WO2021096270A1 - Ampk 억제기능과 아연항상성 조절기능에 기반한 다발성 경화증 치료용 약학적 조성물 - Google Patents
Ampk 억제기능과 아연항상성 조절기능에 기반한 다발성 경화증 치료용 약학적 조성물 Download PDFInfo
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Definitions
- the present invention relates to a pharmaceutical composition for the treatment of multiple sclerosis, and more particularly, to a pharmaceutical composition for the treatment of multiple sclerosis based on an AMPK inhibitory function and a zinc homeostasis control function.
- MS Multiple sclerosis
- the mechanism is involved.
- the treatment of multiple sclerosis has been mainly steroids and immunosuppressants. This is based on the fact that the main mechanism of multiple sclerosis is an autoimmune mechanism, and it is an attempt to control the disease by weakening the body's immune function.
- the above treatments have a distinct effect in the acute phase of the disease, they do not play a role in suppressing or reducing the recurrence of the disease in the long term.
- beta-globulin is injected through the spinal fluid or skin.
- the downside is that you have to keep receiving it.
- Korean Patent No. 1324647 discloses a composition for treating or preventing multiple neurosclerosis and a screening method thereof.
- LeuSH L-Leucinethiol
- the present invention provides a pharmaceutical composition for the treatment of multiple sclerosis based on an AMPK inhibitory function and a zinc homeostasis modulating function that effectively treats multiple sclerosis due to a neuroprotective effect without side effects. It aims to do.
- these problems are exemplary, and the scope of the present invention is not limited thereby.
- a pharmaceutical composition for the treatment of multiple sclerosis or encephalomyelitis containing a compound having the structure of the following formula 1 as an active ingredient:
- R 1 to R 5 are each independently hydrogen, a hydroxy group, a halogen, a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 7 carbon atoms, a substituted alkoxy group having 1 to 7 carbon atoms, or an unsubstituted alkoxy group, an amine group.
- a carboxyl group or R 2 and R 3 together form a -O-(CH 2 ) n -O- ring or a substituted or unsubstituted benzene ring (n is an integer of 1 to 3)
- R 6 is hydrogen or a methyl group
- R 7 is hydrogen or halogen, in the above formula Is a single bond or a double bond).
- a method for treating multiple sclerosis in a subject comprising administering to a subject suffering from multiple sclerosis a therapeutically effective amount of a compound having the structure of Formula 1 below:
- R 1 to R 5 are each independently hydrogen, a hydroxy group, a halogen, a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 7 carbon atoms, a substituted alkoxy group having 1 to 7 carbon atoms or an unsubstituted alkoxy group, amine A group, a carboxyl group, or R 2 and R 3 together form a -O-(CH 2 ) n -O- ring or a substituted or unsubstituted benzene ring (n is an integer of 1 to 3), and R 6 is a hydrogen or methyl group And R 7 is hydrogen or halogen, in the above formula Is a single bond or a double bond).
- a method for treating encephalomyelitis in a subject comprising administering to a subject suffering from encephalomyelitis a therapeutically effective amount of a compound having the structure of Formula 1 below:
- R 1 to R 5 are each independently hydrogen, a hydroxy group, a halogen, a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 7 carbon atoms, a substituted alkoxy group having 1 to 7 carbon atoms or an unsubstituted alkoxy group, amine A group, a carboxyl group, or R 2 and R 3 together form a -O-(CH 2 ) n -O- ring or a substituted or unsubstituted benzene ring (n is an integer of 1 to 3), and R 6 is a hydrogen or methyl group And R 7 is hydrogen or halogen, in the above formula Is a single bond or a double bond).
- R 1 to R 5 are each independently hydrogen, a hydroxy group, a halogen, a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 7 carbon atoms, a substituted alkoxy group having 1 to 7 carbon atoms or an unsubstituted alkoxy group, amine A group, a carboxyl group, or R 2 and R 3 together form a -O-(CH 2 ) n -O- ring or a substituted or unsubstituted benzene ring (n is an integer of 1 to 3), and R 6 is a hydrogen or methyl group And R 7 is hydrogen or halogen, in the above formula Is a single bond or a double bond).
- R 1 to R 5 are each independently hydrogen, a hydroxy group, a halogen, a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 7 carbon atoms, a substituted alkoxy group having 1 to 7 carbon atoms or an unsubstituted alkoxy group, amine A group, a carboxyl group, or R 2 and R 3 together form a -O-(CH 2 ) n -O- ring or a substituted or unsubstituted benzene ring (n is an integer of 1 to 3), and R 6 is a hydrogen or methyl group And R 7 is hydrogen or halogen, in the above formula Is a single bond or a double bond).
- the pharmaceutical composition for the treatment of multiple sclerosis based on the AMPK inhibitory function and zinc homeostasis control function of the present invention made as described above is treated with a novel compound having AMPK activity inhibitory function and zinc homeostasis control function to prevent spinal cord injury due to multiple sclerosis. It can be used to develop new treatments that can overcome behavioral disorders. Of course, the scope of the present invention is not limited by these effects.
- 1A is a diagram showing a timeline for an experimental design according to an embodiment of the present invention.
- 1H10 was administered intraperitoneally once a day, and mice were sacrificed 21 days after immunization.
- 1B is a graph analyzing EAE clinical scores for the vehicle administration group.
- 1C is a graph analyzing EAE clinical scores for the 1H10 administration group.
- FIG. 2A is a microscopic photograph observing representative microglia/macrophage activation in the spinal cord of sham-operated and MOG35-55 immunized mice (vehicle or 1H10). F4/80 (red), DAPI-stained nuclei (blue), and demyelinated regions were confirmed by reduced MBP staining (green). Scale bar, 50 ⁇ m.
- 2D is a representative image of Iba-1- (green) and CD68- (red) immune positive cells as images merged into vehicle- and 1H10-treated EAE mice. Nuclei stained with DAPI (blue). Scale bar, 50 ⁇ m.
- Figure 2g is a graph analyzing the colocalization scatterplots of Iba-1 with CD68.
- 3A is a micrograph showing a spinal cord section stained for cresyl violet to detect infiltration of SMS mononuclear cells. Scale bar, 100 ⁇ m.
- 3C is a micrograph showing the expression of T and B cells stained with antibodies to cell surface molecules such as CD4, CD8 and CD20.
- 3D is a graph analyzing the intensity of CD4, CD8 and CD20 immune responses in the thoracic spinal cord treated with or without 1H10 in sham-operated or EAE mice.
- 3E is a graph analyzing the percent area of CD4, CD8 and CD20 immune responses in the thoracic spinal cord treated with or without 1H10 in sham-operated or EAE mice.
- 3F is a representative immunofluorescence image showing CD8+ T cells co-labeled with phospho-AMPK ⁇ 1/2 in the spinal cord from vehicle- and 1H10-treated EAE mice.
- 3G is a graph showing the analysis of colocalization scatterplots of phospho-AMPK ⁇ 1/2 and CD8.
- 4A is a photomicrograph showing a portion of the spinal cord stained with TSQ to detect zinc accumulation. Scale bar, 100 ⁇ m.
- 4B is a micrograph showing a portion of the spinal cord stained for anti-mouse immunoglobulin G (IgG) to detect endogenous IgG. Scale bar, 100 ⁇ m.
- IgG immunoglobulin G
- 4E is a double-labeled confocal micrograph of CD31 + endothelial cells (red) and endogenous mouse IgG molecules (green) in the white matter of the spinal cord from vehicle- and 1H10-treated EAE mice. Scale bar, 20 ⁇ m.
- Figure 4f is an immunofluorescence image showing the expression of MMP-9 in the white matter of the spinal cord. Scale bar, 50 ⁇ m.
- Figure 5a is a graph showing the expression of the fluorescent substance FluoZin-3 as verified by the 1H10 treatment of the present invention to control the homeostasis of zinc.
- FIG. 5B is a graph showing the expression of free zinc fluorescently labeled drug (FluoZin-3) to verify the regulation of zinc homeostasis according to the 1H10 treatment of the present invention.
- 6A is a timeline showing the experimental design by analyzing the long-term protection effect of 1H10 after EAE induction. After 1H10 was administered intraperitoneally once a day for the entire period, mice were sacrificed 45 days after the initial immunization.
- 6B is a graph analyzing the long-term protective effect of 1H10 after induction of EAE, and analyzing the EAE clinical score for the vehicle.
- Figure 6c is a graph analyzing the long-term protective effect of 1H10 after EAE induction, and analyzing the EAE clinical score for the 1H10 administration group.
- FIG. 7 is a diagram of the results of research showing that loss of homeostasis of zinc may cause multiple sclerosis.
- MS multiple sclerosis
- 9 is a graph analyzing the neuroprotective effect of 25 similar compounds having a similar structure based on the structural similarity of 1H10 of the present invention.
- 10 is a graph analyzing the inhibitory effect of oxidative stress according to 25 novel compounds and 1H10 treatment.
- 11 is a graph analyzing the inhibitory effect of oxidative stress according to 8 novel compounds and 1H10 treatment.
- 12 is a graph analyzing the effect of inhibiting excitotoxicity according to 8 novel compounds and 1H10 treatment.
- 13 is a graph analyzing the effect of inhibiting apoptosis according to 8 novel compounds and 1H10 treatment.
- 14 is a graph showing the results of a zinc binding assay according to 25 novel compounds and 1H10 treatment.
- 15 is a graph analyzing AMPK ⁇ 2 inhibitory activity according to 25 novel compounds and 1H10 treatment.
- 16 is a graph showing the results of self-toxicity analysis according to 4 novel compounds and 1H10 treatment.
- FIG. 17 is an immunofluorescence photograph of GFAP (green) as an analysis of the activity of astrocytes in spinal cord tissue according to the 1H10 treatment of the present invention.
- GFAP green
- an abnormal increase astrogliosis
- MOG35-55 immunized mice vehicle or 1H10 was observed.
- Scale bar 50 ⁇
- FIG. 19 shows expression of IFN gamma and TNF alpha among cytokines in the spinal cord of the mouse on the 21st day after induction of EAE mice.
- IFN- ⁇ , green C, H
- TNF- ⁇ , red tumor necrosis factor alpha
- D I
- double label confocal micrographs AE
- Nuclei stained with DAPI blue
- B G
- Scale bar 20 ⁇
- AMP-activated protein kinase as used herein is a heterologous trimer protein composed of a catalytic ⁇ subunit ( ⁇ 1 or ⁇ 2), and two regulatory subunits ( ⁇ and ⁇ ). AMPK is phosphorylated and activated when the cellular energy level is low, and again regulates cellular metabolism to regulate gene expression over a long period of time to restore the level of ATP. It is known that an increase in the AMP/ATP ratio, a change in cellular pH and redox state, and an increase in the creatine/phosphocreatine ratio activate AMPK.
- Zinc used in this document is a substance abundantly present in the entire body, including the central nervous system, and plays a very important role in synaptic plasticity and learning of nerve cells. However, excessive zinc accumulation or severe deficiency is toxic to neurons. Intracellular accumulation of zinc is a major cause of nerve damage after acute neurological diseases such as stroke, epilepsy, traumatic brain injury, and hypoglycemia, and occurs in Alzheimer's disease, a chronic disease. It is well known that it causes the generation of plaques.
- a pharmaceutical composition for the treatment of multiple sclerosis or encephalomyelitis containing a compound having the structure of the following formula 1 as an active ingredient:
- R 1 to R 5 are each independently hydrogen, a hydroxy group, a halogen, a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 7 carbon atoms, a substituted alkoxy group having 1 to 7 carbon atoms, or an unsubstituted alkoxy group, an amine group.
- a carboxyl group or R 2 and R 3 together form a -O-(CH 2 ) n -O- ring or a substituted or unsubstituted benzene ring (n is an integer of 1 to 3)
- R 6 is hydrogen or a methyl group
- R 7 is hydrogen or halogen, in the above formula Is a single bond or a double bond).
- the unsubstituted alkyl group may be methyl, ethyl, propyl or butyl
- the substituted alkyl group is fluoromethyl, difluoromethyl, trifluoromethyl, chloromethyl, dichloromethyl, trichloromethyl, or It may be iodomethyl, diiodomethyl, or triraiodomethyl
- the halogen may be fluorine (F), chlorine (Cl), bromine (Br), or iodine (I).
- the compound is (5Z)-5-(1H-Indol-3-ylmethylene)-2-[2-(trifluoromethyl) phenyl]amino-1,3-thiazol-4(5H)-one,
- the compound may have an effect of preventing demyelination, a neuroprotective effect, reducing tissue damage, preventing apoptosis, or inhibiting inflammatory infiltration.
- a method for treating multiple sclerosis in a subject comprising administering to a subject suffering from multiple sclerosis a therapeutically effective amount of a compound having the structure of Formula 1 below:
- R 1 to R 5 are each independently hydrogen, a hydroxy group, a halogen, a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 7 carbon atoms, a substituted alkoxy group having 1 to 7 carbon atoms or an unsubstituted alkoxy group, amine A group, a carboxyl group, or R 2 and R 3 together form a -O-(CH 2 ) n -O- ring or a substituted or unsubstituted benzene ring (n is an integer of 1 to 3), and R 6 is a hydrogen or methyl group And R 7 is hydrogen or halogen, in the above formula Is a single bond or a double bond).
- a method for treating encephalomyelitis in a subject comprising administering to a subject suffering from encephalomyelitis a therapeutically effective amount of a compound having the structure of Formula 1 below:
- R 1 to R 5 are each independently hydrogen, a hydroxy group, a halogen, a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 7 carbon atoms, a substituted alkoxy group having 1 to 7 carbon atoms or an unsubstituted alkoxy group, amine A group, a carboxyl group, or R 2 and R 3 together form a -O-(CH 2 ) n -O- ring or a substituted or unsubstituted benzene ring (n is an integer of 1 to 3), and R 6 is a hydrogen or methyl group And R 7 is hydrogen or halogen, in the above formula Is a single bond or a double bond).
- R 1 to R 5 are each independently hydrogen, a hydroxy group, a halogen, a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 7 carbon atoms, a substituted alkoxy group having 1 to 7 carbon atoms or an unsubstituted alkoxy group, amine A group, a carboxyl group, or R 2 and R 3 together form a -O-(CH 2 ) n -O- ring or a substituted or unsubstituted benzene ring (n is an integer of 1 to 3), and R 6 is a hydrogen or methyl group And R 7 is hydrogen or halogen, in the above formula Is a single bond or a double bond).
- R 1 to R 5 are each independently hydrogen, a hydroxy group, a halogen, a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 7 carbon atoms, a substituted alkoxy group having 1 to 7 carbon atoms or an unsubstituted alkoxy group, amine A group, a carboxyl group, or R 2 and R 3 together form a -O-(CH 2 ) n -O- ring or a substituted or unsubstituted benzene ring (n is an integer of 1 to 3), and R 6 is a hydrogen or methyl group And R 7 is hydrogen or halogen, in the above formula Is a single bond or a double bond).
- the effective amount of the compound may vary depending on the type of the affected part of the patient, the application site, the number of treatments, the treatment time, the formulation, the condition of the patient, the type of adjuvant, and the like.
- the amount used is not particularly limited, but may be 0.01 ⁇ g/kg/day to 10 mg/kg/day.
- the daily dose may be administered once a day, divided into 2-3 times a day at appropriate intervals, or intermittently administered at intervals of several days.
- the compound may be contained in an amount of 0.1-100% by weight based on the total weight of the composition.
- the pharmaceutical composition of the present invention may further include suitable carriers, excipients, and diluents commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions.
- suitable carriers, excipients, and diluents commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions may be used in the preparation of pharmaceutical compositions.
- solid or liquid additives for preparation may be used in the preparation of pharmaceutical compositions.
- the additive for formulation may be either organic or inorganic.
- excipients include lactose, sucrose, sucrose, glucose, cornstarch, starch, talc, sorbit, crystalline cellulose, dextrin, kaolin, calcium carbonate, and silicon dioxide.
- a binder for example, polyvinyl alcohol, polyvinyl ether, ethyl cellulose, methyl cellulose, arabic rubber, tragacanth, gelatin, shellac, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, calcium citrate, And dextrin and pectin.
- the lubricant include magnesium stearate, talc, polyethylene glycol, silica, and hydrogenated vegetable oil. Any colorant that is permitted to be added to pharmaceuticals can be used. These tablets and granules can be appropriately coated with a sugar coat, gelatin coating, or other necessary. In addition, preservatives, antioxidants, etc. can be added as needed.
- the pharmaceutical composition of the present invention may be prepared in any formulation conventionally prepared in the art (for example, Remington's Pharmaceutical Science, the latest edition; Mack Publishing Company, Easton PA), and the form of the formulation is not particularly limited. . These formulations are described in Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042 (Chapter 87: Blaug, Seymour), a formula generally known for all pharmaceutical chemistry.
- the compound in the pharmaceutical composition of the present invention, can be administered orally or parenterally, preferably parenteral administration by intravenous injection, subcutaneous injection, intracerebroventricular injection, and intracerebrospinal fluid injection. , It can be administered by intramuscular injection and intraperitoneal injection.
- Zinc Transporter 3 which is located at the nerve endings and regulates the movement of zinc transporter 3 (ZnT3), which is located at the nerve endings, suppresses the symptoms of multiple sclerosis and tissue damage of the spinal cord white matter. As the results are released one after another, interest in zinc and multiple sclerosis is increasing.
- nerve cell damage processes such as zinc neurotoxicity and excitatory toxicity are accompanied by a decrease in ATP and an increase in AMP, and the AMPK activity, which is activated by AMP, is evident, and when the increased AMPK activity is lowered, nerve cell damage is reduced.
- AMPK activity which is activated by AMP
- AMPK activity is associated with damage and pathological involvement of the central nervous system in neurodegenerative diseases such as dementia, Parkinson's disease, Huntington's chorea, and multiple sclerosis. Accordingly, the present inventors have conducted a study on the neurotoxic mechanism centered on AMPK, which is the most important in metabolic regulation, and based on the preceding research, the present inventors conducted a study on the development of a new AMPK inhibitor to screen for a new compound, and the AMPK inhibitor ((Z)-5 -((1H-indol-3-yl)methylene)-2-((3-hydroxyphenyl)amino)thiazol- 4(5H)-one, named "1H10", formula 2) was discovered.
- the present invention has shown that the 1H10 can suppress the onset of disease at various levels after induction of autoimmune encephalomyelitis (EAE), which is an animal model of multiple sclerosis. Specifically, 1H10 treatment showed excellent symptom relief effect in the behavioral experiment and the incidence rate was also suppressed. In addition, it was confirmed that demyelination and immune cell activity of the spinal cord were reduced, and immune cells were prevented from invading into the demyelinating site. This suggests that the 1H10 drug is related to the mechanism of inhibition of AMPK activity.
- EAE autoimmune encephalomyelitis
- the pharmaceutical composition for the treatment of multiple sclerosis based on the AMPK inhibitory function and zinc homeostasis control function of the present invention can overcome spinal cord damage and behavioral disorders caused by multiple sclerosis by treating a novel compound with AMPK activity inhibitory function and zinc homeostasis control function. It provides a new therapeutic agent that can be used.
- the novel drug can act as a zinc chelator in the process of nerve cell damage. In particular, in the case of 1H10, it can act as a zinc ionophore as well as chelation, so it can be developed as an active zinc homeostasis modulator.
- the experimental animal used in the present invention is an 8-week-old C57BL/6 female mouse supplied from Daehan Biolink. These mice were raised in an environment where temperature and humidity were controlled, and food and water were supplied freely.
- the mouse cortical neurons used in the present invention were extracted and cultured from the brain of a mouse embryo, and Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Gibco, Grand Island, NY) to which 5% fetal bovine serum (FBS) and 5% horse serum (HS) were added. , US) was incubated at 95% humidity, 5% CO 2 and 37°C temperature conditions. For activation and differentiation of the cells, the cells were proliferated at a density of 2 x 10 4 cells in a 24-well tissue culture plate and cultured in MEM medium without FBS and HS before treatment with zinc and compounds.
- DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
- FBS fetal bovine serum
- HS horse serum
- the present inventors induce an autoimmune encephalomyelitis (EAE), an animal model of multiple sclerosis, by subcutaneous injection of Myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55 (MOG35-55) peptide antigen into C57BL/6 female mice (Fig. 1a).
- EAE autoimmune encephalomyelitis
- MOG35-55 Myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55
- CFA Complete freund's adjuvant
- mice were injected with the same amount of CFA containing MOG35-55 and Mycobacterium tuberculosis H37Ra in both sides.
- Pertussis toxin (4 ⁇ g/ml, List Biological Laboratories, USA) was injected intraperitoneally on the day of immunization and on the second day after immunization. After the immunization, the weight and clinical symptoms of the mice were measured every day, and the degree of progression of EAE was evaluated based on specific clinical symptoms. Details on this are described below.
- EAE clinical symptom evaluation used in the present invention was evaluated based on previous studies (Jones et al., J Neuroimmunol . Aug 13;199(1-2):83-93. 2008). Specifically, for the evaluation of clinical symptoms of EAE, the motion of the mice was evaluated daily according to the following criteria.
- score 0 no symptoms; score 0.5, partial paralysis of the tail or slight abnormal gait; score 1.0, complete or partial tail palsy and mild hindlimb palsy; score 1.5, complete tail palsy and mild hindlimb palsy; score 2.0, tail palsy and moderate hind limb weakness (proven that feet often fall out while walking in a cage); score 2.5, no weight in hind legs, but slight movement; score 3.0, complete hind limb paralysis; score 3.5, paralysis of the hind limbs and mild weakness in the forelimbs; score 4.0, limbs are completely paralyzed, but the head is moving; score 4.5, moribund state; score 5.0, death.
- the present inventors anesthetized mice with urethane on the 21st day after EAE induction, and then perfused with 4% paraformaldehyde to the heart to fix the spinal cord, and after extracting the spinal cord, mononuclear cells from the spinal cord The infiltrate was observed through cresyl violet staining.
- the spinal cord was cut to a thickness of 30 um in a cryostat, and the slices were obtained, and then placed on a gelatin-coated slide and dried at room temperature for 30 minutes. It was immersed in 100% and 70% ethanol solutions for 3 minutes each, followed by staining in 0.1% cresyl violet solution for 15 minutes.
- the present inventors On the 21st day after EAE induction, the present inventors anesthetized the mouse with urethane, and then perfused with 4% paraformaldehyde to the heart to fix the spinal cord, and after extracting the spinal cord, the infiltration of immune cells in the spinal cord was observed. To this end, immunohistochemistry was performed using CD4 and CD8 used as markers for T cells, and CD20 antibodies used as markers for B cells. The frozen sections were reacted with 3% hydrogen peroxide for 15 minutes at room temperature to remove endogenous peroxidase, and then the primary antibodies rat anti-CD4 (1:50, BD Bioscience, CA, USA), CD8 (1:50).
- IgG Immunoglobulin G
- the IgG is the most abundant immunoglobulin in plasma, and it is easy to identify it, so the presence of IgG in the spinal cord is used to monitor damage to the blood-brain barrier and extravasation of proteins (Ruth and Feinerman, Acta Neuropathol. 76(4): 380-7.1988).
- the frozen sections were reacted with biotinylated horse anti-mouse IgG (1:250, Vector Laboratories, USA) at room temperature for 2 hours and then reacted with ABC regent in the same manner as above, and then colored with DAB solution.
- the present inventors anesthetized mice with urethane on the 21st day after EAE induction, and then perfused with 4% paraformaldehyde to the heart to fix the spinal cord.After the spinal cord was excised, the tissue demyelination and microglia Immunofluorescence staining was performed with myelin basic protein (MBP) and F4/80 (Microglia/Macrophage) antibodies to test the activity of cells/macrophages.
- MBP myelin basic protein
- F4/80 Microglia/Macrophage
- Iba-1 Ionized calcium binding adapter molecule-1
- CD68 which are used as markers for microglia/macrophages, are used as markers for microglia/macrophages to analyze the phenotype of strongly active microglia/macrophages in the white matter part of the damaged spinal cord.
- Cluster of Differentiation 68 Biimmunofluorescence staining was performed using an antibody.
- AMPK AMP-activated protein kinase
- Matrix metallopeptidase 9 In order to compare and analyze the activity of (MMP-9), immunofluorescence staining was performed using an MMP-9 antibody. To test the activity of astrocytes in the spinal cord, immunofluorescence staining was performed using an antibody of glial fibrillary acidic protein (GFAP), and the expression of cytokines such as tumor necrosis factor (TNF) alpha and interferon (IFN) gamma were compared and analyzed. For this, double immunofluorescence staining was performed using TNF-alpha and IFN gamma antibodies.
- GFAP glial fibrillary acidic protein
- TNF tumor necrosis factor
- IFN interferon
- the frozen sections were reacted with 3% hydrogen peroxide for 15 minutes at room temperature to remove endogenous peroxidase, and then the primary antibody, rat anti-MBP (1:200, Abcam, UK).
- the present inventors examined the spinal cord tissue after the evaluation of clinical symptoms of EAE-induced mice was completed by the histochemical method of N-(6 methoxy 8 quinolyl) para toluenesulfonamide (TSQ), which is a zinc staining method.
- TSQ N-(6 methoxy 8 quinolyl) para toluenesulfonamide
- zinc is present at the end of the nerve axons in gray matter, and only very small amounts are observed in the white matter.
- the mice were anesthetized with 5% isoflurane, and the spinal cord was removed without perfusion and rapidly cooled with dry ice. The unfixed frozen tissue was cut to a thickness of 20 ⁇ m in a -15°C cryostat to obtain a section.
- TSQ fluorescence was observed using an Olympus IX70 fluorescence microscope with a wavelength of 360 nm/490 nm and evaluated using an INFINITY3-1 CCD cooled digital color camera (Lumenera Co., Canada) and INFINITY analysis software.
- FluoZin-3 a substance that shows fluorescence when bound to free zinc, was treated on neurons of cultured mice, exposed to zinc (300 ⁇ M) for 15 minutes, and then the zinc was removed. The zinc concentration in nerve cells was measured for 60 minutes.
- the present inventors observed the demyelination of spinal cord tissue and the activity of microglia/macrophages through immunofluorescence staining.
- the white matter of the spinal cord to be stained in green color
- the green staining was lowered in the tissues of EAE mice, and the red color indicating the activity of microglia/macrophages appeared strongly (FIG. 2A).
- the decrease in MBP means that myelin covering the axon of the nerve is damaged (FIG. 2B).
- the EAE-induced demyelination and microglia/macrophage activity were significantly reduced in the spinal cord of animals to which 1H10 was continuously administered (FIG. 2C).
- the present inventors observed the activity of astrocytes in spinal cord tissue through immunofluorescence staining. As a result, it was confirmed that the green color indicating the activity of astrocytes was strongly distributed in the spinal cord white matter (white matte) of the experimental group in which EAE was induced, whereas the activity of astrocytes was significantly suppressed in the experimental group administered with 1H10 (Fig. 17 and 18).
- the present inventors observed the invasion of monocytes in the spinal cord of the mouse on the 21st day after induction of EAE mice by cresyl violet staining.
- AMPK activity is known to enhance the survival of T cells.
- phosphorylation of AMPK in CD8(+) T cells infiltrated into the spinal cord after EAE induction was increased, but was observed to be significantly decreased in the experimental group to which 1H10 was administered (FIGS. 3f to 3h).
- the above results suggest that inhibition of AMPK by 1H10 of the present invention can alleviate symptoms of EAE by reducing the survival of autoreactive T cells infiltrated into the spinal cord.
- the present inventors observed expression of IFN gamma and TNF alpha among cytokines in the spinal cord of the mouse on the 21st day after induction of EAE mice through immunofluorescence staining. As a result, it was observed that the expression of IFN gamma in the spinal cord white matter was increased in the experimental group to which 1H10 was administered after EAE induction, whereas the expression of TNF alpha was decreased (FIGS. 19 and 20).
- the present inventors observed abnormal accumulation of zinc in the EAE-induced spinal cord white matter, damage to the blood brain barrier (BBB), and the activity of MMP-9 by the administration of 1H10.
- mice administered with vehicle or mice administered with only 1H10 mice administered with only 1H10 (Sham group)
- IgG staining due to BBB damage was not found in white matter or gray matter.
- mice 3 weeks after injection of MOG IgG infiltration was significantly increased in both white matter and gray matter, and this phenomenon was found to be significantly reduced by the administration of 1H10 (FIGS. 4c to 4e).
- the present inventors administered 1H10 intraperitoneally once a day for the entire period after induction of mouse EAE, and then sacrificed the mouse 45 days after the initial immunization to observe clinical symptoms and incidence (FIG. 6A), and 1H10 was administered. It was observed that the clinical symptoms and incidence rate significantly decreased in the experimental group (FIGS. 6b to 6d). This proves that the administration of 1H10 is effective in relieving the symptoms of EAE for a long time in the acute phase (21 days) as well as the chronic phase (45 days).
- 1H10 of the present invention based on the structural similarity of 1H10 of the present invention, 25 similar compounds having similar structures were purchased from a compound library manufacturer (InterBioScreen, Russia; Akos, Germany). Thereafter, ZnCl 2 (400 ⁇ M) was treated for 10 minutes to induce zinc toxicity in the cerebral cortical neurons of the cultured mice, and after 12.5 hours, the selected 25 compounds and the previously selected drug 1H10 were used. Treatment (20 ⁇ M) was performed and the inhibition of cell death was observed through cell viability assay (Cell Counting Kit-8, Dojindo).
- the present inventors observed the effects of inhibiting oxidative stress in addition to zinc toxicity for the eight drugs and 1H10 of the above examples. Specifically, oxidative damage induced neurotoxicity by treating the cortical neurons of mice with H 2 O 2 (100 ⁇ M) and FeCl 2 (100 ⁇ M) for about 4 hours and 20 hours, respectively, and the selected 8 drugs and 1H10 was treated (20 ⁇ M). After that, cytotoxicity was observed through LDH (Lactate Dehydrogenase) analysis.
- LDH Lacate Dehydrogenase
- the present inventors observed the effect of inhibiting excitotoxicity on the 8 drugs of the above example and 1H10. Specifically, excitotoxicity was induced by treatment with NMDA (N-methyl-D-aspartate, 50 ⁇ M) on the cortical neurons of mice for 3 hours, and treatment with the selected 8 drugs and 1H10 (20 ⁇ M) and LDH cells As a result of observing toxicity, 6 drugs (4B01, 4B08, 4C01, 4C03, 4C04, 4C08) except for 4B04 and 4C06 were found to significantly inhibit excitatory toxicity by NMDA (FIG. 12).
- the present inventors observed the effect of inhibiting apoptosis on the 8 drugs of the above example and 1H10. Specifically, neurotoxicity caused by apoptosis was induced by treatment with Etoposide (ETPS, 10 ⁇ M) on cortical neurons of mice for 20 hours. Thereafter, the selected 8 drugs and 1H10 were treated (20 ⁇ M) and LDH cytotoxicity was observed. As a result, 5 drugs (4B01, 4B08, 4C01, 4C06, 4C08) except 4B04, 4C03, 4C04 showed ETPS toxicity. It was found to significantly inhibit (Figure 13).
- Etoposide Etoposide
- the present inventors measured the recombinant AMPK ⁇ 2 enzyme activity by treatment with 1H10 and 25 compounds (10 ⁇ M each) and the previously well-known AMPK inhibitor compound C (CC, 10 ⁇ M) through KinaseProfilerTM Service (Eurofins, UK). As a result, 4A06, 4B02, 4C04, 4C05, 4C06, 4C08, 4D01 showed similar AMPK inhibitory effects to 1H10 (FIG. 15).
- the present inventors determined the self-toxicity of 4 drugs (4B01, 4B08, 4C01, 4C08) that showed a protective effect in common against all cytotoxicity (zinc toxicity, oxidative damage, excitotoxicity, apoptosis) with 1H10. Compared. Specifically, in the cerebral cortical neuron culture of mice, each 40 ⁇ M of the drug was treated and LDH cytotoxicity was observed after 24 or 48 hours.
- the compounds according to an embodiment of the present invention have protective effects on various toxic mechanisms such as excitotoxicity, oxidative stress, apoptosis, and zinc neurotoxicity related to conventional multiple sclerosis.
- MMP-9 activity was reduced through zinc chelation to prevent the permeation and accumulation of immune cells in the white matter of the spinal cord, thereby reducing the autoimmune response, thereby suppressing the occurrence of multiple sclerosis disease. Therefore, 1H10 of the present invention can be used in the development of drugs capable of replacing steroids and immunosuppressants having serious side effects due to long-term administration and controlling fundamental problems.
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Abstract
본 발명은 부작용 없는 우수한 신경보호 효과로 인해 다발성 경화증을 효과적으로 치료하는 AMPK 억제기능과 아연항상성 조절기능에 기반한 다발성 경화증 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
Description
본 발명은 다발성 경화증 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 더 상세하게는 AMPK 억제기능과 아연항상성 조절기능에 기반한 다발성 경화증 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
다발성 경화증(multiple sclerosis, MS)은 인체 내 면역계의 제어 이상과 신경세포의 축삭(Axon)을 감싸고 있는 미엘린 수초(Myelin sheath)의 파괴로 발생하는 중추 신경계의 자가 면역 염증성 질환으로 다양한 형태의 신경독성기전이 관련되어 있다. 이러한 다발성 경화증의 치료는 기존에 주로 스테로이드와 면역억제제가 사용되어 왔는데 이는 다발성 경화증의 주요 기전이 자가면역 기전이라는 사실에 근거한 것으로서 신체의 면역 기능을 약화시킴으로써 병을 조절하려는 시도이다. 그러나 최근까지의 연구에 의하면 상기 치료들이 비록 질환의 급성기에는 뚜렷한 효과를 가지고 있으나 장기적으로는 병의 재발을 억제하거나 감소시키는 역할을 하지 못하는 것으로 나타났다. 따라서 효과가 인정된 것은 급성기에 대량의 스테로이드 제제나 면역억제제 등을 일정 간격으로 수일에 걸쳐 주입하는 방법이다. 최근에는 재발을 방지함으로써 만성적인 퇴행을 경감시키기 위해 베타글로블린 (beta-globulin)을 척수액이나 피부를 통해 주입하는 치료가 많이 시도되고 있는데 현재까지는 큰 부작용 없이 효과가 있는 것으로 인정되고 있으나 상기 치료는 지속적으로 계속 받아야만 한다는 단점이 있다.
한편, 체내 과도한 아연(Zinc)의 축적 혹은 심각한 결핍은 신경세포에 독성을 나타내며, 아연의 항상성 소실은 다발성 경화증의 원인이 될 수 있다고 보고되었다. 최근 다양한 연구팀들이 다발성 경화증에서 아연 항상성에 관한 연구를 진행하고 있고 이에 따라 다양한 결과물들을 발표되고 있으나 현재까지 대부분이 아연 항상성 소실에 대한 현상 변화에 대한 결과일 뿐 그와 관련된 정확한 기전 연구는 미비한 실정이다. 또한 그 측정법과 샘플의 다양성 등으로 인해 다발성 경화증에서 아연에 관한 연구는 좀 더 면밀히 진행될 필요가 있다. 이와 관련하여 대한민국 등록특허 제1324647호는 다발성신경경화증의 치료 또는 예방용 조성물 및 이의 스크리닝 방법에 대해 개시하고 있다.
그러나 상기 선행기술의 경우, LeuSH(L-Leucinethiol)를 이용하여 NADPH 산화효소 및/또는 MMP의 활성을 억제하는 것으로 AMPK 억제기능 및 아연의 신경독성 제어에 기반한 다발성 경화증 치료용 물질에 관한 기술은 아직 미개척 분야이다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 부작용 없는 신경보호 효과로 인해 다발성 경화증을 효과적으로 치료하는 AMPK 억제기능과 아연항상성 조절기능에 기반한 다발성 경화증 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물을 유효성분으로 함유하는, 다발성 경화증 또는 뇌척수염 치료용 약학적 조성물이 제공된다:
(화학식 1)
(상기 식에서 R1 내지 R5는 각각 독립적으로 수소, 히드록시기, 할로겐, 탄소수 1 내지 7의 치환된 알킬기 또는 치환되지 않은 알킬기, 탄소수 1 내지 7의 치환된 알콕시기 또는 치환되지 않은 알콕시기, 아민기, 카르복실기이거나 R2 및 R3는 함께 -O-(CH2)n-O- 고리 또는 치환 또는 비치환된 벤젠고리를 형성하며(n은 1 내지 3의 정수), R6는 수소 또는 메틸기이고, R7은 수소 또는 할로겐이고, 상기 화학식에서 
는 단일결합 또는 이중결합이다).
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물을 다발성 경화증에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 다발성 경화증 치료방법이 제공된다:
(화학식 1)
(상기 식에서 R1 내지 R5는 각각 독립적으로 수소, 히드록시기, 할로겐, 탄소수 1 내지 7의 치환된 알킬기 또는 치환되지 않은 알킬기, 탄소수 1 내지 7의 치환되된 알콕시기 또는 치환되지 않은 알콕시기, 아민기, 카르복실기이거나 R2 및 R3는 함께 -O-(CH2)n-O- 고리 또는 치환 또는 비치환된 벤젠고리를 형성하며(n은 1 내지 3의 정수), R6는 수소 또는 메틸기이고, R7은 수소 또는 할로겐이고, 상기 화학식에서 
는 단일결합 또는 이중결합이다).
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물을 뇌척수염에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 뇌척수염 치료방법이 제공된다:
(화학식 1)
(상기 식에서 R1 내지 R5는 각각 독립적으로 수소, 히드록시기, 할로겐, 탄소수 1 내지 7의 치환된 알킬기 또는 치환되지 않은 알킬기, 탄소수 1 내지 7의 치환되된 알콕시기 또는 치환되지 않은 알콕시기, 아민기, 카르복실기이거나 R2 및 R3는 함께 -O-(CH2)n-O- 고리 또는 치환 또는 비치환된 벤젠고리를 형성하며(n은 1 내지 3의 정수), R6는 수소 또는 메틸기이고, R7은 수소 또는 할로겐이고, 상기 화학식에서 
는 단일결합 또는 이중결합이다).
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 다발성 경화증 치료에 사용되는 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물이 제공된다:
(화학식 1)
(상기 식에서 R1 내지 R5는 각각 독립적으로 수소, 히드록시기, 할로겐, 탄소수 1 내지 7의 치환된 알킬기 또는 치환되지 않은 알킬기, 탄소수 1 내지 7의 치환되된 알콕시기 또는 치환되지 않은 알콕시기, 아민기, 카르복실기이거나 R2 및 R3는 함께 -O-(CH2)n-O- 고리 또는 치환 또는 비치환된 벤젠고리를 형성하며(n은 1 내지 3의 정수), R6는 수소 또는 메틸기이고, R7은 수소 또는 할로겐이고, 상기 화학식에서 
는 단일결합 또는 이중결합이다).
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 뇌 척수염 치료에 사용되는 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물이 제공된다:
(화학식 1)
(상기 식에서 R1 내지 R5는 각각 독립적으로 수소, 히드록시기, 할로겐, 탄소수 1 내지 7의 치환된 알킬기 또는 치환되지 않은 알킬기, 탄소수 1 내지 7의 치환되된 알콕시기 또는 치환되지 않은 알콕시기, 아민기, 카르복실기이거나 R2 및 R3는 함께 -O-(CH2)n-O- 고리 또는 치환 또는 비치환된 벤젠고리를 형성하며(n은 1 내지 3의 정수), R6는 수소 또는 메틸기이고, R7은 수소 또는 할로겐이고, 상기 화학식에서 
는 단일결합 또는 이중결합이다).
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 AMPK 억제기능과 아연항상성 조절기능에 기반한 다발성 경화증 치료용 약학적 조성물은 AMPK 활성 억제기능과 아연 항상성 조절기능을 가진 신규화합물로 이를 처리하여 다발성 경화증으로 인한 척수 손상과 행동장애를 극복할 수 있는 새로운 치료제 개발에 활용할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른 실험설계에 대한 타임라인을 나타내는 그림이다. 전체 실험 과정에 대해 1H10을 1일 1회 복강 내 투여 하였고 면역화 후 21일에 마우스를 희생시켰다.
도 1b는 비히클 투여군에 대한 EAE 임상 점수를 분석한 그래프이다.
도 1c는 1H10 투여군 대한 EAE 임상 점수를 분석한 그래프이다.
도 1d는 비히클 또는 1H10- 처리된 면역화 마우스의 백분율 질환 발생률을 분석한 그래프이다. 데이터는 평균 ± SEM이다(실험군 당 n = 7-8). * p <0.05.
도 2a는 거짓 수술(sham-operated) 및 MOG35-55 면역화 마우스(비히클 또는 1H10)의 척수에서의 대표적인 미세아교세포/대식세포 활성화를 관찰한 현미경 사진이다. F4/80(적색), DAPI로 염색된 핵(청색), 탈수초화 영역은 감소된 MBP 염색으로 확인하였다(녹색). 스케일 바, 50 μm.
도 2b는 동일한 척수(spinal cord) 영역(평균 ± SEM; 그룹당 n = 3-5)에서 측정된 MBP 면역 반응성 퍼센트 영역을 분석한 그래프이다.
도 2c는 동일한 척수 영역(평균 ± SEM; 그룹당 n = 3-5)에서 측정된 미세아교세포/대식세포 활성화 등급을 분석한 그래프이다.
도 2d는 비히클-및 1H10-처리된 EAE 마우스에 병합된 이미지로서의 Iba-1-(녹색) 및 CD68-(적색) 면역 양성 세포의 대표적인 이미지이다. DAPI (청색)로 염색 된 핵. 스케일 바, 50 μm.
도 2e는 동일한 척수 영역에서 결정된 Iba-1의 면역 형광 강도의 정량화(평균 ± SEM; 그룹당 n = 3-5)를 분석한 그래프이다. * p <0.05.
도 2f는 동일한 척수 영역에서 결정된 CD68(F)의 면역 형광 강도의 정량화를 분석한 그래프이다(평균 ± SEM; 그룹당 n = 3-5). * p <0.05.
도 2g는 CD68으로 Iba-1의 공동 국소 산점도(Colocalization scatterplots)를 분석한 그래프이다.
도 2h는 Mander 's 겹침 계수 및 Pearson의 상관 계수(평균 ± SEM; 그룹당 n = 4)를 측정하여 CD68을 사용한 Iba-1의 정량적 공동 국소화 파라미터를 분석한 그래프이다. * p <0.05.
도 3a는 SMS 단핵세포의 침윤을 검출하기 위해 크레실 바이올렛(cresyl violet)에 대해 염색된 척수 섹션을 나타내는 현미경 사진이다. 스케일 바, 100 μm.
도 3b는 초기 면역화 후 3주에 비히클 또는 1H10으로 처리된 마우스에서 척수로부터 침윤된 단핵세포의 정량화를 분석한 그래프이다(평균 ± SEM; 그룹당 n = 5). * p <0.05.
도 3c는 CD4, CD8 및 CD20과 같은 세포 표면 분자에 대한 항체로 염색된 T 및 B 세포의 발현을 나타내는 현미경 사진이다.
도 3d는 거짓-수술(sham-operated) 또는 EAE 마우스에서 1H10 처리 또는 무처리된 흉부 척수에서 CD4, CD8 및 CD20 면역반응의 강도를 분석한 그래프이다.
도 3e는 거짓-수술(sham-operated) 또는 EAE 마우스에서 1H10 처리 또는 무처리된 흉부 척수에서 CD4, CD8 및 CD20 면역 반응의 퍼센트 면적를 분석한 그래프이다.
도 3f는 비히클-및 1H10- 처리된 EAE 마우스로부터 척수에서 phospho-AMPKα 1/2와 공동-표지된 CD8+ T 세포를 나타내는 대표적인 면역형광 이미지이다.
도 3g는 phospho-AMPKα 1/2와 CD8의 공동 국소 산점도(Colocalization scatterplots)를 분석한 그래프이다.
도 3h는 Mander의 중첩 계수 및 Pearson의 상관 계수(평균 ± SEM; 그룹당 n = 4)를 측정함으로써 phospho-AMPKα 1/2를 갖는 CD8의 정량적 공동 국소화 파라미터를 분석한 그래프이다. * p <0.05.
도 4a는 아연 축적을 탐지하기 위해 TSQ로 염색된 척수 부분을 나타내는 현미경 사진이다. 스케일 바, 100 μm.
도 4b는 내인성 IgG를 검출하기 위해 항-마우스 면역 글로불린 G(IgG)에 대해 염색된 척수 부분을 나타내는 현미경 사진이다. 스케일 바, 100 μm.
도 4c는 초기 면역화 후 3주에 비히클 또는 1H10으로 처리된 마우스에서 척수로부터 IgG 누출의 강도를 분석한 그래프이다(평균 ± SEM; 그룹당 n = 3-5). * p <0.05.
도 4d는 초기 면역화 후 3주에 비히클 또는 1H10으로 처리된 마우스에서 척수로부터 IgG 누출의 퍼센트 면적을 분석한 그래프이다(평균 ± SEM; 그룹당 n = 3-5). * p <0.05.
도 4e는 비히클-및 1H10- 처리된 EAE 마우스로부터 척수의 백질에서 CD31 + 내피세포(적색) 및 내인성 마우스 IgG 분자(녹색)의 이중 표지 공 초점 현미경 사진이다. 스케일 바, 20 μm.
도 4f는 척수의 백질에서 MMP-9의 발현을 나타내는 면역형광 이미지이다. 스케일 바, 50 μm.
도 4g는 거짓 수술(sham-operated) 및 EAE 마우스에서 1H10 처리 또는 무처리된 흉부 척수에서의 MMP-9 면역 반응성 퍼센트 면적을 나타내는 그래프이다(평균 ± SEM; 그룹당 n = 3-5). * p <0.05.
도 5a는 본 발명의 1H10 처리에 따른 아연의 항상성 조절을 검증한 것으로 형광물질인 FluoZin-3의 발현을 분석한 그래프이다.
도 5b는 본 발명의 1H10 처리에 따른 아연의 항상성 조절을 검증한 것으로 자유 아연 형광 표지 약물(FluoZin-3)의 발현을 분석한 그래프이다.
도 6a는 EAE 유도 후 1H10의 장기 보호 효과를 분석한 것으로, 실험 설계를 나타내는 타임 라인이다. 1H10을 전체 기간 동안 1일 1회 복강 내 투여한 후, 최초 면역화 후 45일에 마우스를 희생시켰다.
도 6b는 EAE 유도 후 1H10의 장기 보호 효과를 분석한 것으로, 비히클 대한 EAE 임상 점수를 분석한 그래프이다.
도 6c는 EAE 유도 후 1H10의 장기 보호 효과를 분석한 것으로, 1H10 투여군 대한 EAE 임상 점수를 분석한 그래프이다.
도 6d는 EAE 유도 후 1H10의 장기 보호 효과를 분석한 것으로, 비히클 또는 1H10- 처리된 면역화된 마우스의 백분율 질환 발생률을 분석한 그래프이다. 데이터는 평균 ± SEM(그룹당 n = 6-8). * p <0.05.
도 7은 아연의 항상성 소실은 다발성 경화증의 원인이 될 수 있음을 나타내는 연구결과에 대한 그림이다.
도 8은 다발성 경화증(MS) 병인과 아연의 가능한 연관성을 개략적으로 나타내고 있는 그림이다.
도 9는 본 발명의 1H10의 구조 유사성을 기반으로 하여 이와 유사한 구조를 가지는 25개 유사 화합물의 신경 보호 효과를 분석한 그래프이다.
도 10은 25개의 신규 화합물 및 1H10 처리에 따른 산화성 손상(oxidative stress) 억제효과를 분석한 그래프이다.
도 11는 8개의 신규 화합물 및 1H10 처리에 따른 산화성 손상(oxidative stress) 억제 효과를 분석한 그래프이다.
도 12는 8개의 신규 화합물 및 1H10 처리에 따른 흥분독성(excitotoxicity) 억제 효과를 분석한 그래프이다.
도 13은 8개의 신규 화합물 및 1H10 처리에 따른 아폽토시스(apoptosis) 억제 효과를 분석한 그래프이다.
도 14는 25개의 신규 화합물 및 1H10 처리에 따른 아연 결합 분석(Zinc binding assay) 결과를 나타내는 그래프이다.
도 15는 25개의 신규 화합물 및 1H10 처리에 따른 AMPKα2 억제 활성을 분석한 그래프이다.
도 16은 4개의 신규 화합물 및 1H10 처리에 따른 자체 독성 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 17은 본 발명의 1H10 처리에 따른 척수 조직의 성상교세포의 활성을 분석한 것으로 GFAP(녹색)에 대한 면역형광 사진이다. 21일째에 거짓-수술군(sham-operated) 및 MOG35-55 면역화된 마우스(비히클 또는 1H10)의 척수의 대표적인 성상교세포의 비정상적인 증가(astrogliosis)를 관찰하였다. 스케일 바, 50 μ
도 18은 본 발명의 1H10 처리에 따른 척수 조직의 성상교세포의 활성을 분석한 것으로 동일한 척수 영역에서 결정된 GFAP의 면역 형광 강도의 정량화한 그래프이다(평균 ±SEM; 그룹당 n = 4). * p <0.05 대 비히클 처리된 EAE 마우스; #p <0.05 vs. 거짓-수술 마우스(Kruskal-Wallis 테스트에 이어 Bonferroni post-hoc 테스트 : Chi square = 11.514, df = 3, p = 0.009)
도 19는 EAE 마우스 유도 후 21일째 되는 날에 상기 마우스의 척수에서 사이토카인 중 IFN gamma와 TNF alpha의 발현을 면역 형광염색을 통해 관찰한 것으로 (AJ) 비히클에서 척수의 백질에서 인터페론 감마(IFN-γ, 녹색) (C, H) 및 종양 괴사인자 알파(TNF-α, 빨간색) (D, I)의 이중 라벨 공초점 현미경 사진(AE) 및 1H10 처리된 EAE 마우스(FJ). DAPI(파란색)(B, G)로 염색된 핵. 스케일 바, 20 μ
도 20은 EAE 마우스 유도 후 21일째 되는 날에 상기 마우스의 척수에서 사이토카인 중 IFN gamma와 TNF alpha의 발현을 면역 형광염색을 통해 관찰한 것으로 동일한 척수 영역에서 결정된 IFN-γ 및 TNF-α의 면역 형광 강도의 정량화한 그래프이다(평균 ±SEM; 그룹당 n = 3-4). * p <0.05 대 비히클 처리된 EAE 마우스 (페어링 되지 않은 Student 's t-test).
용어의 정의:
본 문서에서 사용되는 "AMPK(AMP-activated protein kinase)"는 촉매 α 서브유닛(α1 또는 α2), 및 2개의 조절 서브유닛(β 및 γ)으로 구성된 이형삼량체 단백질(heterologous trimer protein)이다. AMPK는 세포 에너지 수준이 낮을 때 인산화되고 활성화되며 다시 세포 대사 작용을 조절하여 유전자 발현을 장기간에 걸쳐 조절하여 ATP의 수준을 회복한다. AMP/ATP 비의 증가, 세포 pH 및 산화 환원 상태의 변화 및 크레아틴/포스포크레아틴 비의 증가가 AMPK를 활성화시키는 것으로 공지되어 있다.
본 문서에서 사용되는 "아연(Zinc)"은 중추신경계를 포함하여 몸 전체에 풍부하게 존재하는 물질로 신경세포의 시냅스 가소성이나 학습에 매우 중요한 역할을 담당한다. 그러나 과도한 아연의 축적 혹은 심각한 결핍은 신경세포에 독성을 나타낸다. 아연의 세포내 축적이 급성 신경질환인 뇌졸중(stroke), 뇌전증(epilepsy), 외상성 뇌손상(traumatic brain injury), 저혈당증(hypoglycemia) 후에 발생하는 신경 손상을 일으키는 주요인이고 만성 질환인 알츠하이머병에서 발생하는 plaque의 생성을 일으킨다는 것은 이미 잘 알려져 있다.
발명의 상세한 설명:
본 발명의 일 관점에 따르면, 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물을 유효성분으로 함유하는, 다발성 경화증 또는 뇌척수염 치료용 약학적 조성물이 제공된다:
(화학식 1)
(상기 식에서 R1 내지 R5는 각각 독립적으로 수소, 히드록시기, 할로겐, 탄소수 1 내지 7의 치환된 알킬기 또는 치환되지 않은 알킬기, 탄소수 1 내지 7의 치환된 알콕시기 또는 치환되지 않은 알콕시기, 아민기, 카르복실기이거나 R2 및 R3는 함께 -O-(CH2)n-O- 고리 또는 치환 또는 비치환된 벤젠고리를 형성하며(n은 1 내지 3의 정수), R6는 수소 또는 메틸기이고, R7은 수소 또는 할로겐이고, 상기 화학식에서 
는 단일결합 또는 이중결합이다).
상기 조성물에 있어서, 상기 치환되지 않은 알킬기는 메틸, 에틸, 프로필 또는 부틸일 수 있고 상기 치환된 알킬기는 플루오로메틸, 디플루오로메틸, 트리플루오로메틸기, 클로로메틸, 디클로로메틸, 트리클로로메틸 또는 아이오도메틸, 디아이오도메틸, 또는 트리라아이오도메틸일 수 있으며 상기 할로겐은 불소(F), 염소(Cl), 브롬(Br) 또는 요오드(I)일 수 있다.
상기 조성물에 있어서, 상기 화합물은 (5Z)-5-(1H-Indol-3-ylmethylene)-2-[2-(trifluoromethyl) phenyl]amino-1,3-thiazol-4(5H)-one,
(5Z)-5-(1H-Indol-3-ylmethylene)-2-[3-(trifluoromethyl)phenyl]amino-1,3-thiazol-4(5H)-one,
(5Z)-2-[(3-Bromophenyl)amino]-5-(1H-indol-3-ylmethylene)-1,3-thiazol-4(5H)-one,
(5Z)-5-(1H-Indol-3-ylmethylene)-2-[(4-methylphenyl)amino]-1,3-thiazol-4(5H)-one,
(5Z)-5-(1H-Indol-3-ylmethylene)-2-[(3-methylphenyl)amino]-1,3-thiazol-4(5H)-one,
(5Z)-2-Anilino-5-(1H-indol-3-ylmethylene)-1,3-thiazol-4(5H)-one,
(5Z)-2-[(2,4-Dimethylphenyl)amino]-5-(1H-indol-3-ylmethylene)-1,3-thiazol-4(5H)-one,
(5Z)-2-[(2-Chlorophenyl)amino]-5-(1H-indol-3-ylmethylene)-1,3-thiazol-4(5H)-one,
(5Z)-2-[(3,4-Dimethylphenyl)amino]-5-(1H-indol-3-ylmethylene)-1,3-thiazol-4(5H)-one,
(5Z)-2-[(4-Hydroxyphenyl)amino]-5-(1H-indol-3-ylmethylene)-1,3-thiazol-4(5H)-one,
(5Z)-5-(1H-Indol-3-ylmethylene)-2-[(2-methylphenyl)amino]-1,3-thiazol-4(5H)-one,
(5Z)-2-[(2,3-Dimethylphenyl)amino]-5-(1H-indol-3-ylmethylene)-1,3-thiazol-4(5H)-one,
(5E)-5-(1H-Indol-3-ylmethylene)-2-(1-naphthylamino)-1,3-thiazol-4(5H)-one,
(5Z)-2-[(3-Chlorophenyl)amino]-5-(1H-indol-3-ylmethylene)-1,3-thiazol-4(5H)-one,
(5E)-2-Anilino-5-[(5-bromo-1H-indol-3-yl)methylene]-1,3-thiazol-4(5H)-one,
(5E)-2-[(4-Butylphenyl)amino]-5-(1H-indol-3-ylmethylene)-1,3-thiazol-4(5H)-one,
(5Z)-2-[(4-Butylphenyl)amino]-5-(1H-indol-3-ylmethylene)-1,3-thiazol-4(5H)-one,
(5Z)-5-(1H-Indol-3-ylmethylene)-2-[(3-methoxyphenyl)amino]-1,3-thiazol-4(5H)-one,
(5Z)-5-[(2-Methyl-1H-indol-3-yl)methylene]-2-[(4-methylphenyl)amino]-1,3-thiazol-4(5H)-one,
(5E)-5-[(2-Methyl-1H-indol-3-yl)methylene]-2-[(4-methylphenyl)amino]-1,3-thiazol-4(5H)-one,
3-[(5Z)-5-(1H-Indol-3-ylmethylene)-4-oxo-4,5-dihydro-1,3-thiazol-2-yl]aminobenzoic acid,
2-[(5E)-5-(1H-Indol-3-ylmethylene)-4-oxo-4,5-dihydro-1,3-thiazol-2-yl]aminobenzoic acid,
(5Z)-2-[(2-Chlorophenyl)amino]-5-[(2-methyl-1H-indol-3-yl)methylene]-1,3-thiazol-4(5H)-one,
2-Hydroxy-5-[(5Z)-5-(1H-indol-3-ylmethylene)-4-oxo-4,5-dihydro-1,3-thiazol-2-yl]aminobenzoic acid,
(2E,5E)-5-((5-bromo-1H-indol-3-yl)methylene)-2-(phenylimino)thiazolidin-4-one,
(2Z,5E)-5-((1H-indol-3-yl)methylene)-2-((4-butylphenyl)imino)thiazolidin-4-one,
(Z)-5-((1H-indol-3-yl)methylene)-2-((4-butylphenyl)amino)thiazol-4(5H)-one,
(Z)-5-((1H-indol-3-yl)methylene)-2-((3-methoxyphenyl)amino)thiazol-4(5H)-one,
(2E,5Z)-5-((2-methyl-1H-indol-3-yl)methylene)-2-(p-tolylimino)thiazolidin-4-one,
(2Z,5E)-5-((2-methyl-1H-indol-3-yl)methylene)-2-(p-tolylimino)thiazolidin-4-one,
(Z)-3-((5-((1H-indol-3-yl)methylene)-4-oxo-4,5-dihydrothiazol-2-yl)amino)benzoic acid,
(E)-2-((5-((1H-indol-3-yl)methylene)-4-oxo-4,5-dihydrothiazol-2-yl)amino)benzoic acid,
(2Z,5Z)-2-((2-chlorophenyl)imino)-5-((2-methyl-1H-indol-3-yl)methylene)thiazolidin-4-one,
(Z)-5-((5-((1H-indol-3-yl)methylene)-4-oxo-4,5-dihydrothiazol-2-yl)amino)-2-hydroxybenzoic acid 또는
(Z)-5-((1H-indol-3-yl)methylene)-N-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-4-methylene-4,5-dihydrothiazol-2-amine일 수 있다.
상기 조성물에 있어서, 상기 화합물은 탈수초화방지(demyelination), 신경보호효과(neuroprotective effect), 조직손상의 감소, 세포사멸(apoptosis) 방지 또는 염증성 침윤(Inflammatory infiltration)의 억제효과를 가질 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물을 다발성 경화증에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 다발성 경화증 치료방법이 제공된다:
(화학식 1)
(상기 식에서 R1 내지 R5는 각각 독립적으로 수소, 히드록시기, 할로겐, 탄소수 1 내지 7의 치환된 알킬기 또는 치환되지 않은 알킬기, 탄소수 1 내지 7의 치환되된 알콕시기 또는 치환되지 않은 알콕시기, 아민기, 카르복실기이거나 R2 및 R3는 함께 -O-(CH2)n-O- 고리 또는 치환 또는 비치환된 벤젠고리를 형성하며(n은 1 내지 3의 정수), R6는 수소 또는 메틸기이고, R7은 수소 또는 할로겐이고, 상기 화학식에서 
는 단일결합 또는 이중결합이다).
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물을 뇌척수염에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 뇌척수염 치료방법이 제공된다:
(화학식 1)
(상기 식에서 R1 내지 R5는 각각 독립적으로 수소, 히드록시기, 할로겐, 탄소수 1 내지 7의 치환된 알킬기 또는 치환되지 않은 알킬기, 탄소수 1 내지 7의 치환되된 알콕시기 또는 치환되지 않은 알콕시기, 아민기, 카르복실기이거나 R2 및 R3는 함께 -O-(CH2)n-O- 고리 또는 치환 또는 비치환된 벤젠고리를 형성하며(n은 1 내지 3의 정수), R6는 수소 또는 메틸기이고, R7은 수소 또는 할로겐이고, 상기 화학식에서 
는 단일결합 또는 이중결합이다).
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 다발성 경화증 치료에 사용되는 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물이 제공된다:
(화학식 1)
(상기 식에서 R1 내지 R5는 각각 독립적으로 수소, 히드록시기, 할로겐, 탄소수 1 내지 7의 치환된 알킬기 또는 치환되지 않은 알킬기, 탄소수 1 내지 7의 치환되된 알콕시기 또는 치환되지 않은 알콕시기, 아민기, 카르복실기이거나 R2 및 R3는 함께 -O-(CH2)n-O- 고리 또는 치환 또는 비치환된 벤젠고리를 형성하며(n은 1 내지 3의 정수), R6는 수소 또는 메틸기이고, R7은 수소 또는 할로겐이고, 상기 화학식에서 
는 단일결합 또는 이중결합이다).
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 뇌 척수염 치료에 사용되는 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물이 제공된다:
(화학식 1)
(상기 식에서 R1 내지 R5는 각각 독립적으로 수소, 히드록시기, 할로겐, 탄소수 1 내지 7의 치환된 알킬기 또는 치환되지 않은 알킬기, 탄소수 1 내지 7의 치환되된 알콕시기 또는 치환되지 않은 알콕시기, 아민기, 카르복실기이거나 R2 및 R3는 함께 -O-(CH2)n-O- 고리 또는 치환 또는 비치환된 벤젠고리를 형성하며(n은 1 내지 3의 정수), R6는 수소 또는 메틸기이고, R7은 수소 또는 할로겐이고, 상기 화학식에서 
는 단일결합 또는 이중결합이다).
본 발명의 약학적 조성물에서 상기 화합물의 유효량은 환자의 환부의 종류,적용부위, 처리회수, 처리시간, 제형, 환자의 상태, 보조제의 종류 등에 따라 변할수 있다. 사용량은 특별히 한정되지 않지만, 0.01μg/kg/day 내지 10 mg/kg/day일일 수 있다. 상기 1일량은 1일에 1회, 또는 적당한 간격을 두고 하루에 2~3회에 나눠 투여해도 되고, 수일(數日) 간격으로 간헐(間歇)투여해도 된다.
본 발명의 약학적 조성물에서 상기 화합물은, 조성물 총 중량에 대하여 0.1-100 중량%로 함유될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 약학적 조성물의 제조에는 고체 또는 액체의 제제용 첨가물을 사용할 수 있다. 제제용 첨가물은 유기 또는 무기 중 어느 것이어도 된다.
부형제로서는 예를 들면 유당, 자당, 백당, 포도당, 옥수수 전분(cornstarch), 전분, 탈크, 소르비트, 결정 셀룰로오스, 덱스트린, 카올린, 탄산칼슘 및 이산화규소 등을 들 수 있다. 결합제로서는 예를 들면 폴리비닐알코올, 폴리비닐에테르, 에틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 아라비아고무, 트래거캔스(tragacanth),젤라틴, 셀락(shellac), 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 구연산칼슘, 덱스트린 및 펙틴(pectin) 등을 들 수 있다. 활택제로서는 예를 들면 스테아린산마그네슘, 탈크, 폴리에틸렌글리콜, 실리카, 경화식물유 등을 들 수있다. 착색제로서는 통상 의약품에 첨가하는 것이 허가되어 있는 것이라면 모두 사용할 수 있다. 이들의 정제, 과립제에는 당의(糖衣), 젤라틴코팅, 기타 필요에 따라 적절히 코팅할 수 있다. 또한, 필요에 따라 방부제, 항산화제 등을 첨가할 수있다.
본 발명의 약학적 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며(예: 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, 최신판;Mack Publishing Company, Easton PA), 제제의 형태는 특별히 한정되는 것은 아니다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042(Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기술되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물에서 상기 화합물은 경구 또는 비경구로 투여되는 것이 가능하며, 바람직하게는 비경구 투여로 정맥내 주입, 피하 주입, 뇌실내 주입(intracerebroventricular injection), 뇌척수액내 주입(intracerebrospinal fluid injection), 근육내 주입 및 복강 주입 등으로 투여할 수 있다.
퇴행성 신경계 질환인 다발성 경화증 치료를 위해 현재까지 많은 약과 치료법이 개발되고 있지만 아직까지 별로 효과는 없는 실정이고 최근 다발성 경화증에서 나타나는 현상과 같이, 유해한 면역 세포가 뇌로 침입하는 것을 막기 위해 많은 연구자들이 연구를 수행하고 있다. 본 발명자들은 아연의 킬레이터 투여 및 신경종말에 위치하여 아연의 소포체(synaptic vesicle) 이동을 조절하는 Zinc Transporter 3(ZnT3)를 유전적으로 제거한 마우스에서 다발성 경화증의 증상과 척수 백질의 조직 손상을 억제한다는 결과들을 속속 발표함으로 아연과 다발성 경화증에 관한 관심이 고조되고 있는 실정이다. 또한 이러한 과정에 NADPH oxidase의 활성화로 인한 활성산소 생성이 다발성 경화증에서 발생하는 myelin 수초의 2차적인 손상에 관여함이 보고되었다. 따라서 최근 발표된 여러 연구 결과에 의하면 아연(zinc)이 세포종말로부터 분비된 후 세포질 내에 축적이 되고 이로 인해 단백질로부터의 유리에 의한 아연의 독성으로 myelin 수초가 손상됨이 알려지고 있다(도 7). 본 발명의 선행 연구에서는 아연제거제 (Clioquinol, CQ) 투여 및 아연의 소포체로의 이동에 관여하는 zinc transporter 3(ZnT3)의 유전자를 제거한 동물에서 수초탈락과 미세아교세포의 활성을 감소시키고 뇌염을 유발하는 T세포의 침투 억제 등을 수반하는 EAE의 증상들을 개선시킴을 보고한 바 있으며 이러한 과정에 NADPH oxidase의 활성화로 인한 활성산소 생성 등이 다발성 경화증에서 발생하는 myelin 수초의 2차적인 손상에 관여 한다는 사실을 보고하였다. 상기 선행연구들은 각각 하기와 같다: (Choi BY et al., Neurobiol Dis. Jun;54:382-91. J Neuroinflammation. May 28;12:104. 2015, Neurobiol Dis. Oct;94:205-12. 2016).
또한, 아연신경독성, 흥분독성 등의 신경세포손상 과정은 ATP 감소와 AMP 증가 현상이 수반되어 AMP에 의해 활성화되는 AMPK 활성이 뚜렷이 나타나며, 이 때 증가된 AMPK 활성을 낮춰주면 신경세포 손상이 줄어드는 것을 알 수 있었다(Eom JW et al, Mol Brain. Feb 9;9:14, 2016). 본 발명자들은 뇌신경세포손상 과정에서 AMPK와 관련된 세포사 기전 규명 연구를 진행하였고 관련 기전을 2016년 Molecular Brain(IF: 3.410)에 보고한 바 있다. 또한 최근 발표된 여러 연구 결과에 의하면 치매증, 파킨슨병, 헌팅턴무도병, 다발성 경화증 등의 신경퇴행성 질환에서 AMPK 활성이 중추신경계의 손상 및 병적 관여와 연관되어 있다고 보고되었다. 이에 본 발명자들은 대사조절에 가장 핵심적인 AMPK 중심의 신경독성기전 연구를 수행한 바 있으며, 상기 선행연구를 바탕으로 신규 AMPK 억제제 개발연구를 진행하여 새로운 화합물을 스크리닝하여 AMPK 억제제((Z)-5-((1H-indol-3-yl)methylene)-2-((3-hydroxyphenyl)amino)thiazol- 4(5H)-one, "1H10"으로 명명함, 화학식 2)를 발굴하였으며, 이 후 이 약물들의 작용기전(Mechanism of action, MOA) 연구과정에서 유효물질들이 세포 내 free 상태의 아연의 농도를 조절함으로써 뇌졸중으로 인해 발생되는 아연독성, 흥분독성, 산화적 손상 등의 다양한 원인에 의해 발생하는 신경세포사멸을 감소시킨다는 것을 보고한 바 있다(Eom JW et al., ACS Chem Neurosci. May 15;10(5):2345-2354, 2019)(도 8).
(화학식 2)
본 발명은 다발성 경화증 동물모델인 자가 면역성 뇌척수염(EAE) 유도 후 상기 1H10이 다양한 수준에서 질환 발병을 억제할 수 있음을 나타내었다. 구체적으로, 1H10 처리에 따라 행동실험에서 탁월한 증상완화 효과를 보여 주었고 발병율도 억제되었다. 또한 척수의 탈수초화 현상, 면역세포 활성이 감소되었으며 탈수초화가 진행된 부위로 면역세포들이 침윤되는 것을 방지함을 확인하였다. 이는 상기 1H10 약물의 AMPK 활성 억제 기전과 관련되어 있음을 시사하는 것이다. 아울러, 척수 백질 내로 아연 축적도 1H10 처리에 따라 감소되어 MMP-9 억제와 이에 따라 면역세포들이 축적되는 것을 방지할 수 있음을 확인하였고 1H10이 아연에 직접 작용하여 chelation 할 수 있음을 관찰하였다. 마지막으로 45일까지 투여된 장기적인 EAE 모델에서도 1H10의 효과가 탁월함을 입증하였다.
따라서 본 발명의 AMPK 억제기능과 아연항상성 조절기능에 기반한 다발성 경화증 치료용 약학적 조성물은 AMPK 활성 억제기능과 아연 항상성 조절기능을 가진 신규화합물을 처리하여 다발성 경화증으로 인한 척수 손상과 행동장애를 극복할 수 있는 새로운 치료제를 제공한다. 상기 신규 약물은 신경세포 손상 과정에서 아연 킬레이터(chelator)로 작용할 수 있으며, 특히 1H10의 경우 chelation 뿐만 아니라 zinc ionophore로도 작용할 수 있어서 적극적인 아연항상성 조절 물질로 개발 가능하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
일반적 방법
공시 재료
본 발명에서 사용한 실험동물은 대한 바이오 링크로부터 공급받은 8주령의 C57BL/6 계통의 암컷 마우스이다. 이러한 마우스들은 온도와 습도가 조절되는 환경에서 사육되었으며 사료와 물은 자유식으로 공급되었다.
대뇌피질 신경세포(Cerebral Cortex Neurons) 배양
본 발명에서 사용한 마우스 대뇌피질 신경세포는 마우스 배아의 뇌로부터 추출 배양하여 5% 우태아혈청(FBS)과 5% 마혈청(HS)을 첨가한 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM, Gibco, Grand Island, NY, US)을 이용하여 95% 습도, 5% CO2 및 37℃ 온도 조건에서 배양하였다. 상기 세포의 활성화와 분화를 위해 24-well 조직 배양 플레이트에서 2 x104 세포의 밀도로 증식하였고 아연 및 화합물을 처리하기 전에는 FBS와 HS가 없는 MEM 배지에서 배양하였다.
다발성 경화증의 동물모델 제조
본 발명자들은 C57BL/6 암컷 마우스에 Myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55 (MOG35-55) 펩티드 항원을 피하 주사하여 다발성 경화증 동물모델인 자가 면역성 뇌척수염(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)을 유도하였다(도 1a). 이를 위해 먼저 MOG35-55(Ana spec, USA)와 Complete freund's adjuvant (CFA)를 준비하였고 MOG35-55(2 mg/ml)는 Phosphate buffered saline (1x PBS, Sigma)을 넣고 녹인 후, 상기 CFA는 25ml Incomplete freund's adjuvant(IFA. Sigma)를 50 ml conical tube에 넣었다. 이어서 후드에서 Mycobacterium tuberculosis H37Ra(100mg; Difco, USA) 앰플을 조심스레 깨서 추가한 후 vortex해서 냉장보관 하였다. 그 후, 마우스의 양쪽 옆구리에 MOG35-55 및 Mycobacterium tuberculosis H37Ra를 함유한 CFA를 동일한 양으로 혼합하여 주사하였다. 그리고 Pertussis toxin(4 ㎍/ml, List Biological Laboratories, USA)을 면역 당일과 면역 후 2일째에 복강으로 주사하였다. 상기 면역 후, 매일 마우스의 체중과 임상 증상을 측정하였으며 EAE의 진행 정도는 특정적인 임상 증상을 기준으로 하여 평가하였다. 이에 대한 자세한 내용은 아래에 기재되어 있다.
EAE 임상적 증상 평가
본 발명에서 사용한 EAE 임상적 증상 평가는 선행연구(Jones et al., J Neuroimmunol. Aug 13;199(1-2):83-93. 2008)를 기반으로 평가하였다. 구체적으로, EAE의 임상적 증상 평가를 위하여 마우스의 동작은 하기 기준에 따라 매일 평가되었다. score 0, 증상 없음; score 0.5, 꼬리의 부분적 마비 또는 약간의 비정상적인 걸음; score 1.0, 완전한 꼬리 마비 또는 부분적인 꼬리 마비와 가벼운 뒷다리 심약; score 1.5, 완전한 꼬리 마비와 가벼운 뒷다리 심약; score 2.0, 꼬리 마비와 보통의 뒷다리 심약 (케이지 위에서 걷는 동안 발이 자주 빠지는 것으로 증명함); score 2.5, 뒷다리의 무게감은 없지만 약간의 움직임이 있음; score 3.0, 완전한 뒷다리 마비; score 3.5, 뒷다리 마비와 앞다리에 가벼운 심약; score 4.0, 사지가 완전히 마비되었지만 머리는 움직임; score 4.5, 빈사상태; score 5.0, 사망.
크레실 바이올렛(cresyl violet) 염색
본 발명자들은 EAE 유도 후 21일째 되는 날에 마우스를 우레탄으로 마취한 후에 4% 파라포름알데히드를 심장으로 관류하여 척수(spinal cord)를 고정하였고 상기 척수를 적출한 후 척수에서 단핵세포(mononuclear cell)들의 침윤을 cresyl violet 염색을 통해 관찰하였다. 이를 위해, 먼저 척수를 동결절편기(Cryostat)에서 30 um의 두께로 박절을 하여 절편을 얻은 후 젤라틴으로 코팅된 슬라이드에 올려 30분 동안 실온에서 건조시켰다. 100%, 70% 에탄올 용액에 순서대로 각각 3분씩 담근 후 0.1% 크레실 바이올렛 용액에 15분 동안 염색했다. 그 후 과하게 염색된 부분을 제거하기 위해 흐르는 물에 수세하였고 50%, 70%, 80%, 90%, 100% 에탄올 용액에 각각 3-5분 동안 탈수과정, 자일렌(xylene)에 15분간 2번씩 투명화 과정을 거친 후 봉입하여 광학현미경으로 관찰하였다.
면역조직화학법
본 발명자들은 EAE 유도 후 21일째 되는 날에 마우스를 우레탄으로 마취한 후에 4% 파라포름알데히드를 심장으로 관류하여 척수(spinal cord)를 고정하였고 상기 척수를 적출한 후 척수 내 면역세포들의 침윤을 관찰하기 위해 T세포의 마커로 사용되는 CD4, CD8 및 B세포의 마커로 사용되는 CD20 항체를 사용하여 면역조직화학법을 수행하였다. 동결절편은 내인성 페록시다아제의 제거를 위해 3% hydrogen peroxide에 15분간 상온에서 반응시킨 후 1차 항체인 rat anti-CD4(1:50, BD Bioscience, CA, USA), CD8(1:50, BD Bioscience), goat anti-CD20(1:50, SantaCruz Biotechnology, USA)를 4℃ 냉장에서 15시간 동안 반응시켰다. 그 이후, biotinylated anti-rat IgG 또는 anti-goat IgG (1:250, Vector Laboratories, USA)를 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 이어서 avidin-biotin peroxidase conjugate (ABC regent, Vector Laboratories)로 2시간 실온에서 반응 시켰으며 면역 반응이 끝난 조직은 3,3'-diaminobenzidine (DAB, Vector Laboratories) 용액에서 발색시켰다. 또한 EAE로 인해 발생하는 혈액뇌관문의 손상을 측정하기 위해 혈청 내 Immunoglobulin G (IgG)의 유출을 확인하였다. 상기 IgG는 혈장에 가장 풍부한 면역 글로불린으로 이를 확인하기가 용이하여 척수 내 IgG의 존재는 혈액뇌관문의 손상 및 단백질들의 혈관외유출을 감시하는데 사용된다(Ruth and Feinerman, Acta Neuropathol. 76(4):380-7. 1988). 그 후, 동결절편은 2시간 동안 실온에서 biotinylated horse anti-mouse IgG (1:250, Vector Laboratories, USA)를 반응시킨 후 위와 같은 방법으로 ABC regent에 반응시킨 다음 DAB 용액으로 발색시켰다. 각 단계 사이에는 PBS로 충분히 세척하였고, 에탄올과 자일렌의 탈수 및 투명화 과정을 거친 후 봉입하여 광학현미경으로 관찰하였으며, 마우스 한 마리 당 3~5개 이상의 시야에서 이미지 J 프로그램 (National Institute of Health (NIH), USA)을 이용하여 분석하였다.
면역 형광염색
본 발명자들은 EAE 유도 후 21일째 되는 날에 마우스를 우레탄으로 마취한 후에 4% 파라포름알데히드를 심장으로 관류하여 척수(spinal cord)를 고정하였고 상기 척수를 적출한 후 조직의 탈수초 현상 및 미세아교세포/대식세포의 활성을 검사하기 위해 myelin basic protein(MBP) 및 F4/80(Microglia/Macrophage) 항체로 면역 형광염색을 실시하였다. 또한 손상된 척수의 백질 부분에 강하게 활성된 미세아교세포/대식세포의 유전자형(phenotype)을 분석하기 위해 미세아교세포/대식세포의 마커로 사용되는 Iba-1(Ionized calcium binding adaptor molecule-1) 및 CD68(Cluster of Differentiation 68) 항체를 이용하여 이중면역 형광염색을 수행하였다. 아울러, 척수 내로 침윤하는 T 세포에서 AMP-activated protein kinase(AMPK) 활성이 이러한 세포들의 생존에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해 CD8과 phospho-AMPK 항체를 이용하여 이중면역 형광염색을 수행하였으며 Matrix metallopeptidase 9(MMP-9)의 활성을 비교 분석하기 위해 MMP-9 항체를 이용하여 면역 형광염색을 실시하였다. 척수 내 성상교세포의 활성을 검사하기 위해 glial fibrillary acidic protein(GFAP) 항체를 이용하여 면역 형광염색을 수행하였으며 tumor necrosis factor(TNF) alpha, interferon(IFN) gamma 등의 사이토카인의 발현을 비교 분석하기 위해 TNF-alpha와 IFN gamma 항체를 이용하여 이중면역 형광염색을 수행하였다. 상기 기재된 면역조직화학법과 같은 방법으로 동결절편은 내인성 페록시다아제의 제거를 위해 3% hydrogen peroxide에 15분간 상온에서 반응시킨 후 1차 항체인 rat anti-MBP(1:200, Abcam, UK), F4/80(1:100, eBioscience, USA), goat anti-Iba1(1:500, Abcam), CD68 (1:100, Bio-Rad Laboratories, USA), CD8(1:50, BD Bioscience), pAMPK(1:100, Abcam), MMP-9 (1:100, Abcam), GFAP (1:500, Abcam), IFN gamma (1:100, Invitrogen, USA), TNF alpha (1:250, Abcam)를 4℃ 냉장에서 15시간 동안 반응시켰다. 그 후, 각각의 1차 항체의 host에 맞는 Alexa Fluor 488-, 594-, 647-conjugated secondary antibodies (1:250, Invitrogen, USA)를 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 각 단계 사이에는 PBS로 충분히 세척하였고, 자일렌의 투명화 과정을 거친 후 DPX로 봉입하여 공초점 레이져 주사현미경(Confocal Laser Scanning Microscope, Carl Zeiss LSM710, Germany)으로 관찰하였으며, 마우스 한 마리 당 3~5개 이상의 시야에서 Image J 프로그램 (National Institute of Health (NIH), USA)을 이용하여 분석하였다.
아연 염색법(TSQ)
본 발명자들은 EAE 유도 마우스의 임상적 증상 평가가 끝난 후 척수 조직을 아연(zinc) 염색법인 N-(6 methoxy 8 quinolyl) para toluenesulfonamide(TSQ) histochemical method에 의하여 검사하였다. 정상적인 척수에서 아연은 회백질 (gray matter)의 신경 축삭의 종말에 존재하며 백질에서는 아주 소량만이 관찰되어 진다. EAE 유도 후 21일째 되는 날에 마우스를 5% 이소플루란(isoflurane)으로 마취한 후에 관류 없이 척수를 적출하여 드라이아이스로 급속 냉각시켰다. 고정되지 않은 동결조직은 -15℃ 동결절편기(Cryostat)에서 20 ㎛의 두께로 박절을 하여 절편을 얻었다. 동결절편은 즉시 젤라틴으로 코팅된 슬라이드에 올려지고 30분 동안 실온에서 건조시킨 후 TSQ 용액에 60초 동안 담근 다음 0.9% 생리식염수로 60초 동안 헹군다. TSQ 형광도는 360 nm/490 nm의 파장을 가진 올림푸스 IX70 형광 현미경을 사용하여 관찰하였으며 INFINITY3-1 CCD 냉각 디지털 컬러 카메라(Lumenera Co., Canada)와 INFINITY 분석 소프트웨어를 사용하여 평가하였다.
아연 chelation
본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 1H10((Z)-5-((1H-indol-3-yl) methylene)-2-((3-hydroxyphenyl)amino)thiazol-4(5H)-one) 처리에 따른 아연 chelation 가능성 검증을 위해 자유 아연에 결합하면 형광을 나타내는 물질인 FluoZin-3를 배양된 생쥐의 신경세포에 처리하였고, 아연(300 μM)에 15분간 노출시킨 후 상기 아연을 제거한 다음 60분 동안 신경세포 내 아연농도를 측정하였다. 또한 시험관에 20 μM 아연(ZnCl2) 및 아연과 결합하였을 때 형광을 나타내는 NewPort Green DCF 형광물질을 첨가 후 본 발명의 1H10을 농도별로 처리하였고 아연 chelator인 클리오퀴놀(clioquinol)과 칼슘 이온 운반체(ionophore)인 이오노마이신(ionomycin)을 대조군으로 사용하였다.
실험예 1: 동물 모델의 임상적 징후 및 발병율
본 발명의 일 실시예에 따라 다발성 경화증의 동물모델인 자가 면역성 뇌척수염 유도한 결과 마우스에 심각한 행동 장애가 발생하였으나 본 발명의 1H10을 투여한 실험군에서는 상기 행동 장애가 현저히 억제되는 것으로 나타났다(도 1b 및 1c). 또한, EAE 마우스의 임상적 증상을 평가한 결과, 1H10을 투여한 실험군에서는임상적 증상뿐만 아니라 발병율 또한 억제되는 것을 관찰하였다(도 1c).
상기 결과는 본 발명의 1H10이 미엘린(myelin) 희소돌기신경교(oligodendrocyte) 당 단백질 35-55(MOG35-55)-유도된 EAE의 임상적 징후 및 질병 진행을 개선함을 시사하는 것이다(도 1d).
실험예 2: 미세아교세포/대식세포의 활성
본 발명자들은 척수 조직의 탈수초(demyelination) 현상 및 미세아교세포/대식세포의 활성을 면역 형광염색을 통해 관찰하였다. 그 결과, 정상 조직의 경우, 초록색으로 염색이 되어야할 척수의 백질이 EAE 마우스의 조직에서는 초록색 염색이 저하되고 미세아교세포/대식세포의 활성을 나타내는 빨간색이 강하게 나타남을 확인하였다(도 2a). 상기 MBP의 감소는 신경의 축삭을 덮고 있는 미엘린(myelin)이 손상되어 있음을 의미한다(도 2b). 그러나 1H10을 지속적으로 투여한 동물의 척수에서는 상기 EAE-유도 탈수초화 및 미세아교세포/대식세포의 활성이 현저히 감소하는 것으로 나타났다(도 2c).
또한 미세아교세포/대식세포의 표현형 분석을 위해 이중면역 형광염색을 수행한 결과, Iba-1과 CD68이 동시에 발현하면 활성화된 M1 type의 미세아교 세포/대식세포를 의미하는데(도 2d) EAE 유도 후 1H10을 투여군에서 활성화된 M1 type의 미세아교세포/대식세포가 현저히 감소함을 확인하였다(도 2e 내지 2h).
실험예 3: 성상교세포의 활성
본 발명자들은 척수 조직의 성상교세포의 활성을 면역 형광염색을 통해 관찰하였다. 그 결과, EAE를 유도한 실험군의 척수 백질(white matte)에서 성상교세포의 활성을 나타내는 초록색이 강하게 분포되어 있는 반면 1H10을 투여한 실험군에서는 성상교세포의 활성이 현저하게 억제됨을 확인하였다(도 17 및 18).
실험예 4: AMPK의 인산화 및 EAE-유도 면역 세포 침윤
본 발명자들은 EAE 마우스 유도 후 21일째 되는 날에 상기 마우스의 척수에서 단핵세포들의 침윤을 크레실 바이올렛 염색 방법으로 관찰하였다.
그 결과, 단핵세포들이 EAE를 유도한 실험군의 척수 백질(white matte)에서 단핵세포들이 많이 분포되어 있는 반면 1H10을 투여한 실험군에서는 단핵세포의 침윤이 현저하게 억제됨을 확인하였다(도 3a 및 3b). 또한, 상기 척수 내로 침윤된 단핵세포들이 면역세포일 것이라는 가설을 확인하기 위해 CD4, CD8 및 CD20 항체를 사용하여 면역조직화학법을 수행한 결과, EAE 유도 후 많은 CD4, CD8 및 CD20(+) 세포들이 척수 백질 주변에 분포되어 있는 반면 1H10을 투여한 실험군에서는 상기 T, B 세포의 침윤이 현저하게 억제됨을 관찰하였다(도 3c 내지 3e). 아울러, 최근 보고에 의하면 AMPK 활성이 T 세포의 생존(survival)을 증진시키는 것으로 알려져 있어 AMPK의 활성을 관찰한 결과, EAE 유도 후 척수 내에 침윤된 CD8(+) T 세포에서 AMPK의 인산화(phosphorylation)가 증가되었으나 1H10을 투여한 실험군에서는 현저하게 감소됨을 관찰하였다(도 3f 내지 3h). 상기 결과는 본 발명의 1H10에 의한 AMPK의 억제가 척수 내로 침윤된 자가반응성(autoreactive) T 세포의 생존(survival)을 감소시켜 EAE의 증상을 완화시킬 수 있음을 시사하는 것이다.
실험예 5: 사이토카인의 발현
본 발명자들은 EAE 마우스 유도 후 21일째 되는 날에 상기 마우스의 척수에서 사이토카인 중 IFN gamma와 TNF alpha의 발현을 면역 형광염색을 통해 관찰하였다. 그 결과, EAE 유도 후 1H10을 투여한 실험군에서 vehicle 군에 비해 척수 백질 내에 IFN gamma의 발현은 증가된 반면 TNF alpha의 발현은 감소됨을 관찰하였다 (도 19 및 20).
실험예 6: 아연의 비정상적인 축적, BBB의 손상 및 MMP-9의 활성
본 발명자들은 1H10의 투여에 의한 EAE-유도 척수 백질 내 아연의 비정상적인 축적, 혈액뇌관문(BBB)의 손상 및 MMP-9의 활성을 관찰하였다.
그 결과, 정상 조직의 백질에서는 TSQ 염색으로 인한 신호가 관찰되지 않았으나 EAE-유도 후 21일째 TSQ 염색을 수행한 결과 척수의 백질 부위에서 비정상적인 "patch like" 형광이 관찰되었다. 상기와 같은 양상은 정상 동물이나 vehicle을 투여한 동물의 척수에서는 관찰되지 않았고 patch 같은 모양의 TSQ 이상 염색 현상은 1H10의 투여에 의하여 현저히 감소됨을 확인하였다(도 4a 및 4b). 또한 EAE-유도 후 MMP-9의 활성이 증가되며 이로 인해 BBB의 손상으로 T-cell 이나 B-cell, 및 다른 면역 세포들이 중추 신경계로 침투하는데 면역세포의 침투가 중추 신경계의 면역계를 교란함으로써 미엘린초(myelin sheath)를 파괴할 수 있다는 연구결과를 바탕으로 본 발명자들은 BBB 손상을 관찰하기 위해 immunoglobulin G(IgG) 분출의 조직학적 분석과 MMP-9의 활성도를 측정하였다. 그 결과, Vehicle을 투여한 마우스나 1H10만을 투여한 마우스(Sham group)에서는 BBB의 손상으로 인한 IgG의 염색이 백질이나 회백질에서 발견이 되지 않았다. 그러나 MOG를 주입하고 3주가 지난 마우스에서는 IgG의 침윤이 백질이나 회백질 모두에서 현저히 증가되었으며 상기 현상은 1H10의 투여에 의하여 현저히 감소하는 것으로 나타났다(도 4c 내지 4e). 아울러 MMP-9은 아연에 의하여 활성이 증가됨으로 상기 관찰한 아연의 백질 내 증가와 MMP-9의 활성 증가가 서로 밀접한 관계가 있을 것으로 생각되어 MMP-9의 활성을 비교한 결과, EAE 유도 후 1H10을 투여한 실험군에서 vehicle 군에 비해 척수 백질 내에 MMP-9의 활성이 억제됨을 확인하였다(도 4f 및 4g).
실험예 7: 아연의 항상성 조절 검증
자유 아연에 결합하면 형광을 나타내는 물질인 FluoZin-3을 이용하여 1H10 처리에 따른 아연 chelation 가능성을 검증한 결과, 1H10 처리한 실험군에서 세포 내 아연 증가가 현저하게 감소되는 것을 확인하였다(도 5a). 또한 테스트 튜브에서 1 μM 아연, 5 μM 자유 아연 형광 표지 약물(FluoZin-3)과 함께 다양한 농도의 (0, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 40 μM) 1H10 또는 clioquinol을 반응시킨 후 형광 값을 측정한 결과, 각 약물의 IC50값은 4.234 μM, 10.06 μM로 측정되었으나 최종 FluoZin-3의 형광 수치는 clioquinol이 더 낮았다. 본 발명의 1H10은 clioquinol 보다 더 낮은 농도에서도 아연과 결합하지만, 고농도에서는 아연 결합 강도가 clioquinol 보다 낮은 것으로 사료된다(도 5b). 상기 결과는 본 발명의 1H10이 AMPK 억제 기능뿐만 아니라 아연에 직접 결합하여 신경세포 내 아연항상성을 조절할 수 있음을 시사하는 것이다.
실험예 8: 장기보호 효과
본 발명자들은 마우스 EAE 유도 후 1H10을 전체 기간 동안 1일 1회 복강 내 투여한 다음, 최초 면역화 후 45일에 마우스를 희생시켜 임상적 증상 및 발병율을 관찰한 결과(도 6a), 1H10을 투여한 실험군에서 임상적 증상 및 발병율이 현저하게 감소함을 관찰하였다(도 6b 내지 6d). 이는 1H10의 투여가 급성기(21일) 뿐만 아니라 만성기(45일) 까지도 장기간 EAE의 증상을 완화시키데 효과가 있음을 증명하는 것이다.
실험예 9: 유사화합물 검색 및 아연독성 억제효과 관찰
본 발명의 일 실시예에 따라 본 발명의 1H10의 구조 유사성을 기반으로 하여 이와 유사한 구조를 가지는 25개 유사 화합물을 화합물 라이브러리 제조회사(InterBioScreen, Russia; Akos, Germany)로부터 구입하였다. 이 후 상기 배양된 생쥐의 대뇌피질 신경세포에 아연독성을 유발하기 위하여 ZnCl2(400 μM)을 10분간 처리하였고 12.5시간 경과 한 뒤, 상기 선별된 25개의 화합물 및 기존에 선별된 약물인 1H10을 처리(20 μM)하여 세포 생존능 분석(cell viability assay, Cell Counting Kit-8, Dojindo)을 통해 세포사(cell death) 억제 여부를 관찰하였다.
그 결과, 상기 처리한 25개의 새로운 화합물 중에서 8개의 약물(4B01, 4B04, 4B08, 4C01, 4C03, 4C04, 4C06, 4C08)이 신경보호 효과를 나타내었다(도 9). 상기 선별된 25개 화합물의 명칭과 구조를 하기 표 1에 표시하였다.
| 코드명 | 구조식 | IUPAC 명칭 |
| 4-A01 |
 |
(5Z)-5-(1H-Indol-3-ylmethylene)-2-{[2-(trifluoromethyl)phenyl]amino}-1,3-thiazol-4(5H)-one |
| 4-A02 |
 |
(5Z)-5-(1H-Indol-3-ylmethylene)-2-{[3-(trifl(uoromethyl)phenyl]amino}-1,3-thiazol-4(5H)-one |
| 4-A03 |
 |
(5Z)-2-[(3-Bromophenyl)amino]-5-(1H-indol-3-ylmethylene)-1,3-thiazol-4(5H)-one |
| 4-A04 |
 |
(5Z)-5-(1H-Indol-3-ylmethylene)-2-[(4-methylphenyl)amino]-1,3-thiazol-4(5H)-one |
| 4-A05 |
 |
(5Z)-5-(1H-Indol-3-ylmethylene)-2-[(3-methylphenyl)amino]-1,3-thiazol-4(5H)-one |
| 4-A06 |
 |
(5Z)-2-Anilino-5-(1H-indol-3-ylmethylene)-1,3-thiazol-4(5H)-one |
| 4-A07 |
 |
(5Z)-2-[(2,4-Dimethylphenyl)amino]-5-(1H-in dol-3-ylmethylene)-1,3-thiazol-4(5H)-one |
| 4-A08 |
 |
(5Z)-2-[(2-Chlorophenyl)amino]-5-(1H-indol-3-ylmethylene)-1,3-thiazol-4(5H)-one |
| 4-B01 |
 |
(5Z)-2-[(3,4-Dimethylphenyl)amino]-5-(1H-indol-3-ylmethylene)-1,3-thiazol-4(5H)-one |
| 4-B02 |
 |
(5Z)-2-[(4-Hydroxyphenyl)amino]-5-(1H-indol-3-ylmethylene)-1,3-thiazol-4(5H)-one |
| 4-B03 |
 |
(5Z)-5-(1H-Indol-3-ylmethylene)-2-[(2-methylphenyl)amino]-1,3-thiazol-4(5H)-one |
| 4-B04 |
 |
(5Z)-2-[(2,3-Dimethylphenyl)amino]-5-(1H-indol-3-ylmethylene)-1,3-thiazol-4(5H)-one |
| 4-B05 |
 |
(5E)-5-(1H-Indol-3-ylmethylene)-2-(1-naphthylamino)-1,3-thiazol-4(5H)-one |
| 4-B06 |
 |
(5Z)-2-[(3-Chlorophenyl)amino]-5-(1H-indol-3-ylmethylene)-1,3-thiazol-4(5H)-one |
| 4-B07 |
 |
(2E,5E)-5-((5-bromo-1H-indol-3-yl)methylene)-2-(phenylimino)thiazolidin-4-one |
| 4-B08 |
 |
(2Z,5E)-5-((1H-indol-3-yl)methylene)-2-((4-butylphenyl)imino)thiazolidin-4-one |
| 4-C01 |
 |
(Z)-5-((1H-indol-3-yl)methylene)-2-((4-butylphenyl)amino)thiazol-4(5H)-one |
| 4-C02 |
 |
(Z)-5-((1H-indol-3-yl)methylene)-2-((3-methoxyphenyl)amino)thiazol-4(5H)-one |
| 4-C03 |
 |
(2E,5Z)-5-((2-methyl-1H-indol-3-yl)methylene)-2-(p-tolylimino)thiazolidin-4-one |
| 4-C04 |
 |
(2Z,5E)-5-((2-methyl-1H-indol-3-yl)methylene)-2-(p-tolylimino)thiazolidin-4-one |
| 4-C05 |
 |
(Z)-3-((5-((1H-indol-3-yl)methylene)-4-oxo-4,5-dihydrothiazol-2-yl)amino)benzoic acid |
| 4-C06 |
 |
(E)-2-((5-((1H-indol-3-yl)methylene)-4-oxo-4,5-dihydrothiazol-2-yl)amino)benzoic acid |
| 4-C07 |
 |
(2Z,5Z)-2-((2-chlorophenyl)imino)-5-((2-methyl-1H-indol-3-yl)methylene)thiazolidin-4-one |
| 4-C08 |
 |
(Z)-5-((5-((1H-indol-3-yl)methylene)-4-oxo-4,5-dihydrothiazol-2-yl)amino)-2-hydroxybenzoic acid |
| 4-D01 |
 |
(Z)-5-((1H-indol-3-yl)methylene)-N-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-4-methylene-4,5-dihydrothiazol-2-amine |
실험예 10: 산화 스트레스 분석
본 발명자들은 상기 실시예의 8개의 약물 및 1H10을 대상으로 아연독성 외 산화성 손상(oxidative stress) 억제효과를 관찰하였다. 구체적으로 산화성손상은 H2O2(100 μM), FeCl2(100 μM)을 마우스의 대뇌피질 신경세포에 각각 약 4시간, 20시간 처리하여 신경독성을 유발하였고 상기 선별된 8개의 약물 및 1H10을 처리(20 μM) 하였다. 이 후 LDH(Lactate Dehydrogenase) 분석을 통해 세포독성을 관찰하였다.
그 결과, 4C06, 4C08을 제외한 6개의 약물(4B01, 4B04, 4B08, 4C01, 4C03, 4C04)은 H2O2 독성을 유의성 있게 억제하는 것으로 나타났다(도 10). 또한 추가적으로 4C06과 4C08에 대해서 H2O2 외에도 철(iron)에 의해 유발되는 산화성 손상을 확인한 결과, 상기 4C08이 철에 의한 산화성 손상을 억제하는 것으로 나타났다(도 11).
실험예 11: 흥분 독성 분석
본 발명자들은 상기 실시예의 8개의 약물 및 1H10을 대상으로 흥분독성(excitotoxicity) 억제 효과를 관찰하였다. 구체적으로 흥분독성은 NMDA(N-methyl-D-aspartate, 50 μM)를 마우스의 대뇌피질 신경세포에 3시간 동안 처리하여 유발하였고 상기 선별된 8개의 약물 및 1H10을 처리(20 μM)하고 LDH 세포독성을 관찰한 결과, 4B04, 4C06를 제외한 6개의 약물(4B01, 4B08, 4C01, 4C03, 4C04, 4C08)은 NMDA에 의한 흥분독성을 유의하게 억제하는 것으로 나타났다(도 12).
실험예 12: 아폽토시스 분석
본 발명자들은 상기 실시예의 8개의 약물 및 1H10을 대상으로 아폽토시스(apoptosis) 억제 효과를 관찰하였다. 구체적으로 아폽토시스에 의한 신경독성은 Etoposide(ETPS, 10 μM)를 마우스의 대뇌피질 신경세포에 20시간 처리하여 유발하였다. 그 후 상기 선별된 8개의 약물 및 1H10을 처리(20 μM)하고 LDH 세포독성을 관찰한 결과, 4B04, 4C03, 4C04를 제외한 5개의 약물(4B01, 4B08, 4C01, 4C06, 4C08)이 ETPS 독성을 유의하게 억제하는 것으로 나타났다(도 13).
실험예 13: 아연 결합 분석
본 발명자들은 상기 실시예의 25개 화합물 및 1H10을 대상으로 아연 결합 분석(Zinc binding assay)을 수행하였다. 구체적으로 테스트 튜브 상에서 1H10과 25개의 화합물(각각 20 μM)과 함께 아연(20 μM) 및 아연 형광 염색물질인 Newport green DCF(0.1 μM, Kd(Zn)=1 μM)을 이용하여 자유 결합 여부를 측정하였다. 이때 아연 chelator인 클리오퀴놀(clioquinol)과 칼슘 이온 운반체(ionophore)인 이오노마이신(ionomycin)을 대조군으로 사용하였다(각각 20μM). 그 결과, 이오노마이신을 제외한 모든 약물이 아연과 결합 가능함을 확인하였다(도 14).
실험예 14: AMPKα2 억제 활성
본 발명자들은 1H10과 25개의 화합물(각각 10 μM)과 함께 기존에 잘 알려진 AMPK 억제제 compound C(CC, 10 μM) 처리에 따른 recombinant AMPKα2 효소 활성을 KinaseProfilerTM Service(Eurofins, UK)를 통해 측정하였다. 그 결과, 4A06, 4B02, 4C04, 4C05, 4C06, 4C08, 4D01에서 1H10과 유사한 AMPK 억제효과를 나타내었다(도 15).
실험예 15: 자체 독성 분석
본 발명자들은 모든 세포 독성(아연독성, 산화성손상, 흥분독성, 아폽토시스)에 대해 공통적으로 보호효과를 나타낸 4가지 약물(4B01, 4B08, 4C01, 4C08)에 대한 자체 독성(self-toxicity)을 1H10과 비교하였다. 구체적으로 마우스의 대뇌피질 신경세포 배양체에서 상기 약물을 각각 40 μM 처리하고 24시간 또는 48시간 후 LDH 세포독성을 관찰하였다.
그 결과, 1H10은 약물 처리 24 시간 후 7.81±2.77%, 48시간 후 60.72±8.28%의 자체 독성이 관찰되었으나 4B01은 약물 처리 48 시간 후, 1H10보다 강한 자체 독성이 있음을 확인하였다. 또한 4B08, 4C01은 1H10과 무의미한 차이의 자체 독성을 나타내었으나 4C08은 약물 처리 48시간까지 자체 독성을 나타내지 않았다(도 16).
결론적으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 화합물들은 종래 다발성 경화증과 관련된 흥분독성(excitotoxicity), 산화성손상(oxidative stress), 아폽토시스(apoptosis), 아연독성(zinc neurotoxicity) 등의 다양한 독성기전에 보호효과를 나타내었고 아울러 아연 킬레이션을 통해 MMP-9 활성을 감소시켜 면역세포들의 척수 백질 내 투과 및 축적을 방지하여 자가면역 반응을 감소시킴에 따라 다발성 경화증 질환의 발생을 억제할 수 있음을 증명하였다. 따라서 본 발명의 1H10은 장기 투여에 의한 부작용이 심각한 스테로이드 제제와 면역억제제를 대체하고 근본적인 문제를 제어할 수 있는 약물의 개발에 활용될 수 있다.
본 발명은 상술한 실시예 및 실험예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예 및 실험예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
Claims (11)
- 본 발명의 일 관점에 따르면, 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물을 유효성분으로 함유하는, 다발성 경화증 또는 뇌척수염 치료용 약학적 조성물이 제공된다:
(화학식 1)(상기 식에서 R1 내지 R5는 각각 독립적으로 수소, 히드록시기, 할로겐, 탄소수 1 내지 7의 치환된 알킬기 또는 치환되지 않은 알킬기, 탄소수 1 내지 7의 치환된 알콕시기 또는 치환되지 않은 알콕시기, 아민기, 카르복실기이거나 R2 및 R3는 함께 -O-(CH2)n-O- 고리 또는 치환 또는 비치환된 벤젠고리를 형성하며(n은 1 내지 3의 정수), R6는 수소 또는 메틸기이고, R7은 수소 또는 할로겐이고, 상기 화학식에서는 단일결합 또는 이중결합이다).
- 제1항에 있어서,상기 치환되지 않은 알킬기는 메틸, 에틸, 프로필 또는 부틸인, 조성물.
- 제1항에 있어서,상기 치환된 알킬기는 플루오로메틸, 디플루오로메틸, 트리플루오로메틸기, 클로로메틸, 디클로로메틸, 트리클로로메틸 또는 아이오도메틸, 디아이오도메틸, 또는 트리라아이오도메틸인, 조성물.
- 제1항에 있어서,상기 할로겐은 불소(F), 염소(Cl), 브롬(Br) 또는 요오드(I)인, 조성물.
- 제1항에 있어서,상기 화합물은 (5Z)-5-(1H-Indol-3-ylmethylene)-2-{[2-(trifluoromethyl) phenyl]amino}-1,3-thiazol-4(5H)-one,(5Z)-5-(1H-Indol-3-ylmethylene)-2-{[3-(trifluoromethyl)phenyl]amino}-1,3-thiazol-4(5H)-one,(5Z)-2-[(3-Bromophenyl)amino]-5-(1H-indol-3-ylmethylene)-1,3-thiazol-4(5H)-one,(5Z)-5-(1H-Indol-3-ylmethylene)-2-[(4-methylphenyl)amino]-1,3-thiazol-4(5H)-one,(5Z)-5-(1H-Indol-3-ylmethylene)-2-[(3-methylphenyl)amino]-1,3-thiazol-4(5H)-one,(5Z)-2-Anilino-5-(1H-indol-3-ylmethylene)-1,3-thiazol-4(5H)-one,(5Z)-2-[(2,4-Dimethylphenyl)amino]-5-(1H-indol-3-ylmethylene)-1,3-thiazol-4(5H)-one,(5Z)-2-[(2-Chlorophenyl)amino]-5-(1H-indol-3-ylmethylene)-1,3-thiazol-4(5H)-one,(5Z)-2-[(3,4-Dimethylphenyl)amino]-5-(1H-indol-3-ylmethylene)-1,3-thiazol-4(5H)-one,(5Z)-2-[(4-Hydroxyphenyl)amino]-5-(1H-indol-3-ylmethylene)-1,3-thiazol-4(5H)-one,(5Z)-5-(1H-Indol-3-ylmethylene)-2-[(2-methylphenyl)amino]-1,3-thiazol-4(5H)-one,(5Z)-2-[(2,3-Dimethylphenyl)amino]-5-(1H-indol-3-ylmethylene)-1,3-thiazol-4(5H)-one,(5E)-5-(1H-Indol-3-ylmethylene)-2-(1-naphthylamino)-1,3-thiazol-4(5H)-one,(5Z)-2-[(3-Chlorophenyl)amino]-5-(1H-indol-3-ylmethylene)-1,3-thiazol-4(5H)-one,(5E)-2-Anilino-5-[(5-bromo-1H-indol-3-yl)methylene]-1,3-thiazol-4(5H)-one,(5E)-2-[(4-Butylphenyl)amino]-5-(1H-indol-3-ylmethylene)-1,3-thiazol-4(5H)-one,(5Z)-2-[(4-Butylphenyl)amino]-5-(1H-indol-3-ylmethylene)-1,3-thiazol-4(5H)-one,(5Z)-5-(1H-Indol-3-ylmethylene)-2-[(3-methoxyphenyl)amino]-1,3-thiazol-4(5H)-one,(5Z)-5-[(2-Methyl-1H-indol-3-yl)methylene]-2-[(4-methylphenyl)amino]-1,3-thiazol-4(5H)-one,(5E)-5-[(2-Methyl-1H-indol-3-yl)methylene]-2-[(4-methylphenyl)amino]-1,3-thiazol-4(5H)-one,3-{[(5Z)-5-(1H-Indol-3-ylmethylene)-4-oxo-4,5-dihydro-1,3-thiazol-2-yl]amino}benzoic acid,2-{[(5E)-5-(1H-Indol-3-ylmethylene)-4-oxo-4,5-dihydro-1,3-thiazol-2-yl]amino}benzoic acid,(5Z)-2-[(2-Chlorophenyl)amino]-5-[(2-methyl-1H-indol-3-yl)methylene]-1,3-thiazol-4(5H)-one,2-Hydroxy-5-{[(5Z)-5-(1H-indol-3-ylmethylene)-4-oxo-4,5-dihydro-1,3-thiazol-2-yl]amino}benzoic acid,(2E,5E)-5-((5-bromo-1H-indol-3-yl)methylene)-2-(phenylimino)thiazolidin-4-one,(2Z,5E)-5-((1H-indol-3-yl)methylene)-2-((4-butylphenyl)imino)thiazolidin-4-one,(Z)-5-((1H-indol-3-yl)methylene)-2-((4-butylphenyl)amino)thiazol-4(5H)-one,(Z)-5-((1H-indol-3-yl)methylene)-2-((3-methoxyphenyl)amino)thiazol-4(5H)-one,(2E,5Z)-5-((2-methyl-1H-indol-3-yl)methylene)-2-(p-tolylimino)thiazolidin-4-one,(2Z,5E)-5-((2-methyl-1H-indol-3-yl)methylene)-2-(p-tolylimino)thiazolidin-4-one,(Z)-3-((5-((1H-indol-3-yl)methylene)-4-oxo-4,5-dihydrothiazol-2-yl)amino)benzoic acid,(E)-2-((5-((1H-indol-3-yl)methylene)-4-oxo-4,5-dihydrothiazol-2-yl)amino)benzoic acid,(2Z,5Z)-2-((2-chlorophenyl)imino)-5-((2-methyl-1H-indol-3-yl)methylene)thiazolidin-4-one,(Z)-5-((5-((1H-indol-3-yl)methylene)-4-oxo-4,5-dihydrothiazol-2-yl)amino)-2-hydroxybenzoic acid 또는(Z)-5-((1H-indol-3-yl)methylene)-N-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-4-methylene-4,5-dihydrothiazol-2-amine인, 조성물.
- 제1항에 있어서,상기 화합물은(Z)-5-((1H-indol-3-yl)methylene)-2-((3,4-dimethylphenyl)amino)thiazol-4(5H)-one,(2Z,5E)-5-((1H-indol-3-yl)methylene)-2-((4-butylphenyl)imino)thiazolidin-4-one,(Z)-5-((1H-indol-3-yl)methylene)-2-((4-butylphenyl)amino)thiazol-4(5H)-one,(2E,5Z)-5-((2-methyl-1H-indol-3-yl)methylene)-2-(p-tolylimino)thiazolidin-4-one,(2Z,5E)-5-((2-methyl-1H-indol-3-yl)methylene)-2-(p-tolylimino)thiazolidin-4-one,(Z)-5-((5-((1H-indol-3-yl)methylene)-4-oxo-4,5-dihydrothiazol-2-yl)amino)-2-hydroxybenzoic acid 또는(Z)-5-((1H-indol-3-yl)methylene)-2-((3-hydroxyphenyl)amino)thiazol-4(5H)-one인, 조성물.
- 제1항에 있어서,상기 화합물은 탈수초화방지(demyelination), 신경보호효과(neuroprotective effect), 조직손상의 감소, 세포사멸(apoptosis) 방지 또는 염증성침윤(Inflammatory infiltration)의 억제효과를 갖는, 조성물.
- 치료적으로 유효한 양의 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물을 다발성 경화증에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 다발성 경화증 치료방법:
(화학식 1)(상기 식에서 R1 내지 R5는 각각 독립적으로 수소, 히드록시기, 할로겐, 탄소수 1 내지 7의 치환된 알킬기 또는 치환되지 않은 알킬기, 탄소수 1 내지 7의 치환되된 알콕시기 또는 치환되지 않은 알콕시기, 아민기, 카르복실기이거나 R2 및 R3는 함께 -O-(CH2)n-O- 고리 또는 치환 또는 비치환된 벤젠고리를 형성하며(n은 1 내지 3의 정수), R6는 수소 또는 메틸기이고, R7은 수소 또는 할로겐이고, 상기 화학식에서는 단일결합 또는 이중결합이다).
- 치료적으로 유효한 양의 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물을 뇌척수염에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 뇌척수염 치료방법:
(화학식 1)(상기 식에서 R1 내지 R5는 각각 독립적으로 수소, 히드록시기, 할로겐, 탄소수 1 내지 7의 치환된 알킬기 또는 치환되지 않은 알킬기, 탄소수 1 내지 7의 치환되된 알콕시기 또는 치환되지 않은 알콕시기, 아민기, 카르복실기이거나 R2 및 R3는 함께 -O-(CH2)n-O- 고리 또는 치환 또는 비치환된 벤젠고리를 형성하며(n은 1 내지 3의 정수), R6는 수소 또는 메틸기이고, R7은 수소 또는 할로겐이고, 상기 화학식에서는 단일결합 또는 이중결합이다).
- 다발성 경화증 치료에 사용되는 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물:
(화학식 1)(상기 식에서 R1 내지 R5는 각각 독립적으로 수소, 히드록시기, 할로겐, 탄소수 1 내지 7의 치환된 알킬기 또는 치환되지 않은 알킬기, 탄소수 1 내지 7의 치환되된 알콕시기 또는 치환되지 않은 알콕시기, 아민기, 카르복실기이거나 R2 및 R3는 함께 -O-(CH2)n-O- 고리 또는 치환 또는 비치환된 벤젠고리를 형성하며(n은 1 내지 3의 정수), R6는 수소 또는 메틸기이고, R7은 수소 또는 할로겐이고, 상기 화학식에서는 단일결합 또는 이중결합이다).
- 뇌 척수염 치료에 사용되는 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물:
(화학식 1)(상기 식에서 R1 내지 R5는 각각 독립적으로 수소, 히드록시기, 할로겐, 탄소수 1 내지 7의 치환된 알킬기 또는 치환되지 않은 알킬기, 탄소수 1 내지 7의 치환되된 알콕시기 또는 치환되지 않은 알콕시기, 아민기, 카르복실기이거나 R2 및 R3는 함께 -O-(CH2)n-O- 고리 또는 치환 또는 비치환된 벤젠고리를 형성하며(n은 1 내지 3의 정수), R6는 수소 또는 메틸기이고, R7은 수소 또는 할로겐이고, 상기 화학식에서는 단일결합 또는 이중결합이다).
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