TWI481406B - 活化ａｍｐｋ之化合物及其使用 - Google Patents

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活化AMPK之化合物及其使用

本發明係關於腺嘌呤，此化合物適用於活化AMPK(AMP-活化蛋白激酶)，並使用該化合物於預防或治療生理狀況或疾病。

AMPK係明確為細胞能量之感應器及能量需求之回應者。AMPK為異三元體由催化性α 次單元體、調節性β 、γ 次單元體組成，所有次單元體在真核生物具高度保留性。AMPK活化係藉由其上游激酶如LKB1、鈣離子/攜鈣素依賴的蛋白質磷酸激酶(Ca²⁺ /Calmodulin dependent kinase)及TAK1磷酸化α 次單元體具保留性之第172蘇胺酸殘基，由生理或病理壓力造成高AMP/ATP比例亦活化AMPK。AMPK活化後會促進分解代謝路徑進行並抑制合成代謝，藉由減少ATP消耗及促進ATP生成進而恢復細胞能量平衡。

作為一能量代謝平衡調節者，AMPK被認為對代謝症候群，包括第二型糖尿病、心血管疾病、脂肪肝等為一具潛力之藥物標的。許多代謝症候群都與胰島素抵抗有關。胰島素抵抗係為一病理狀態，在此狀況細胞無法對胰島素進行回應，因此血液中過多的葡萄糖無法移除至骨骼肌或脂肪組織。在肌肉細胞中，AMPK活化以非胰島素依賴性方式，透過轉錄調控增加葡萄糖運輸蛋白(GLUT4)表現量，並誘導GLUT4轉移至細胞膜上導致細胞攝取葡萄糖速率增加。AMPK活化亦分別藉由抑制乙醯輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase)及羥甲基戊二酸單醯輔酶A還原酶(HMG-CoA reductase)抑制脂肪酸及膽固醇合成。此外AMPK活化導致數個轉錄因子之抑制，包括SREBP-1c,ChREBP and HNF-4a，並下降調節脂肪酸合成及糖質新生作用相關酵素之蛋白質表現。上述提及之研究發現，均支持AMPK係為代謝症候群尤其糖尿病之治療標的。

除了能量代謝平衡調節外，AMPK亦參與數個細胞機制之調節，包括發炎反應、細胞生長、細胞凋亡、自體吞噬、老化及分化。許多研究顯示AMPK為發炎反應抑制者。AMPK活化透過抑制細胞核轉錄因子(NF-κB)之訊息傳遞抑制發炎反應。細胞核轉錄因子之訊息傳遞為活化先天免疫及後天免疫主要路徑，當AMPK活化後會透過刺激SIRT1、Forkhead box O(FoxO)或peroxisome proliferator-activated receptor co-activator 1α(PGC1α)抑制細胞核轉錄因子之轉錄活性以達到抑制發炎反應之效果。此外數個研究室亦證明AMPK活化抑制環氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)之蛋白質表現。環氧化酶-2係為一誘導性酵素，可被發炎性細胞激素及生長因子調控，其功能為將花生四烯酸轉化成前列腺素因而導致發炎反應及疼痛，因此抑制環氧化酶之活性或表現已被證實具抗發炎作用。

數個AMPK活化劑已於生物體內實驗被證實具抗發炎功能。舉例而言，5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleoside(AICAR)於小鼠模式已被證實可緩解由三硝基苯磺酸或右旋糖酐硫酸酯鈉所引起之急性及復發性結腸炎，AICAR治療顯著降低疾病小鼠之體重減少並減緩發炎反應。此外AICAR對於人類多發性硬化症動物模式(EAE)有明顯之治療效果，亦降低以脂多醣誘導小鼠肺損傷之嚴重程度。

細胞訊息傳遞路徑失調可能會導致細胞異常生長，最終導致癌症。哺乳動物雷帕黴素標靶蛋白(mTOR)係為一絲胺酸/蘇胺酸激酶，其調控細胞生長及自體吞噬作用。哺乳動物雷帕黴素標靶蛋白訊息傳遞路徑之活性失調在許多不同癌症被發現，因此哺乳動物雷帕黴素標靶蛋白抑制劑被認為係癌症治療之潛力藥物。大量研究證實AMPK磷酸化tuberous sclerosis complex 2(TSC2)及Raptor達到抑制哺乳動物雷帕黴素標靶蛋白路徑。各種AMPK活化劑包括AICAR、metformin、phenformin已被證實抑制哺乳動物雷帕黴素標靶蛋白訊息路徑，並抑制癌細胞生長。此外AMPK活化透過抑制哺乳動物雷帕黴素標靶蛋白複合體-1誘導自體吞噬作用。由於AMPK抑制哺乳動物雷帕黴素標靶蛋白複合體-1，U1k1上第757絲胺酸磷酸化減少，其後第317及777絲胺酸被AMPK磷酸化，U1k1被AMPK磷酸化後隨之啟動自體吞噬作用。

綜上所述，AMPK被認為對許多人類疾病或病理狀況，包括發炎性疾病、傷口癒合、神經退化、癌症、氧化壓力及心血管疾病為一很好之治療標的。事實上，AMPK活化劑已被應用於至少24類疾病之臨床試驗，包括：細菌及真菌疾病、行為及心理失調、血液及淋巴疾病、癌症、腫瘤、消化系統疾病、耳鼻喉疾病、眼疾、腺體及賀爾蒙相關疾病、心血管疾病、免疫系統疾病、嘴巴及牙齒疾病、肌肉、骨骼、軟骨疾病、神經系統疾病、營養及代謝性疾病、呼吸道疾病、皮膚及結締組織疾病、傷口癒合等。我們在此公開了一種新穎AMPK活化劑-腺嘌呤及使用該化合物於預防或治療疾病。

根據本發明之實施例，提供一新穎AMPK活化劑-腺嘌呤，可於細胞內活化AMPK，因此可於哺乳動物預防或治療可被AMPK改善之生理狀況或疾病。根據本發明之實施例，提供一透過活化AMPK降低血糖之方法，從而預防或治療疾病包括：代謝症候群、前期糖尿病、第二型糖尿病、胰島素抵抗，其中給予需要此治療之哺乳動物有效劑量之腺嘌呤及/或醫藥學上可接受之鹽。

根據本發明之實施例，提供一透過活化AMPK抗發炎之方法，從而預防或治療發炎性狀況或疾病，其中給予需要此治療之哺乳動物有效劑量之腺嘌呤及/或醫藥學上可接受之鹽。

根據本發明之實施例，提供一透過活化AMPK抑制纖維母細胞生長之方法，從而於傷口癒合期間預防疤痕組織生成。

根據本發明之實施例，提供一加強傷口癒合之方法，其中給予需要此治療之哺乳動物有效劑量之腺嘌呤及/或醫藥學上可接受之鹽。

根據本發明之實施例，提供一抑制反應性氧族(ROS)生成之方法，從而保護或治療哺乳動物之細胞遠離反應性氧族傷害，其中給予需要此治療之哺乳動物有效劑量之腺嘌呤及/或醫藥學上可接受之鹽。

根據本發明之實施例，提供一抑制癌細胞生長之方法，從而預防或治療癌症，其中給予需要此治療之哺乳動物有效劑量之腺嘌呤及/或醫藥學上可接受之鹽。

因此，本發明係關於腺嘌呤，此化合物適用於活化AMPK，並使用腺嘌呤於預防或治療生理狀況或疾病，包括：前期糖尿病、胰島素抵抗、第二型糖尿病、代謝症候群、肥胖、發炎、傷口癒合、阿茲海默症、癌症、氧化壓 力及心血管疾病。

本發明人已意外地發現，腺嘌呤係為一新穎之AMPK活化劑，並具有各種生物性功能。近年來，AMPK活化已被證實有助於疾病的預防及治療，如前期糖尿病、胰島素抵抗、第二型糖尿病、代謝症候群、肥胖、發炎、傷口癒合、阿茲海默症、癌症、氧化壓力、心血管疾病以及促進傷口癒合。發明人認為，此效果可歸因於AMPK活化所導致但不限於降低環氧化酶-2表現量、抑制應性氧族(ROS)之生產及葡萄糖攝取活性之增加。

預期適應症

基於發明人之研究成果(見以下之實施例)，腺嘌呤可透過活化AMPK作為使用於各種生理狀況或疾病之治療劑。以下提供預期適應症之示例性引導及證據。

腺嘌呤於高血糖、前期糖尿病、胰島素抵抗、第二型糖尿病之治療最近已有報告指出AMPK活化劑包括metformin,A769662,AICAR於糖尿病或肥胖小鼠模式降低血漿葡萄糖濃度。於本發明中，1 μM~600 μM之腺嘌呤顯著增加肌肉細胞C2C12之葡萄糖攝取(表2)。更進一步以高脂肪飼料餵養小鼠作為第二型糖尿病動物模型評估腺嘌呤對血漿葡萄糖濃度調節效果。與控制組之高脂肪飼料餵養小鼠比較，給予腺嘌呤顯著減少高脂肪飼料餵養小鼠之血漿葡萄糖30%以上，並減少血漿三酸甘油酯35%以上，15%以上之體重減少(實施例3)。這裡使用之術語「高血糖」係指一生理狀況，其特徵為血糖高於126毫克/分升。這裡使用之術語「前期糖尿病」係指一生理狀況，其特徵為空腹血糖高於100毫克/分升但低於140毫克/分升。 這裡使用之術語「胰島素抵抗」係指一生理狀況，其中全身或組織包括肝臟、骨骼肌、脂肪組織無法對胰島素反應。這裡使用之術語「第二型糖尿病」亦指非胰島素依賴型糖尿病或成人發病型糖尿病。係指代謝失調引起之胰島素生產不足或胰島素抵抗，其特徵通常為空腹血糖高於140毫克/分升。根據此實施例，腺嘌呤被證實加速葡萄糖攝取，因此可作為與高血糖有關之生理狀況或疾病之有效治療方式。

腺嘌呤於發炎性疾病之治療

各種AMPK活化劑已被證實於生物體內具抗發炎功能。舉例而言，5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleoside(AICAR)於小鼠模式已被證實可緩解由三硝基苯磺酸或右旋糖酐硫酸酯鈉所引起之急性及復發性結腸炎，AICAR治療顯著降低疾病小鼠之體重減少並減緩發炎反應。此外AICAR對於人類多發性硬化症動物模式(EAE)有明顯之治療效果，亦降低以脂多醣誘導小鼠肺損傷之嚴重程度。於本發明中，腺嘌呤於體外試驗中抑制脂多醣誘導之發炎反應：於脂多醣刺激下，經腺嘌呤處理之巨噬細胞之發炎性細胞激素分泌量，包括腫瘤壞死因子α(TNF-α)、介白素-1β(IL-1β)及介白素-6(IL-6)，與控制組相比有顯著性減少。腺嘌呤亦減少人類巨噬細胞因脂多醣誘導表現之環氧化酶-2表現量(實施例4)。於三硝基苯磺酸誘導之發炎性腸病(IBD)小鼠模式中，給予腺嘌呤治療組別之結腸發炎性細胞激素，包括腫瘤壞死因子(TNF)、干擾素γ(INFγ)及介白素(IL-17)均較控制組小鼠顯著減少，且挽救體重損失(實施例5)。

這裡使用之術語「發炎性細胞激素」係指促進系統性發炎反應之細胞激素。 這裡使用之術語「發炎性疾病」係指與發炎相關之疾，包括但不限制於僵直性脊椎炎、關節炎(骨關節炎、風濕性關節炎、乾癬性關節炎)、氣喘、動脈粥樣硬化、克隆氏症、結腸炎、皮膚炎、大腸憩室炎、纖維肌痛症、肝炎、激躁性結腸症、系統性紅斑性狼瘡、腎炎、阿茲海默症、帕金森式症、潰瘍性大腸炎等。近年來，許多報告已證實AMPK係環氧化酶-2上游調控者，可抑制環氧化酶-2之蛋白質表現。與先前研究相符，發明人發現一新穎AMPK活化劑，腺嘌呤，可有效抑制環氧化酶-2之蛋白質表現，由此可知腺嘌呤可抑制環氧化酶-2介導之發炎。根據本發明，腺嘌呤被發現可抑制發炎，因此可作為發炎相關之生理狀況或疾病之治療。

腺嘌呤於傷口癒合及疤痕形成

AMPK被認為可促進細胞能動性並加強傷口癒合。一AMPK活化劑，白藜蘆醇，已被證實可加強手術傷口之癒合。除了傷口癒合外，在癒合過程中減少疤痕的形成一直為現代醫學之首選目標。新生兒傷口癒合不同於成人之傷口癒合，不會伴隨疤痕之形成，此間差異在於環氧化酶-2之活化。於成人之傷口癒合過程，環氧化酶-2活性會經由TGF-beta被提升，因而導致傷口處前列腺素生產之增加。前列腺素已被證實可促進纖維母細胞增生及膠原蛋白之形成，此兩種因素可導致疤痕形成。因此，抑制環氧化酶-2之活性被認為可有效預防疤痕形成。於本發明中，腺嘌呤抑制纖維母細胞生長(實施例8)並降低環氧化酶-2之蛋白質表現。於動物模式中，於傷口處直接施用腺嘌呤不僅可加強傷口癒合並可減少疤痕生成(實施例9)。依據上述資料，局部施用腺嘌呤可有效加強傷口癒合並防止疤痕形成。

神經退化

許多細胞機制之缺陷已被證實與神經退化性疾病有關，包括發炎、細胞內運輸、自體吞噬等。自體吞噬之功能在於移除細胞內失去功能之胞器或蛋白質團塊，並且對細胞內平衡扮演重要角色。許多神經退化性疾病之發病機制涉及細胞內或細胞外蛋白質團塊之沉積，而移除這些蛋白質團塊已顯示可改善此類疾病之進展。此外，自體吞噬途徑受損或移除負責自體吞噬之蛋白質已被證實導致神經退化。AMPK活化已證實可促進自體吞噬路徑。因此，透過活化AMPK以促進自體吞噬路徑可作為預防或控制神經退化性疾病之有效策略。AMPK活化劑已被證實可經由自體吞噬路徑減少類澱粉沉積。每日給予AMPK活化劑-白藜蘆醇可增加阿茲海默症小鼠之壽命。另一AMPK活化劑-薑黃素亦被證實可作為阿茲海默症治療之潛在藥物。於本發明中，發明人發現腺嘌呤於神經細胞Neuro-2A中顯著加強自體吞噬活性並降低Aβ累積，此外腺嘌呤改善阿茲海默症疾病小鼠之認知功能(實施例6、7)。根據上述發現，腺嘌呤可作為神經退化性疾病之治療使用。

這裡使用之術語「神經退化」係指神經元結構或功能逐漸喪失之情況。神經退化性疾病係為神經退化之結果，包括但不限制於阿茲海默症、帕金森氏症、漢丁頓舞蹈症、肌萎縮性脊髓側索硬化症、脊髓小腦萎縮症、脊髓性肌肉萎縮症等。

反應性氧族相關疾病

生物組織中，反應性氧族包括超氧化物自由基、羥基自由基及過氧化氫不 斷的被產生，且過量之反應性氧族與許多疾病有關，包括但不限制於：神經組織肌肉無力伴隨運動失調與色素沉積性視網膜炎(NARP)、MELAS症候群、肌抽躍癲癇合併紅色襤褸肌纖維症(MERRF)、Leber遺傳性視神經萎縮症(LHON)、KSS症候群、阿茲海默症、帕金森氏症、漢丁頓舞蹈症、肌萎縮性脊髓側索硬化症、弗裡德賴希氏共濟失調(FA)及老化。許多研究報告證實AMPK活化劑如AICAR，於高葡萄糖、棕梠酸或白蛋白誘導狀況下，可減少反應性氧族產生。於本發明中，腺嘌呤降低HUVEC細胞中反應性氧族之生產(表6)，因此腺嘌呤可作為反應性氧族相關之生理狀況或疾病之治療使用。

癌症

AMPK活化抑制環氧化酶-2與哺乳動物雷帕黴素標靶蛋白途徑，此二路徑為癌細胞生長之重要機制。基於環氧化酶-2與哺乳動物雷帕黴素標靶蛋白對癌症之重要性，活化AMPK以達抑制環氧化酶-2與哺乳動物雷帕黴素標靶蛋白途徑被認為是合理之癌症治療策略。事實上，許多研究報告證實AMPK活化劑中斷癌症發展，舉例而言，phenformin及metformin於異體移植之癌症小鼠模式被發現抑制乳癌腫瘤發展及生長。於本發明中，腺嘌呤抑制人類肝癌細胞Hep G2、人類乳腺癌細胞MCF7及結腸癌細胞HT29之細胞生長(實施例11)。腺嘌呤對Hep G2、MCF7、HT29之50%生長抑制濃度分別為544.1,537.5 and 531.9 M。於Hep G2移植小鼠模式，長期給予腺嘌呤顯著延遲腫瘤生長。根據本發明，以腺嘌呤活化AMPK之治療方式，可預防或控制癌症的形成或發展。

實施例1 AMPK活性分析

於小鼠肌肉細胞C2C12、小鼠纖維母細胞3T3、人類肝癌細胞Hep G2、人類乳腺癌細胞MCF7及人類結腸癌細胞HT29人類臍帶靜脈內皮細胞HUVEC、人類急性單核白血球細胞株THP1、人類巨噬細胞U937、小鼠微神經膠細胞BV-2、神經母細胞瘤細胞Neuro2A及毛乳突細胞Dermal Papilla進行腺嘌呤對AMPK磷酸化影響之分析。細胞以Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)含10%胎牛血清(FBS),4mM L-glutamine,2 mM sodium pyruvate及1% penicillin/streptomycin(Invitrogen GibcoBRL,Carlsbad,CA,USA)於37℃、5% CO₂ 環境下培養。3×10⁵ 細胞接種於6-well盤，24小時後以指定化合物處理細胞30分鐘，接著溶解細胞並以西方墨點法進行分析。等量蛋白質以十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳進行分離，接著轉印至聚偏氟乙烯膜。轉印後之聚偏氟乙烯膜浸泡至溶於PBS緩衝液之3%牛血清白蛋白60分鐘後，分別加入抗磷酸化AMPK(Thr172)抗體(1：2000,Cell signaling)、抗AMPK抗體(1：2000,Cell signaling)，於4℃作用。16小時後加入對應之二抗於室溫下反應1小時。具免疫反應帶以冷光受質偵測，並以底片紀錄訊號。所得之訊號掃描後以TotalLab Quant軟體(TotalLab)進行分析。

腺嘌呤對AMPK活化之影響統整於表1。於所有測試細胞中，腺嘌呤均顯著 活化AMPK。

實施例2 葡萄糖攝取-生物體外分析

使用螢光葡萄糖類似物(2-NBDG,Molecular Probes)於肌肉細胞C2C12分析腺嘌呤對葡萄糖攝取之影響。C2C12細胞以各濃度之腺嘌呤於37℃下處理30分鐘後，加入500 μM螢光葡萄糖類似物，於室溫下培養5分鐘後， 細胞以Kreb-Hepes緩衝溶液清洗三次，並以70%乙醇固定。細胞內葡萄糖類似物之螢光以螢光光度計偵測。

腺嘌呤對葡萄糖攝取之影響統整於表2。腺嘌呤顯著促進C2C12細胞之葡萄糖攝取且具濃度依賴性。數據表示為三個獨立實驗的平均值±標準差。

實施例3 腺嘌呤之抗糖尿病效果

為了進一步評估腺嘌呤對血漿葡萄糖水平調節之影響，以高脂肪飼料餵養小鼠作為第二型糖尿病動物模型進行試驗。C57BL/6J小鼠飼養於22℃、12小時日/夜循環並以不限制飲食方式餵養高脂肪飼料(60% kcal% fat)或正常飼料。0.1-50毫克/公斤之腺嘌呤以腹腔注射方式給于24周齡小鼠，注射後1與3小時測量血糖值。腹腔注射高脂肪飼料餵養小鼠一天兩次並持續6天，最後一次投藥1小時後，收集血漿並測量血漿葡萄糖及三酸甘油脂含量。

與施打生理食鹽水之高脂肪飼料餵養小鼠相比，發現腺嘌呤降低血漿葡萄糖量大於30%，降低三酸甘油脂量大於35%，並且降低體重15%以上。

實施例4 腺嘌呤抑制脂多醣引起之發炎反應

藉由檢測人類巨噬細胞內環氧化酶-2蛋白質量及腫瘤壞死因子α(TNF-α)、介白素-1β(IL-1β)及介白素-6(IL-6)分泌量評估腺嘌呤對發炎反應之影響。以50 nM PMA處理24小時，誘導人類急性單核白血球細胞株THP1分化至巨噬細胞。THP1巨噬細胞進一步以50 ng脂多醣含10~600 μM腺嘌呤或載體刺激6小時，接著溶解細胞並以西方墨點法進行分析。等量蛋白質以十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳進行分離，接著轉印至聚偏氟乙烯膜。轉印後之聚偏氟乙烯膜浸泡至溶於PBS緩衝液之3%牛血清白蛋白60分鐘後，分別加入抗環氧化酶-2抗體(1：1000,Cell signaling)、抗機動蛋白抗體(1：5000,Cell signaling)，於4℃作用。16小時後加入對應之二抗於室溫下反應1小時。具免疫反應帶以冷光受質偵測，並以底片紀錄訊號。所得之訊號掃描後以TotalLab Quant軟體(TotalLab)進行分析。腫瘤壞死因子α(TNF-α)、介白素-1β(IL-1β)及介白素-6(IL-6)分泌量以酵素連結免疫吸附法分析。

腺嘌呤對免疫反應之影響統整於表3。與控制組胞比較，經腺嘌呤處理之巨噬細胞，其環氧化酶-2蛋白質表現量及腫瘤壞死因子α(TNF-α)、介白素-1β(IL-1β)及介白素-6(IL-6)分泌量均顯著下降。

實施例5 腺嘌呤於生物體抑制三硝基苯磺酸誘發之發炎反應

進一步以三硝基苯磺酸誘導之發炎性腸病(IBD)小鼠模式，評估腺嘌呤對發炎反應之影響。C57BL/6J小鼠飼養於22℃、12小時日/夜循環。以五個逐步提升之三硝基苯磺酸劑量：0.5 mg、0.75 mg、1.0 mg、1.25 mg與1.5 mg溶於50%乙醇分別每周給予小鼠0.1mL誘發復發性結腸炎。第三次給予三硝基苯磺酸後每日以腹腔注射方式給予小鼠腺嘌呤(0.01,0.1,5 or 30 mg/kg體重)或生理食鹽水。第五次給予三硝基苯磺酸後兩天即將小鼠犧牲。結腸組織溶解液之發炎性細胞激素：腫瘤壞死因子(TNF)、干擾素γ(INFγ)及介白素(IL-17)以酵素連結免疫吸附法分析。

給予腺嘌呤治療組別之結腸發炎性細胞激素包括腫瘤壞死因子(TNF)、干擾素γ(INFγ)及介白素(IL-17)，均較控制組小鼠顯著減少，且挽救體重損失。

實施例6 類澱粉β胜肽及自體吞噬活性分析

以神經母細胞瘤細胞Neuro2A分析腺嘌呤對類澱粉β胜肽之影響。

Neuro2A細胞以Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)含10%胎牛血清(FBS),4mM L-glutamine,2 mM sodium pyruvate及1% penicillin/streptomycin(Invitrogen GibcoBRL,Carlsbad,CA,USA)於37℃、5% CO₂ 環境下培養。3×10⁵ 細胞接種於6-well盤，24小時後，細胞以APP695進行轉染，並以腺嘌呤處理細胞24小時，接著溶解細胞並以西方墨點法進行分析。等量蛋白質以十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳進行分離，接著轉印至聚偏氟乙烯膜。轉印後之聚偏氟乙烯膜浸泡至溶於PBS緩衝液之3%牛血清白蛋白60分鐘後，分別加入抗類澱粉β胜肽抗體(1：1000,Abcam)、抗LC3抗體(1：1000,Cell signaling)，抗機動蛋白抗體(1：5000,Cell signaling)，於4℃作用。16小時後加入對應之二抗於室溫下反應1小時。具免疫反應帶以冷光受質偵測，並以底片紀錄訊號。所得之訊號掃描後以TotalLab Quant軟體(TotalLab)進行分析。

腺嘌呤對類澱粉β胜肽及LC3-II/LC3-I比例之影響統整於表4。於Neuro2A細胞中，腺嘌呤顯著性減少類澱粉β胜肽量並且增加LC3-II/LC3-I比例。由於LC3-I轉換至LC3-II代表自體吞噬之活性，於腺嘌呤處理之細胞中，較控制組細胞較高之LC3-II/LC3-I比例，反映腺嘌呤活化自體吞噬作用之功能。

實施例7 腺嘌呤於阿茲海默症實驗小鼠模式解救類澱粉β胜肽誘導之神經退化

類澱粉β胜肽25-35購買自Sigma-Aldrich(St.Louis,Missouri)。胜肽溶解於無菌生理食鹽水並注射前培養於37℃下7天。C57BL/6J小鼠飼養於22℃、12小時日/夜循環。成鼠以ketamine(500毫克/公斤)及xyline(100毫克/公斤)麻醉，並放置於立體定位注射儀。5 nmol之類澱粉β胜肽25-35以10 μl注射器注射至側腦室，側腦是座標為-0.5 mm(前後向)、±1 mm(內外側向)、-2.5 mm(背腹向)相對於前囪。每日以腹腔注射方式給予類澱粉β胜肽注射小鼠腺嘌呤或生理食鹽水，腺嘌呤注射劑量為0.01,0.1,5 or 30毫克/公斤體重，連續注射4周。4周後，小鼠認知功能以莫里斯水迷宮方法分析。水迷宮以圓形水池進行，平台置於目標象限之水面下以 進行隱藏平台試驗。於5天隱藏平台試驗期間，每次試驗小鼠均隨機放置於水池內做為起始點，每日6次試驗。5日隱藏平台試驗後1日進行探索性試驗。進行探索性試驗時，移除隱藏平台並以目標象限對面象限作為起始點。以攝錄機紀錄小鼠於迷宮中泳動60秒之情形，以軟體分析小鼠尋找平台時間及泳動路徑。

於隱藏平台試驗中，經腺嘌呤治療之小鼠，其尋找到平台所花費時間較控制組小鼠顯著性減少。此試驗結果證實腺嘌呤可挽救阿茲海默症實驗小鼠受損之學習及記憶功能。再者，腺嘌呤治療小鼠於探索性試驗中，其停留於目標象線時間較控制組小鼠長，證明腺嘌呤增進記憶保留。

實施例8 腺嘌呤抑制纖維母細胞生長

人類纖維母細胞株3T3以Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)含10%胎牛血清(FBS),4mM L-glutamine,2 mM sodium pyruvate及1% penicillin/streptomycin(Invitrogen GibcoBRL,Carlsbad,CA,USA)於37℃、5% CO₂ 環境下培養。於細胞生長試驗中，1×10⁵ 細胞接種於6-well盤，24小時後，以指定濃度之腺嘌呤處理細胞72小時，計算存活之細胞數。細胞以trypsin-EDTA分離並以trypan blue進行染色，以血球計數器計算存活細胞數。

腺嘌呤對3T3細胞生長之影響統整於表5。由表5結果可知，腺嘌呤顯著抑制3T3細胞生長並具劑量依賴性。數據表示為三個獨立實驗的平均值±標準差。

實施例9 腺嘌呤加強傷口癒合並減少疤痕形成

C57BL/6J小鼠飼養於22℃、12小時日/夜循環。12周齡成鼠以ketamine(500毫克/公斤)及xyline(100毫克/公斤)麻醉，於小鼠背部以6-mm皮膚取樣器製造傷口。形成傷口後，於傷口施用10~1200 μM腺嘌呤或食鹽水。皮膚傷口接著以半透性透明片傷口敷料固定。小鼠以腺嘌呤或生理食鹽水處理14天後犧牲。疤痕形成以Masson’s trichrome染色分析(組織以4% paraformaldehyde固定)。

經14處理後，腺嘌呤處理傷口之癒合速度較控制組快，且根據組織染色分析，以腺嘌呤處理之傷口再生組織，其疤痕顯著較控制組傷口小。

實施例10 腺嘌呤降低反應性氧族生成

人類臍帶靜脈內皮細胞HUVEC以Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)含10%胎牛血清(FBS),4mM L-glutamine,2 mM sodium pyruvate及1% penicillin/streptomycin(Invitrogen GibcoBRL,Carlsbad,CA,USA)於37℃、5% CO₂ 環境下培養。2×10⁴ 細胞接種於96-well黑盤，24小時後，將培養基置換成含5.6或30 mM葡萄糖之DMEM培養基並加入指定濃度之腺嘌呤。處理24小時後，細胞內反應性氧族以H₂ DCF-DA偵測。細胞以PBS緩衝液清洗1次後，培養於100 μM DCF 37℃ 30分鐘。DCF螢光以盤式螢光分析儀分析(激發波長：485 nm；散射波長：530 nm)。

腺嘌呤對反應性氧族生成之影響統整於表6。腺嘌呤顯著性減少高葡萄糖誘導之反應性氧族生成並具劑量依賴性。。

實施例11 癌細胞生長抑制試驗

以人類肝癌細胞Hep G2、人類乳腺癌細胞MCF7及人類結腸癌細胞HT29進行腺嘌呤對癌細胞生長之影響。細胞以Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)含10%胎牛血清(FBS),4mM L-glutamine,2 mM sodium pyruvate及1% penicillin/streptomycin(Invitrogen GibcoBRL,Carlsbad,CA,USA)於37℃、5% CO₂ 環境下培養。1×10⁵ 細胞接種於6-well盤，24小時後，以指定濃度之腺嘌呤處理細胞72小時，計算存活之細胞數。細胞以trypsin-EDTA分離並以trypan blue進行染色，以血球計數器計算存活細胞數。

腺嘌呤對Hep G2、MCF7、HT29之50%生長抑制濃度分別為544.1,537.5 and 531.9 μM。

實施例12 腫瘤生長試驗

人類肝癌細胞Hep G2以Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)含10%胎牛血清(FBS),4mM L-glutamine,2 mM sodium pyruvate及1% penicillin/streptomycin(Invitrogen GibcoBRL,Carlsbad,CA,USA)於37℃、5% CO2環境下培養。5×10⁶ 細胞以皮下注射方式注射至8周齡NOD-SCID小鼠。移植後，每日以腹腔注射方式給予小鼠5、20、50毫克/公斤體重之腺嘌呤，每3日測量腫瘤大小。移植後14天，相較於控制組小鼠，給予腺嘌呤顯著延緩腫瘤之生長。

儘管本發明已具某些特定實施例加以說明，但熟習此項技術者應了解，在不悖離本發明之精神與範圍的情況下，可在其中做出各種改變及修改。實施例並不意圖限制本發明的範圍。本發明範疇由以下專利範圍界定，且在合理範圍內廣泛理解該等專利申請範圍。

Claims (11)

1. 一種有效劑量之腺嘌呤及/或其醫藥學上可接受之鹽用於製備活化AMPK(AMP-activated protein kinase)之組成物的用途。
2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，從而治療可被該組成物改善之疾病或生理狀況，其中該組成物包括一有效劑量之腺嘌呤及/或其醫藥學上可接受之鹽。
3. 如申請專利範圍第1項所述之用途，從而降低細胞中發炎性細胞激素之分泌及環氧化酶-2之表現，以治療發炎性生理狀況或疾病，其中該組成物包括一有效劑量之腺嘌呤及/或其醫藥學上可接受之鹽。
4. 如申請專利範圍第1項所述之用途，從而抑制纖維母細胞生長，以於傷口癒合過程抑制疤痕形成，其中該組成物包括一有效劑量之腺嘌呤及/或其醫藥學上可接受之鹽。
5. 如申請專利範圍第1項所述之用途，從而加強傷口癒合，其中該組成物包括一有效劑量之腺嘌呤及/或其醫藥學上可接受之鹽。
6. 如申請專利範圍第1項所述之用途，從而增加細胞葡萄糖之攝取，以預防或治療選自由以下組成之群之生理狀況或疾病：前期糖尿病、第二型糖尿病以及代謝症候群，其中該組成物包括一有效劑量之腺嘌呤及/或其醫藥學上可接受之鹽。
7. 如申請專利範圍第1項所述之用途，從而減少哺乳動物之血漿三酸甘油酯及減少體重，以預防或治療肥胖情況，其中該組成物包括一有效劑量之腺嘌呤及/或其醫藥學上可接受之鹽。
8. 如申請專利範圍第1項所述之用途，從而抑制細胞中類澱粉β胜肽之累積，以預防或治療阿茲海默症，其中該組成物包括一有效劑量之腺嘌呤及/或其醫藥學上可接受之鹽。
9. 如申請專利範圍第1項所述之用途，從而加強細胞自體吞噬活性，以治療可被自體吞噬作用改善之疾病或生理狀況，其中該組成物包括一有效劑量之腺嘌呤及/或其醫藥學上可接受之鹽。
10. 如申請專利範圍第1項所述之用途，從而抑制細胞活性氧族之生成，以於哺乳動物中保護及治療受活性氧族傷害之細胞，其中該組成物包括一有效劑量之腺嘌呤及/或其醫藥學上可接受之鹽。
11. 如申請專利範圍第1項所述之用途，從而抑制癌細胞生長，以預防或治療癌症，其中該組成物包括一有效劑量之腺嘌呤及/或其醫藥學上可接受之鹽。