CN114929217A

CN114929217A - 基于ampk抑制功能和锌稳态控制功能用于治疗多发性硬化的药物组合物

Info

Publication number: CN114929217A
Application number: CN202080093043.2A
Authority: CN
Inventors: 金良姬; 严在源; 徐相源; 崔普永
Original assignee: Zinc Medical Corp
Current assignee: Zinc Medical Corp
Priority date: 2019-11-14
Filing date: 2020-11-12
Publication date: 2022-08-19
Also published as: EP4066832A1; JP2023501814A; WO2021096270A1; US20230000839A1; EP4066832A4; KR20220088750A; JP7398840B2

Abstract

本发明基于AMPK抑制功能和锌稳态控制功能提供了用于治疗多发性硬化的药物组合物，其中所述药物组合物具有优异的神经保护作用而无副作用，并因此有效地治疗多发性硬化。

Description

基于AMPK抑制功能和锌稳态控制功能用于治疗多发性硬化的药物组合物

技术领域

本发明涉及用于治疗多发性硬化的药物组合物，并且更具体地，本发明涉及基于AMPK抑制功能和锌稳态控制功能用于治疗多发性硬化的药物组合物。

背景技术

多发性硬化(MS)是中枢神经系统的自身免疫炎性疾病，其由于人体中免疫系统的异常控制和神经元轴突周围髓鞘的破坏而发生，并且已知其涉及各种神经毒性。类固醇和免疫抑制剂已主要用于治疗多发性硬化，其基于多发性硬化的主要机制是自身免疫机制的事实。它试图通过减弱身体的免疫功能来控制疾病。然而，迄今为止的研究已经显示，尽管这些治疗在疾病的急性期具有显著的作用，但是它们在长期抑制疾病或减少疾病的复发中不起作用。因此，迄今为止，广为人知的有效疗法是在急性期以规则的间隔在几天内注射大量的类固醇或免疫抑制剂。近年来，已经进行了许多尝试以通过脊髓液或皮肤注射β-球蛋白，以通过防止该疾病的复发来缓解慢性恶化。然而，缺点是人们应该继续接受治疗。

另一方面，据报道，体内过量的锌累积或严重缺乏对神经元是有毒的，并且锌的稳态丧失可能引起多发性硬化。最近，各种研究组已经对多发性硬化中的锌稳态进行了研究，并且已经公布了各种结果，但是它们中的大多数是锌的稳态损失现象的变化的结果，并且准确的机械研究是不足的。此外，由于测量锌的方法和样品多样性，需要对多发性硬化中的锌进行更密切的研究。在这方面，韩国专利号1324647公开了用于治疗或预防多发性硬化的组合物及其筛选方法。

技术问题

然而，现有技术涉及使用LeuSH (L-亮氨酸硫醇)抑制NADPH氧化酶和/或MMP的功能，并因此基于抑制AMPK和控制锌神经毒性的多发性硬化治疗剂仍然未被开发。

本发明旨在于解决包括上述问题在内的各种问题，并且本发明的目的在于提供用于治疗多发性硬化的药物组合物，其基于AMPK抑制功能和锌稳态控制功能，用于有效地治疗多发性硬化而无副作用。然而，该问题是示例性的，并且本发明的范围不限于此。

发明内容

根据本发明的一方面，提供了用于治疗多发性硬化或脑脊髓炎的药物组合物，其含有具有下式I的结构的化合物作为活性成分：

(式I)

(在上式中，R₁至R₅各自独立地为氢、羟基、卤素、C1-7取代或未取代的烷基、胺基、羧基，并且R₂和R₃一起形成-O-(CH₂)_n-O-环(n为1-3的整数)或取代或未取代的C6芳环，R₆为氢或甲基，并且R₇为氢或卤素，并且

为单键或双键。)

根据本发明的另一方面，提供了用于治疗患有多发性硬化的受试者的多发性硬化的方法，所述方法包括给予所述受试者治疗有效量的具有下式I的结构的化合物：

(式I)

为单键或双键。)

(式I)

根据本发明的另一方面，提供了用于治疗多发性硬化的具有下式I的结构的化合物：

(式I)

为单键或双键。)

发明的效果

如上所述制备的根据本发明的基于AMPK抑制功能和锌稳态控制功能用于治疗多发性硬化的药物组合物可以用于开发新的治疗剂，通过给予具有AMPK活性抑制功能和锌稳态控制功能的新型化合物，所述治疗剂可以克服由于多发性硬化引起的脊髓损伤和行为障碍。当然，本发明的范围不受这些作用的限制。

附图说明

图1A是说明根据本发明的实施方案的实验设计的时间线的图。对于整个实验过程，1H10每天一次腹膜内给药，并且在免疫后第21天处死小鼠。

图1B是表示仅给予媒介物的对照组的EAE临床评分的分析的图。

图1C是表示给予1H10的实验组的EAE临床评分的分析的图。

图1D是表示媒介物治疗的或1H10治疗的免疫小鼠的发病率的分析的图。数据为平均值±SEM (n=7-8/实验组)。**p<0.05。

图2A是假手术和MOG35-55免疫小鼠(媒介物治疗的或1H10治疗的)脊髓中典型的小胶质细胞/巨噬细胞激活的显微照片。F4/80 (红色)、用DAPI染色的细胞核(蓝色)和脱髓鞘化区域通过MBP染色减少(绿色)鉴定。比例尺，50 μm。

图2B是表示在相同脊髓区域测量的MBP免疫反应性区域的百分比的分析的图(平均值±SEM；n=3-5/组)。

图2C是表示在相同脊髓区域测量的小胶质细胞/巨噬细胞激活等级的分析的图(平均值±SEM；n=3-5/组)。

图2D是Iba-1-(绿色)和CD68-(红色)阳性细胞的代表性图像，作为合并到媒介物治疗的和1H10治疗的EAE小鼠中的图像。用DAPI染色的细胞核(蓝色)。比例尺，50 μm。

图2E是表示在相同脊髓区域确定的Iba-1的免疫荧光强度的定量(平均值±SEM；n=3-5)的图。**p<0.05。

图2F是表示在相同脊髓区域确定的CD68 (F)的免疫荧光强度的定量的图(平均值±SEM；n=3-5/组)。**p<0.05。

图2G是表示Iba-1与CD68的共定位散点图的图。

图2H是表示使用CD68通过测量Mander重叠系数和Pearson相关系数(平均值±SEM；n=4/组)，Iba-1的定量共定位参数的图。**p<0.05。

图3A是一系列显微照片，显示用甲酚紫染色的脊髓的切片，以检测SMS单核细胞的浸润。比例尺，100 μm。

图3B是表示在初始免疫后3周用媒介物或1H10治疗的小鼠中从脊髓浸润的单核细胞的定量的图(平均值±SEM；n=5/组)。**p<0.05。

图3C是显示用抗细胞表面分子(例如CD4、CD8和CD20)的抗体染色的T细胞和B细胞的表达的显微照片。

图3D是表示用1H10或仅用媒介物治疗的假手术或EAE小鼠的胸脊髓中CD4、CD8和CD20免疫应答的强度的图。

图3E是表示用1H10或仅用媒介物治疗的假手术或EAE小鼠的胸脊髓中CD4、CD8和CD20阳性区域百分比的分析的图。

图3F是一系列代表性免疫荧光显微照片，显示来自用媒介物或1H10治疗的EAE小鼠的脊髓中用磷酸-AMPKα 1/2共标记的CD8⁺T细胞。

图3G是表示磷酸-AMPKα 1/2和CD8的共定位散点图的图。

图3H是表示通过测量每组的Mander重叠系数和Pearson相关系数(平均值±SEM；n=4)分析CD8和磷酸-AMPKα 1/2的定量共定位参数的图。**p<0.05。

图4A是一系列显微照片，显示用TSQ染色的脊髓的一部分，以检测锌累积。比例尺，100 μm。

图4B是一系列显微照片，显示用抗小鼠免疫球蛋白G (IgG)染色的脊髓的一部分，以检测内源IgG。比例尺，100 μm。

图4C是表示在初始免疫后3周用媒介物或1H10治疗的小鼠中IgG从脊髓中渗漏的强度的图(平均值±SEM；n=3-5/组)。**p<0.05。

图4D是表示在初始免疫后3周用媒介物或1H10治疗的小鼠中IgG从脊髓渗漏的面积百分比的分析的图(平均值±SEM；n=3-5/组)。**p<0.05。

图4E是来自未用1H10治疗的EAE小鼠的脊髓白质中CD31⁺内皮细胞(红色)和内源性小鼠IgG分子(绿色)的一系列双标记共聚焦显微图像。比例尺，20 μm。

图4F是一系列免疫荧光图像，显示MMP-9在脊髓白质中的表达。比例尺，50 μm。

图4G是显示分别用1H10或仅媒介物治疗的假手术和EAE小鼠的胸脊髓中MMP-9免疫反应性区域的百分比的图。(平均值±SEM；n=3-5/组)。**p<0.05。

图5A是根据本发明的实施方案，表示FluoZin-3 (一种锌的荧光指示剂)的分布的分析的图，以验证取决于1H10治疗的锌稳态。

图5B是根据本发明的实施方案，表示FluoZin-3 (一种锌的荧光指示剂)的分布的分析的图，以验证取决于1H10治疗的锌稳态。

图6A是时间线，显示用于分析在诱导EAE后1H10的长期保护作用的实验设计。在整个期间内每天一次腹膜内给予1H10后，在初始免疫后45天处死小鼠。

图6B是表示媒介物的EAE临床评分的图，以分析诱导EAE后1H10的长期保护作用。

图6C是表示1H10的EAE临床评分的图，以分析诱导EAE后1H10的长期保护作用。

图6D是表示在用仅媒介物或1H10治疗的免疫小鼠中发病率(%)的图，以分析在诱导EAE后1H10的长期保护作用。数据取平均值±SEM (n=6-8/组)。**p<0.05。

图7是说明显示锌的稳态丧失可以引起多发性硬化的研究结果的图。

图8是示意性说明多发性硬化(MS)的病理与锌之间的可能关联的图。

图9是表示根据本发明的实施方案，基于结构分析，具有与1H10相似结构的25种类似物化合物的神经保护作用的分析的图。

图10是表示根据本发明的实施方案，以上鉴定的25种新型化合物和1H10对氧化应激的抑制作用的分析的图。

图11是表示根据本发明的实施方案，由八种新型化合物和1H10的治疗引起的对氧化应激的抑制作用的分析的图。

图12是表示根据本发明的实施方案，由八种新型化合物和1H10的治疗对兴奋毒性的抑制作用的分析的图。

图13是表示根据本发明的实施方案，由八种新型化合物和1H10的治疗对细胞凋亡的抑制作用的分析的图。

图14是表示25种新化合物和1H10的锌结合分析结果的图。

图15是表示25种新型化合物和1H10的AMPKα2抑制活性分析的图。

图16是表示本发明人进行的四种新化合物和1H10的毒理学分析的结果的图。

图17是GFAP (绿色)的一系列免疫荧光照片，作为依赖于本发明的1H10治疗的脊髓组织中星形胶质细胞活性的分析。在第21天，我们观察到假手术和MOG35-55免疫小鼠(用仅媒介物或1H10治疗)的脊髓中的异常星形胶质增生。比例尺，50 μm。

图18是表示根据本发明的实施方案，通过分析依赖于1H10治疗的脊髓组织中星形胶质细胞的活性，在相同脊髓区域确定的GFAP的免疫荧光强度的定量的图(平均值±SEM；n=4/组)。*p<0.05相对于仅用媒介物治疗的EAE小鼠；#p<0.05相对于假手术小鼠(采用Kruskal-Wallis检验，Bonferroni post-hoc检验：卡方检验=11.514，df=3，p=0.009)。

图19显示在诱导EAE后第21天，通过针对干扰素γ (IFN-γ，绿色) (C，H)和肿瘤坏死α (TNF-α，红色) (D，I)的双标记的共聚焦显微免疫荧光成像，在用1H10 (A至E)或仅用媒介物(F至J)治疗的EAE免疫小鼠的脊髓中IFNγ和TNFα的表达的观察结果。细胞核用DAPI (蓝色) (B，G)染色。比例尺，20 μm。

图20是表示通过免疫荧光染色在诱导EAE后第21天用1H10或仅媒介物治疗的EAE免疫小鼠的脊髓中IFNγ和TNFα的免疫荧光强度的定量的图(平均值±SEM；n=3-4/组)。*p<0.05相对于仅用媒介物治疗的EAE小鼠(未配对的Student'st-检验)。

术语的定义：

如本文所用，“AMP激活的蛋白激酶(AMPK)”是由催化α亚基(α1或α2)和两个调节亚基(β和γ)组成的异源三聚蛋白。AMPK在细胞能量水平低时被磷酸化和激活，并进而调节细胞代谢，从而在长时间内调节基因表达以恢复ATP水平。已知增加AMP/ATP的比率、改变细胞pH和氧化还原态以及增加肌酸/磷酸肌酸的比率都可以激活AMPK。

如本文所用，“锌”是大量存在于整个身体(包括中枢神经系统)中的金属元素，并且在突触可塑性以及神经元的学习和记忆中起非常重要的作用。然而，众所周知，过量的锌累积或严重的缺乏对神经元是有毒的。锌的细胞内累积是在急性神经疾病(例如中风、癫痫、创伤性脑损伤和低血糖)后发生的神经损伤的主要原因，并且它引起在阿尔茨海默病的脑(一种慢性疾病)中产生的斑块的形成。

具体实施方式

(式I)

为单键或双键。)

在上述组合物中，未取代的烷基可以是甲基、乙基、丙基或丁基，并且取代的烷基可以是氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、氯甲基、二氯甲基、三氯甲基、碘甲基、二碘甲基或三碘甲基，并且卤素可以是氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)或碘(I)。

在上述组合物中，化合物可以是(5Z)-5-(1H-吲哚-3-基亚甲基)-2-[2-(三氟甲基)苯基]氨基-1,3-噻唑-4(5H)酮，

(5Z)-5-(1H-吲哚-3-基亚甲基)-2-[3-(三氟甲基)苯基]氨基-1,3-噻唑-4(5H)酮，

(5Z)-2-[(3-溴苯基)氨基]-5-(1H-吲哚-3-基亚甲基)-1,3-噻唑-4(5H)酮，

(5Z)-5-(1H-吲哚-3-基亚甲基)-2-[(4-甲基苯基)氨基]-1,3-噻唑-4(5H)酮，

(5Z)-5-(1H-吲哚-3-基亚甲基)-2-[(3-甲基苯基)氨基]-1,3-噻唑-4(5H)酮，

(5Z)-2-苯胺基-5-(1H-吲哚-3-基亚甲基)-1,3-噻唑-4(5H)酮，

(5Z)-2-[(2,4-二甲基苯基)氨基]-5-(1H-吲哚-3-基亚甲基)-1,3-噻唑-4(5H)酮，

(5Z)-2-[(2-氯苯基)氨基]-5-(1H-吲哚-3-基亚甲基)-1,3-噻唑-4(5H)酮，

(5Z)-2-[(3,4-二甲基苯基)氨基]-5-(1H-吲哚-3-基亚甲基)-1,3-噻唑-4(5H)酮，

(5Z)-2-[(4-羟基苯基)氨基]-5-(1H-吲哚-3-基亚甲基)-1,3-噻唑-4(5H)酮，

(5Z)-5-(1H-吲哚-3-基亚甲基)-2-[(2-甲基苯基)氨基]-1,3-噻唑-4(5H)酮，

(5Z)-2-[(2,3-二甲基苯基)氨基]-5-(1H-吲哚-3-基亚甲基)-1,3-噻唑-4(5H)酮，

(5E)-5-(1H-吲哚-3-基亚甲基)-2-(1-萘基氨基)-1,3-噻唑-4(5H)酮，

(5Z)-2-[(3-氯苯基)氨基]-5-(1H-吲哚-3-基亚甲基)-1,3-噻唑-4(5H)酮，

(5E)-2-苯胺基-5-[(5-溴-1H-吲哚-3-基)亚甲基]-1,3-噻唑-4(5H)酮，

(5E)-2-[(4-丁基苯基)氨基]-5-(1H-吲哚-3-基亚甲基)-1,3-噻唑-4(5H)酮，

(5Z)-2-[(4-丁基苯基)氨基]-5-(1H-吲哚-3-基亚甲基)-1,3-噻唑-4(5H)酮，

(5Z)-5-(1H-吲哚-3-基亚甲基)-2-[(3-甲氧基苯基)氨基]-1,3-噻唑-4(5H)酮，

(5Z)-5-[(2-甲基-1H-吲哚-3-基)亚甲基]-2-[(4-甲基苯基)氨基]-1,3-噻唑-4(5H)酮，

(5E)-5-[(2-甲基-1H-吲哚-3-基)亚甲基]-2-[(4-甲基苯基)氨基]-1,3-噻唑-4(5H)酮，

3-[(5Z)-5-(1H-吲哚-3-基亚甲基)-4-氧代-4,5-二氢-1,3-噻唑-2-基]氨基苯甲酸，

2-[(5E)-5-(1H-吲哚-3-基亚甲基)-4-氧代-4,5-二氢-1,3-噻唑-2-基]氨基苯甲酸，

(5Z)-2-[(2-氯苯基)氨基]-5-[(2-甲基-1H-吲哚-3-基)亚甲基]-1,3-噻唑-4(5H)酮，

2-羟基-5-[(5Z)-5-(1H-吲哚-3-基亚甲基)-4-氧代-4,5-二氢-1,3-噻唑-2-基]氨基苯甲酸，

(2E,5E)-5-((5-溴-1H-吲哚-3-基)亚甲基)-2-(苯基亚氨基)噻唑烷-4酮，

(2Z,5E)-5-((1H-吲哚-3-基)亚甲基)-2-((4-丁基苯基)亚氨基)噻唑烷-4酮，

(Z)-5-((1H-吲哚-3-基)亚甲基)-2-((4-丁基苯基)氨基)噻唑-4(5H)酮，

(Z)-5-((1H-吲哚-3-基)亚甲基)-2-((3-甲氧基苯基)氨基)噻唑-4(5H)酮，

(2E,5Z)-5-((2-甲基-1H-吲哚-3-基)亚甲基)-2-(对甲苯基亚氨基)噻唑烷-4酮，

(2Z,5E)-5-((2-甲基-1H-吲哚-3-基)亚甲基)-2-(对甲苯基亚氨基)噻唑烷-4酮，

(Z)-3-((5-((1H-吲哚-3-基)亚甲基)-4-氧代-4,5-二氢噻唑-2-基)氨基)苯甲酸，

(E)-2-((5-((1H-吲哚-3-基)亚甲基)-4-氧代-4,5-二氢噻唑-2-基)氨基)苯甲酸，

(2Z,5Z)-2-((2-氯苯基)亚氨基)-5-((2-甲基-1H-吲哚-3-基)亚甲基)噻唑烷-4酮，

(Z)-5-((5-((1H-吲哚-3-基)亚甲基)-4-氧代-4,5-二氢噻唑-2-基)氨基)-2-羟基苯甲酸，或

(Z)-5-((1H-吲哚-3-基)亚甲基)-N-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-4-亚甲基-4,5-二氢噻唑-2-胺。

在组合物中，化合物可以具有抗脱髓鞘化作用、神经保护作用、抗细胞凋亡作用或抗炎浸润作用。

根据本发明的另一方面，提供了用于治疗患有多发性硬化的受试者的多发性硬化的方法，所述方法包括给予受试者治疗有效量的具有下式I的结构的化合物：

(式I)

为单键或双键。)

根据本发明的另一方面，提供了用于治疗患有脑脊髓炎的受试者的脑脊髓炎的方法，所述方法包括给予受试者治疗有效量的具有下式I的结构的化合物：

(式I)

为单键或双键。)

(式I)

为单键或双键。)

根据本发明的另一方面，提供了用于治疗脑脊髓炎的具有下式I的结构的化合物：

(式I)

为单键或双键。)

在本发明的药物组合物中化合物的有效量可以根据患者的病变类型、施用部位和治疗次数、治疗时间、剂型、患者的状况、辅助剂类型等而变化。对用量没有特别限制，但可以是0.01 μg/kg/天至10 mg/kg/天。日剂量可以每天一次给药，或以适当的间隔每天分开给药2-3次，或可以以几天的间隔间歇给药。

在本发明的药物组合物中，基于组合物的总重量，可以以0.1-100重量%的量包含所述化合物。本发明的药物组合物可以进一步包括通常用于制备药物组合物的合适的载体、赋形剂和稀释剂。此外，用于固体或液体制剂的添加剂可以用于制备药物组合物。用于制剂的添加剂可以是有机或无机的。

赋形剂的实例包括乳糖、蔗糖、葡萄糖、玉米淀粉、淀粉、滑石、山梨醇、结晶纤维素、糊精、高岭土、碳酸钙和二氧化硅。粘结剂的实例包括聚乙烯醇、聚乙烯醚、乙基纤维素、甲基纤维素、阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、虫胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、柠檬酸钙、糊精和果胶。润滑剂的实例包括硬脂酸镁、滑石、聚乙二醇、二氧化硅和氢化植物油。作为着色剂，如果允许正常加入到药物中，则可以使用任何一种。这些片剂和颗粒剂可以根据需要用糖包衣、明胶包衣或其它合适的包衣进行包衣。另外，根据需要，可以加入防腐剂、抗氧化剂等。

本发明的药物组合物可以以本领域常规使用的任何制剂制备(例如，Remington'sPharmaceutical Science, 最近的版本; Mack Publishing Company, Easton PA)，并且制剂的类型没有特别限制。这些制剂描述于Remington's Pharmaceutical Science, 第15版, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042 (第87章: Blaug,Seymour)，这是所有药物化学通常已知的配方。

在本发明的药物组合物中，化合物可以口服或肠胃外给药，并且优选肠胃外给药，包括静脉内注射、皮下注射、脑室内注射、脑脊髓液内注射、肌肉注射和腹膜内注射。

尽管迄今为止已经开发了许多药物和治疗方法用于治疗多发性硬化(一种退行性神经系统疾病)，它们仍然不是非常有效。最近，许多研究者已经对如何防止有害的免疫细胞浸润到脑中(作为多发性硬化中出现的现象之一)进行了研究。据报道，在遗传学上去除控制神经末梢突触小泡运动的锌转运体3 (ZnT3)并给予锌螯合剂的小鼠中，由于抑制多发性硬化症状和脊髓白质的组织损伤，对锌与多发性硬化之间相关性的兴趣正在增加。另外，据报道在该过程中，NADPH氧化酶的激活导致的活性氧物类的产生与多发性硬化中发生的髓磷脂的继发性损伤有关。因此，根据最近公开的一些研究的结果，已知锌从细胞末端分泌，并然后在细胞质中累积，从而由于从蛋白质释放的锌的毒性而损伤髓磷脂(图7)。在本发明人的先前的研究中，报道了脱髓鞘化和小胶质细胞活性降低，并且抑制了引起脑炎的T细胞浸润，这是动物中EAE的症状，在该动物中，参与锌转运进入突触小泡的锌转运体3(ZnT3)编码基因被遗传去除，或者当给予氯碘羟喹(CQ) (一种锌螯合剂)时。前述研究分别如下：Choi, B. Y.等人, Neurobiol. Dis. 54: 382-391, 2013; Choi, B. Y. 等人, J. Neuroinflammation. 12: 104, 2015; Choi, B. Y. 等人, Neurobiol. Dis. 94: 205-212, 2016)。

另外，神经细胞损伤过程(例如锌神经毒性和兴奋毒性)伴随着ATP的减少和AMP的增加，使得清楚地显示由AMP激活的AMPK活性(Eom, J. W.等人, Mol. Brain. 9: 14,2016)。本发明人进行了研究，以鉴定在脑神经细胞损伤过程中与AMPK有关的细胞死亡机制，并在2016年在Molecular Brain (IF: 3.410)中报道了相关机制。此外，根据最近公开的一些研究的结果，已经报道了AMPK活性与神经变性疾病(例如痴呆、帕金森病、亨廷顿舞蹈病和多发性硬化)中的中枢神经系统的损伤和病理相关。因此，本发明人对基于AMPK的神经毒性机制进行了研究，基于AMPK的神经毒性机制对于代谢调节是最重要的。基于前述研究，本发明人对新型AMPK抑制剂的开发进行了研究，并筛选了新化合物以获得发现的AMPK抑制剂((Z)-5-((1H-吲哚-3-基)亚甲基)-2-((3-羟基苯基)氨基)噻唑-4(5H)-酮，命名为“1H10”，式II)，然后从研究药物的作用机制(MOA)中，本发明人报道了1H10通过调节细胞中游离锌的浓度，减少中风后由锌毒性、兴奋毒性和氧化损伤等引起的神经元细胞死亡(EomJ. W.等人, ACS Chem Neurosci. 10(5): 2345-2354, 2019, 图8)。

(式II)

本发明已显示，在诱导实验自身免疫脑脊髓炎(EAE) (一种多发性硬化的动物模型)后，1H10可以在各种水平下抑制疾病的发作。具体地，根据1H10治疗，行为实验显示优异的症状缓解作用，并且还抑制发病率。另外，确认脊髓的脱髓鞘化、免疫细胞活性降低，并且抑制免疫细胞向脱髓鞘化发展的区域的浸润。这些结果表明该作用与1H10化合物抑制AMPK活性的机制有关。此外，证实根据1H10治疗在脊髓白质中锌累积减少，从而抑制MMP-9并因此防止免疫细胞的累积，并观察到1H10可以直接作用于锌并螯合它。最后，证明即使在给药长达45天的长期EAE模型中，1H10的有效性也是优异的。

因此，本发明的基于AMPK抑制功能和锌稳态控制功能的用于治疗多发性硬化的药物组合物提供了新的治疗剂，其能够通过具有AMPK抑制和锌稳态控制功能的新型化合物的治疗来克服由多发性硬化引起的脊髓损伤和行为障碍。该新型药物可以在神经细胞损伤过程中作为锌螯合剂发挥作用，特别是，1H10可以作为锌离子载体(ionophore)以及锌螯合剂发挥作用，并因此可以开发为用于控制锌稳态的活性剂。

下文中，通过以下实施例和实验实施例更详细地描述本发明。然而，本发明不限于以下实施例和实验实施例，而是可以以各种不同的形式实施，并且提供以下实施例和实验实施例以完成本发明并将本发明的范围完全告知本领域技术人员。

一般方法

材料

本发明所用的实验动物是由Dae Han BioLink, Co., Ltd. (Korea)供应的8周龄C57BL/6雌性小鼠。这些小鼠在通过温度和湿度控制的环境中饲养，并且自由地喂养饲料和水。

培养大脑皮层神经元

本发明所用的小鼠皮层神经元从小鼠胚胎的脑中提取，并在补充有5%胎牛血清(FBS)和5%马血清(HS)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM, Gibco, Grand Island, NY,US)中，在95%湿度、5% CO₂和37℃的条件下培养。对于细胞的激活和分化，细胞在24孔组织培养板中生长至2×10⁴个细胞的密度，并在用锌和化合物处理之前在没有FBS和HS的MEM培养基中培养。

多发性硬化的动物模型的制造

本发明人通过在C57BL/6雌性小鼠中皮下注射髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白35-55(MOG35-55)肽抗原诱导实验自身免疫脑脊髓炎(EAE) (一种多发性硬化的动物模型) (图1A)。为此，首先制备MOG35-55 (Ana spec, USA)和完全弗氏佐剂(CFA)，并且将MOG35-55(2 mg/ml)溶解在磷酸盐缓冲盐水(1×PBS，Sigma)中，然后通过将25 ml不完全弗氏佐剂(IFA. Sigma)分配到50 ml锥形管中制备25 ml CFA。然后，在通风橱中，将结核分枝杆菌H37Ra (100 mg；Difco, USA)加入到IFA中以制备CFA并在涡旋后在使用前将其储存在冰箱中。然后，将MOG35-55和含有结核分枝杆菌H37Ra的CFA以相同量混合，并注射到小鼠的两侧中。然后在免疫当天和免疫后第二天腹膜内注射百日咳毒素(4 μg/ml，List BiologicalLaboratories, USA)。免疫后，每天测量小鼠体重和临床症状，并基于特定的临床症状评价EAE进展的程度。下面提供关于这一点的更多细节。

EAE临床症状评估

基于先前的研究评价EAE临床症状(Jones等人, J. Neuroimmunol. 199(1-2):83-93. 2008)。具体地说，为了评价EAE的临床症状，根据下列标准每天评价小鼠的行为。评分0，无症状；评分0.5，尾部部分麻痹或轻微的异常步态；评分1.0，完全或部分尾部麻痹和轻度后肢无力；评分1.5，完全尾部麻痹和轻度后肢无力；评分2.0，尾部麻痹和中度后肢无力(通过在笼上行走时频繁的失足证明)；评分2.5，后肢体重减轻但轻微运动；评分3.0，完全后肢麻痹；评分3.5，后肢麻痹和轻度前肢无力；评分4.0，四肢完全麻痹但头部移动；评分4.5，垂死；评分5.0，死亡。

甲酚紫染色

在EAE诱导后的第21天，本发明人用氨基甲酸乙酯麻醉小鼠，然后将4%多聚甲醛灌注到心脏中以固定脊髓。提取脊髓后，通过甲酚紫染色观察脊髓中单核细胞的浸润。为此，首先，将脊髓在低温恒温器中切成30 μm厚度以获得冷冻切片，然后放置在明胶包衣的载玻片上并在室温下干燥30分钟。在100%和70%乙醇溶液中依次各浸渍3分钟后，将它们在0.1%甲酚紫溶液中染色15分钟。然后，用自来水洗涤它们以去除过度染色的区域，在50%、70%、80%、90%和100%乙醇溶液中各自脱水3-5分钟，并且在二甲苯中各自经历两次透明过程15分钟后，将它们包埋并用光学显微镜观察。

免疫组织化学

在EAE诱导后的第21天，本发明人用氨基甲酸乙酯麻醉小鼠，然后将4%多聚甲醛灌注到心脏中以固定脊髓。然后，使用抗CD4、抗CD8和抗CD20抗体作为T细胞的标记进行免疫组织化学。将冷冻切片与3%过氧化氢在室温下反应15分钟以去除内源过氧化物酶，然后与一抗大鼠抗CD4 (1:50，BD Bioscience, CA, USA)、抗CD8 (1:50，BD Bioscience)和山羊抗CD20 (1:50，SantaCruz Biotechnology, USA)抗体在4℃下反应15小时。然后将其与生物素化的抗大鼠IgG或抗山羊IgG (1:250，Vector Laboratories, USA)在室温下反应2小时。然后，将其与抗生物素蛋白-生物素过氧化物酶缀合物(ABC试剂, VectorLaboratories)在室温下反应2小时，并将组织在3,3'-二氨基联苯胺(DAB, VectorLaboratories)溶液中着色。另外，为了测量EAE引起的血脑屏障损伤，证实血清中免疫球蛋白G (IgG)的渗漏。IgG是血浆中最丰富的免疫球蛋白，并且易于识别，因此脊髓中IgG的存在用于监测血脑屏障的损伤和蛋白质的外渗(Ruth和Feinerman, Acta Neuropathol. 76(4): 380-387, 1988)。然后，冷冻切片与生物素化的马抗小鼠IgG (1:250，VectorLaboratories, USA)在室温下反应2小时，然后与ABC试剂以与上述相同的方式反应，然后用DAB溶液着色。在各步骤之间，用PBS充分洗涤，并且分别用乙醇和二甲苯进行脱水和透明过程后，将其包埋，并用光学显微镜观察。Image J程序(National Institute of Health,USA)用于分析。

免疫荧光染色

在EAE诱导后的第21天，本发明人用氨基甲酸乙酯麻醉小鼠，然后将4%多聚甲醛灌注到心脏中以固定脊髓。提取脊髓后，为了检查组织的脱髓鞘化和小胶质细胞/巨噬细胞的活性、细胞/巨噬细胞活性，用抗髓磷脂碱性蛋白(MBP)和抗F4/80 (小胶质细胞/巨噬细胞)抗体进行免疫荧光染色。此外，针对电离的钙结合衔接分子-1 (Iba-1)和抗CD68 (分化簇68)的抗体用作小胶质细胞/巨噬细胞的标志物，以分析受损脊髓的白质部分中强激活的小胶质细胞/巨噬细胞的表型。使用针对CD8和基质金属蛋白酶9 (MMP-9)的抗体进行双免疫荧光染色，以研究AMP-激活的蛋白激酶(AMPK)活性如何影响这些细胞的存活。此外，使用抗CD8和抗磷酸-AMPK抗体进行双免疫荧光染色以确定AMP激活的蛋白激酶(AMPK)活性如何影响这些细胞在浸润脊髓的T细胞中的存活。为了比较和分析(MMP-9)的活性，使用抗MMP-9抗体进行免疫荧光染色。为了检查脊髓中星形胶质细胞的活性，用抗神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体进行免疫荧光染色。为了比较和分析细胞因子(例如肿瘤坏死因子(TNF)α和干扰素(IFN)γ)的表达，使用抗TNF-α和抗IFNγ抗体进行双免疫荧光染色。采用与上述免疫组织化学方法相同的方式，冷冻切片与3%过氧化氢在室温下反应15分钟以去除内源过氧化物酶，然后将其与一抗大鼠抗MBP (1:200，Abcam，UK)、抗F4/80 (1:100，eBioscience,USA)、山羊抗Iba1 (1:500，Abcam)、抗CD68 (1:100，Bio-Rad Laboratories, USA)、抗CD8(1:50，BD Bioscience)、抗p-AMPK (1:100，Abcam)、抗MMP-9 (1:100，Abcam)、抗GFAP (1:500，Abcam)、抗IFNγ (1:100，Invitrogen, USA)、抗TNFα (1:250，Abcam)抗体在4℃下反应15小时。然后将其与适于各一抗宿主的Alexa Fluor 488、594、647-缀合的二抗(1:250，Invitrogen, USA)在室温反应2小时。在每个步骤之间，用PBS彻底洗涤，并且在使用二甲苯的透明过程后，用DPX包埋，并用共聚焦激光扫描显微镜(Carl Zeiss LSM710, Germany)观察，使用Image J程序(NIH, USA)分析3-5个视野/小鼠的图像。

锌染色(TSQ)

在EAE诱导的小鼠中评价临床症状后，本发明人通过N-(6-甲氧基8喹啉基)对甲苯磺酰胺(TSQ)组织化学方法(一种锌染色方法)检查脊髓组织。在正常脊髓中，锌存在于灰质的轴突末梢，并且在白质中仅观察到非常少量的锌。在EAE诱导后的第21天，用5%异氟烷麻醉小鼠，并且不灌注而去除脊髓，并用干冰快速冷却。在-15℃的低温恒温器中将未固定的冷冻的组织切成20 μm厚度的切片，以获得冷冻切片。立即将冷冻切片放置在明胶包衣的载玻片上，在室温下干燥30分钟，在TSQ溶液中浸渍60秒，然后用0.9%盐水冲洗60秒。使用Olympus IX70荧光显微镜以360 nm/490 nm的波长观察TSQ荧光，并使用INFINITY3-1 CCD-冷却的数码彩色照相机(Lumenera Co., Canada)和INFINITY分析软件进行评价。

锌螯合

本发明人采用FluoZin-3处理(如果FluoZin-3结合培养神经元的游离锌，则其发射荧光)以验证根据本发明的实施方案根据1H10 {(Z)-5-((1H-吲哚-3-基)亚甲基)-2-((3-羟基苯基)氨基)噻唑-4(5H)酮}的治疗的锌螯合的可能性，然后在暴露锌(300 μM) 15分钟并去除锌之后，测量神经元中胞质锌水平60分钟。此外，将20 μM锌(ZnCl₂)和NewPortGreen DCF荧光团(当其与锌结合时发射荧光)加入到试管中，并用不同浓度的本发明的1H10进行处理。氯碘羟喹(一种锌螯合剂)和钙离子载体磷离子霉素用作对照。

实验实施例1：动物模型中的临床体征和发病率

根据本发明的实施方案，作为诱导自身免疫脑脊髓炎(多发性硬化的动物模型)的结果，在小鼠中发生严重的行为障碍，但是在给予本发明的1H10的实验组中，显著抑制行为障碍(图1B和1C)。另外，作为评价EAE小鼠的临床症状的结果，观察到在给予1H10的实验组中，不仅临床症状而且发病率也被抑制(图1C)。

这些结果表明，本发明的1H10改善髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白35-55 (MOG35-55)诱导的EAE的临床体征和疾病进展(图1D)。

实验实施例2：小胶质细胞/巨噬细胞的活性

本发明人通过免疫荧光染色研究了脊髓中的脱髓鞘化和小胶质细胞/巨噬细胞的活性。结果证实，在EAE小鼠的组织中，脊髓白质的绿色信号减少，其在正常组织中应染成绿色，并且强烈地显示指示小胶质细胞/巨噬细胞活性的红色(图2A)。MBP的减少意味着覆盖神经轴突的髓磷脂被损伤(图2C)。然而，在连续给予1H10的动物的脊髓中，EAE诱导的脱髓鞘化和小胶质细胞/巨噬细胞的活性显著降低(图2C)。

此外，作为进行用于小胶质细胞/巨噬细胞的表型分析的双免疫荧光染色的结果，同时表达Iba-1和CD68意味着激活的M1型小胶质细胞/巨噬细胞(图2D)，并且证实了在EAE诱导后给予1H10的组中激活的M1型小胶质细胞/巨噬细胞显著减少(图2E至2H)。

实验实施例3：星形胶质细胞的活性

本发明人通过免疫荧光染色研究了脊髓组织中星形胶质细胞的活性。结果证实，指示星形胶质细胞活性的绿色强烈分布于EAE诱导的实验组的脊髓白质中，而星形胶质细胞的活性在给予1H10的实验组中被显著抑制(图17和18)。

实验实施例4：AMPK磷酸化和EAE诱导的免疫细胞浸润

本发明人通过甲酚紫染色研究了在诱导EAE小鼠后第21天小鼠脊髓中单核细胞的浸润。

结果证实，在给予1H10的实验组中单核细胞浸润被显著抑制，而在EAE诱导后，在仅用媒介物治疗的小鼠的脊髓白质中分布大量单核细胞(图3A和3B)。此外，作为使用抗CD4、抗CD8和抗CD20抗体进行免疫组织化学以证实浸润到脊髓中的单核细胞是免疫细胞的假设的结果，观察到在EAE诱导后，T细胞和B细胞的浸润在给予1H10的实验组中被显著抑制，而在仅给予媒介物的实验组中，许多CD4、CD8和CD20⁺细胞分布在脊髓白质周围(图3C至3E)。另外，根据最近的报道，已知AMPK活性增强T细胞的存活。观察AMPK活性的结果是，EAE诱导后浸润到脊髓中的CD8⁺T细胞中AMPK的磷酸化增加，但是观察到在给予1H10的实验组中其显著降低(图3F至3H)。上述结果表明本发明的1H10对AMPK的抑制可以通过降低浸润到脊髓中的自身反应性T细胞的存活来缓解EAE的症状。

实验实施例5：细胞因子的表达

本发明人通过免疫荧光染色研究了在诱导EAE后第21天小鼠脊髓中细胞因子中IFNγ和TNFα的表达。结果是，观察到与仅给予媒介物的组相比，在EAE诱导后给予1H10的实验组中，在脊髓白质中IFNγ的表达增加，而TNFα的表达降低(图19和20)。

实验实施例6：锌的异常累积，BBB的损伤和MMP-9的活性

本发明人研究了通过给予1H10，EAE诱导的锌在脊髓白质中的异常累积、血脑屏障(BBB)的损伤和MMP-9的活性。

结果是，在正常组织的白质中没有观察到由于TSQ染色引起的信号，但是在EAE诱导后第21天进行TSQ染色的结果是，在脊髓的白质区域中观察到异常的“斑点状”荧光。在正常动物或没有EAE诱导的媒介物给药的动物的脊髓中没有观察到上述模式，并且证实了通过给予1H10斑点状TSQ异常染色显著降低(图4A和4B)。另外，据报道，在EAE诱导后，MMP-9的活性增加，从而T细胞、B细胞和其它免疫细胞由于BBB的损伤而浸润到中枢神经系统中，而免疫细胞浸润可能通过干扰中枢神经系统的免疫系统而破坏髓鞘。基于先前的研究，本发明人进行了免疫球蛋白G (IgG)渗漏的组织学分析，并测量MMP-9活性以观察BBB损伤。结果是，在仅给予媒介物的小鼠或给予1H10的小鼠(假手术组)中，在白质或灰质中没有检测到由于BBB损伤引起的IgG染色。然而，在MOG注射后3周的小鼠中，IgG浸润在白质和灰质两者中都显著增加，并且这种现象通过给予1H10而显著减少(图4C至4E)。另外，由于锌使MMP-9的活性增加，认为在白质中观察到的锌增加与MMP-9活性增加彼此密切相关。证实了与仅给予媒介物的对照组相比，给予1H10的实验组中MMP-9在脊髓白质中的活性被抑制(图4F和4G)。

实验实施例7：验证锌的稳态调节

作为使用FluoZin-3 (一种结合游离锌时发射荧光的材料)验证根据1H10治疗的锌螯合的可能性的结果，证实在给予1H10的实验组中细胞内锌水平的增加显著降低(图5A)。另外，在试管中使各种浓度(0、0.5、1、2、5、10、20、40 μM)的1H10或氯碘羟喹与1 μM锌和5 μM荧光标记的游离锌药物(FluoZin-3)反应后，测量荧光值。每种药物的IC₅₀值确定为4.234 μM和10.06 μM，但最终氯碘羟喹的FluoZin-3荧光值较低。本发明的1H10即使在比氯碘羟喹更低的浓度也结合锌，但在高浓度时，锌结合强度被认为低于氯碘羟喹(图5B)。上述结果表明本发明的1H10可以通过直接结合锌调节神经元中的锌稳态以及AMPK抑制活性。

实验实施例8：长期保护作用

在小鼠中诱导EAE后，本发明人在整个期间内每天一次腹膜内给予实验动物1H10，然后在初始免疫后45天处死小鼠以研究临床症状和发病率(图6A)。观察到在给予1H10的实验组中临床症状和发病率显著降低(图6B至6D)。这证明给予1H10不仅在急性期(21天)而且在慢性期(45天)有效缓解长期EAE的症状。

实验实施例9：类似化合物的研究和对锌毒性的抑制作用的研究

根据本发明的实施方案，基于本发明的1H10的结构相似性，从化合物库制造商(InterBioscreen, Russia; Akos, Germany)购买25种具有相似结构的相似化合物。然后，为了诱导培养的小鼠的皮层神经元中的锌毒性，用ZnCl₂ (400 μM)处理10分钟，并且12.5小时后，用选择的25种化合物和先前选择的药物1H10 (20 μM)进行治疗，并通过细胞活力测定(Cell Counting Kit-8, Dojindo)确定细胞死亡是否被抑制。

结果是，在上述治疗的25种新化合物中，8种药物(4B01、4B04、4B08、4C01、4C03、4C04、4C06、4C08)显示神经保护作用(图9)。所选的25种化合物的名称和结构示于下表1中。

表1

实验实施例10：氧化应激的分析

本发明人研究了上述实施例的8种药物和1H10对除锌毒性外的氧化应激的抑制作用。具体地，通过分别用H₂O₂ (100 μM)和FeCl₂ (100 μM)处理小鼠皮层神经元约4小时和20小时，氧化损伤诱导神经毒性，并用8种选择的药物和1H10 (20 μM)治疗。然后，通过LDH(乳酸脱氢酶)分析观察细胞毒性。

结果是，发现除4C06和4C08之外的6种药物(4B01、4B04、4B08、4C01、4C03、4C04)显著抑制H₂O₂毒性(图10)。此外，作为对于4C06和4C08证实除了H₂O₂之外的铁引起的氧化损伤的结果，发现4C08抑制铁引起的氧化损伤(图11)。

实验实施例11：兴奋毒性分析

本发明人研究了上述实施例的8种药物和1H10对兴奋毒性的抑制作用。具体地，通过在小鼠皮层神经元中用NMDA (N-甲基-D-天冬氨酸，50 μM)处理3小时诱导兴奋毒性。兴奋毒性的观察结果是，除了4B04和4C06之外，6种药物(4B01、4B08、4C01、4C03、4C04、4C08)显著抑制NMDA引起的兴奋毒性(图12)。

实验实施例12：细胞凋亡分析

本发明人研究了上述实施例的8种药物和1H10对神经元细胞死亡的抑制作用。具体地，通过在小鼠皮层神经元中用依托泊苷(ETPS，10 μM)处理20小时，诱导细胞凋亡引起的神经毒性。然后，用选择的8种药物和1H10进行治疗(20 μM)，并观察LDH细胞毒性。结果是，除了4B04、4C03和4C04之外，5种药物(4B01、4B08、4C01、4C06、4C08)显示对ETPS毒性的显著抑制作用(图13)。

实验实施例13：锌结合分析

本发明人对上述实施例的25种化合物和1H10进行了锌结合测定。具体地，在试管中使用锌(20 μM)和锌荧光示踪剂Newport green DCF (0.1μM，Kd (Zn)=1μM)以及1H10和25种化合物(各20 μM)测量化合物与锌的自由结合程度。此时，氯碘羟喹(一种锌螯合剂)和离子霉素(一种钙离子载体)用作对照(各20 μM)。结果证实，除了离子霉素之外的所有化合物都能够与锌结合(图14)。

实验实施例14：AMPKα2抑制活性

本发明人通过KinaseProfiler^TM Service (Eurofins, UK)测量依赖于1H10和25种化合物(分别为10 μM)和公知的AMPK抑制剂化合物C (CC，10 μM)的治疗的重组AMPKα2酶活性。结果是，4A06、4B02、4C04、4C05、4C06、4C08和4D01表现出与1H10相似的AMPK抑制作用(图15)。

实验实施例15：固有毒性分析

本发明人对4种药物(4B01、4B08、4C01、4C08)进行了固有毒性分析，显示对所有细胞毒性(锌毒性、氧化损伤、兴奋毒性、细胞凋亡)的共同保护作用，并与1H10进行了比较。具体地，在小鼠皮层神经元培养物中用40 μM的每种药物进行治疗，并在24小时或48小时后观察LDH细胞毒性。

结果证实，1H10在药物治疗24小时后的固有毒性为7.81±2.77%，并且在药物治疗48小时后的固有毒性为60.72±8.28%，但4B01在药物治疗48小时后的固有毒性比1H10更强。此外，4B08和4C01显示的固有毒性与1H10没有显著差异，但4C08直到药物治疗48小时才显示固有毒性(图16)。

总之，根据本发明的实施方案的化合物对各种毒性机制(例如与常规多发性硬化相关的兴奋毒性、氧化应激、细胞凋亡和锌神经毒性)具有保护作用。另外，证明通过锌螯合降低MMP-9活性，通过防止免疫细胞在脊髓白质中的浸润和累积从而减少自身免疫应答，可以抑制多发性硬化疾病的发生。因此，本发明的1H10可以用于开发可以替代类固醇和免疫抑制剂的药物并控制根本问题，所述类固醇和免疫抑制剂由于长期给药而具有严重副作用。

尽管已经参考上述实施例和实验实施例描述了本发明，但这些仅仅是示例性的，并且本领域普通技术人员可以理解，可以由其进行各种修改和等同的其它实施例和实验实施例。因此，本发明的真实范围应当由所附权利要求的技术精神来确定。