WO2021133142A1 - 세포배양기재 및 이의 제조방법 - Google Patents

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WO2021133142A1
WO2021133142A1 PCT/KR2020/019213 KR2020019213W WO2021133142A1 WO 2021133142 A1 WO2021133142 A1 WO 2021133142A1 KR 2020019213 W KR2020019213 W KR 2020019213W WO 2021133142 A1 WO2021133142 A1 WO 2021133142A1
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cell culture
tyr
lys
gly
substrate
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PCT/KR2020/019213
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김형택
서동식
구희관
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주식회사 아모라이프사이언스
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    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins

Definitions

  • the present invention relates to a cell culture substrate and a method for manufacturing the same.
  • Cell culture is a technique for collecting cells from a living body and culturing them outside the living body, and the cultured cells are differentiated into various tissues of the body such as skin, organs, and nerves to be transplanted into the human body or transplanted into the human body before differentiation to engraft and differentiate. It can be used to treat various diseases by making it happen at the same time.
  • Cultivation of mammalian cells is one of many processes in the life sciences and health sciences.
  • Cell culture substrates for mammalian cell culture and analysis involving fixation-dependent cells are often used, for example, in vessels such as well-plates made of high molecular weight polymers or glass, or plates such as films, where the cells are placed on the surface of the vessel or plate.
  • Additional surface treatment is required to adhere to the Such surface treatment may include, for example, forming an adsorption layer on the surface by adsorption, grafting, or plasma polymerization techniques or implementing an appropriate surface shape.
  • the surface treatment may be through chemical modification of the vessel or plate surface itself, for example, atmospheric corona, radio frequency vacuum plasma, DC glow discharge, and microwave plasma treatment ( microwave plasma treatments).
  • the current method of culturing, differentiating, cross-differentiating, and reprogramming various stem cells and somatic cells including stem cells, for example, adult stem cells (ASCs) and pluripotent stem cells (Pluriopotent stem cells), is complex.
  • a method of culturing stem cells by forming a similar microenvironment such as an extracellular matrix by forming a coating layer using culture environments, for example, extracellular matrix proteins or other proteins that help cell proliferation, on the surface of the solid substrate. it is common
  • the coating layer is formed by simply treating a solution containing the various proteins described above on a cell adhesion surface such as a container or plate and drying it.
  • a cell adhesion surface such as a container or plate
  • the activity is easily lost, so it is difficult to prepare a cell culture substrate with a coating layer formed in advance, and even if it is manufactured, it must be stored at a low temperature, and even when stored at a low temperature, the storage days are very short, within 30 days.
  • it is common to form a coating layer on the cell adhesion surface immediately before the cell loading operation which causes inconvenience in the cell culture operation and prolongs the preparation time before cell culture.
  • An object of the present invention is to provide a cell culture material capable of culturing cells to a level designed for seaweed and a method for manufacturing the same.
  • Another object of the present invention is to provide a cell culture substrate capable of achieving high cell culture efficiency as it has excellent cell adhesion and can stably proliferate the adhered cells, and a method for preparing the same.
  • the present invention has another object to provide a cell culture coating composition that can achieve the above excellent properties.
  • the present invention provides a substrate having a non-porous surface, and a cell culture coating layer covering at least a portion of the non-porous surface, wherein the cell culture coating layer is a functional peptide bound to a mussel adhesive protein. It provides a cell culture substrate in which the granules formed of the fusion protein for cell culture are aggregated.
  • the functional peptide may have a function of promoting any one or more of cell adhesion, migration, proliferation and differentiation.
  • the substrate may be formed of any one or more materials selected from the group consisting of polycarbonate, polystyrene, polyimide, polyester, polyurethane, and glass.
  • the mussel adhesive protein may be any one protein selected from the group consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 14, or a protein to which one or more amino acid sequences selected from the group are linked.
  • the functional peptide may include an RGD sequence.
  • the functional peptide may be any one or more peptides selected from the group consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 to SEQ ID NO: 18, or a peptide to which one or more amino acid sequences selected from the group are linked.
  • the present invention relates to (1) preparing a fusion protein for cell culture in which an active solution containing a carbodiimide-based coupling agent and a reactive agent and a functional peptide are bound to a mussel adhesive protein, (2) the prepared active solution and cells Preparing a cell culture coating composition by mixing a fusion protein for culture, and (3) treating the cell culture coating composition on the surface of a non-porous cell culture substrate to form a cell culture coating layer to provide.
  • the carbodiimide-based coupling agent is 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl carbodiimide hydrochloride (EDC) or N,N'-dicyclohexylcarboimide (DCC) ), and the reactant may be N-hydroxysuccinimide (NHS) or N-hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS), and more preferably N-hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-) NHS).
  • EDC 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl carbodiimide hydrochloride
  • DCC N,N'-dicyclohexylcarboimide
  • the reactant may be N-hydroxysuccinimide (NHS) or N-hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS), and more preferably N-hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-) NHS).
  • the carbodiimide-based coupling agent and the reactive agent are included in the active solution in a weight ratio of 1: 0.1 to 10, and the cell culture coating composition contains 1 carbodiimide-based coupling agent with respect to 100 parts by weight of the cell culture fusion protein. ⁇ 100 parts by weight may be mixed.
  • the present invention is a cell culture coating composition for forming a cell culture coating layer on the surface of a non-porous cell culture substrate, and includes a cell culture fusion protein in which a functional peptide is bound to a mussel adhesive protein, a carbodiimide-based coupling agent, and a reactant. It provides a cell culture coating composition, characterized in that.
  • ECM extracellular matrix
  • the cell culture substrate according to the present invention contains substances such as proteins that help cell culture, it can be stored for a long period of time at room temperature for several years, so it has excellent storage stability and at the same time, the activity of substances that help cell culture is maintained or With minimal degradation, cells can be cultured to the initially designed level. In addition, it has excellent cell adhesion to the cell culture substrate and can achieve high cell culture efficiency by stably proliferating the adhered cells, so it can be widely applied to various cell cultures such as stem cells.
  • FIG. 1 and 2 are SEM photographs of the surface of the cell culture substrate according to Examples 1 and 2 of the present invention.
  • FIG. 3 is a SEM photograph of the surface of a cell culture substrate according to a comparative example of the present invention.
  • FIGS. 8 and 9 are photographs of cell culture results using a cell culture substrate according to an embodiment of the present invention and a cell culture substrate according to a comparative example;
  • FIG. 10 is a photograph showing the results of culturing each of the four types of cells after applying various types of media to the cell culture substrate according to an embodiment of the present invention
  • 11 to 13 are photographs of the results of culturing cells after an accelerated experiment in order to evaluate the storage stability of a cell culture substrate according to an embodiment of the present invention and a cell culture substrate according to a comparative example.
  • a cell culture substrate includes a substrate having a non-porous surface and a cell culture coating layer covering at least a portion of the non-porous surface, wherein the cell culture coating layer is a functional peptide binding to a mussel adhesive protein. and a fusion protein for cell culture.
  • the substrate is a support for culturing cells, all of which may be non-porous, or at least the surface on which the cell culture coating layer to be described later is disposed may be non-porous.
  • the substrate may be used without limitation in the case of a substrate commonly used in cell culture.
  • the substrate may be a substrate in the form of a container commonly called a well plate or a plate-shaped plate such as a film, but is not limited thereto.
  • the material of the substrate can also be used without limitation in the case of the material of the substrate used in conventional cell culture, for example, any one or more selected from the group consisting of polycarbonate, polystyrene, polyimide, polyester, polyurethane, and glass. It may be formed of a material.
  • the surface on which the cell culture coating layer is to be formed may be one that has been subjected to a known surface modification treatment such as plasma treatment, but preferably a surface that has not been subjected to plasma treatment.
  • a known surface modification treatment such as plasma treatment
  • plasma treatment a surface that has not been subjected to plasma treatment.
  • the cell culture coating layer to be described later is formed on the surface of the substrate that is not plasma-treated, it is possible to achieve an increased effect on cell culture efficiency compared to the case where it is formed on the surface of the substrate treated with plasma.
  • the cell culture coating layer is a layer that provides a cell adhesion surface on which cells to be cultured are seeded and then settled and proliferated.
  • the cell culture coating layer is formed including a fusion protein for cell culture in which a functional peptide is bound to a mussel adhesive protein.
  • the cell culture coating layer is provided on the cell adhesion surface, in which particles formed of the cell culture fusion protein are aggregated. do.
  • the cell culture coating layer which is formed through a cell culture fusion protein and the coating layer surface is implemented in the form of aggregated particles, is very excellent in cell culture efficiency and forms a cell culture coating layer even when stored at room temperature for more than several years.
  • the cell culture coating layer does not use a polymer-based adhesive component, for example, an acrylic adhesive component, and introduces a functional peptide to the surface of the cell culture substrate, so there is no cytotoxicity, and the advantage of culturing cells more bio-friendly There is this.
  • the cell culture coating layer is formed through a cell culture fusion protein in which a functional peptide is bound to a mussel adhesive protein.
  • the functional peptide is a material having a function that can help cell culture, specifically, cell adhesion and movement. , it may be a substance that performs a function of promoting any one or more of proliferation and differentiation.
  • the functional peptide may be used without limitation in the case of known peptides that perform these functions. Non-limiting examples thereof include adrenomedullin, angiopoietin, bone morphogenetic protein (BMP), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), epidermal growth factor (EGF), erythropoietin.
  • Fibroblast growth factor glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), Granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), Granulocyte macrophage colony-stimulating factor , GM-CSF), growth differentiation factor-9 (GDF9), hepatocyte growth factor (HGF), hepatoma-derived growth factor (HDGF), insulin-like growth factor (Insulin- like growth factor, IGF), keratinocyte growth factor (KGF), migration-stimulating factor (MSF), myostatin (Myostatin, GDF-8), nerve growth factor (Nerve growth factor, NGF), platelet-derived growth factor (PDGF), thrombopoietin (TPO), T-cell growth factor (TCGF), neuropilin, transforming growth factor- Alpha (TGF- ⁇ ), transforming growth factor-beta (TGF- ⁇ ), tumor necrosis factor-alpha (TNF- ⁇ ), vascular endothelial growth factor (VEGF), IL-1, IL-2
  • At least one extracellular matrix selected from the group consisting of hyaluronic acid, heparin sulfate, chondroitin sulfate, termatin sulfate, keratan sulfate, alginate, fibrin, fibrinogen, collagen, elastin, fibronectin, vitronectin, cadherin and laminin It may include a sequence of a predetermined amino acid included in (extracellular matrix).
  • the functional peptide may include an RGD sequence in an amino acid sequence.
  • the functional peptide may be any one or more peptides selected from the group consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 to SEQ ID NO: 18, or a peptide to which one or more amino acid sequences selected from the group are linked.
  • the functional peptide is vitronectin poly It may be a peptide, a collagen polypeptide, a laminin polypeptide, a fibronectic polypeptide, or a variant thereof.
  • the functional peptide may be, for example, a peptide having 3 to 100 amino acids, more preferably 3 to 50, for example 3 to 30, and through this, when stored in the coating layer at room temperature for a long time Also, it may be more advantageous because decomposition, denaturation, etc. are minimized or prevented.
  • the functional peptide is bound to the mussel adhesive protein, and specifically, it may be bound to the carboxy terminus, the amino terminus, or both the carboxy terminus and the amino terminus of the mussel adhesive protein.
  • the bond may be a covalent bond, specifically, an amino bond.
  • the functional peptide and the mussel adhesive protein can be combined by a known method, and can be prepared by, for example, a recombinant protein production method using E. coli.
  • the mussel adhesive protein and the functional peptide may be directly covalently bonded, but the present invention is not limited thereto, and it is revealed that the mussel adhesive protein and the functional peptide may be indirectly bonded through a predetermined substance such as a cross-linking agent.
  • the reason for binding the functional peptide to the mussel adhesive protein is that the mussel adhesive protein is advantageous in fixing the functional peptide to the substrate surface with good adhesion properties. This is because the biocompatibility is excellent. In addition, there is an advantage in that the dissociation of the seeded cells can be minimized after the seeded cells are seated on the cell adhesion surface due to good adhesion properties with the seeded cells.
  • the mussel adhesive protein is an adhesive protein derived from mussels, and a known adhesive protein collectively referred to as a mussel adhesive protein may be used without limitation.
  • the mussel adhesive protein may be any one protein selected from the group consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 14 or a protein to which one or more amino acid sequences selected from the group are linked, for example, SEQ ID NO: 13 can
  • the granules are formed in an appropriate amount, and if the aggregated amount is large, that is, when the particle size increases and the number of particles decreases, cell adhesion and cell proliferation may be reduced.
  • the cell culture substrate according to an embodiment of the present invention in which the above-described cell culture coating layer is provided on the substrate surface is (1) an active solution containing a carbodiimide-based coupling agent and a reactive agent and a functional peptide bound to a mussel adhesive protein Preparing a cell culture fusion protein, (2) mixing the prepared active solution with the cell culture fusion protein to prepare a cell culture coating composition, and (3) treating the cell culture coating composition on the surface of a non-porous substrate It may be prepared including the step of forming a cell culture coating layer.
  • step (1) a fusion protein for cell culture in which an active solution containing a carbodiimide-based coupling agent and a reactive agent and a functional peptide are bound to a mussel adhesive protein is performed.
  • the active solution includes a carbodiimide-based coupling agent and a reactive agent, and may further include a solvent.
  • the active solution is a substance that introduces the fusion protein for cell culture to the surface of the substrate, and improves the adhesion between the cell culture coating layer and the surface of the substrate compared to the case where the fusion protein for cell culture is simply treated on the surface of the substrate by a conventional method.
  • the fusion protein is aggregated in a granular shape, there is little risk of infection by external bacteria, stable long-term storage is possible even with temperature changes, and there is little variation in cell culture.
  • the granular form in which the fusion protein induced by the active solution is aggregated is difficult to see as due to a specific chemical bond between the fusion proteins, for example, an amino bond between a carboxyl group and an amine group by a conventionally known carbodiimide-based coupling agent.
  • a specific chemical bond between the fusion proteins for example, an amino bond between a carboxyl group and an amine group by a conventionally known carbodiimide-based coupling agent.
  • a number of hydroxyl groups included in the mussel adhesive protein can also be reacted with the carbodiimide-based coupling agent. Therefore, it is difficult to see that the granular form formed by the fusion protein according to the present invention having a plurality of reaction sites is due to a certain specific reaction and chemical bonding, and it is caused by the combination between the active solution and the fusion protein according to the present invention. It can be seen as a unique result.
  • the carbodiimide-based coupling agent may be used without limitation in the case of a coupling agent that allows the fusion proteins to bind to each other, for example, 1-[3-(dimethylamino)propyl]-3-ethylcarboimide hydrochloride (EDC) or N,N'-dicyclohexylcarboimide (DCC).
  • EDC 1-[3-(dimethylamino)propyl]-3-ethylcarboimide hydrochloride
  • DCC N,N'-dicyclohexylcarboimide
  • reaction agent is provided to prevent the fusion protein in a coupled state with the carbodiimide-based coupling agent from being hydrated, thereby increasing the efficiency of binding the fusion proteins to each other.
  • N-hydroxysulfosuccin is It may be mid (Sulfo-NHS).
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • the active solution may include the carbodiimide-based coupling agent and the reactant in a weight ratio of 1:0.1 to 10. If they are not included in an appropriate ratio, it is difficult to achieve the desired effect of the present invention, and there is a concern that the cell adhesion in the implemented cell culture coating layer is significantly reduced.
  • the active solution may further contain sodium acetate to improve reactivity.
  • the sodium acetate may be included in an amount of 1 to 100 parts by weight based on 100 parts by weight of the carbodiimide-based coupling agent.
  • the active solution may further include a solvent
  • the solvent may be water or an organic solvent, for example water.
  • the method for preparing the active solution is not particularly limited, but for example, a sodium acetate solution is added to a carbodiimide-based coupling agent solution and a reactant solution, respectively, and mixed to prepare two kinds of solutions, and then two kinds of solutions After mixing in an appropriate ratio, the reaction is induced for 30 to 60 minutes, and then the final active solution can be prepared by reacting again for 25 to 40 minutes in an incubator at 28 to 35 ° C.
  • step (2) a step of preparing a cell culture coating composition by mixing the prepared active solution and the fusion protein for cell culture is performed.
  • the cell culture fusion protein and the active solution may be mixed by adjusting the content so that 1 to 100 parts by weight of the carbodiimide-based coupling agent is included with respect to 100 parts by weight of the cell culture fusion protein. If the amount of the carbodiimide-based coupling agent is less than 1 part by weight, cell adhesion may not occur or differentiation may occur, and if it exceeds 100 parts by weight, the cells may be detached after attachment, so it may be difficult to stably culture the cells.
  • the prepared active solution and the fusion protein for cell culture can be prepared as a final coating composition for cell culture after inducing a reaction for more than 0 to 2 hours after mixing.
  • the cell culture coating composition is treated on the surface of the non-porous substrate to form a cell culture coating layer.
  • the method of treating the prepared cell culture coating composition on the surface of the substrate may be by a conventional coating method, for example, in the case of a substrate such as a well plate, it may be dispensed using a pipette aid. After the cell culture coating composition is treated on the surface, a reaction can be induced in an incubator at 4 to 60° C. for more than 0 minutes to 2 hours to form a cell culture coating layer.
  • the washing process may be further performed, and for example, the washing process may be repeated 2 to 5 times in total for more than 0 to 30 minutes through tertiary distilled water. After the washing process, it can be naturally dried in the air, and through this, a cell culture substrate can be manufactured.
  • Table 1 shows amino acid sequences for the above-described mussel adhesive protein and functional peptide.
  • a 6-well plate made of sterilized polystyrene was prepared as a substrate. At this time, the 6-well plate was prepared without plasma treatment. Thereafter, 2 ml of the cell culture coating composition prepared in the following preparation example was dispensed in each well using a pipette aid, and then reacted in a constant temperature incubator to form a cell culture coating layer on the surface of the substrate. After washing three times for 10 minutes each using tertiary distilled water, the cell culture substrate was prepared by drying in the air with the plate lid open in a clean bench.
  • the fusion protein for cell culture was prepared by binding the functional peptide of SEQ ID NO: 15 to the carboxy terminus of the mussel adhesive protein of SEQ ID NO: 13 to the amino terminus.
  • the fusion protein was prepared by a recombinant protein production method using E. coli.
  • the EDC solution was put into a conical tube, a Sulfo-NHS solution was added, and the cell culture fusion protein was added to the prepared active solution while stirring, followed by stirring to prepare a cell culture coating composition.
  • the cell culture coating composition contained 1 part by weight of EDC with respect to 100 parts by weight of the cell culture fusion protein, and EDC and Sulfo-NHS were mixed in a weight ratio of 1:2, and NaOAc contained in the coating composition was EDC 100 It was included so that it might become 100 weight part with respect to weight part.
  • the concentration of the fusion protein for cell culture in the cell culture coating composition was 0.05 mg/ml.
  • the surface SEM photograph of the cell culture coating layer according to Example 1 is as shown in FIG. 1 , and it can be confirmed that the cell culture coating layer is formed by collecting particles.
  • Example 2 It was prepared in the same manner as in Example 1, except that the cell culture fusion protein was changed to one in which the functional peptide of SEQ ID NO: 19 was bound to the amino terminus of the mussel adhesive protein of SEQ ID NO: 14 to the carboxy terminus of the mussel adhesive protein of SEQ ID NO: 14 to prepare a cell culture substrate.
  • the surface SEM photograph of the cell culture coating layer according to Example 2 is as shown in FIG. 2 , and it can be confirmed that the cell culture coating layer is formed by collecting particles.
  • the surface SEM photograph of the cell culture coating layer according to Comparative Example 2 is as shown in FIG. 3 , and it can be confirmed that it has a smooth surface.
  • Example 2 It was prepared in the same manner as in Example 2, except that the cell culture fusion protein was changed to one in which the functional peptide of SEQ ID NO: 19 was linked to the amino terminus of the mussel adhesive protein of SEQ ID NO: 14 to the amino terminus, and the material of the cell culture substrate was changed A cell culture substrate was prepared by changing it to a polycarbonate.
  • the surface SEM photograph of the cell culture coating layer according to Example 3 is as shown in FIG. 4 , and it can be confirmed that the cell culture coating layer is formed by collecting particles even when the material of the substrate to be coated is changed.
  • Example 4 Prepared in the same manner as in Example 1, but using the cell culture coating composition prepared by changing the concentration of the cell culture fusion protein in the cell culture coating composition to 0.01 mg/ml, 0.1 mg/ml, and 0.5 mg/ml, respectively A cell culture substrate was prepared.
  • the surface SEM images of the cell culture coating layer according to Examples 4 to 6 are as shown in FIGS. 5, 6 and 7, respectively, and as the concentration of the cell culture fusion protein increases, the particle diameter of the formed granules becomes larger, and the number of particles decreases. , it can be confirmed that large grains with irregular grain shapes are formed according to the bonding between the grains.
  • the cell culture substrate according to Example 1 has excellent cell adhesion and growth, but the cell culture substrate according to Comparative Example 2 of FIG. 9 did not properly adhere and grow cells. have.
  • Example 1 As can be seen from FIG. 10 , it can be seen that the cell culture substrate of Example 1 is suitable for culturing various types of cells and has excellent compatibility with various types of media.
  • a cell culture substrate was prepared by coating Matrigel and Vitronectin-XF TM , which are commercially available as a coating composition for cell culture, on a 6-well plate made of sterilized polystyrene as a substrate according to the coating composition manufacturer's protocol.
  • Example 1 The cell culture substrates according to Example 1, Comparative Example 3 and Comparative Example 4 were subjected to an accelerated aging test according to the guidelines according to the setting of the expiration date of the medical device and the safety evaluation in the following manner, and then culturing the induced pluripotent stem cells for storage stability evaluated.
  • the cell culture material is stored at an elevated temperature (60°C) for 0 months, 1 month, 2 months, and 3 months, and the aging period of each cell culture material was prepared to be year 0, year 1, year 2, and year 3.
  • the cell culture substrate according to Example 1 even when the aging period is accelerated to be 0, 1, 2, or 3 years, it can be seen that all of the cells can be cultured and the cell culture performance is excellent.
  • the cell culture performance was excellent when the aging period was 0 years, but cells were not cultured in the specimen in which the aging period was accelerated to 1 to 3 years.
  • the cells were cultured in the 0 to 3 year accelerated specimen, but the number of cultured cells was significantly smaller compared to the specimen according to Example 1, and through this, the storage stability and cell culture of the cell culture substrate according to Example 1 It can be seen that the performance is very good.

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Abstract

세포배양기재가 제공된다. 본 발명의 일 실시예에 의한 세포배양기재는 비다공성 표면을 구비하는 기재, 및 상기 비다공성 표면의 적어도 일부를 피복한 세포배양 코팅층을 구비하며, 상기 세포배양 코팅층은 기능성 펩타이드가 홍합 접착단백질에 결합된 세포배양용 융합단백질로 형성된 알갱이들이 집합되어 표면의 적어도 일부를 형성하도록 구현된다. 이에 의하면, 세포배양에 도움을 주는 단백질과 같은 물질을 함유함에도 불구하고 상온에서 수년 간 장기간 저장이 가능해 저장안정성이 매우 우수한 동시에 세포배양에 도움을 주는 물질의 활성은 그대로 유지되거나 최소한의 저하만 발생해 초도 설계한 수준으로 세포를 배양시킬 수 있다. 또한, 세포배양기재에 세포 부착성이 우수하고, 부착된 세포를 안정적으로 증식시킬 수 있음에 따라서 높은 세포배양 효율을 달성할 수 있음에 따라서 줄기세포 등 각종 세포배양에 널리 응용될 수 있다.

Description

세포배양기재 및 이의 제조방법
본 발명은 세포배양기재 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
최근, 질병 치료에 배양 세포의 이용이 확대됨에 따라 세포 배양에 대한 관심 및 연구가 증가하고 있다. 세포 배양은 세포를 생체로부터 채취하고, 생체 밖에서 배양시키는 기술이며, 배양된 세포는 피부, 장기, 신경 등 신체의 다양한 조직으로 분화시켜 인체에 이식되거나 분화시키기 전 상태로 인체에 이식시켜 생착 및 분화를 동시에 이루어지게 하여 다양한 질병 치료에 활용될 수 있다.
포유류 세포의 배양은 생명 과학 및 보건 과학에서 많은 공정들 중 하나이다. 고정-의존성 세포를 수반하는 포유류 세포 배양 및 분석을 위한 세포배양기재는 흔히 예를 들어 고분자 중합체 또는 유리로 만들어진 웰-플레이트와 같은 용기나 필름과 같은 플레이트가 많이 사용되는데, 세포가 용기나 플레이트 표면에 부착되게 하는 추가의 표면 처리가 요구된다. 이와 같은 표면 처리는 예를 들어 흡착, 그래프팅 또는 플라스마 중합 기술에 의해 표면 상에 흡착층을 형성시키거나 적절한 표면형상을 구현하는 것을 포함할 수 있다. 또는 상기 표면 처리는 용기나 플레이트 표면 그 자체에 화학적 개질을 통한 것일 수 있으며, 예를 들어 대기 코로나, 무선 주파수 진공 플라스마(radio frequency vacuum plasma), DC 글로우 방전(glow discharge), 및 마이크로파 플라스마 처리(microwave plasma treatments)등을 통해 수행될 수 있다.
한편, 줄기세포 예를 들어 성인 줄기세포(adult stem cells, ASCs), 전분화능줄기세포(Pluriopotent stem cell)을 포함한 각종 줄기세포 및 체세포들을 배양 및 분화, 교차분화, 리프로그래밍 하는 현재의 방법은 복잡한 배양 환경들, 예를 들어 세포외 기질 단백질이나, 세포의 증식에 도움을 주는 다른 여러 단백질을 이용한 코팅층을 고형 기재 표면 상에 형성시켜 세포외 기질과 같은 유사한 미세환경을 형성시켜 줄기 세포를 배양하는 것이 일반적이다.
한편, 상기 코팅층은 상술한 각종 단백질들을 포함한 용액을 단순히 용기나 플레이트와 같은 세포부착 표면에 처리한 뒤 건조시켜 형성시키는데, 코팅층 내 단백질의 활성 안정성은 매우 낮아서 코팅층을 형성시킨 뒤 상온에서 몇 시간 내 활성을 쉽게 잃어버리는 문제가 있어서 미리 코팅층이 형성된 세포배양기재를 제조해 두기 어렵고, 제조하더라도 이를 저온에서 보관해야 하며, 저온 보관 시에도 보관일수가 30일 이내로 매우 짧은 문제가 있다. 또한, 이와 같은 열악한 저장안정성으로 인해 세포 로딩 작업 직전에 세포부착 표면에 코팅층을 형성시키는 것이 일반적이며, 이로 인해 세포배양 작업상 불편함과, 세포배양 전 준비시간이 연장되는 문제가 있다.
본 발명은 상기와 같은 점을 감안하여 안출한 것으로, 상온에서 수년 간 장기간 저장이 가능해 저장안정성이 매우 우수하고, 그럼에도 불구하고 세포배양에 도움을 주는 물질의 활성은 그대로 유지되거나 최소한의 저하만 발생해 초도 설계한 수준으로 세포를 배양시킬 수 있는 세포배양기재 및 이의 제조방법을 제공하는데 목적이 있다.
또한, 본 발명은 세포 부착성이 우수하고, 부착된 세포를 안정적으로 증식시킬 수 있음에 따라서 높은 세포배양 효율을 달성할 수 있는 세포배양기재 및 이의 제조방법을 제공하는데 다른 목적이 있다.
나아가 본 발명은 위와 같은 우수한 특성을 달성할 수 있도록 하는 세포배양 코팅조성물을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.
상술한 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 비다공성 표면을 구비하는 기재, 및 상기 비다공성 표면의 적어도 일부를 피복한 세포배양 코팅층을 구비하며, 상기 세포배양 코팅층은 기능성 펩타이드가 홍합 접착단백질에 결합된 세포배양용 융합단백질로 형성된 알갱이들이 집합된 것인 세포배양기재를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 기능성 펩타이드는 세포의 부착, 이동, 증식 및 분화 중 어느 하나 이상을 촉진시키는 기능을 가질 수 있다.
또한, 상기 기재는 폴리카보네이트, 폴리스티렌, 폴리이미드, 폴리에스테르, 폴리우레탄 및 유리로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 재질로 형성된 것일 수 있다.
또한, 상기 홍합 접착단백질은 서열번호 1 내지 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 단백질 또는 상기 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열이 연결된 단백질일 수 있다.
또한, 상기 기능성 펩타이드는 RGD 서열을 포함할 수 있다.
또한, 상기 기능성 펩타이드는 서열번호 15 내지 서열번호 18의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 펩타이드 또는 상기 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열이 연결된 펩타이드일 수 있다.
또한, 본 발명은 (1) 카보디이미드계 커플링제 및 반응제를 포함하는 활성용액과 기능성 펩타이드가 홍합 접착단백질에 결합된 세포배양용 융합단백질을 준비하는 단계, (2) 준비된 활성용액과 세포배양용 융합단백질을 혼합하여 세포배양 코팅조성물을 제조하는 단계, 및 (3) 세포배양 코팅조성물을 비다공성 세포배양기재 표면에 처리하여 세포배양 코팅층을 형성시키는 단계를 포함하는 세포배양기재 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 카보디이미드계 커플링제는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필 카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC) 또는 N,N'-디시클로헥실카보이미드(DCC)이며, 상기 반응제는 N-하이드록시석신이미드(NHS) 또는 N-하이드록시설포석신이미드(Sulfo-NHS)일 수 있고, 보다 바람직하게는 N-하이드록시설포석신이미드(Sulfo-NHS)일 수 있다.
또한, 상기 카보디이미드계 커플링제와 반응제는 1: 0.1~10 중량비로 활성용액에 포함되며, 상기 세포배양 코팅조성물은 세포배양용 융합단백질 100 중량부에 대해서 카보디이미드계 커플링제가 1 ~ 100 중량부로 혼합될 수 있다.
또한, 본 발명은 비다공성 세포배양 기재 표면에 세포배양 코팅층을 형성하는 세포배양 코팅조성물로서, 기능성 펩타이드가 홍합 접착단백질에 결합된 세포배양용 융합단백질, 카보디이미드계 커플링제 및 반응제를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포배양 코팅조성물을 제공한다.
이하, 본 발명에서 사용한 용어에 대하여 설명한다.
본 발명의 "세포외 기질(extracellular matrix, ECM)"은 세포의 외부를 둘러싸고 있는 기질로서, 세포와 세포 사이를 차지하고 있으며, 주로 단백질과 다당류로 이루어진 망상 구조를 가지는 것을 의미하는 것이다.
본 발명에 의한 세포배양기재는 세포배양에 도움을 주는 단백질과 같은 물질을 함유함에도 불구하고 상온에서 수년 간 장기간 저장이 가능해 저장안정성이 매우 우수한 동시에 세포배양에 도움을 주는 물질의 활성은 그대로 유지되거나 최소한의 저하만 발생해 초도 설계한 수준으로 세포를 배양시킬 수 있다. 또한, 세포배양기재에 세포 부착성이 우수하고, 부착된 세포를 안정적으로 증식시킬 수 있음에 따라서 높은 세포배양 효율을 달성할 수 있음에 따라서 줄기세포 등 각종 세포배양에 널리 응용될 수 있다.
도 1 및 도 2는 본 발명의 실시예1과 실시예2에 따른 세포배양기재 표면의 SEM 사진,
도 3은 본 발명의 비교예에 따른 세포배양기재 표면의 SEM 사진,
도 4 내지 도 7은 본 발명의 실시예에 따른 세포배양기재 표면의 SEM 사진,
도 8 및 도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포배양기재와, 비교예에 따른 세포배양기재를 통한 세포배양결과를 촬영한 사진,
도 10은 본 발명의 일 실시에에 따른 세포배양기재에 여러 종류의 배지를 적용시킨 뒤 4종의 세포 각각 배양시킨 결과에 대한 사진, 그리고
도 11 내지 도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포배양기재와, 비교예에 따른 세포배양기재의 저장안정성을 평가하기 위해서 가속화실험을 한 뒤 세포를 배양한 결과에 대한 사진이다.
이하, 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 의한 세포배양기재는 비다공성 표면을 구비하는 기재 및 상기 비다공성 표면의 적어도 일부를 피복한 세포배양 코팅층을 구비하며, 상기 세포배양 코팅층은 기능성 펩타이드가 홍합 접착단백질에 결합된 세포배양용 융합단백질을 포함한다.
상기 기재는 세포를 배양하기 위한 지지체로서, 전부가 비다공성의 기재이거나, 적어도 후술하는 세포배양 코팅층이 배치되는 표면이 비다공성일 수 있다. 또한, 상기 기재는 세포배양 시 통상적으로 사용되는 기재의 경우 제한 없이 사용될 수 있다. 일예로서 상기 기재는 통상적으로 웰플레이트라고 불리는 용기 형태의 기재이거나 또는 필름과 같은 판상인 플레이트일 수 있으나 이에 제한 되는 것은 아니다. 또한, 상기 기재의 재질 역시 통상적인 세포배양 시 사용되는 기재의 재질의 경우 제한 없이 사용할 수 있으며, 일 예로 폴리카보네이트, 폴리스티렌, 폴리이미드, 폴리에스테르, 폴리우레탄 및 유리로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 재질로 형성된 것일 수 있다.
상기 기재에서 세포배양 코팅층이 형성될 표면은 플라즈마 처리와 같은 공지된 표면개질 처리가 된 것일 수 있으나, 바람직하게는 플라즈마 처리가 되지 않은 표면일 수 있다. 후술하는 세포배양 코팅층은 플라즈마 처리가 되지 않은 기재의 표면에 형성되었을 때, 플라즈마 처리된 기재의 표면에 형성된 경우에 대비해 세포배양효율에 상승된 효과를 달성할 수 있다.
다음으로 상술한 기재의 표면 상에 구비되는 세포배양 코팅층에 대해 설명한다.
상기 세포배양 코팅층은 배양될 세포가 파종된 뒤 안착 및 증식하는 세포부착 표면을 제공하는 층이다. 상기 세포배양 코팅층은 기능성 펩타이드가 홍합 접착단백질에 결합된 세포배양용 융합단백질을 포함하여 형성되는데, 구체적으로 상기 세포부착 표면에는 상기 세포배양용 융합단백질로 형성된 알갱이들이 집합되어 형성된 세포배양 코팅층이 구비된다. 세포배양용 융합단백질을 통해 형성되고 코팅층 표면이 알갱이들이 집합된 형태로 구현된 세포배양 코팅층은 세포배양 효율에 있어서 매우 우수한 동시에 상온에서도 수 년 이상 보관하는 경우에도 세포배양 코팅층을 형성하는 세포배양용 융합단백질이 분해, 변성됨에 따라서 야기되는 기능성 펩타이드의 활성 감소가 방지 또는 최소화됨에 따라서 저장안정성이 매우 향상되는 이점이 있다. 또한, 상기 세포배양 코팅층은 폴리머 계열의 접착성분, 예를 들어 아크릴계 접착성분을 사용하지 않고 기능성 펩타이드를 세포배양기재 표면에 도입함에 따라서 세포독성이 없고, 세포를 보다 생체친화적으로 배양시킬 수 있는 이점이 있다.
상기 세포배양 코팅층은 기능성 펩타이드가 홍합 접착단백질에 결합된 세포배양용 융합단백질을 통해 형성되는데, 상기 기능성 펩타이드는 세포배양에 도움을 줄 수 있는 기능을 갖는 물질로서, 구체적으로는 세포의 부착, 이동, 증식 및 분화 중 어느 하나 이상을 촉진시키는 기능을 수행하는 물질일 수 있다. 상기 기능성 펩타이드는 이러한 기능을 수행하는 공지된 펩타이드의 경우 제한없이 사용될 수 있다. 이에 대한 비제한적인 예로서, 아드레노메둘린(Adrenomedullin), 앙기오포이에틴(Angiopoietin), 뼈형성단백질(BMP), 뇌유래신경영양인자(BDNF), 표피생장인자(EGF), 에리스로포이에틴(Erythropoietin), 섬유아세포 증식인자(Fibroblast growth factor), 신경교의세포주유래신경영양인자(GDNF), 과립구집락자극인자(Granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF), 과립대식세포집락자극인자(Granulocyte macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF), 성장분화인자-9(Growth differentiation factor-9, GDF9), 간세포생장인자(HGF), 간세포선종 유래 생장인자(Hepatoma-derived growth factor, HDGF), 인슐린유사생장인자(Insulin-like growth factor, IGF), 각질세포 증식인자(Keratinocyte growth factor , KGF), 이동자극인자(Migration-stimulating factor, MSF), 마이오스타틴(Myostatin , GDF-8), 신경생장인자(Nerve growth factor, NGF), 혈소판유래생장인자(Platelet-derived growth factor, PDGF), 트롬보포이에틴(Thrombopoietin, TPO), T-세포생장인자(T-cell growth factor, TCGF), 뉴로필린, 형질전환생장인자-알파(TGF-α), 형질전환생장인자-베타(TGF-β), 종양괴사인자-알파(TNF-α), 혈관내피생장인자(VEGF), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-7로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 생장인자(GF)에 포함된 소정의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또는, 히알루론산, 헤파린황산염, 콘드로이틴황산염, 테르마틴황산염, 케라탄황산염, 알진염, 피브린, 피브리노겐, 콜라겐, 엘라스틴, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 카드헤린 및 라미닌으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 세포외 기질(extracellular matrix)에 포함되는 소정의 아미노산의 서열을 포함할 수 있다.
일예로 상기 기능성 펩타이드는 아미노산 서열 내 RGD 서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 기능성 펩타이드는 서열번호 15 내지 서열번호 18의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 펩타이드 또는 상기 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열이 연결된 펩타이드일 수 있다 또한, 상기 기능성 펩타이드는 비트로넥틴 폴리펩타이드, 콜라겐 폴리펩타이드, 라미닌 폴리펩타이드, 피브로넥틱 폴리펩타이드 또는, 이들의 변이체일 수 있다.
한편, 상기 기능성 펩타이드는 일예로 아미노산 개수가 3 ~ 100개, 보다 바람직하게는 3 ~ 50개, 일예로 3 ~ 30개인 펩타이드 일 수 있으며, 이를 통해 장시간 상온에서 코팅층에 함유된 상태로 보관되는 경우에도 분해, 변성 등이 최소화 또는 방지되기에 보다 유리할 수 있다.
또한, 상기 기능성 펩타이드는 홍합 접착단백질에 결합되는데, 구체적으로 홍합 접착단백질의 카르복시 말단, 아미노 말단 또는 카르복시 말단과 아미노 말단 양단에 결합될 수 있다. 이때 상기 결합은 공유결합이며, 구체적으로 아미노결합일 수 있다. 한편, 기능성 펩타이드와 홍합 접착단백질은 공지된 방법을 통해 결합시킬 수 있고, 일예로 대장균을 이용한 재조합 단백질 생산법을 통해 제조할 수 있다. 한편, 홍합 접착단백질과 기능성 펩타이드 간에 직접 공유결합으로 결합될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니며 가교제와 같은 소정의 물질을 매개하여 홍합 접착단백질과 기능성 펩타이드 간 간접적으로 결합될 수 있음을 밝혀둔다.
기능성 펩타이드를 홍합 접착단백질에 결합시키는 이유는 홍합 접착단백질이 기능성 펩타이드를 기재 표면에 부착특성이 좋게 고정시키기에 유리하며, 상술한 것과 같이 폴리머 기반의 접착성분에 대비해 배양세포에 가할 수 있는 독성이 없고, 생체적합성이 우수하기 때문이다. 또한, 파종된 세포와의 부착특성이 좋아서 파종된 세포가 세포부착 표면에 안착된 후 탈리를 최소화할 수 있는 이점이 있다.
상기 홍합 접착단백질은 홍합에서 유래한 접착단백질로서, 홍합 접착단백질로 통칭되는 공지의 접착단백질의 경우 제한 없이 사용될 수 있다. 바람직하게는 상기 홍합 접착단백질은 서열번호 1 내지 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 단백질 또는 상기 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열이 연결된 단백질일 수 있고, 일예로 서열번호 13번일 수 있다.
또한, 알갱이들은 적절한 양으로 형성되는 것이 바람직하며, 만일 aggregation된 양이 많을 경우, 즉 알갱이 입경이 커지고, 입자 수는 적어지는 경우 세포부착 및 세포증식이 저하될 우려가 있다.
상술한 세포배양 코팅층이 기재 표면에 구비된 본 발명의 일 실시예에 의한 세포배양기재는 (1) 카보디이미드계 커플링제 및 반응제를 포함하는 활성용액과 기능성 펩타이드가 홍합 접착단백질에 결합된 세포배양용 융합단백질을 준비하는 단계, (2) 준비된 활성용액과 세포배양용 융합단백질을 혼합하여 세포배양 코팅조성물을 제조하는 단계, 및 (3) 세포배양 코팅조성물을 비다공성 기재 표면에 처리하여 세포배양 코팅층을 형성시키는 단계를 포함하여 제조될 수 있다.
먼저, 본 발명에 따른 (1) 단계로서 카보디이미드계 커플링제 및 반응제를 포함하는 활성용액과 기능성 펩타이드가 홍합 접착단백질에 결합된 세포배양용 융합단백질을 준비하는 단계를 수행한다.
상기 활성용액은 카보디이미드계 커플링제와 반응제를 포함하며, 용매를 더 포함할 수 있다. 활성용액은 세포배양용 융합 단백질을 기재 표면에 도입시키는 물질로서, 단순히 세포배양용 융합 단백질을 통상의 방법으로 기재 표면에 처리한 경우에 대비해 세포배양 코팅층과 기재 표면 간의 부착력을 향상시키며, 세포배양용 융합 단백질을 알갱이 형상으로 응집시키고, 외부 균의 감염의 우려가 적고 온도의 변화에도 안정적으로 장기간 보관이 가능하며 세포배양 시 편차가 적은 이점이 있다. 한편, 활성용액이 유도하는 융합 단백질이 응집된 알갱이 형태는 융합 단백질 간 어떤 특정의 화학결합, 예를 들어 종래 알려진 카보디이미드계 커플링제에 의한 카르복시기와 아민기 간 아미노 결합에 의한 것으로 보기 어려운데, 이는 홍합 접착단백질 내 포함된 다수의 히드록시기 역시 카보디이미드계 커플링제와 반응될 수 있기 때문이다. 따라서 다수의 반응사이트를 가지고 있는 본 발명에 따른 융합단백질이 형성한 알갱이 형태는 어떤 특정 반응 및 이에 따른 화학결합에 의한 것으로 보기는 어렵고, 활성용액과 본 발명에 따른 융합단백질 간 조합에 따라서 발생하는 특유의 결과로 볼 수 있다.
상기 카보디이미드계 커플링제는 융합 단백질들이 서로 결합되도록 하는 커플링제의 경우 제한 없이 사용될 수 있으며, 일예로 1-[3-(디메틸아미노)프로필]-3-에틸카보이미드 하이드로클로라이드(EDC) 또는 N,N'-디시클로헥실카보이미드(DCC)일 수 있다.
또한, 상기 반응제는 카보디이미드계 커플링제와 커플링된 상태의 융합단백질이 수화되는 것을 방지하여 융합 단백질들이 서로 결합되는 효율을 증가시키기 위해 구비되는 것으로서, 일예로 N-하이드록시설포석신이미드(Sulfo-NHS)일 수 있다. 한편, 반응제로 종래에 알려진 N-하이드록시석신이미드(NHS)의 경우 본 발명이 목적하는 효과를 발현하는데 있어서 용이하지 않을 수 있다.
상기 활성용액은 상기 카보디이미드계 커플링제와 반응제를 1 :0.1 ~ 10 중량비로 포함할 수 있다. 만일 이들이 적절한 비율로 포함되지 못할 경우 본 발명이 목적하는 효과를 달성하기 어렵고, 구현된 세포배양코팅층에서 세포의 부착성이 현저히 저하될 우려가 있다.
또한, 상기 활성용액은 반응성 향상을 위하여 아세트산나트륨을 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 아세트산 나트륨은 카보디이미드계 커플링제 100 중량부에 대해서 1 ~ 100 중량부로 포함될 수 있다.
또한, 상기 활성용액은 용매를 더 포함할 수 있는데, 상기 용매는 물 또는 유기용매일 수 있고, 일예로 물일 수 있다.
상기 활성용액은 제조하는 방법이 특별히 한정되는 것은 아니나, 일예로 아세트산 나트륨 용액을 카보디이미드계 커플링제 용액과 반응제 용액에 각각 투입하여 혼합하여 2 종의 용액을 제조한 뒤, 2종의 용액을 적절한 비율로 혼합한 뒤 30 ~ 60분간 반응을 유도하고, 이후 28 ~ 35℃ 항온 배양기에서 다시 25 ~ 40분간 반응시켜 최종 활성용액이 제조될 수 있다.
다음으로 본 발명에 따른 (2) 단계로서, 준비된 활성용액과 세포배양용 융합단백질을 혼합하여 세포배양 코팅조성물을 제조하는 단계를 수행한다.
이때, 상기 세포배양용 융합단백질과 활성용액은, 세포배양용 융합단백질 100 중량부에 대해서 카보디이미드계 커플링제가 1 ~ 100 중량부 포함되도록 함량을 조절하여 혼합될 수 있다. 만일 카보디이미드계 커플링제가 1 중량부 미만일 경우 세포의 부착이 되지 않거나 분화가 될 수 있고, 100 중량부를 초과할 경우 세포가 부착 후 탈리될 수 있어서 세포를 안정적으로 배양하기 어려울 수 있다.
또한, 준비된 활성용액과 세포배양용 융합단백질은 혼합 후 0 초과 ~ 2시간 동안 반응을 유도한 뒤 최종 세포배양용 코팅조성물로 제조될 수 있다.
다음으로 본 발명에 따른 (3) 단계로서, 세포배양 코팅조성물을 비다공성 기재 표면에 처리하여 세포배양 코팅층을 형성시키는 단계를 수행한다.
준비된 세포배양 코팅조성물을 기재 표면에 처리하는 방법은 통상적인 코팅방법에 의할 수 있고, 일예로 웰플레이트와 같은 기재일 경우 파이펫 에이드를 이용해 분주할 수 있다. 세포배양 코팅조성물을 표면에 처리한 뒤 4 ~ 60℃ 항온배양기에서 0분 초과 ~ 2시간 동안 반응을 유도해 세포배양 코팅층을 형성시킬 수 있다.
이후 세척공정을 더 거칠 수 있고, 일예로 3차 증류수를 통해 0초과 ~ 30분씩 총 2 ~ 5회 세척공정을 반복수행할 수 있다. 세척공정을 거친 후에는 공기 중에서 자연건조시킬 수 있으며, 이를 통해 세포배양기재를 제조할 수 있다.
하기 표 1은 상술한 홍합 접착단백질과 기능성 펩타이드에 대한 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 아미노산 서열
1 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
2 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
3 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
4 Glu Val His Ala Cys Lys Pro Asn Pro Cys Lys Asn Asn Gly Arg Cys Tyr Pro Asp Gly Lys Thr Gly Tyr Lys Cys Lys Cys Val Gly Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Cys Ala Cys
5 Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly Gly Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Gly Ser Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp Asn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr Glu Phe Glu Phe
6 Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly Gly Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp Asn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr
7 Gly His Val His Arg His Arg Val Leu His Lys His Val His Asn His Arg Val Leu His Lys His Leu His Lys His Gln Val Leu His Gly His Val His Arg His Gln Val Leu His Lys His Val His Asn His Arg Val Leu His Lys His Leu His Lys His Gln Val Leu His
8 Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ala Tyr His Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser
9 Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser
10 Tyr Asp Asp Tyr Ser Asp Gly Tyr Tyr Pro Gly Ser Ala Tyr Asn Tyr Pro Ser Gly Ser His Trp His Gly His Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Gly Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Phe Lys Arg Thr Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys His Tyr Gly Gly Ser Ser Ser
11 Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser
12 Gly Gly Gly Asn Tyr Arg Gly Tyr Cys Ser Asn Lys Gly Cys Arg Ser Gly Tyr Ile Phe Tyr Asp Asn Arg Gly Phe Cys Lys Tyr Gly Ser Ser Ser Tyr Lys Tyr Asp Cys Gly Asn Tyr Ala Gly Cys Cys Leu Pro Arg Asn Pro Tyr Gly Arg Val Lys Tyr Tyr Cys Thr Lys Lys Tyr Ser Cys Pro Asp Asp Phe Tyr Tyr Tyr Asn Asn Lys Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Asn Asp Lys Asp Tyr Phe Asn Cys Gly Ser Tyr Asn Gly Cys Cys Leu Arg Ser Gly Tyr
13 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ala Tyr His Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys
14 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Ly
15 Lys Gly Gly Pro Gln Val Thr Arg Gly Asp Val Phe Thr Met Pro
16 Gly Ala Cys Arg Gly Asp Cys Leu Gly Ala
17 Lys Gly Gly Pro Gln Cys Val Thr Arg Gly Asp Val Phe Cys Thr Pro
18 Arg Gly Asp
19 Pro His Ser Arg Asn Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Gly Asp Ser Pro
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기로 하지만, 하기 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니며, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 해석되어야 할 것이다.
<실시예1>
기재로 멸균된 폴리스티렌 재질의 6웰 플레이트를 준비했다. 이때, 6웰 플레이트는 플라즈마 처리가 되지 않은 것을 준비했다. 이후 하기의 준비예에서 제조된 세포배양 코팅조성물을 각 웰당 2㎖씩 파이펫 에이드를 이용해 분주한 뒤 항온 배양기에서 반응하여 기재 표면에 세포배양 코팅층을 형성시켰다. 이후 3차 증류수를 이용하여 10분씩 3회 세척한 뒤, 클린벤치 내에서 플레이트 뚜껑을 열어둔 채로 공기 중에서 건조시켜 세포배양기재를 제조하였다.
* 준비예 - 세포배양 코팅조성물 제조
세포배양용 융합단백질은 서열번호 13 홍합 접착단백질의 카르복시 말단에 서열번호 15의 기능성 펩타이드를 아미노 말단에 결합시킨 것을 준비하였다. 이때, 융합단백질은 대장균을 이용한 재조합 단백질 생산법으로 제조하였다.
한편, 활성용액을 준비하기 위해서 3차 증류수에 용해된 NaOAc, NaHCO3, 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid 용액을 먼저 제조한 뒤 EDC와 Sulfo-NHS 시약이 각각 분주되어 있는 마이크로 튜브에 각각 넣어서 EDC용액과 Sulfo-NHS을 제조했다.
세포배양 코팅조성물을 제조하기 위해서 코니칼 튜브에 EDC 용액을 투입한 뒤, Sulfo-NHS 용액을 넣고 교반하면서 준비된 활성용액에 세포배양용 융합단백질을 투입한 뒤 교반시켜 세포배양 코팅조성물을 제조하였다. 이때, 세포배양 코팅조성물은 세포배양용 융합단백질 100 중량부에 대해서 EDC가 1 중량부 포함되도록 하고, EDC와 Sulfo-NHS는 1:2 중량비가 되도록 혼합하였으며, 코팅조성물에 포함된 NaOAc는 EDC 100 중량부에 대해서 100 중량부가 되도록 포함시켰다. 이때, 세포배양 코팅조성물에서 세포배양용 융합단백질의 농도는 0.05㎎/㎖이었다.
실시예1에 따른 세포배양 코팅층의 표면 SEM 사진은 도 1과 같으며, 세포배양 코팅층이 알갱이가 집합되어 형성된 것을 확인할 수 있다.
<실시예2>
실시예1과 동일하게 실시하여 제조하되, 세포배양용 융합단백질을 서열번호 14의 홍합 접착단백질의 카르복시 말단에 서열번호 19의 기능성 펩타이드를 아미노 말단에 결합 시킨 것으로 변경해서 세포배양기재를 제조하였다. 실시예2에 따른 세포배양 코팅층의 표면 SEM 사진은 도 2와 같으며, 세포배양 코팅층이 알갱이가 집합되어 형성된 것을 확인할 수 있다.
<비교예1>
실시예1과 동일하게 실시하여 제조하되, 세포배양 코팅조성물로 코팅시키지 않고, 플라즈마 처리도 되지 않은 6웰 플레이트를 세포배양기재로 사용하였다. 비교예2에 따른 세포배양 코팅층의 표면 SEM 사진은 도 3과 같으며, 매끄러운 표면을 갖는 것을 확인할 수 있다.
<실시예3>
실시예2와 동일하게 실시하여 제조하되, 세포배양용 융합단백질을 서열번호 14의 홍합 접착단백질의 카르복시 말단에 서열번호 19의 기능성 펩타이드를 아미노 말단에 결합 시킨 것으로 변경하고, 세포배양기재의 재질을 폴리카보네이트인 것으로 변경하여 세포배양기재를 제조하였다. 실시예3에 따른 세포배양 코팅층의 표면 SEM 사진은 도 4와 같으며, 피코팅 기재의 재질을 변경한 경우에도 세포배양 코팅층이 알갱이가 집합되어 형성된 것을 확인할 수 있다.
<실시예4 ~ 6>
실시예1과 동일하게 실시하여 제조하되, 세포배양 코팅조성물에서 세포배양용 융합단백질의 농도를 각각 0.01㎎/㎖, 0.1㎎/㎖, 0.5㎎/㎖로 변경해서 제조한 세포배양 코팅조성물을 이용해 세포배양기재를 제조하였다. 실시예4 내지 6에 따른 세포배양 코팅층의 표면 SEM 사진은 각각 도 5, 도 6 및 도 7과 같으며, 세포배양용 융합단백질의 농도가 높아질수록 형성된 알갱이의 입경은 더 커지고, 입자수가 적어지며, 입자들 간 결합에 따라서 알갱이 형상이 비정형인 거대 알갱이들이 형성되는 것을 확인할 수 있다.
<비교예2>
실시예1과 동일하게 실시하여 제조하되, 세포융합 단백질 대신에 동일농도로 서열번호 15의 기능성 펩타이드로 변경하여 세포배양기재를 제조하였다.
<실험예1>
실시예1 및 비교예2에 따른 세포배양기재에 유도만능줄기세포를 동일한 양을 분주한 뒤 줄기세포 배양배지(StemMACSTM)를 이용하여 5일간 배양 후 세포염색법으로 세포배양여부를 관찰으며, 세포배양 결과 사진을 도 8 및 도 9에 나타내었다.
도 8을 통해 확인할 수 있듯이 실시예1에 따른 세포배양기재는 세포의 부착, 성장이 우수하나, 도 9의 비교예2에 따른 세포배양기재는 세포의 부착 및 성장이 제대로 이루어지지 않은 것을 알 수 있다.
<실험예 2>
실시예1에 따른 세포배양기재에 각각의 배지에 hiPSC-1, hESO, hiPSC-2, hiPSC-3을 분주한 뒤 mTeSR1TM, TeSR2TM, StemMACSTM, E8TM 배지를 이용하여 5일간 배양한 후, 세포염색법으로 세포배양여부를 관찰으며, 세포배양 결과 사진을 도 10에 나타내었다.
도 10을 통해 확인할 수 있듯이, 실시예1의 세포배양기재는 여러 종류의 세포 배양에 적합하고, 다양한 종류의 배지와 상용성도 우수한 것을 알 수 있다.
<비교예 3 ~ 4>
기재로 멸균된 폴리스티렌 재질의 6웰 플레이트에 세포배양용 코팅조성물로 시판 중인 Matrigel, Vitronectin-XFTM을 해당 코팅조성물 제조사의 프로토콜에 의거하여 코팅시켜서 세포배양기재를 제조하였다.
<실험예3>
실시예1, 비교예 3 및 비교예 4에 따른 세포배양기재를 아래의 방법으로 의료기기 유효기간 설정 및 안정성 평가에 따른 가이드라인에 따라 가속노화 시험을 시킨 뒤 유도만능줄기세포를 배양시켜서 저장안정성을 평가했다.
구체적으로 세포배양기재를 실시간노화를 단축된 시간 내에서 재현하기 위해 상승된 온도(60℃)에서 세포배양기재를 0개월, 1개월, 2개월, 3개월 보관하여 각각의 세포배양기재의 노화기간을 0년, 1년, 2년, 3년이 되도록 준비했다.
실시예 및 비교예 별 각각 준비된 4개의 세포배양기재에 유도만능줄기세포를 동일한 양을 분주한 뒤 줄기세포 배양배지(StemMACSTM)를 이용하여 5일간 배양 후 광학현미경으로 촬영하여 세포배양여부를 관찰으며, 세포배양 결과 사진을 도 11(실시예1), 도 12(비교예3) 및 도 13(비교예4)에 나타내었고, 배양된 세포 수를 카운팅해서 하기 표 2에 나타내었다.
가속화 시편별 배양세포수(×106)
0개월 1개월 2개월 3개월
실시예1 6.9 7.96 5.63 8.36
비교예3 6.45 0 0 0
비교예4 1.11 2.14 2.63 1.28
도 11 내지 도 13 및 표 2를 통해 확인할 수 있듯이,
실시예1에 따른 세포배양기재의 경우 노화기간이 0년, 1년, 2년, 3년이 되도록 가속화 시킨 경우에도 모두 세포배양이 가능하고, 세포배양 성능이 우수한 것을 알 수 있다. 그러나 비교예3의 경우 노화기간이 0년인 경우 세포배양 성능이 우수하나, 노화기간이 1년 ~ 3년이 되도록 가속화시킨 시편에서는 세포가 배양되지 않았다. 또한, 비교예4의 경우 0 년 ~ 3년 가속화 시편에서 세포가 배양되었으나 실시예1에 따른 시편에 대비해 배양된 세포 수가 현저히 적었고, 이를 통해서 실시예1에 따른 세포배양기재의 저장안정성 및 세포배양성능이 매우 우수한 것을 알 수 있다.
이상에서 본 발명의 일 실시예에 대하여 설명하였으나, 본 발명의 사상은 본 명세서에 제시되는 실시 예에 제한되지 아니하며, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서, 구성요소의 부가, 변경, 삭제, 추가 등에 의해서 다른 실시 예를 용이하게 제안할 수 있을 것이나, 이 또한 본 발명의 사상범위 내에 든다고 할 것이다.

Claims (10)

  1. 비다공성 표면을 구비하는 기재; 및
    상기 비다공성 표면의 적어도 일부를 피복한 세포배양 코팅층;을 구비하며,
    상기 세포배양 코팅층은 기능성 펩타이드가 홍합 접착단백질에 결합된 세포배양용 융합단백질로 형성된 알갱이들이 집합된 것인 세포배양기재.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 기능성 펩타이드는 세포의 부착, 이동, 증식 및 분화 중 어느 하나 이상을 촉진시키는 기능을 갖는 것을 특징으로 하는 세포배양기재.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 기재는 폴리카보네이트, 폴리스티렌, 폴리이미드, 폴리에스테르, 폴리우레탄 및 유리로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 재질로 형성된 것을 특징으로 하는 세포배양기재.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 홍합 접착단백질은 서열번호 1 내지 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 단백질 또는 상기 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열이 연결된 단백질인 것을 특징으로 하는 세포배양기재.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 기능성 펩타이드는 RGD 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포배양기재.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 기능성 펩타이드는 서열번호 15 내지 서열번호 18의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 펩타이드 또는 상기 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열이 연결된 펩타이드인 것을 특징으로 하는 세포배양기재.
  7. (1) 카보디이미드계 커플링제 및 반응제를 포함하는 활성용액과 기능성 펩타이드가 홍합 접착단백질에 결합된 세포배양용 융합단백질을 준비하는 단계;
    (2) 준비된 활성용액과 세포배양용 융합단백질을 혼합하여 세포배양 코팅조성물을 제조하는 단계; 및
    (3) 세포배양 코팅조성물을 비다공성 기재 표면에 처리하여 세포배양 코팅층을 형성시키는 단계;를 포함하는 세포배양기재 제조방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 카보디이미드계 커플링제는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필 카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC) 또는 N,N'-디시클로헥실카보이미드(DCC)이며, 상기 반응제는 N-하이드록시설포석신이미드(Sulfo-NHS)인 것을 특징으로 하는 세포배양기재 제조방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 카보디이미드 커플링제와 반응제는 1: 0.1 ~ 10 중량비로 활성용액에 포함되며,
    상기 세포배양 코팅조성물은 세포배양용 융합단백질 100 중량부에 대해서 카보디이미드계 커플링제가 1 ~ 100 중량부로 혼합되는 것을 특징으로 하는 세포배양기재 제조방법.
  10. 비다공성 세포배양 기재 표면에 세포배양 코팅층을 형성하는 세포배양 코팅조성물로서, 기능성 펩타이드가 홍합 접착단백질에 결합된 세포배양용 융합단백질, 카보디이미드계 커플링제 및 반응제를 포함하는 것을 특징으로 하는 비다공성 세포배양 기재용 세포배양 코팅조성물.
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