WO2021085986A2 - 추출 공정이 단순화된 천연물질의 선택적 추출 방법 - Google Patents

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WO2021085986A2
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Definitions

  • the present invention relates to a method for extracting a selective natural substance with a simplified extraction process, and more particularly, inducing a physical emulsification of an optional ingredient (non-polar/polar, poorly soluble/water-soluble, HLB) or a substance among natural substances It relates to a technology for extracting and concentrating/separating by dissolving and solubilizing, and to a method for extracting a selective natural substance with a simplified extraction process using a dissolution-emulsion extraction (DEE).
  • DEE dissolution-emulsion extraction
  • Extraction is the separation by dissolving components contained in solid or liquid raw materials with a solvent.It is a general extraction method. If the raw material is solid, the solid-liquid extraction method is used, and if the raw material is liquid, the liquid-liquid Use the extraction method.
  • Liquid-liquid extraction is the separation of certain components in a mixture from other components by applying a solvent to a liquid mixture containing a solute.
  • liquid-liquid extraction method In order to extract non-polar substances in natural substances, a liquid-liquid extraction method is generally used.
  • non-polar solvents such as nucleic acid (hexane), chloroform (methane dichloride), ethyl acetate, etc. are toxic. It is very strong, and there is a problem in that the extraction process is very inefficient and complex due to several repetitive extraction processes and a drying process for removing the non-polar solvent, and the process is long, the extraction efficiency is low, and the process is long, resulting in a high production cost.
  • the raw material is extracted multiple times with methanol, and hexane is mixed in the extract for a plurality of fractions, and chloroform is mixed for a plurality of fractions, Ethyl acetate is mixed and extracted through a plurality of fractions and butyl alcohol is mixed and extracted through a plurality of fractions, and when extraction is performed, about 25 mg of Brevilin A is extracted from 300 g of dry weight of medium-sized scallop, so the extraction amount is very low and the efficiency is very low.
  • Patent Document 1
  • Patent Literature 1 discloses the extract of S. snailfish, and in this case, natural substances were extracted by the supercritical carbon dioxide extraction method, but the conditions for use of this extraction method are complicated and the extraction time takes a considerable amount of time, and the extraction efficiency is also very high. There is a low problem.
  • Patent Document 1 Chinese Patent Publication 104840457 B
  • Non-Patent Document 1 Arch Pharm Res Vol 29, No 1, 64-66, 2006.
  • Embodiments of the present invention are intended to provide a method of extracting natural substances using a dissolution-emulsion extraction (DEE) method.
  • DEE dissolution-emulsion extraction
  • the first extraction step of cold-spit extraction by precipitating natural raw materials in alcohol for less than 72 hours, lipophilic solubilizing agent and water in the first extract comprising a second extraction step of phase separation and separating the upper layer of the phase-separated solution to obtain a non-polar natural material.
  • a method for extracting a non-polar natural substance characterized in that water is added to the first extract.
  • a non-polar natural material is obtained by separating the upper layer of the phase-separated solution, adding alcohol to phase-separate again, and then separating the alcohol layer of the re-phase-separated solution.
  • a method for extracting a non-polar natural material characterized in that the temperature is raised when the phase separation composition is mixed and stirred in the second extraction step to concentrate the non-polar natural material.
  • the upper layer of the phase-separated solution provides a method for extracting a non-polar natural material, characterized in that it contains a lipophilic solubilizing agent and a non-polar natural material.
  • the non-polar natural material provides a method for extracting a non-polar natural material, characterized in that it comprises Brevilin A or a derivative thereof.
  • the non-polar natural substance may inhibit or inhibit the JAK-STAT signaling process, or activate the Wnt signaling process to increase stem cells in the hemocytosis system and hair follicles. It provides a method for extracting non-polar natural substances.
  • the natural material raw material includes any one or more selected from the group consisting of plants of the genus C. Centipeda minima , Litsea glutinous , plants of the genus Arnica and plants of the genus Helenium. It provides a method for extracting non-polar natural substances.
  • the phase separation composition 1 to 90% by weight of a lipophilic solubilizing agent; And it provides a method for extracting a non-polar natural material containing 10 to 99% by weight of water.
  • the phase separation composition provides a method for extracting a non-polar natural substance, characterized in that it further comprises 60% by weight or less of a nonionic surfactant.
  • Embodiments of the present invention relate to a method of extracting natural substances from raw materials such as wild grass, and in particular, non-polar natural substances can be extracted relatively easily with high efficiency using a dissolution-emulsion extraction (DEE) method. .
  • DEE dissolution-emulsion extraction
  • the liquid-liquid extraction method using toxic solvents since the liquid-liquid extraction method using toxic solvents is not used, steps such as drying can be omitted.Since the solvent is a material harmless to the human body, the extract containing natural substances is separated and immediately produced as a product without any other steps. It can be used, and the active substance concentration can be increased due to the limiting micelle concentration, and the absorption rate of the product can be increased by microemulsion.
  • FIG. 1 is a view for explaining a comparison between a liquid-liquid extraction method, which is an existing natural substance extraction method, and a dissolution-emulsification extraction method (DEE) according to an embodiment of the present invention.
  • DEE dissolution-emulsification extraction method
  • FIG. 3 is a photograph showing a phase-separated composition according to an extraction method according to an embodiment of the present invention.
  • phase separation composition is a view for explaining the behavior of the phase separation composition according to an embodiment of the present invention.
  • 5 to 8 are views showing changes in the amount of hair loss and the amount of hair growth as a man uses the hair tonic prepared according to an embodiment of the present invention for 4 weeks.
  • 9 to 12 are views showing changes in the amount of hair loss and the amount of hair growth as a woman uses the hair tonic prepared according to an embodiment of the present invention for 24 weeks.
  • the first extraction step of cold-spit extraction by precipitating natural raw materials in alcohol for less than 72 hours, lipophilic solubilizing agent and water in the first extract comprising a second extraction step of phase separation and separating the upper layer of the phase-separated solution to obtain a non-polar natural material.
  • first and second are used to describe various components, and the terms are used only for the purpose of distinguishing one component from other components.
  • a method of extracting a natural substance refers to a non-polar natural substance as a dissolution-emulsion extraction (DEE).
  • DEE dissolution-emulsion extraction
  • the extraction method of a non-polar natural substance includes a first extraction step of precipitating the raw material of a natural substance in alcohol for less than 72 hours to extract cold needles, and a phase separation comprising a lipophilic solubilizing agent and water in the first extract. And a second extraction step of phase-separating the composition by mixing and stirring, and a step of separating the upper layer of the phase-separated solution to obtain a non-polar natural material.
  • a non-polar natural substance is extracted from a natural material, a phase separation composition is mixed, dissolved and emulsified, and then a non-polar natural substance, which is an active substance, is extracted through phase separation.
  • 1 is a view for explaining a comparison between a liquid-liquid extraction method, which is an existing natural substance extraction method, and a dissolution-emulsification extraction method (DEE) according to an embodiment of the present invention.
  • 2 is a table comparing the characteristics of various extraction methods.
  • liquid-liquid extraction method in order to extract non-polar substances in natural substances, a liquid-liquid extraction method is generally used.
  • solvents are nucleic acid (hexane), chloroform (methane dichloride), and ethyl acetate.
  • a non-polar solvent the toxicity is very strong, the extraction process is complicated, and the extraction efficiency is low, resulting in a high production cost and a long process.
  • the raw materials of natural substances are washed with water, and the raw materials of natural substances are precipitated in alcohol for less than 72 hours and subjected to the first extraction step of cold needle extraction.
  • water may be added to the first extract, and the upper layer of the solution phase-separated in the second extraction step is separated and then phase-separated again by adding alcohol, and then re-phase separation.
  • separating the alcohol layer of the resulting solution a non-polar natural substance can be obtained.
  • an active fraction from which the solubilizing agent is separated can be obtained.
  • the second alcohol extraction is performed by dissolving the active material in the alcohol layer as much as possible in an alcohol composition of 90% or less, using the solubilizing agent is not soluble in alcohol 90% or less, and separating the solubilizing agent (Labrafac) to separate only the natural active fraction. This is a method of obtaining an oral or highly pure active fraction.
  • alcohol in the primary extract may be removed before the second extraction step.
  • the natural material raw material may be used as a plant of the genus Middle Saffron (Centipeda minima ), a plant of the Samputuri (Litsea glutinous), a plant of the genus Arnica and a plant of the genus Helenium.
  • the natural material used in the examples of the present invention was Jungdae Garipul, and Goesan Herbal Organic Agricultural Products Cooperative (https://natural-herb.co.kr) purchased and used domestic Abul vinegar (Chongdae Garipul, Yeongcheon). .
  • the natural raw materials in particular, scallop, contain a non-polar natural substance, Brevilin A or a derivative thereof.
  • the non-polar natural substance extracted from S. scallop contains Brevilin A and various derivatives thereof.
  • the non-polar natural substance which is an active ingredient extracted from S. sphenoid, can inhibit or inhibit the JAK-STAT signaling process, or activate the Wnt signaling process to increase stem cells in the hemocytosis system and hair follicles.
  • Brevilin A is a natural substance, and it is widely known to inhibit JAK (janus kinase activity) and STAT3 signaling in cancer cells ( PLoS One 8 (5) (2013) e63697 ).
  • Brevilin A inhibits and inhibits JAK-STAT signaling, and is effective in autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis.
  • Brevilin A is a major component of S. scallop, and studies on anticancer activity using it have been mainly conducted, but there are no studies on hair loss and hair growth.
  • Brevilin A inhibits or inhibits the JAK-STAT signaling process, such as colds, scabies, diabetes, nominal, eczema, coloriasis, rhinitis, swelling, asthma, sinusitis, dermatitis, hazelnutrition, seawater, fever and pertussis (child diseases).
  • JAK-STAT signaling process such as colds, scabies, diabetes, nominal, eczema, coloriasis, rhinitis, swelling, asthma, sinusitis, dermatitis, hazelnutrition, seawater, fever and pertussis (child diseases).
  • autoimmune diseases including rheumatoid arthritis and cancer or tumors
  • adult alopecia alopecia areata
  • alopecia areata
  • neurogenic alopecia alopecia areata
  • tricotillomania malignant alopecia
  • female type alopecia male pattern alopecia
  • autoimmune diseases such as hair loss, telogen hair loss, tinea head, total head alopecia, hypochondriasis, hereditary alopecia or general alopecia.
  • the non-polar natural substance includes any one or more of the following compounds, which shows the chemical structure of Brevilin A and its derivatives ( P. Wu et al. / Phytochemistry 76 (2012) 133-140 ). .
  • a natural substance is extracted from a natural substance to prepare a first extract.
  • extraction solvent several solvents such as water and alcohol may be selected and used, and alcohol was used in the present invention.
  • the extraction can be used by selecting any one of a method such as hot water extraction, cold needle extraction, reflux cooling extraction, solvent extraction, steam distillation, ultrasonic extraction, and elution, and additionally, a conventional fractionation process can be performed. .
  • Extraction according to the embodiments of the present invention may be extracted by immersing a natural material raw material in cold water.
  • a natural material raw material for example, the scallop scallop itself may be used, or a powder obtained by pulverizing it may be used.
  • the step of removing the alcohol component may be selectively performed by concentrating the first extract according to the first extraction under reduced pressure.
  • phase separation composition is added to the first extract and mixed.
  • FIG. 3 is a photograph showing a phase-separated composition according to an extraction method according to an embodiment of the present invention.
  • the phase separation composition may include a lipophilic solubilizer and water.
  • the phase separation composition 1 to 90% by weight of a lipophilic solubilizing agent; And 10 to 99% by weight of water.
  • the lipophilic solubilizing agent may be included in an amount of 50 times or less, preferably 30 times or less compared to the content of the non-polar natural material contained in the primary extract.
  • the phase separation composition may further include a nonionic surfactant.
  • the phase separation composition may contain 40% by weight or less of a nonionic surfactant.
  • phase separation composition of the present invention that is, the composition ratio of the lipophilic solubilizer, nonionic surfactant, and water
  • the state of the solution changes into phase separation, microemulsion, and emulsion.
  • Labrafac is one of the lipophilic solubilizers
  • Labrasol is one of the nonionic surfactants.
  • phase separation compositions according to the embodiments of the present invention are physically accelerated and mixed with a specific substance to emulsify in a short period of time, and at that time, a specific substance suitable for the composition is solubilized, and when separated over time, the fraction containing the solubilized specific substance is separated. It is concentrated and the layers are separated from each other. Therefore, the non-polar natural substance, which is the active substance contained in the natural raw material, is first extracted and then mixed with the phase-separating composition to make the lipophilic solubilizer and the non-polar natural substance in one layer, and the rest of water and other components in the other layer. It is contained, and phase separation occurs.
  • Examples of the present invention relate to a technology for extracting and concentrating/separating an optional component (non-polar/polar, poorly soluble/water soluble, HLB) or material among natural products by inducing physical emulsification and rapidly dissolving and solubilizing them. It relates to a method of extracting selective natural substances using the extraction method (Dissolution-Emulsion Extract, DEE), and using this, in a mixture of non-polar/polar substances, poorly soluble/water-soluble substances, or substances with high HLB/low HLB, Optionally, a substance having any one property can be extracted or vice versa.
  • DEE Dissolution-Emulsion Extract
  • the temperature when the phase separation composition contains a nonionic surfactant, in the step of mixing the phase separation composition, the temperature may be increased and mixed for clear phase separation.
  • the mixture obtained by mixing the phase separation composition with the first extract may be stirred while maintaining a temperature of 30 to 50°C, preferably while maintaining a temperature of 35 to 45°C.
  • FIG. 4 is a view for explaining the behavior of the phase separation composition according to an embodiment of the present invention.
  • Brevilin A and its derivatives that is, non-polar natural substances
  • a nonionic surfactant or a lipophilic solubilizing agent when mixed with the phase separation composition in the first extract, Brevilin A and its derivatives, that is, non-polar natural substances, are extracted and dissolved in a nonionic surfactant or a lipophilic solubilizing agent.
  • CMC critical micelle concentration
  • the nonionic surfactant exhibits a distinct compositional polarity according to the ideal gas law as the temperature increases, and the aqueous layer in the mixed solution The phase separation between the fruit and oil layers clearly occurs, and concentration occurs as much as the volume of the lipid surfactant.
  • the method of phase separation by raising the temperature can be advantageous when the addition of a lipophilic solubilizing agent having a relatively high HLB (hydrophile-lipophile balance) value, for example, Labrafac having an HLB value of 3 or less, preferably HLB is close to 1.
  • a lipophilic solubilizing agent having a relatively high HLB (hydrophile-lipophile balance) value for example, Labrafac having an HLB value of 3 or less, preferably HLB is close to 1.
  • the nonionic surfactant is Labrasol, Crodex A-PA-(RB), Geleol, Gelot 64, Suppocire AS2X, Suppocire BML, Synperonic PE/F 127, Synperonic PE/L 44 and Tefose 63. It may include any one or more selected from the group.
  • the lipophilic solubilizer is BRIJ 010-SS-(RB), Capryol 90, Capryol PGMC, Gantrez ES-435, Gantrez S-97 BF, Gelucire 43/01, Gelucire 44/14, Gelucire 50/13 , Gelucire 48/16, Labrafac CC, Labrafac Lipophile WL1349, Labrafac PG, Labrafil M 1944 CS, Labrafil M 2125 CS, Labrafil M 2130 CS, Lauroglycol 90, Lauroglycol FCC, Monosteol, Peceol, Pharmasolve, Plurol Oleique CC497, Span 20- LQ-(SG), Span 60-PA-(SG), upper Refined Oleic Acid-LQ-(JP), Super Refined Tween 80A-LQ-(MH), Surfadone LP-300, Transcutol HP, Transcutol P, TWEEN 60 -SS-(
  • the upper layer of the phase-separated solution is separated to obtain a fraction containing a target active substance, a non-polar natural substance.
  • An emulsified product may be prepared by additionally mixing an emulsifying composition in the microemulsion range, which is outside the range of the phase separation composition, to the phase separation layer, which is a high concentration active fraction extracted according to the above methods.
  • a nonionic surfactant with a relatively high HLB value for example, Labrasol having an HLB value of 12 or higher
  • Labrasol having an HLB value of 12 or higher
  • Natural substances extracted according to the embodiments of the present invention and products containing the same are not used in a liquid-liquid extraction method using a toxic solvent, so steps such as drying can be omitted, and the solvent is not affected by the human body. Since it is a harmless substance, the extract containing natural substances can be separated and used as a product immediately without any other steps, and the concentration of the active substance can be increased due to the limiting micelle concentration, and the absorption rate of the product can be increased with microemulsion.
  • the use of surfactant increases the absorption rate by increasing the solubility of the compound by using the CMC of the surfactant, and increases the absorption rate at the absorption site by reducing the size of the material to be absorbed as well as increasing the solubility of the microemulsion. have.
  • Products manufactured in this way are hair tonic, hair conditioner, hair lotion, hair nutrition lotion, hair shampoo, hair rinse, hair treatment, hair cream, hair nutrition cream, hair moisture cream, hair massage cream, hair wax, hair aerosol , Hair pack, hair nutrition pack, hair soap, hair cleansing foam, hair oil, hair dryer, hair preservation agent, hair dye, hair wave agent, hair bleaching agent, hair gel, hair glaze, hairdressing agent, hair lacquer, hair moisturizer, Products such as hair mousse, hair spray, etc., can be prepared in formulations such as cream, gel, patch, spray, ointment, warning agent, lotion, liner, pasta and cataplasma as external skin preparation, liquid, solid , It can be appropriately utilized in gaseous form.
  • Such a product is effective in improving various diseases to which the effects of Brevilin A and its derivatives can be applied.
  • Seawater, fever and pertussis (pediatric diseases), as well as rheumatoid arthritis, lupus and autoimmune diseases including cancer or tumors, and adult alopecia, alopecia areata, alopecia areata, neurogenic alopecia, alopecia areata, tricotillomania
  • autoimmune diseases such as malignant alopecia, female type alopecia, male type alopecia, androgenic alopecia, telogen alopecia, tinea head, alopecia totalis, hypotrichosis, hereditary alopecia or general alopecia.
  • the raw material for natural products is Jungdae Garipul, and Goesan Herbal Organic Agricultural Products Cooperative (https://natural-herb.co.kr) purchased domestically produced Abul vinegar (Chongdae Garipul, Yeongcheon), washed and dried.
  • 1,000 g of heavy scallop hay was precipitated in 10 L of 80% ethanol for 48 hours, followed by cold extraction with ethanol to obtain a first extract. Thereafter, the first extract was concentrated under reduced pressure to remove ethanol.
  • Example 1 Primary extract content Water content Lipophilic solubilizer content Non-polar natural substance content Parts by weight Parts by weight Content compared to non-polar natural substances Parts by weight
  • Example 1 10mg/g (1%) 25 60 60 15
  • Example 2 10 84 6
  • Example 3 25 65 40 10
  • Example 4 10
  • Example 5 25 70 20 5
  • Example 6 10
  • Example 7 25 66 35 9
  • Example 8 10mg/g (0.2%) 90 0 60 10
  • Example 9 50 44 6
  • Example 10 93 0 40 7
  • Example 11 50 46 4
  • Example 12 96 0 20 4
  • Example 13 50 48 2
  • Example 14 50 46 35 4
  • Example 15 2mg/g (1%) 90 0 60 10
  • Example 16 93 0 40 7
  • Example 17 96 0 20 4
  • Example 18 94 0 35 6
  • the temperature was raised to 60 degrees, left for 6 hours, and then the separated aqueous layer was removed and separated. After allowing to stand for 6 hours, the phase separated supernatant was separated.
  • the raw material for natural products is Jungdae Garipul, and Goesan Herbal Organic Agricultural Products Cooperative (https://natural-herb.co.kr) purchased domestically produced Abul vinegar (Chongdae Garipul, Yeongcheon), washed and dried.
  • nucleic acid 500 mL of water (DW) and 1000 mL of nucleic acid (Cyclohexane) were mixed, stirred with a vortex mixer for 1 minute, and placed in a separating funnel to separate the nucleic acid layer. And the nucleic acid layer obtained by repeating 3 times was concentrated and analyzed by HPLC.
  • the nucleic acid fraction layer was removed, and 500 mL of chloroform (MC) was mixed with the remaining aqueous layer extract, and the chloroform (MC) layer was separated by placing it in a separating funnel. And the chloroform (MC) layer obtained by repeating three times was concentrated and analyzed by HPLC.
  • MC chloroform
  • the chloroform (MC) fraction layer was removed, and 500 mL of ethyl acetate (EtAC) was mixed with the remaining aqueous layer extract, and the ethyl acetate (EtAC) layer was separated by putting it in a separating funnel. And the ethyl acetate (EtAC) layer obtained by repeating three times was concentrated and analyzed by HPLC.
  • EtAC ethyl acetate
  • the ethyl acetate (EtAC) fraction layer was removed from the above, and the remaining aqueous layer extract was concentrated and analyzed by HPLC.
  • the obtained chloroform (MC) layer was fractionated under mobile phase (MC:M, 100:1 ⁇ 1:1) conditions through Silica gel column chromatography, further separated, and analyzed by HPLC, which is shown in Table 4.
  • the raw material for natural products is Jungdae Garipul, and Goesan Herbal Organic Agricultural Products Cooperative (https://natural-herb.co.kr) purchased domestically produced Abul vinegar (Chongdae Garipul, Yeongcheon), washed and dried.
  • the supernatant (second extract) separated according to Example 7 was concentrated (naturally concentrated at elevated temperature) to not exceed 120% of the volume of the added lipophilic solubilizing agent, and Labrasol 5g, Labrafac, as an emulsifying composition in the concentrated supernatant.
  • a microemulsion was prepared by mixing 4.4g, 0.5g of Lecithin, and 0.1g of D-pantenol. Accordingly, a microemulsion of 12mg/mL, 10mL, and a tonic formulation having a yield of 87.5% were prepared. These emulsions contain safe excipients, not organic solvents, and can be used as various types of products such as ointments and tonics on their own without any additional process (Preparation Example 1).
  • the supernatant (second extract) separated according to Example 7 was concentrated (naturally concentrated at elevated temperature) so as not to exceed 120% of the volume of the added lipophilic solubilizing agent, and mixed with 90% ethanol in the concentrated supernatant to provide lipophilicity.
  • a fraction containing Brevilin A and derivatives from which the solubilizing agent was removed was prepared by layer-separating the solubilizing agent.
  • braviline-A depends on the lipophilic solubilizer (Lipds sulubilizer) regardless of the concentration amount. This is a photograph to explain the state that it can be separated and extracted by selectively concentrating and its derivatives, and has a more suitable performance for a trace extraction method.
  • the phase separation composition of the present invention can extract all natural substances contained in the extract, substantially regardless of the concentration of the non-polar natural substance to be extracted contained in the primary extract. That is, it can be used to efficiently extract or remove a trace amount of material. That is, although the concentration of the non-polar natural substance to be extracted is lowered, the phase-separated region is reduced in the same or similar to this, but it was found that the desired substance can be separated by sufficiently performing phase separation. Most of the pesticides remaining in fruits and vegetables are non-polar (poorly soluble/lipophilic). They are not washed well and are deposited on the fibers of plants. In order to remove pesticides remaining in these plants, it is possible to use the phase separation composition.
  • the hair tonic prepared according to Preparation Example 1 was measured for the amount of hair loss and the change in hair growth amount according to the use of the hair tonic for a certain period of time in general men and women. Hair Tonic was used in such a way that the hair was cleanly applied to the scalp after shampooing according to the user's level.
  • the amount of hair loss it was determined by the number of strands of hair filtered after a shower, and the amount of hair growth was determined by the hair density in the same area as measured by a hair analyzer.
  • 5 to 8 are views showing changes in the amount of hair loss and the amount of hair growth as a man uses the hair tonic prepared according to an embodiment of the present invention for 4 weeks.
  • 9 to 12 are views showing changes in the amount of hair loss and the amount of hair growth as a woman uses the hair tonic prepared according to an embodiment of the present invention for 24 weeks.
  • FIGS. 5 to 12 it was found that the amount of hair loss gradually decreased as the amount of hair tonic was used in a certain amount, and it was found that the amount of hair loss increased somewhat as the use was stopped during the experiment period. In particular, in the case of a female experimenter, most of the hair tonics of a certain amount or more were periodically used as shown in FIG. 8, and as a result, it was found that the amount of hair loss continued to decrease. In FIGS. 6 to 8 and 10 to 12, the amount of hair growth in both experimenters increased, and in the case of a male case, the hair density increased by about 19% as in FIG. 7, and the amount of hair loss as in FIG. 8 was about 36.

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Abstract

비극성 천연물질의 추출 방법이 개시된다. 본 발명의 일 실시예에 따른 비극성 천연물질의 추출 방법은, 천연물 원료를 에탄올에 72시간 이내의 시간 동안 침전시켜 냉침 추출하는 1차 추출 단계, 1 차 추출액에 친유성 가용화제 및 물을 포함하는 상분리 조성물을 혼합 및 교반하여 상분리시키는 2차 추출 단계 및 상분리된 용액의 상층을 분리하여 비극성 천연물질을 수득하는 단계를 포함한다. 따라서, 비극성 천연물질을 용해-유화 추출법(Dissolution-Emulsion Extract, DEE)을 이용하여 고효율로 비교적 용이하게 추출할 수 있다.

Description

[규칙 제26조에 의한 보정 06.11.2020]　추출 공정이 단순화된 천연물질의 선택적 추출 방법
본 발명은 추출 공정이 단순화된 선택적인 천연물질의 추출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 천연물 중 선택적인 성분(비극성/극성, 난용성/수용성, HLB) 또는 물질을 물리적인 유화를 유도해 빠르게 용해 및 가용화시켜 추출하고 농축/분리 하는 기술에 관한 것으로 용해-유화 추출법(Dissolution-Emulsion Extract, DEE)을 이용한 추출 공정이 단순화된 선택적 천연물질의 추출방법에 관한 것이다.
추출(extraction)이란 고체 또는 액체 형태의 원료에 함유된 성분을 용제로 용해하여 분리하는 것으로, 일반적인 추출 방법으로 원료가 고체인 경우 고-액 추출 방법을 사용하며, 원료가 액체인 경우 액-액 추출 방법을 사용한다.
액-액 추출 방법(liquid-liquid extraction; LLE)은 용질을 함유하고 있는 액체 혼합물에 용제를 작용시켜 혼합물 중의 특정 성분을 다른 성분들로부터 분리하는 것이다.
천연물질 내 비극성 물질을 추출하기 위하여, 일반적으로 액-액 추출 방법이 사용되며, 액-액 추출시 핵산(hexane), 클로로포름(methane dichloride), 에틸아세테이트(ethyl acetate) 등과 같이 비극성 용매는 독성이 매우 강하며, 반복적인 여러 추출 과정 그리고 비극성 용매 제거를 위한 건조 과정에 의하여 추출 과정이 매우 비효율적이고 복잡하며 공정이 길고, 추출 효율이 낮고 공정이 길어짐에 따라 높은 생산 단가를 나타내는 문제점이 있다.
예를 들어, 중대가리풀(Centipeda minima)로부터 Brevilin A를 추출하기 위한 과정은, 원료를 메탄올로 복수 회에 걸쳐 추출하고, 추출액에 헥산을 혼합하여 분획 복수 회, 클로로포름을 혼합하여 분획 복수 회, 에틸아세테이트를 혼합하여 분획 복수 회, 부틸알코올을 혼합하여 분획 복수 회를 통하여 추출하며, 추출시 중대가리풀 건조 중량 300g에서 Brevilin A는 25mg 정도 추출되어 그 추출량이 극미량으로 효율이 매우 낮다.(비특허문헌1)
다른 추출 방법으로 실험 결과, 레진 추출의 경우 추출 효율이 더 낮은 것으로 나타났고, 비누화/불검화 추출의 경우 역시 추출이 안되거나 추출 효율이 매우 낮은 것으로 나타났다.
중대가리풀의 추출물에 관하여 특허문헌 1에 개시되어 있고, 여기에서는 초임계 이산화탄소 추출법으로 천연물질을 추출하였으나, 이러한 추출법은 사용되기 위한 조건이 복잡하고 추출 시간이 상당시간 소요되며, 추출 효율 역시 매우 낮은 문제점이 있다.
이에 천연물 등에서, 비극성을 가지는 천연물질을 용이하게 고효율로 추출하여 그 추출물을 용이하게 활용할 수 있는 신규한 추출 방법의 개발이 필요하다.
특허문헌 1: 중국 등록특허공보 104840457 B
비특허문헌 1: Arch Pharm Res Vol 29, No 1, 64-66, 2006.
본 발명의 실시예들은 용해-유화 추출법(Dissolution-Emulsion Extract, DEE)을 이용하여 천연물질을 추출하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 천연물질을 선택적으로 추출하는 방법에 따르면, 천연물 원료를 알코올에 72시간 이내의 시간 동안 침전시켜 냉침 추출하는 1차 추출 단계, 1 차 추출액에 친유성 가용화제 및 물을 포함하는 상분리 조성물을 혼합 및 교반하여 상분리시키는 2차 추출 단계 및 상분리된 용액의 상층을 분리하여 비극성 천연물질을 수득하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 2차 추출 단계 이전에, 상기 1차 추출액에 물을 첨가하는 것을 특징으로 하는 비극성 천연물질의 추출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상분리된 용액의 상층을 분리하여 알코올을 첨가하여 재차 상분리시킨 후, 재상분리된 용액의 알코올층을 분리하여 비극성 천연물질을 수득하는 것을 특징으로 하는 비극성 천연물질의 추출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 2차 추출 단계 이전에, 상기 1차 추출액의 알코올을 제거하는 것을 특징으로 하는 비극성 천연물질의 추출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 2차 추출 단계 이후에, 상기 2차 추출액의 알코올을 제거하는 것을 특징으로 하는 비극성 천연물질의 추출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 2차 추출 단계에서 상분리 조성물을 혼합 및 교반시 승온하여 비극성 천연물질을 농축시키는 것을 특징으로 하는 비극성 천연물질의 추출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 상분리된 용액의 상층은 친유성 가용화제 및 비극성 천연물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 비극성 천연물질의 추출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 비극성 천연물질은 Brevilin A 또는 이의 유도체를 포함하는 것을 특징으로 하는 비극성 천연물질의 추출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 비극성 천연물질은 JAK-STAT 신호전달과정을 저해 또는 억제하거나, Wnt 신호전달과정을 활성화시켜 혈구형성계통과 모낭에서 줄기세포를 증가시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 비극성 천연물질의 추출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 천연물 원료는 중대가리풀( Centipeda minima), 삼푸트리( Litsea glutinous), Arnica 속 식물 및 Helenium 속 식물로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 비극성 천연물질의 추출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 상분리 조성물은, 친유성 가용화제 1 내지 90중량%; 및 물 10 내지 99중량%를 포함하는 비극성 천연물질의 추출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 상분리 조성물은 60 중량% 이하의 비이온성 계면활성제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 비극성 천연물질의 추출 방법을 제공한다.
본 발명의 실시예들은 야생초 등의 원료로부터 천연물질을 추출하는 방법에 관한 것으로, 특히 비극성 천연물질을 용해-유화 추출법(Dissolution-Emulsion Extract, DEE)을 이용하여 고효율로 비교적 용이하게 추출할 수 있다.
또한, 독성 용매를 사용하는 액-액 추출법을 사용하지 않음으로 인하여 건조 등의 단계를 생략할 수 있으며, 용매가 인체에 무해한 물질이므로 천연물질이 함유된 추출액을 분리하여 즉시 다른 단계없이 바로 제품으로서 사용이 가능하며, 한계미셀농도로 인하여 활성 물질 농도를 증가시킬 수 있으며, 마이크로 에멀전화로 제품의 흡수율을 증가시킬 수 있다.
도 1은 기존 천연물질의 추출 방법인 액-액 추출 방법과 본 발명의 일 실시예에 따른 용해-유화 추출법(DEE)을 비교하여 설명하기 위한 도면이다.
도 2는 여러가지 추출 방법의 특성을 비교한 표이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 추출 방법에 따라 상분리된 조성물을 나타내는 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 상분리 조성물의 거동을 설명하기 위한 도면이다.
도 5 내지 도 8은 본 발명의 실시예에 따라 제조된 헤어 토닉을 남성이 4주 간 사용함에 따른 탈모량 및 발모량의 변화를 나타내는 도면들이다.
도 9 내지 도 12는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 헤어 토닉을 여성이 24주일 간 사용함에 따른 탈모량 및 발모량의 변화를 나타내는 도면들이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 천연물질을 선택적으로 추출하는 방법에 따르면, 천연물 원료를 알코올에 72시간 이내의 시간 동안 침전시켜 냉침 추출하는 1차 추출 단계, 1 차 추출액에 친유성 가용화제 및 물을 포함하는 상분리 조성물을 혼합 및 교반하여 상분리시키는 2차 추출 단계 및 상분리된 용액의 상층을 분리하여 비극성 천연물질을 수득하는 단계를 포함한다.
이하, 본 발명의 실시예들에 따른 추출 공정이 단순화된 천연물질의 선택적 추출 방법, 이에 따라 추출된 천연물질 및 이의 용도 등에 대하여 설명하기로 한다.
그에 앞서, 본 명세서에 사용되는 전문 용어는 단지 특정 실시예를 언급하기 위한 것이며, 본 발명을 한정하는 것을 의도하지 않는다. 그리고, 여기서 사용되는 단수 형태들은 문구들이 이와 명백히 반대의 의미를 나타내지 않는 한 복수 형태들도 포함한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 '포함' 또는 '함유'의 의미는 특정 특성, 영역, 정수, 단계, 동작, 요소 또는 성분을 구체화하며, 다른 특정 특성, 영역, 정수, 단계, 동작, 요소, 또는 성분의 부가를 제외시키는 것은 아니다.
본 발명에서, 제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는 데 사용되며, 상기 용어들은 하나의 구성 요소를 다른 구성 요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어는 단지 예시적인 실시예들을 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도는 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다", "구비하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 실시된 특징, 숫자, 단계, 구성 요소 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 구성 요소, 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 예시하고 하기에서 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명에서는 천연물질의 추출 방법은 비극성 천연물질을 용해-유화 추출법(Dissolution-Emulsion Extract, DEE)으로 지칭한다.
본 발명의 실시예에 다른 비극성 천연물질의 추출 방법은, 천연물 원료를 알코올에 72시간 이내의 시간 동안 침전시켜 냉침 추출하는 1차 추출 단계, 1 차 추출액에 친유성 가용화제 및 물을 포함하는 상분리 조성물을 혼합 및 교반하여 상분리시키는 2차 추출 단계 및 상분리된 용액의 상층을 분리하여 비극성 천연물질을 수득하는 단계를 포함한다.
용해-유화 추출법에 따르면, 천연물 원료 내 비극성 천연물질을 추출하여 상분리 조성물을 혼합하여 용해 및 유화시킨 후, 상분리를 통하여 활성물질인 비극성 천연물질을 추출한다.
도 1은 기존 천연물질의 추출 방법인 액-액 추출 방법과 본 발명의 일 실시예에 따른 용해-유화 추출법(DEE)을 비교하여 설명하기 위한 도면이다. 도 2는 여러가지 추출 방법의 특성을 비교한 표이다.
앞서 설명한 바와 같이, 천연물질 내 비극성 물질을 추출하기 위하여, 일반적으로 액-액 추출 방법이 사용되며, 액-액 추출시 용매들은 핵산(hexane), 클로로포름(methane dichloride), 에틸아세테이트(ethyl acetate) 등과 같이 비극성 용매로서 독성이 매우 강하며, 추출 과정이 복잡하고, 추출 효율이 낮아 높은 생산 단가 및 공정이 길어지는 문제점이 있다.
먼저 천연물 원료를 물로 세척하고, 천연물 원료를 알코올에 72시간 이내의 시간 동안 침전시켜 냉침 추출하는 1차 추출 단계를 거친다.
일 실시예에 있어서, 상기 2차 추출 단계 이전에, 상기 1차 추출액에 물을 첨가할 수 있으며, 2차 추출 단계에서 상분리된 용액의 상층을 분리하여 알코올을 첨가하여 재차 상분리시킨 후, 재상분리된 용액의 알코올층을 분리하여 비극성 천연물질을 수득할 수 있다. 알코올층을 분리하여 가용화제가 분리된 활성분획을 수득할 수 있다. 여기서, 2번째 알코올 추출은 가용화제가 알콜 90% 이하에서는 녹지 않는 특성을 이용하여 90% 이하의 알코올 조성에서 활성물질을 알코올층에 최대한 녹게하고 가용화제(Labrafac)를 분리시켜 분리된 천연 활성 분획만을 수득하여 경구 또는 순도 높은 활성 분획을 얻는 방법이다.
다른 실시예에 있어서, 상기 2차 추출 단계 이전에, 상기 1차 추출액의 알코올을 제거할 수 있다.
본 발명에 일 실시예에 있어서, 상기 천연물 원료는 중대가리풀( Centipeda minima), 삼푸트리( Litsea glutinous), Arnica 속 식물 및 Helenium 속 식물을 사용할 수 있다.
본 발명의 실시예에서 사용된 천연물 원료는 중대가리풀로, 괴산약초유기농산물협동조합(https://natural-herb.co.kr) 국내산 아불식초(중대가리풀, 영천)을 구입하여 사용하였다.
아불식초(중대가리풀, Centipeda minima)에 Brevilin A가 함유되어 있다는 문헌은 다수 발견되었으며, 일부 문헌에 샴푸트리( Litsea glutinous)에도 Brevilin A가 함유되어 있다고 보고한 문헌이 존재한다. 뿐만 아니라, Arnica 속 식물( Arnica longifolia, Arctium lappa, Arnica chamissonis subsp. Foliosa, Arnica chamissonis Less.) 및 Helenium 속 식물( Helenium autumnale L, Helenium alternifolium, Helenium pinnatifidum, Helenium vernale, Helenium brevifolium, and Helenium flexuosum)에도 일부 Brevilin A가 함유되어 있다는 문헌이 발견되었다.
예를 들어, 상기 천연물 원료들, 특히 중대가리풀은 비극성 천연물질인 Brevilin A 또는 이의 유도체를 포함하고 있다. 중대가리풀로부터 추출된 비극성 천연물질은 Brevilin A와 다양한 이의 유도체 화합물을 포함하고 있다.
중대가리풀로부터 추출된 유효성분인 상기 비극성 천연물질은 JAK-STAT 신호전달과정을 저해 또는 억제하거나, Wnt 신호전달과정을 활성화시켜 혈구형성계통과 모낭에서 줄기세포를 증가시킬 수 있다.
Brevilin A는 천연물질로서, 암세포에서 JAK(janus kinase activity)를 저해하고, STAT3 신호 전달을 억제하는 것은 널리 알려져 있다( PLoS One 8 (5) (2013) e63697).
즉, Brevilin A는 JAK-STAT 신호전달을 저해 및 억제하여, 류마티스관절염 등 자가면역 질환에 효과가 있다.
문헌 전반적으로 Brevilin A는 중대가리풀의 주요 성분이며, 이를 이용한 항암 활성에 대한 연구가 주로 이루어졌으나, 탈모 및 발모에 관한 연구는 부재한 실정이다.
예를 들어, Brevilin A는 JAK-STAT 신호전달과정의 저해 또는 억제함으로써 감기, 개창, 당뇨, 명목, 백태, 비색증, 비염, 창종, 천식, 축농증, 피부염, 학질, 해수, 해열 및 백일해(소아질환) 뿐만 아니라 류마티스 관절염과 암 또는 종양을 포함하는 자가면역 질환 및 장년성 탈모, 결발성탈모, 원형탈모, 신경성탈모, 비강성탈모, 트리코틸로 마니아, 악성탈모, 여성형탈모, 남성형 탈모, 안드로겐성탈모, 휴지기탈모, 두부백선, 전두탈모, 감모증, 유전성탈모 또는 전신탈모 등 자가면역 질환의 치료에 효과를 나타낼 수 있다.
예를 들어, 상기 비극성 천연물질은 하기의 화합물들 중 어느 하나 이상을 포함하며, 이는 Brevilin A 및 이의 유도체들의 화학 구조를 나타낸 것이다( P. Wu et al. / Phytochemistry 76 (2012) 133-140).
Figure PCTKR2020014754-appb-img-000001
본 발명의 일 실시예에 따른 비극성 천연물질의 추출방법은, 먼저 천연물 원료에서 천연물질을 추출하여 1차 추출액을 제조한다.
추출용매는 물, 알코올 등 여러 용매를 선택하여 사용할 수 있으며, 본 발명에서는 알코올을 사용하였다.
예를 들어, 추출은 열수 추출법, 냉침 추출법, 환류냉각 추출법, 용매 추출법, 수증기 증류법, 초음파 추출법, 용출법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있으며, 추가적으로 통상의 분획 공정을 수행할 수 있다.
본 발명의 실시예들에 따른 추출은 천연물 원료를 냉수에 담궈 냉침 추출할 수 있다. 예를 들어, 천연물 원료는 중대가리풀 자체를 사용하거나, 이를 분쇄한 분말을 사용할 수 있다.
이후, 1차 추출에 따른 1차 추출액을 감압 농축하여 알코올 성분을 제거하는 단계를 선택적으로 진행할 수 있다. 농축하는 단계를 거치지 않은 1차 추출액을 이용하여 바로 다음 단계로 넘어가더라도 본 발명을 달성하는데 차이는 없으나, 보다 명확한 상분리 및 추출 효율의 측면에서 불필요한 알코올 성분을 제거하는 것이 바람직할 수 있다.
이후, 상기 1차 추출액에 상분리 조성물을 첨가하여 혼합한다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 추출 방법에 따라 상분리된 조성물을 나타내는 사진이다.
상기 상분리 조성물은 친유성 가용화제 및 물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 상분리 조성물은, 친유성 가용화제 1 내지 90중량%; 및 물 10 내지 99중량%를 포함할 수 있다. 상기 친유성 가용화제는 상기 1차 추출액에 포함된 비극성 천연물질 함량 대비하여 50배 이하로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 30배 이하로 포함될 수 있다.
예를 들어, 상기 상분리 조성물은 비이온성 계면활성제를 더 포함할 수 있다. 상기 상분리 조성물은 비이온성 계면활성제를 40 중량% 이하로 포함할 수 있다.
본 발명의 상분리 조성물의 성분, 즉 친유성 가용화제, 비이온성 계면활성제 및 물의 조성비에 따라 상분리(Phase separation), 마이크로 에멀전(Microemulsion), 에멀전(emulsion)으로 용액의 상태가 변화한다. Labrafac은 친유성 가용화제의 하나이고, Labrasol은 비이온성 계면활성제의 하나이다.
본 발명의 실시예들에 따른 상분리 조성물들은 특정 물질과 물리적으로 가속 혼합하여 단기적으로 에멀전화되고 그때에 조성에 맞는 특정 물질을 가용화하고, 시간이 지나 분리될 때에는 가용화된 특정 물질을 포함한 분획이 분리 농축되는 되어 서로 층이 분리되는 성질을 나타낸다. 따라서, 천연물 원료 내에 함유된 활성 물질인 비극성 천연물질은 1차 추출된 이후에, 상분리 조성물과 혼합하여 친유성 가용화제와 비극성 천연물질이 하나의 층에, 그리고 나머지 물 및 기타 성분이 다른 층에 함유되어 상분리가 일어난다.
본 발명의 실시예들은 천연물 중 선택적인 성분(비극성/극성, 난용성/수용성, HLB) 또는 물질을 물리적인 유화를 유도해 빠르게 용해 및 가용화시켜 추출하고 농축/분리 하는 기술에 관한 것으로 용해-유화 추출법(Dissolution-Emulsion Extract, DEE)을 이용한 선택적 천연물질의 추출방법에 관한 것이며, 이를 활용하여 비극성/극성 물질, 난용성/수용성 물질 또는 높은 HLB/낮은 HLB를 가지는 물질들이 혼합되어 있는 혼합물에서, 선택적으로 어느 하나의 성질을 가지는 물질을 추출하거나 이와 반대로 제거할 수 있다.
본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 상분리 조성물이 비이온성 계면활성제를 포함하는 경우, 상기 상분리 조성물을 혼합하는 단계에서, 보다 명확한 상분리를 위하여 승온시키며 혼합할 수 있다. 예를 들어, 상분리 조성물을 1차 추출액에 혼합한 혼합물을 30 내지 50℃의 온도를 유지하면서 교반할 수 있으며, 바람직하게는 35 내지 45℃의 온도를 유지하면서 교반할 수 있다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 상분리 조성물의 거동을 설명하기 위한 도면이다. 도 4를 참조하면, 1차 추출액에 상기 상분리 조성물과 혼합하게 되면 Brevilin A 및 이의 유도체, 즉 비극성 천연물질이 비이온성 계면활성제 내지 친유성 가용화제에 추출 및 용해된다. 이때 추가로 고속 혼합을 하면 혼합물 내 계면활성제 및 가용화제의 표면적이 증가하면서 추출 내지 용해되지 않은 일부 비극성 천연물질이 대부분이 용해되어 순간적인 한계미셀농도(critical micelle concentration; CMC) 상태가 되며, 이때, 혼합액의 온도가 증가함에 따라 클라우드 포인트(cloud point)를 다다르게 되면, 이온성 계면활성제와 달리 비이온성 계면활성제는 온도의 증가에 따라 이상기체 법칙에 따라 뚜렷한 조성의 극성을 나타내게 되고, 혼합액 중 수층과 유층이 서로 명확하게 상분리가 일어나며, 지질 계면 활성제의 부피만큼 농축이 일어나게 된다.
특히, 승온시켜 상분리 시키는 방법은 HLB(hydrophile-lipophile balance) 값이 비교적 높은 친유성 가용화제, 예를 들어, HLB 값이 3이하, 바람직하게는 HLB가 1에 가까운 Labrafac의 첨가시 유리하게 작용할 수 있다.예를 들어, 상기 비이온성 계면활성제는 Labrasol, Crodex A-PA-(RB), Geleol, Gelot 64, Suppocire AS2X, Suppocire BML, Synperonic PE/F 127, Synperonic PE/L 44 및 Tefose 63로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 친유성 가용화제는 BRIJ 010-SS-(RB), Capryol 90, Capryol PGMC, Gantrez ES-435, Gantrez S-97 BF, Gelucire 43/01, Gelucire 44/14, Gelucire 50/13, Gelucire 48/16, Labrafac CC, Labrafac Lipophile WL1349, Labrafac PG, Labrafil M 1944 CS, Labrafil M 2125 CS, Labrafil M 2130 CS, Lauroglycol 90, Lauroglycol FCC, Monosteol, Peceol, Pharmasolve, Plurol Oleique CC497, Span 20-LQ-(SG), Span 60-PA-(SG), upper Refined Oleic Acid-LQ-(JP), Super Refined Tween 80A-LQ-(MH), Surfadone LP-300, Transcutol HP, Transcutol P, TWEEN 60-SS-(SG), TWEEN 80 HP-LQ-(MH), TWEEN 80-LQ-(SG) 및 Vitamin E TPGS로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
상분리된 용액의 상층을 분리하여 목표로 하는 활성물질인 비극성 천연물질을 함유하는 분획을 수득한다.
상기의 방법들에 따라 추출된 고농도의 활성 분획인 상분리층에 상기 상분리 조성물의 범위를 벗어난, 마이크로 에멀전 범위의 에멀전화 조성물을 추가로 혼합하여, 에멀전화된 제품을 제조할 수 있다.
특히, 고농도의 활성 분획에 HLB값이 비교적 높은 비이온성 계면활성제, 예를 들어, HLB 값이 12 이상인 Labrasol의 첨가시 마이크로 에멀전화(micro emulsion)를 통하여 흡수 촉진 및 피부투과도를 높이는데 유리하게 작용할 수 있다.
본 발명의 실시예들에 따라 추출된 천연물질 및 이를 포함하는 조성물 등의 제품은 독성 용매를 사용하는 액-액 추출법을 사용하지 않음으로 인하여 건조 등의 단계를 생략할 수 있으며, 용매가 인체에 무해한 물질이므로 천연물질이 함유된 추출액을 분리하여 즉시 다른 단계없이 바로 제품으로서 사용이 가능하며, 한계미셀농도로 인하여 활성 물질 농도를 증가시킬 수 있으며, 마이크로 에멀전화로 제품의 흡수율을 증가시킬 수 있다.
일반적으로 계면활성제의 사용은 계면활성제의 CMC를 이용하여 화합물의 용해도를 높여 흡수율을 증가시키게 되며, 마이크로 에멀전도 용해도 높이는 것 뿐만 아니라 흡수시키려는 물질의 사이즈를 감소시켜 흡수 사이트에서의 흡수율을 증가시킬 수 있다.
이와 같이 제조된 제품은, 헤어토닉, 헤어컨디셔너, 헤어로션, 헤어영양로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어크림, 헤어영양크림, 헤어모이스처크림, 헤어맛사지크림, 헤어왁스, 헤어에어로졸, 헤어팩, 헤어영양팩, 헤어비누, 헤어클랜징폼, 헤어오일, 모발건조제, 모발보존처리제, 모발염색제, 모발용웨이브제, 모발탈색제, 헤어젤, 헤어글레이즈, 헤어드레싱어, 헤어래커, 헤어모이스처라이저, 헤어무스, 헤어스프레이 등의 제품, 피부외용제로서 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제와 카타플라즈마제 등의 제형으로 제조될 수 있고, 액상, 고체상, 기체상으로 적절히 활용될 수 있다.
이와 같은 제품은 Brevilin A 및 이의 유도체들의 효과를 적용할 수 있는 다양한 질환 개선에 효과적이며, 예를 들어, 감기, 개창, 당뇨, 명목, 백태, 비색증, 비염, 창종, 천식, 축농증, 피부염, 학질, 해수, 해열 및 백일해 (소아질환) 뿐만 아니라 류마티스 관절염, 루푸스와 암 또는 종양을 포함하는 자가면역 질환 및 장년성 탈모, 결발성탈모, 원형탈모, 신경성탈모, 비강성탈모, 트리코틸로 마니아, 악성탈모, 여성형탈모, 남성형 탈모, 안드로겐성탈모, 휴지기탈모, 두부백선, 전두탈모, 감모증, 유전성탈모 또는 전신탈모 등 자가면역 질환의 치료에 효과를 나타낼 수 있다.
이하, 본 발명의 비극성 천연물질의 추출 방법에 관한 실시예를 통하여 보다 상세히 설명하도록 한다.
본 발명의 추출 방법은, 천연물 원료를 냉침 추출 및 알코올 추출하고, 추출액에 상분리 조성물을 혼합하여 상분리 시킨 후, 일부 층을 분리하여 비극성 천연물질을 수득한다.
실시예
천연물 원료는 중대가리풀로, 괴산약초유기농산물협동조합(https://natural-herb.co.kr) 국내산 아불식초(중대가리풀, 영천)을 구입하고, 세척 및 건조하였다.
중대가리풀 건초 1,000g을 48시간 동안 80% 에탄올 10L에 침전시켜 에탄올 냉침 추출하여 1차 추출액을 얻었다. 이후, 1차 추출액을 감압 농축하여 에탄올을 제거하였다.
감압 농축한 1차 추출액 및 상분리 조성물을 하기 표 1의 조성비에 따라 혼합한 후, 60분 간 고속 혼합(호모게나이져 사용)하하고, 분획펀넬(분리기)로 옮겨 교반기로 30분간 교반 후, 승온하여 수층을 제거하고 분리하였다.
1차 추출액 함량 물 함량 친유성 가용화제 함량
비극성 천연물질 함량 중량부 중량부 비극성 천연물질 대비 함량 중량부
실시예1 10mg/g(1%) 25 60 60 15
실시예2 10 84 6
실시예3 25 65 40 10
실시예4 10 86 4
실시예5 25 70 20 5
실시예6 10 88 2
실시예7 25 66 35 9
실시예8 10mg/g(0.2%) 90 0 60 10
실시예9 50 44 6
실시예10 93 0 40 7
실시예11 50 46 4
실시예12 96 0 20 4
실시예13 50 48 2
실시예14 50 46 35 4
실시예15 2mg/g(1%) 90 0 60 10
실시예16 93 0 40 7
실시예17 96 0 20 4
실시예18 94 0 35 6
이후, 60도로 승온 후, 6시간 방치한 후 분리된 수층을 제거하여 분리하였다. 6시간 방치한 후, 상분리된 상층액을 분리하였다.
상층액 내 Brevilin A의 함량을 HPLC(Water 2960 HPLC)로 분석하였다. HPLC 분석 조건은 아래 표 2와 같다.
항목 조건
Column SUPERSIL COLUMN ODS-I, 4.6 X 250mm, 5㎛
Mobilie phase Solvent A(45%) Solvent B(55%)
0.1% formic acid in water Methanol
Oven temp. 40℃
Flow rate 1ml/min.
Injection volume 20㎕
Run time 30 min.
Wave length 224nm
이에 따른 각 실시예별 Brevilin A 함량은 표 3에 나타내었다.
중대가리풀 건초 1,000g을 48시간 동안 80% 에탄올 10L에 침전시켜 에탄올 냉침 추출하여 1차 추출액을 얻었다. 이후, 1차 추출액을 감압 농축하여 에탄올을 제거한 추출액을 HPLC로 분석하였으며, 추출액에 2mg/mL의 농도로 Brevilin A를 함유하고 있음을 확인하였다(건초 대비 0.20%의 함량).
추출층의 Brevilin A 함량 (mg) 추출층의 Brevilin-A 농축농도 농축율(ppm) 1차 추출물 대비 지표성분의 수율(%)
실시예1 185.25 12,350 74.1
실시예2 73.2 12,200 73.2
실시예3 195.5 19,550 78.2
실시예4 84.1 21,025 84.1
실시예5 133.5 26,700 53.4
실시예6 56.1 28,050 56.1
실시예7 218.75 25,000 87.5
실시예8 89.6184 8,298 49.8
실시예9 45.2 7,533.33 45.2
실시예10 109.126 14,667.4 58.7
실시예11 57.1 14,275 57.1
실시예12 41.2877 10,752 21.5
실시예13 23.1 11,550 23.1
실시예14 63 18,000 63.0
실시예15 128.498 11,898 71.4
실시예16 154.397 20,752.3 83.0
실시예17 107.274 27,936 55.9
실시예18 173.392 26,351.3 92.2
비교예1-LLE
천연물 원료는 중대가리풀로, 괴산약초유기농산물협동조합(https://natural-herb.co.kr) 국내산 아불식초(중대가리풀, 영천)을 구입하고, 세척 및 건조하였다.
중대가리풀 건초 1,000g을 48시간 동안 80% 에탄올 10L에 침전시켜 에탄올 냉침 추출하여 1차 추출액을 얻었다. 이후, 1차 추출액을 감압 농축하여 에탄올을 제거하였다. 이후, 1차 추출액을 감압 농축하여 에탄올을 제거하여 2차 추출액을 얻었다. 2차 추출액은 filter 후에 증발건조시켜 0.6 g의 추출물을 얻었다.
물(DW) 500mL와 핵산(Cyclohexane) 1000mL를 혼합하고 vortex mixer로 1분간 교반하고 Separating Funnel에 담아 핵산층을 분리 하였다. 그리고 3회 반복하여 수득한 핵산 층은 농축하여 HPLC 로 분석하였다.
상기에서 핵산 분획층을 제거 하고 남은 수층 추출물에 클로로포름(MC) 500mL을 혼합하고 Separating Funnel에 담아 클로로포름(MC) 층을 분리하였다. 그리고 3회 반복하여 수득한 클로로포름(MC) 층은 농축하여 HPLC 로 분석하였다.
상기에서 클로로포름(MC) 분획층을 제거 하고 남은 수층 추출물에 에틸아세테이트(EtAC) 500mL을 혼합하고 Separating Funnel에 담아 에틸아세테이트(EtAC) 층을 분리하였다. 그리고 3회 반복하여 수득한 에틸아세테이트(EtAC) 층은 농축하여 HPLC 로 분석하였다.
상기에서 에틸아세테이트(EtAC) 분획층을 제거 하고 남은 수층 추출물을 농축하여 HPLC 로 분석하였다.
상기에서 확보된 클로로포름(MC)층에 Silica gel column chromatography 를 통해 이동상(MC:M, 100:1 ~ 1:1)조건으로 분획하여 추가 분리하였고 HPLC로 분석하였으며, 이를 표 4에 나타내었다.
비교예2-RESIN
천연물 원료는 중대가리풀로, 괴산약초유기농산물협동조합(https://natural-herb.co.kr) 국내산 아불식초(중대가리풀, 영천)을 구입하고, 세척 및 건조하였다.
중대가리풀 건초 1,000g을 48시간 동안 80% 에탄올 10L에 침전시켜 에탄올 냉침 추출하여 1차 추출액을 얻었다. 이후, 1차 추출액을 감압 농축하여 에탄올을 제거하여 2차 추출액을 얻었다. 2차 추출액은 filter 후에 증발 건조시키고, 물 1000ml와 레진(HP-20) 100g을 혼합하고 교반기로 1분간 교반하고, 100rpm으로 1시간 동안 incubation을 수행하였다. 이후, 원심 분리하여 1차 상등액을 분리(물 포함)하고 남은 레진에 에탄올 300ml를 혼합하였다. 재차 원심 분리하여 2차 상등액을 분리(에탄올 포함)하였다. 분리된 상등액 각각을 농축하고 이와 동일한 양의 에탄올에 재현탁하여 syringe filter를 이용하여 filter 후 HPLC로 분석하였다.
Brevilin A 함량 (mg) 1차 추출액 대비 Brevilin A 수율(%)
비교예1 650.1 (Cyclohexane 층) 32.55
862.4 (MC 층) 42.12
310.6 (EtOAC 층) 15.53
167.2 (수 층) 8.35
비교예2 Brevilin A 함량 (mg) 1차 추출액 대비 Brevilin A 수율(%)
82.7 (1차 상등액, 수층) 4.13
16.28 (2차 상등액, 에탄올층) 49.35
비교예1 Brevilin A 함량(mg) MC 층 대비 Brevilin A 수율(%)
0(Chromatography, 1fr.) 0
7.32(Chromatography, 2fr.) 0.85
10.83(Chromatography, 3fr.) 1.26
20.21(Chromatography, 4fr.) 2.34
68.9(Chromatography, 5fr.) 7.99
98.7(Chromatography, 6fr.) 11.44
140.7(Chromatography, 7fr.) 16.31
210.6(Chromatography, 8fr.) 24.42
164.7(Chromatography, 9fr.) 19.10
65.3(Chromatography, 10fr.) 7.57
22.1(Chromatography, 11fr.) 2.56
10.8(Chromatography, 12fr.) 1.25
6.2(Chromatography, 13fr.) 0.72
제조예 1
상기 실시예7에 따라 분리된 상층액(2차 추출액)은 첨가된 친유성 가용화제 부피의 120%를 넘지않도록 농축(승온 자연 농축)하고, 농축된 상층액에 에멀전화 조성물로 Labrasol 5g, Labrafac 4.4g, Lecithin 0.5g, D-pantenol 0.1g을 혼합하여 마이크로 에멀전을 제조하였다. 이에 따라, micro emulsion 12mg/mL, 10mL, 수율 87.5%의 토닉 제제를 제조하였다. 이러한 에멀전은 유기용매가 아닌 안전한 부형제들을 포함하고 있는 것으로서 별도의 추가 공정없이 그 자체로 연고, 토닉 등의 다양한 형태의 제품으로 사용 가능하다(제조예1).
2차 추출물, 중량(%) (DEE, 실시예 7) Labrasol, 중량(%) Lecithin, 중량(%) D-pantenol, 중량((%)
50 44 5 1
제조예 2
상기 실시예7에 따라 분리된 상층액(2차 추출액)은 첨가된 친유성 가용화제 부피의 120%를 넘지않도록 농축(승온 자연 농축)하고, 농축된 상층액에 90% 에탄올과 혼합하여 친유성 가용화제를 층분리 하여 제거 하여 가용화제를 제거한 Brevilin A및 유도체를 포함하는 분획을 제조 하였다.
친유성 가용화제가 제거된 3차 추출물에 3.2g에 아래와 같은 조성으로 고속혼합하여 3.4mg/mL, 100mL의 민감성 피부용 토닉 제제를 제조하였다.
3차 추출물(가용화제 제거) 중량(%) 에탄올(95%) Oleic acid, 중량(%) Lecithin, 중량(%) D-pantenol, 중량((%)
34 50 10 5 1
다양한 농도의 1차 추출물에서 2차 추출(Dissolution Emulsion Extract or Lipid-based drug(fr.) extract systems.)을 진행 할 때, 농도 물량과 상관 없이 친유성 가용화제(Lipds sulubilizer)에 따라 braviline- A와 그의 유도체를 선택적으로 농축하여 분리 추출할 수 있고 더욱이 미량의 추출법에 더욱 적합한 성능을 갖는다는 상태를 설명하기 위한 사진이다.
본 발명의 상분리 조성물은, 실질적으로 1차 추출액에 포함되어 있는 추출하고자 하는 비극성 천연물질의 농도와 상관 없이, 추출액에 포함되어 있는 천연물질을 모두 추출해낼 수 있다. 즉, 극미량의 물질을 효율적으로 추출 또는 제거하는데 사용될 수 있다. 즉, 추출하고자 하는 비극성 천연물질의 농도가 낮아졌음에도 불구하고, 이와 동일 내지 유사하게 상분리된 영역이 줄어드나, 충분히 상분리를 시켜 원하는 물질을 분리해낼 수 있음을 알 수 있었다. 과일, 채소 등에 잔류하는 농약들은 대부분이 비극성(난용성/친유성)을 가지는데, 이들은 잘 씻기지 않을 뿐만 아니라 식물의 섬유질에 침착된다. 이러한 식물들에 잔류하는 농약을 제거하기 위하여 상기 상분리 조성물의 활용이 가능하다.
실험예
상기 제조예1에 따라 제조된 헤어 토닉을 일반 남성 및 여성을 대상으로 일정기간 사용에 따른 탈모량 및 발모량의 변화를 측정하였다. 헤어 토닉은 머리카락을 사용자의 수준에 맞추어 깨끗이 샴푸 후에 두피에 직접적으로 펴바르는 식으로 사용하였다. 여기서, 탈모량은 정확하게 측정하는 것은 다소 어려우므로 샤워 후 걸러지는 머리카락의 가닥수로 판단하였으며, 발모량은 모발진단기로 측정되는 동일 영역에서의 모발 밀도로 판단하였다.
도 5 내지 도 8은 본 발명의 실시예에 따라 제조된 헤어 토닉을 남성이 4주 간 사용함에 따른 탈모량 및 발모량의 변화를 나타내는 도면들이다. 도 9 내지 도 12는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 헤어 토닉을 여성이 24주일 간 사용함에 따른 탈모량 및 발모량의 변화를 나타내는 도면들이다.
도 5 내지 도 12를 참조하면, 헤어 토닉을 일정용량 사용함에 따라, 점차 탈모량이 줄어듬을 알 수 있고, 실험 기간 중에 사용을 중단 함에 따라 다소 탈모량이 늘어났음을 알 수 있었다. 특히, 여성 실험자의 경우 도 8에서와 같이 대부분 일정 용량 이상의 헤어 토닉을 주기적으로 사용하였으며, 그 결과 탈모량이 지속적으로 감소하였음을 알 수 있었다. 도 6 내지 도 8, 도 10 내지 도 12에서, 양 실험자들 모두 발모량이 증가하였으며, 남성 사례의 경우 도 7에서와 같이 모발 밀도가 약 19% 증가하였고, 도 8에서와 같이 탈모량은 약 36% 감소하였으며, 여성 사례의 경우 도 11에서와 같이 모발 밀도가 약 15% 증가하였고, 도 12에서와 같이 탈모량은 약 29% 감소하였음을 알 수 있었다. 추가적으로 4주 이후부터는 이 탈모량에 대해서 조화평균을 보면 초기 10 내지 150 가닥의 탈모량의 실험자들은 4주 이후 탈모량의 조화평균을 보면 50 내지 60 가닥으로 모두 안정화 되고 있는 것으로 확인할 수 있었다.
상술한 바에 있어서, 본 발명의 예시적인 실시예들을 설명하였지만, 본 발명은 이에 한정되지 않으며 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 다음에 기재하는 특허청구범위의 개념과 범위를 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변경 및 변형이 가능함을 이해할 수 있을 것이다.

Claims (12)

  1. 천연물 원료를 알코올에 72시간 이내의 시간 동안 침전시켜 냉침 추출하는 1차 추출 단계;
    1 차 추출액에 친유성 가용화제 및 물을 포함하는 상분리 조성물을 혼합 및 교반하여 상분리시키는 2차 추출 단계; 및
    상분리된 용액의 상층을 분리하여 비극성 천연물질을 수득하는 단계를 포함하는 비극성 천연물질의 추출 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 2차 추출 단계 이전에, 상기 1차 추출액에 물을 첨가하는 것을 특징으로 하는 비극성 천연물질의 추출 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상분리된 용액의 상층을 분리하여 알코올을 첨가하여 재차 상분리시킨 후, 재상분리된 용액의 알코올층을 분리하여 비극성 천연물질을 수득하는 것을 특징으로 하는 비극성 천연물질의 추출 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 2차 추출 단계 이전에, 상기 1차 추출액의 알코올을 제거하는 것을 특징으로 하는 비극성 천연물질의 추출 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 2차 추출 단계 이후에, 상기 2차 추출액의 알코올을 제거하는 것을 특징으로 하는 비극성 천연물질의 추출 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    2차 추출 단계에서 상분리 조성물을 혼합 및 교반시 승온하여 비극성 천연물질을 농축시키는 것을 특징으로 하는 비극성 천연물질의 추출 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 상분리된 용액의 상층은 친유성 가용화제 및 비극성 천연물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 비극성 천연물질의 추출 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 비극성 천연물질은 Brevilin A 또는 이의 유도체를 포함하는 것을 특징으로 하는 비극성 천연물질의 추출 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 비극성 천연물질은 JAK-STAT 신호전달과정을 저해 또는 억제하거나, Wnt 신호전달과정을 활성화시켜 혈구형성계통과 모낭에서 줄기세포를 증가시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 비극성 천연물질의 추출 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 천연물 원료는 중대가리풀( Centipeda minima), 삼푸트리( Litsea glutinous), Arnica 속 식물 및 Helenium 속 식물로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 비극성 천연물질의 추출 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 상분리 조성물은, 친유성 가용화제 1 내지 90중량%; 및 물 10 내지 99중량%를 포함하는 비극성 천연물질의 추출 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 상분리 조성물은 60 중량% 이하의 비이온성 계면활성제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 비극성 천연물질의 추출 방법.
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