ES2863173T3

ES2863173T3 - Compuesto para la activación de AMPK y sus usos

Info

Publication number: ES2863173T3
Application number: ES13894637T
Authority: ES
Inventors: Jen-Yi Chiu; Han-Min Chen; Cheng-Yi Kuo; Jiun-Tsai Lin; Chun-Fang Huang
Original assignee: Energenesis Biomedical Co Ltd
Current assignee: Energenesis Biomedical Co Ltd
Priority date: 2013-09-26
Filing date: 2013-09-26
Publication date: 2021-10-08
Anticipated expiration: 2033-09-26
Also published as: PL3050567T3; CA3112089C; AU2013401767B2; EP3050567B1; KR20160060137A; AU2019203668B2; CA3112089A1; KR102101465B1; CA3112108C; IL244752B; AU2020244377B2; KR20200041393A; MY182801A; DK3050567T3; WO2015042821A1; AU2019203668A1; EP3769766A1; EP3050567A4; CA3112108A1; CA2925511C

Abstract

Una composición para su uso en la prevención de la formación de cicatrices durante la cicatrización de heridas, caracterizada porque la composición comprende adenina y/o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma como único ingrediente activo eficaz en la prevención de la formación de cicatrices durante la cicatrización de heridas, en la que la adenina y/o la sal farmacéuticamente aceptable de la misma se administra a un mamífero que necesita dicho tratamiento.

Description

DESCRIPCIÓN

Compuesto para la activación de AMPK y sus usos

Campo técnico

La presente divulgación se refiere a la adenina que es útil para activar la AMPK (proteína quinasa activada por AMP) y al uso del compuesto en la prevención o el tratamiento de afecciones o enfermedades.

Antecedentes

La AMPK es un sensor de energía celular y responde a la demanda de energía. La AMPK es un heterotrímero compuesto por la subunidad a catalítica y las subunidades p y y reguladoras. Todas estas subunidades están altamente conservadas en los eucariotas. La activación de la AMPK se produce a través de la fosforilación en el residuo conservado número 172 de treonina de la subunidad a por parte de quinasas upstream como la LKB1, la quinasa dependiente de Ca2+/Calmodulina y la TAK1. Una elevada relación AMP/ATP causada por un estrés fisiológico o patológico activa la AMPK. Al activarse, la AMPK activa la vía catabólica e inhibe el anabolismo, lo que a la larga restablece el equilibrio energético celular al disminuir el consumo de ATP y promover su generación.

Como regulador de la homeostasis energética, se ha sugerido que la AMPK es una posible diana farmacológica para los síndromes metabólicos, como la diabetes de tipo II, las enfermedades cardiovasculares y la enfermedad del hígado graso. Muchos de los síndromes metabólicos están relacionados con la resistencia a la insulina. La resistencia a la insulina es una afección patológica en la que las células no responden a la insulina, por lo que el exceso de glucosa en el torrente sanguíneo no puede ser eliminado hacia el músculo esquelético o el tejido graso. La activación de la AMPK aumenta el nivel proteico de GLUT4, un transportador de glucosa, a través de la regulación transcripcional e induce la translocación de GLUT4 a la membrana plasmática de las células musculares de forma independiente de la insulina, lo que provoca un aumento de la tasa de captación de glucosa celular. La activación de la AMPK también inhibe la síntesis de ácidos grasos y colesterol mediante la supresión de la acetil-CoA carboxilasa y la HMG-CoA reductasa, respectivamente. Además, la activación de la AMPK conduce a la inhibición de varios factores de transcripción, como SREBP-1c, ChREBP y HNF-4a, y regula a la baja la expresión de enzimas que participan principalmente en la síntesis de ácidos grasos y la gluconeogénesis. Estos resultados apoyan la idea de que la AMPK es una diana de elección en el tratamiento del síndrome metabólico, en particular, de la diabetes.

Además de la regulación de la homeostasis energética, la AMPK ha estado implicada en la modulación de varios mecanismos celulares, como la inflamación, el crecimiento celular, la apoptosis, la autofagia, la senescencia y la diferenciación. Amplios estudios demuestran que la AMPK es un represor de la inflamación. La activación de la AMPK puede inhibir la inflamación mediante la supresión de la señalización NF-^kB. La señalización NF-^kB es la principal vía que activa la inmunidad innata y adaptativa. La activación de AMPK puede inhibir la actividad transcripcional de NF-kB indirectamente a través de la estimulación de SIRT1, la familia Forkhead box O (FoxO) o el coactivador del receptor activado por el proliferador de peroxisomas 1a (PGC1a). Varios grupos también han demostrado que la activación de la AMPK suprime la expresión proteica de la ciclooxigenasa-2 (COX-2). La COX-2 es una enzima inducible controlada por citoquinas proinflamatorias y factores de crecimiento. La COX-2 convierte el ácido araquidónico en prostaglandina, lo que provoca inflamación y dolor. La inhibición de la actividad o expresión de la COX-2 se ha relacionado con la antiinflamación.

Se ha demostrado que varios activadores de la AMPK poseen una función antiinflamatoria in vivo. Por ejemplo, se ha mostrado que el 5-aminoimidazol-4-carboxamida ribonucleósido (AICAR) mejora el modelo de ratón con colitis aguda y recidivante inducida por el ácido 2,4,6-trinitrobenceno sulfónico (TNBS) o el dextrano sulfato sódico. Los ratones tratados con AICAR mostraron una reducción de la pérdida de peso corporal y una atenuación significativa de la inflamación. El AICAR también mostró efectos terapéuticos en el tratamiento de la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), un modelo animal de esclerosis múltiple, y disminuye la gravedad de la lesión pulmonar inducida por LPS en ratones.

La desregulación de la vía de señalización celular puede conducir a un crecimiento celular anormal y, en última instancia, al cáncer. La diana de rapamicina en mamíferos (mTOR) es una serina/treonina quinasa que regula la proliferación celular y la autofagia. La actividad de la vía de señalización de mTOR está desregulada en muchos tipos de cáncer y, por tanto, los inhibidores de mTOR se consideran fármacos potenciales para la terapia del cáncer. Existen numerosos estudios que demuestran que la AMPK fosforila el complejo de esclerosis tuberosa 2 (TSC2) y Raptor para inhibir la vía mTOR. También se ha demostrado que una variedad de activadores de AMPK, como AICAR, metformina y fenformina, suprimen la señalización de mTOR e inhiben el crecimiento de las células cancerosas. Además, la activación de AMPK induce la autofagia mediante la supresión de la actividad de mTORC1. Debido a la inhibición de mTORC1 por AMPK, la fosforilación de Ulk1 en Ser757 disminuye y posteriormente Ulk1 puede ser fosforilada por AMPK en Ser317 y Ser777. La Ulk1 fosforilada por AMPK está activa y entonces inicia la autofagia.

En base de lo mencionado anteriormente, se ha sugerido que la AMPK es un buen objetivo en muchas enfermedades en seres humanos o condiciones patológicas, incluyendo enfermedades inflamatorias, curación de heridas, neurodegeneración, cáncer, estrés oxidativo y enfermedades cardiovasculares. De hecho, los activadores de la AMPK se han aplicado en ensayos clínicos en al menos 24 categorías de enfermedades, entre las que se incluyen enfermedades bacterianas y fúngicas, comportamientos y trastornos mentales, afecciones sanguíneas y linfáticas, cánceres y otras neoplasias, enfermedades del sistema digestivo, enfermedades y anomalías en el momento del nacimiento o antes, enfermedades del oído, la nariz y la garganta, enfermedades oculares enfermedades relacionadas con las glándulas y las hormonas, enfermedades del corazón y la sangre, enfermedades del sistema inmunitario, enfermedades de la boca y los dientes, enfermedades de los músculos, los huesos y los cartílagos, enfermedades del sistema nervioso, enfermedades nutricionales y metabólicas, enfermedades profesionales, enfermedades parasitarias, enfermedades del tracto respiratorio, enfermedades de la piel y del tejido conjuntivo, cicatrización de heridas, etc.

Los documentos WO 93/03734 A1, RO 60784 A2, WO 2010/002492 A1, EP 1302196 A1, US 2013/116215 A1, EP 1665940 A1, US 2009/131537 A1, WO 99/37151 A1, WO 2009/014642 A2, CN 102406649 A, y CN 101744191 A se refieren a composiciones que comprenden adenina, o un análogo de la misma, y su uso en la prevención o el tratamiento de una serie de enfermedades.

Sumario

La presente divulgación proporciona una composición para su uso en la prevención de la formación de cicatrices durante la cicatrización de heridas según la reivindicación 1 y una composición para su uso en la mejora de la cicatrización de heridas según la reivindicación 2.

Descripción detallada

Los inventores han descubierto que la adenina es un novedoso activador de la AMPK y tiene varias funciones biológicas. En los últimos años, se ha mostrado que la activación de la AMPK es beneficiosa para la prevención y el tratamiento de enfermedades como la prediabetes, la resistencia a la insulina, la diabetes de tipo 2, el síndrome metabólico, la obesidad, la inflamación, la enfermedad de Alzheimer, el cáncer, el estrés oxidativo y las enfermedades cardiovasculares, así como para mejorar la cicatrización de las heridas. Los inventores contemplan que tales efectos pueden atribuirse a la activación de la AMPK, que da lugar, entre otras cosas, a la reducción de la COX-2, la producción de ROS y el aumento de la captación de glucosa.

Indicaciones previstas

En base de los hallazgos del inventor (véanse ejemplos a continuación), se contempla que la adenina puede ser utilizada como agente terapéutico para varias afecciones o enfermedades a través de la activación de la AMPK. A continuación, se ofrecen ejemplos de orientación y pruebas sobre las indicaciones contempladas.

Ejemplo de referencia: La adenina en el tratamiento de la hiperglucemia, la prediabetes, la resistencia a la insulina y la diabetes de tipo 2

Recientemente se ha informado de que los activadores de la AMPK, incluidos la metformina, el A769662 y el AICAR, reducen la glucosa plasmática en modelos de ratones diabéticos o con obesidad. En la presente divulgación, 1 pM-600 pM de adenina aumentó significativamente la captación de glucosa de las células musculares C2C12 (Tabla 2). Para evaluar aún más los efectos de la adenina en la modulación del nivel de glucosa en plasma, se utilizaron ratones alimentados con una dieta alta en grasas como modelo animal de diabetes de tipo 2. El tratamiento crónico de los ratones alimentados con una dieta alta en grasas con adenina redujo significativamente la glucosa plasmática en más de un 30% y disminuyó los triacilglicéridos plasmáticos en más de un 35% en comparación con los ratones de control. También se observó una disminución de más del 15% del peso corporal (ejemplo 3). Como se utiliza en el presente documento, el término "hiperglucemia" se refiere a una afección fisiológica caracterizada por un nivel de azúcar en sangre superior a 126 mg/dL. Como se utiliza en el presente documento, "prediabetes" se refiere a una afección fisiológica caracterizada por una glucemia en ayunas superior a 100 mg/dL, pero inferior a 140 mg/dL. Como se utiliza en el presente documento, "resistencia a la insulina" se refiere a una afección fisiológica en la que todo el cuerpo o los tejidos, incluidos el hígado, el músculo esquelético y el tejido adiposo, no responden a la insulina. Como se utiliza en el presente documento, la "diabetes de tipo 2" también se refiere a la diabetes mellitus no dependiente de la insulina (DMNID) o a la diabetes del adulto. Se refiere a un trastorno metabólico causado por una producción insuficiente de insulina o una resistencia a la insulina que suele manifestarse por una glucosa en ayunas superior a 140 mg/dL. Según los ejemplos, se ha encontrado que la adenina acelera la captación de glucosa, por lo que se ha sugerido como un tratamiento útil para las afecciones o enfermedades que se asocian con la glucosa elevada en sangre.

Ejemplo de referencia: La adenina en el tratamiento de la inflamación

Se ha demostrado que varios activadores de la AMPK poseen una función antiinflamatoria in vivo. Por ejemplo, el tratamiento diario de 5-aminoimidazol-4-carboxamida ribonucleósido (AICAR) en ratones tratados con ácido 2,4,6-trinitrobenceno sulfónico (TNBS) o dextrano sulfato sódico mejora la colitis aguda y recidivante al reducir la pérdida de peso corporal y atenuar significativamente la inflamación. El tratamiento de AICAR tuvo efectos terapéuticos en la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), un modelo animal de esclerosis múltiple. El tratamiento de AICAR en ratones disminuyó la gravedad de la lesión pulmonar inducida por LPS. En la presente divulgación, la adenina inhibió la inflamación inducida por LPS in vitro: bajo la estimulación de LPS, el nivel de secreción de citoquinas proinflamatorias, incluyendo TNFa, IL-1p e IL-6, se redujo significativamente en los macrófagos tratados con adenina en comparación con las células de control. La adenina también redujo la expresión de la COX-2 inducida por el LPS en los macrófagos humanos (ejemplo 4). En el modelo de ratón de la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) inducida por TNBS, el tratamiento crónico con adenina redujo significativamente las citoquinas proinflamatorias, incluyendo el TNF, el INF^yy la IL-17 en el colon, en comparación con los ratones de control, y salvó la pérdida de peso corporal en estos ratones (ejemplo 5).

Tal como se utiliza en el presente documento, "citoquinas proinflamatorias" se refiere a las citoquinas que promueven la inflamación sistémica. "Enfermedades inflamatorias" utilizadas en el presente documento se refieren a enfermedades asociadas con la inflamación, incluyendo pero no limitándose a, la espondilitis anquilosante, la artritis (osteoartritis, artritis reumatoide, artritis psoriásica), el asma, aterosclerosis, enfermedad de Crohn, colitis, dermatitis, diverticulitis, fibromialgia, hepatitis, síndrome del intestino irritable, lupus eritematoso sistémico, nefritis, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y colitis ulcerosa. Recientemente, varios informes demuestran que la AMPK es un regulador ascendente de la COX-2 y suprime la expresión de la proteína COX-2. Al igual que los hallazgos anteriores, los inventores encontraron que un nuevo activador de AMPk , la adenina, también puede suprimir la expresión de COX-2, lo que sugiere que la adenina puede ser un compuesto útil para inhibir la inflamación mediada por COX-2. Según la presente divulgación, la adenina es capaz de inhibir la inflamación, por lo que se sugiere como un tratamiento útil para las condiciones o enfermedades asociadas a la inflamación.

La adenina en la curación de heridas y la formación de cicatrices

Se ha sugerido que la AMPK promueve la motilidad celular y mejora la cicatrización de heridas en células cultivadas. Se ha encontrado que un activador de la AMPK, el resveratrol, mejora la curación de las heridas por incisión. Además de cerrar la herida, reducir la formación de cicatrices durante el proceso de cicatrización ha sido un objetivo preferente en la medicina moderna. La cicatrización de las heridas neonatales, a diferencia de la de los adultos, no va acompañada de la formación de cicatrices. La diferencia radica en la activación de la Cox-2. En la cicatrización de heridas en adultos, la actividad de la COX-2 se eleva (por el TGF-beta), lo que da lugar a una mayor producción de prostaglandina en los lugares de la herida. La prostaglandina promueve el crecimiento de los fibroblastos y la formación de colágeno, dos factores que conducen a la formación de cicatrices. Por ello, la inhibición de las actividades de la COX-2 se ha considerado un tratamiento eficaz para prevenir la formación de cicatrices. En la presente divulgación, la adenina inhibió el crecimiento de células de fibroblastos humanos (ejemplo 8) y redujo la expresión de la COX-2. Utilizando un modelo animal, el tratamiento tópico con adenina en el lugar de la herida no sólo mejoró el cierre de la misma, sino que también redujo la formación de cicatrices (ejemplo 9). Según los datos anteriores, la administración tópica de adenina es útil para mejorar la cicatrización y prevenir la formación de cicatrices.

Ejemplo de referencia: Neurodegeneración

Los defectos en varios mecanismos celulares diferentes se han relacionado con la neurodegeneración, incluyendo la inflamación, el tráfico intracelular y la autofagia. La autofagia funciona para eliminar orgánulos disfuncionales o agregados de proteínas en la célula y desempeña un papel crucial en el mantenimiento de la homeostasis celular. La patogénesis de muchas enfermedades neurodegenerativas implica la presencia de depósitos de agregados proteicos intracelulares o extracelulares. Se ha mostrado que la eliminación de estos agregados proteicos mejora la progresión de estas enfermedades. El deterioro de la vía de la autofagia o la eliminación de las proteínas responsables de la autofagia se ha relacionado con la neurodegeneración. Se ha mostrado que la activación de la AMPK facilita la vía de la autofagia. Por lo tanto, la promoción de la vía de la autofagia a través de la activación de la AMPK puede ser una estrategia útil para prevenir o controlar la neurodegeneración. Se ha mostrado que los activadores de la AMPK disminuyen la deposición de amiloide a través de la vía de la autofagia. La administración diaria de resveratrol aumenta la duración de la vida en modelos de ratones con enfermedad de Alzheimer (EA). También se ha demostrado que otro activador de la AMPK, la curcumina, es un fármaco potencial para la terapia de la EA. En la presente divulgación, los inventores encontraron que la adenina aumentaba significativamente la actividad de autofagia y reducía la acumulación de Ap de manera dependiente de la dosis en las células Neuro2A y mejoraba la función cognitiva en el modelo de ratones con EA (ejemplos 6 y 7). Según estos hallazgos, la adenina puede ser útil en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas.

Como se utiliza en el presente documento, la "neurodegeneración" se refiere a la afección que supone la pérdida progresiva de la estructura o la función de las neuronas. La enfermedad neurodegenerativa es el resultado de procesos neurodegenerativos que incluyen la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson (EP), la enfermedad de Huntington (EH), la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la ataxia espinocerebelosa (AEC), la atrofia muscular espinal (AME), etc.

Ejemplo de referencia: Enfermedades asociadas a los ROS

Las especies reactivas de oxígeno (ERO), incluidos los radicales superóxido, hidroxilo y peróxido de hidrógeno, se producen continuamente en los tejidos. Una variedad de enfermedades han sido asociadas con el exceso de ROS incluyendo NARP (debilidad muscular neurogénica, ataxia y retinitis pigmentosa), MELAS (encefalomiopatía mitocondrial, acidosis láctica y episodios similares a un derrame cerebral), MERRF (epilepsia mioclónica y fibras rojas rasgadas), LHON (neuropatía óptica hereditaria de Leber) y KSS (síndrome de Kearns-Sayre, oftalmoplejia, ataxia, retinitis pigmentosa, defecto de conducción cardíaca y elevación de proteínas en el líquido cefalorraquídeo), la enfermedad de Parkinson (EP), la enfermedad de Alzheimer (EA), la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la enfermedad de Huntington (EH) y la ataxia de Friedreich (AF) y el envejecimiento. Numerosos informes muestran que el activador de AMPK, AICA^r, redujo la producción de ROS bajo la inducción de alta glucosa, palmitato o albúmina. En la presente divulgación, se encontró que la adenina reduce la producción de ROS de manera dependiente de la dosis en células HUVEC (Tabla 6), por lo que se sugirió como un tratamiento útil para las condiciones o enfermedades que se asocian con ROS.

Ejemplo de referencia: Cáncer

La activación de la AMPK suprime las vías de la COX-2 y la mTOR, que son mecanismos importantes del crecimiento de las células cancerosas. Debido a la contribución de mTOR y COX-2 a la agresividad del cáncer, la activación de AMPK se sugiere como una estrategia racional para la terapia del cáncer. De hecho, numerosos informes han demostrado que los activadores de la AMPK interrumpen la progresión del cáncer. Por ejemplo, se ha encontrado que la fenformina y la metformina inhiben el desarrollo y el crecimiento de los tumores de mama en modelos de ratones xenoinjertados. En la presente divulgación, se encontró que la adenina inhibe la proliferación de la línea celular de carcinoma hepatocelular humano Hep G2, la línea celular de adenocarcinoma de mama humano MCF7 y la línea celular de adenocarcinoma de colon humano de grado II HT29 (ejemplo 11). El IC50 de la adenina para HepG2, MCF7 y HT29 fue de 544,1, 537,5 y 531,9 pM, respectivamente. En ratones trasplantados con HepG2, el tratamiento crónico con adenina retrasó significativamente el crecimiento del tumor de forma dependiente de la dosis. Según la presente divulgación, el tratamiento con adenina para activar la actividad de la AMPK puede prevenir o controlar el desarrollo y la progresión del cáncer.

Ejemplo

Se han utilizado muchos ejemplos para ilustrar la presente divulgación. Los ejemplos que se presentan a continuación no deben considerarse como un límite al ámbito de la divulgación.

Ejemplo 1 (Referencia)

Ensayo de activación de la AMPK

Los efectos de la adenina en la activación de la AMPK se evaluaron basándose en la fosforilación de la proteína AMPK tras el tratamiento con adenina. La célula muscular de ratón C2C12, el fibroblasto de ratón 3T3, la célula de carcinoma de hígado humano Hep G2, la línea celular de adenocarcinoma de mama humano MCF7 y la línea celular de adenocarcinoma de colon humano de grado II HT29, la célula endotelial de vena umbilical humana HUVEC, la célula de leucemia monocítica aguda humana THP1, la célula de macrófagos humanos U937 la célula de microglía murina BV-2, la célula de neuroblastoma de ratón Neuro2A y la célula de papila dérmica se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con alto contenido de glucosa y 10% de suero fetal bovino (FBS), 4 mM de L-glutamina, 2 mM de piruvato sódico y 1% de penicilina/estreptomicina (Invitrogen GibcoBRL, Carlsbad, Calif., EE.UU.) a 37°C, bajo un 5% de CO². Las células se sembraron a razón de 3 x 105 por pocillo en placas de 6 pocillos. Veinticuatro horas después de la siembra, se añadió adenina a los medios de cultivo, tal como se indica. Después de 30 minutos, las células se lisaron y se sometieron a un análisis de transferencia western. Se separó una cantidad igual de proteína de cada muestra mediante SDS-PAGE y luego se aplicó una electrotransferencia en membranas de PVDF. Las membranas se bloquearon con un 3% de BSA en PBS durante 60 minutos y se incubaron con un anticuerpo anti-fosfo-AMPK (Thr172) (1:2.000, Cell signaling) o un anticuerpo anti-AMPK (1:2.000, Cell signaling) a 4°C durante 16 h, seguido del correspondiente anticuerpo secundario durante 1 h a temperatura ambiente (RT). Las bandas inmunorreactivas se detectaron mediante quimioluminiscencia mejorada y se registraron utilizando una película Kodak. Las señales detectadas se escanearon y luego se cuantificaron utilizando el software TotalLab Quant (TotalLab).

El efecto de la adenina en la activación de la AMPK se resume en la Tabla 1. La adenina activó significativamente la AMPK en todas las células analizadas.

Tabla 1

Ejemplo 2 (Referencia)

Captación de glucosa in vitro

Los efectos de la adenina en la captación de glucosa se analizaron midiendo la captación del análogo fluorescente de la glucosa (2-NBDG, Molecular Probes) en las células musculares C2C12. Las células C2C12 se trataron con las concentraciones indicadas de adenina durante 30 min a 37°C, y luego se incubaron con 500 pM de análogo fluorescente de la glucosa. Tras 5 min de incubación a temperatura ambiente, las células se lavaron tres veces con solución tamponada Kreb-Hepes y se fijaron en alcohol al 70%. La fluorescencia del análogo de la glucosa en las células se midió utilizando un sistema de lectura de microplacas de fluorescencia.

El efecto de la adenina sobre la captación de glucosa se resume en la Tabla 2. La adenina estimuló significativamente la captación de glucosa en las células C2C12 de manera dependiente de la dosis. Los datos se presentan como la media±SEM de tres experimentos independientes.

Tabla 2

Ejemplo 3 (Referencia)

Efectos antidiabéticos de la adenina

Para evaluar aún más los efectos de la adenina en la modulación del nivel de glucosa en plasma, se utilizaron ratones alimentados con una dieta alta en grasas como modelo animal de diabetes de tipo 2. Los ratones C57BL/6J fueron mantenidos a 22°C bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y alimentados con una dieta alta en grasas (60% kcal% de grasa) o una dieta normal ad libitum. Se administraron inyecciones intraperitoneales de adenina (de 0,1 a 50 mg/kg) o vehículo a los ratones alimentados con una dieta alta en grasas a partir de las 24 semanas de edad y se midieron las lecturas de glucosa a 1 y 3 horas. La administración de adenina por vía IP o de un vehículo sólo a los ratones alimentados con una dieta alta en grasas continuó dos veces al día durante 6 días. El día 6, se recogió plasma 1 hora después de la última dosis para analizar, evaluar y medir la glucosa y los triglicéridos en plasma.

El grupo inyectado con adenina mostró una reducción de >30% en la glucosa plasmática y de más de 35% en los triacilglicéridos plasmáticos, así como una reducción de más de 15% en el peso corporal en comparación con el grupo de control.

Ejemplo 4 (Referencia)

La adenina suprime la respuesta inflamatoria inducida por el LPS in vitro

Los efectos de la adenina en la respuesta inflamatoria se evaluaron en macrófagos humanos THP1 examinando el nivel de proteínas de la COX-2 intracelular y el TNFa, IL-1p e IL-6 secretados. La diferenciación de los monocitos THP1 en macrófagos se indujo con 50 nM de PMA durante 24 horas. Los macrófagos THP1 se estimularon además con 50 ng de LPS durante 6 horas en presencia de 10-600 pM de adenina o vehículo, seguido de lisis celular y análisis de transferencia western. Se separaron cantidades iguales de proteína mediante SDS-PAGE y luego se aplicó una electrotransferencia en membranas de PVDF. Las membranas se bloquearon con BSA al 3% en PBS durante 60 minutos y se incubaron con un anticuerpo anti-COX-2 (1:1.000, Cell signaling), un anticuerpo anti-actina (1:5.000, Cell signaling) a 4° C durante 16 horas, seguido del correspondiente anticuerpo secundario durante 1 hora a temperatura ambiente (RT). Las bandas inmunorreactivas se detectaron mediante quimioluminiscencia mejorada y se registraron utilizando una película Kodak. Las señales detectadas se escanearon y luego se cuantificaron utilizando el software TotalLab Quant (TotalLab). El TNFa, la IL-1p y la IL-6 secretados se analizaron mediante ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas.

El efecto de la adenina en la respuesta inmunitaria se resume en la Tabla 3. La expresión de COX-2 y el nivel de secreción de TNFa, IL-1p e IL-6 se redujeron significativamente en los macrófagos tratados con adenina en comparación con las células de control.

Tabla 3

Ejemplo 5 (Referencia)

La adenina suprimió la inflamación inducida por el ácido 2,4,6-trinitrobenceno sulfónico (TNBS) in vivo Para evaluar aún más los efectos de la adenina en la respuesta inflamatoria, se utilizó el modelo de ratones con enfermedad inflamatoria intestinal (EII) inducida por TNBS. Los ratones C57BL/6J se mantuvieron a 22° C, bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Se indujo la colitis recidivante con cinco dosis escalonadas de TNBS, 0,5 mg, 0,75 mg, 1,0 mg, 1,25 mg y 1,5 mg, en etanol al 50%, administradas respectivamente por 0,1 mL por ratón semanalmente. Después de la tercera administración de TNBS, se administró a los ratones una inyección intraperitoneal diaria de adenina (0,01, 0,1, 5 o 30 mg/kg de peso corporal) o solución salina. Dos días después de la quinta administración de TNBS, los ratones fueron sacrificados. Se evaluaron las citocinas inflamatorias, incluidas el TNF, el INFy y la IL-17, a partir de lisados colónicos mediante ensayos inmunoenzimáticos.

El nivel de TNF, INFy e IL-17 se redujo significativamente en el colon de los ratones tratados con adenina de manera dependiente de la dosis en comparación con los ratones no tratados con adenina. Además, el tratamiento con adenina también rescató la pérdida de peso corporal causada por el TNBS.

Ejemplo 6 (Referencia)

Péptido p amiloide y ensayo de autofagia

Se analizaron los efectos de la adenina sobre el péptido p amiloide en la célula de neuroblastoma de ratón Neuro2A. Las células Neuro2A se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con alto contenido de glucosa, que contenía un 10% de suero bovino fetal (FBS), 4 mM de L-glutamina, 2 mM de piruvato sódico y un 1% de penicilina/estreptomicina (Invitrogen GibcoBRL, Carlsbad, California, EE.UU.) a 37°C bajo un 5% de CO². Las células se sembraron a 3 x 105 por pocillo (placa de 6 pocillos). 24 horas después de la siembra, las células se transfectaron con APP695 humano y se trataron con la concentración indicada de adenina durante 24 horas, seguidas de lisis celular y análisis de transferencia western. Se separaron cantidades iguales de proteína mediante SDS-PAGE y luego se aplicó una electrotransferencia en membranas de PVDF. Las membranas se bloquearon con BSA al 3% en PBS durante 60 min y se incubaron con un anticuerpo anti-Ap (1:1.000, abcam), un anticuerpo anti-LC3 (1:1.000, Cell signaling) y un anticuerpo antiactina (1:5.000, Cell signaling) a 4 °C durante 16 h, seguido del correspondiente anticuerpo secundario durante 1 h a temperatura ambiente (RT). Las bandas inmunorreactivas se detectaron mediante quimioluminiscencia mejorada y se registraron utilizando Kodakfilm. Las señales detectadas se escanearon y luego se cuantificaron utilizando el software TotalLab Quant (TotalLab).

Los efectos de la adenina sobre la producción de sAp y la relación LC3-II/LC3-I se resumen en la Tabla 4. La adenina redujo significativamente la cantidad de Ap y aumentó la relación LC3-II/LC3-I de forma dependiente de la dosis en las células Neuro2A. Dado que la conversión de LC3-I en LC3-II es indicativa de la actividad de autofagia, la relación mayor LC3-II/LC3-I en las células tratadas con adenina refleja la capacidad de la adenina para inducir la actividad de autofagia.

Tabla 4

Ejemplo 7 (Referencia)

La adenina rescató la neurodegeneración de los ratones modelo de la enfermedad de Alzheimer inducida por Ap

El Ap25-35 se adquirió en Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri). Los péptidos se disolvieron en solución salina destilada y se agregaron mediante incubación a 37°C durante 7 días antes de la inyección. Los ratones C57BL/6J se mantuvieron a 22° C bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Los ratones adultos fueron anestesiados con ketamina (500 mg/kg) y xilacina (100 mg/kg) y colocados en un marco estereotáxico. Se inyectaron cinco nmol del Ap25-35 agregado en el ventrículo lateral utilizando una jeringa Hamilton de 10 pl. Las coordenadas anteroposterior (AP), medial-lateral (ML) y dorsoventral objetivo fueron -0,5 mm, ±1 mm y -2,5 mm respecto al bregma. Para evaluar el efecto de la adenina en la enfermedad neurodegenerativa, se inyectó diariamente por vía intraperitoneal a ratones con infusión de Ap 0,01, 0,1, 5 o 30 mg/kg de peso corporal de adenina o vehículo durante 4 semanas. Las funciones cognitivas de estos ratones se analizaron mediante el ensayo del laberinto de agua de Morris después de 4 semanas de inyección. El laberinto acuático se realizó en una piscina circular llena de agua y se sumergió una plataforma bajo la superficie del agua en el cuadrante objetivo para la prueba de plataforma oculta. Durante la prueba de plataforma oculta de 5 días, los ratones se colocaron aleatoriamente en los puntos de inicio de la piscina en cada ensayo diario (6 ensayos por día). El ensayo Probe (prospectivo, aleatorizado, abierto, ciego para el evaluador) se realizó 1 día después de la prueba de plataforma oculta de 5 días. Para el ensayo Probe se retiró la plataforma utilizada en el ensayo de plataforma oculta y el punto de partida se situó en el cuadrante opuesto al cuadrante objetivo. Se permitió a los ratones nadar en el laberinto durante 60 s y se les grabó con una cámara de vídeo. La latencia para encontrar la plataforma y las trayectorias de nado se analizaron mediante un software.

En la prueba de la plataforma oculta, los ratones con EA tratados con adenina tardaron significativamente menos tiempo en encontrar la plataforma de manera dependiente de la dosis que los ratones con EA de control. Este resultado demostró que el tratamiento con adenina rescató las deficiencias del aprendizaje especial y la memoria de los ratones con EA. Además, los ratones con EA tratados con adenina pasaron un mayor porcentaje de tiempo en el cuadrante objetivo en el ensayo Probe que los ratones con EA de control, lo que indica que la adenina mejora la retención de la memoria.

Ejemplo 8

La adenina inhibe la proliferación de fibroblastos

La línea celular de fibroblastos humanos 3T3 se cultivó en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con alto contenido de glucosa, que contenía 10% de suero bovino fetal (FBS), 4 mM de L-glutamina, 2 mM de piruvato sódico y 1% de penicilina/estreptomicina (Invitrogen GibcoBRL, Carlsbad, California, EE.UU.) a 37°C bajo 5% de CO². Para el ensayo de proliferación celular, las células 3T3 se sembraron a 1 * 105 por pocillo (placa de 6 pocillos). Veinticuatro horas después de la siembra, las células se trataron con la concentración indicada de adenina durante 72 horas y se contó el número de células viables. Las células se desprendieron utilizando una solución de tripsina-EDTA y se tiñeron con azul tripán. Las células vivas se contaron con un hemocitómetro.

Los efectos de la adenina en la proliferación de células 3T3 se resumen en la Tabla 5. Según la Tabla 5, la adenina inhibió significativamente la proliferación de las células 3T3 en forma dependiente de la dosis. Los datos se presentan como la media±SEM de tres experimentos independientes.

Tabla 5

Ejemplo 9

La adenina mejora la cicatrización de las heridas y reduce la formación de cicatrices

Ratones C57BL/6J se mantuvieron a 22°C bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Los experimentos se realizaron con ratones de 12 semanas de edad. Después de anestesiarlos con una inyección intraperitoneal de ketamina (500 mg/kg) y xilacina (100 mg/kg), se hicieron heridas de escisión de espesor total de la piel de 6 mm en el lomo de los ratones utilizando punzones de biopsia de piel de 6 mm. Inmediatamente después de la herida, se aplicó 10-1200 pM de adenina o solución salina sola en el lecho de la herida. A continuación, se cubrieron las heridas cutáneas con un apósito transparente semipermeable y se fijaron a la piel. Los ratones fueron tratados con adenina o vehículo durante 14 días y luego fueron sacrificados. La formación de la cicatriz se evaluó mediante la tinción de tricrómico de Masson (el tejido se fijó con paraformaldehído al 4%).

Tras 14 días de tratamiento, la extensión del cierre fue significativamente mayor en los ratones tratados con adenina de forma dependiente de la dosis que en los ratones de control. Según el examen histológico del tejido regenerado, el tratamiento tópico con adenina disminuyó significativamente la anchura de la cicatriz en comparación con las heridas tratadas con el vehículo.

Ejemplo 10 (Referencia)

La adenina redujo la producción de ROS

Células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs) se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contenía 10% de suero bovino fetal (FBS), 4 mM de L-glutamina, 2 mM de piruvato sódico y 1% de penicilina/estreptomicina (Invitrogen GibcoBRL, Carlsbad, Calif., EE.UU.) a 37°C bajo 5% de CO². Las células se sembraron a razón de 2*104 por pocillo en pocillos negros de 96. Veinticuatro horas después de la siembra, se cambió el medio a DMEM fresco con 5,6 o 30 mM de glucosa y se trató con la concentración indicada de adenina. Veinticuatro horas después del tratamiento, se detectaron las ERO intracelulares utilizando H2DCF-DA. Las células se lavaron una vez con PBS y luego se incubaron con 100 pM de DCF a 37°C durante 30 minutos. A continuación, se midió la fluorescencia del DCF utilizando un sistema de lectura de microplacas de fluorescencia con longitudes de onda de excitación de 485 nm y de emisión de 530 nm.

El efecto de la adenina sobre la producción de ROS se resume en la Tabla 6. La adenina redujo significativamente la producción de ROS inducida por la hiperglucemia de manera dependiente de la dosis.

Tabla 6

Ejemplo 11 (Referencia)

Ensayo de inhibición del crecimiento de las células cancerosas

Se utilizó la línea celular de carcinoma hepatocelular humano Hep G2, la línea celular de adenocarcinoma de mama humano MCF7 y la línea celular de adenocarcinoma de colon humano de grado I1HT29 para evaluar los efectos de la adenina en la proliferación celular. Estas líneas celulares se obtuvieron de ATCC y se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con alto contenido en glucosa, que contenía un 10% de suero bovino fetal (FBS), 4 mM de L-glutamina, 2 mM de piruvato sódico y un 1% de penicilina/estreptomicina (Invitrogen GibcoBRL, Carlsbad, California, EE.UU.) a 37°C bajo un 5% de CO². Las células se sembraron a 1 * 105 por pocillo (placa de 6 pocillos). Veinticuatro horas después de la siembra, las células se trataron con la concentración indicada de adenina durante 72 horas y luego se realizó el recuento de células. Las células se separaron con una solución de tripsina-EDTA y se tiñeron con azul tripán. Las células vivas se contaron con un hemocitómetro.

El IC50 de la adenina para HepG2, MCF7 y HT29 fue de 544,1, 537,5 y 531,9 pM, respectivamente.

Ejemplo 12 (Referencia)

Ensayo de crecimiento de tumor

La línea celular de carcinoma hepatocelular humano Hep G2 se cultivó en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con alto contenido de glucosa, que contenía 10% de suero bovino fetal (FBS), 4 mM de L-glutamina, 2 mM de piruvato sódico y 1% de penicilina/estreptomicina (Invitrogen GibcoBRL, Carlsbad, California, EE.UU.) a 37°C bajo 5% de CO². Para la implantación de los tumores, se inyectaron 5 * 106 células Hep G2 por vía subcutánea en ratones machos de 8 semanas de edad con inmunodeficiencia combinada severa y diabetes no obesa (NOD-SCID). Tras la implantación, los ratones fueron inyectados diariamente por vía intraperitoneal con 5, 20 o 50 mg/kg de peso corporal de adenina y el tamaño del tumor fue monitorizado cada 3 días. El crecimiento del tumor se retrasó significativamente en los ratones tratados con adenina en comparación con los ratones de control 14 días después de la implantación.

El alcance de la presente divulgación se define únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición para su uso en la prevención de la formación de cicatrices durante la cicatrización de heridas, caracterizada porque la composición comprende adenina y/o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma como único ingrediente activo eficaz en la prevención de la formación de cicatrices durante la cicatrización de heridas, en la que la adenina y/o la sal farmacéuticamente aceptable de la misma se administra a un mamífero que necesita dicho tratamiento.

2. Una composición para su uso en mejorar la cicatrización de heridas, caracterizada porque la composición comprende adenina y/o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma como único ingrediente activo eficaz para mejorar la cicatrización de heridas, en la que la adenina y/o la sal farmacéuticamente aceptable de la misma se administran a un mamífero que necesita dicho tratamiento.