WO2021085818A1 - 숙신화 콜라겐-피브리노겐 하이드로겔의 제조방법 - Google Patents

숙신화 콜라겐-피브리노겐 하이드로겔의 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
WO2021085818A1
WO2021085818A1 PCT/KR2020/011037 KR2020011037W WO2021085818A1 WO 2021085818 A1 WO2021085818 A1 WO 2021085818A1 KR 2020011037 W KR2020011037 W KR 2020011037W WO 2021085818 A1 WO2021085818 A1 WO 2021085818A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
collagen
fibrinogen
col
hydrogel
fbg
Prior art date
Application number
PCT/KR2020/011037
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
권일근
이재서
나하람
허동녕
문호진
Original Assignee
경희대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 경희대학교 산학협력단 filed Critical 경희대학교 산학협력단
Priority to US17/771,893 priority Critical patent/US20220396671A1/en
Publication of WO2021085818A1 publication Critical patent/WO2021085818A1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08H—DERIVATIVES OF NATURAL MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08H1/00—Macromolecular products derived from proteins
    • C08H1/06—Macromolecular products derived from proteins derived from horn, hoofs, hair, skin or leather
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08H—DERIVATIVES OF NATURAL MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08H1/00—Macromolecular products derived from proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J3/00—Processes of treating or compounding macromolecular substances
    • C08J3/02—Making solutions, dispersions, lattices or gels by other methods than by solution, emulsion or suspension polymerisation techniques
    • C08J3/03—Making solutions, dispersions, lattices or gels by other methods than by solution, emulsion or suspension polymerisation techniques in aqueous media
    • C08J3/075—Macromolecular gels
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L89/00—Compositions of proteins; Compositions of derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L89/00—Compositions of proteins; Compositions of derivatives thereof
    • C08L89/04—Products derived from waste materials, e.g. horn, hoof or hair
    • C08L89/06—Products derived from waste materials, e.g. horn, hoof or hair derived from leather or skin, e.g. gelatin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J2389/00—Characterised by the use of proteins; Derivatives thereof
    • C08J2389/04—Products derived from waste materials, e.g. horn, hoof or hair
    • C08J2389/06—Products derived from waste materials, e.g. horn, hoof or hair derived from leather or skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L2203/00—Applications
    • C08L2203/02—Applications for biomedical use

Definitions

  • the present technology relates to a method for preparing a succinated collagen-fibrinogen hydrogel, and to a succinated collagen-fibrinogen hydrogel prepared accordingly.
  • Collagen is a light protein that is mainly present in animal bones and skin, and is also distributed in cartilage, organ membranes, and hair, and is also a component of fish scales. It is also called collagen and exists as a fibrous solid. When viewed under an electron microscope, it has a complex horizontal pattern structure and does not dissolve in water, dilute acid, or dilute alkali, but becomes gelatin when boiled and dissolves. It has a triple helix structure in which three polypeptide chains are twisted, and is a protein with a particularly high content of hydroproline.
  • the amino acid sequence of collagen is'glycine-proline-X' or'glycine-amino acid-hydroxyproline', and the amino acids that are the main constituents are glycine, hydroxyproline, and proline.
  • it is not degraded by proteolytic enzymes such as trypsin, but is degraded by collagenase.
  • the method of separating collagen from tissue is to extract it with an organic solvent, treat it with acid and alkali, and then act on trypsin and hyaluronidase. Through this process, collagen, an insoluble substance, is obtained.
  • Collagen is a representative biodegradable polymer material and has been widely used as a scaffold in tissue engineering. Although collagen is insoluble, it has excellent stability as a biological component and has advantages such as difficulty in generating an immune response because of high homology between animals. For this reason, collagen has been actively used in the fields of food, medicine, and cosmetics. However, collagen does not dissolve well at pH 5 or higher, and precipitates and aggregates. In the past, collagen was mainly solubilized under weak acidic conditions, but when collagen was dissolved and solubilized in an acidic state, it was prepared as a hydrogel and used as a biological material, which may adversely affect cells.
  • Republic of Korea Patent Registration No. 10-0465015 removes non-collagen substances through enzyme treatment, reduces immunity, and then extracts and removes fatty impurities and insoluble collagen using an organic solvent.
  • Disclosed is a method of manufacturing.
  • an organic solvent as described above, there is a problem that collagen may be denatured, and the use of an organic solvent that is harmful to the human body may cause side effects when applying to a living body when a hydrogel is prepared using the separated collagen.
  • the purpose of the present technology is to prepare succinic collagen with improved hydrophilicity and improved biocompatibility by combining collagen with succinic acid through a simple process, and using this, a succinated collagen-fibrinogen hydrogel that can be used as a biological material. It is to provide a method of manufacturing.
  • Another object of the present technology is to provide a succinated collagen-fibrinogen hydrogel prepared according to the above method.
  • the present technology comprises the steps of dissolving collagen in a weak acid and stirring while adding 4-dimethylaminopyridine (DMAP); Adding succinic anhydride to the stirred product at room temperature and mixing; Reacting by adding NaOH while stirring the mixture to adjust the pH to 7 to 8; Dialysis of the reactant and freeze-drying the dialyzed solution to prepare succinic collagen; dissolving the succinic collagen in deionized water; Stirring while adding 1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide hydrochloride and N-hydroxysuccinimide dissolved in deionized water to the succinicated collagen dissolved in the deionized water; Stirring while adding fibrinogen dissolved in phosphate buffered saline; And dialysis of the agitated material, and freeze-drying the dialyzed solution to prepare a succinated collagen-fibrinogen complex.
  • DMAP 4-dimethylaminopyridine
  • Dissolving the collagen-fibrinogen complex in phosphate buffered saline Mixing a thrombin solution and a calcium chloride solution dissolved in a phosphate buffered saline solution to the solution; And it provides a method for producing a collagen-fibrinogen hydrogel comprising a; step of gelation by applying heat.
  • the present technology provides a method for producing a succinated collagen-fibrinogen hydrogel prepared according to the above method.
  • the manufacturing method of the succinated collagen-fibrinogen hydrogel according to the present technology prevents the coagulation of collagen with a simple process, and improves hydrophilicity, cell proliferation rate, cell affinity, and cell proliferation performance. Biomaterials can be manufactured.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a manufacturing process of succinated collagen-fibrinogen in which succinated collagen is prepared according to the present technology and fibrinogen is combined with succinicated collagen.
  • FIG. 2 is a photograph comparing the results of dissolving (Atelo) collagen and succinicated collagen (COL-SUC) according to the present technology in deionized water at a concentration of 2%, respectively.
  • FIG. 3 shows the results of a collagen plate coating test in order to evaluate the cell proliferation performance (biocompatibility) of COL-SUC prepared according to the present technology.
  • Figure 4 shows the results of measuring the chemical state of the surface of COL-SUC and COL-FBG according to the present technology using a Fourier transform infrared spectrometer (FT-IR, Thermo Scientic Nicolet 380 spectrometer, USA).
  • FT-IR Fourier transform infrared spectrometer
  • TGA thermal gravimetric analysis
  • FIG. 6 shows the results of the flowability experiment of the COL-FBG hydrogel according to the present technology.
  • FIG. 7 shows the biocompatibility evaluation test results of the COL-FBG hydrogel according to the present technology.
  • FIG. 8 shows the results of an evaluation test for alkaline phosphatase (ALP) activity of COL-FBG hydrogel according to the present technology.
  • ALP alkaline phosphatase
  • FIG. 10 shows the results of measuring ALP activity according to the mixing ratio of COL-FBG and bone grafts tested with 2% COL-FBG hydrogel.
  • the present technology comprises the steps of: (a) dissolving collagen in a weak acid and stirring while adding 4-dimethylaminopyridine (DMAP); (b) adding and mixing succinic anhydride to the stirred product at room temperature; (c) reacting by adding NaOH while stirring the mixture to adjust the pH to 7 to 8; (d) dialysis of the reactant and freeze-drying the dialyzed solution to prepare succinic collagen; (e) dissolving the succinated collagen in deionized water; (f) stirring while adding 1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide hydrochloride and N-hydroxysuccinimide dissolved in deionized water to the succinicated collagen dissolved in the deionized water.
  • DMAP 4-dimethylaminopyridine
  • the weak acid of the step (a) may be an acid having a pH of 3 to 6, preferably acetic acid.
  • the succinic anhydride is preferably added in an amount of 20 to 50 parts by weight based on 100 parts by weight of collagen, more preferably 25 to 45 parts by weight, even more preferably 30 to 40 parts by weight, considering the appropriateness of the reaction. It is preferable to add parts by weight.
  • step (d) it is preferable to use a dialysis tube of 3000 to 3500 Da in consideration of the size of the prepared collagen succinate.
  • step (h) it is preferable to use a dialysis tube of 10 to 20 kDa in consideration of the size of the succinated collagen-fibrinogen complex to be prepared.
  • the step (i) is preferably dissolved in phosphate buffered saline so that the concentration of the collagen-fibrinogen complex is 1 to 5%.
  • the present technology provides a succinated collagen-fibrinogen hydrogel prepared according to the above method.
  • the hydrogel manufactured according to the present technology has excellent cell evolution and thermal stability, and has excellent cell proliferation and bone differentiation performance when transplanted in vivo.
  • Type 1 Atelocollagen from Dalim Tissen was used as collagen.
  • SA Succinic anhydride,> 99%
  • DMAP 4-dimethylaminopyridine,> 98%)
  • fibrinogen from 50-70% human plasma protein thrombin from human plasma
  • EDC 1-Ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide hydrochloride
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • Deionized water was prepared using an ultra-pure water system (Puris-Ro800, Bio Lab Tech., Korea). Acetic acid was purchased from Junsei Chemical Co., Ltd., Japan. Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS, Dulbecco's phosphate-buffered saline, pH 7.4) was purchased from Gibco (USA). Human adipose tissue-derived MSC, human adipose tissue-derived MSC growth medium and supplements (10% FBS, 0.02% penicillin and streptomycin) were purchased from CEFO CO. (CEFOgroTM ADMSC).
  • 48-well cell culture plates and cell culture dishes (100 mm x 20 mm) were purchased from Corning Incorporated, USA.
  • EZ-Cytox (en-hanced cell viability assay kit) was purchased from Dogen (Korea). All reagents and solvents were used as such without further purification.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a manufacturing process of succinated collagen-fibrinogen in which succinated collagen is prepared according to the present technology and fibrinogen is combined with succinicated collagen.
  • Succinated collagen (COL-SUC) according to the present technology was synthesized through ring-opening polymerization in acidic conditions. Atherocollagen (500mg, 1 equivalent) was dissolved in 0.1M acetic acid at a concentration of 0.3% and stirred overnight. Subsequently, while adding 4-dimethylaminopyridine (DMAP, 583.7mg, 5.8mmol) as a catalyst, the reaction was carried out by vigorous magnetic stirring for 1 hour. After the reaction was completed, succinic anhydride (SA, 145.9mg, 1.45mmol) was added to the solution three times at room temperature for 1 hour. Thereafter, the mixture was stirred at room temperature and adjusted to pH 7 to 8 using 1N NaOH.
  • DMAP 4-dimethylaminopyridine
  • SA succinic anhydride
  • reaction mixture was a clear solution. After reacting the pH-adjusted solution overnight, the reaction mixture was dialyzed against deionized water (DW) for 3 days using a 3500Da dialysis tube. The dialyzed solution was freeze-dried and stored at -70°C.
  • DW deionized water
  • FIG. 2 is a photograph comparing the results of dissolving (Atelo) collagen and succinicated collagen (COL-SUC) according to the present technology in deionized water at a concentration of 2%, respectively. As shown in Fig. 2, it was found that the dissolution was not well performed in the case of atelocollagen (left), but the naked eye was observed that dissolution was well performed in the case of succinated collagen (COL-SUC) (right) according to the present technology. You can also check it.
  • Example 3 COL-SUC cell proliferation evaluation
  • Atellocollagen Comparative Example
  • COL-SUC Example
  • a 96-well plate was immersed in 100 ⁇ l collagen solution for 2 hours at room temperature. Thereafter, the 96-well plate was taken out of the collagen solution, washed three times with PBS, and air dried under the hood. As a control, a 96-well plate not coated with atelocollagen or COL-SUC was used.
  • hADSC Human adipose tissue-derived MSC cells
  • a 96-well tissue culture plate in which the human adipose tissue-derived MSC cells (hADSC) were cultured was measured for absorbance at 450 nm using a Benchmark Plus microplate spectrophotometer (Bio-Rad, BR170-6930). The results are shown in FIG. 3.
  • Fibrinogen conjugated succinated collagen complex (COL-FBG) according to the present technology was prepared.
  • COL-SUC (30 mg, 1 equivalent) prepared according to Example 2 was dissolved in 15 ml deionized water for 2 hours, and separately fibrinogen (FBG, 680 mg, 20 equivalent) was added to 20 ml phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4. ) For 10 minutes.
  • fibrinogen FBG, 680 mg, 20 equivalent
  • PBS phosphate buffered saline
  • EDC 1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide hydrochloride
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • Example 5 Evaluation of the properties of COL-SUC and COL-FBG
  • Figure 4 shows the results of measuring the chemical state of the surface of COL-SUC and COL-FBG according to the present technology using a Fourier transform infrared spectrometer (FT-IR, Thermo Scientic Nicolet 380 spectrometer, USA).
  • FT-IR Fourier transform infrared spectrometer
  • the process of synthesizing fibrinogen in COL-SUC is achieved by forming an amide group by meeting the carboxyl group of COL-SUC and the amine group of fibrinogen. As shown in FIG. 3, it can be confirmed that the synthesis was well performed through the peaks of amide I (1644cm -1 ) and amide II (1536cm -1 ).
  • thermogravimetric analysis TGA
  • TGA thermal gravimetric analysis
  • Various samples including COL-SUC prepared according to Example 2 and COL-FBG prepared according to Example 4, were placed in a platinum pan in a furnace in an amount of 2 to 6 mg. The sample was heated from 10° C. to 800° C. at a heating rate of 10° C./min under nitrogen flow.
  • a COL-FBG hydrogel was prepared using COL-FBG prepared according to Example 4.
  • COL-FBG was dissolved in PBS and prepared at 2% and 4% concentrations, respectively.
  • thrombin TRB
  • a crosslinking agent thrombin (TRB) was first dissolved in PBS while stirring at room temperature for 2 minutes at a concentration of 1000 IU/mL.
  • a calcium chloride solution having a concentration of 50 mM was also prepared. Thereafter, the thrombin solution and the calcium chloride solution were added in a ratio of 1:1 to prepare a crosslinking agent.
  • crosslinking agent solution was added to the previously prepared COL-FBG solution, mixed in a volume ratio of 98:2 (COL-FBG solution:crosslinker solution), and stirred until the mixture became homogeneous.
  • COL-FBG gelation was induced by increasing the temperature to 37° C. in the incubator until an independent gel was formed.
  • COL-FBG hydrogel was prepared by culturing in a 10 IU/mL thrombin solution.
  • Example 7 Evaluation of the properties of COL-FBG hydrogel
  • Example 6 The rheometer experiment of the COL-FBG hydrogel according to the present technology prepared in Example 6 was tested. 6 shows the results of the flowability experiment of the COL-FBG hydrogel according to the present technology.
  • both 2% and 4% have higher fluidity at 37°C. This is because collagen naturally gels at 37°C, and fibrinogen is converted to fibrin at 37°C, resulting in a sol-gel conversion.
  • the existing commercially available collagen gel or fibrin gel had a strength of about 100Pa, whereas the COL-FBG hydrogel of Example 6 had a strength of 400Pa at 2% and 850Pa at 4%. This is because the COL-FBG hydrogel gelled more firmly. Therefore, it can be seen that the COL-FBG hydrogel of Example 6 according to the present technology has a fluidity of more suitable strength for use in vivo.
  • the biocompatibility of the COL-FBG hydrogel according to the present technology prepared in Example 6 was evaluated.
  • Cells for biocompatibility evaluation were encapsulated in human adipose tissue-derived MSC cells (hADSC) at a density of 2 ⁇ 10 4 in a 96-well tissue culture plate.
  • hADSCs were grown in human adipose tissue derived MSC growth medium and supplements (10% FBS, 0.02% penicillin and streptomycin).
  • the hydrogel was washed with sterile PBS and the culture medium was changed every 2 days. After incubation for 1, 3 and 7 days at 37° C. in 5% CO 2 environment, 100 ⁇ l of CCK solution was added to each well, and the plate was incubated for 2 hours. Absorbance was measured using a Benchmark Plus micro plate spectrophotometer (Bio-Rad, BR170-6930). The results are shown in FIG. 7.
  • cytotoxicity was evaluated by setting the concentration of the hydrogel to 2% and 4%, and the cell proliferation rate was confirmed with a fluorescence microscope by staining with F-actin. As a result of cytotoxicity evaluation and microscopic observation, it was confirmed that the cell proliferation rate of 2% hydrogel was better. In the case of a relatively 4% hydrogel, it can be seen that the inside is too dense and the cells do not proliferate well. In general, there are few cases in which cells proliferate and extend inside the hydrogel, but the COL-FBG hydrogel according to the present technology prepared in Example 6 contains cell-friendly collagen and fibrin, so that such proliferation is possible. . In FIG. 7, the control was cultured in 2D on a plate.
  • ALP activity evaluation test of the COL-FBG hydrogel according to the present technology prepared in Example 6 was performed.
  • Human adipose tissue-derived MSC cells (hADSC) were encapsulated in a 48-well tissue culture plate at a density of 2 ⁇ 10 4 and cultured in a growth medium for 1 day, and then the medium was changed to an osteogenic medium. Cell cultures were collected on days 5, 10 and 15, respectively, and used as samples.
  • cultured hADSCs were washed with DPBS and lysed in 3X RIPA buffer for 1 hour at 4°C.
  • the dissolved hADSC was centrifuged at 10,000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was reacted with p-nitrophenol phosphate (pNPP: p-nitrophenolphosphate, Sigma Aldrich) for 30 minutes in an incubator at 37°C.
  • pNPP p-nitrophenol phosphate
  • the p-nitrophenol production was measured using an ELISA reader at a wavelength of 405 nm. The results are shown in FIG. 8.
  • the alkaline phosphatase activity was confirmed by staining the COL-FBG hydrogel. It can be seen that bone differentiation is well performed in 2% hydrogel than in 4% hydrogel in which the hydrogel is more dense.
  • NC is cultured using a growth medium in 2D on a plate
  • PC is cultured using a bone differentiation medium in 2D on a plate.
  • Example 6 In vivo availability evaluation test of the COL-FBG hydrogel according to the present technology prepared in Example 6 was performed. For testing, lyophilized 2% COL-FBG was dissolved in PBS at room temperature. Using a solution in which COL-FBG was dissolved, a bone graft was prepared in a ratio of COL-FBG: bone grafts of 2:1, 1:2, 1:8 and 1:16, respectively.
  • the crosslinked composite was cut to a diameter of 6 mm for further experimentation.
  • Cell culture and absorbance measurements were prepared and measured in the same manner as in the biocompatibility evaluation test of Example 7-2.
  • the experiment was carried out with a hydrogel concentration of 2.
  • cytotoxicity evaluation was performed, and the cell proliferation rate was confirmed with a fluorescence microscope by staining with F-actin. The results are shown in FIG. 9.
  • NC is cultured using a growth medium in 2D on a plate
  • PC is cultured using a bone differentiation medium in 2D on a plate.
  • a hydrogel having excellent hydrophilicity, cell proliferation rate, cell affinity, and cell proliferation performance can be manufactured, so the present technology can be used in the development of various biocompatible materials such as bone fillers and drug delivery systems.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 기술은 숙신화 콜라겐-피브리노겐 하이드로겔의 제조방법 및 이에 따라 제조된 숙신화 콜라겐-피브리노겐 하이드로겔에 관한 것으로, 본 기술에 따른 숙신화 콜라겐-피브리노겐 하이드로겔의 제조방법은 간단한 공정으로 콜라겐의 엉김현상을 방지하고, 친수성, 세포 증식률, 세포 친화성 및 세포 확산 성능이 향상되어 생체 내 이용적합성이 우수한 콜라겐 기반의 생체 소재를 제조할 수 있다.

Description

숙신화 콜라겐-피브리노겐 하이드로겔의 제조방법
본 기술은 숙신화 콜라겐-피브리노겐 하이드로겔의 제조방법 및 이에 따라 제조된 숙신화 콜라겐-피브리노겐 하이드로겔에 관한 것이다.
콜라겐은 동물의 뼈와 피부에 주로 존재하며 연골, 장기 막, 머리카락 등에도 분포되어 있는 경단백질로 물고기 비늘의 성분이기도 하다. 교원질이라고도 하며 섬유상 고체로 존재한다. 전자현미경으로 보면 복잡한 가로무늬 구조로 되어 있으며 물, 묽은 산, 묽은 알칼리에 녹지 않지만 끓이면 젤라틴이 되어 용해된다. 3 개의 폴리펩티드 사슬이 꼬여 있는 삼중나선형 구조로 특히 하이드로프롤린의 함량이 많은 단백질이다. 콜라겐의 아미노산 서열은 '글리신-프롤린-X'나 '글리신-아미노산-하이드록시프롤린'으로 주된 구성인 아미노산은 글리신, 하이드록시프롤린, 프롤린 등이다. 또한 트립신과 같은 단백질 분해효소에 의하여 분해되지 않고, 콜라게나아제에 의하여 분해된다. 조직으로부터 콜라겐을 분리하는 방법은 유기용매로 추출하여 산·알칼리 처리를 한 후 트립신·히알루로니다아제를 작용시키는 것이다. 이러한 과정을 통해 불용성 물질인 콜라겐을 얻는다.
콜라겐은 대표적인 생분해성 고분자 물질로 조직공학에서 지지체로써 널리 사용되어왔다. 콜라겐은 불용성이지만 생체 성분으로 안정성이 뛰어나고, 동물 간에 상동성이 높기 때문에 면역 반응을 일으키기 어려운 등의 이점을 갖는다. 이 때문에, 콜라겐은 식품, 의약품, 화장품 분야에서 활발하게 이용되어 왔다. 그러나 콜라겐은 pH 5 이상에서는 잘 용해되지 않고, 침전하여 응집된다. 기존에는 주로 약한 산성 조건에서 콜라겐을 가용화하였으나 산성 상태에서 콜라겐을 용해시켜 가용화한 것을 그대로 사용하여 하이드로겔로 제조하고 이를 생체 소재로 사용할 경우 세포에 악영향을 미칠 수 있다.
이와 관련하여 대한민국 등록특허 제10-0465015호는 효소처리를 통해 비콜라겐성 물질을 제거하고 면역성을 감소시킨 후 유기 용매를 이용해 지방성 불순물 및 불용성 콜라겐을 추출하여 제거함으로써 높은 순도의 제1형 콜라겐을 제조하는 방법에 대해 개시하고 있다. 그러나, 이와 같이 유기용매를 사용하는 경우에는 콜라겐의 변성이 있을 수 있고 인체에 유해한 유기용매의 사용은 분리된 콜라겐을 이용하여 하이드로겔을 제조할 경우 생체 적용 시 부작용을 일으킬 수 있다는 문제가 있다.
본 기술의 목적은, 간단한 공정을 통해 콜라겐에 숙신산을 결합시켜 친수성이 향상되고 생체 내 이용적합성이 향상된 숙신화 콜라겐을 제조하고, 이를 이용하여 생체 소재로 사용될 수 있는 숙신화 콜라겐-피브리노겐 하이드로겔을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 기술의 다른 목적은 상기 방법에 따라 제조된 숙신화 콜라겐-피브리노겐 하이드로겔을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 기술은 콜라겐을 약산에 용해하고, 4-디메틸아미노피리딘(DMAP)을 첨가하면서 교반하는 단계; 상기 교반물에 숙신산 무수물(Succinic anhydride)를 실온에서 첨가하여 혼합하는 단계; 상기 혼합물을 교반하면서 NaOH를 첨가하여 pH 7 내지 8로 조절하여 반응시키는 단계; 상기 반응물을 투석시키고, 투석된 용액을 동결 건조하여 숙신화 콜라겐을 제조하는 단계;상기 숙신화 콜라겐을 탈이온수에 용해시키는 단계; 상기 탈이온수에 용해된 숙신화 콜라겐에 탈이온수에 용해된 1-에틸-3-(3-디메틸 아미노프로필) 카르보디이미드 히드로클로라이드와 N-하이드록시석신이미드를 첨가하면서 교반하는 단계; 인산염 완충 식염수에 용해된 피브리노겐을 첨가하면서 교반하는 단계; 및 상기 교반물을 투석하고, 투석된 용액을 동결 건조하여 숙신화 콜라겐-피브리노겐 복합체를 제조하는 단계; 상기 콜라겐-피브리노겐 복합체를 인산염 완충 식염수에 용해시키는 단계; 상기 용해액에 인산염 완충 식염수에 용해된 트롬빈 용액 및 염화칼슘 용액을 혼합하는 단계; 및 열을 가하여 겔화시키는 단계;를 포함하는 콜라겐-피브리노겐 하이드로겔의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 기술은 상기 방법에 따라 제조된 숙신화 콜라겐-피브리노겐 하이드로겔의 제조방법을 제공한다.
본 기술에 따른 숙신화 콜라겐-피브리노겐 하이드로겔의 제조방법은 간단한 공정으로 콜라겐의 엉김현상을 방지하고, 친수성, 세포 증식률, 세포 친화성 및 세포 확산 성능이 향상되어 생체 내 이용적합성이 우수한 콜라겐 기반의 생체 소재를 제조할 수 있다.
도 1은 본 기술에 따라 숙신화 콜라겐을 제조하고 숙신화 콜라겐에 피브리노겐을 결합한 숙신화 콜라겐-피브리노겐의 제조 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 (아텔로)콜라겐 및 본 기술에 따른 숙신화 콜라겐(COL-SUC)을 탈이온수에 각각 2% 농도로 용해시킨 결과를 비교한 사진이다.
도 3은 본 기술에 따라 제조된 COL-SUC의 세포 증식 성능(생체 적합성)을 평가하기 위하여 콜라겐 플레이트 코팅 시험을 한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 푸리에 변환 적외선 분광계(FT-IR, Thermo Scientic Nicolet 380 spectrometer, USA))를 사용하여 본 기술에 따른 COL-SUC 및 COL-FBG의 표면의 화학상태를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 기술에 따른 COL-SUC 및 COL-FBG의 열 중량 분석(TGA) 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 기술에 따른 COL-FBG 하이드로겔의 유동성 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 기술에 따른 COL-FBG 하이드로겔의 생체 적합성을 평가시험 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 기술에 따른 COL-FBG 하이드로겔의 알칼리성 포스파타제(ALP) 활성을 평가시험 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 기술에 따른 COL-FBG 하이드로겔의 생체 내 이용가능성 평가시험 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 2%의 COL-FBG 하이드로겔로 실험한 COL-FBG와 골 이식편의 혼합비율에 따른 ALP 활성 측정결과를 나타낸 것이다.
하나의 양태로 본 기술은 (a) 콜라겐을 약산에 용해하고, 4-디메틸아미노피리딘(DMAP)을 첨가하면서 교반하는 단계; (b) 상기 교반물에 숙신산 무수물(Succinic anhydride)를 실온에서 첨가하여 혼합하는 단계; (c) 상기 혼합물을 교반하면서 NaOH를 첨가하여 pH 7 내지 8로 조절하여 반응시키는 단계; (d) 상기 반응물을 투석시키고, 투석된 용액을 동결 건조하여 숙신화 콜라겐을 제조하는 단계; (e) 상기 숙신화 콜라겐을 탈이온수에 용해시키는 단계; (f) 상기 탈이온수에 용해된 숙신화 콜라겐에 탈이온수에 용해된 1-에틸-3-(3-디메틸 아미노프로필) 카르보디이미드 히드로클로라이드와 N-하이드록시석신이미드를 첨가하면서 교반하는 단계; (g) 인산염 완충 식염수에 용해된 피브리노겐을 첨가하면서 교반하는 단계; 및 (h) 상기 교반물을 투석하고, 투석된 용액을 동결 건조하여 숙신화 콜라겐-피브리노겐 복합체를 제조하는 단계; (i) 상기 콜라겐-피브리노겐 복합체를 인산염 완충 식염수에 용해시키는 단계; (j) 상기 (i) 단계의 용해액에 인산염 완충 식염수에 용해된 트롬빈 용액 및 염화칼슘 용액을 혼합하는 단계; 및 (k) 열을 가하여 겔화시키는 단계;를 포함하는 숙신화 콜라겐-피브리노겐 하이드로겔의 제조방법을 제공한다.
상기 (a) 단계의 약산은 pH 3 내지 6의 산일 수 있으며, 바람직하게는 아세트산일 수 있다.
상기 (b) 단계에서 숙신산 무수물은 반응의 적정성을 고려하여 콜라겐 100 중량부에 대하여 20 내지 50 중량부를 첨가하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 25 내지 45 중량부, 보다 더 바람직하게는 30 내지 40 중량부를 첨가하는 것이 바람직하다.
상기 (d) 단계의 투석은 제조되는 숙신산 콜라겐의 크기를 고려하여 3000 내지 3500Da의 투석 튜브를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 (h) 단계의 투석은 제조되는 숙신화 콜라겐-피브리노겐 복합체의 크기를 고려하여 10 내지 20kDa의 투석 튜브를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 (i) 단계는 상기 콜라겐-피브리노겐 복합체의 농도가 1 내지 5%의 농도가 되도록 인산염 완충 식염수에 용해시키는 것이 바람직하다.
본 기술은 다른 하나의 양태로 상기 방법에 따라 제조된 숙신화 콜라겐-피브리노겐 하이드로겔을 제공한다. 본 기술에 따라 제조된 하이드로겔은 세포 진화성과 열적 안정성이 우수하며, 생체 내 이식 시, 세포 증식과 골 분화 성능이 뛰어나다.
이하, 도면을 참조하여 본 기술의 실시예의 구성 및 작용을 상세하게 설명한다.
실시예 1: 재료
콜라겐은 다림 티센사(Dalim Tissen, 한국)의 타입 1 아텔로콜라겐(Type 1 Atelocollagen)을 사용하였다. 숙신산 무수물(SA: Succinic anhydride, > 99%), 4-디메틸아미노피리딘(DMAP: 4-dimethylaminopyridine, > 98%), 인간 혈장 50-70% 단백질 유래 피브리노겐, 인간 혈장 유래 트롬빈, 1-에틸-3-(3-디메틸 아미노프로필) 카르보디이미드 히드로클로라이드(EDC: 1-Ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide hydrochloride) 및 N-하이드록시석신이미드(NHS: N-hydroxysuccinimide)는 시그마-알드리치사(Sigma-Aldrich, 미국)에서 구입한 것을 사용하였다. 탈이온수(DW: Deionized water)는 초-순수 시스템(Puris-Ro800, Bio Lab Tech., Korea)을 이용하여 제조하였다. 아세트산(Acetic acid)은 준세이사(Junsei Chemical Co., Ltd., 일본)에서 구입하였다. 둘베코 인산염 완충 식염수(DPBS, Dulbecco's phosphate-buffered saline, pH 7.4)는 깁코사(Gibco, 미국)로부터 구입하였다. 인간 지방 조직 유래 MSC, 인간 지방 조직 유래 MSC 성장 배지 및 보충제(10% FBS, 0.02% 페니실린 및 스트렙토마이신)는 CEFO CO.(CEFOgroTM ADMSC)로부터 구입하였다. 48-웰 세포 배양 플레이트 및 세포 배양 디쉬(100mm x 20mm)는 코닝 인코포레이티드사(Corning Incorporated, USA)로부터 구입하였다. EZ-Cytox(en-hanced cell viability assay kit)는 도겐사(Dogen, 한국)에서 구입하였다. 모든 시약 및 용매는 추가적인 정제 없이 그대로 사용하였다.
실시예 2: 숙신화 콜라겐(COL-SUC) 제조
도 1은 본 기술에 따라 숙신화 콜라겐을 제조하고 숙신화 콜라겐에 피브리노겐을 결합한 숙신화 콜라겐-피브리노겐의 제조 과정을 나타낸 모식도이다.
본 기술에 따른 숙신화 콜라겐(COL-SUC)은 산성조건에서 고리를 여는 중합반응(ring-opening polymerization)을 통하여 합성하였다. 아텔로콜라겐(500mg, 1당량)을 0.1M 아세트산에 0.3% 농도로 용해시키고 밤새 교반하였다. 이어서 촉매로 4-디메틸아미노피리딘(DMAP, 583.7mg, 5.8mmol)을 첨가하면서 1시간 동안 격렬하게 자기로 교반(magnetic stirring)하여 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 상기 용액에 숙신산 무수물(SA, 145.9mg, 1.45mmol)를 3번 실온에서 1시간 동안 첨가하였다. 이후, 상기의 혼합물을 실온에서 교반하면서 1N NaOH를 이용하여 pH 7 내지 8로 조정하였다. 이때 반응 혼합물은 투명한 용액이었다. pH가 조정된 용액을 밤새 반응시킨 후, 3500Da 투석 튜브를 사용하여 반응 혼합물을 탈이온수(DW)에 대해 3일 동안 투석시켰다. 투석된 용액을 동결 건조하여 -70℃에서 보관하였다.
도 2는 (아텔로)콜라겐 및 본 기술에 따른 숙신화 콜라겐(COL-SUC)을 탈이온수에 각각 2% 농도로 용해시킨 결과를 비교한 사진이다. 도 2에 도시된 바와 같이, 아텔로콜라겐(좌)의 경우 용해가 잘 이루어지지 않은 것으로 나타났으나, 본 기술에 따른 숙신화 콜라겐(COL-SUC)(우)의 경우 용해가 잘 이루어지는 것을 육안으로도 확인할 수 있다.
실시예 3: COL-SUC 세포 증식 평가
본 기술에 따라 제조된 상기 실시예 2의 COL-SUC의 세포 증식 성능(생체 적합성)을 평가하기 위하여 콜라겐 플레이트 코팅 시험을 하였다.
0.1% 아텔로콜라겐(atellocollagen)(비교예) 및 COL-SUC(실시예)를 0.1M 아세트산에 용해시키고, 이와 별개로 0.1% COL-SUC를 탈이온수에 용해시켰다. 콜라겐 코팅을 위해 96-웰 플레이트(96-well plate)에 100㎕ 콜라겐 용액에 2시간 동안 실온에서 침지시켰다. 이 후, 96-웰 플레이트를 콜라겐 용액에서 꺼내 PBS로 3회 세척하고 후드 아래에서 공기 건조시켰다. 대조군(Control)으로는 아텔로콜라겐이나 COL-SUC을 코팅하지 않은 96-웰 플레이트를 사용하였다.
인간 지방 조직 유래 MSC 세포(hADSC)를 상기에서 제조한 대조군, 비교예 및 실시예 각각의 96-웰 조직 배양 플레이트에 2x104의 밀도로 시딩(seeding)하였다. hADSC를 인간 지방 조직 유래 MSC 성장 배지 및 보충제(10% FBS, 0.02% 페니실린 및 스트렙토 마이신)에서 성장시켰다. 모든 실험은 멸균된 PBS로 세척하고 배양 배지를 2일마다 교체하였다. 각각의 플레이트를 5% CO2 환경, 37℃에서 1, 3 및 7일간으로 기간을 달리하여 각각 배양한 후, 100㎕의 CCK(Cell Counting Kit) 용액을 각각의 96-웰 조직 배양 플레이트에 첨가하고 2시간 동안 배양하였다.
상기 인간 지방 조직 유래 MSC 세포(hADSC)가 배양된 96-웰 조직 배양 플레이트를 벤치마크 플러스 마이크로 플레이트 분광 광도계(Bio-Rad, BR170-6930)를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 3에 도시하였다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 아텔로콜라겐(비교예)에 비하여 본 기술에 따른 COL-SUC(실시예)가 코팅된 플레이트에서 배양된 세포의 활성이 더 높게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 이는 배양 기간이 길수록 더 눈에 띄는 차이를 보였다. 현미경을 통한 이미지에서도 플레이트에 아무것도 처리하지 않은 그룹(control 그룹)과 아텔로콜라겐으로 코팅한 그룹(비교예)에 비하여 COL-SUC(실시예)에서 세포 증식이 더 활발하게 나타난 것을 확인할 수 있다.
실시예 4: 피브리노겐 접합 숙신화 콜라겐 복합체(COL-FBG) 제조
본 기술에 따른 피브리노겐 접합 숙신화 콜라겐 복합체(COL-FBG)를 제조하였다.
상기 실시예 2에 따라 제조한 COL-SUC(30mg, 1 당량)을 15ml 탈이온수에 2시간 동안 용해시키고, 이와 별개로 피브리노겐(FBG, 680mg, 20 당량)을 20ml 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.4)에 10분 동안 용해시켰다. 또한 상기 용액과는 별개로 1-에틸-3-(3-디메틸 아미노프로필) 카르보디이미드 히드로클로라이드(EDC, 0.0776mg, 5 당량) 및 N-하이드록시석신이미드(NHS, 0.1151mg, 10당량)를 1ml 탈이온수에 용해시켰다. EDC 및 NHS를 상기 COL-SUC 용액에 첨가하면서 15분 간 격렬하게 자기 교반하였다. 이 후, FBG 용액을 천천히 첨가한 후, 반응 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 교반이 완결되면 반투명 용액이 얻어지는데, 이 용액을 14kDa 투석 튜브를 사용하여 PBS에 대해 3일 동안 투석하였다. 투석된 용액은 투명한 용액이고, 이를 동결 건조하고 -70℃에서 보관하였다.
실시예 5: COL-SUC 및 COL-FBG의 특성 평가
5-1. 적외선 분광계 측정
상기 실시예 2에 따라 제조한 COL-SUC 및 실시예 4에 따라 제조한 COL-FBG의 적외선 분광 특성을 평가하였다. 도 4는 푸리에 변환 적외선 분광계(FT-IR, Thermo Scientic Nicolet 380 spectrometer, USA))를 사용하여 본 기술에 따른 COL-SUC 및 COL-FBG의 표면의 화학상태를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
COL-SUC에 피브리노겐을 합성하는 과정은 COL-SUC의 카복실 그룹과 피브리노겐의 아민 그룹이 만나 아마이드 그룹을 형성하여 이루어진다. 도 3에 나타난 바와 같이, 아마이드 Ⅰ(1644cm-1)과 아마이드 Ⅱ(1536cm-1)의 피크를 통하여 합성이 잘 이루어졌음을 확인할 수 있다.
5-2. 열 중량 분석
상기 실시예 2에 따라 제조한 COL-SUC 및 실시예 4에 따라 제조한 COL-FBG의 열 중량 분석(TGA: Thermogravimetric analysis)을 실시하였다.
도 5는 본 기술에 따른 COL-SUC 및 COL-FBG의 열 중량 분석(TGA) 결과를 나타낸 것이다. TGA는 TA Instruments 2960 SDT V3.0F를 사용하여 수행되었다. TGA는 복합체의 합성 여부, 열 안정성, 피브리노겐의 결합량을 확인하기 위한 것이다.
실시예 2에 따라 제조한 COL-SUC 및 실시예 4에 따라 제조한 COL-FBG을 포함하여 다양한 샘플들을 2~6mg의 양으로 반응로(furnace) 내의 백금 팬에 넣었다. 샘플을 질소 흐름 하에서 10℃/min의 가열 속도로 10℃에서부터 800℃까지 가열하였다.
도 5에 나타난 바와 같이, 본 기술에 따른 COL-SUC의 경우 순수한 콜라겐(COL)과 비교하여 열 안정성이 약 25℃ 증가한 것을 확인할 수 있었으며, 본 기술에 따른 COL-FBG의 경우 순수한 피브리노겐(FBG)과 비교하여 열 안정성이 약 10℃ 증가한 것을 확인할 수 있었다. 또한 COL-FBG에서 FBG가 결합한 양을 계산한 결과, COL-FBG에서 FBG가 88.8% 결합되어 있는 것을 확인할 수 있다(FBG 45% 대비 COL-FBG에 붙은 비율 40%).
실시예 6 - COL-FBG 하이드로겔 제조
실시예 4에 따라 제조된 COL-FBG를 이용하여 COL-FBG 하이드로겔을 제조하였다. COL-FBG는 PBS에 용해시켜 각각 2%와 4% 농도로 준비하였다. 이와 별개로 가교제를 제조하기 위해 먼저 트롬빈(TRB)을 1000IU/mL의 농도로 실온에서 2분 동안 교반하면서 PBS에 용해시켰다. 또 50mM 농도의 염화칼슘 용액도 준비하였다. 이 후 트롬빈 용액과 염화칼슘 용액이 1:1의 비율이 되도록첨가하여 가교제를제조하였다. 상기 가교제 용액을 미리 준비한 COL-FBG 용액에 첨가하여 98:2의 부피비(COL-FBG 용액:가교제 용액)로 혼합하여 혼합물이 균질해질 때까지 교반하였다. 독립된 겔이 형성될 때까지 인큐베이터에서 온도를 37℃로 증가시켜 COL-FBG 겔화를 유도하였다. 이어서 피브리노겐을 피브린으로 중합시키기 위하여 10IU/mL의 트롬빈 용액에서 배양 하여 COL-FBG 하이드로겔을 제조하였다.
실시예 7: COL-FBG 하이드로겔의 특성 평가
7-1. 유동성 실험
상기 실시예 6에서 제조된 본 기술에 따른 COL-FBG 하이드로겔의 유동성(rheometer experiment)을 실험하였다. 도 6은 본 기술에 따른 COL-FBG 하이드로겔의 유동성 실험 결과를 나타낸 것이다.
유동성 실험은 실온(25℃) 및 37℃의 진동 모드에서, 평행판이 있는 레오미터(rotating rheomet)(Anton Paar, Austria)를 사용하여 수행되었다. 디스크 형태로 제조된 COL-FBG 하이드로겔을 8mm 직경의 플레이트-플레이트 지오메트리(plate-plate geometry) 및 1mm 갭을 갖는 회전식 레오미터로 주파수-의존 점탄성 거동(frequency-dependent viscoelastic behavior)을 측정하였다. 각 샘플의 저장 탄성률(G’) 및 손실 탄성률(G”) 값은 다음 식 1을 이용하여 계산되었고, 주파수 스윕은 1%의 일정한 변형률에서 0.1~10Hz 범위에서 수행되었다.
[식 1]
Figure PCTKR2020011037-appb-I000001
도 6에 나타난 바와 같이, 2%와 4%의 경우 모두 37℃에서 좀 더 높은 유동성을 가지는 것을 확인할 수 있다. 이는 37℃에서 콜라겐이 자연적으로 겔화되며, 피브리노겐이 37℃를 기점으로 피브린으로 전환되어 졸-겔 전환이 되기 때문이다. 기존에 시판되고 있는 콜라겐젤이나 피브린 젤은 강도가 100Pa정도인데 반해, 실시예 6의 COL-FBG 하이드로겔은 2%에서는 400Pa, 4%에서는 강도가 850Pa정도로 나타났다. 이는 COL-FBG 하이드로겔이 더 단단하게 겔화되었기 때문이다. 따라서 본 기술에 따른 실시예 6의 COL-FBG 하이드로겔이 생체 내에서 이용되기에 더 적합한 강도의 유동성을 가지는 것을 알 수 있다.
7-2. 생체 적합성 평가
상기 실시예 6에서 제조된 본 기술에 따른 COL-FBG 하이드로겔의 생체 적합성을 평가시험을 수행하였다. 생체 적합성 평가를 위한 세포는 인간 지방 조직 유래 MSC 세포(hADSC)를 96-웰 조직 배양 플레이트에 2x104의 밀도로 캡슐화하였다. hADSC를인간 지방 조직 유래 MSC 성장 배지 및 보충제(10% FBS, 0.02% 페니실린 및 스트렙토 마이신)에서 성장시켰다. 모든 실험에서, 하이드로겔을 멸균된 PBS로 세척하고 배양 배지를 2일마다 교체하였다. 5% CO2 환경, 37℃에서 1, 3 및 7일간 배양한 후, 100㎕의 CCK 용액을 각 웰에 첨가하고 플레이트를 2시간 동안 인큐베이션 하였다. 흡광도는 벤치마크 플러스 마이크로 플레이트 분광 광도계(Bio-Rad, BR170-6930)를 사용하여 측정하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 도시된 바와 같이, 하이드로겔의 농도를 2%, 4%로 하여 세포 독성을 평가하고, F-actin으로 염색하여 세포의 증식률을 형광 현미경으로 확인하였다. 세포 독성 평가와 현미경 관찰결과, 2% 하이드로겔의 세포 증식률이 더 좋은 것으로 확인되었다. 상대적으로 4% 하이드로겔의 경우에는 내부가 너무 조밀하여 세포가 잘 증식하지 못하는 것을 확인할 수 있다. 일반적으로 하이드로겔 내부에서는 세포가 증식하여 뻗어 나가는 경우가 적으나, 실시예 6에서 제조된 본 기술에 따른 COL-FBG 하이드로겔은 세포에 친화적인 콜라겐과 피브린이 포함하고 있어 이와 같은 증식이 가능한 것이다. 도 7에서 대조군(control)은 플레이트(plate)에 2D로 배양한 것이다.
7-3. 알칼리성 포스파타제(ALP) 활성을 평가
상기 실시예 6에서 제조된 본 기술에 따른 COL-FBG 하이드로겔의 알칼리성 포스파타제(ALP: alkaline phosphatase) 활성 평가시험을 수행하였다. 인간 지방 조직 유래 MSC 세포(hADSC)를 48-웰 조직 배양 플레이트에 2x104의 밀도로 캡슐화하고, 성장 배지에 1일간 배양한 후 배지를 골 형성(osteogenic) 배지로 변경하였다. 세포 배양은 5, 10 및 15일 에 각각 채취하여 샘플로 사용하였다. ALP 활성 분석을 위해, 배양된 hADSC를 DPBS로 세척하고 4℃에서 1시간 동안 3X RIPA 완충액으로 용해시켰다. 용해된 hADSC를 10,000rpm에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 37℃ 인큐베이터에서 p-니트로페놀포스페이트(pNPP: p-nitrophenolphosphate, Sigma Aldrich)와 30분 동안 반응시켰다. p-니트로페놀 생산량은 405nm 파장에서 ELISA 판독기를 사용하여 측정되었다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 도시한 바와 같이, COL-FBG 하이드로겔을 염색하여 알칼리성 포스파타제 활성을 확인하였다. 하이드로겔 내부가 더 조밀한 4%의 하이드로겔보다 2%의 하이드로겔 내에서 골분화가 잘 이루어지는 것을 확인할 수 있다. 도 8에서 NC는 플레이트(plate)에 2D로 증식 배지를 이용하여 배양(culture)한 것이고, PC는 플레이트(plate)에 2D로 골분화 배지를 이용하여 배양(culture)한 것이다.
7-4. 생체 내 이용가능성 평가
상기 실시예 6에서 제조된 본 기술에 따른 COL-FBG 하이드로겔의 생체 내 이용가능성 평가시험을 수행하였다. 시험을 위해 동결 건조된 2%의 COL-FBG를 실온에서 PBS에 용해시켰다. COL-FBG가 용해된 용액을 이용하여 골 이식편(bone graft)을 COL-FBG : 골 이식편이 2:1, 1:2, 1:8 및 1:16의 비율이 되도록 각각 제조하였다.
혼합된 용액에 동일한 백분율의 트롬빈 용액을 첨가하고 1mm의 갭을 갖는 2개의 유리 슬라이드 사이에 부었다. 혼합 후 혼합물을 실시예 6에서의 COL-FBG 하이드로겔과 동일한 조건으로 가교시켰다.
가교된 복합체는 추가 실험을 위해 직경이 6mm가 되도록 절단하였다. 세포 배양과 흡광도 측정은 상기 실시예 7-2.의 생체 적합성 평가시험과 동일하게 준비하여 측정하였다. 하이드로겔 농도 2로 하여 실험을 수행하였다. 이어서, 세포 독성 평가를 수행하고, F-actin으로 염색하여 세포의 증식률을 형광 현미경으로 확인하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이, 2% 하이드로겔을 대조군으로 두고 비교하였을 때 하이드로겔 내에 COL-FBG의 비율이 더 높고 골 이식편이 가장 적게 들어간 그룹(2:1)에서 세포 생존률이 가장 높게 나타났고, 골 이식편이 많이 포함(1:16)될수록 생존률이 낮게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 이로부터 COL-FBG의 비율이 높을수록 제조되는 하이드로겔의 COL-FBG가 주변 환경에 더 친화적으로 작용하여 세포의 생존률을 높이는 것을 확인할 수 있다. 도 9에서 대조군(control)은 플레이트(plate)에 2D로 배양한 것이다.
도 10은 2%의 COL-FBG 하이드로겔로 실험한 COL-FBG와 골 이식편의 혼합비율에 따른 ALP 활성 측정결과를 나타낸 것이다. 도 10에 나타난 바와 같이, 골 이식편이 적게 포함될수록 골분화가 더 잘되는 것을 확인할 수 있다. 도 10에서 NC는 플레이트(plate)에 2D로 증식 배지를 이용하여 배양(culture)한 것이고, PC는 플레이트(plate)에 2D로 골분화 배지를 이용하여 배양(culture)한 것이다.
이상 실시예를 통해 본 기술을 설명하였으나, 본 기술은 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 실시예는 본 기술의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정되거나 변경될 수 있으며, 본 기술분야의 통상의 기술자는 이러한 수정과 변경도 본 기술에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.
본 기술에 따라 친수성, 세포 증식률, 세포 친화성 및 세포 확산 성능이 우수한 하이드로젤을 제조할 수 있으므로, 본 기술은 골 충진재, 약물 전달체 등 다양한 생체 적합성 소재의 개발에 활용될 수 있다.

Claims (7)

  1. (a) 콜라겐을 약산에 용해하고, 4-디메틸아미노피리딘(DMAP)을 첨가하면서 교반하는 단계;
    (b) 상기 교반물에 숙신산 무수물(Succinic anhydride)를 실온에서 첨가하여 혼합하는 단계;
    (c) 상기 혼합물을 교반하면서 NaOH를 첨가하여 pH 7 내지 8로 조절하여 반응시키는 단계;
    (d) 상기 반응물을 투석시키고, 투석된 용액을 동결 건조하여 숙신화 콜라겐을 제조하는 단계;
    (e) 상기 숙신화 콜라겐을 탈이온수에 용해시키는 단계;
    (f) 상기 탈이온수에 용해된 숙신화 콜라겐에 탈이온수에 용해된 1-에틸-3-(3-디메틸 아미노프로필) 카르보디이미드 히드로클로라이드와 N-하이드록시석신이미드를 첨가하면서 교반하는 단계;
    (g) 인산염 완충 식염수에 용해된 피브리노겐을 첨가하면서 교반하는 단계;
    (h) 상기 교반물을 투석하고, 투석된 용액을 동결 건조하여 숙신화 콜라겐-피브리노겐 복합체를 제조하는 단계;
    (i) 상기 콜라겐-피브리노겐 복합체를 인산염 완충 식염수에 용해시키는 단계;
    (j) 상기 (i) 단계의 용해액에 인산염 완충 식염수에 용해된 트롬빈 용액 및 염화칼슘 용액을 혼합하는 단계; 및
    (k) 열을 가하여 겔화시키는 단계;를 포함하는 숙신화 콜라겐-피브리노겐 하이드로겔의 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 약산은 아세트산인 것을 특징으로 하는 숙신화 콜라겐-피브리노겐 하이드로겔의 제조방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서 콜라겐 100 중량부에 대하여 숙신산 무수물 20 내지 50 중량부를 첨가하는 것을 특징으로 하는 숙신화 콜라겐-피브리노겐 하이드로겔의 제조방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 (d) 단계의 투석은 3000 내지 3500Da 의 투석 튜브를 사용하는 것을 특징으로 하는 숙신화 콜라겐-피브리노겐 하이드로겔의 제조방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 (h) 단계의 투석은 10 내지 20kDa의 투석 튜브를 사용하는 것을 특징으로 하는 숙신화 콜라겐-피브리노겐 하이드로겔의 제조방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 (i) 단계는 상기 콜라겐-피브리노겐 복합체의 농도가 1 내지 5%의 농도가 되도록 인산염 완충 식염수에 용해시키는 것을 특징으로 하는 숙신화 콜라겐-피브리노겐 하이드로겔의 제조방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따라 제조된 숙신화 콜라겐-피브리노겐 하이드로겔.
PCT/KR2020/011037 2019-10-31 2020-08-19 숙신화 콜라겐-피브리노겐 하이드로겔의 제조방법 WO2021085818A1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US17/771,893 US20220396671A1 (en) 2019-10-31 2020-08-19 Method for preparation of succinylated collagen-fibrinogen hydrogel

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2019-0138136 2019-10-31
KR1020190138136A KR102119693B1 (ko) 2019-10-31 2019-10-31 숙신화 콜라겐-피브리노겐 하이드로겔의 제조방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021085818A1 true WO2021085818A1 (ko) 2021-05-06

Family

ID=71089269

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2020/011037 WO2021085818A1 (ko) 2019-10-31 2020-08-19 숙신화 콜라겐-피브리노겐 하이드로겔의 제조방법

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20220396671A1 (ko)
KR (1) KR102119693B1 (ko)
WO (1) WO2021085818A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112107504A (zh) * 2020-09-24 2020-12-22 成都维德医疗器械有限责任公司 一种改性ⅰ型胶原蛋白凝胶的制备方法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102119693B1 (ko) * 2019-10-31 2020-06-05 경희대학교 산학협력단 숙신화 콜라겐-피브리노겐 하이드로겔의 제조방법
CN117777492B (zh) * 2023-11-14 2024-09-27 宁波大学 一种基于纤维蛋白原和卡拉胶的常温抗菌水凝胶的制备方法及应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007217699A (ja) * 1998-12-04 2007-08-30 Incept Llc 生体適合性架橋ポリマー
KR100828494B1 (ko) * 2007-12-06 2008-05-13 (주)다림티센 피부주름개선용 화장품 에센스 조성물 및 그의 조성방법
JP2010510212A (ja) * 2006-11-17 2010-04-02 アボット、カーディオバスキュラー、システムズ、インコーポレーテッド 変性二成分ゲル化系、使用方法および製造方法
KR101522462B1 (ko) * 2012-09-19 2015-05-21 아주대학교산학협력단 효소 고정화 지지체를 이용한 in situ 형성 하이드로젤의 제조방법 및 이의 생의학적 용도
US9884121B2 (en) * 2007-01-31 2018-02-06 Alumend, Llc Biomaterials and a method for making and using same
KR102119693B1 (ko) * 2019-10-31 2020-06-05 경희대학교 산학협력단 숙신화 콜라겐-피브리노겐 하이드로겔의 제조방법

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100465015B1 (ko) 2002-03-04 2005-01-13 이재관 유기용매를 이용한 가용성 콜라겐의 제조방법

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007217699A (ja) * 1998-12-04 2007-08-30 Incept Llc 生体適合性架橋ポリマー
JP2010510212A (ja) * 2006-11-17 2010-04-02 アボット、カーディオバスキュラー、システムズ、インコーポレーテッド 変性二成分ゲル化系、使用方法および製造方法
US9884121B2 (en) * 2007-01-31 2018-02-06 Alumend, Llc Biomaterials and a method for making and using same
KR100828494B1 (ko) * 2007-12-06 2008-05-13 (주)다림티센 피부주름개선용 화장품 에센스 조성물 및 그의 조성방법
KR101522462B1 (ko) * 2012-09-19 2015-05-21 아주대학교산학협력단 효소 고정화 지지체를 이용한 in situ 형성 하이드로젤의 제조방법 및 이의 생의학적 용도
KR102119693B1 (ko) * 2019-10-31 2020-06-05 경희대학교 산학협력단 숙신화 콜라겐-피브리노겐 하이드로겔의 제조방법

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112107504A (zh) * 2020-09-24 2020-12-22 成都维德医疗器械有限责任公司 一种改性ⅰ型胶原蛋白凝胶的制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
KR102119693B1 (ko) 2020-06-05
US20220396671A1 (en) 2022-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2021085818A1 (ko) 숙신화 콜라겐-피브리노겐 하이드로겔의 제조방법
Yue et al. Visible light crosslinkable human hair keratin hydrogels
US8105629B2 (en) Collagen gel and process of producing the same
US8206774B2 (en) Diazonium salt modification of silk polymer
Adali et al. The chondrocyte cell proliferation of a chitosan/silk fibroin/egg shell membrane hydrogels
WO2022025488A1 (ko) 젤라틴 및 합성고분자를 포함하는 하이드로젤 복합체 및 이의 제조방법
JP2009509594A (ja) シルクフィブロイン含有医療用人工神経移植体及びその調製方法
Patil et al. Silk fibroin-alginate based beads for human mesenchymal stem cell differentiation in 3D
WO2011132842A2 (ko) 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법 및 그 방법에 의해 제조된 골대체재
WO2012086988A9 (en) Artificial silk membrane having excellent flexibility and suturing ability and method of manufacturing the same
CN107916260B (zh) 一种基于水凝胶包裹单细胞的方法及产品和应用
Li et al. Magnetic liquid metal scaffold with dynamically tunable stiffness for bone tissue engineering
KR102282070B1 (ko) 폐 오가노이드 배양용 조성물의 제조 방법, 그 조성물 및 이를 이용한 오가노이드 배양 방법
He et al. Construction of a dual-component hydrogel matrix for 3D biomimetic skin based on photo-crosslinked chondroitin sulfate/collagen
WO2016036061A1 (ko) 온도감응성 생분해 하이드로겔
CN110713601A (zh) 基于生物正交反应的可快速固化水凝胶、其制法与应用
KR102145057B1 (ko) 숙신화 콜라겐 및 이를 이용한 숙신화 콜라겐-피브리노겐 복합체의 제조방법
WO2019216678A1 (ko) 버크홀데리아 유래 티로시나아제를 이용하여 제조된 접착력을 가지는 가교 결합 물질, 그의 제조 방법 및 그의 응용
CN115944778B (zh) 一种可注射骨修复凝胶及其制备方法和应用
CN109876194B (zh) 一种可调节降解速率的poss-peg杂化水凝胶及其制备方法和其应用
WO2013180417A1 (ko) 신규한 나노섬유막 및 이의 제조방법
CN111388758A (zh) 基于甲基丙烯酸化水凝胶/羟乙基纤维素/脱细胞基质的复合生物墨水及其制备方法
WO2015016400A1 (ko) 방선균 유래 티로시나아제를 이용하여 제조된 가교 결합 물질, 그의 제조 방법 및 그의 응용
WO2019078454A1 (ko) 의료용 임플란트 표면 개질용 조성물 및 그에 의해 표면 개질된 의료용 임플란트
Li et al. Osteoimmunity-regulating nanosilicate-reinforced hydrogels for enhancing osseointegration

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 20881320

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 20881320

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1