WO2021019830A1 - 粒子定量装置 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a particle quantifying device.
  • particles are identified and counted in units of one, so changes in the number of particles can be detected with high sensitivity even when the concentration is low or the number of particles is small, and high-sensitivity and high-precision detection is possible.
  • the conventional technology has a problem that the range of the number of particles that can accurately recognize particles is narrow.
  • the particle counting method as in Patent Document 2 for example, when the number of particles increases, the contact between particles and the overlap between particles increase stochastically, and individual identification of particles becomes difficult.
  • the distribution is usually represented by the Poisson distribution, and a simple counting model is known (Fig. 12). That is, when the number of particles existing in a certain area increases, the efficiency of counting the particles individually decreases. In the region where the number of particles is larger, the particles overlap each other in the light transmission direction. As a result, the transmitted light intensity is lowered as a whole due to multiple scattering or the like, so that the acquired image becomes unclear, the particle discrimination ability in image processing deteriorates, and counting is lost (FIG. 13).
  • the present invention has been made in view of such a situation, and an object of the present invention is to provide a particle quantification device that widens the range of the number of particles capable of accurately recognizing particles in a particulate sample.
  • An example of the particle quantifying device is An image acquisition means for acquiring a sample image representing a particulate sample, A data processing means for performing arithmetic processing on the sample image and It is a particle quantifying device equipped with The data processing means Obtain the frequency domain representation of the sample image and The frequency domain representation is separated into high frequency components and low frequency components. A high frequency image is acquired as a spatial region representation of the high frequency component. A low frequency image is acquired as a spatial region representation of the low frequency component. Recognizing the particulate sample based on the high frequency image and the low frequency image. It is characterized by that.
  • an example of the particle quantifying device is An image acquisition means for acquiring a sample image representing a particulate sample, A data processing means for performing arithmetic processing on the sample image and It is a particle quantifying device equipped with The data processing means Based on the sample image, a high numerical aperture image by light of a component that optically passes through a high numerical aperture optical path and a low numerical aperture image by light of a component that optically passes through a low numerical aperture optical path are acquired. And The particulate sample is quantified based on the high numerical aperture image and the low numerical aperture image. It is characterized by that.
  • an example of the particle quantifying device is An image acquisition means for acquiring a sample image representing a particulate sample, A data processing means for performing arithmetic processing on the sample image and It is a particle quantifying device equipped with The data processing means In the sample image, the particle region where the particles are present is extracted. Calculate the number of pixels in the particle area and The particulate sample is quantified based on the ratio of the number of pixels in the particle region to the number of pixels in the sample image. It is characterized by that.
  • the range of the number of particles that can accurately recognize the particles in the particulate sample becomes wider.
  • the schematic block diagram of the observation apparatus which concerns on 1st Embodiment.
  • the flowchart which shows an example of the operation of the observation apparatus of FIG.
  • An example of an image relating to the operation of the observation device of FIG. A histogram of the brightness of all pixels in a high frequency image.
  • the figure which shows the change according to the culture elapsed time of the total number of high-intensity pixels in a high-frequency image.
  • FIG. 1 is a schematic configuration diagram showing the configuration of the observation device 1 according to the first embodiment.
  • the observation device 1 is a device for observing a particulate sample.
  • a particulate sample means, for example, a sample containing particles, cells, or bacteria.
  • the meaning of "particle” is not particularly limited, but may be defined as including an organism such as a cell or a bacterium, or may be an inanimate object such as latex particles or polystyrene beads.
  • the observation device 1 has, as main components, an optical system 101 for illumination, a sample container 102, a pedestal 103, an XY stage 104, an objective lens 105, an objective lens actuator 106, and the like.
  • An image pickup camera 107 and a computer 108 are provided.
  • the illumination optical system 101 uniformly illuminates the particulate sample. For example, when the particulate sample is arranged on the bottom surface of the sample container 102, the bottom surface of the sample container 102 is uniformly illuminated.
  • the illumination optical system 101 is constructed from a light source, a Koehler illumination optical system, and the like.
  • the sample container 102 shall have a storage portion capable of holding a particulate sample.
  • Particulate samples can be provided, for example, as one or more sample solutions.
  • As the sample container 102 for example, a petri dish, a dish, or a microtiter plate or the like is used.
  • the sample container 102 holds a biologically related particulate sample such as cells or bacteria inside or in a well thereof.
  • the sample container 102 can be used for work such as cell culture or bacterial culture, and in particular, can be used for identification culture, culture for drug susceptibility testing, and the like.
  • the pedestal 103 can hold the sample container 102. It is preferable that the pedestal 103 has a structure in which the upper surface and the lower surface (that is, upstream or downstream in the optical path) of the measurement sample surface in the sample container 102 transmit light.
  • a transparent member may be used, or a void without a shielding structure or the like may be used.
  • the XY stage 104 can move the pedestal 103 on which the sample container 102 is placed in the X and Y directions.
  • the XY stage 104 may include a heater or the like for controlling the temperature of the sample container 102 (not shown).
  • a heater for example, a transparent glass heater can be arranged on the bottom surface or the periphery thereof.
  • the entire optical system may be surrounded by a heat insulating material, and the temperature inside may be controlled by a heater.
  • the objective lens 105 is held by the objective lens actuator 106.
  • the objective lens actuator 106 is an actuator that moves the objective lens 105 in the Z direction (illumination optical axis direction), and can scan the focal position of the objective lens 105 in the depth direction of the sample container 102.
  • the image pickup camera 107 can be focused on the measurement sample surface of the sample container 102.
  • the image pickup camera 107 functions as an image acquisition means for acquiring an image (sample image) representing a particulate sample. Such a configuration is suitable when the particles are translucent.
  • the sample image is a transmitted image, that is, an image composed of light transmitted through the particulate sample.
  • the imaging camera 107 is installed at the focal position of the objective lens 105, that is, at a position where an image of a particulate sample is formed. If the objective lens 105 is compatible with an infinity correction optical system, an imaging lens is installed between the imaging camera 107 and the objective lens 105.
  • the imaging camera 107 captures, for example, a sample image as a microscope image.
  • the image pickup camera 107 has a function of converting an captured sample image into an electric signal and outputting or transmitting the image. In this embodiment, the captured sample image is transferred to the computer 108.
  • An optical filter such as a colored glass filter or an interference filter may be appropriately inserted between the image pickup camera 107 and the objective lens 105, if necessary.
  • the computer 108 can be configured by using a known computer, and includes a calculation unit that performs various calculation processes and controls, and a storage unit that stores information.
  • the storage unit may include a temporary, volatile or transient storage medium such as a semiconductor memory device, or may include a non-temporary, non-volatile or non-transient storage medium such as a hard disk, and includes both of these. It may be.
  • the computer 108 may include an input device (mouse, keyboard, etc.) that receives input from the user and a display device (display, etc.) that displays the measurement result.
  • the computer 108 functions as a data processing means for performing arithmetic processing on the sample image, and executes a data processing step for performing arithmetic processing on the sample image.
  • cells or bacteria which are biologically related particulate samples, are used as the observation target of the observation device 1.
  • Cells or bacteria are cultured in 96-well microtiter plates and changes over time are measured.
  • FIG. 2 is an example of changes over time in an image (transmitted light image) when a particulate sample is cultured in a constant temperature state.
  • FIG. 2A is an image immediately after the start of observation
  • FIG. 2B is an image about 2 hours after the start of observation
  • FIG. 2C is an image 6 hours after the start of observation.
  • This figure shows how the particulate sample grows with the culturing time.
  • FIG. 2 (b) the particulate samples can be individually identified, but after 6 hours (FIG. 2 (c)), the particles come close to each other or overlap each other. , The outline of each particle becomes unclear.
  • the overall brightness is reduced, making it difficult to identify each particle.
  • the particle counting method as in Patent Document 2 it becomes difficult to identify the particles, and it becomes difficult to perform accurate counting.
  • an objective lens and an imaging lens may be used, and the image may be imaged on an imaging camera for detection.
  • the transmitted light image contains various information collected by each lens.
  • the straight component not the straight component but the high frequency component mainly generated by scattering / diffraction contributes greatly.
  • the straight-ahead component contributes to the magnitude of the intensity of the image.
  • FIG. 3 is a diagram for explaining the outline of the imaging optical system and the separation of the high numerical aperture component and the low numerical aperture component.
  • numerical aperture (Numerical aperture) may be simply abbreviated as "NA”.
  • the optical path L1 near the center of the lens corresponds to light with a low NA component. If the low NA component is used, an image mainly containing the straight light component can be acquired, so that the change in the transmitted light intensity can be acquired, and information equivalent to the intensity information measured by the so-called turbidity method can be obtained. can get. Further, the optical path L2 at the peripheral edge of the lens corresponds to light having a high NA component. If a high NA component is used, a scattered or diffracted component will be imaged, so that a particle image from which the background light intensity has been removed can be extracted.
  • the observation device 1 approximately analyzes the intensity information of the image (low NA image) with the low NA component. That is, the particles are identified based on the decrease in brightness that occurs when the particles are present, and the existing region (or the pixels constituting the region) is extracted.
  • the intensity information depending on the fine structure is acquired from the image with the high NA component (high NA image), and the existing region of the particles (or the pixels constituting the region) is extracted based on this. Then, the regions of both images are combined to form a particle region. This makes it possible to accurately recognize or quantify particles for a wider range of particle numbers (or particle concentrations).
  • the present inventor can substantially separate the high NA component and the low NA component by using the frequency domain representation of the image without actually preparing two types of optical detection systems. I paid attention to. For example, if the frequency domain representation (for example, Fourier transform) of a transmitted light image is acquired and this frequency domain representation is separated into a high frequency component and a low frequency component, a component substantially corresponding to a high NA component and a low NA component (for example). Alternatively, components that roughly correspond to these) can be obtained.
  • the frequency domain representation for example, Fourier transform
  • the observation device 1 constructs two types of images from one sample image, whereby the measurement time can be shortened and the device cost can be reduced.
  • the frequency domain representation can be obtained, for example, by a two-dimensional FFT (Fast Fourier Transform) process. Further, the obtained frequency domain representation is separated into a high frequency component and a low frequency component, and IFFT (Inverse Fast Fourier Transform) processing is performed on each component to obtain a high frequency image with the high frequency component and a low frequency component. It is possible to acquire a low frequency image with a frequency component.
  • FFT Fast Fourier Transform
  • IFFT Inverse Fast Fourier Transform
  • FIG. 4 is a flowchart showing an example of the operation of the observation device 1, that is, an example of a particle recognition method and a particle quantification method executed by the observation device 1.
  • FIG. 5 shows an example of an image related to the operation of the observation device 1.
  • bacteria cultured as a particulate sample are used.
  • the process shown in FIG. 4 is started by the observation device 1 acquiring a sample image (step S1).
  • Step S1 is an image acquisition step. This process is performed, for example, by the imaging camera 107 imaging a particulate sample.
  • the imaging camera 107 may transmit the captured sample image to the computer 108, and the computer 108 may receive the sample image.
  • FIG. 5A is an example of the sample image acquired in step S1. This example is a transmission image of cultured bacteria having a culture time of about 150 minutes.
  • the computer 108 acquires a spatial domain representation of the luminance values of the pixels of the sample image. For example, the brightness values of the pixels at each position arranged in two dimensions are acquired.
  • the computer 108 executes a data processing step including the subsequent steps S2 to S5.
  • the computer 108 acquires the frequency domain representation of the sample image (step S2). This process is performed, for example, by performing a Fourier transform or other frequency domain transform on the spatial domain representation. In this embodiment, a two-dimensional FFT is used as an example of the Fourier transform.
  • FIG. 5 (b) is an image of a frequency domain representation obtained by performing a two-dimensional FFT process on FIG. 5 (a).
  • the center represents a component having a frequency (spatial frequency) of 0, and the closer to the periphery, the higher the frequency.
  • the brightness of each pixel in the image represents the magnitude of the frequency component corresponding to that position.
  • the frequency domain representation is an image is taken as an example for explanation, but the frequency domain representation is not limited to the image and can be processed in any format.
  • the computer 108 separates the acquired frequency domain representation into a high frequency component and a low frequency component (step S3). Separation can be performed, for example, as shown in FIGS. 5 (c) and 5 (d).
  • a boundary line that separates the low frequency region including the point of frequency 0 and the high frequency region not including the point of frequency 0 is defined.
  • the boundary line can be, for example, a circle having a predetermined radius (for example, a radius of 6 pixels) centered on a point having a frequency of 0.
  • the inside of this circle is the low frequency region, and the outside of the circle is the high frequency region.
  • the low frequency domain is sometimes referred to as the region of interest (ROI).
  • the affiliation of points on the circumference can be arbitrarily determined, and may be included in the low frequency region or in the high frequency region.
  • the inside of the circle, that is, the low frequency region is masked to acquire the high frequency component.
  • the masking process is executed, for example, by setting the size of the component (luminance in the image) of the region to 0.
  • the low frequency component masking the outside of the circle, that is, the high frequency region is acquired.
  • step S4 the computer 108 acquires the spatial domain representation of each component (step S4). That is, a low frequency image is acquired as a spatial region representation of a low frequency component, and a high frequency image is acquired as a spatial region representation of a high frequency component.
  • This process is performed, for example, by executing the inverse conversion of the conversion in step S2 for the frequency domain representation.
  • the two-dimensional FFT is used in step S2
  • the two-dimensional IFFT is used in step S4.
  • the spatial area representation can be expressed in the same format as the spatial area representation (that is, the image) before the FFT conversion.
  • 5 (e) is a high frequency image composed of the high frequency components shown in FIG. 5 (c)
  • FIG. 5 (f) is a low frequency image composed of the low frequency components shown in FIG. 5 (d). In this way, two types of images having different characteristics are acquired.
  • the computer 108 recognizes or quantifies the particulate sample based on the obtained high-frequency image and low-frequency image (step S5).
  • the computer 108 recognizes a region in the sample image where particles are present.
  • the observation device 1 functions as a particle recognition device that recognizes the particulate sample.
  • the computer 108 quantifies the amount of particles contained in the sample image.
  • the observation device 1 functions as a particle quantification device for quantifying the particulate sample.
  • the "quantitative quantity" includes, in addition to accurately measuring the number of particles, calculating the approximate number of particles, calculating the concentration of particles, and the like.
  • the computer 108 may start the recognition or quantification of another sample image.
  • the loop shown in FIG. 4 may be executed at predetermined time intervals. That is, the imaging camera 107 may acquire sample images at predetermined time intervals, and the computer 108 may recognize or quantify the particulate sample for each sample image. In this way, it is possible to obtain information on changes over time that represent the state of increase in particles.
  • FIG. 6 is an example of a histogram of luminance for all pixels of a high frequency image. This histogram is of the high frequency image of FIG. 5 (e).
  • the "m” in the figure represents a time unit, and in this example, it represents a "minute”.
  • "0 m” represents the brightness distribution of the image at the start of culture, that is, the state in which the elapsed culture time is 0 minutes
  • "34 m" represents the brightness distribution of the image in the state where the elapsed culture time is 34 minutes.
  • FIG. 7 is a diagram showing changes in the total number of high-intensity pixels in a high-frequency image according to the elapsed culture time.
  • the "high-luminance pixel” means a pixel whose brightness exceeds a predetermined threshold brightness.
  • FIG. 7 is an example when the threshold brightness is about 6. This threshold is shown by a broken line in FIG.
  • the brightness of each pixel is represented by 256 steps from 0 to 255, where 0 is the lowest brightness (dark) and 255 is the highest brightness (bright).
  • the number of high-brightness pixels is increasing with time in a time zone of less than about 400 minutes.
  • the number of high-luminance pixels increases as the amount of particles increases, it can be said that a change in the amount of particles can be detected with high sensitivity by using a high-frequency image.
  • FIG. 8 is an example of a histogram of luminance for all pixels of a low frequency image. This histogram is from the low frequency image of FIG. 5 (f). Although the data for each elapsed culture time are not individually specified, FIG. 8 (a) shows the elapsed culture time of 0 to 184 minutes, and FIG. 8 (b) shows the elapsed culture time of 214 to 304 minutes. 8 (c) shows the culture elapsed time of 334 to 424 minutes.
  • FIG. 9 is a diagram showing changes in the total number of low-luminance pixels in a low-frequency image according to the elapsed culture time.
  • the "low-luminance pixel” means a pixel whose brightness is smaller than a predetermined threshold brightness.
  • FIG. 9 is an example when the threshold brightness is about 96. This threshold is shown by a broken line in FIG.
  • the number of low-brightness pixels will increase over time.
  • the number of low-luminance pixels increases as the amount of particles increases, it can be said that a change in the amount of particles can be detected with high sensitivity by using a low-frequency image.
  • the number of low-brightness pixels is almost constant. It is considered that this is because the particles are present in the entire sample image and are saturated. Even in this time zone, the number of low-luminance pixels does not decrease over time, so it can be said that the possibility of erroneously recognizing the amount of particles using a low-frequency image is low.
  • the computer 108 extracts the region where the particles exist in the high frequency image (first region), extracts the region where the particles exist in the low frequency image (second region), and is based on these two regions. Quantify the particulate sample.
  • the first region is extracted based on the brightness of each pixel of the high frequency image
  • the second region is extracted based on the brightness of each pixel of the low frequency image.
  • the logical sum of the first region in the high frequency image and the second region in the low frequency image may be acquired. Since the first region and the second region represent the region where the particles exist in each image, the particles can be efficiently quantified by combining them (for example, obtaining the logical sum). That is, the computer 108 obtains the logical sum (logical sum region) of the particle existence region by taking the logical sum of the first region and the second region, and quantifies the particulate sample based on this logical sum region. You may. In particular, the particulate sample may be quantified based on the area of the OR region. The area is represented by, for example, the number of pixels.
  • FIG. 10 shows the change in the total number of pixels in the OR region according to the elapsed culture time.
  • the elapsed culture time elapses from 0 minutes to 1000 minutes or more, the state changes from a state in which the number of particles is small to a state in which the particles are densely packed and the particles overlap each other.
  • FIG. 7 (example of a high frequency image) reflects the increase of particles only up to about 400 minutes, and after that, the number of pixels decreases as the number of particles increases, which may lead to erroneous detection of the amount of particles.
  • the increase of particles is accurately reflected for a while even after exceeding 400 minutes, and the number of pixels does not decrease even after saturation, and false detection of the amount of particles is suppressed. Will be done.
  • the increase of particles is not reflected until about 200 minutes, and until then, the number of pixels decreases as the number of particles increases, which leads to erroneous detection of the amount of particles.
  • the increase of particles is accurately reflected from about 100 minutes, and the number of pixels does not decrease until then, and erroneous detection of the amount of particles is suppressed.
  • a calibration curve obtained in advance can be used to determine the specific value of the amount of particles.
  • the computer 108 may obtain a calibration curve that associates a value representing the number of pixels in the OR region with the amount of particulate sample. Such a calibration curve may be stored in advance by the computer 108.
  • the computer 108 may quantify the particulate sample based on such a calibration curve and the number of pixels in the OR region.
  • the relationship between the culture time and the amount of particulate sample is obtained by a separate experiment or the like, and the culture time and the logical sum are obtained from the information shown in FIGS. 6 and 8. Find the relationship with the number of pixels in the area. Based on these two types of relationships, it is possible to create a calibration curve that associates the number of pixels in the OR region with the amount of the particulate sample. Then, as described above, the amount of the particulate sample in the sample image can be determined based on the calibration curve and the number of pixels in the logical sum region with respect to the desired sample image.
  • the particulate sample is quantified based on the number of pixels in the OR region as shown in FIG. 10, the range of the number of particles that can accurately recognize the particles becomes wider.
  • the extraction process of each area can be easily performed only by setting the threshold value, and the cost can be reduced.
  • the processing speed can be increased. Further, since two different types of images are created from one sample image, the time such as the exposure time for imaging is shortened as compared with the configuration in which each image is imaged under different optical conditions, and the device The size can be reduced, the processing speed can be improved, and the cost can be reduced.
  • the computer 108 may output information indicating a change over time for each loop. For example, information indicating the time-dependent change in the brightness of each pixel in the first region in the high-frequency image and information indicating the time-dependent change in the brightness of each pixel in the second region in the low-frequency image may be output. Alternatively, the computer 108 may output information representing the time-dependent change in the number of pixels in the first region in the high-frequency image and information representing the time-dependent change in the number of pixels in the second region in the low-frequency image.
  • Each threshold can be arbitrarily designed. For example, in the frequency domain representation (FIGS. 5B to 5D), it is not necessary to set the radius of the circle that separates the low frequency domain and the high frequency domain to 6, and when extracting high-luminance pixels in a high-frequency image. It is not necessary to set the threshold brightness (FIG. 6) of 6 to 6, and it is not necessary to set the threshold brightness (FIG. 8) to 96 when extracting low-luminance pixels in a low-frequency image.
  • the particulate sample was quantified based on the OR region, but it is not necessary to use the OR region.
  • the computer 108 acquires the non-zero-order frequency domain representation by removing the 0th-order diffraction component from the frequency domain representation of the sample image, and acquires the non-zero-order image as the spatial domain representation of the non-zero-order frequency domain representation.
  • the particulate sample may be recognized or quantified based on a non-zero order image.
  • the computer 108 uses a sample image to obtain a high numerical aperture (NA) image due to the light of the component that optically passes through the optical path having a high numerical aperture, and the light of the component that optically passes through the optical path having a low numerical aperture.
  • NA numerical aperture
  • the particulate sample may be recognized or quantified based on the high NA image and the low NA image.
  • the computer 108 extracts the particle region in which the particles are present in the sample image, calculates the number of pixels in the particle region, and prepares the particulate sample based on the ratio of the number of pixels in the particle region to the number of pixels in the sample image. It may be recognized or quantified.
  • the computer 108 may calculate the ratio of the number of pixels in the OR region to the total number of pixels of the sample image, and recognize or quantify the particulate sample based on this ratio.
  • the computer 108 may recognize or quantify the particulate sample based on the number of pixels in the first region and the number of pixels in the second region.
  • a correction value based on the brightness of the pixel may be determined in advance, this correction value may be multiplied by each pixel, and each component may be separated based on the result. It is also possible to apply a method in which the average number of pixels per particle is acquired in advance and the number of pixels in the OR region is divided by this average to calculate the number of particles. These methods also have the same effects as those in the first embodiment.
  • the amount of the particulate sample may be corrected based on the amount of decrease in the overall brightness (for example, the average value of the brightness of each pixel). Even an image or partial image in which the number of pixels in the OR region is saturated (that is, an image or partial image in which the number of low-luminance pixels no longer increases even if the number of particulate samples increases) is particulate. Increasing the number of samples may result in a decrease in overall brightness.
  • a function may be used that corrects the amount of the particulate sample according to the statistical amount of pixel brightness of a certain sample image or a specific part thereof.
  • the statistical amount of pixel brightness may be, for example, the peak brightness value in the brightness histogram as shown in FIG. 8 or the average value of pixel brightness.
  • a function that corrects to increase the amount of particulate sample as the peak brightness decreases can be used. Since the decrease in brightness is information that the overlap of particles is increasing, the measurement range of the amount of the particulate sample can be further expanded by making a correction based on the amount of decrease in brightness, and a wider dynamic range can be obtained. be able to.
  • the format of the sample image can be arbitrarily designed by those skilled in the art. For example, an 8-bit grayscale image may be used, or a 16-bit grayscale image may be used. Further, the color image may be converted into a grayscale image before use.
  • a transmitted light image is used as the sample image, but the sample image is not limited to the transmitted image, and any image that can be converted into a frequency domain representation can be used.
  • a phase contrast image, a differential interference contrast image, or the like that can be obtained by a known means can be used as a sample image. The process is the same in this case as well.
  • the particulate sample has translucency, but a sample having no translucency may be used. Further, as the particulate sample, for example, particles, cells or bacteria are used, but samples other than these may be used.
  • Image correction may be performed on the sample image. For example, image processing such as shading correction, sensitivity unevenness correction, noise removal, smoothing, etc. may be performed. Further, the light source unevenness, the detector sensitivity unevenness, and the like may be corrected. These corrections allow for more accurate quantification.
  • the optical system of the observation device does not have to have the configuration as shown in FIG. 1, and may be any configuration as long as it can provide an image acquisition means for acquiring a sample image. Further, the sample image may be acquired via a communication network, a portable storage medium, or the like without including an optical system.
  • the observation device may not be used to quantify the particulate sample.
  • it may be a device that identifies a region where particles exist and outputs the position or shape of the region.
  • the present disclosure is not limited to the above-described embodiments and modifications, but also includes various other modifications.
  • Each embodiment is described in detail in order to explain the present disclosure in an easy-to-understand manner, and is not necessarily limited to the one including all the configurations described. It is also possible to replace a part of the configuration of one embodiment with a part of the configuration of another embodiment, and it is also possible to add a part of the configuration of another embodiment to the configuration of one embodiment. Is. In addition, it is possible to add / delete / replace the configurations of other embodiments with respect to a part of the configurations of each embodiment.

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Abstract

粒子状試料における粒子を正確に認識できる粒子数の範囲をより広くする粒子定量装置を提供する。　観察装置１は、粒子状試料を表す試料画像を取得する撮像カメラ１０７と、試料画像に関する演算処理を行うコンピュータ１０８とを備える。コンピュータ１０８は、試料画像の周波数領域表現を取得し、周波数領域表現を、高周波数成分および低周波数成分に分離し、高周波数成分の空間領域表現として高周波数画像を取得し、低周波数成分の空間領域表現として低周波数画像を取得し、高周波数画像および低周波数画像に基づいて粒子状試料を認識または定量する。

Description

粒子定量装置
　この発明は、粒子定量装置に関する。
　細胞の培養や、薬剤感受性検査などでの細菌の培養などにおいて、細胞、細菌などの状態を計測する技術が必要である。一例として、培養容器下方向から培養状態をカメラなどで検出し、その特徴量を基に細胞数、細菌数を算定する技術が知られている。
　細胞量・細胞数などを計測する方法として、透過画像の全体的な強度変化から粒子状物体の濃度を算定する方式がある。いわゆる濁度計測で利用される方法である。図１１のように、粒子濃度が多くなると、粒子による光散乱または／および回折または／および光吸収により、カメラなどで検出される透過光が減少するので、その透過光強度変化から、粒子数を算定するという方法である。このような方法の例は、特許文献１に記載される。
　このような方法では、粒子が高濃度に存在する場合に、粒子による光散乱・吸収による強度減少箇所が多くなり、全体として十分な強度変化が生じ、粒子数・濃度の算定が容易になるという利点がある。
　また別の方法として、粒子状物体の特徴量から粒子を識別し、粒子を個々にカウントするという方式がある。たとえば、粒子の大きさに対して十分に細かく測定できるようなカメラなどで検出し、透過画像のコントラストから、粒子を識別し、粒子を個々に計数する粒子カウント方式がある。このような方法の例は、特許文献２に記載される。
　粒子カウント方式では、粒子を１個単位で識別し、計数するため、低濃度または粒子数が少ないときでも、粒子数の変化を感度よく検出でき、高感度、高精度の検出が可能となるという利点がある。これにより、例えば、粒子数のわずかな変化を高精度に検出することができるようになり、また、培養時の細胞の増殖の兆しをより早期に検知することができる。
特開２００７－３０６８８９号公報 特開２００２－２１４２２８号公報
　しかしながら、従来の技術では、粒子を正確に認識できる粒子数の範囲が狭いという課題があった。
　たとえば特許文献１のように透過光強度変化を使う方法では、粒子数が少ないときは粒子による光散乱・吸収量が全体に対して僅かであり、透過光強度変化が小さい。そのため、粒子数・濃度を正確に算定することが困難になる。
　一方、たとえば特許文献２のような粒子カウント方式では、粒子数が多くなると、粒子同士の接触、粒子同士の重なりが確率的に多くなり、粒子の個別識別が困難になる。通常その分布はポアソン分布であらわされ、簡便的な数え落としモデルが知られている（図１２）。つまり、一定面積内に存在する粒子数が多くなると、粒子を個々に計数する効率が低下することになる。粒子数がさらに多い領域では、粒子同士の光透過方向への重なりが多くなる。その結果、多重散乱等により透過光強度が全体に低下するため、取得画像が不鮮明になり、画像処理での粒子識別能が悪くなり、数え落としが発生することになる（図１３）。このような理由等により、粒子カウントを行う場合、一定面積内に存在する粒子数が多くなると、図１２、図１３に示す影響が重なり、見かけ上の粒子計数値が逆に少なくなってしまい（例えば、図１４）、正確な粒子数、粒子濃度の算定が困難になる。とくに、粒子数が増えているにも関わらず、粒子数が少なくなってしまうという誤認識を引き起こしやすくなっている。個々の粒子を識別し、計数する場合には、このような原理的に避けられない課題がある。
　本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、粒子状試料における粒子を正確に認識できる粒子数の範囲をより広くする粒子定量装置を提供することを目的とする。
　この発明に係る粒子定量装置の一例は、
　粒子状試料を表す試料画像を取得する画像取得手段と、
　前記試料画像に関する演算処理を行うデータ処理手段と、
を備える、粒子定量装置であって、
　前記データ処理手段は、
　前記試料画像の周波数領域表現を取得し、
　前記周波数領域表現を、高周波数成分および低周波数成分に分離し、
　前記高周波数成分の空間領域表現として高周波数画像を取得し、
　前記低周波数成分の空間領域表現として低周波数画像を取得し、
　前記高周波数画像および前記低周波数画像に基づいて前記粒子状試料を認識する、
ことを特徴とする。
　また、この発明に係る粒子定量装置の一例は、
　粒子状試料を表す試料画像を取得する画像取得手段と、
　前記試料画像に関する演算処理を行うデータ処理手段と、
を備える、粒子定量装置であって、
　前記データ処理手段は、
　前記試料画像に基づいて、光学的に高開口数の光路を通過する成分の光による高開口数画像と、光学的に低開口数の光路を通過する成分の光による低開口数画像とを取得し、
　前記高開口数画像および前記低開口数画像に基づいて前記粒子状試料を定量する、
ことを特徴とする。
　また、この発明に係る粒子定量装置の一例は、
　粒子状試料を表す試料画像を取得する画像取得手段と、
　前記試料画像に関する演算処理を行うデータ処理手段と、
を備える、粒子定量装置であって、
　前記データ処理手段は、
　前記試料画像において粒子が存在する粒子領域を抽出し、
　前記粒子領域の画素数を算定し、
　前記試料画像の画素数に対する、前記粒子領域の画素数の割合に基づいて、前記粒子状試料を定量する、
ことを特徴とする。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2019-138526号の開示内容を包含する。
　この発明に係る粒子定量装置によれば、粒子状試料における粒子を正確に認識できる粒子数の範囲がより広くなる。
第１の実施形態に係る観察装置の概略構成図。 粒子状試料を恒温状態で培養したときの画像の経時変化の一例。 撮像光学系における高ＮＡ成分および低ＮＡ成分の説明図。 図１の観察装置の動作の一例を示すフローチャート。 図１の観察装置の動作に係る画像の例。 高周波数画像の全画素に対する輝度のヒストグラム。 高周波数画像における高輝度画素の総数の、培養経過時間に応じた変化を表す図。 低周波数画像の全画素に対する輝度のヒストグラム。 低周波数画像における低輝度画素の総数の、培養経過時間に応じた変化を表す図。 粒子存在領域の画素の総数の、培養経過時間に応じた変化を示す図。 従来技術による、透過光強度から粒子状試料を検出する方式の説明図。 従来技術によって画像から粒子識別して粒子数をカウントする際の、数え落としモデルによる粒子量に対する計数効率変化を説明するシミュレーション図。 従来技術による、粒子同士の重なりによる散乱・回折などによる光透過強度減少による、数え落としの影響を説明するシミュレーション図。 従来技術による、数え落としが発生する場合の、実粒子数と、識別計数粒子数の関係を説明するシミュレーション図。
　以下、図面を参照して本発明の実施形態について説明する。なお、図面は本発明の原理に則った具体的な実施形態を示しているが、これらは本発明の理解のためのものであり、決して本発明を限定的に解釈するために用いられるものではない。
［第１の実施形態］
（１）装置の構成の概要
　第１の実施形態に係る装置を図１に沿って説明する。図１は、第１の実施形態に係る観察装置１の構成を示す概略構成図である。観察装置１は、粒子状試料を観察するための装置である。粒子状試料とは、たとえば粒子、細胞、または細菌を含む試料を意味する。「粒子」の意味はとくに限定しないが、たとえば細胞または細菌等の生物を含むものとして定義されてもよく、ラテックス粒子やポリスチレンビーズ等の無生物であってもよい。
　図１に示すように、観察装置１は、主要な構成要素として、照明用光学系１０１と、サンプル容器１０２と、台座１０３と、ＸＹステージ１０４と、対物レンズ１０５と、対物レンズアクチュエータ１０６と、撮像カメラ１０７と、コンピュータ１０８とを備える。
　照明用光学系１０１は、粒子状試料を均一に照明する。たとえば粒子状試料がサンプル容器１０２の底面に配置されている場合には、サンプル容器１０２の底面を均一に照明する。照明用光学系１０１は、光源およびケーラー照明光学系などから構築される。
　サンプル容器１０２は、粒子状試料を保持できる格納部を有するものとする。粒子状試料は、たとえば１つ以上のサンプル液として提供可能である。サンプル容器１０２としては、たとえば、シャーレ、ディッシュ、マイクロタイタープレート様のものが使われる。サンプル容器１０２は、その窪み内部またはウェル内に、細胞、細菌などの生体関連の粒子状試料を保持する。サンプル容器１０２は、細胞培養または細菌培養等の作業に用いることができ、とくに、同定培養や薬剤感受性検査のための培養などに用いることができる。
　台座１０３は、サンプル容器１０２を保持することができる。台座１０３としては、サンプル容器１０２内の測定試料面の上面及び下面（すなわち光路における上流または下流）が光を透過する構造であると好適である。光を透過する構造としては、透明な部材を用いてもよいし、遮蔽構造体等のない空隙としてもよい。
　ＸＹステージ１０４は、サンプル容器１０２を載せた台座１０３をＸ方向及びＹ方向に移動させることができる。ＸＹステージ１０４は、サンプル容器１０２を温度調節するヒーター等を備えてもよい（不図示）。ヒーターとしては、例えば、透明ガラスヒータをその底面または周囲に配置することができる。または、光学系全体を断熱材で囲い、内部をヒーターで温度調節しても良い。
　対物レンズ１０５は対物レンズアクチュエータ１０６に保持される。対物レンズアクチュエータ１０６は、対物レンズ１０５をＺ方向（照明光軸方向）に移動させるアクチュエータであり、対物レンズ１０５の焦点位置をサンプル容器１０２の深さ方向に走査することができる。対物レンズ１０５の動作により、サンプル容器１０２の測定試料面に撮像カメラ１０７の焦点を合わせることができる。
　撮像カメラ１０７は、粒子状試料を表す画像（試料画像）を取得する画像取得手段として機能する。このような構成は、粒子が透光性を有する場合に好適である。本実施形態では、試料画像は透過画像すなわち粒子状試料を透過した光によって構成される画像となる。撮像カメラ１０７は、対物レンズ１０５の焦点位置、すなわち粒子状試料の像が結像される位置に設置される。対物レンズ１０５が無限遠補正光学系対応のものであれば、撮像カメラ１０７と対物レンズ１０５の間に結像レンズを設置する。撮像カメラ１０７は、たとえば試料画像を顕微鏡画像として撮像する。撮像カメラ１０７は、撮像した試料画像を電気信号に変換し、出力または送信する機能を備える。本実施形態では、撮像された試料画像はコンピュータ１０８に転送される。
　撮像カメラ１０７と対物レンズ１０５との間には、必要に応じて、色ガラスフィルタ、干渉フィルタなどの光学フィルタ（不図示）を適宜挿入してもよい。
　コンピュータ１０８は、公知のコンピュータを用いて構成することができ、各種演算処理および制御を行なう演算部と、情報を記憶する記憶部とを備える。記憶部は、半導体メモリ装置などの一時的、揮発性または過渡的記憶媒体を含んでもよいし、ハードディスクなどの非一時的、不揮発性または非過渡的記憶媒体を含んでもよく、これらの両方を含んでもよい。また、コンピュータ１０８は、ユーザからの入力を受け付ける入力装置（マウス、キーボードなど）と、測定結果を表示する表示装置（ディスプレイなど）を備えてもよい。コンピュータ１０８は、本実施形態において、試料画像に関する演算処理を行うデータ処理手段として機能し、試料画像に関する演算処理を行うデータ処理工程を実行する。
　本実施形態では、観察装置１の観察対象として、生体関連の粒子状試料である細胞または細菌を用いる。細胞または細菌は、９６穴マイクロタイタープレート内で培養され、経時変化が計測される。
（２）試料画像の特徴
　図２は、粒子状試料を恒温状態で培養したときの画像（透過光像）の経時変化の一例である。図２（ａ）は観察開始直後の画像であり、図２（ｂ）は観察開始から約２時間後の画像であり、図２（ｃ）は観察開始から６時間後における画像である。この図は、粒子状試料が培養時間に伴って増殖している様子を示している。約２時間後（図２（ｂ））では、粒子状試料を個別に識別することが可能であるが、６時間後（図２（ｃ））では、粒子同士が近接し、または重なってしまい、各粒子の輪郭が不鮮明となる。また、全体的に輝度が小さくなり、各粒子の識別は困難になる。この結果、特許文献２のような粒子カウント方式では、粒子の識別が困難になり、正確な計数が困難になってしまう。
　試料の撮像位置の像を取得するには、たとえば対物レンズ及び結像レンズを使い、撮像カメラにその像を結像させて検出すればよい。透過光像には、各レンズによって集められた種々の情報が含まれる。粒子等の細かな構造は、直進成分ではなく、主に散乱・回折などで生じる高周波数成分が大きく寄与する。一方、直進成分は、画像の強度の大きさに寄与する。
（３）試料画像の成分
　図３は、撮像光学系の概要と、高開口数成分と低開口数成分の切り分けとを説明する図である。なお、本明細書および図面において、「開口数」（Numerical Aperture）を単に「ＮＡ」と略記する場合がある。
　レンズ中央付近の光路Ｌ１は、低ＮＡ成分の光に対応する。低ＮＡ成分を使えば、直進光成分を主に含む画像を取得することができるので、透過光強度の変化を取得することができ、いわゆる濁度法で計測される強度情報と同等の情報が得られる。また、レンズ周縁部の光路Ｌ２は、高ＮＡ成分の光に対応する。高ＮＡ成分を使えば、散乱または回折された成分を結像させることになるので、背景光強度が除かれた粒子像を抽出することができる。
　本実施形態に係る観察装置１は、近似的に、低ＮＡ成分による画像（低ＮＡ画像）の強度情報を解析する。すなわち、粒子が存在する場合に生じる輝度低下に基づいて粒子を識別し、その存在領域（またはその領域を構成する画素）を抽出する。一方で、高ＮＡ成分による画像（高ＮＡ画像）から、細かな構造に依存する強度情報を取得し、これに基づいて粒子の存在領域（またはその領域を構成する画素）を抽出する。そして、両画像の領域を合わせて、粒子の領域とする。これにより、より広い範囲の粒子数（または粒子濃度）に対して、粒子を正確に認識または定量することができる。
　これら各成分に係る画像を検出するために、従来の技術では、低ＮＡ用および高ＮＡ用の２種類の光学検出系を設け、それぞれについて画像を取得する必要がある。これに対し、本発明者は、実際に２種類の光学検出系を準備しなくとも、画像の周波数領域表現を用いれば、高ＮＡ成分および低ＮＡ成分を実質的に分離することができるという点に着目した。たとえば、透過光像の周波数領域表現（たとえばフーリエ変換）を取得し、この周波数領域表現を高周波数成分および低周波数成分に分離すれば、実質的に高ＮＡ成分および低ＮＡ成分に相当する成分（または近似的にこれらに相当する成分）を取得することができる。
　この原理に基づいて、本実施形態に係る観察装置１は、ひとつの試料画像から２種類の画像を構築し、これによって、測定時間を短縮するとともに、装置コストも低減することができる。周波数領域表現の取得は、たとえば２次元ＦＦＴ（高速フーリエ変換）処理によって行うことができる。また、得られた周波数領域表現を、高周波数成分と低周波数成分とに分離し、各成分に対してＩＦＦＴ（逆高速フーリエ変換）処理を行うことにより、高周波数成分による高周波数画像と、低周波数成分による低周波数画像とを取得することができる。これら２種類の画像を用いることにより、より広い範囲の粒子数（または粒子濃度）に対して、粒子を正確に認識または定量することができる。
（４）装置の作用の概要
　図４は、観察装置１の動作の一例を示すフローチャートであり、すなわち、観察装置１によって実行される粒子認識方法および粒子定量方法の例を表す。また、図５に、観察装置１の動作に係る画像の例を示す。この例では、粒子状試料として培養される細菌を用いている。図４に示す処理は、観察装置１が試料画像を取得することによって開始される（ステップＳ１）。ステップＳ１は画像取得工程である。この処理は、たとえば撮像カメラ１０７が粒子状試料を撮像することによって実行される。撮像カメラ１０７は、撮像された試料画像をコンピュータ１０８に送信してもよく、コンピュータ１０８は試料画像を受信してもよい。
　図５の例では、粒子状試料として、培養される細菌を用いている。図５（ａ）はステップＳ１において取得される試料画像の例である。この例は、培養時間約１５０分次の培養細菌の透過画像である。コンピュータ１０８は、試料画像の画素の輝度値について、空間領域表現を取得する。たとえば、２次元に配列された各位置の画素の輝度値を取得する。
　次に、コンピュータ１０８は、後続のステップＳ２～Ｓ５を含んで構成されるデータ処理工程を実行する。まずコンピュータ１０８は、試料画像の周波数領域表現を取得する（ステップＳ２）。この処理は、たとえば空間領域表現に対して、フーリエ変換その他の周波数領域変換を実行することにより行われる。本実施形態では、フーリエ変換の例として２次元ＦＦＴを用いる。
　図５（ｂ）は、図５（ａ）を２次元ＦＦＴ処理して得られる周波数領域表現の画像である。図５（ｂ）の画像において、中心は周波数（空間周波数）０の成分を表し、周縁に近づくほど周波数が高い成分を表す。画像中の各画素の輝度は、その位置に対応する周波数成分の大きさを表す。本明細書および図面では、説明のために周波数領域表現を画像とした場合を例とするが、周波数領域表現は画像に限らず任意の形式で処理することができる。
　次に、コンピュータ１０８は、取得した周波数領域表現を、高周波数成分および低周波数成分に分離する（ステップＳ３）。分離はたとえば図５（ｃ）および図５（ｄ）に示すように行うことができる。図５（ｂ）の画像において、周波数０の点を含む低周波数領域と、周波数０の点を含まない高周波数領域とを分離する境界線を定義する。境界線は、たとえば周波数０の点を中心とした所定半径（たとえば半径６画素）の円とすることができる。この円の内側が低周波数領域、円の外側が高周波数領域となる。低周波数領域は関心領域（ＲＯＩ）と呼ばれる場合がある。なお円周上の点の所属は任意に決定可能であり、低周波数領域に含めてもよいし、高周波数領域に含めてもよい。
　次に、図５（ｃ）のように、円の内側すなわち低周波数領域をマスクして高周波数成分を取得する。マスク処理は、たとえば当該領域の成分の大きさ（画像では輝度）を０とすることによって実行される。同様に、図５（ｄ）のように、円の外側すなわち高周波数領域をマスクした低周波数成分を取得する。
　ステップＳ３の後、コンピュータ１０８は、各成分の空間領域表現を取得する（ステップＳ４）。すなわち、低周波数成分の空間領域表現として低周波数画像を取得し、高周波数成分の空間領域表現として高周波数画像を取得する。この処理は、たとえば周波数領域表現に対して、ステップＳ２の変換の逆変換を実行することにより行われる。本実施形態では、ステップＳ２で２次元ＦＦＴが用いられているので、ステップＳ４では２次元ＩＦＦＴを用いる。
　空間領域表現は、ＦＦＴ変換前の空間領域表現（すなわち画像）と同形式で表現することができる。図５（ｅ）は、図５（ｃ）に示す高周波数成分からなる高周波数画像であり、図５（ｆ）は、図５（ｄ）に示す低周波数成分からなる低周波数画像である。このようにして、互いに異なる特性を有する２種類の画像が取得される。
　次に、コンピュータ１０８は、得られた高周波数画像および低周波数画像に基づき、粒子状試料を認識または定量する（ステップＳ５）。たとえば、コンピュータ１０８は、試料画像において粒子が存在する領域を認識する。この場合には、観察装置１は、粒子状試料を認識する粒子認識装置として機能する。または、たとえば、コンピュータ１０８は、試料画像に含まれる粒子の量を定量する。この場合には、観察装置１は、粒子状試料を定量する粒子定量装置として機能する。ここで、「定量」とは、粒子の数を正確に計測することの他に、粒子の概数を算出すること、粒子の濃度を算出すること、等を含む。
　コンピュータ１０８は、１つの試料画像に対する認識または定量が終了すると、別の試料画像に対する認識または定量を開始してもよい。とくに、図４に示すループを所定時間ごとに実行してもよい。すなわち、撮像カメラ１０７は、所定時間ごとに試料画像を取得してもよく、コンピュータ１０８は、各試料画像について粒子状試料を認識または定量してもよい。このようにすると、粒子の増加の様子を表す経時変化に係る情報を得ることができる。
（５）定量の具体的手法
　粒子状試料を定量する具体的手法の例を以下に説明する。
　図６は、高周波数画像の全画素に対する輝度のヒストグラムの例である。このヒストグラムは図５（ｅ）の高周波数画像のものである。図中の「ｍ」は時間単位を表し、この例では「分」を表す。たとえば、「０ｍ」は培養開始時点すなわち培養経過時間が０分である状態の画像の輝度分布を表し、「３４ｍ」は培養経過時間が３４分である状態の画像の輝度分布を表す。
　図６の例では、培養時間が大きくなるにつれて輝度の高い画素が増えることが測定されている。つまり、試料画像において粒子が存在する領域が増えていることを検出しているということができ、したがって、高周波数画像において輝度の高い画素は、粒子が存在する領域に対応すると言うことができる。特に、培養経過時間が小さい場合でも、粒子の存在領域の変化を有意に識別することができる。
　図７は、高周波数画像における高輝度画素の総数の、培養経過時間に応じた変化を表す図である。ここで、「高輝度画素」とは、輝度が所定の閾値輝度を超える画素を意味する。図７は、閾値輝度を６程度とした場合の例である。この閾値を図６に破線で示す。なお、本実施形態では、各画素の輝度を０～２５５の２５６段階で表し、０が最も輝度が低く（暗く）、２５５が最も輝度が高い（明るい）ものとする。
　約４００分未満の時間帯で、高輝度画素の数が時間とともに増加している。ここで、粒子の量が増加するにつれ高輝度画素の数も増加すると考えられるので、高周波数画像を用いれば、この時間帯において粒子の量の変化を感度良く検出できると言える。
　図８は、低周波数画像の全画素に対する輝度のヒストグラムの例である。このヒストグラムは図５（ｆ）の低周波数画像のものである。培養経過時間ごとのデータを個別には特定しないが、図８（ａ）は培養経過時間が０分～１８４分のものを示し、図８（ｂ）は培養経過時間が２１４～３０４分のものを示し、図８（ｃ）は培養経過時間が３３４～４２４分のものを示す。
　図８（ａ）からわかるように、約２００分より短い時間帯の画像では、時間が経過してもヒストグラムに大きな変化は無い。しかしながら、図８（ｃ）に示すように、３３０分程度を超えると、輝度分布が低輝度側にシフトする様子が検出される。したがって、低周波数画像において輝度の低い画素は、粒子が存在する領域に対応すると言うことができる。
　図９は、低周波数画像における低輝度画素の総数の、培養経過時間に応じた変化を表す図である。ここで、「低輝度画素」とは、輝度が所定の閾値輝度より小さい画素を意味する。図９は、閾値輝度を９６程度とした場合の例である。この閾値を図８に破線で示す。
　約３００分を超えると、低輝度画素の数が時間とともに増加するようになる。ここで、粒子の量が増加するにつれ低輝度画素の数も増加すると考えられるので、低周波数画像を用いれば、この時間帯において粒子の量の変化を感度良く検出できると言える。
　また、５００分以降では低輝度画素の数がほぼ一定となっている。これは、粒子が試料画像全体に存在し、飽和しているためと考えられる。この時間帯でも、時間が経過しても低輝度画素数が減少するようなことはないので、低周波数画像を用いて粒子の量を誤って認識する可能性は低いと言える。
　このように、コンピュータ１０８は、高周波数画像において粒子が存在する領域（第１領域）を抽出し、低周波数画像において粒子が存在する領域（第２領域）を抽出し、これら２つの領域に基づいて粒子状試料を定量する。とくに、高周波数画像の各画素の輝度に基づいて第１領域を抽出し、低周波数画像の各画素の輝度に基づいて第２領域を抽出する。
　そして、これら２つの領域を合わせて考慮することにより、粒子の定量が可能となる。より具体的には、高周波数画像における第１領域と、低周波数画像における第２領域との論理和を取得してもよい。第１領域および第２領域は、各画像における粒子の存在領域を表すので、これらを合わせる（たとえば論理和を取得する）ことにより、粒子の定量を効率よく行なうことができる。すなわち、コンピュータ１０８は、第１領域と第２領域との論理和を取ることによって、粒子存在領域の論理和（論理和領域）を取得し、この論理和領域に基づいて粒子状試料を定量してもよい。とくに、論理和領域の面積に基づいて粒子状試料を定量してもよい。面積はたとえば画素の数によって表される。
　図１０は、論理和領域の画素の総数の、培養経過時間に応じた変化を示す。培養経過時間が０分から１０００分以上まで経過するにつれて、粒子が少ない状態から、粒子が密集し粒子同士が重なってしまう状態まで変化する。
　ここで、図７（高周波数画像の例）では４００分程度までしか粒子の増加を反映していないし、それ以降は粒子の増加につれて画素数が減少するため粒子の量の誤検出につながる可能性があるが、図１０の例では４００分を超えてからもしばらく粒子の増加を正確に反映しており、かつ、飽和して以降も画素数は減少せず、粒子の量の誤検出は抑制される。
　また、図９（低周波数画像の例）では、２００分程度までは粒子の増加を反映していないし、それまでは粒子の増加につれて画素数が減少しているため粒子の量の誤検出につながる可能性があるが、図１０の例では１００分程度から粒子の増加を正確に反映しており、かつ、それまでも画素数は減少せず、粒子の量の誤検出は抑制される。
　粒子の量の具体的な値の決定には、あらかじめ求めた検量線を用いることができる。たとえば、コンピュータ１０８は、論理和領域の画素数を表す値と、粒子状試料の量とを関連付ける検量線を取得してもよい。このような検量線は、コンピュータ１０８があらかじめ記憶していてもよい。
　また、たとえば、コンピュータ１０８は、このような検量線と、論理和領域の画素数とに基づいて、粒子状試料を定量してもよい。より具体的な例としては、論理和領域の画素数に応じて粒子状試料の量を与える関数や、論理和領域の画素数の割合に応じて粒子状試料の量を与える関数を用いることができる。
　より具体的な例として、培養時間と、粒子状試料の量（たとえば細胞の数）との関係を別途の実験等で求めておき、図６および図８に示す情報から、培養時間と論理和領域の画素数の数との関係を求める。これら２種類の関係に基づいて、論理和領域の画素数と、粒子状試料の量とを関連付ける検量線を作成することができる。そして、上述のように、この検量線と、所望の試料画像に対する論理和領域の画素数とに基づき、その試料画像における粒子状試料の量を決定することができる。
　このように、図１０のように論理和領域の画素数に基づいて粒子状試料の定量を行うと、粒子を正確に認識できる粒子数の範囲がより広くなる。
　また、閾値を設定するだけで、各領域の抽出処理は簡単に行なうことができ、低コスト化が可能になる。また処理速度も高速にできる。また、２種の異なる画像を１つの試料画像から作成するので、各画像を異なる光学的条件でそれぞれ撮像するような構成と比較すると、撮像のための露光時間などの時間が短縮し、また装置サイズの小型化ができ、処理速度向上、低コスト化が実現できる。
　なお、図４に示すようなループを（たとえば所定時間間隔で）実行する場合には、コンピュータ１０８は、各ループについて、経時変化を表す情報を出力してもよい。たとえば、高周波数画像における第１領域の各画素の輝度の経時変化を表す情報と、低周波数画像における第２領域の各画素の輝度の経時変化を表す情報とを出力してもよい。あるいは、コンピュータ１０８は、高周波数画像における第１領域の画素数の経時変化を表す情報と、低周波数画像における第２領域の画素数の経時変化を表す情報とを出力してもよい。
［その他の実施形態］
　第１の実施形態において、以下のような変形を施すことができる。
　各閾値は任意に設計することができる。たとえば、周波数領域表現（図５（ｂ）～（ｄ））において低周波数領域と高周波数領域とを分離する円の半径を６とする必要はなく、高周波数画像において高輝度画素を抽出する際の閾値輝度（図６）を６とする必要はなく、低周波数画像において低輝度画素を抽出する際の閾値輝度（図８）を９６とする必要はない。
　第１の実施形態では、論理和領域に基づいて粒子状試料の定量を行ったが、論理和領域を用いる必要はない。たとえば、コンピュータ１０８は、試料画像の周波数領域表現から０次回折成分を除去することにより非０次周波数領域表現を取得し、非０次周波数領域表現の空間領域表現として非０次画像を取得し、非０次画像に基づいて粒子状試料を認識または定量してもよい。
　または、コンピュータ１０８は、試料画像に基づいて、光学的に高開口数の光路を通過する成分の光による高ＮＡ（開口数）画像と、光学的に低開口数の光路を通過する成分の光による低ＮＡ画像とを取得し、高ＮＡ画像および低ＮＡ画像に基づいて粒子状試料を認識または定量してもよい。
　または、コンピュータ１０８は、試料画像において粒子が存在する粒子領域を抽出し、粒子領域の画素数を算定し、試料画像の画素数に対する、粒子領域の画素数の割合に基づいて、粒子状試料を認識または定量してもよい。
　または、コンピュータ１０８は、論理和領域の画素数の、試料画像の画素の総数に対する割合を算定し、この割合に基づいて、粒子状試料を認識または定量してもよい。
　または、コンピュータ１０８は、第１領域の画素数と、第２領域の画素数とに基づいて粒子状試料を認識または定量してもよい。
　試料画像の各画素に対してその画素の輝度に基づく補正値をあらかじめ決定しておき、この補正値を各画素に乗算し、その結果に基づいて各成分の分離を行ってもよい。また、あらかじめ１粒子あたり平均画素数を取得しておき、論理和領域の画素数をこの平均で除算して、粒子数を算定する方式も適用可能である。これらの方式でも、第１の実施形態と同様の効果を有する。
　論理和領域の画素数が飽和している状態では、全体的な輝度（たとえば各画素の輝度の平均値）の減少量に基づいて、粒子状試料の量を補正してもよい。論理和領域の画素数が飽和している画像または部分画像（すなわち、粒子状試料が増加してももはや低輝度画素が増加しない状態になっている画像または部分画像）であっても、粒子状試料が増加すれば全体的な輝度の減少が生じる場合がある。
　たとえば、ある試料画像またはその特定部分の、画素の輝度の統計的量に応じ、粒子状試料の量を補正するような関数を用いてもよい。画素の輝度の統計的量とは、たとえば、図８のような輝度ヒストグラムにおけるピーク輝度の値であってもよいし、画素の輝度の平均値であってもよい。たとえば、ピーク輝度が減少するにつれ粒子状試料の量を増加させるように補正する関数を用いることができる。輝度の減少は、粒子の重なりが増えている情報であるので、輝度の減少量に基づく補正を行なうことにより、粒子状試料の量の測定範囲をさらに広げることができ、より広いダイナミックレンジを得ることができる。
　試料画像の形式は当業者が任意に設計可能である。たとえば、８ｂｉｔのグレースケール画像を用いてもよいし、１６ｂｉｔのグレースケール画像を用いてもよい。また、カラー画像をグレースケール画像へ変換してから用いてもよい。
　第１の実施形態では、試料画像として透過光像を使用したが、試料画像は透過画像に限らず、周波数領域表現に変換できる画像であれば任意の形式のものを用いることができる。たとえば、公知の手段で取得できる相差像、微分干渉像などを試料画像とすることもできる。この場合でも処理は同様である。
　第１の実施形態または第２の実施形態では、粒子状試料は透光性を有するが、透光性を有しないものを用いてもよい。また、粒子状試料としてはたとえば粒子、細胞または細菌が用いられるが、これら以外の試料を用いてもよい。
　試料画像に対して画像補正を行ってもよい。たとえば、シェーディング補正、感度ムラ補正、ノイズ除去、スムージング、等などの画像処理を行なってもよい。また、光源ムラ、検出器感度ムラなどの補正を行なってもよい。これらの補正を行うと、より正確な定量が可能になる。
　観察装置の光学系は図１のような構成とする必要はなく、試料画像を取得する画像取得手段を設けることができる構成であればどのようなものであってもよい。また、光学系を含まず、通信ネットワークまたは可搬型記憶媒体等を介して試料画像を取得するものであってもよい。
　観察装置は、粒子状試料の定量を行わないものであってもよい。たとえば、粒子の存在領域を識別し、その位置または形状等を出力する装置であってもよい。
　本開示は、上述した実施形態および変形例に限定されるものではなく、様々な他の変形例をも包含する。各実施形態は、本開示を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施形態の構成の一部を他の実施形態の構成の一部に置き換えることが可能であり、また、ある実施形態の構成に他の実施形態の構成の一部を加えることも可能である。また、各実施形態の構成の一部について、他の実施形態の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
　１…観察装置（粒子定量装置）
　１０１…照明用光学系
　１０２…サンプル容器
　１０３…台座
　１０４…ＸＹステージ
　１０５…対物レンズ
　１０６…対物レンズアクチュエータ
　１０７…撮像カメラ（画像取得手段）
　１０８…コンピュータ（データ処理手段）
　Ｓ１…ステップ（画像取得工程）
　Ｓ２，Ｓ３，Ｓ４，Ｓ５…ステップ（データ処理工程）
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (12)

  1. 　粒子状試料を表す試料画像を取得する画像取得手段と、
    　前記試料画像に関する演算処理を行うデータ処理手段と、
    を備える、粒子定量装置であって、
    　前記データ処理手段は、
    　前記試料画像の周波数領域表現を取得し、
    　前記周波数領域表現を、高周波数成分および低周波数成分に分離し、
    　前記高周波数成分の空間領域表現として高周波数画像を取得し、
    　前記低周波数成分の空間領域表現として低周波数画像を取得し、
    　前記高周波数画像および前記低周波数画像に基づいて前記粒子状試料を認識する、
    ことを特徴とする、粒子定量装置。
  2. 　前記データ処理手段は、前記粒子状試料を認識し、定量することを特徴とする、請求項１に記載の粒子定量装置。
  3. 　前記高周波数成分の分離は、前記周波数領域表現から０次回折成分を除去することであることを特徴とする、請求項１または２に記載の粒子定量装置。
  4. 　粒子状試料を表す試料画像を取得する画像取得手段と、
    　前記試料画像に関する演算処理を行うデータ処理手段と、
    を備える、粒子定量装置であって、
    　前記データ処理手段は、
    　前記試料画像に基づいて、光学的に高開口数の光路を通過する成分の光による高開口数画像と、光学的に低開口数の光路を通過する成分の光による低開口数画像とを取得し、
    　前記高開口数画像および前記低開口数画像に基づいて前記粒子状試料を定量する、
    ことを特徴とする、粒子定量装置。
  5. 　粒子状試料を表す試料画像を取得する画像取得手段と、
    　前記試料画像に関する演算処理を行うデータ処理手段と、
    を備える、粒子定量装置であって、
    　前記データ処理手段は、
    　前記試料画像において粒子が存在する粒子領域を抽出し、
    　前記粒子領域の画素数を算定し、
    　前記試料画像の画素数に対する、前記粒子領域の画素数の割合に基づいて、前記粒子状試料を定量する、
    ことを特徴とする、粒子定量装置。
  6. 　前記データ処理手段は、
    　前記高周波数画像において粒子が存在する第１領域を抽出し、
    　前記低周波数画像において粒子が存在する第２領域を抽出し、
    　前記第１領域および前記第２領域に基づいて前記粒子状試料を定量する、
    ことを特徴とする、請求項１または２に記載の粒子定量装置。
  7. 　前記データ処理手段は、
    　前記第１領域と前記第２領域との論理和を取ることによって論理和領域を取得し、
    　前記論理和領域の面積に基づいて前記粒子状試料を定量する、
    ことを特徴とする、請求項６に記載の粒子定量装置。
  8. 　前記画像取得手段は、所定時間ごとに前記試料画像を取得し、
    　前記データ処理手段は、各前記試料画像について前記粒子状試料を定量する、
    ことを特徴とする、請求項１または２に記載の粒子定量装置。
  9. 　前記データ処理手段は、
    　前記高周波数画像の各画素の輝度に基づいて前記第１領域を抽出し、
    　前記低周波数画像の各画素の輝度に基づいて前記第２領域を抽出する、
    ことを特徴とする、請求項６に記載の粒子定量装置。
  10. 　前記データ処理手段は、
    　前記第１領域の画素数と、前記第２領域の画素数とに基づいて前記粒子状試料を定量する、
    ことを特徴とする、請求項６に記載の粒子定量装置。
  11. 　前記データ処理手段は、
    　前記第１領域の各画素の輝度の経時変化を表す情報と、前記第２領域の各画素の輝度の経時変化を表す情報とを出力するか、または、
    　前記第１領域の画素数の経時変化を表す情報と、前記第２領域の画素数の経時変化を表す情報とを出力する、
    ことを特徴とする、請求項６に記載の粒子定量装置。
  12. 　前記粒子状試料は透光性を有し、
    　前記粒子状試料は、粒子、細胞、または細菌である、
    ことを特徴とする、請求項１または２に記載の粒子定量装置。
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