WO2021201609A1 - 췌도 이식 보호용 조성물 - Google Patents

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WO2021201609A1
WO2021201609A1 PCT/KR2021/004022 KR2021004022W WO2021201609A1 WO 2021201609 A1 WO2021201609 A1 WO 2021201609A1 KR 2021004022 W KR2021004022 W KR 2021004022W WO 2021201609 A1 WO2021201609 A1 WO 2021201609A1
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compound
formula
islets
islet
composition
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PCT/KR2021/004022
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English (en)
French (fr)
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진상만
김재현
김규리
이한신
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주식회사 엘지화학
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
    • C07D405/12—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links

Definitions

  • the present invention relates to a composition having a protective effect upon transplantation of islets, and more particularly, to provide a protective effect against oxidative stress and inflammation during islet transplantation comprising a compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof. It relates to a composition capable of:
  • n, X, R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 and R 6 are as defined in the specification.
  • Type 1 diabetes or type 2 diabetes which has recently been rapidly increasing, is highly dependent on insulin because pancreatic ⁇ -cells are destroyed, and the incidence of life-threatening hypoglycemia and diabetic complications is high.
  • Islet transplantation refers to an operation in which a pancreas donated from a brain dead is biochemically treated to isolate pure islets, and then administered to a recipient. The purpose of surgery is to allow diabetic patients to control their blood sugar normally without insulin administration. Transplanted islets secrete insulin, allowing the recipient to lead a normal life without insulin administration.
  • pancreatic islet transplantation has been a promising strategy to eliminate severe hypoglycemia and achieve normoglycemia in patients with type 1 diabetes, exacerbated by impaired awareness of hypoglycemia.
  • the substantial loss of transplanted islet mass during the peri-transplant period remains a significant obstacle to its widespread clinical use.
  • hypoxia/reoxygenation-induced injury and the release of damage-associated molecular patterns are associated with innate immunity and pro-inflammatory effects. It is increasingly recognized as a potent activator of proinflammatory cytokine production. Unlike apoptosis, which is a non-inflammatory or even anti-inflammatory mode of cell death, necroptosis or necrosis is highly immunogenic. Both DAMPs released from necrotic cells and cell-specific activation of the nucleotide-binding oligomerization domain (NOD)-like receptor protein 3 (NLRP3) inflammasome during necrosis are responsible for this immunogenicity, at least in part.
  • NOD nucleotide-binding oligomerization domain
  • NLRP3 nucleotide-binding oligomerization domain
  • ROS mitochondrial reactive oxygen species
  • mPTP mitochondrial permeability transition pore
  • the present invention provides a composition for protecting islet transplantation comprising a compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient:
  • n 0 or 1
  • X is C or N, provided that when X is N, n is 0, and when X is C, n is 1;
  • R 1 is hydrogen or C 1 -C 6 alkyl
  • R 2 is phenyl or pyridine
  • R 3 is hydrogen, halogen or C 1 -C 6 alkyl
  • R 4 is hydrogen, halogen, 2-carboxy-pyrrolidin-1-yl, pyrrolidin-1-yl, 4-acetic acid-1,3-thiazolin-2-yl, —CH 2 -(1,1 -dioxo-thiomorpholin-4-yl) or -CH 2 -(2-oxopiperazin-4-yl);
  • R 5 is hydrogen, C 1 -C 6 alkyl or C 3 -C 6 cycloalkyl
  • R 6 represents -DWR 7 , wherein D is cyclopentyl, cyclohexyl, pyrrolidine, tetrahydropyran, tetrahydrofuran or piperidine; W is a direct bond, -SO 2 -, -CO-, -C(O)O-; R 7 is hydrogen, hydroxy or C 1 -C 6 alkyl.
  • the compound of Formula 1 is (tetrahydropyran-4-yl)-[2-phenyl-5-(1,1-dioxo-thiomorpholin-4-yl) of Formula 2 )methyl-1H-indol-7-yl]amine:
  • the pharmaceutically acceptable salt is an acid that forms a non-toxic acid addition salt containing a pharmaceutically acceptable anion, such as sulfuric acid, hydrochloric acid, nitric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, iodide inorganic acids such as hydrochloric acid and the like; organic carboxylic acids such as tartaric acid, formic acid, citric acid, acetic acid, trichloroacetic acid, trifluoroacetic acid, gluconic acid, benzoic acid, lactic acid, fumaric acid, maleic acid, salicylic acid and the like; acid addition salts formed with sulfonic acids such as methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, naphthalenesulfonic acid, and the like.
  • a pharmaceutically acceptable anion such as sulfuric acid, hydrochloric acid, nitric acid, phosphoric acid
  • base addition salts such as alkali metal or alkaline earth metal salts formed with lithium, sodium, potassium, calcium, magnesium and the like; amino acid salts such as lysine, arginine, and guanidine; organic salts such as dicyclohexylamine, N-methyl-D-glucamine, tris(hydroxymethyl)methylamine, diethanolamine, choline, triethylamine, and the like.
  • the compound of Formula 1 according to the present invention can be converted into a salt thereof by a conventional method, and the preparation of the salt can be easily performed by a person skilled in the art based on the structure of Formula 1 without a separate explanation. .
  • Pancreatic islet (pancreatic islet) transplantation is a procedure in which only insulin-producing islet cells from the pancreas are isolated and transplanted into a recipient.
  • ⁇ -cells are vulnerable to oxidative stress due to a weak antioxidant defense system.
  • Various factors including hypothermia, mechanical stress, and collagenase exposure during islet isolation, can generate oxidative stress and ultimately lead to cell death.
  • hypothermia can generate oxidative stress and ultimately lead to cell death.
  • apoptosis Under low oxygen and nutrient utilization in the process of islet transplantation and revascularization, apoptosis, autophagy, necrosis and necroptosis occur in islets. Unlike necrosis, apoptosis generally does not involve an inflammatory response, but primary apoptosis in islets by hypoxia is immune to provide non-cleaved caspase-9 and caspase-3 rather than cleaved forms. can induce activation.
  • DAMP damage-associated molecular patterns
  • TLRs Toll-like receptors
  • HMGB1 is secreted by damaged or necrotic cells during apoptosis, plays a role in DAMP signaling and proinflammatory cytokines, and is implicated in the pathogenesis of various inflammatory diseases.
  • cytokines such as interleukin (IL)-1 ⁇ , interferon (IFN)- ⁇ , and tumor necrosis factor (TNF)- ⁇
  • IFN interleukin
  • TNF tumor necrosis factor
  • NF-kB is a transcription factor that induces oxidative stress by regulating NADPH oxidase.
  • Concerted action of proinflammatory cytokines induces expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS), blockade of iNOS activity or increased expression of manganese peroxide dismutase (MnSOD) Attenuates cytokine-induced NF-kB activation under in vitro conditions in insulin-producing cell lines.
  • iNOS inducible nitric oxide synthase
  • MnSOD manganese peroxide dismutase
  • isolated human islets are generally cultured under serum-deprived culture conditions prior to clinical allogeneic islet transplantation. During culturing of islets under serum-starved conditions, the islets are further exposed to various stresses in the culture medium, nutrient deprivation, various pro-inflammatory cytokines, enzymes from the exocrine pancreas, and a lack of adequate oxygenation, these stresses being detrimental to the ⁇ -cells. and induce excessive accumulation of ROS.
  • IAPP islet amyloid polypeptide
  • the compound of Formula 1 of the present invention can protect islets by reducing the amount of oxidative stress and reactive oxygen species (ROS) when treated while isolating islets.
  • ROS reactive oxygen species
  • cytokines e.g., interleukin-1 ⁇ , interleukin-6 and tumor necrosis factor (TNF)- ⁇
  • ROS mitochondrial reactive oxygen species
  • the compound of Formula 1 of the present invention effectively protects the islets during treatment while isolating islets through the above-mentioned mechanism of action or when the isolated islets are treated during serum-deficient culture, thereby dramatically reducing the diabetes reversal rate after islet transplantation. can be improved
  • composition of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier, if necessary.
  • carrier means a material that facilitates the addition of a compound into a cell or tissue, and there is no particular limitation thereto.
  • composition of the present invention can significantly improve the success rate in islet transplantation by providing an excellent protective effect on islet cells.
  • Figure 2 shows the C57BL/6 treatment of compound 1 during isolation of islets. This is the result of evaluating the effect on the in vitro survival rate, function and expression of proinflammatory cytokines in mouse islets.
  • Figure 4 shows that treatment of compound 1 during serum-deficient culture RINm5F cells and This is the result of evaluating the effect on cell viability and ROS of hIAPP +/- mouse islets.
  • Compound 1 (Tetrahydropyran-4-yl)-[2-phenyl-5-(1,1-dioxo-thiomorpholin-4-yl)methyl-1H-indol-7-yl]amine (hereinafter "Compound 1 ”) was synthesized according to the method disclosed in Example 36 of International Publication No. WO 2009/025478.
  • hIAPP +/- FVB/N mice Heterozygous human islet amyloid polypeptide transgenic ( hIAPP +/- ) FVB/N mice (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA), C58BL/6 mice (Orient Bio, Seongnam, Korea) and cynomolgus monkeys Islets were isolated from (Macaca fascicularis; Orient Bio, Seongnam, Korea).
  • rat insulinoma cells RINm5F cells
  • tBHP tert-butyl hydroperoxide
  • RINm5F cells were suspended in DMEM medium (Gibco, Grand Island, NY, USA) containing 100 IU/mL penicillin and 100 ⁇ g/mL streptomycin, and cultured at 37° C. in a fully humidified 5% CO 2 atmosphere. All experimental protocols in this study were approved by the Animal Experimental Ethics Committee (IACUC) of Samsung Biomedical Research Institute.
  • IACUC Animal Experimental Ethics Committee
  • Mouse islets were isolated from hIAPP +/- and C57BL/6 mice aged 10-12 weeks, as described above. Briefly, 0.8 mg/mL of collagenase in HBSS buffer (Hank's buffered saline solution, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) with or without 20 ⁇ M compound 1 was added to the common bile duct. ) was injected to treat the mouse pancreas (digestion). Treated mouse pancreas was purified using a Ficoll (Biochrom, Berlin, Germany) gradient and washed several times with 1x HBSS. The isolated islets were cultured while freely floating in 10 mL of RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, NY, USA). Prior to ex vivo and in vivo studies, the medium was supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) at 37° C. and 5% CO 2 culture.
  • FBS heat-inactivated fetal bovine serum
  • NHP nonhuman primate
  • hIAPP +/- FVB/N and C57BL/6J mice were suspended in RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, NY, USA) containing 100 IU/mL penicillin and 100 ⁇ g/mL streptomycin and fully humidified 5 % CO 2 Incubated at 37 °C atmosphere.
  • Purified NHP islets were suspended in CMRL 1066 medium (Corning Life Sciences, Tewksbury, MA, USA; Cat. No. 99-663-CV) containing 100 IU/mL penicillin and 100 ⁇ g/mL streptomycin, and fully humidified 5 % CO 2 Incubated at 37 °C atmosphere.
  • the medium was supplemented with 10% FBS (FBS group) and 0-20 ⁇ M compound 1 + 0.625% HSA (human serum albumin; Green Cross, Yongin, Korea) for treatment during serum-deficient culture An optimal concentration of 1 was determined.
  • the medium contains 10% FBS (FBS group), 20 ⁇ M compound 1 + 10% FBS (FBS + compound 1 group), 0.625% HAS (Green Cross, Yongin, Korea; HSA group) or 20 ⁇ M compound 1 + 0.625% HSA ( HSA + compound 1 group) was supplemented.
  • islets The viability of islets was evaluated using Alamar blue staining according to the manufacturer's protocol (Invitrogen, Grand Island, NY, USA). Briefly, islets isolated from hIAPP +/- mice were treated with RPMI 1640 containing 10% FBS and 0.625% BSA, with or without compound 1, in a 24-well plate with 100 islet equivalents per well (islet equivalents, IE) ) in culture. After 1 and 3 days, 10x Alamar blue solution was directly added to each well, and the islets were incubated at 37° C. for 4 hours while protecting them from direct light. The fluorescence intensity of each well was measured at 570/585 nm (excitation/emission) using the GloMax-Multi Plus Detection System (Promega, Fitchburg, WI, USA), and the values were normalized to blanks.
  • Islet viability after isolation and culture was assessed using dual fluorescence of acridine orange (0.67 ⁇ mol/L) and propidium iodide (75 ⁇ mol/L) (AO/PI) staining to simultaneously visualize live and dead islet cells. . Fluorescence imaging was performed with a fluorescence microscope (Nikon ECLIPSE 80i, Tokyo, Japan), and live and dead areas were quantified using NIS-Element AR 3.0 (Nikon). The islet viability (%) was calculated as live islet cells/total islet cells ⁇ 100.
  • the ATP content of islets was analyzed by luminometry. Samples were first mixed with 200 ⁇ L of commercially available lyophilized ATP monitoring reagent (ATP Bioluminescence Assay KIT CLS II, Roche Diagnostics) containing firefly luciferase and luciferin reconstituted in imidazole buffer (100 mM, pH 7.75). The emitted light was measured in a luminometer (LKB 1250 luminometer). The adenine nucleotide content of the samples was determined after calibration of the control (pancreatic islets or no cells) and calculated with reference to ATP standards treated in the same manner as the samples.
  • ATP Bioluminescence Assay KIT CLS II Roche Diagnostics
  • the level of oxidative stress in hIAPP +/- mouse islets was determined immediately after islets isolation and after ex vivo culture of the isolated islets. Oxidative stress in islets was quantified by using a fluorescence-based intracellular ROS detection method and estimating the concentration of malondialdehyde (MDA), a byproduct of lipid peroxidation.
  • MDA malondialdehyde
  • Total ROS, superoxide ions, and formation of nitric oxide were determined using a reactive oxygen species (ROS) detection kit (ENZ-51011, Enzo Life Sciences, Farmingdale, New York, USA). ROS content was determined by DHR123 fluorescence level. The kit was applied according to the manufacturer's protocol.
  • GSIS Glucose-stimulated insulin secretion
  • the harvested islets were treated with 500 ⁇ L Trizol (Life Technologies, Grand Island, NY, USA), and then 100 ⁇ L of chloroform was added. After incubation at 4° C. for 5 min, the mixture was centrifuged at 12,000 rpm for 15 min, and total RNA was precipitated by the addition of 250 ⁇ L of isopropyl alcohol. The RNA pellet was washed with 75% ethanol, and RNA was eluted from the pellet using RNase-free water (Wellgene, Daegu, Korea). RNA purity was assessed by NanoDrop (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA) and agarose gel electrophoresis.
  • RNA was reverse transcribed to quantify gene expression using the SuperScriptTM II reverse transcription system (Life Technologies) according to the manufacturer's protocol.
  • Real-time qRT-PCR was performed using gene-specific primer pairs (Table 1).
  • the amplified PCR product was normalized to the amplified ⁇ -actin PCR product from the same sample.
  • PCR products were separated on a 1% agarose gel and images were obtained using a Gel DocTM XR instrument (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).
  • Gel DocTM XR instrument Bio-Rad, Hercules, CA, USA.
  • real-time PCR was performed using the SYBR premix kit (Takara Bio Inc., Tokyo, Japan) and ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) according to the manufacturer's protocol. .
  • islets were transplanted into the renal scapular space of diabetic hIAPP ⁇ / ⁇ mice.
  • IE numbers were calculated using the Ricordi algorithm by classifying islets according to their diameter.
  • non-fasting blood glucose levels were measured 3 times a week for the first 2 weeks and twice a week for the last 2 weeks.
  • kidney tissue sections are scanned for image acquisition and then, to establish the transplanted tissue segmentation, a number of representative areas of transplanted islet cells and areas to be excluded from analysis, such as kidney tissue, are identified by a learn-by-example interface by means of a learn-by-example interface. investigated.
  • ⁇ -cell segmentation For ⁇ -cell segmentation, a spectral library was used to identify hematoxylin-stained nuclei and DAB-stained cytoplasm ( ⁇ -cells) in the transplanted tissue. With these training sets, an algorithm for identifying only DAB-stained cells in transplanted tissue was identified. All captured 10X images were analyzed and DAB-stained transplanted ⁇ -cells were counted.
  • h11APP oligomers Accumulation of h11APP oligomers was assessed using sections of hIAPP+/ ⁇ mouse islets stained with A11 Ab (anti-oligomeric antibody, Invitrogen) and insulin antibody (Dako). Islets were blocked with 10% normal donkey serum and incubated with primary rabbit anti-oligomer (1:100). After washing the islets, the secondary Cy3-conjugated (conjugated) anti-rabbit antibody was incubated for 1 hour. After washing, sections were stained with guinea pig anti-insulin primary antibody (1:500; Dako) followed by Alexa Fluor 488 anti-guinea pig secondary antibody (1:200; Jackson ImmunoResearch Laboratories).
  • Sections were mounted after counter staining with 4',6-diamidino-2-phenylindole (4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI).
  • DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole
  • Sections of islet grafts below the renal capsule were subjected to islet amyloid after 0.5% Thioflavin S staining (Sigma) with guinea pig anti-insulin antibody (1:500; Dako, Carpenteria, CA) and Cy3-conjugated anti -Guinea pig secondary antibody (1:200; PA, West Grove, Jackson ImmunoResearch Labora-tories) was tested for ⁇ -cells using insulin immunostaining. Sections were mounted after staining with DAPI. To quantify the accumulation of amyloid per section, the percentage ratio of Thioflavin S-stained cells (green) in the total islet transplant site (green + red + blue portions) was determined using confocal microscopy. The original magnification for the panel was 100x.
  • Results were appropriately expressed as mean ⁇ standard deviation (SD) or median and interquartile ranges. Continuous variables were compared using Student's t-test, one-way analysis of variance (ANOVA), or Mann-Whitney U test as appropriate. Longitudinal data were analyzed by two-way ANOVA using the Bonferroni post hoc test using Graphpad Prism 5 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). A p value ⁇ 0.05 was accepted as statistically significant for comparison.
  • islets from hIAPP +/- FVB/N mice were isolated with collagenase with or without 20 ⁇ M of compound 1 supplementation.
  • the relative ex vivo cell viability assessed by Alamar blue assay was significantly increased in the compound 1 treated group compared to the untreated group ( FIG. 1A ).
  • the level of ATP was significantly higher in the treatment of compound 1 during islet isolation compared to the non-treated group in compound 1 ( FIG. 1B ).
  • the ROS content and oxidative stress level in islets treated with Compound 1 during islet isolation were significantly reduced compared to control islets without Compound 1 treatment ( FIGS. 1C and 1D ).
  • the stimulation index obtained in the glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) assay indicating in vitro islet function showed similar values between the two groups (Fig. 1E).
  • c-Jun N-terminal kinase and HMGB1 High mobility group box 1
  • IL-1 ⁇ , IL-6 and tumor necrosis factor Transcriptional expression of pro-inflammatory cytokines including TNF
  • FIGS. 6A and 6D show cell viability of hIAPP +/- FVB/N mouse islets during serum-deficient culture with and without supplementation of compound 1 as assessed by AO/PI staining.
  • islets cultured with BSA for 72 h showed greater apoptosis with impaired cell viability markedly improved by supplementation with compound 1 and positivity of red PI-positive cells. was experienced (Figs. 6A and 6B).
  • Transcriptional levels of TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-6, c-JUN and HMGB1 after 1 and 3 days of ex vivo culture were significantly attenuated in the BSA+ Compound 1 group than in the BSA group ( FIGS. 6C and 6D ). .
  • FIG. 6E To evaluate the function of islets, a markedly increased stimulation index was observed in islets from hIAPP +/- mice when Compound 1 was added to the medium during serum-deficient culture conditions ( FIG. 6E ). After culturing in medium with or without compound 1 for 72 hours under serum-deficient culture conditions, the accumulation rate of hIAPP oligomers in hIAPP +/- islets was significantly reduced in the BSA + compound 1 group compared to the BSA group. (Fig. 6F).
  • Compound 1 could protect against serum deficiency-induced damage to the survival rate of pancreatic islets in vitro. More importantly, supplementation of the medium with Compound 1 during serum-starved culture significantly reduced the accumulation of amyloid and toxic IAPP oligomers and improved islet transplantation function in vivo.

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Abstract

본 발명은 췌도 이식 시 보호 효과를 갖는 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 화학식 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 췌도 이식 시에 산화 스트레스 및 염증 등에 대한 보호 효과를 제공할 수 있는 조성물에 관한 것이다.

Description

췌도 이식 보호용 조성물
본 발명은 췌도 이식 시 보호 효과를 갖는 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 췌도 이식 시에 산화 스트레스 및 염증 등에 대한 보호 효과를 제공할 수 있는 조성물에 관한 것이다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2021004022-appb-I000001
상기 화학식 1에서, n, X, R1, R2, R3, R4, R5 및 R6는 명세서에서 정의된 바와 같다.
제1형 당뇨병 또는 최근 급증하고 있는 장기간 진행된 제2형 당뇨병은 췌장 β-세포가 파괴되어 인슐린에 대한 의존도가 높고, 생명을 위협하는 저혈당 및 당뇨병 합병증의 발생률이 높다. 췌도 이식(islet transplantation)이란 뇌사자로부터 기증받은 췌장을 생화학적으로 처리하여 순수한 췌도로 분리한 후에 수혜자에게 투여하는 수술을 말한다. 수술의 목적은 당뇨를 앓는 환자가 인슐린의 투여 없이 혈당을 정상적으로 조절할 수 있도록 하기 위한 것이다. 이식된 췌도는 인슐린을 분비하면서 수혜자가 인슐린의 투여 없이도 정상적인 생활을 할 수 있도록 하게 한다.
동종 췌도 이식(allogeneic pancreatic islet transplantation)은 저혈당에 대한 손상된 인식으로 더 심해진 제1형 당뇨병 환자에서 심각한 저혈당을 제거하고 정상 혈당을 달성하기 위한 유망한 전략이었다. 그러나 이식 전후의(peri-transplant) 기간 동안 이식된 췌도 질량의 실질적인 손실은 광범위한 임상 사용에 중요한 장애물로 남아있다.
이식 전후의 기간 동안, 저산소증/재산소화(reoxygenation)-유발 손상 및 HMGB1(high-mobility group box 1)과 같은 손상-관련 분자 패턴(damage-associated molecular patterns, DAMPs)의 방출이 선천성 면역 및 전염증성(proinflammatory) 사이토카인 생성의 강력한 활성화제로서 점점 더 인정되고 있다. 비염증성 또는 심지어 항 염증성 세포 사멸의 모드인 아폽토시스(apoptosis)와는 달리, 네크롭토시스(necroptosis) 또는 괴사(necrosis)는 매우 면역원성(immunogenic)이다. 적어도 부분적으로, 괴사 세포로부터 방출된 DAMPs 및 괴사 과정 동안 NLRP3(nucleotide-binding oligomerization domain (NOD)-like receptor protein 3) 인플라마좀(inflammasome)의 세포 고유 활성화 모두가 이러한 면역원성을 담당한다.
mPTP(mitochondrial permeability transition pore)의 개방을 유도하는 미토콘드리아 반응성 산소종(ROS)의 생성은 네크로톱시스 및 괴사 과정을 촉진하는 주요 플레이어(player) 중 하나이다. β-세포가 카탈라아제, 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제(superoxide dismutase) 및 글루타티온 과산화효소(glutathione peroxidase)와 같은 항산화 효소 유전자의 낮은 발현으로 인해 산화 스트레스에 매우 취약한 것으로 알려져 있기 때문에 이식된 췌도의 네크롭토시스 및 괴사에서 미토콘드리아 ROS의 역할이 중요할 수 있다. 따라서, 다양한 췌도 이식 과정에서 생성된 산화 스트레스와 저산소증/재산소화 유발 손상이 상당한 β-세포 손상과 이식 췌도의 주요 손실에 있어서 중요한 역할을 할 수 있다. 이와 관련하여, 다양한 항산화제가 일부 연구에서 산화 손상으로부터 췌도를 보호하는데 가능한 효과를 제공하여 in vitro에서 췌도 생존력 및 인슐린 분비를 향상시키고 췌도 이식 절차를 개선시키는데 사용되었다. 그러나 이들 접근법의 임상적 적용 가능성은 임상 등급 물질의 보다 강력한 효능 및 이용 가능성을 요구하고 있다. 또한, 미토콘드리아 ROS의 생산은 이전 연구에서 특정 목표가 아니었고, 이들 연구는 주로 아폽토시스의 감소에 중점을 두었다.
이에 본 발명은 췌도 이식에 있어 췌도를 효율적으로 보호할 수 있는 조성물을 제공하는 것을 그 기술적 과제로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 유효성분으로 하기 화학식 1의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 췌도 이식 보호용 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2021004022-appb-I000002
상기 화학식 1에서,
n은 0 또는 1이고;
X는 C 또는 N이며, 다만 X가 N일 경우 n은 0이고, X가 C일 경우 n은 1이며;
R1은 수소 또는 C1-C6 알킬이고;
R2는 페닐 또는 피리딘이며;
R3는 수소, 할로겐 또는 C1-C6 알킬이고;
R4는 수소, 할로겐, 2-카복시-피롤리딘-1-일, 피롤리딘-1-일, 4-아세트산-1,3-티아졸린-2-일, -CH2-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일) 또는 -CH2-(2-옥소피페라진-4-일)이며;
R5는 수소, C1-C6 알킬 또는 C3-C6 사이클로알킬이고;
R6는 -D-W-R7을 나타내며, 여기에서 D는 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 피롤리딘, 테트라하이드로피란, 테트라하이드로퓨란 또는 피페리딘이고; W는 직접결합, -SO2-, -CO-, -C(O)O-이며; R7은 수소, 하이드록시 또는 C1-C6 알킬이다.
본 발명에 따른 일 구체예에서 상기 화학식 1의 화합물은 하기 화학식 2의 (테트라하이드로피란-4-일)-[2-페닐-5-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일)메틸-1H-인돌-7-일]아민이다:
[화학식 2]
Figure PCTKR2021004022-appb-I000003
본 발명에 따른 다른 구체예에서, 상기 약제학적으로 허용가능한 염은 약제학적으로 허용되는 음이온을 함유하는 무독성 산부가염을 형성하는 산, 예를 들어, 황산, 염산, 질산, 인산, 브롬화수소산, 요오드화수소산 등과 같은 무기산; 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플루오로아세트산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산, 살리실산 등과 같은 유기 카본산; 메탄설폰산, 에탄설폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산, 나프탈렌설폰산 등과 같은 설폰산 등에 의해 형성된 산 부가염이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 약제학적으로 허용되는 염기 부가염, 예를 들어, 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등에 의해 형성된 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염; 라이신, 아르기닌, 구아니딘 등의 아미노산 염; 디사이클로헥실아민, N-메틸-D-글루카민, 트리스(하이드록시메틸)메틸아민, 디에탄올아민, 콜린, 트리에틸아민 등과 같은 유기염 등이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 상기 화학식 1의 화합물은 통상적인 방법에 의해 그의 염으로 전환될 수 있으며, 염의 제조는 별도의 설명이 없이도 상기 화학식 1의 구조를 바탕으로 통상의 기술자에 의해 용이하게 수행될 수 있다.
췌도(췌장 소도, pancreatic islet) 이식은 췌장에서 인슐린을 생산하는 췌도 세포만을 분리하여 수여자에게 이식하는 시술로, 고형 장기가 아닌 세포 치료의 대표적인 예이다.
그러나 β-세포는 약한 항산화 방어 시스템으로 인해 산화 스트레스에 취약하다. 췌도 분리 동안 저체온증, 기계적 스트레스 및 콜라게나아제(collagenase) 노출을 포함한 다양한 요인이 산화 스트레스를 생성하고 궁극적으로 세포 사멸을 유발할 수 있다. 췌도 이식 및 혈관재형성(revascularization) 과정에서의 낮은 산소 및 영양분 이용률 하에서, 아폽토시스(apoptosis), 자가 포식(autophagy), 괴사 및 네크롭토시스(necroptosis) 가 췌도에서 발생한다. 괴사와는 달리, 아폽토시스는 일반적으로 염증 반응을 포함하지 않지만, 저산소증에 의한 췌도에서의 일차 아폽토시스는 절단된 형태가 아닌 비절단(non-cleaved) 카스파제-9 및 카스파제-3을 제공하는 면역 활성화를 유도할 수 있다. 이것은 주요 세포 사멸 과정이, 이차 아폽토시스보다는 손상-관련 분자 패턴(damage-associated molecular patterns, DAMPs)의 방출을 유도하는 괴사로 향한다는 것을 나타낸다. DAMP는 HMGB1(high mobility group box-1), dsDNA 및 요산과 같은 분자로 세포 내 공간에서 방출되며, 선천 면역계와 관련된 Toll-like receptors(TLR)에 의해 주로 인식된다. DAMPs는 괴사 및 네크롭토시스에 의한 세포 사멸의 결과로서 허혈 및 재관류 손상 동안 방출되고, 췌도 이식 실패에서 염증 캐스케이드(cascade)에 기여하기에, 아폽토시스 또는 자가 포식보다는 괴사 및 네크롭토시스를 억제하는 것이 DAMPs 방출 및 췌도 이식 기간 동안 면역 반응을 감소를 위한 바람직한 전략일 수 있다.
HMGB1은 세포 사멸 동안 손상된 세포 또는 괴사 세포에 의해 분비되고, DAMP 신호 및 전염증성(proinflammatory) 사이토카인의 역할을 하며, 다양한 염증성 질환의 발병과 관련이 있다. 인터류킨(IL)-1β, 인터페론(IFN)-γ 및 종양괴사인자(TNF)-α와 같은 몇몇 염증성 사이토카인은 또한 ROS 형성 및 JNK 활성화, 및 NF-kB의 전위(translocation)를 포함하는 일련의 세포 내 신호 전달 경로를 통해 β-세포 기능 장애 및 아폽토시스를 유도하는 것을 담당하는 것으로 알려져 있다. NF-kB는 NADPH 산화 효소를 조절하여 산화 스트레스를 유발하는 전사 인자이다. 전염증성 사이토카인의 공동 작용(concerted action)은 유도성 산화질소 신타아제(inducible nitric oxide synthase, iNOS)의 발현을 유도하고, iNOS 활성의 차단 또는 망간 과산화물 디스뮤타제(MnSOD)의 증가된 발현은 인슐린-생성 세포주에서 in vitro 조건 하에서 사이토카인-유도된 NF-kB 활성화를 약화시킨다.
안전 규정에 대한 동물성 제품의 사용을 피하기 위해, 분리된 인간 췌도는 일반적으로 임상 동종 췌도 이식 전에 혈청-결핍(serum-deprived) 배양 조건하에서 배양된다. 혈청 결핍 조건 하에서 췌도의 배양 동안, 췌도는 배양 배지에서 다양한 스트레스, 영양소 박탈, 다양한 전염증성 사이토카인, 외분비 췌장으로부터의 효소 및 적절한 산소화의 결여에 추가로 노출되며, 이러한 스트레스는 β-세포에 유해하고, ROS의 초과 축적을 유도한다. 또한, 췌도 아밀로이드 폴리펩티드(islet amyloid polypeptide, IAPP)의 독성은 제2형 당뇨병에서 점진적인 β-세포 양의 감소 및 췌도 섬유화를 일으키는 원인으로 인식되었고, 혈당 상태에서 혈청이 결핍된 배양이 독성 hIAPP 올리고머 축적을 유발한다. IL-1/IL-1 수용체 축(axis)의 저해가 혈청-결핍 배양에 의해서 야기되는 췌도의 염증 반응 및 기능 장애를 약화 할 수는 있지만, IL-1 봉쇄(blockade)가 혈청-결핍 배양 동안 독성 올리고머의 축적을 약화시키지는 못한다.
본 발명의 화학식 1의 화합물은 췌도를 분리하는 동안 처리할 경우 산화 스트레스 및 활성산소(ROS)의 양을 감소시켜 췌도를 보호할 수 있다.
또한, 본 발명의 화학식 1의 화합물을 분리된 췌도를 혈청-결핍(serum-deprived) 배양하는 동안 처리할 경우 c-jun N-말단 키나아제, HMGB1(high mobility group box-1) 및 전염증성(proinflammatory) 사이토카인(예컨대, 인터류킨-1β, 인터류킨-6 및 종양괴사인자(TNF)-α)의 발현을 감소시키고, 강력한 미토콘드리아 활성산소(ROS) 소거 활성(scavenging activity)으로 인하여 아밀로이드 및 독성 IAPP(islet amyloid polypeptide) 올리고머의 축적을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 화학식 1의 화합물은 상기와 같은 작용기전을 통하여 췌도를 분리하는 동안 처리하거나 분리된 췌도를 혈청-결핍 배양하는 동안 처리할 경우 췌도를 효율적으로 보호하여 췌도 이식 후의 당뇨병 reversal rate를 획기적으로 향상시킬 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 필요에 따라 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본원에서 “담체(carrier)”란 세포 또는 조직 내로 화합물의 부가를 용이하게 하는 물질을 의미하고, 이에 따른 특별한 제한은 없다.
본 발명의 조성물은 췌도 세포에 뛰어난 보호 효과를 제공함으로써 췌도 이식에서의 성공율을 현저히 향상시킬 수 있다.
도 1은 화합물 1의 췌도 분리 동안의 처리가 분리된 hIAPP+/- 마우스 췌도의 in vitro 생존율, 기능 및 전염증성 사이토카인 발현에 미치는 효과를 평가한 결과이다.
도 2는 화합물 1의 췌도 분리 동안의 처리가 분리된 C57BL/6 마우스 췌도의 in vitro 생존율, 기능 및 전염증성 사이토카인 발현에 미치는 효과를 평가한 결과이다.
도 3은 화합물 1의 췌도 분리 동안의 처리가 hIAPP+/- 마우스 췌도의 이식 후 in vivo 결과에 미치는 효과를 평가한 결과이다.
도 4는 화합물 1의 혈청-결핍 배양 동안의 처리가 RINm5F 세포 및 hIAPP+/- 마우스 췌도의 세포 생존율 및 ROS에 미치는 효과를 평가한 결과이다.
도 5는 화합물 1의 혈청-결핍 배양 동안의 처리가 비인간 영장류(nonhuman primate, NHP) 췌도에서의 세포 생존율 및 ROS에 미치는 효과를 평가한 결과이다.
도 6은 화합물 1의 혈청-결핍 배양 동안의 처리가 분리된 hIAPP+/- 마우스 췌도의 in vitro 생존율, 기능, 전염증성 사이토카인 발현 및 올리고머 축적에 미치는 효과를 평가한 결과이다.
도 7은 화합물 1의 혈청-결핍 배양 동안의 처리가 hIAPP+/- 마우스 췌도의 이식 후 in vivo 결과에 미치는 효과를 평가한 결과이다.
이하에서 본원 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것일 뿐 발명의 범위가 이들에 의해서 한정되는 것은 아니다.
I. 실험 물질 및 방법
1. 화합물
(테트라하이드로피란-4-일)-[2-페닐-5-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일)메틸-1H-인돌-7-일]아민(이하에서 "화합물 1"이라 일컫는다)을 국제공개공보 WO 2009/025478호의 실시예 36에서 개시한 방법에 따라 합성하였다.
2. 실험 동물 및 세포주
이종접합성 인간 췌도 아밀로이드 폴리펩티드(human islet amyloid polypetide) 유전자 이식(hIAPP +/-) FVB/N 마우스(Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA), C58BL/6 마우스 (오리엔트바이오, 대한민국 성남) 및 cynomolgus 원숭이(Macaca fascicularis; 오리엔트바이오, 대한민국 성남)로부터 췌도를 분리하였다. 추가의 in vitro 연구를 위해, 랫트(rat) insulinoma 세포(RINm5F 세포)를 tert-부틸 하이드로퍼옥사이드(tBHP) 노출 또는 혈청 결핍 조건하에 배양 동안 화합물 1로 처리 또는 처리하지 않았다. RINm5F 세포를 100 IU/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신을 함유하는 DMEM 배지(Gibco, Grand Island, NY, USA)에 현탁시키고, 완전히 가습된 5% CO2 분위기에서 37℃에서 배양하였다. 이 연구의 모든 실험 프로토콜은 삼성생명과학연구소(Samsung Biomedical Research Institute)의 동물실험윤리위원회(IACUC)에 의해 승인되었다.
3. 췌도 분리
마우스 췌도를 상기 기술한 바와 같이, 10주 내지 12주령의 hIAPP+/- 및 C57BL/6 마우스로부터 분리하였다. 간략하게, 20 μM 화합물 1을 포함하거나 포함하지 않는 HBSS 완충용액(Hank's buffered saline solution, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 내의 0.8 mg/mL의 콜라게나아제를 총담관(common bile duct)으로 주입하여 마우스 췌장을 처리(digestion)하였다. 처리된 마우스 췌장으로부터 Ficoll(Biochrom, Berlin, Germany) 구배(gradient)를 사용하여 정제하고, 1x HBSS로 수회 세척하였다. 분리된 췌도를 10 mL의 RPMI 1640(Gibco, Grand Island, NY, USA)에서 자유롭게 부유하면서 배양하였다. Ex vivo 및 in vivo 연구 전에 37℃ 및 5% CO2 배양에서 10% 열-불활성화 FBS(fetal bovine serum)를 배지에 보충하였다.
4. 비인간 영장류 췌도 분리
해부된 비인간 영장류(nonhuman primate, NHP) 췌장에 차가운 Liberase MTF C/T 용액(4 mL/g 췌장; Roche)을 덕트내(intraductally) 주사하였다. 처리(digestion) 및 분리는 상기 설명한 Ricordi의 자동 분리 기술을 사용하여 수행하였다. 모든 분리된 NHP 췌도를 in vitro 및 in vivo 연구 전에 37℃ 및 5% CO2 배양에서 10% 열-불활성화 돼지 혈청이 보충된 CMRL 배지에서 배양하였다.
5. 분리된 췌도의 혈청-결핍 ex vivo 배양
정제된 hIAPP+/- FVB/N 및 C57BL/6J 마우스를 100 IU/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신을 함유하는 RPMI 1640(Gibco, Grand Island, NY, USA)에 현탁시키고, 완전히 가습된 5% CO2 분위기에서 37℃에서 배양하였다. 정제된 NHP 췌도를 100 IU/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신을 함유하는 CMRL 1066 배지(Corning Life Sciences, Tewksbury, MA, USA; 카탈로그 번호 99-663-CV)에 현탁시키고, 완전히 가습된 5% CO2 분위기에서 37℃에서 배양하였다. 마우스 췌도의 ex vivo 배양 동안, 3개의 실험 그룹을 hIAPP+/- FVB/N 및 C57BL/6J 마우스 췌도를 사용한 실험에 대해 지정하였다: 10% FBS(Tissue Culture Biologicals, Los Alamitos, CA, USA; 카탈로그 번호 101)가 보충된 배지(FBS 그룹), 0.625% BSA(Qbiogene, Carlsbad, CA, USA; 카탈로그 번호 BSA003)가 보충된 배지(BSA 그룹), 및 0, 0.1, 1, 10 및 20 μM 화합물 1 + 0.625% BSA가 보충된 배지(BSA + 화합물 1 그룹). NHP 췌도를 사용한 실험에서, 배지에 10% FBS(FBS 그룹) 및 0-20 μM 화합물 1 + 0.625% HSA(human serum albumin; 녹십자, 대한민국 용인)을 보충하여 혈청-결핍 배양 동안의 처리를 위한 화합물 1의 최적 농도를 결정하였다. 또한, 배지에는 10% FBS(FBS 그룹), 20 μM 화합물 1 + 10% FBS(FBS + 화합물 1 그룹), 0.625% HAS(녹십자, 대한민국 용인; HSA group) 또는 20 μM 화합물 1 + 0.625% HSA(HSA + 화합물 1 그룹)가 보충되었다.
6. Alamar blue 어세이에 의한 췌도 생존율 평가
제조자(Invitrogen, Grand Island, NY, USA)의 프로토콜에 따라 Alamar blue 염색을 사용하여 췌도의 생존율(viability)을 평가하였다. 간략하게, hIAPP+/- 마우스로부터 분리된 췌도를 화합물 1을 포함하거나 포함하지 않는, 10% FBS 및 0.625% BSA를 함유한 RPMI 1640로 24-웰 플레이트에서 웰당 100개의 췌도 당량 (islet equivalents, IE)의 밀도로 배양하였다. 1일 및 3일 후에, 10x Alamar blue 용액을 각 웰에 직접 첨가하고, 췌도를 직접광으로부터 보호하면서 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 각각의 웰의 형광 강도를 GloMax-Multi Plus Detection System(Promega, Fitchburg, WI, USA)을 사용하여 570/585 nm (여기/방출)에서 측정하고, 값을 블랭크(blank)로 표준화하였다.
7. Acridine orange/propidium iodide (AO/PI) 어세이
분리 및 배양 후 췌도 생존율을, 살아있는 췌도와 죽은 췌도 세포를 동시에 시각화하기 위해 acridine orange(0.67 μmol/L) 및 propidium iodide(75 μmol/L) (AO/PI) 염색의 이중 형광을 사용하여 평가하였다. 형광 현미경(Nikon ECLIPSE 80i, Tokyo, Japan)으로 형광 이미징을 수행하고, NIS-Element AR 3.0 (Nikon)을 사용하여 살아있는 영역 및 죽은 영역을 정량화하였다. 췌도 생존율(%)은 살아있는 췌도 세포/총 췌도 세포 × 100으로 계산하였다.
8. ATP 어세이
췌도의 ATP 함량을 발광 측정법에 의해 분석하였다. 샘플을 먼저 이미다졸 완충액(100 mM, pH 7.75)에서 재구성된 firefly 루시퍼라아제 및 루시페린을 함유하는 시판되는 동결건조된 ATP 모니터링 시약(ATP Bioluminescence Assay KIT CLS II, Roche Diagnostics) 200 μL와 혼합하였다. 방출된 광은 luminometer (LKB 1250 luminometer)에서 측정하였다. 샘플의 아데닌 뉴클레오티드 함량은 대조군(췌도 또는 세포 없음)의 보정 후 결정되었고 샘플과 동일한 방식으로 처리된 ATP 표준을 참조하여 계산하였다.
9. 형광 기반 세포 내 자유 라디칼 검출 및 지질 과산화
hIAPP+/- 마우스 췌도에서의 산화 스트레스 수준을 췌도 분리 직후 및 분리된 췌도의 ex vivo 배양 후 결정하였다. 췌도의 산화 스트레스를 형광-기반 세포 내 ROS 검출 방법을 사용하고, 지질 과산화(peroxidation)의 부산물인 말론디알데히드 (malondialdehyde, MDA)의 농도를 추정함으로써 정량화하였다. 총 ROS, 슈퍼옥사이드 이온 및 산화 질소의 형성은 반응성 산소종(ROS) 검출 키트(ENZ-51011, Enzo Life Sciences, Farmingdale, New York, USA)를 사용하여 결정하였다. ROS 함량은 DHR123 형광 수준에 의해 측정하였다. 키트는 제조자의 프로토콜에 따라 적용하였다.
10. 글루코오스-자극 인슐린 분비(glucose-stimulated insulin secretion, GSIS) 어세이
췌도를 정선(hand-picking)하고 PBS로 세척을 한 후, 12 mm 직경의 인서트 웰(insert well)(Merck Millipore, Billerica, MA, USA)에 웰당 10 개의 췌도로 시딩(seeding)하고, 60 mg/dL 글루코오스가 첨가된 Kreb's-Ringer 완충액(KRB: 129 mM NaCl, 4.8 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, 1.2 mM KH2PO4, 5 mM NaHCO3, 10 mM HEPES 및 0.2% BSA)으로 37℃에서 90분 동안 예비 배양하였다. 세척 후, 췌도를 1 시간 동안 300 mg/dL 글루코오스-KRB와 함께 배양한 다음, 1 시간 동안 60 mg/dL 글루코오스-KRB와 함께 추가로 배양하였다. 마우스 췌도에 의한 상청액으로의 인슐린 방출을 각각 ELISA(ALPCO, Salem, NH, USA) 및 multiplex 키트(Merck Millipore)로 측정하였다.
11. RNA 분리 및 cDNA 합성
수거된 췌도를 500 μL Trizol(Life Technologies, Grand Island, NY, USA)로 처리한 다음, 100 μL의 클로로포름을 첨가하였다. 4℃에서 5 분 동안 배양한 후, 혼합물을 12,000 rpm에서 15 분 동안 원심분리하고, 250 μL의 이소프로필 알코올을 첨가하여 총 RNA를 침전시켰다. RNA 펠릿을 75% 에탄올로 세척하고, RNase-free water(웰진, 대한민국 대구)를 사용하여 펠렛으로부터 RNA를 용출시켰다. RNA 순도를 NanoDrop (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA) 및 아가로스 겔 전기영동에 의해 평가하였다. RNA의 순도는 260/230 및 260/280의 광학 밀도(OD)의 비에 기초하여 1.9 내지 2.0의 범위였다. 제조자의 프로토콜에 따라 SuperScriptTM II 역전사 시스템(Life Technologies)을 사용하여 유전자의 발현을 정량하기 위해 총 RNA를 역전사시켰다.
12. 실시간 정량적 역전사(quantitative reverse transcription, qRT)-PCR
실시간 qRT-PCR을 유전자-특이적 프라이머 쌍(표 1)을 사용하여 수행하였다. 증폭된 PCR 생성물을 동일한 샘플로부터 증폭된 β-액틴 PCR 생성물로 표준화하였다. PCR 산물을 1% 아가로스 겔에서 분리하고, Gel DocTM XR 기기(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 이미지를 얻었다. 유전자의 발현 수준을 정량화하기 위하여, 제조자의 프로토콜에 따라 SYBR premix 키트(Takara Bio Inc., Tokyo, Japan) 및 ABI Prism 7000(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 실시간 PCR을 수행하였다.
[표 1]
Figure PCTKR2021004022-appb-I000004
13. hIAPP+/- 췌도의 in vivo 췌도 기능
hMAPP+/- 마우스의 in vivo 췌도 기능을 평가하기 위해, marginal mass renal subcapsular islet transplantation 모델을 사용하였다. 당뇨병을 유도하기 위해, 180 mg/kg의 스트렙토조토신(STZ, Sigma-Aldrich)을 8 내지 10 주령 hIAPP-/- FVB/N 마우스에 투여 하였다. 2회 연속 혈당 수치가 300 mg/dL 보다 높을 때 마우스는 당뇨병을 갖는 것으로 간주되었다. Ex vivo 배양 동안 췌도 질량 및 기능에 대한 화합물 1의 조합된 효과를 평가하기 위해 hIAPP+/- 마우스로부터 분리된 췌도의 동일 량(수용자 당 췌도의 400 IEQ)을 다음 두 그룹에 할당하였다: 0.625% BSA (BSA 그룹) 및 0.625% BSA + 화합물 1 (BSA + 화합물 1 그룹). 72 시간 동안 배양한 후, 췌도를 당뇨병성 hIAPP-/- 마우스의 신장 견갑골 공간으로 이식하였다. IE 번호는 이들의 직경에 따라 췌도를 분류하여 Ricordi 알고리즘을 사용하여 계산하였다. 췌도 이식 후, 비공복(non-fasting) 혈당 수준을 처음 2 주 동안 주 3회, 마지막 2 주 동안 주 2회 측정하였다.
14. 조직학적 분석
이식 4 주 후, 마우스 신장의 이식 부위를 제거하고 파라핀에 포매(embedded)시켰다. 면역조직화학 염색을 간략하게 설명하면 다음과 같았다. 탈파라핀화 후, 4-μm 조직 섹션을 폴리클로날(polyclonal) 기니피그 항-인슐린 항체(1 : 1000, A0546, DAKO, Denmark), 글루카곤 (1 : 500, ab92517, abcam, United Kingdom) 및 아밀로이드(1:2500, #44-344, Invitrogen)로 염색하였다. 염색된 슬라이드는 ×10/22 개구수(numeric aperture) 및 ×40/0.75 개구수 objective를 갖는 Olympus BX40 광학 현미경(Olympus, Japan)을 사용하여 관찰하였다. 디지털 이미지 (Olympus DP50)로 사진 이미지를 수집하고 Image-Pro Plus 5.1 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
DAB-표지된 β-세포의 정량화를 위해, 모든 슬라이드를 Vectra 3.0 automated quantitative pathology imaging system에서 10×로 이미지화하고, inForm 소프트웨어 (모두 Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA)를 사용하여 분석하였다. 이식된 신장 조직 섹션을 이미지 획득을 위해 스캔한 다음 이식된 조직 세그먼테이션을 설정하기 위해, 이식된 췌도 세포의 다수의 대표적인 영역 및 신장 조직과 같이 분석에서 제외될 영역을 learn-by-example 인터페이스에 의해 조사하였다. β-세포 세그먼테이션의 경우, 이식된 조직 내에서 헤마톡실린-염색된 핵 및 DAB-염색된 세포질(β-세포)을 확인하기 위해 스펙트럼 라이브러리(spectral library)를 사용하였다. 이들 훈련 세트로, 이식된 조직에서 오직 DAB-염색된 세포만을 식별하기 위한 알고리즘이 확인되었다. 캡처된(captured) 10X 이미지를 모두 분석하고, DAB-염색된 이식된 β-세포를 계수하였다.
15. hIAPP 올리고머 축적의 평가
h11APP 올리고머의 축적을 A11 Ab(항-올리고머 항체, Invitrogen) 및 인슐린 항체(Dako)로 염색된 hIAPP+/- 마우스 췌도의 섹션을 사용하여 평가하였다. 췌도를 10% 정상 당나귀 혈청으로 블록(block)하고, 1차 토끼 항-올리고머(1:100)와 배양하였다. 췌도를 세척한 다음 2차 Cy3-결합된(conjugated) 항-토끼 항체와 함께 1 시간 동안 배양하였다. 세척 후, 섹션을 기니피그 항-인슐린 1차 항체(1:500; Dako)에 이어서 Alexa Fluor 488 항-기니피그 2차 항체(1 : 200; Jackson ImmunoResearch Laboratories)로 염색하였다. 4',6-디아미디노-2-페닐 인돌(4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)로 카운터 염색한 후 섹션을 마운팅하였다. 췌도 당 hIAPP 올리고머의 축적을 정량하기 위해, 총 DAPI+ 췌도 세포 중 A11-염색된 세포의 비율을 공초점 현미경을 사용하여 측정하였다.
16. 아밀로이드 축적의 평가
신장 캡슐 아래 췌도 이식편의 섹션을, 0.5% 티오플라빈 S 염색(Sigma) 후 섬 아밀로이드에 대해서, 기니피그 항-인슐린 항체(1:500; Dako, Carpenteria, CA) 및 Cy3-결합된(conjugated) 항-기니피그 2차 항체(1:200; PA, West Grove, Jackson ImmunoResearch Labora-tories)로 인슐린 면역염색을 사용하여 β-세포에 대해서 검사하였다. 섹션을 DAPI로 염색한 후 마운팅하였다. 섹션 당 아밀로이드의 축적을 정량화하기 위해, 전체 췌도 이식 부위(녹색 + 적색 + 청색 부분) 중 티오플라빈 S-염색된 세포(녹색)의 백분율 비율을 공초점 현미경을 사용하여 측정하였다. 패널에 대한 원 배율은 100배이었다.
17. 통계 분석
결과는 평균 ± 표준 편차(SD) 또는 중간값과 사분위수(interquartile) 범위로 적절하게 표현하였다. 연속 변수는 Student's t-test, 일원 분산 분석(ANOVA) 또는 Mann-Whitney U 검정을 적절히 사용하여 비교하였다. 종 방향 데이터는 Graphpad Prism 5(GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)를 사용하는 Bonferroni post hoc 테스트를 이용한 two-way ANOVA에 의해 분석되었다. p 값 <0.05는 비교를 위해 통계적으로 유의한 것으로 받아들여졌다.
II. 결과
1. 췌도 분리 동안 산화 스트레스 및 전염증 반응으로부터의 보호 효과
췌도 분리 동안 화합물 1의 효과를 평가하기 위해, hIAPP+/- FVB/N 마우스로부터의 췌도를 20 μM의 화합물 1으로 보충하거나 보충하지 않고 콜라게나아제로 분리 하였다. Alamar blue 분석에 의해 평가된 상대적 ex vivo 세포 생존율은 비 처리 군과 비교하여 화합물 1 처리 군에서 유의하게 증가되었다(도 1A). 또한, 췌도 분리 동안 화합물 1의 처리는 화합물 1 비 처리 군과 비교하여 ATP의 수준이 유의하게 높았다(도 1B). 또한, 췌도 분리 동안 화합물 1으로 처리된 췌도에서의 ROS 함량 및 산화 스트레스 수준은 화합물 1 처리가 없는 대조군 췌도에 비해 현저하게 감소하였다(도 1C 및 1D). 체외 섬 기능을 나타내는 글루코스-자극 인슐린 분비(GSIS) 어세이에서 얻은 자극 지수는 두 그룹 사이에 비슷한 값을 보여주었다(도 1E). 다음으로, 화합물 1을 보충하거나 보충하지 않고 분리 후 배양 배지에서의 c-Jun N-말단 키나아제 및 HMGB1(High mobility group box 1), 및 인터루킨(IL)-1β, IL-6 및 종양괴사인자(TNF)-α를 포함하는 전염증성 사이토카인의 전사 발현을 조사하였다. 이러한 전사 발현 수준은 비 처리 군과 비교하여 화합물 1 처리 군에서 유의하게 감소하였다(도 1F). 이러한 결과는 야생형 C57BL/6 마우스 췌도에서 재현되었다(도 2).
2. 췌도 이식 후 결과 향상 효과
췌도 분리 동안 in vivo에서 화합물 1 보충의 효과를 조사하기 위해, 화합물 1의 보충이 있거나 없는 동안 분리된 췌도의 한계 질량(marginal mass)을 스트렙토조토신(STZ)-유도된 당뇨병성 hIAPP-/- FVB/N 마우스의 신장 견갑골 공간에 이식하였다(도 3A). 화합물 1 처리 군의 이식 후 글루코오스 수준은 비 처리 군보다 현저히 낮았고, 이식된 신장의 제거는 화합물 1 처리 군에서 고혈당증의 회복을 확인했다(도 3B). 화합물 1 군은 대조군과 비교하여 복강내 글루코오스 내성 시험 (intraperitoneal glucose tolerance test, IPGTT) 동안 당뇨병 reversal rate 및 글루코오스 수준 측면에서 더 나은 이식 후 결과를 나타냈다(도 3C, 3D 및 3E). 화합물 1 군은 대조군과 비교하여 이식된 조직에서 인슐린 양성 영역의 비율이 더 높았다(도 3F).
3. 혈청이 결핍된 배양 동안 hIAPP+/- 형질전환 마우스 및 NHP 췌도의 보호
혈청이 결핍된 상태에서 tert-부틸 하이드로퍼옥사이드(tBHP) 노출 또는 췌도 배양에 대한 화합물 1의 보충 효과를 조사하였다. tBHP에 노출된 RINm5F 세포가 LDH 방출 및 ROS 형성을 가졌음에도 불구하고, 화합물 1의 보충 후 세포 독성 및 ROS 함량이 현저하게 감소되었다(도 4A 및 4B). 랫트 insulinoma 세포(RINm5F 세포) 및 hIAPP+/- FVB/N 마우스로부터의 췌도의 상대 세포 생존율은 0.1 μM 내지 20 μM에서 용량-의존적 방식에 의해 혈청 결핍-유도된 세포 독성을 유의하게 증가시켰다(도 4C 및 4D). 혈청이 결핍된 배양 조건 동안 화합물 1으로 배지를 보충하면 0.1 μM부터 20 μM까지 용량-의존적 방식으로 hINAPP+/- FVB/N 마우스의 RINm5F 세포 및 췌도에서 혈청 결핍-유도된 ROS 역시 감소하였다(도 4E 및 4F). NHP 췌도에서 유사한 결과가 관찰되었다(도 5A, 5B 및 5C).
도 6A는 AO/PI 염색에 의해 평가된 화합물 1의 보충이 있거나 없는 혈청-결핍 된 배양 동안 hIAPP+/- FVB/N 마우스 췌도의 세포 생존율을 보여준다. FBS-처리된 췌도와 비교하여, 72 시간 동안 BSA로 배양된 췌도는 적색 PI-양성 세포의 양성(positivity) 및 화합물 1의 보충에 의해 현저하게 개선된 세포 생존율의 손상으로 보여지는 더 큰 세포 사멸을 경험하였다(도 6A 및 6B). Ex vivo 배양 1일 및 3일 후의 TNF-α, IL-1β, IL-6, c-JUN 및 HMGB1의 전사 수준은 BSA 그룹의 것보다 BSA+ 화합물 1 그룹에서 현저하게 약화되었다 (도 6C 및 6D). 췌도의 기능을 평가하기 위해, 혈청-결핍된 배양 조건 동안 화합물 1을 배지에 첨가할 때 hIAPP+/- 마우스로부터의 췌도에서 현저하게 증가된 자극 지수(stimulation index)가 관찰되었다(도 6E). 혈청이 결핍된 배양 조건 하에서 72 시간 동안 화합물 1을 첨가하거나 첨가하지 않은 배지에서 배양한 후, hIAPP+/- 췌도에서 hIAPP 올리고머의 축적 비율은 BSA 그룹과 비교하여 BSA+화합물 1 그룹에서 현저하게 감소하였다(도 6F).
4. 이식 후 혈당 결과 개선 및 이식 췌도 아밀로이드 축적 향상
혈청-결핍된 배양 동안 화합물 1을 배지에 보충하는 것이 in vivo 마우스 모델에서 이식 후 결과를 향상시키는지 여부를 조사하였다. hIAPP+/- FVB/N 마우스로부터의 췌도의 한계 질량(marginal mass)을 72 시간 동안 화합물 1의 보충이 있거나 없이 배양하고 STZ-유도된 당뇨병성 hIAPP-/- FVB/N 마우스의 subrenal subcapsular에 이식하였다(도 7A). 화합물 1 그룹은 이식 후 글루코오스 수준, 당뇨병 reversal rate, 및 IPGTT 동안의 글루코오스 수준 및 글루코오스의 AUC를 포함하여 이식 후 결과가 훨씬 더 우수함을 보여주었다(도 7B, 7C, 7D 및 7E). 이식된 조직의 인슐린 양성 면적은 대조군의 비율보다 화합물 1 그룹에서 더 컸다(도 7F). 또한, 대조군과 비교하여 화합물 1 그룹의 췌도 이식편에서 아밀로이드 축적 비율이 상당히 감소되었다(도 7G).
III. 검토
췌도 분리 동안 화합물 1의 보충은 시험 관내 섬 세포 생존력을 증가 시켰으며, 산화 스트레스, 활성산소(ROS) 함량, 및 c-Jun, HMGB1 및 전염증성(proinflammatory) 사이토카인의 발현을 약화시켰다. 또한, in vivo 연구를 통하여 분리 동안 화합물 1의 처리가 개선된 이식 후 결과를 보일 수 있음을 확인할 수 있었다.
게다가 화합물 1이 in vitro 췌도 생존율의 혈청 결핍-유도된 손상으로부터 보호할 수 있음을 확인할 수 있었다. 보다 중요하게, 혈청이 결핍된 배양 동안 화합물 1로 배지를 보충하면 아밀로이드 및 독성 IAPP 올리고머의 축적이 현저히 감소하고 in vivo 췌도 이식 기능이 개선되었다.
이러한 결과로부터 췌도 이식 과정에서 혈청-결핍 배양뿐만 아니라 췌도 분리 동안 본원 발명의 화합물 1의 보충에 따른 유리한 효과를 확인할 수 있었다.

Claims (8)

  1. 활성성분으로 하기 화학식 1의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 췌도 이식 보호용 조성물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2021004022-appb-I000005
    상기 화학식 1에서,
    n은 0 또는 1이고;
    X는 C 또는 N이며, 다만 X가 N일 경우 n은 0이고, X가 C일 경우 n은 1이며;
    R1은 수소 또는 C1-C6 알킬이고;
    R2는 페닐 또는 피리딘이며;
    R3는 수소, 할로겐 또는 C1-C6 알킬이고;
    R4는 수소, 할로겐, 2-카복시-피롤리딘-1-일, 피롤리딘-1-일, 4-아세트산-1,3-티아졸린-2-일, -CH2-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일) 또는 -CH2-(2-옥소피페라진-4-일)이며;
    R5는 수소, C1-C6 알킬 또는 C3-C6 사이클로알킬이고;
    R6는 -D-W-R7을 나타내며, 여기에서 D는 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 피롤리딘, 테트라하이드로피란, 테트라하이드로퓨란 또는 피페리딘이고; W는 직접결합, -SO2-, -CO-, -C(O)O-이며; R7은 수소, 하이드록시 또는 C1-C6 알킬이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물이 하기 화학식 2의 (테트라하이드로피란-4-일)-[2-페닐-5-(1,1-디옥소-티오몰포린-4-일)메틸-1H-인돌-7-일]아민인 것을 특징으로 하는 조성물:
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2021004022-appb-I000006
  3. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물이 췌도를 분리하는 동안 처리되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물이 분리된 췌도를 혈청-결핍(serum-deprived) 배양하는 동안 처리되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물이 산화 스트레스 및 활성산소(reactive oxygen species, ROS)의 양을 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제3항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물이 c-jun N-말단 키나아제, HMGB1(high mobility group box-1) 및 전염증성(proinflammatory) 사이토카인의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 전염증성 사이토카인이 인터류킨-1β, 인터류킨-6 및 종양괴사인자(TNF)-α인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제4항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물이 아밀로이드 및 독성 IAPP(islet amyloid polypeptide) 올리고머의 축적을 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
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