WO2021066109A1 - ノネナールによる皮膚ダメージを抑制するための薬剤および方法 - Google Patents

ノネナールによる皮膚ダメージを抑制するための薬剤および方法 Download PDF

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skin
skin damage
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masking
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忍 中西
傳田　光洋
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Definitions

  • the present invention relates to a drug and a method for suppressing skin damage caused by nonenal.
  • Unsaturated aldehydes such as nonenal are known as aging odors, and various substances have been developed as substances that mask such aging odors (Patent Documents 1 and 2). It is also known that a carbonylation-inducing substance such as nonenal induces skin yellowing (Patent Document 3).
  • fragrance products containing rose oil and the like have an action of secreting oxytocin, which has an action of promoting IGF-1 production in dermis cells and epidermal cells (Patent Document 4).
  • An object of the present invention is to provide a drug for suppressing skin damage caused by nonenal.
  • nonenal suppresses the proliferation of skin cells and causes skin damage such as skin thinning. Based on this discovery, we have conducted extensive studies on a wide variety of materials, and found that nonenal masking agents such as benzaldehyde, dihydromilsenol, linalool, phenylethyl alcohol, benzyl acetate, and anisaldehyde have an inhibitory effect on skin damage. And came to make the present invention.
  • nonenal masking agents such as benzaldehyde, dihydromilsenol, linalool, phenylethyl alcohol, benzyl acetate, and anisaldehyde have an inhibitory effect on skin damage. And came to make the present invention.
  • the present application includes the following inventions: (1) A nonennal masking agent that suppresses skin damage caused by nonennal. (2) A drug that is a skin damage suppressant and contains a nonenal masking agent. (3) The nonenal masking agent is one or more compounds selected from the group consisting of benzaldehyde, dihydromilsenol, linalool, phenylethyl alcohol, benzyl acetate, and anisaldehyde, (1) or (2). The drug described in. (4) The drug according to any one of (1) to (3), wherein the skin damage is skin thinning. (5) A composition containing the agent according to any one of (1) to (4).
  • a beauty method that suppresses skin damage caused by nonenal by administering a nonenal masking agent comprising a nonenal masking agent.
  • the nonenal masking agent is one or more compounds selected from the group consisting of benzaldehyde, dihydromilsenol, linalool, phenylethyl alcohol, benzyl acetate, and anisaldehyde.
  • Method (8) The cosmetological method according to (6) or (7), wherein the skin damage is skin thinning.
  • an agent and a method effective for skin damage caused by nonenal are provided. If skin damage caused by nonenal is suppressed, it is effective in suppressing skin aging.
  • FIG. 1 shows the results of Experiment 1-2, and the cell viability (%) when various malodorous substances were added is shown as a relative value with the control result as 100.0 (control vs. each malodorous substance). Two-sided t-test, **** P ⁇ 0.001).
  • FIG. 2 shows the results of Experiment 2, and the cell viability (%) when each concentration of nonenal was added is shown as a relative value with the control result as 100.0 (control vs. each concentration of nonenal). Two-sided t-test, **** P ⁇ 0.001).
  • FIG. 3 shows the results of Experiment 3-2, and the cell viability (%) when various evaluation target substances at various concentrations were added is shown as a relative value with the control result as 100.0 (control vs. each evaluation).
  • FIG. 4 shows the results of Experiment 3-3, and the cell viability (%) when various evaluation target substances and each concentration of nonenal were added is shown as a relative value with the control result as 100.0 (control vs. nonenal).
  • Figure 5 shows the case where only the solvent (ethanol) was added to the 3D skin model created in Experiment 4 (upper left: control), when only nonenal was added (lower left: 50 ⁇ M nonenal), or nonenal and various substances to be evaluated were added. It is a photograph showing the result of the case (center and right: 50 ⁇ M nonenal + 50 ⁇ M various evaluation target substances).
  • FIG. 6 shows the case where only the solvent (ethanol) was added (control: control), the case where only nonenal was added (nonenal), or the case where nonenal and various evaluation target substances were added to the 3D skin model prepared in Experiment 4 (control).
  • the skin thickness of nonenal + various evaluation target substances is shown as the cross-sectional area (Area ⁇ m 2 / ⁇ m) of the skin portion per 1 ⁇ m of the lateral skin length in the cross-sectional view as shown in the left figure (right figure) (right figure).
  • Figure 7 shows the case where only the solvent (ethanol) was added to the 3D skin model prepared in Experiment 4 (upper left: control), when only nonenal was added (lower left: 50 ⁇ M nonenal), or nonenal and various substances to be evaluated were added.
  • FIG. 8 shows the case where only the solvent (ethanol) was added (control: control), the case where only nonenal was added (nonenal), or the case where nonenal and various substances to be evaluated were added to the 3D skin model prepared in Experiment 4 (control).
  • control controls the case where only the solvent (ethanol) was added
  • nonenal the case where only nonenal was added
  • control the case where nonenal and various substances to be evaluated were added to the 3D skin model prepared in Experiment 4
  • Nonenal addition vs. Dunnet assay for each substance under evaluation, * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01).
  • Nonenal (2-nonenal) is an unsaturated aldehyde having the following structure, and in the present specification, it refers to a trans form (t-2-nonenal).
  • Nonenal is related to the odor of aging and yellowing of the skin (Patent Documents 1 to 3), the effect on the skin has not been sufficiently elucidated.
  • nonenal causes skin damage, including skin thinning.
  • nonenal masking agents such as benzaldehyde, dihydromilsenol, linalool, phenylethyl alcohol, benzyl acetate, and anisaldehyde exhibit a skin damage-suppressing effect by nonenal.
  • the present invention is based on such findings.
  • the nonenal masking agent refers to a substance having a nonenal masking action that masks the odor caused by nonenal.
  • the nonenal masking action refers to masking the unpleasant odor caused by nonenal.
  • CNG Cyclic nucleotide-gated ions
  • the nonennal masking action is to reduce or block the binding of nonenal to the CNG channel by binding to nonenal or by other means, or the electricity generated by the binding of nonenal to the olfactory receptor. It may be to reduce or block the signal, and so on.
  • substances such as benzaldehyde, dihydromilsenol, linalool, phenylethyl alcohol, benzyl acetate, and anisaldehyde have a high current reduction rate (%) and masking score for nonenal. Has been reported.
  • Non-Patent Document 1 a substance having a high electric signal reduction rate and masking score for nonenal measured by the method as described in Non-Patent Document 1 can be used, although not limited to the present invention.
  • a known substance known to have a nonenal masking action for example, as described in Patent Documents 1 and 2, may be used, and various sensory tests using an odor judge or a specific panelist may be used.
  • a substance having a high nonennal masking action may be searched for and used by a method such as investigating the binding property to nonenal or the binding mode.
  • the skin damage inhibitor of the present invention contains the above-mentioned nonenal masking agent as an active ingredient.
  • the skin damage inhibitor and the nonenal masking agent of the present invention (hereinafter, these may be collectively referred to as "the agent of the present invention") may contain any one of the above-mentioned active ingredients alone, or 2 More than one kind may be contained in any combination and ratio.
  • Skin damage is not limited, but includes thinning of the skin of animals including humans and / or suppression of skin cell proliferation.
  • the present inventors have shown that the addition of nonenal to the skin model suppresses thinning and skin cell proliferation. Suppression of skin cell proliferation and / or thinning of the skin has adverse effects such as wrinkles, deflation, sagging, skin aging, decreased elasticity, decreased skin function, and decreased tolerance to fatigue and external stimuli.
  • the skin damage caused by nonenal is suppressed, it is expected to have effects such as prevention / improvement of wrinkles, deflation, sagging, skin aging, etc., and improvement of skin elasticity, skin function, tolerance, etc.
  • the nonenal masking agent suppresses damage such as skin thinning and / or damage due to suppression of cell proliferation through nonenal masking.
  • damage such as skin thinning and / or damage due to suppression of cell proliferation through nonenal masking.
  • its mechanism of action has not been elucidated, it is generated by reducing or blocking the binding of nonenal to CNG channels by means such as binding of a nonenal masking agent to nonenal, or by binding of nonenal to an olfactory receptor. It may be related to reducing or blocking the electrical signals.
  • the agent of the present invention comprises or takes as an active ingredient one or more compounds selected from the group consisting of benzaldehyde, dihydromilsenol, linalool, phenylethyl alcohol, benzyl acetate, and anisaldehyde. Consists of compounds.
  • Benzaldehyde (also known as benzenecarbaldehyde) is an aromatic aldehyde having the following structure. Benzaldehyde may be artificially synthesized, commercially available products may be used, and since it is present in natural products such as almonds, apricots, and peach seeds, it is used in the form of essential oils and extracts thereof. May be good.
  • Dihydromilsenol also known as 2,6-dimethyl-7-octen-2-ol
  • Dihydromilsenol is an organic compound having the following structure. May be artificially synthesized, a commercially available product may be used, or a natural product may be used in the form of an essential oil or an extract.
  • Linalool is a monoterpene alcohol with the following structure. It may be in any form of R-form, S-form, and racemic form. Linalool may be artificially synthesized or commercially available, and since it is present in rosewood, neroli, lavender, bergamot, clary sage, coriander, etc., it is used in the form of an essential oil or extract thereof. May be good.
  • Phenylethyl alcohol (also known as 2-phenylethanol, 2-phenylethyl alcohol, ⁇ -phenylethyl alcohol) is an aromatic alcohol having the following structure. Phenylethyl alcohol may be artificially synthesized, a commercially available product may be used, or since it exists in roses or the like, it may be used in the form of an essential oil or an extract thereof.
  • Benzyl acetate is an ester having the following structure. Benzyl acetate may be artificially synthesized or commercially available, and since it is present in jasminum, Iran-Iran, Gardenia jasminoides, and many other flowers, it is used in the form of an essential oil or an extract thereof. May be good.
  • Anisaldehyde (also known as p-anisaldehyde, 4-methoxybenzaldehyde) is an organic compound having the following structure.
  • Anisealdehyde may be artificially synthesized, a commercially available product may be used, or since it is present in anise or the like, it may be used in the form of an essential oil or an extract thereof.
  • the essential oil When using the essential oil, it is possible to use the essential oil obtained by drying the flowers, leaves, pericarp, bark, roots, seeds, etc. of the above plant and any method such as steam distillation method, squeezing method, solvent extraction method and the like.
  • the extraction method is not particularly limited, but an extract obtained by an extraction method using a lower alcohol such as ethanol, an organic solvent such as hexane, or a mixed solvent thereof such as hexane / ethanol can be used. Can be used.
  • the essential oil / extract containing the active ingredient can be obtained by the essential oil / extraction operation and may be used as it is, but it may be used after performing conventional refining treatments such as sterilization, washing, filtration, decolorization, and deodorization. May be good. Further, it may be used after being concentrated or diluted if necessary.
  • the agent of the present invention may also be a composition in which the above-mentioned active ingredient is combined with one or more other ingredients such as excipients, carriers and / or diluents.
  • the composition and form of the composition are arbitrary, and may be appropriately selected according to conditions such as the active ingredient and use.
  • the composition can be produced by a conventional method with a formulation appropriately combined with an excipient, a carrier and / or a diluent and the like and other components according to the dosage form.
  • the agent of the present invention is used for cosmetics, quasi-drugs, etc. for the purpose of preventing / improving skin thinning, preventing / improving wrinkles, deflation, sagging, skin aging, etc., and improving skin elasticity, skin function, resistance, etc. It can be blended in compositions such as quasi-drugs, pharmaceuticals, and functional foods.
  • cosmetics it can be blended in any cosmetics applied to the skin, such as sunscreens, lotions, serums, beauty creams, and aftercare lotions. It is preferably blended with an external preparation for skin that can be applied directly to the skin.
  • the agent of the present invention can appropriately contain any compounding ingredients used in compositions such as cosmetics and pharmaceuticals, as long as the effects are not impaired.
  • optional compounding ingredients examples include oils, surfactants, powders, coloring materials, water, alcohols, thickeners, chelating agents, silicones, antioxidants, ultraviolet absorbers, moisturizers, fragrances, and various medicinal properties.
  • Ingredients, preservatives, pH regulators, neutralizers and the like can be mentioned.
  • it may contain other medicinal ingredients that promote the nonennal masking action and the suppression of skin damage.
  • the nonenal masking agent in the agent or composition of the present invention is not limited as long as the nonenal masking action of the present invention is impaired. It can be appropriately determined according to the purpose, form, usage method, and the like.
  • a nonenal masking agent such as one or more compounds selected from the group consisting of benzaldehyde, dihydromilsenol, linalol, phenylethyl alcohol, benzyl acetate, and anisaldehyde in the total amount of cosmetics, for example, 0.0001 to 0.0001.
  • 0.001% by weight 0.001 to 0.005% by weight, 0.005 to 0.01% by weight, 0.01 to 0.02% by weight, 0.02 to 0.05% by weight, 0.05 to 0.1% by weight, 0.1 to 1.0% by weight, 1.0 to 10% by weight, 10 to 50% by weight It can be blended in any ratio such as%, 50 to 100% by weight.
  • the possible forms of the agent or composition of the present invention are not limited to the above-mentioned dosage forms and forms.
  • the present invention also provides a method for suppressing skin damage caused by nonenal by administering the agent or composition of the present invention.
  • the method of the present invention is a method for the purpose of cosmetology and may not be treated by a doctor or a medical professional.
  • the subject to which the agent or composition of the present invention is administered may be a subject in which skin damage caused by nonenal is objectively or subjectively recognized, or a subject who wishes to prevent skin damage caused by nonenal.
  • it may be a subject judged to have a large amount of nonenal, yellowing of skin color, thinning of skin, decreased cell proliferation, having an aging odor, etc., or skin damage due to aging odor or nonenal.
  • the subject may be concerned about skin thinning, wrinkles, deflation, sagging, decreased skin elasticity, and the like.
  • the present invention also provides a method for screening a skin damage inhibitor using the nonenal masking action as an index.
  • the screening method of the present invention may include a step of measuring the nonenal masking action of the candidate drug and a step of selecting a skin damage inhibitor based on the nonenal masking action of the candidate drug.
  • the method of the present invention enables screening as to whether or not a candidate drug has an anti-photoaging effect, and enables product development and proposals for new skin care.
  • Experiment 1 Evaluation of malodorous substances
  • Experiment 1-1 Preparation of malodorous substances The following known substances were used as substances with malodor.
  • Experiment 1-2 Effect of malodorous substance on skin
  • Human epidermal cells (4000 cells) were cultured in Human-KG2 (Kurabo) medium at 37 ° C for 3 days, and then the substance of Experiment 1 was added to the medium to a concentration of 50 ⁇ M. The same amount of ethanol as a solvent was added to the control. The cells were cultured at 37 ° C. for 24 hours after the addition, and the number of cells after the addition was counted. The ratio (%) of the number of cells when the substance was added to the number of control cells was calculated by the following formula, and the survival rate was calculated.
  • Experiment 2 Evaluation of cytotoxicity by difference in nonenal concentration
  • nonenal which was found to be toxic in Experiment 1
  • concentration dependence of cytotoxicity by nonenal was investigated. The result is shown in figure 2.
  • the higher the concentration of nonenal the significantly decreased the cell viability, indicating that the cytotoxicity of nonenal depends on the concentration.
  • Experiment 3 Evaluation of substances having a nonenal masking action
  • Experiment 3-1 Preparation of substances to be evaluated The following substances having or not having a nonenal masking action were used as the substances to be evaluated.
  • Experiment 3-2 Cytotoxicity of the substance to be evaluated The cell viability is determined by the same method as in Experiment 1-2 except that the substance to be evaluated is used at various concentrations (5 ⁇ M, 50 ⁇ M, 500 ⁇ M) instead of the malodorous substance. Then, the cytotoxicity of the substance to be evaluated was investigated. The results are shown in Figure 3. From FIG. 3, it was confirmed that the substances to be evaluated except ⁇ -damascone have no cytotoxicity.
  • Experiment 3-3 Effect of suppressing skin damage by nonenal of the substance to be evaluated Cell viability in the same manner as in Experiment 1-2 except that the substance to be evaluated of 5 ⁇ M and nonenal of various concentrations (5 ⁇ M, 50 ⁇ M, 500 ⁇ M) are used.
  • the effect of suppressing skin damage by nonenal which is the substance to be evaluated, was investigated. The results are shown in Fig. 4. From FIG. 4, the cell viability decreased in a concentration-dependent manner when only nonenal was added, but the decrease in cell viability was suppressed when a substance having a nonennal masking action was added. On the other hand, even if a substance having no nonennal masking action was added, such a decrease in cell viability was not suppressed.
  • Experiment 4 Skin damage suppression effect by nonenal using 3D skin model
  • Experiment 4-1 Creation of 3D skin model Cell culture insert ( ⁇ 12 mm, porous membrane) coated with CellStart (Invitrogen Life Technologies) solution diluted 50 times in DPBS Human epidermal cell cells (2.2 ⁇ 10 5 cells / 500 ⁇ l) diluted in CnT Prime medium (CELLnTEC) solution were seeded in (average pore size: 0.4 ⁇ m), and 1 ml of CnT Prime medium (CELLnTEC) solution was added under the insert to 37 ° C. Was cultured for 3 days.
  • the medium on the insert was replaced with 500 ⁇ l of CnT-PR-3D medium (CELLnTEC) to which vitamin C (50 ⁇ g / ml) was added, and the medium under the insert was replaced with 1 ml, and the cells were cultured at 37 ° C. for 1 day.
  • the medium on the insert was sucked up, the medium under the insert was replaced with 500 ⁇ l of CnT-PR-3D medium (CELLnTEC) to which vitamin C (50 ⁇ g / ml) was added, and the cells were cultured at 37 ° C. for 1 day.
  • a 3D skin model was constructed by performing this work for 8 days.
  • Experiment 4-2 Evaluation of the skin damage suppressing effect of nonenal, which is the substance to be evaluated, based on the skin thickness.
  • the substance was added, and the same amount of ethanol as a solvent was added to the control, and the mixture was cultured at 37 ° C. for 3 days.
  • the results are shown in Figures 5 and 6.
  • the addition of nonenal showed thinning of the skin, but the addition of the substance to be evaluated having a nonennal masking action suppressed the thinning of the skin.
  • Even a substance having no nonennal masking action was added such suppression of skin thinning was not observed.
  • Experiment 4-3 Evaluation of the skin damage suppressing effect of nonenal, which is the substance to be evaluated, based on the number of proliferating cells. Evaluation of 50 ⁇ M nonenal alone or 50 ⁇ M nonenal and 50 ⁇ M 3 days before the completion of the skin model of the skin model created in Experiment 4-1. The target substance was added, and the same amount of ethanol as a solvent was added to the control, and the cells were cultured at 37 ° C. for 2 days, and BrdU primary antibody (Abcam, Ab6326) was added to the medium to a concentration of 50 ⁇ M. The cells were cultured at 37 ° C for 1 day.
  • the skin model is then stained with BrdU secondary antibody (DAKO, # E0468) (1/5000 dilution), the number of BrdU-positive cells is counted, and divided by the length of the skin model (total length in the lateral direction of the skin model). Therefore, the number of BrdU-positive cells (cells / mm) per 1 mm length was calculated.
  • DAKO BrdU secondary antibody
  • nonenal has the effect of promoting skin damage such as skin damage and / or skin thinning due to suppression of skin cell proliferation, but benzaldehyde, dihydromilsenol, linalol, phenylethyl alcohol, benzyl acetate, and anis. It was found that the use of a nonenal masking agent such as aldehyde can suppress such skin damage. These substances are expected to suppress skin damage, prevent and improve wrinkles, deflation, sagging, skin aging, etc., and improve skin elasticity, skin function, tolerance, etc.

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Abstract

ノネナールによる皮膚ダメージ抑制に有効な剤、およびかかる剤を用いてノネナールによる皮膚ダメージを抑制する方法の提供。　ベンズアルデヒド、ジヒドロミルセノール、リナロール、フェニルエチルアルコール、ベンジルアセテート、およびアニスアルデヒドからなる群より選択される1又は複数の化合物といったノネナールマスキング剤は、ノネナールによる皮膚細胞増殖抑制及び／又は皮膚菲薄化等の皮膚ダメージ抑制に有効である。

Description

ノネナールによる皮膚ダメージを抑制するための薬剤および方法
　本発明は、ノネナールによる皮膚ダメージを抑制するための薬剤および方法に関する。
　ノネナール等の不飽和アルデヒドは加齢臭として知られており、このような加齢臭をマスクする物質として様々な物質が開発されている（特許文献1、2）。また、ノネナール等のカルボニル化誘導物質は、皮膚黄色化を誘発することも知られている（特許文献3）。
　一方、好ましい香りにより、ストレス等が軽減され間接的に皮膚状態が良好になることも知られている。例えば、ローズ油等を含むフレグランス製品には真皮細胞と表皮細胞におけるIGF-1産生を促進する作用があるオキシトシンを分泌させる作用があることが報告されている（特許文献4）。
　しかしながら、これまでに、ノネナール等の悪臭物質が皮膚にどのような影響を及ぼし、そして皮膚へ悪影響がある場合、それをどのように抑制するかについては十分に解明されていなかった。
特開平11-286423号公報 特開平11-286428号公報 特開2012-32287号公報 特開2011-98898号公報
Takeuchi et. al., The Journal of General Physiology. Vol. 133 No. 6, pp583-601
　本発明の課題は、ノネナールによる皮膚ダメージを抑制するための薬剤を提供することにある。
　本発明者らは、ノネナールが皮膚細胞の増殖を抑制すること及び皮膚菲薄化といった皮膚ダメージを与えることを発見した。かかる発見に基づき、多種多様な素材について鋭意検討を重ね、ベンズアルデヒド、ジヒドロミルセノール、リナロール、フェニルエチルアルコール、ベンジルアセテート、およびアニスアルデヒドをはじめとするノネナールマスキング剤が、皮膚ダメージ抑制作用を示すことを見出し、本発明を為すに至った。
　本願は下記の発明を包含する：
（1）ノネナールマスキング剤であって、ノネナールによる皮膚ダメージを抑制するための薬剤。
（2）皮膚ダメージ抑制剤であって、ノネナールマスキング剤を含む薬剤。
（3）前記ノネナールマスキング剤が、ベンズアルデヒド、ジヒドロミルセノール、リナロール、フェニルエチルアルコール、ベンジルアセテート、およびアニスアルデヒドからなる群より選択される1又は複数の化合物である、（1）又は（2）に記載の薬剤。
（4）前記皮膚ダメージが皮膚菲薄化である、（1）～（3）のいずれか1項に記載の薬剤。
（5）（1）～（4）のいずれか1項に記載の薬剤を含む組成物。
（6）ノネナールによる皮膚ダメージをノネナールマスキング剤を投与することにより抑制する美容方法。
（7）前記ノネナールマスキング剤が、ベンズアルデヒド、ジヒドロミルセノール、リナロール、フェニルエチルアルコール、ベンジルアセテート、およびアニスアルデヒドからなる群より選択される1又は複数の化合物である、（6）に記載の美容方法。
（8）前記皮膚ダメージが皮膚菲薄化である、（6）又は（7）に記載の美容方法。
（9）ノネナールによる皮膚ダメージを抑制する必要がある対象において、ベンズアルデヒド、ジヒドロミルセノール、リナロール、フェニルエチルアルコール、ベンジルアセテート、およびアニスアルデヒドからなる群より選択される1又は複数の化合物を投与することによりノネナールによる皮膚ダメージを抑制するための方法。
（10）前記皮膚ダメージが皮膚菲薄化である、（9）に記載の方法。
（11）ノネナールによる皮膚ダメージを治療するための、ベンズアルデヒド、ジヒドロミルセノール、リナロール、フェニルエチルアルコール、ベンジルアセテート、およびアニスアルデヒドからなる群より選択される1又は複数の化合物。
（12）前記皮膚ダメージが皮膚菲薄化である、（11）に記載の化合物。
（13）ノネナールによる皮膚ダメージを抑制するための薬物の製造におけるベンズアルデヒド、ジヒドロミルセノール、リナロール、フェニルエチルアルコール、ベンジルアセテート、およびアニスアルデヒドからなる群より選択される1又は複数の化合物の応用。
　本発明によれば、ノネナールによる皮膚ダメージに有効な剤および方法が提供される。ノネナールによる皮膚ダメージが抑制されれば、皮膚の老化抑制に有効である。
図1は、実験1-2の結果であり、各種悪臭物質を添加した場合の細胞生存率（％）を、対照（control）の結果を100.0とした相対値で示す (対照対各悪臭物質での両側t検定，****P＜0.001)。 図2は、実験2の結果であり、各濃度のノネナールを添加した場合の細胞生存率（％）を、対照（control）の結果を100.0とした相対値で示す(対照対各濃度のノネナールでの両側t検定，****P＜0.001)。 図3は、実験3-2の結果であり、様々な濃度の各種評価対象物質を添加した場合の細胞生存率（％）を、対照の結果を100.0とした相対値で示す(対照対各評価対象物質での両側t検定，**P＜0.01，***P＜0.001)。 図4は、実験3-3の結果であり、各種評価対象物質と各濃度のノネナールを添加した場合の細胞生存率（％）を、対照の結果を100.0とした相対値で示す(対照対ノネナール添加、ノネナール添加対各評価対象物質での両側t検定，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)。 図5は、実験4において作成した3D皮膚モデルに溶媒（エタノール）のみを添加した場合（左上：対照）、ノネナールのみを添加した場合（左下：50μMノネナール）、又はノネナールおよび各種評価対象物質を添加した場合（中央および右：50μMノネナール＋50μM各種評価対象物質）の結果を示す写真である。 図6は、実験4において作成した3D皮膚モデルに溶媒（エタノール）のみを添加した場合（対照：control）、ノネナールのみを添加した場合（nonenal）、又はノネナールおよび各種評価対象物質を添加した場合（nonenal+各種評価対象物質）の皮膚の厚さを、左図のような断面図における横方向の皮膚の長さ１μm当たりの皮膚部分の断面積（Area μm2/μm）として示す（右図）(対照対ノネナール添加、ノネナール添加対各評価対象物質での両側t検定，**P＜0.01，***P＜0.005)。 図7は、実験4において作成した3D皮膚モデルに溶媒（エタノール）のみを添加した場合（左上：対照）、ノネナールのみを添加した場合（左下：50μMノネナール）、又はノネナールおよび各種評価対象物質を添加した場合（中央および右：50μMノネナール＋50μM各種評価対象物質）のBrdU陽性細胞を示す写真である。 図8は、実験4において作成した3D皮膚モデルに溶媒（エタノール）のみを添加した場合（対照：control）、ノネナールのみを添加した場合（nonenal）、又はノネナールおよび各種評価対象物質を添加した場合（nonenal+各種評価対象物質）のBrdU陽性細胞数を、図7に示す皮膚部分の断面図における横方向の長さ1mm当たりのBrdU陽性細胞数（cells/mm）として示すグラフである(対照対ノネナール添加、ノネナール添加対各評価対象物質でのDunnet検定，*P＜0.05，**P＜0.01)。
　ノネナール（2-ノネナール）は、以下の構造を有する不飽和アルデヒドであり、本明細書ではトランス体（t-2-ノネナール）を指す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　ノネナールは、加齢臭や皮膚黄色化に関係することが報告されている（特許文献1～3）ものの、皮膚にどのような作用を及ぼすのか十分な解明がされていなかった。しかしながら、本発明者らは、ノネナールが皮膚菲薄化をはじめとする皮膚ダメージを引き起こすことを発見した。更に、本発明者らは、ベンズアルデヒド、ジヒドロミルセノール、リナロール、フェニルエチルアルコール、ベンジルアセテート、およびアニスアルデヒドといったノネナールマスキング剤が、ノネナールによる皮膚ダメージ抑制作用を示すことを見出した。本発明は、かかる発見に基づく。
　ノネナールマスキング剤とは、ノネナールによる臭いをマスクするノネナールマスキング作用がある物質を指す。ノネナールマスキング作用とは、ノネナールによる不快な臭いを覆い隠すことを指す。
　嗅覚は、嗅上皮の嗅覚細胞に存在する嗅覚受容体でにおい物質が受容されると、イオンチャネルの作用により電気信号に変換され、その信号が嗅神経から脳へと伝えられ、脳でにおいとして認識されるものである。イオンチャネルとして、嗅細胞の繊毛膜に存在する非選択的イオンチャネルである環状ヌクレオチドゲートイオンチャネル（cyclic nucleotide-gated ion （CNG） channels、以下CNGチャネルと称する）が作用し、ここにも様々なにおい分子が結合される（非特許文献1）。
　よって、本発明において、ノネナールマスキング作用とは、ノネナールに結合することやその他の手段によりノネナールのCNGチャネルへの結合を低減又は阻止すること、ノネナールが嗅覚受容体へ結合することにより発生される電気信号を低減又は阻止すること、等であってもよい。例えば、非特許文献1では、ベンズアルデヒド、ジヒドロミルセノール、リナロール、フェニルエチルアルコール、ベンジルアセテート、アニスアルデヒド等の物質はノネナールに対する電気信号低減率（current reduction rate （％））およびマスキングスコアが高いことが報告されている。よって、本発明のノネナールマスキング剤として、限定されないものの、非特許文献1に記載のような方法で測定されるノネナールに対する電気信号低減率やマスキングスコアが高い物質が使用できる。あるいは、ノネナールマスキング作用を有することが知られている、例えば、特許文献1、2等に記載されるような公知の物質を使用してもよく、臭気判定士や特定のパネリストを用いる各種官能試験といった方法、あるいは、ノネナールへの結合性や結合様式を調べるといった方法等によりノネナールマスキング作用が高い物質を探索して使用してもよい。
　本発明の皮膚ダメージ抑制剤は、上述のようなノネナールマスキング剤を有効成分として含有する。本発明の皮膚ダメージ抑制剤及びノネナールマスキング剤（以降これらを総称して「本発明の剤」という場合がある）は、上述の有効成分の何れか1種を単独で含有してもよく、2種類以上を任意の組み合わせ及び比率で含有してもよい。
　皮膚ダメージは、限定されないものの、ヒトを含む動物の皮膚の菲薄化及び／又は皮膚細胞増殖抑制によるものが挙げられる。本発明者らにより皮膚モデルにノネナールを添加すると菲薄化すること及び皮膚細胞増殖が抑制されることが示された。皮膚細胞増殖が抑制され及び／又は皮膚が菲薄化すると、しわ、しぼみ、たるみ、皮膚老化、弾力低下、皮膚機能の低下、疲労や外部刺激に対する耐性の低下などの悪影響がある。ノネナールによる皮膚ダメージが抑制されると、しわ、しぼみ、たるみ、皮膚老化等の予防・改善、並びに皮膚弾力、皮膚機能、耐性等の改善といった効果が期待される。
　本発明の皮膚ダメージ抑制剤は、ノネナールマスキング剤がノネナールマスキングを介して皮膚菲薄化等のダメージ及び／又は細胞増殖抑制等によるダメージを抑制していることが考えられる。その作用機序は解明されていないものの、ノネナールマスキング剤がノネナールに結合するなどといった手段によりノネナールのCNGチャネルへの結合を低減又は阻止する、あるいは、ノネナールが嗅覚受容体へ結合することにより発生される電気信号を低減又は阻止することに関連がある可能性が考えられる。
　一実施形態では、本発明の剤は、ベンズアルデヒド、ジヒドロミルセノール、リナロール、フェニルエチルアルコール、ベンジルアセテート、およびアニスアルデヒドからなる群より選択される1又は複数の化合物を有効成分として含有するあるいはかかる化合物からなる。
　ベンズアルデヒド（別名：ベンゼンカルバルデヒド）は、以下の構造を有する芳香族アルデヒドである。ベンズアルデヒドは、人工的に合成してもよく、市販品を用いてもよく、また、アーモンド、アンズ、モモの種子等の天然物に存在するためそれらの精油や抽出物としての形態で使用してもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　ジヒドロミルセノール（別名：2，6-ジメチル-7-オクテン-2-オール）は、以下の構造を有する有機化合物である。は、人工的に合成してもよく、市販品を用いてもよく、天然物の精油や抽出物としての形態で使用してもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　リナロールは、以下の構造を有するモノテルペンアルコールである。R体、S体、ラセミ体のいずれの形態であってもよい。リナロールは、人工的に合成してもよく、市販品を用いてもよく、ローズウッド、ネロリ、ラベンダー、ベルガモット、クラリセージ、コリアンダー等に存在するためそれらの精油や抽出物としての形態で使用してもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　フェニルエチルアルコール（別名：2-フェニルエタノール、2-フェニルエチルアルコール、β-フェニルエチルアルコール）は、以下の構造を有する芳香族アルコールである。フェニルエチルアルコールは、人工的に合成してもよく、市販品を用いてもよく、バラ等に存在するためそれらの精油や抽出物としての形態で使用してもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　ベンジルアセテートは、以下の構造を有するエステルである。ベンジルアセテートは、人工的に合成してもよく、市販品を用いてもよく、ジャスミン、イランイラン、クチナシ、その他多くの花等に存在するためそれらの精油や抽出物としての形態で使用してもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　アニスアルデヒド（別名：p-アニスアルデヒド、4-メトキシベンズアルデヒド）は、以下の構造を有する有機化合物である。アニスアルデヒドは、人工的に合成してもよく、市販品を用いてもよく、アニス等に存在するためそれらの精油や抽出物としての形態で使用してもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　精油を用いる場合、上記植物体の花、葉、果皮、樹皮、根、種子等を乾燥させて水蒸気蒸留法、圧搾法、溶剤抽出法等の任意の方法により得られる精油を用いることができる。抽出物を用いる場合、抽出方法は特に限定されるものではないが、エタノール等の低級アルコール、ヘキサン等の有機溶媒、又はヘキサン／エタノールといったこれらの混合溶媒を用いた抽出法により得られる抽出物を用いることができる。精油・抽出操作により、有効成分を含む精油・抽出物を得ることができ、そのまま使用してもよいが、滅菌、洗浄、濾過、脱色、脱臭等の慣用の精製処理を加えてから使用してもよい。また、必要により濃縮又は希釈してから使用してもよい。
　本発明の剤は、上記の有効成分を、1種又は2種以上の他の成分、例えば賦形剤、担体及び／又は希釈剤等と組み合わせた組成物とすることもできる。組成物の組成や形態は任意であり、有効成分や用途等の条件に応じて適切に選択すればよい。当該組成物は、その剤形に応じ、賦形剤、担体及び／又は希釈剤等及び他の成分と適宜組み合わせた処方で、常法を用いて製造することができる。
　例えば、本発明の剤は、皮膚菲薄化の予防・改善、しわ、しぼみ、たるみ、皮膚老化等の予防・改善、皮膚弾力、皮膚機能、耐性等の改善等を目的として、化粧料、医薬部外品、医薬品、機能性食品等の組成物に配合しうる。化粧料に配合する場合、日焼け止め、化粧水、美容液、美容クリーム、アフターケアローション等、皮膚に適用される任意の化粧料に配合することができる。皮膚に直接適用することができる皮膚外用剤に配合することが好ましい。本発明の剤は、その効果を損なわない範囲で、化粧品や医薬品等の組成物に用いられる任意配合成分を、必要に応じて適宜配合することができる。前記任意配合成分としては、例えば、油分、界面活性剤、粉末、色材、水、アルコール類、増粘剤、キレート剤、シリコーン類、酸化防止剤、紫外線吸収剤、保湿剤、香料、各種薬効成分、防腐剤、pH調整剤、中和剤などが挙げられる。例えば、ノネナールマスキング作用や皮膚ダメージ抑制を促進する他の薬効成分などが含まれていてもよい。
　本発明を化粧品、医薬品、医薬部外品等の皮膚外用剤に適用する場合、本発明の剤又は組成物におけるノネナールマスキング剤は、本発明のノネナールマスキング作用を損なわない限り限定されず、種類、目的、形態、利用方法などに応じて、適宜決めることができる。例えば、化粧料全量中に、ベンズアルデヒド、ジヒドロミルセノール、リナロール、フェニルエチルアルコール、ベンジルアセテート、およびアニスアルデヒドからなる群より選択される1又は複数の化合物等のノネナールマスキング剤を、例えば、0.0001～0.001重量％、0.001～0.005重量％、0.005～0.01重量％、0.01～0.02重量％、0.02～0.05重量％、0.05～0.1重量％、0.1～1.0重量％、1.0～10重量％、10～50重量％、50～100重量％等任意の割合で配合できる。
　しかしながら、本発明の剤や組成物の採り得る形態は、上述の剤型や形態に限定されるものではない。
　また、本発明は、ノネナールによる皮膚ダメージを本発明の剤又は組成物を投与することにより抑制する方法も提供する。本発明の方法は、美容を目的とする方法であり、医師や医療従事者による治療ではないことがある。
　本発明の剤又は組成物を投与する対象は，ノネナールによる皮膚ダメージが客観的又は主観的に認められる対象であっても，ノネナールによる皮膚ダメージを予防したいと希望する対象であってもよい。例えば，ノネナール量が多い、肌色黄色化、菲薄化、細胞増殖の低下がみられる、加齢臭を有する、等と判断された対象であってもよく、あるいは，加齢臭やノネナールによる皮膚ダメージ，例えば，皮膚菲薄化、しわ、しぼみ、たるみ、皮膚弾力低下等を気にしている対象であってもよい。
　また、本発明は、ノネナールマスキング作用を指標とした、皮膚ダメージ抑制剤のスクリーニング方法も提供する。本発明のスクリーニング方法は、候補薬剤のノネナールマスキング作用を測定する工程、候補薬剤のノネナールマスキング作用に基づき、皮膚ダメージ抑制剤を選択する工程、を含んでもよい。本発明の方法により，候補薬剤が抗光老化効果を有するか否かについてのスクリーニングが可能となり，製品開発や新たな肌ケアの提案が可能になる。
　次に実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。
実験1：悪臭物質の評価
実験1-1：悪臭物質の調製
　悪臭を有する物質として下記の公知物質を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
実験1-2：悪臭物質による皮膚への作用
　実験1-1にて調製した悪臭物質の皮膚に対する作用を確認するために、以下の実験を行った。
　ヒト表皮細胞（4000個）をHumedia-KG2（クラボウ）培地にて3日間37℃で培養後、実験1の物質を培地に50μMとなるように添加した。対照には溶媒であるエタノールを同量添加した。添加後24時間37℃で培養し、添加後の細胞数を計数した。対照の細胞数に対する物質を添加した際の細胞数の割合（％）を以下の式により計算し、生存率を求めた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000009
　結果を図1に示す。図1に示すように他の悪臭物質に比べてノネナールを使用すると細胞生存率が有意に減少し、皮膚細胞に対し毒性があることが示された。
実験2：ノネナール濃度の違いによる細胞毒性の評価
　次に、実験1で毒性が見られたノネナールを様々な濃度（0μM、5μM、10μM、25μM、50μM）で用いること以外は実験1-2と同様の方法で細胞生存率を求めることで、ノネナールによる細胞毒性の濃度依存性を調べた。
　結果を図2に示す。図2に示すようにノネナールの濃度が高いほど細胞生存率が有意に減少し、ノネナールの細胞毒性は濃度に依存することが示された。
実験3：ノネナールマスキング作用を有する物質の評価
実験3-1：評価対象物質の調製
　下記のノネナールマスキング作用を有する又は有さない物質を評価対象物質として使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
実験3-2：評価対象物質の細胞毒性
　悪臭物質の代わりに様々な濃度（5μM、50μM、500μM）の評価対象物質を用いること以外は実験1-2と同様の方法で細胞生存率を求めることで、評価対象物質の細胞毒性を調べた。
　結果を図3に示す。図3より、β-ダマスコンを除く上記評価対象物質は、細胞毒性を有さないことが確認された。
実験3-3：評価対象物質のノネナールによる皮膚ダメージ抑制効果
　5μMの評価対象物質および様々な濃度（5μM、50μM、500μM）のノネナールを用いること以外は実験1-2と同様の方法で細胞生存率を求めることで、評価対象物質のノネナールによる皮膚ダメージ抑制効果を調べた。
　結果を図4に示す。図4より、ノネナールのみを添加すると濃度依存的に細胞生存率は減少したが、ノネナールマスキング作用を有する物質を添加すると、細胞生存率の減少が抑制された。一方、ノネナールマスキング作用を有さない物質を添加しても、このような細胞生存率の減少の抑制は見られなかった。
実験4：3D皮膚モデルを用いたノネナールによる皮膚ダメージ抑制効果
　実験4-1：3D皮膚モデルの作成
　DPBSに50倍希釈したCellStart(Invitrogen Life Technologies)液でコーティングしたセルカルチャーインサート（φ12mm，多孔膜の平均孔径：0.4μm）にCnT Prime培地(CELLnTEC)溶液に希釈したヒト表皮細胞細胞（2.2×105個/500μl）を播種し，CnT Prime培地(CELLnTEC)溶液1mlをインサート下に加えて37℃で3日間培養した。その後、インサート上の培地をビタミンC（50μg/ml）が加えられたCnT-PR-3D培地(CELLnTEC)で500μl、インサート下の培地を1mlに置換し、37℃で1日間培養した。1日後、インサート上の培地を吸い取り、インサート下の培地をビタミンC（50μg/ml）が加えられたCnT-PR-3D培地(CELLnTEC)500μlに置換し、37℃で1日間培養した。この作業を8日間行うことで3D皮膚モデルを構築した。
実験4-2：評価対象物質のノネナールによる皮膚ダメージ抑制効果の皮膚厚による評価
　実験4-1で作成した皮膚モデルの皮膚モデル完成の３日前に50μMノネナールのみ、又は50μMノネナールおよび50μMの各種評価対象物質を添加し、そして対照には溶媒であるエタノールを同量添加し、3日間37℃で培養した。
　結果を図5、6に示す。これらの図からわかるように、ノネナールを添加すると皮膚の菲薄化が見られるが、ノネナールマスキング作用を有する評価対象物質を添加すると皮膚の菲薄化が抑制されていた。一方、ノネナールマスキング作用を有さない物質を添加してもこのような皮膚の菲薄化の抑制は見られなかった。これらの結果は、実験2～3の結果と一致する。
実験4-3：評価対象物質のノネナールによる皮膚ダメージ抑制効果の増殖細胞数による評価
　実験4-1で作成した皮膚モデルの皮膚モデル完成の３日前に50μMノネナールのみ、又は50μMノネナールおよび50μMの各種評価対象物質を添加し、そして対照には溶媒であるエタノールを同量添加し、2日間37℃で培養し、BrdU一次抗体（Abcam社製、Ab6326）を50μMとなるように培地に添加してさらに1日間37℃で培養した。その後BrdU二次抗体（DAKO社製、#E0468）（1/5000希釈）により皮膚モデルを染色し、BrdU陽性細胞の数をカウントし、皮膚モデルの長さ（皮膚モデル横方向の全長）で割ることで1mmの長さ当たりのBrdU陽性細胞数（cells/mm）を算出した。
　結果を図7、8に示す。これらの図からわかるように、ノネナールを添加すると皮膚における増殖細胞数が減少し細胞増殖が抑制されていることがわかるが、ノネナールマスキング作用を有する評価対象物質を添加すると増殖細胞数の減少が抑制されていた。一方、ノネナールマスキング作用を有さない物質を添加してもこのような増殖細胞数の減少の抑制は見られなかった。これらの結果は、実験2～3の結果と一致する。
　以上の結果により、ノネナールには皮膚細胞増殖抑制による皮膚ダメージ及び／又は皮膚菲薄化といった皮膚ダメージを促進する作用があるが、ベンズアルデヒド、ジヒドロミルセノール、リナロール、フェニルエチルアルコール、ベンジルアセテート、およびアニスアルデヒド等のノネナールマスキング剤を使用すると、かかる皮膚ダメージを抑制できることが分かった。これらの物質は、皮膚ダメージを抑制し、ひいてはしわ、しぼみ、たるみ、皮膚老化等を予防・改善したり、皮膚弾力、皮膚機能、耐性等を改善すること等が期待される。

Claims (8)

  1. 　ノネナールマスキング剤であって、ノネナールによる皮膚ダメージを抑制するための薬剤。
  2. 　皮膚ダメージ抑制剤であって、ノネナールマスキング剤を含む薬剤。
  3. 　前記ノネナールマスキング剤が、ベンズアルデヒド、ジヒドロミルセノール、リナロール、フェニルエチルアルコール、ベンジルアセテート、およびアニスアルデヒドからなる群より選択される1又は複数の化合物である、請求項1又は2に記載の薬剤。
  4. 　前記皮膚ダメージが皮膚菲薄化である、請求項1～3のいずれか1項に記載の薬剤。
  5. 　請求項1～4のいずれか1項に記載の薬剤を含む組成物。
  6. 　ノネナールによる皮膚ダメージをノネナールマスキング剤により抑制する美容方法。
  7. 　前記ノネナールマスキング剤が、ベンズアルデヒド、ジヒドロミルセノール、リナロール、フェニルエチルアルコール、ベンジルアセテート、およびアニスアルデヒドからなる群より選択される1又は複数の化合物である、請求項6に記載の美容方法。
  8. 　前記皮膚ダメージが皮膚菲薄化である、請求項6又は7に記載の美容方法。
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