KR20160060137A

KR20160060137A - Ampk 활성화 화합물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20160060137A
Application number: KR1020167010883A
Authority: KR
Inventors: 젠-이 치오; 한-민 첸; 쳉-이 쿠오; 지운-차이 린; 천-팡 황
Original assignee: 에너지네시스 바이오메디컬 컴퍼니 리미티드
Priority date: 2013-09-26
Filing date: 2013-09-26
Publication date: 2016-05-27
Also published as: CA3112114A1; AU2013401767B2; CA2925511C; CA3112089A1; AU2020244377A1; IL244752A0; MY182801A; KR102101465B1; CA3112108C; KR102221723B1; JP6254263B2; AU2013401767A1; CA3112089C; AU2019203668B2; DK3050567T3; AU2019203668A1; JP2016531855A; KR20200041392A; PL3050567T3; WO2015042821A1

Abstract

본 개시내용은 아데닌 및/또는 그의 제약상 허용되는 염인 것인, AMPK를 활성화시키기 위한 화합물을 개시한다. 본 개시내용은 또한 상기 화합물의 용도를 개시한다. 상기 화합물은 AMP-활성화된 단백질 키나제 (AMPK)를 활성화시키는 데 유용하고, 상기 화합물은 병증 또는 질환의 예방 또는 치료에 사용되고, 이로써, 포유동물에서 AMPK에 의해 개선될 수 있는 병증 또는 질환을 예방 또는 치료한다.

Description

AMPK 활성화 화합물 및 이의 용도{COMPOUND FOR ACTIVATING AMPK AND USES THEREOF}

본 개시내용은 AMPK (AMP-활성화된 단백질 키나제)를 활성화시키는 데 유용한 아데닌, 및 병증 또는 질환 예방 또는 치료에서의 상기 화합물의 용도에 관한 것이다.

AMPK는 세포 에너지 센서 및 에너지 요구에 대한 반응자이다. AMPK는 촉매성 α서브유니트 및 조절성 β, γ서브유니트로 이루어진 이종삼량체이다. 상기 서브유니트들은 모두 진핵 생물에서 고도로 보존된다. AMPK의 활성화는 상류 키나제, 예컨대, LKB1, Ca2+/칼모듈린 의존성 키나제, 및 TAK1에 의한 α서브유니트의 보존되는 172번째 트레오닌 잔기 상의 인산화를 통해 이루어진다. 생리학적 또는 병적 스트레스에 의해 유발된 높은 AMP/ATP 비율이 AMPK를 활성화시킨다. 활성화시, AMPK는 이화작용 경로를 활성화시키고, 동화 작용을 억제시켜 이 기간에 ATP 소비는 감소시키고, ATP 생성은 촉진시킴으로써 세포 에너지 균형이 회복된다.

에너지 항상성의 조절 인자로서 AMPK는 2형 당뇨병, 심혈관 질환, 및 지방간 질환을 비롯한, 대사 증후군에 대한 잠재적인 약물 표적으로서 제안되어 왔다. 다수의 대사 증후군은 인슐린 저항성과 연관되어 있다. 인슐린 저항성은, 세포가 인슐린에 대해 반응하지 못함에 따라, 혈류 중 과량의 글루코스가 골격근 또는 지방 조직으로 제거될 수 없는 병적 상태이다. AMPK의 활성화는 전사 조절을 통해 글루코스 수송체인 GLUT4의 단백질 수준을 증가시키고, 인슐린 비의존적 방식으로 근육 세포에서 GLUT4의 원형질막으로의 전위를 유도하여 세포 글루코스 흡수율을 증가시킨다. AMPK의 활성화는 또한 각각 아세틸-CoA 카르복실라제 및 HMG-CoA 리덕타제를 억제시킴으로써 지방산 및 클레스테롤 합성을 억제시킨다. 추가로, AMPK가 활성화되면, 이를 통해 SREBP-1c, ChREBP 및 HNF-4a를 비롯한 수개의 전사 인자는 억제되고, 지방산 합성 및 글루코스 신생 합성에 주로 관여하는 효소의 발현은 하향조절된다. 이러한 관찰 결과는 AMPK가 대사 증후군, 특히, 당뇨병 치료에서 최상의 표적이 된다는 의견을 지지한다.

에너지 항상성 조절 이외에도, AMPK는 염증, 세포 성장, 아포프토시스, 자가포식 작용, 노화 및 분화를 비롯한, 수개의 세포 기전을 조정하는 데 연루되어 있다. 광범위한 연구를 통해 AMPK가 염증의 억제 인자라는 것이 입증되었다. AMPK의 활성화는 NF-κB 신호전달을 억제시킴으로써 염증을 억제시킬 수 있다. NF-κB 신호전달은 선천 및 적응 면역을 활성화시키는 주경로이다. AMPK의 활성화는 간접적으로 SIRT1, 포크헤드 박스 O (FoxO) 패밀리 또는 퍼옥시좀 증식 인자-활성화된 수용체 보조활성인자 1α (PGC1α)를 자극시킴으로써 NF-κB 전사 활성을 억제시킬 수 있다. AMPK의 활성화가 사이클로옥시게나제-2 (COX-2)의 단백질 발현을 억제시킨다는 것 또한 여러 그룹을 통해서 입증되었다. COX-2는 전염증성 (pro-inflammatory) 시토카인 및 성장 인자에 의해 제어되는 유도성 효소이다. COX-2는 아라키돈산을 프로스타글란딘으로 전환시킴으로써 염증 및 통증을 유발한다. COX-2 활성 또는 발현 억제가 항염증과 연관되어 왔다.

수개의 AMPK 활성인자는 생체내에서 항염증성 기능을 가지는 것으로 입증되었다. 예를 들어, 5-아미노이미다졸-4-카르복스아미드 리보뉴클레오시드 (AICAR)는 2,4,6-트리니트로벤젠 술폰산 (TNBS) 또는 덱스트란 황산나트륨에 의해 유도된 급성 및 재발성 결장염 마우스 모델을 개선시킨 것으로 나타났다. AICAR 처리된 마우스는 감소된 체중 손실 및 염증의 현저한 약화를 보였다. AICAR은 또한 다발성 경화증의 동물 모델인 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE)을 치료하는 데 있어 치료학적 효과를 보였고, 이는 마우스에서 LPS 유도성 폐 손상의 중증도를 감소시킨다.

세포성 신호전달 경로의 조절장애는 비정상적인 세포 성장, 및 결국에는 암을 유도할 수 있다. 라파마이산의 포유동물 표적 (mTOR)은 세포 증식 및 자가포식 작용을 조절하는 세린/트레오닌 키나제이다. 다수의 상이한 암에서는 mTOR 신호전달 경로의 활성의 조절장애가 일어나고, 이로써, mTOR 억제제가 암 요법을 위한 잠재적인 약물인 것으로 간주된다. AMPK는 결절성 경화증 복합체 2 (TSC2) 및 랍터를 인산화시켜 mTOR 경로를 억제시킨다는 것을 입증한 광범위한 연구들이 존재한다. AICAR, 메트포르민, 펜포르민을 비롯한 다양한 AMPK 활성인자 또한 mTOR 신호전달을 억제시키고, 암 세포 성장을 억제시키는 것으로 입증되었다. 추가로, AMPK의 활성화는 mTORC1 활성을 억제시킴으로써 자가포식 작용을 유도한다. AMPK에 의한 mTORC1의 억제에 기인하여 Ser⁷⁵⁷ 상의 Ulk1의 인산화는 감소되고, 이어서, Ser³¹⁷　및 Ser⁷⁷⁷ 상의 Ulk1은 AMPK에 의해 인산화될 수 있다. AMPK 인산화된 Ulk1은 활성을 띠고, 이어서, 자가포식 작용을 개시한다.

상기 언급된 내용에 기초하여, AMPK는 염증성 질환, 상처 치유, 신경퇴행, 암, 산화 스트레스 및 심혈관 질환을 비롯한 다수의 인간 질환 또는 병적 상태에서 우수한 표적이 되는 것으로 제안되었다. 실제로, AMPK 활성인자는 박테리아성 및 진균성 질환, 행동 및 정신 장애, 혈액 및 림프 병증, 암 및 다른 신생물, 소화계 질환, 출생시 또는 출생 전 질환 및 이상, 귀, 코, 및 목구멍 질환, 눈 질환, 샘 및 호르몬 관련 질환, 심장 및 혈액 질환, 면역계 질환, 구강 및 치아 질환, 근육, 뼈, 및 연골 질환, 신경계 질환, 영양성 및 대사 질환, 직업병, 기생충에 의한 질환, 기도 질환, 피부 및 결합 조직 질환, 상처 치유 등을 비롯한, 적어도 24개의 질환 카테고리에서 임상 시험을 위해 적용되어 왔다.

본 개시내용은 신규한 AMPK 활성 인자인 아데닌, 및 질환 예방 또는 치료를 위한 상기 화합물의 용도를 제공한다.

본 개시내용은 아데닌 및/또는 그의 제약상 허용되는 염인, AMPK를 활성화시키기 위한 화합물을 제공한다.

상기 화합물은 AMPK 활성인자에 의해 개선될 수 있는 질환 또는 병증을 치료하고, 여기서, 아데닌 및/또는 그의 제약상 허용되는 염은 상기 치료를 필요로 하는 포유동물에게 투여된다.

상기 화합물은 세포에서 전염증성 시토카인 분비 및 COX-2 발현을 감소시키고, 이로써, 염증성 병증 또는 질환을 치료하고, 여기서, 아데닌 및/또는 그의 제약상 허용되는 염은 상기 치료를 필요로 하는 포유동물에게 투여된다.

상기 화합물은 세포 내로의 글루코스 흡수를 증가시키고, 이로써, 당뇨병전기 (pre-diabetes), 2형 당뇨병, 대사 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택되는 병증 또는 질환을 예방 또는 치료하고, 여기서, 아데닌 및/또는 그의 제약상 허용되는 염은 상기와 같은 처치를 필요로 하는 포유동물에게 투여된다.

상기 화합물은 포유동물에서 혈장 트리글리세리드를 감소시키고, 체중을 감소시키고, 이로써, 비만의 병증을 예방 또는 치료하고, 여기서, 아데닌 및/또는 그의 제약상 허용되는 염은 상기와 같은 처치를 필요로 하는 포유동물에게 투여된다.

상기 화합물은 세포에서 아밀로이드 β 펩티드 축적을 억제시키고, 이로써, 알츠하이머병을 예방 또는 치료하고, 여기서, 아데닌 및/또는 그의 제약상 허용되는 염은 상기와 같은 처치를 필요로 하는 포유동물에게 투여된다.

상기 화합물은 세포에서 자가포식 작용 활성을 증진시키고, 이로써, 자가포식 작용에 의해 개선될 수 있는 질환 또는 병증을 치료하고, 여기서, 아데닌 및/또는 그의 제약상 허용되는 염은 상기 치료를 필요로 하는 포유동물에게 투여된다.

상기 화합물은 섬유모세포 증식을 억제시키고, 이로써, 상처 치유 동안의 흉터 형성을 예방하고, 여기서, 아데닌 및/또는 그의 제약상 허용되는 염은 상기와 같은 처치를 필요로 하는 포유동물에게 투여된다.

상기 화합물은 상처 치유를 증진시키고, 여기서, 아데닌 및/또는 그의 제약상 허용되는 염은 상기와 같은 처치를 필요로 하는 포유동물에게 투여된다.

상기 화합물은 세포에서 ROS 생산을 억제시키고, 이로써, 포유동물에서 ROS 손상으로부터 세포를 보호 및 치료하고, 여기서, 아데닌 및/또는 그의 제약상 허용되는 염은 상기 처치를 필요로 하는 포유동물에게 투여된다.

상기 화합물은 암 세포 증식을 억제시키고, 이로써, 암을 예방 또는 치료하고, 여기서, 아데닌 및/또는 그의 제약상 허용되는 염은 상기와 같은 처치를 필요로 하는 포유동물에게 투여된다.

본 개시내용은 AMPK 활성인자에 의해 개선될 수 있는 질환 또는 병증 치료용 의약 제조를 위해 사용하기 위한 상기 화합물을 제공한다.

본 개시내용은 염증성 병증 또는 질환 치료용 의약 제조를 위해 사용하기 위한 상기 화합물을 제공한다.

본 개시내용은 당뇨병전기, 2형 당뇨병, 대사 증후군 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 병증 또는 질환 예방 또는 치료용 의약 제조를 위해 사용하기 위한 상기 화합물을 제공한다.

본 개시내용은 알츠하이머병 예방 또는 치료용 의약 제조를 위해 사용하기 위한 상기 화합물을 제공한다.

본 개시내용은 자가포식 작용에 의해 개선될 수 있는 질환 또는 병증 치료용 의약 제조를 위해 사용하기 위한 상기 화합물을 제공한다.

본 개시내용은 상처 치유 동안의 흉터 형성 예방용 의약 제조를 위해 사용하기 위한 상기 화합물을 제공한다.

본 개시내용은 ROS 손상으로부터의 세포 보호 및 치료용 의약 제조를 위해 사용하기 위한 상기 화합물을 제공한다.

본 개시내용은 암 예방 또는 치료용 의약 제조를 위해 사용하기 위한 상기 화합물을 제공한다.

상기 언급된 내용에 기초하여, 본 개시내용의 한 실시양태에 따라, 세포에서 AMPK를 활성화시키고, 이로써, 포유동물에서 AMPK에 의해 개선될 수 있는 병증 또는 질환을 예방 또는 치료하기 위한 신규한 AMPK 활성 인자인 아데닌을 제공한다.

본 개시내용의 한 실시양태에 따라, 대사 증후군, 2형 당뇨병, 인슐린 저항성을 비롯한 질환 예방 또는 치료를 필요로 하는 포유동물에게 유효량의 아데닌 및/또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것인, 세포에서 AMPK를 활성화시켜 혈중 글루코스를 감소시키고, 이로써, 대사 증후군, 2형 당뇨병, 인슐린 저항성을 비롯한 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 개시내용의 한 실시양태에 따라, 염증성 병증 또는 질환 치료를 필요로 하는 포유동물에게 유효량의 아데닌 및/또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것인, 세포에서 AMPK를 활성화시켜 항-염증을 유도하고, 이로써, 염증성 병증 또는 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

본 개시내용의 한 실시양태에 따라, AMPK를 활성화시켜 섬유모세포 증식을 억제시키고, 이로써, 상처 치유 동안의 흉터 형성을 예방하는 방법을 제공한다.

본 개시내용의 한 실시양태에 따라, 상처 치유 증진을 필요로 하는 포유동물에게 유효량의 아데닌 및/또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것인, 상처 치유를 증진시키는 방법을 제공한다.

본 개시내용의 한 실시양태에 따라, ROS 손상으로부터의 세포의 보호 및 치료를 필요로 하는 포유동물에게 유효량의 아데닌 및/또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것인, 세포에서 ROS 생산을 억제시키고, 이로써, 포유동물에서 세포를 ROS 손상으로부터 보호 및 치료하는 방법을 제공한다.

본 개시내용의 한 실시양태에 따라, 암 예방 또는 치료를 필요로 하는 포유동물에게 유효량의 아데닌 및/또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것인, 암 세포 증식을 억제시키고, 이로써, 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 개시내용은 AMPK를 활성화시키는 데 유용한 아데닌, 및 당뇨병전기, 인슐린 저항성, 2형 당뇨병, 대사 증후군, 비만, 염증, 상처 치유, 알츠하이머병, 암, 산화 스트레스 및 심혈관 질환을 비롯한 질환의 예방 또는 치료에서의 아데닌의 용도에 관한 것이다.

본 발명자들은 아데닌이 신규한 AMPK 활성 인자이며, 다양한 생물학적 기능을 가진다는 것을 발견하게 되었다. 최근, AMPK의 활성화는 질환, 예컨대, 당뇨병전기, 인슐린 저항성, 2형 당뇨병, 대사 증후군, 비만, 염증, 알츠하이머병, 암, 산화 스트레스 및 심혈관 질환을 예방 및 치료하는 데 유익할 뿐만 아니라, 상처 치유를 증진시키는 데에도 유익한 것으로 밝혀졌다. 본 발명자들은 상기와 같은 효과는, 제한하는 것은 아니지만, COX-2를 감소시키고, ROS를 생산하고, 글루코스 흡수를 증가시키는 결과를 유도하는 AMPK의 활성화에 기인하는 것일 수 있다고 고려한다.

고려되는 적응증

본 발명자들의 발견에 기초하여 (하기 실시예 참조), 아데닌은 AMPK를 활성화시키는 것을 통한 다양한 병증 또는 질환용 치료제로서 사용될 수 있다고 고려된다. 하기는 고려되는 적응증에 관한 예시적인 지침 및 증거를 제공한다.

고혈당증 , 당뇨병전기 , 인슐린 저항성, 및 2형 당뇨병 치료에서의 아데닌

최근 메트포르민, A769662, AICAR을 비롯한 AMPK 활성인자가 당뇨병 또는 비만 마우스 모델에서 혈장 글루코스를 감소시켰다고 보고되었다. 본 개시내용에서, 1 μM-600 μM의 아데닌은 C2C12 근육 세포의 글루코스 흡수를 유의적으로 증가시켰다 (하기 표 2). 아데닌이 혈장 글루코스 수준 조정에 미치는 효과를 추가로 평가하기 위해, 고지방 식이를 섭취한 마우스를 2형 당뇨병 동물 모델로서 제공하였다. 고지방 식이를 섭취한 마우스를 아데닌으로 만성 처리한 결과, 대조군 마우스와 비교하였을 때, 혈장 글루코스는 30% 초과만큼 유의적으로 감소되었고, 혈장 트리아실글리세리드는 35% 초과만큼 유의적으로 감소되었다. 체중이 15% 초과만큼 감소된 것 또한 관찰되었다 (실시예 3). 본원에서 사용되는 바, "고혈당증"이란, 혈당이 126 mg/dL 초과인 것을 특징으로 하는 생리학적 병증을 의미한다. 본원에서 사용되는 바, "당뇨병전기"란, 공복시 혈당이 100 mg/dL 초과이지만, 140 mg/dL 미만인 것을 특징으로 하는 생리학적 병증을 의미한다. 본원에서 사용되는 바, "인슐린 저항성"이란, 간, 골격근, 지방 조직을 비롯한 전신 또는 조직이 인슐린에 대해 반응하지 못하는 생리학적 병증을 의미한다. 본원에서 사용되는 바, "2형 당뇨병"은 또한 비인슐린-의존성 당뇨병 (NIDDM) 또는 성인 발병형 당뇨병을 지칭한다. 이는 흔히 공복시 글루코스가 140 mg/dL 초과인 것으로 나타나는, 불충분한 인슐린 생산 또는 인슐린 저항성에 의해 유발되는 대사 장애를 의미한다. 실시예에 따라, 아데닌는 글루코스 흡수를 가속화시키는 것으로 나타났고, 그러므로, 높은 혈중 글루코스와 관련된 병증 또는 질환에 대하여 유용한 치료법인 것으로 제안되었다.

염증 치료에서의 아데닌

다양한 AMPK 활성인자는 생체내에서 항염증성 기능을 갖는 것으로 입증되었다. 예를 들어, 2,4,6-트리니트로벤젠 술폰산 (TNBS) 또는 덱스트란 황산나트륨으로 처리된 마우스를 5-아미노이미다졸-4-카르복스아미드 리보뉴클레오시드 (AICAR)로 매일 처리할 때, 체중 손실을 감소시키고, 염증을 현저히 약화시킴으로써 급성 및 재발성 결장염을 개선시킨다. AICAR 처리는 다발성 경화증의 동물 모델인 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE)에서 치료학적 효과를 보였다. 마우스에게 AICAR을 처리한 결과, LPS 유도성 폐 손상의 중증도는 감소되었다. 본 개시내용에서, 아데닌은 생체내에서 LPS 유도성 염증을 억제시킨다: LPS 자극하에서 TNFα, IL-1β 및 IL-6을 비롯한 전염증성 시토카인의 분비 수준은 대조군 세포와 비교하였을 때 아데닌 처리된 대식세포에서 유의적으로 감소되었다. 아데닌은 또한 인간 대식세포에서 LPS에 의해 유도된 COX-2 발현을 감소시켰다 (실시예 4). TNBS 유도성 염증성 장 질환 (IBD) 마우스 모델에서, 아데닌으로 만성적으로 처리한 결과, 대조군 마우스와 비교하였을 때, 결장에서 TNF, INFγ 및 IL-17을 비롯한 전염증성 시토카인을 유의적으로 감소시켰고, 상기 마우스에서 체중 손실을 구제하였다 (실시예 5).

본원에서 사용되는 바, "전염증성 시토카인"이란 전신 염증을 촉진시키는 시토카인을 의미한다. 본원에서 사용되는 바, "염증성 질환"이란, 강직성 척추염, 관절염 (골관절염, 류마티스 관절염, 건선성 관절염), 천식, 죽상동맥경화증, 크론병, 결장염, 피부염, 게실염, 섬유근육통, 간염, 과민성 장 증후군, 전신성홍반성 루푸스, 신염, 알츠하이머병, 파킨슨병 및 궤양성 결장염을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 염증과 관련된 질환을 의미한다. 최근, 수개의 보고를 통해 AMPK가 COX-2의 상류 조절 인자이고, COX-2 단백질 발현을 억제한다는 것이 입증되었다. 이전 관찰 결과와 같이, 본 발명자들은 신규한 AMPK 활성 인자인 아데닌 또한 COX-2 발현을 억제시킬 수 있다는 것을 발견하게 되었고, 이는 아데닌이 COX-2 매개 염증을 억제시키는 데 유용한 화합물이 될 수 있다는 것을 제안한다. 본 개시내용에 따라, 아데닌은 염증을 억제시킬 수 있다는 것으로 밝혀졌고, 그러므로, 이는 염증과 관련된 병증 또는 질환에 대해 유요한 치료법인 것으로 제안되었다.

상처 치유 및 흉터 형성에서의 아데닌

AMPK는 배양된 세포에서 세포 운동성을 촉진시키고, 상처 치유를 증진시키는 것으로 제안되었다. AMPK 활성 인자인 레스베라트롤은 절개 상처 치유를 증진시키는 것으로 밝혀졌다. 상처를 봉합하는 것 이외에도, 현대 의약에서는 치유 과정 동안 흉터 형성을 감소시키는 것이 선호하는 목표가 되어 왔다. 성인 상처 치유와 달리, 신생아의 상처 치유는 흉터 형성을 동반하지 않는다. 그 차이는 Cox-2 활성화에 있다. 성인 상처 치유에서는 COX-2 활성이 (TGF-베타에 의해) 상승되어 상처 부위에서 프로스타글란딘의 생산이 증가된다. 프로스타글란딘은, 흉터 형성을 유도하는 두 인자인, 섬유모세포 성장 및 콜라겐 형성을 촉진시킨다. 따라서, Cox-2 활성을 억제시키는 것이 흉터 형성을 예방하는 데 있어 효과적인 처치인 것으로 간주되어 왔다. 본 개시내용에서, 아데닌은 인간 섬유모세포 세포 성장을 억제시켰고 (실시예 8), COX-2 발현을 감소시킨다. 동물 모델을 사용하였을 때, 상처 부위에서의 아데닌의 국소 처리가 상처 봉합을 증진시킬 뿐만 아니라, 흉터 형성을 감소시켰다 (실시예 9). 상기 데이터에 따라, 아데닌의 국소 투여가 상처 치유를 증진시키고, 흉터 형성을 예방하는 데 유용하다.

신경퇴행

수개의 상이한 세포 기전에서의 결함은 염증, 세포내 수송, 및 자가포식 작용을 비롯한, 신경퇴행과 연관되어 왔다. 자가포식 작용은 세포내 기능장애 세포소기관 또는 단백질 응집체를 제거하고, 세포 항상성을 유지하는 데 있어 중요한 역할을 하는 기능을 한다. 많은 신경퇴행성 질환의 발병기전은 세포내 또는 세포외 단백질 응집체 침착물의 존재를 포함한다. 상기 단백질 응집체의 제거는 상기 질환의 진행을 개선시키는 것으로 나타났다. 손상된 자가포식 작용 경로 또는 자가포식 작용을 담당하는 단백질의 제거가 신경퇴행과 연관되어 왔다. AMPK 활성화은 자가포식 작용 경로를 촉진시키는 것으로 밝혀졌다. 그러므로, AMPK의 활성화를 통해 자가포식 작용 경로를 촉진시키는 것이 신경퇴행을 예방하거나, 제어하는 데 유용한 전략법이 될 수 있다. AMPK 활성인자는 자가포식 작용 경로를 통해 아밀로이드 침착을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 알츠하이머병 (AD) 마우스 모델에서 레스베라트롤의 매일 투여가 수명을 연장시킨다. 또 다른 AMPK 활성 인자인 쿠르쿠민 또한 AD 요법을 위한 잠재적인 약물로서 입증되었다. 본 개시내용에서, 본 발명자들은 아데닌이 AD 마우스 모델에서 자가포식 작용 활성을 유의적으로 증진시켰고, 뉴로2A(Neuro2A) 세포에서 용량에 의존하는 방식으로 Aβ 축적을 감소시켰고, 인지 기능을 개선시켰다는 것을 발견하게 되었다 (실시예 6 및 7). 이러한 관찰 결과에 따라, 아데닌은 신경퇴행성 질환 치료에서 유용할 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "신경퇴행"이란 뉴런의 구조 또는 기능의 진행적 손실인 병증을 의미한다. 신경퇴행성 질환은 신경퇴행 과정의 결과이며, 이는 알츠하이머병, 파킨슨병 (PD), 헌팅턴병 (HD), 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 척수소뇌성 실조증 (SCA), 척수 근위축증 (SMA) 등을 포함한다.

ROS 관련 질환

슈퍼옥시드 라디칼, 히드록실 레디칼 및 과산화수소를 비롯한 활성 산소 종 (ROS)은 조직에서 연속하여 생산된다. NARP (신경성 근육 무력, 운동 실조 및 색소성 망막염), MELAS (사립체성 뇌근병증, 유산산증, 및 뇌졸중 유사 에피소드), MERRF (근간대성 간질 및 불균일 적색 근섬유), LHON (레버씨 선천성 시신경 병증(Leber hereditary optic neuropathy)), 및 KSS (컨스-세이어 증후군(Kearns-Sayre syndrome), 안근마비, 운동 실조, 색소성 망막염, 심장 전도 결함 및 뇌척수액 단백질 상승), 파킨슨병 (PD), 알츠하이머병 (AD), 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 헌팅톤병 (HD), 및 프리드라이히(Friedreich's) 운동 실조 (FA) 및 노화를 비롯한, 다양한 질환이 과량의 ROS와 관련이 있다. 다수의 보고를 통해 AMPK 활성 인자인 AICAR이 고글루코스, 팔미테이트 또는 알부민 유도하의 ROS 생산을 감소시켰다는 것이 입증되었다. 본 개시내용에서, 아데닌은 HUVEC 세포에서 용량에 의존하는 방식으로 ROS 생산을 감소시키는 것으로 나타났으며 (하기 표 6), 그러므로, ROS와 관련된 병증 또는 질환에 대한 유용한 치료법으로서 제안되었다.

암

AMPK의 활성화는 암 세포 성장의 중요한 기전인 COX-2 및 mTOR 경로를 억제시켰다. mTOR 및 COX-2의 암 공격성에 대한 기여에 기인하여, AMPK의 활성화는 암 요법을 위해 합리적인 전략법으로서 제안된다. 실제로, 다수의 보고를 통해 AMPK 활성인자가 암 진행을 방해하는 것으로 입증되었다. 예를 들어, 펜포르민 및 메트포르민은 이종 이식 마우스 모델에서 유방 종양 발생 및 성장을 억제시키는 것으로 밝혀졌다. 본 개시내용에서, 아데닌은 인간 간세포 암종 세포주 HepG2, 인간 유방 샘암종 세포주 MCF7 및 인간 결장 샘암종 II급 세포주 HT29의 증식을 억제시키는 것으로 나타났다 (실시예 11). HepG2, MCF7 및 HT29에 대한 아데닌의 IC50은 각각 544.1, 537.5 및 531.9 μM이었다. HepG2 이식된 마우스에서, 아데닌으로 만성적으로 처리한 결과, 종양 성장은 용량에 의존하는 방식으로 유의적으로 지연되었다. 본 개시내용에 따라, 아데닌으로 처리하여 AMPK 활성을 활성화시키는 것이 암 발생 및 진행을 예방 또는 제어할 수 있다.

실시예

본 개시내용을 예시하기 위해 다수의 실시예가 사용되었다. 하기의 실시예는 본 개시내용의 범주를 한정하는 것으로 간주되지 않아야 한다.

실시예 1

MPK 활성화 검정

아데닌 처리시 AMPK 단백질의 인산화에 기초하여 아데닌이 AMPK 활성화에 미치는 효과를 평가하였다. 마우스 근육 세포 C2C12, 마우스 섬유모세포 3T3, 인간 간 암종 세포 HepG2, 인간 제대 정맥 내피 세포 HUVEC, 인간 급성 단핵구 백혈병 세포 THP1, 인간 대식세포인 세포 U937, 뮤린 미세아교세포인 세포 BV-2, 및 마우스 신경모세포종 세포 뉴로2A를 5% CO₂ 하에 37℃에서 10% 우태아 혈청 (FBS), 4 mM L-글루타민, 2 mM 피루브산나트륨 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 고글루코스 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium: DMEM) (인비트로겐 기브코BRL(Invitrogen GibcoBRL: 미국 캘리포니아주 칼즈배드)에서 배양하였다. 세포를 6 웰 플레이트에 웰당 3 x 10⁵개로 플레이팅하였다. 플레이팅 후 24시간이 경과하였을 때, 명시된 바와 같이 배양물에 아데닌을 첨가하였다. 30분 후, 세포를 용해시키고, 세포에 대해 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 각 샘플로부터 동량의 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분리한 후, PVDF 막 상에서 전기블롯팅하였다. 막을 60분 동안 PBS 중에서 3% BSA로 차단하고, 4℃에서 16시간 동안 항-포스포-AMPK (Thr172) 항체 (1:2,000, 셀 시그널링(Cell signaling)) 또는 항-AMPK 항체 (1:2,000, 셀 시그널링)와 함께 인큐베이션시킨 후, 실온 (RT)에서 1시간 동안 상응하는 2차 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 증강 화학 발광에 의해 면역반응성 밴드를 검출하고, 코닥(Kodak) 필름을 이용하여 기록하였다. 검출된 신호를 스캐닝한 후, 토탈랩 콴트(TotalLab Quant) 소프트웨어 (토탈랩(TotalLab))를 이용하여 정량화하였다.

아데닌이 AMPK 활성화에 미치는 효과는 하기 표 1에 요약되어 있다. 아데닌은 모든 시험된 세포에서 AMPK를 유의적으로 활성화시켰다.

세포	아데닌 농도 (μM)	AMPK 활성화 (대조군에 대한 배수)
C2C12	1	1.2
	10	1.7
	100	3.2
	200	3.9
	600	4.1
3T3	1	1.1
	10	1.5
	100	2.9
	200	4.0
	600	4.2
Hep G2	1	1.1
	10	2.1
	100	3.3
	200	3.8
	600	4.2
MCF7	1	1.2
	10	1.6
	100	2.5
	200	3.4
	600	3.7
HT29	1	1.1
	10	1.7
	100	2.9
	200	3.4
	600	3.8
HUVEC	1	1.2
	10	1.9
	100	3.2
	200	3.9
	600	4.1
THP1	1	1.2
	10	2.2
	100	3.7
	200	4.3
	600	4.2
U937	1	1.1
	10	1.3
	100	2.9
	200	3.7
	600	4.0
BV-2	1	1.2
	10	1.7
	40	2.6
	160	3.2
뉴로2A	1	1.2
	10	2.1
	100	3.4
진피 유두	1	1.1
	10	1.4
	100	2.1
	200	2.5
	600	2.8

실시예 2

시험관내 글루코스 흡수

근육 세포 C2C12에서 형광성 글루코스 유사체 (2-NBDG, 몰레큘라 프로브즈(Molecular Probes)) 흡수를 측정함으로써 아데닌이 글루코스 흡수에 미치는 효과를 분석하였다. C2C12 세포를 37℃에서 30분 동안 명시된 농도의 아데닌으로 처리한 후, 500 μM의 형광성 글루코스 유사체와 함께 인큐베이션시켰다. 실온에서 5분간 인큐베이션시킨 후, 세포를 크렙-헤르페스(Kreb-Hepes) 완충 용액으로 3회에 걸쳐 세척하고, 70% 알콜 중에 고정시켰다. 플루오레센스 마이크로플레이트 리더 시스템(Fluorescence Microplate Reader System)을 이용하여 세포 중 글루코스 유사체의 형광을 측정하였다.

아데닌이 글루코스 흡수에 미치는 효과는 하기 표 2에 요약되어 있다. 아데닌은 용량에 의존하는 방식으로 C2C12 세포에서 글루코스 흡수를 유의적으로 자극시켰다. 데이터는 3회의 독립 실험의 평균±SEM으로 제시되어 있다.

제제	농도(μM)	글루코스 흡수(%) (대조군에 대한 비율)
아데닌	1	117±8.1
	10	261±13.4
	100	315±11.9
	600	338±16.5

실시예 3

아데닌의 항-당뇨병 효과

아데닌이 혈장 글루코스 수준 조정에 미치는 효과를 추가로 평가하기 위해, 고지방 식이를 섭취한 마우스를 2형 당뇨병 동물 모델로서 제공하였다. C57BL/6J 마우스를 12시간 명/암 주기 하에 22℃에서 유지시키고, 고지방 식이 (60% kcal% 지방) 또는 정상 식이를 무제한으로 공급하였다. 고지방 식이를 섭취한 마우스에게 24주령때부터 아데닌 (0.1 내지 50 mg/kg) 또는 비히클을 복강내로 주사하고, 1 및 3시간째에 글루코스 판독값을 측정하였다. 고지방 식이를 섭취한 마우스에게만 6일 동안 하루에 2번씩 아데닌 또는 비히클을 IP 투여하였다. 6일째, 혈장 글루코스 및 트리글리세리드 분석, 평가, 측정을 위해, 최종 투약 후 1시간 경과하였을 때, 혈장을 수집하였다.

대조군과 비교하였을 때, 아데닌 주사군은 >30%의 더 낮은 혈장 글루코스 및 35% 초과의 더 낮은 혈장 트리아실글리세리드 뿐만 아니라, 15% 초과의 더 낮은 체중을 보였다.

실시예 4

아데닌은 시험관내에서 LPS에 의해 유도된 염증성 반응을 억제시켰다 .

세포내 COX-2 및 분비된 TNFα, IL-1β 및 IL-6의 단백질 수준을 조사함으로써 인간 THP1 대식세포에서 아데닌이 염증성 반응에 미치는 효과를 평가하였다. 24시간 동안 50 nM PMA에 의해 THP1 단핵구의 대식세포로의 분화를 유도하였다. 10 내지 600 μM의 아데닌 또는 비히클의 존재하에 6시간 동안 50 ng에 의해 THP1 대식세포를 추가로 자극시킨 후, 세포 용해 및 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 동량의 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분리한 후, PVDF 막 상에서 전기 블롯팅하였다. 막을 60분 동안 PBS 중에서 3% BSA로 차단하고, 4℃에서 16시간 동안 항-COX-2 항체 (1:1,000, 셀 시그널링), 항-액틴 항체 (1:5,000, 셀 시그널링)와 함께 인큐베이션시킨 후, 실온 (RT)에서 1 h 동안 상응하는 2차 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 증강 화학 발광에 의해 면역반응성 밴드를 검출하고, 코닥 필름을 이용하여 기록하였다. 검출된 신호를 스캐닝한 후, 토탈랩 콴트 소프트웨어 (토탈랩)를 이용하여 정량화하였다. 효소 결합 면역흡착 검정법에 의해 분비된 TNFα, IL-1β 및 IL-6을 분석하였다.

아데닌이 면역 반응에 미치는 효과는 하기 표 3에 요약되어 있다. 아데닌은 모든 시험된 세포에서 AMPK를 유의적으로 활성화시켰다. 대조군 세포와 비교하였을 때, 아데닌 처리된 대식세포에서 COX-2의 발현 및 TNFα, IL-1β 및 IL-6의 분비 수준은 유의적으로 감소되었다.

아데닌(μM)	TNFα(%) (대조군에 대한 비율)	IL-1β(%) (대조군에 대한 비율)	IL-6(%) (대조군에 대한 비율)	COX-2(%) (대조군에 대한 비율)
0	100±4.7	100±11.3	100±8.5	100±2.9
10	85±9.1	91±8.4	88±6.3	81±4.4
100	41±2.6	29±5.5	21±7.8	59±3.5
600	23±1.8	17±3.7	14±6.2	38±5.3

실시예 5

아데닌은 생체내에서 2,4,6-트리니트로벤젠 술폰산 ( TNBS ) 유도성 염증을 억제시켰다 .

아데닌이 염증성 반응에 미치는 효과를 추가로 평가하기 위해, TNBS 유도성 염증성 장 질환 (IBD) 마우스 모델을 사용하였다. C57BL/6J 마우스를 12시간 명/암 주기 하에 22℃에서 유지시켰다. 용량을 증가시키면서 5개 용량의 TNBS로 재발성 결장염을 유도하고, 매주 마우스 1마리당 0.1 mL에 대해 50% 에탄올 중 0.5 mg, 0.75 mg, 1.0 mg, 1.25 mg, 및 1.5 mg을 각각 투여하였다. TNBS의 3차 투여 후, 마우스에 아데닌 (0.01, 0.1, 5 또는 30 mg/kg (체중)) 또는 염수를 매일 복강내로 주사하였다. TNBS의 5차 투여 후 2일 경과하였을 때, 마우스를 희생시켰다. 결장 용해물로부터의 TNF, INFγ 및 IL-17을 비롯한, 염증성 시토카인을 효소 결합 면역흡착 검정법에 의해 평가하였다.

TNF, INFγ 및 IL-17의 수준은 아데닌으로 처리되지 않은 마우스와 비교하였을 때, 아데닌 처리된 마우스의 결장에서 용량에 의존하는 방식으로 유의적으로 감소되었다. 추가로, 아데닌 처리는 또한 TNBS에 의해 유발된 체중 손실도 구제하였다.

실시예 6

아밀로이드 β 펩티드 및 자가포식 작용 검정

마우스 신경모세포종 세포 뉴로2A에서 아데닌이 아밀로이드 β 펩티드에 미치는 효과를 분석하였다. 뉴로2A 세포를 5% CO₂ 하에 37℃에서 10% 우태아 혈청 (FBS), 4 mM L-글루타민, 2 mM 피루브산나트륨 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 고글루코스 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM) (인비트로겐 기브코BRL: 미국 캘리포니아주 칼즈배드) 중에서 배양하였다. 세포를 (6 웰 플레이트에) 웰당 3 x 10⁵개로 플레이팅하였다. 플레이팅 후 24시간이 경과하였을 때, 세포를 APP695로 형질감염시키고, 24시간 동안 명시된 농도의 아데닌으로 처리한 후, 세포 용해 및 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 동량의 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분리한 후, PVDF 막 상에서 전기 블롯팅하였다. 막을 60분 동안 PBS 중에서 3% BSA로 차단하고, 4℃에서 16시간 동안 항-Aβ 항체 (1:1,000, 압캠(abcam)), 항-LC3 항체 (1:1,000, 셀 시그널링), 및 항-액틴 항체 (1:5,000, 셀 시그널링)와 함께 인큐베이션시킨 후, 실온 (RT)에서 1시간 동안 상응하는 2차 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 증강 화학 발광에 의해 면역반응성 밴드를 검출하고, 코닥 필름을 이용하여 기록하였다. 검출된 신호를 스캐닝한 후, 토탈랩 콴트 소프트웨어 (토탈랩)를 이용하여 정량화하였다.

아데닌이 sAβ 생산 및 LC3-II/LC3-I 비율에 미치는 효과는 하기 표 4에 요약되어 있다. 아데닌은 뉴로2A 세포에서 용량에 의존하는 방식으로 Aβ 양을 유의적으로 감소시키고, LC3-II/LC3-I 비율을 유의적으로 증가시켰다. LC3-I의 LC3-II로의 전환이 자가포식 작용 활성을 나타내는 것이기 때문에, 아데닌 처리된 세포에서 더 높은 LC3-II/LC3-I 비율은 자가포식 작용 활성을 유도할 수 있는 아데닌의 능력을 반영한다.

아데닌(μM)	sAβ 수준(%) (대조군에 대한 비율)	LC3-II/LC3-I 비율 (대조군에 대한 상대적인 비율)
0	100 ± 6.1	1.0 ± 0.1
10	89 ± 7.5	1.2 ± 0.1
20	63 ± 2.2	1.8 ± 0.3
30	48.1 ± 1.7	2.8 ± 0.2
40	31.7 ± 5.1	2.9 ± 0.2
50	29.4 ± 3.6	3.2 ± 0.3

실시예 7

아데닌은 Aβ 유도성 알츠하이머병 모델 마우스의 신경퇴행을 구제하였다.

시그마-알드리치(Sigma-Aldrich: 미국 미주리주 세인트 루이스)로부터 Aβ25-35를 구입하였다. 펩티드를 증류된 염수에 용해시키고, 주사 전 7일 동안 37℃에서 인큐베이션시켜 응집시켰다. C57BL/6J 마우스를 12시간 명/암 주기 하에 22℃에서 유지시켰다. 성체 마우스를 케타민 (500 mg/kg) 및 크실라진 (100 mg/kg)에 의해 마취시키고, 정위 고정식 프레임에 놓았다. 5 nmol의 응집된 Aβ25-35를 10 ㎕의 해밀턴(Hamilton) 시린지를 이용하여 측뇌실 내로 주사하였다. 표적 전-후 (AP), 내측-외측 (ML) 및 등배 좌표는 정수리점 기준으로 -0.5 mm, ±1 mm 및 -2.5 mm였다. 아데닌이 신경퇴행성 질환에 미치는 효과를 평가하기 위해, Aβ 주입 마우스에 4주 동안 매일 0.01, 0.1, 5 또는 30 mg/kg (체중)의 아데닌 또는 비히클을 복강내로 주사하였다. 4주 주사 후 모리스 수중 미로(Morris water maze) 검정법을 사용하여 상기 마우스의 인지 기능을 분석하였다. 물로 가득 찬 원형 풀에서 수중 미로를 실시하고, 잠복 플랫폼 테스트를 위해 플랫폼을 표적 사분면에서 수면 아래로 침지시켰다. 5일간의 잠복 플랫폼 테스트 동안 각각의 매일 시험 (1일당 6회 시험)에서 마우스를 무작위로 풀의 출발점에 놓았다. 5일간의 잠복 플랫폼 테스트 후 1일이 경과하였을 때 프로브 시험을 실시하였다. 프로브 시험을 위해, 잠복 플랫폼 테스트에서 사용된 플랫폼을 제거하고, 출발점을 표적 사분면 반대쪽에 있도록 하였다. 마우스가 미로에서 60초 동안 수영할 수 있도록 허용하고, 비디오 카메라로 기록하였다. 플랫폼을 찾고, 경로를 수영하여 건너는 데 소요되는 잠복 시간을 소프트웨어에 의해 분석하였다.

잠복 플랫폼 테스트에서, 아데닌 처리된 AD 마우스가 플랫폼을 찾는 데 소요되는 시간은 용량에 의존하는 방식으로 대조군 AD 마우스보다 유의적으로 더 짧았다. 이러한 결과를 통해 아데닌 처리가 AD 마우스의 특별한 학습 및 기억 손상을 구제하였다는 것이 입증되었다. 추가로, 아데닌 처리된 AD 마우스는 프로브 검정에서의 표적 사분면에서 대조군 AD 마우스보다 더 높은 비율의 시간을 소비하였으며, 이는 아데닌이 기억 유지를 개선시킨다는 것을 나타내는 것이었다.

실시예 8

아데닌이 섬유모세포 증식을 억제시켰다 .

인간 섬유모세포 세포주 3T3을 5% CO₂ 하에 37℃에서 10% 우태아 혈청 (FBS), 4 mM L-글루타민, 2 mM 피루브산나트륨 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 고글루코스 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM) (인비트로겐 기브코BRL: 미국 캘리포니아주 칼즈배드)에서 배양하였다. 세포 증식 검정을 위해, 3T3 세포를 (6 웰 플레이트에) 웰당 1 x 10⁵개로 플레이팅하였다. 플레이팅 후 24시간이 경과하였을 때, 세포를 72시간 동안 명시된 농도의 아데닌으로 처리하고, 생존가능한 세포의 개수를 계수하였다. 트립신-EDTA 용액을 사용하여 세포를 탈착시키고, 트립판 블루로 염색하였다. 혈구계를 사용하여 살아있는 세포를 계수하였다.

아데닌이 3T3 세포 증식에 미치는 효과는 하기 표 5에 요약되어 있다. 표 5에 따르면, 아데닌은 용량에 의존하는 방식으로 3T3 세포 증식을 유의적으로 억제시켰다. 데이터는 3회의 독립 실험의 평균±SEM으로 제시되어 있다.

아데닌(μM)	세포수(%) (대조군에 대한 비율)
0	100±4.3
10	91±2.7
50	73±8.1
100	64±5.3
200	48±2.8
500	33±6.4
1000	27±11.3

실시예 9

아데닌은 상처 치유를 증진시키고, 흉터 형성을 감소시킨다.

C57BL/6J 마우스를 12시간 명/암 주기 하에 22℃에서 유지시켰다. 12주령된 마우스를 이용하여 실험을 수행하였다. 케타민 (500 mg/kg) 및 크실라진 (100 mg/kg)을 복강내 주사하여 마취시킨 후, 6 mm 피부 생검 펀치를 이용하여 마우스의 등 위에 6 mm 전층 절개 피부 상처를 내었다. 상처를 낸 후 즉시, 10 내지 1,200 μM의 아데닌 또는 염수만 단독으로 상처 기저부에 도포하였다. 이어서, 피부 상처를 반투과성 투명 드레싱으로 덮고, 피부에 고정시켰다. 마우스를 14일 동안 아데닌 또는 비히클로 처리한 후, 희생시켰다. 메이슨 트리크롬(Masson's trichrome) 염색 (조직을 4% 파라포름알데히드로 고정시킴)에 의해 흉터 형성을 평가한다.

14일 동안의 처리 후, 봉합 정도는 대조군 마우스에서보다 아데닌 처리된 마우스에서 용량에 의존하는 방식으로 유의적으로 더 컸다. 재생된 조직에 대한 조직학적 검사에 따르면, 비히클 처리된 상처와 비교하였을 때, 아데닌으로 국소적으로 처리한 것이 흉터 너비를 유의적으로 감소시켰다.

실시예 10

아데닌이 ROS 생산을 감소시켰다.

인간 제대 정맥　내피 세포 (HUVEC)를 5% CO₂ 하에 37℃에서 10% 우태아 혈청 (FBS), 4 mM L-글루타민, 2 mM 피루브산나트륨 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 고글루코스 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM) (인비트로겐 기브코BRL: 미국 캘리포니아주 칼즈배드) 중에서 배양하였다. 세포를 검은색 96 웰에 웰당 2 x 10⁴개로 플레이팅하였다. 플레이팅 후 24시간이 경과하였을 때, 배지를 5.6 또는 30 mM 글루코스를 함유하는 신선한 DMEM으로 교체하고, 명시된 농도의 아데닌으로 처리하였다. 처리 후 24시간이 경과하였을 때, H2DCF-DA를 이용하여 세포내 ROS를 검출하였다. 세포를 PBS로 1회 세척한 후, 37℃에서 30분동안 100 μM DCF와 함께 인큐베이션시켰다. 이어서, 485 nm 여기 파장 및 530 nm 방출 파장에서 플루오레센스 마이크로플레이트 리더 시스템을 이용하여 DCF의 형광을 측정하였다.

아데닌이 ROS 생산에 미치는 효과는 하기 표 6에 요약되어 있다. 아데닌은 용량에 의존하는 방식으로 고혈당증 유도성 ROS 생산을 유의적으로 감소시켰다.

아데닌(μM)	글루코스(mM)	ROS 생산(%) (5.6 mM 글루코스에 대한 비율)
0	30	275 ± 8.1
10	30	211 ± 4.3
100	30	116 ± 1.7
200	30	38.1 ± 2.9
600	30	21.7 ± 3.1
1200	30	22.4 ± 2.5

실시예 11

암 세포 성장 억제 검정

인간 간 간세포 암종 세포주 HepG2, 인간 유방 샘암종 세포주 MCF7 및 인간 결장 샘암종 II급 세포주 HT29를 사용하여 아데닌이 세포 증식에 미치는 효과를 평가하였다. 상기 세포주는 ATCC로부터 입수하였고, 5% CO₂ 하에 37℃에서 10% 우태아 혈청 (FBS), 4 mM L-글루타민, 2 mM 피루브산나트륨 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 고글루코스 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM) (인비트로겐 기브코BRL: 미국 캘리포니아주 칼즈배드) 중에서 배양하였다. 세포를 (6 웰 플레이트에) 웰당 1 x 10⁵개로 플레이팅하였다. 플레이팅 후 24시간이 경과하였을 때, 세포를 72시간 동안 명시된 농도의 아데닌으로 처리한 후, 세포를 계수하였다. 트립신-EDTA 용액을 사용하여 세포를 탈착시키고, 트립판 블루로 염색하였다. 혈구계를 사용하여 살아있는 세포를 계수하였다.

HepG2, MCF7 및 HT29에 대한 아데닌의 IC50은 각각 544.1, 537.5 및 531.9 μM이었다.

실시예 12

종양 성장 검정

인간 간 간세포 암종 세포주 HepG2를 5% CO₂ 하에 37℃에서 10% 우태아 혈청 (FBS), 4 mM L-글루타민, 2 mM 피루브산나트륨 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 고글루코스 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM) (인비트로겐 기브코BRL: 미국 캘리포니아주 칼즈배드)에서 배양하였다. 종양 이식 후, 5 x 10⁶개의　HepG2 세포를 8주령된 수컷 비비만성 당뇨병-중증 복합 면역결핍 (NOD-SCID) 마우스에 피하로 주사하였다. 이식 후, 마우스에 5, 20 또는 50 mg/kg (체중)의 아데닌을 복강내로 매일 주사하고, 매 3일마다 종양 크기를 모니터링하였다. 이식 후 14일이 경과하였을 때, 종양 성장은 대조군 마우스에 비하여 아데닌 처리된 마우스에서 유의적으로 지연되었다.

그러나, 당업자에게는 본원의 본 발명의 개념으로부터 벗어남 없이 이미 기술된 것 이외의 다수의 더 많은 변형이 가능하다는 것이 자명하여야 한다. 실시양태는 본 개시내용의 범주를 한정하고자 하지 않는다. 본 개시내용의 범주는 오직 첨부된 청구범위에 의해서만 정의된다.

Claims

AMP-활성화된 단백질 키나제 (AMPK)를 활성화시키기 위한 화합물로서, 상기 화합물이 아데닌 및/또는 그의 제약상 허용되는 염인 것을 특징으로 하는, 화합물.
제1항에 있어서, 상기 화합물이 AMPK 활성인자에 의해 개선될 수 있는 질환 또는 병증을 치료하고, 상기 아데닌 및/또는 그의 제약상 허용되는 염이 이러한 치료를 필요로 하는 포유동물에게 투여되는 것을 특징으로 하는, 화합물.
제1항에 있어서, 상기 화합물이 세포에서 전염증성 시토카인 분비 및 COX-2 발현을 감소시키고, 염증성 병증 또는 질환을 치료하며, 상기 아데닌 및/또는 그의 제약상 허용되는 염이 이러한 치료를 필요로 하는 포유동물에게 투여되는 것을 특징으로 하는, 화합물.
제1항에 있어서, 상기 화합물이 세포 내로의 글루코스 흡수를 증가시키고, 당뇨병전기, 2형 당뇨병, 대사 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택되는 병증을 예방 또는 치료하며, 상기 아데닌 및/또는 그의 제약상 허용되는 염이 이러한 처치를 필요로 하는 포유동물에게 투여되는 것을 특징으로 하는, 화합물.
제1항에 있어서, 상기 화합물이 포유동물에서 혈장 트리글리세리드를 감소시키고, 체중을 감소시키며, 비만의 병증을 예방 또는 치료하고, 상기 아데닌 및/또는 그의 제약상 허용되는 염이 이러한 처치를 필요로 하는 포유동물에게 투여되는 것을 특징으로 하는, 화합물.
제1항에 있어서, 화합물이 세포에서 Aβ 축적을 억제시키고, 알츠하이머병을 예방 또는 치료하며, 상기 아데닌 및/또는 그의 제약상 허용되는 염이 이러한 처치를 필요로 하는 포유동물에게 투여되는 것을 특징으로 하는, 화합물.
제1항에 있어서, 상기 화합물이 세포에서 자가포식 작용 활성을 증진시키고, 자가포식 작용에 의해 개선될 수 있는 질환 또는 병증을 치료하며, 상기 아데닌 및/또는 그의 제약상 허용되는 염이 이러한 치료를 필요로 하는 포유동물에게 투여되는 것을 특징으로 하는, 화합물.
제1항에 있어서, 상기 화합물이 섬유모세포 증식을 억제시키고, 상처 치유 동안의 흉터 형성을 예방하며, 상기 아데닌 및/또는 그의 제약상 허용되는 염이 이러한 처치를 필요로 하는 포유동물에게 투여되는 것을 특징으로 하는, 화합물.
제1항에 있어서, 상기 화합물이 상처 치유를 증진시키고, 상기 아데닌 및/또는 그의 제약상 허용되는 염이 이러한 처치를 필요로 하는 포유동물에게 투여되는 것을 특징으로 하는, 화합물.
제1항에 있어서, 상기 화합물이 세포에서 ROS 생산을 억제시키고, 포유동물에서 ROS 손상으로부터 세포를 보호 및 치료하며, 상기 아데닌 및/또는 그의 제약상 허용되는 염이 이러한 처치를 필요로 하는 포유동물에게 투여되는 것을 특징으로 하는, 화합물.
제1항에 있어서, 상기 화합물이 암 세포 증식을 억제시키고, 암을 예방 또는 치료하며, 상기 아데닌 및/또는 그의 제약상 허용되는 염이 이러한 처치를 필요로 하는 포유동물에게 투여되는 것을 특징으로 하는, 화합물.
AMPK 활성인자에 의해 개선될 수 있는 질환 또는 병증 치료용 의약 제조를 위한 제1항의 화합물의 용도.
염증성 병증 또는 질환 치료용 의약 제조를 위한 제1항의 화합물의 용도.
당뇨병전기, 2형 당뇨병, 대사 증후군 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 병증 예방 또는 치료용 의약 제조를 위한 제1항의 화합물의 용도.
비만 예방 또는 치료용 의약 제조를 위한 제1항의 화합물의 용도.
알츠하이머병 예방 또는 치료용 의약 제조를 위한 제1항의 화합물의 용도.
자가포식 작용에 의해 개선될 수 있는 질환 또는 병증 치료용 의약 제조를 위한 제1항의 화합물의 용도.
상처 치유 동안의 흉터 형성 예방용 의약 제조를 위한 제1항의 화합물의 용도.
상처 치유 증진용 의약 제조를 위한 제1항의 화합물의 용도.
포유동물에서 ROS 손상으로부터 세포 보호 및 치료용 의약 제조를 위한 제1항의 화합물의 용도.
암 예방 또는 치료용 의약 제조를 위한 제1항의 화합물의 용도.