施例２－１８]
Fmoc-Glu(OBzl)-MeTrp(Boc)-OCTC (化合物51)の合成（実施例条件Ａおよび参照例条件Ａによる合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000119
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000120
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000121
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000122
[実施例２－１９]
Fmoc-Aze(2)-MeThr(Bzl)-OCTC (化合物53)の合成（実施例条件Ａおよび参照例条件Ａによる合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000123
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000124
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000125
[実施例２－２０]
Fmoc-Lys(Z)-MeGlu(OtBu)-OCTC (化合物55)の合成（実施例条件Ａおよび参照例条件Ａによる合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000126
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000127
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000128
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000129
[実施例２－２１]
Fmoc-Thr(tBu)-MeLys(Boc)-OCTC (化合物57)の合成（実施例条件Ａおよび参照例条件Ａによる合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000130
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000131
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000132
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000133
[実施例２－２２]
Fmoc-MePhe-MeMet-OCTC (化合物59)の合成（実施例条件Ａおよび参照例条件Ａによる合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000134
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000135
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000136
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000137
[実施例２－２３]
Fmoc-cVal-Aze(2)-OCTC (化合物61)の合成（実施例条件Ａおよび参照例条件Ａによる合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000138
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000139
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000140
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000141
[実施例２－２４]
Fmoc-Gly-Gly-OCTC (化合物63)の合成（実施例条件Ａおよび参照例条件Ａによる合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000142
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000143
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000144
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000145
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000146
　なお、Entry 2 および 3 では、反応時間を18時間から1時間に短縮した。
[実施例２－２５]
Fmoc-Gly-Leu-OCTC (化合物65)の合成（実施例条件Ａおよび参照例条件Ａによる合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000147
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000148
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000149
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000150
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000151
 　なお、Entry 2 および 3 では、反応時間を18時間から1時間に短縮した。
[実施例２－２６]
Fmoc-Pro-Aib-OCTC (化合物67)の合成（実施例条件Ａおよび参照例条件Ａによる合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000152
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000153
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000154
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000155
[実施例２－２７]
Fmoc-Gly-bAla-OCTC (化合物69)の合成（実施例条件Ａおよび参照例条件Ａによる合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000156
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000157
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000158
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000159
[実施例２－２８]
Fmoc-MeVal-bMeAla-OCTC (化合物71)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000160
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000161
　本配列の伸長は、実施例条件Ａを3点変更し実施した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000162
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000163
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000164
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000165
[実施例２－２９]
Fmoc-MeVal-D-3-MeAbu-OCTC (化合物73)の合成（実施例条件Ａおよび参照例条件Ａによる合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000166
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000167
　本配列の伸長は、実施例条件Ａを1点変更し実施した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000168
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000169
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000170
[実施例２－３０]
Fmoc-Ser(tBu)-MeLeu-OCTC (化合物75)の合成（実施例条件Ａおよび参照例条件Ａによる合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000171
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000172
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000173
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000174
　以上の結果を下表にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000175
　いずれの配列においても実施例条件Ａは参照例条件Ａに比べpremature cleavageを抑制し、良好な収率で2残基のペプチドを与えた。とりわけN-Meαアミノ酸の場合における抑制効果は顕著であった。
[実施例２－３１]
Premature cleavageの抑制効果を生む試薬当量範囲の探索実験
　上記[1残基+1残基縮合実験]（実施例条件Ａ）をもとに、試薬当量を変更して同じ反応を実施した結果を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000176
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000177
　参照例条件Ａ下でFmocアミノ酸の当量を増加させても収率は殆ど改善しなかった(Entry 1, 3)。
　一方、Oxymaの当量を減じると純度、収率が改善した(Entry 4, 8, 13, 16)。
また、DICの当量を増やすと純度、収率が改善した(Entry 5, 6)。
　さらにOxymaの当量を減じ、かつDICの当量を増やすと純度、収率が改善した(Entry 2, 9, 10, 11, 12, 14, 15)。
　とりわけEntry 2, 9, 10, 11では収率が75%を上回る結果を得た。
　以上、実施例２－１～実施例２－３１では、Fmocアミノ酸に対してＤＩＣを１当量以上使用し、添加剤を１当量以下使用する条件でN末端がN-Me化されたアミノ酸もしくはペプチドを伸長し目的のペプチドを合成した。3残基目まで伸長した場合の回収率はいずれも53%を上回り、高いものは90％以上だった。参照例条件Aと比較実験したものは、実施例条件Aの収率および純度とも同等以上だった。
[参照例１]
Chem. Eur. J., 2009, 15, 9394-9403)のFmoc-MeVal-MeAsp（OCTC）-pip (化合物5)の合成（レジンのアミノ酸に対し、Fmocアミノ酸：DIC：添加剤（Oxyma）＝２：２：２の反応条件：参照例条件Ａ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000178
　フィルター付きの5 mLディスポーザブルシリンジに乾燥樹脂(化合物4)を0.200 g (0.525 mmol/g, 0.104 mmol, 1.0 eq)秤量し、N,N-ジメチルホルムアミドを1.3 mL (10 v/w)加え30分間室温で静置させた。N,N-ジメチルホルムアミドを排出後、20%ピペリジンを含むN,N-ジメチルホルムアミド溶液を1.1 mL (8 v/w)を加え室温で15分間振盪させた。反応溶液を排出後、20%ピペリジンを含むN,N-ジメチルホルムアミド溶液を1.1 mL (8 v/w)再び加え室温で15分間振盪させた。反応溶液を排出後、N,N-ジメチルホルムアミド 1.3 mL (10 v/w)で8回洗浄した。次にバイアルにFmoc-MeVal-OH 74 mg (0.21 mmol, 2.0 eq)とOxyma 30 mg (0.21 mmol, 2.0 eq)を秤量し、N,N-ジメチルホルムアミド を0.54 mL (4 v/w)加え溶解させた。続いてDIC を33 μl (0.21 mmol, 2.0 eq)バイアルに室温で加えた後、容器を密閉し2分間室温で振盪した。この溶液をディスポーザブルシリンジで吸引し、密封後室温にて6時間振盪させた。反応溶液を排出後、N,N-ジメチルホルムアミド1.3 mL (10 v/w)で4回、次に2-プロパノール1.3 mL (10 v/w)で2回、続いてメタノール1.3 mL (10 v/w)で4回洗浄した後、終夜室温にて減圧乾燥し、0.178 gの乾燥樹脂 (化合物5)を得た。得られた樹脂を100 mLメスフラスコに21.6 mg秤量し、20%ピペリジンを含むN,N-ジメチルホルムアミド溶液でメスアップし45分室温で振盪した。分光光度計を用いて溶液の吸光度からFmoc定量を行い、得られたFmoc定量値と乾燥樹脂の質量とLC A%から収率を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000179
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000180
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000181
 *Glycine capping実験の質量分析から過剰伸長体Bと同定した。
　また、出発原料残存率を確認するためにGlycine cappingを実施した。すなわち、縮合反応後の反応液を濾過して得た樹脂約10 mgを、N,N-ジメチルホルムアミド懸濁液としてフィルター付きの5 mLディスポーザブルシリンジに移した。N,N-ジメチルホルムアミドを排出後、N,N-ジメチルホルムアミド 1 mLで3回洗浄した。反応用カクテル(バイアルにFmoc-Gly-OH 約70 mgとHATU約0.11 gを秤量し、N,N-ジメチルホルムアミド0.45 mLに懸濁させた後、N,N-ジイソプロピルエチルアミンを45 μL加えて1分間振盪した淡黄色の均一溶液)をディスポーザブルシリンジで吸引し、室温で1時間振盪させた。反応溶液を排出後、N,N-ジメチルホルムアミド1 mLで6回、次にジクロロメタン1 mLで4回洗浄後、脱樹脂反応を行った。Gly-cap体(化合物13)と、エピマー体(化合物6)、目的物(化合物7)、過剰伸長体 (化合物8)、過剰伸長体(化合物9)のLC A%の和とから出発原料残存率を1.3% (1.3÷(1.3+79.9+13.4+2.3))と算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000182
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000183
　上記の反応条件では、目的物の収率が低下することが分かった。反応が未完結であることがGly-cap体(化合物13)の生成から確認される一方、過剰伸長体（化合物8、および化合物9）の生成が認められた。
[参照例２]
Eur. J. Org. Chem., 2013, 6372-6378に記載の反応条件でのFmoc-MeVal-MeAsp（OCTC）-pip (化合物5)の合成（レジンのアミノ酸に対し、Fmocアミノ酸：DIC：添加剤（K-Oxyma）＝２：２：２の反応条件）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000184
　フィルター付きの5 mLディスポーザブルシリンジに乾燥樹脂(化合物4)を0.202 g (0.525 mmol/g, 0.105 mmol, 1.0 eq)秤量し、N,N-ジメチルホルムアミドを1.3 mL (10 v/w)加え30分間室温で静置させた。N,N-ジメチルホルムアミドを排出後、20%ピペリジンを含むN,N-ジメチルホルムアミド溶液を1.1 mL (8 v/w)を加え室温で15分間振盪させた。反応溶液を排出後、20%ピペリジンを含むN,N-ジメチルホルムアミド溶液を1.1 mL (8 v/w)再び加え室温で15分間振盪させた。反応溶液を排出後、N,N-ジメチルホルムアミド 1.3 mL (10 v/w)で8回洗浄した。次にバイアルにFmoc-MeVal-OH 75 mg (0.21 mmol, 2.0 eq)とK-Oxyma 40 mg (0.21 mmol, 2.0 eq)を秤量し、N,N-ジメチルホルムアミドを0.54 mL (4 v/w)加え溶解させた。続いてDICを33 μl (0.21 mmol, 2.0 eq)バイアルに室温で加えた後、直ぐにこの溶液をディスポーザブルシリンジで吸引し、密封後室温にて6時間振盪させた。反応溶液を排出後、N,N-ジメチルホルムアミド1.3 mL (10 v/w)で4回、次に2-プロパノール1.3 mL (10 v/w)で2回、続いてメタノール1.3 mL (10 v/w)で4回洗浄した後、終夜室温にて減圧乾燥し、0.188 gの乾燥樹脂(化合物5)を得た。得られた樹脂を100 mLメスフラスコに21.0 mg秤量し、20%ピペリジンを含むN,N-ジメチルホルムアミド溶液でメスアップし45分室温で振盪した。分光光度計を用いて溶液の吸光度からFmoc定量を行い、得られたFmoc定量値と乾燥樹脂の質量とLC A%から収率を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000185
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000186
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000187
　上記の反応条件では、目的物の収率が低下することが分かった。過剰伸長体 （化合物8）は抑制されるが、エピマー体（化合物6）の生成増加が認められた。
[1残基+2残基縮合実験][出発原料合成]
　縮合反応用の出発原料であるH-MeVal-MeAsp(OCTC)-pip (化合物14)は、本明細書に記載の担持、縮合、脱Fmoc条件を踏襲し合成した。1残基+1残基の縮合は実施例条件Ａに準じ実施した。
　縮合反応用の原料 (化合物14)のペプチド担持率は理論上0.63 mmol/gである。これは以下のように算出した。
1. Fmoc-MeAsp(OH)-pip (化合物3)をCTCレジンに担持した後の乾燥樹脂 (化合物4)のFmoc定量値を実施し、測定値は0.59 mmol/gであった。
2. この乾燥樹脂(化合物4) 1 gは、化合物3の分子量が436.51 (g/mol)であることを考慮すると、下式より0.258 gの化合物1と0.742 gの樹脂成分で構成される。
化合物3： 0.59 (mmol/g) x 1 (g) x 436.51 (g/mol) = 0.258 (g)。
樹脂成分： 1 (g) - 0.258 (g) = 0.742 (g)
3. 乾燥樹脂 (化合物4) 1 gから得られる縮合反応用の原料 (化合物14)の理論収量は、H-MeVal-MeAsp(OH)-pip (化合物15)質量が化合物3の物質量とペプチドの分子量に基づき算出可能であり、樹脂成分質量は反応前後で不変と考えると、
化合物14： 0.59 (mmol/g) x 1 (g) x 327.43 (g/mol) + 0.742 = 0.935 (g)
よって理論上の縮合反応用の原料(化合物14)のペプチド担持率は0.63 (mmol/g) (0.59 ÷ 0.935 = 0.63)となる。
　本参照例でも、固相反応実施時の溶媒量を倍量(v/w)で表記する場合がある。1残基+1残基縮合実験とは異なり、本参照例での倍量の基準は、乾燥樹脂(化合物14)の質量であり、乾燥樹脂100 mgに対しN,N-ジメチルホルムアミド0.80 mL用いる場合の倍量は0.80 mL ÷ 0.100 (g) = 8 v/wである。
[実施例３]
Fmoc-cLeu-MeVal-MeAsp（OCTC）-pip (化合物16)の合成（実施例条件Ａによる合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000188
[縮合実験]
　バイアルにFmoc-cLeu-OH 67 mg (0.19 mmol, 3.0 eq)とOxyma 13 mg (0.095 mmol, 1.5 eq)を秤量し、N,N-ジメチルホルムアミド0.80 mL (8 v/w)を加え、溶解させた。この溶液にDIC 59 μL (0.38 mmol, 6.0 eq)を加え、室温で2時間振盪させた。この反応溶液に乾燥樹脂(化合物14)を0.10 g (0.63 mmol/g, 0.063 mmol, 1.0 eq）加え、室温で24時間振盪させた。
[転換率確認実験]
　もう一つのバイアルにFmoc-Gly-OH 62 mg (0.21 mmol, 3.3 eq)とOxyma 30 mg (0.21 mmol, 3.3 eq)を秤量し、N,N-ジメチルホルムアミド 0.40 mL (4 v/w)を加え、溶解させた。この溶液にDIC 65 μL (0.42 mmol, 6.6 eq)を加え、室温で1時間振盪させた。この溶液をFmoc-cLeu-OHの反応溶液へ移し、室温で2時間振盪させた。反応溶液をフィルター付きのディスポーザブルシリンジへ移し、反応溶液とレジンを濾別した。樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド0.80 mL (8 v/w)、イソプロパノール0.80 mL (8 v/w)を用いて交互に2回ずつ洗浄後、N,N-ジメチルホルムアミド0.80 mL (8 v/w)で2回洗浄し、最後にMTBE 0.80 mL (8 v/w)で洗浄し、室温で通風乾燥させた。得られた乾燥樹脂(化合物16)を1% TFAのジクロロメタン溶液1 mLに浸して、脱樹脂反応を行った。
Gly-cap体(化合物17)と目的物(化合物18)のLC A%から、変換率を75% (68.9 ÷ (23.5 + 68.9)と算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000189
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000190
　上記[縮合実験]をもとに、[縮合実験]の一部を変更して同じ反応を実施した結果を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000191
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000192
　立体障害の大きなアミノ酸であるFmoc-cLeu-OHを縮合させる反応で、DICとOxymaを用いると、縮合反応が効率よく進行することが分かった。Entry 1と比較し、添加剤をOxymaからそれぞれHOAt、HOOBt、またはTCNHPIに変更（Entry 2～Entry 4）したところ、変換率が著しく低下した。Oxymaを用いない場合（Entry 5）、変換率が著しく低下した。溶媒を8 v/w（Entry 1）から4 v/w（Entry 6）に変更した場合、変換率が向上した。添加剤はOxymaが優れていることが分かった。Oxymaを用いると変換率が向上することが分かった。反応溶媒を減らすと、変換率が向上することが分かった。
[参照例３]
Chem. Eur. J., 2009, 15, 9404-9416に記載の反応条件でのFmoc-cLeu-MeVal-MeAsp（OCTC）-pip (化合物15)の合成（レジンのアミノ酸に対し、Fmocアミノ酸：縮合剤（COMU）＝３：３の反応条件）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000193
[縮合実験]
　バイアルにFmoc-cLeu-OH 73 mg (0.21 mmol, 3.0 eq)とCOMU 89 mg (0.21 mmol, 3.0 eq)を秤量し、N,N-ジメチルホルムアミド0.80 mL (8 v/w)を加え、溶解させた。この溶液にN,N-ジイソプロピルエチルアミン73 μL (0.42 mmol, 6.0 eq)を加え、室温で30分間振盪させた。この反応溶液に乾燥樹脂(化合物14)を0.10 g (0.63 mmol/g, 0.063 mmol, 1.0 eq）加え、室温で16時間振盪させた。
[転換率確認実験]
　もう一つのバイアルにFmoc-Gly-OH 62 mg (0.21 mmol, 3.3 eq)とOxyma 30 mg (0.21 mmol, 3.3 eq)を秤量し、N,N-ジメチルホルムアミド0.40 mL (4 v/w)を加え、溶解させた。この溶液にDIC 65 μL (0.42 mmol, 6.6 eq)を加え、室温で1時間振盪させた。この溶液をFmoc-cLeu-OHの反応溶液へ移し、室温で2時間振盪させた。反応溶液をフィルター付きのディスポーザブルシリンジへ移し、反応溶液とレジンを濾別した。樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド 0.80 mL (8 v/w)、イソプロパノール0.80 mL (8 v/w)を用いて交互に2回ずつ洗浄後、N,N-ジメチルホルムアミド0.80 mL (8 v/w)で2回洗浄し、最後にMTBE 0.80 mL (8 v/w)で洗浄し、室温で通風乾燥させた。得られた乾燥樹脂(化合物16)を1% TFAのジクロロメタン溶液1 mLに浸して、脱樹脂反応を行った。
Gly-cap体(化合物17)と目的物(化合物18)のLC A%から、変換率を5.1% (4.7 ÷ (88.3 + 4.7)と算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000194
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000195
　立体障害の大きなアミノ酸であるFmoc-cLeu-OHを縮合させる反応でCOMUを用いると、縮合反応の進行率は5％であり、未反応のGly-cap体（化合物17）が主成績体であった。
　本発明により、従来法を適用した場合に縮合反応が未達となるような、反応性に乏しい配列を含むペプチド化合物を効率的に製造する方法が提供される。

Claims (16)

  1. 　第一のアミノ酸またはペプチドと、第二のアミノ酸またはペプチドとを、添加剤および縮合剤の存在下で縮合させて縮合体を得る工程を含む、ペプチド化合物を製造する方法であって、
    　添加剤のモル数が、第二のアミノ酸またはペプチドのモル数よりも少ない、前記方法。
  2. 　第二のアミノ酸またはペプチドに対する添加剤のモル比が0.8以下である、請求項1に記載の方法。
  3. 　第二のアミノ酸またはペプチドに対する縮合剤のモル比が1.0以上である、請求項1または2記載の方法。
  4. 　第二のアミノ酸またはペプチドに対する縮合剤のモル比が1.2～4.0である、請求項1～3のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　第一のアミノ酸またはペプチドに対する第二のアミノ酸またはペプチドのモル比が10以下である、請求項1～4のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　第一のアミノ酸またはペプチドに対する第二のアミノ酸またはペプチドのモル比が1～2であって、第二のアミノ酸またはペプチドに対する添加剤のモル比が0.7以下である、請求項1～5のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　第一のアミノ酸またはペプチドに対する第二のアミノ酸またはペプチドのモル比（第1のモル比）が2以上であって、第二のアミノ酸またはペプチドに対する添加剤のモル比が、第1のモル比－1以下である、請求項1～6のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　第一のアミノ酸またはペプチドに対する添加剤のモル比が2.0以下である、請求項1～7のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　第一のアミノ酸またはペプチドに対する縮合剤のモル比が1.3以上である、請求項1～8のいずれか一項に記載の方法。
  10. 　添加剤が、Oxyma、HOBt、HOOBt、またはHOAtである、請求項1～9のいずれか一項に記載の方法。
  11. 　縮合剤が、DIC、DCC、EDCI、またはEDCI・HClである、請求項1～10のいずれか一項に記載の方法。
  12. 　前記ペプチド化合物が前記縮合体であるか、あるいは、前記ペプチド化合物がその構造中に前記縮合体を含む、請求項1～11のいずれか一項に記載の方法。
  13. 　第一のアミノ酸、または第一のペプチドのN末端のアミノ酸、および／もしくは第一のペプチドのC末端のアミノ酸が、N-アルキルアミノ酸である、請求項1～12のいずれか一項に記載の方法。
  14. 　第一のアミノ酸、または第一のペプチドのC末端のアミノ酸が、N-アルキルβアミノ酸である、請求項13に記載の方法。
  15. 　第二のアミノ酸、または第二のペプチドのC末端のアミノ酸が、α，α-ジ置換アミノ酸、β-分岐アミノ酸、またはN-アルキルアミノ酸である、請求項1～14のいずれか一項に記載の方法。
  16. 　請求項1～15のいずれか一項に記載の方法によってペプチド化合物を得る工程、および
    　該ペプチド化合物を環化する工程
    を含む、環状ペプチド化合物の製造方法。
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