JP2023543800A - アーテファクトマスキングを用いて生体サンプルを分析するための方法 - Google Patents

Abstract

分析機器によって生体サンプルを分析するための方法であって、生体サンプルが、生物剤を備え、ホログラフィック撮像システム（１０）の視野（１１）中の分析レセプタクル（２）中に配置され、方法は、生体サンプルのホログラフィック画像を収集すること（Ｓ０２）であって、ホログラフィック画像が、各ピクセルに強度値を関連付ける、ホログラフィック画像を収集すること（Ｓ０２）と、収集されたホログラフィック画像から、ピクセルの強度値に従って各ピクセルにアクティブ状態または非アクティブ状態を、非アクティブ状態が、生物剤以外の視野中に存在する要素によって引き起こされたアーテファクトに対応するピクセルに関連付けられるように、関連付ける画像マスクを決定すること（Ｓ０３）と、画像マスクによって定義されたアクティブ状態を有するホログラフィック画像のピクセルのみを使用して、視野（１１）中の生物剤の定量空間的分布を表す少なくとも１つのバイオマスパラメータの値を決定すること（Ｓ０５）と、分析結果からのバイオマスパラメータの値を供給すること（Ｓ０６）とを備える、方法。【選択図】図３

Description

本発明は、撮像によって生体サンプルを分析する分野に関し、より詳細には、生体サンプルを分析する目的での前記生体サンプル中の生物剤の定量空間的分布を表すバイオマスパラメータの決定中の、画像中に存在し得るアーテファクトのマスキングに関する。

撮像による生体サンプルの分析は、分析されるべき生体サンプルがその中に導入される光学分析機器を利用する。生体サンプルは、生物剤の懸濁液からなる。生物剤は、たとえば、微生物（細菌、酵母菌、糸状菌など）である。生体サンプル中の生物剤の分析は、前記生物剤の同定、または前記生物剤に対して有効である最小阻止濃度など、この生物剤の特性の決定を備え得る。

それの初期状態では接種材料と呼ばれる、生体サンプルは、分析機器が生体サンプルの光学的性質の測定をそれを通して行うことができる、少なくとも部分的に透明であるレセプタクルまたはウェル中に配置される。ウェルは、生体サンプル中に存在する生物剤が、試薬との相互作用によって分析されることを可能にするための、酵素基質または抗生物質など、１つまたは複数の試薬とともに、栄養培地を含んでいる。通常、複数のウェルが、各々が接種材料の一部を受け取るように、提供され、ウェルの各々は、異なる試薬を、または異なる濃度の同じ試薬を提供される。接種材料中に存在する生物剤の本質に応じて、生物剤は、ある試薬と反応し、他の試薬とは反応しないか、またはある濃度において反応し、他の濃度においては反応しない。たとえば、抗生物質感受性試験のための耐性記録のコンテキストにおいて、試薬は、異なる濃度における異なる抗生物質からなり、生物剤は、生物剤がそれらに対して感受性のない、または抗生物質濃度が不十分である抗生物質を含んでいるウェル中で増倍するが、生物剤が十分な濃度においてそれらに対して感受性のある抗生物質を含んでいるウェル中で、生物剤の発達は多かれ少なかれ妨害される。

これにより、生物剤と試薬との間の相互作用のこれらの差は、ウェル中のバイオマスの異なる変化によって指し示される。バイオマス、すなわち、各ウェル中に存在する生物学的材料の量は、生物剤自体が、生物剤が懸濁している溶液とは異なる光学的特性を有するので、各ウェル中に存在する生体サンプルの光学的特性に影響を直接的に及ぼす。

詳細には、生体サンプルの透過率が、生物剤の濃度の変化によって影響を及ぼされる。これは、一般的にマクファーランド単位（ＭｃＦ）で表されるサンプルの濁度の測定値を決定する目的での、生体サンプルで満たされたウェルの全体的な透過率（または等価である吸光度）の培養段階における経時的変化の決定に基づいて、生体サンプルを分析するための方法の開発をもたらした。この濁度測定値は、生体サンプル中の生物剤のバイオマスを直接的に表す。この目的で、発光ダイオードが、知られている強度の光ビームを用いてサンプルを照らし、発光ダイオードからするとサンプルの反対側に載置された点接触フォトダイオードが、光ビームが生体サンプルを通過した後に受け取られる光度を決定するために使用され得る。しかしながら、透過率のそのような測定は、むしろ低い感度を有し、０．０５ＭｃＦを下回る、さらには０．１ＭｃＦを下回る濁度を測定することを不可能にする。その上、バイオマスは、生物剤の濃度を決定するために常に使用され得るとは限らず、生物剤の体積が、たとえば、細菌の場合、伸長により増加した場合、バイオマスは、生物剤の数が同じままでありながら、増加する。

結果として、それは、分析レセプタクル中の生物剤の空間的分布、または行われる測定に影響を及ぼし得るアーテファクトを考慮に入れない、総括的測定である。そのようなアーテファクトは、様々な発生源を有し得る。たとえば、分析レセプタクル中の気泡の存在、または分析レセプタクルを密封するフィルムの折り目は、光波の伝搬を相当に変え、それゆえ、光学測定値を変え得る。アーテファクトは、生体サンプル中の異物、すなわち、外部の埃、細菌増殖のために使用される栄養素の結晶、食塩水中で解けなかった試薬など、分析レセプタクル中に存在する、生物剤および食塩水以外の物体によって引き起こされることもある。これらの異物は、光線の一部を吸収することがあり、それゆえ、透過率測定値を変えることもある。

米国特許第５，５６６，２４９号は、顕微鏡によって収集された画像中の泡を検出するための方法を提案する。グレースケール画像が、二項フィルタ処理され、グレースケール画像は、次いで、フィルタ処理済み画像から減じられる。輪郭検出が、気泡の輪郭を検出するために実装され、システムは、泡の存在をマッピングするために、このようにして検出された輪郭を埋める。しかしながら、このシステムは、ホログラフィック画像に好適ではなく、泡が輪郭としてその中で見える、顕微鏡によって収集された画像にのみ好適である。そのうえ、この方法は、気泡以外のアーテファクトをハイライトするために使用され得ない。

本発明の目的は、それゆえ、生体サンプルの分析において、気泡などの異物の存在によって引き起こされる、可能性があるアーテファクトによる測定値の変化なしに、生体サンプル中に存在する生物剤のバイオマスパラメータの値を決定することを可能にすることである。

この目的で、本発明は、分析機器によって生体サンプルを分析するための方法であって、生体サンプルが、生物剤を備え、ホログラフィック撮像システムの視野中の分析レセプタクル中に配置され、方法は、
－ 測定の瞬間における生体サンプルのホログラフィック画像を収集することであって、ホログラフィック画像が、前記ホログラフィック画像の各ピクセルに強度値を関連付け、強度値が、最小強度値と最大強度値との間にわたる強度の範囲内にある、ホログラフィック画像を収集することと、
－ 収集されたホログラフィック画像から、ホログラフィック画像のピクセルの強度値に従ってホログラフィック画像の各ピクセルにアクティブまたは非アクティブ状態を、非アクティブ状態が、生物剤以外の視野中に存在する要素によって引き起こされたアーテファクトに対応するホログラフィック画像のピクセルに関連付けられるように、関連付ける画像マスクを決定することであって、画像マスクは、非アクティブ状態が、強度範囲のサブセットを形成するマスキング範囲内の強度値を有するピクセルの接続されたセットの少なくともいくつかのピクセルに関連付けられるように決定され、前記マスキング範囲が、少なくとも１つのマスキングしきい値によって画定され、画像マスクの決定が、ホログラフィック画像のピクセルの強度値と少なくとも１つのマスキングしきい値との比較と、比較の結果に従う、各ピクセルとの、前記ピクセルの非アクティブ状態を指し示す第１のマスク値または前記ピクセルのアクティブ状態を指し示す第２のマスク値の関連付けとを備える、画像マスクを決定することと、
－ 画像マスクによって定義されたアクティブ状態を呈するホログラフィック画像のピクセルのみに基づいて、視野中の生物剤の定量空間的分布を表す少なくとも１つのバイオマスパラメータの値を決定することと、
－ 分析の結果のうちのバイオマスパラメータの前記値を供給することと
を備える、方法を提案する。

画像マスクのために、生物剤以外の視野中に存在する要素によって引き起こされたアーテファクトに対応するホログラフィック画像のピクセルは、ホログラフィック画像の後続の分析において考慮に入れられず、その結果として、この分析の品質は、実質的に改善され、分析は、分析レセプタクル中の気泡などの異物に対してよりロバストにされる。

本発明は、個々に、またはそれらの様々な可能な組合せで考えられる、以下に列挙される様々な特性によって有利に補完される。
－ 強度値が、最小強度値と最大強度値との間にわたる強度の範囲内にあり、下側マスキングしきい値が、強度範囲の広がりの５％と２５％との間、好ましくは強度範囲の広がりの１０％と２０％との間の値に対応する。
－ 強度値が、最小強度値と最大強度値との間にわたる強度の範囲内にあり、上側マスキングしきい値が、強度範囲の広がりの７５％と９５％との間、好ましくは強度範囲の広がりの８０％と９０％との間の値に対応する。
－ マスクのピクセルの状態が、少なくとも１つのマスキングしきい値に対する前記ピクセルの強度値によって決定される。
－ 画像マスクの決定が、マスキング範囲中の強度値を有するピクセルの接続されたセットのサイズまたは形状の基準を、ピクセルの前記セットのピクセルにアクティブまたは非アクティブ状態を割り当てる目的で考慮に入れ、および／あるいは同様のアクティブまたは非アクティブ状態を有するピクセルの接続されたセットのサイズまたは形状の基準を、ピクセルの前記セットのピクセルのアクティブまたは非アクティブ状態を変更する目的で考慮に入れる。
－ 画像マスクの決定が、数理形態学の実装を備え、詳細には、形態学的拡張が、画像マスクに適用され、形態学的浸食がそれに続く。
－ 画像マスクの決定が、生物剤以外の視野中に存在する要素によって引き起こされたアーテファクトに対応するホログラフィック画像のピクセルに非アクティブ状態を関連付けるように事前構成されたニューラルネットワークの使用を備える。
－ バイオマスパラメータの値が、ホログラフィック画像のアクティブピクセル中で見える生物剤の数から導出される。
－ バイオマスパラメータの値の決定が、ホログラフィック画像のアクティブピクセルの複数の区域の各々についての、アクティブピクセルの前記区域中の生物剤の存在または不在の決定を備える。
－ アクティブピクセルの区域中の生物剤の存在または不在が、区域のグレーレベル値をしきい値と比較することによって、または区域のパターンをデータベース中の参照パターンと比較することによって決定される。
－ 画像マスクが、ホログラフィック画像のピクセルの少なくとも２５％に、好ましくはホログラフィック画像のピクセルの少なくとも３５％にアクティブ状態を関連付ける。

本発明は、ホログラフィック画像を収集するように構成された視野をもつホログラフィックシステムと、データ処理手段とを備える分析機器であって、分析機器が、ホログラフィックシステムの視野中の分析レセプタクル中で生体サンプルを受け取るように、および本発明による分析の方法のステップを実装するように構成された、分析機器にも関する。

本発明の他の特性、目的および利点が、純粋に例示的および非限定的なものであり、添付の図面を参照しながら読まれるべきである、以下の説明から明らかになろう。

本発明の可能な実施形態による、分析のための生体サンプルを載置するために使用され得る、ウェルの形態の複数のレセプタクルを備える分析カードの例を示す図である。 本発明の可能な実施形態による、分析機器において使用され得るホログラフィック撮像システムの例を概略的に示す図である。 本発明の可能な実施形態による、分析の方法のステップを図示する図である。 分析レセプタクル中に存在する泡がその中で見えるホログラフィック画像の例の図である。 図４のホログラフィック画像に基づいて決定された画像マスクの例の図である。 図５の画像マスクに適用される、形態学的拡張と、その後に続く形態学的浸食との適用の結果を示す図である。 図４のホログラフィック画像への図６の画像マスクの適用の結果を示す図である。 生物剤がその中で探されるアクティブピクセルのセットを図示する、図７の詳細を示す図である。

生体サンプルを分析するための方法が、視野をもつホログラフィック撮像システムを備える分析機器によって実装され、分析機器は、ホログラフィック撮像システムの視野中の分析レセプタクル中で生体サンプルを受け取るように構成される。

図１は、分析のための生体サンプルを載置するために使用され得る、ウェルの形態の複数の分析レセプタクル２を備える分析カード１の例を示す。ここで、分析レセプタクル２は、平面上の２次元グリッドで編成され、各レセプタクル２は、一般的に、分析レセプタクル２中に存在する異なる試薬を使用して、異なる分析条件に関連付けられる。たとえば、抗生物質感受性試験のための耐性記録のコンテキストにおいて、試薬は、異なる濃度における異なる抗生物質からなる。分析カード１の使用は必須ではないが、そのような分析カード１は、分析の同じ期間において標準化された様式で複数の試験を行うことを可能にする。

各分析レセプタクル２は、可視またはそれ以外の光の少なくとも１つの波長に対して少なくとも部分的に透明であり、好ましくは、可視スペクトルについて少なくとも部分的に透明である。この透明性は、レセプタクル中に含まれている生体サンプルが、ホログラフィック撮像システムなどの光学手段によって分析されることを可能にする。好ましくは、分析レセプタクル２は、光の伝搬のための透明軸を提供するように、少なくとも２つの対向する透明面を有する。これらの２つの対向する透明面は、たとえば、１０ｍｍ未満離れているか、または好ましくは５ｍｍ未満離れている。一般的に、対向する透明面は、分析レセプタクル２を画定する透明フィルムである。試薬は、一般に、透明面のうちの少なくとも１つに固定される。試薬は、これにより、フィルムが分析カード１に適用される前に、透明面を形成することになるフィルム上に試薬を配置することによって、分析レセプタクル２の中に導入され得る。

分析レセプタクル２を埋めるために、そのような分析カード１は、たとえば、チューブ４中に準備されたある量３の接種材料３に浸されるコンジット５を備え得る。接種材料は、オペレータによって準備され、オペレータは、生物剤、たとえば、食塩水中の懸濁液中の、ロッドまたはスワッブを用いてペトリ皿中の培養液から取り出された生物剤を導入し、希釈が、たとえば、細菌の形態の生物剤の場合は０．５ＭｃＦと０．６３ＭｃＦとの間の、または代替的に、酵母菌の形態の生物剤の場合は１．８ＭｃＦと２．２ＭｃＦとの間の指定された濁度範囲に対応し、範囲は、行われる分析のタイプおよび測定機器に依存する。この予備懸濁液は、次いで、さらに、たとえば、グラム陰性細菌を分析する場合は２０倍ないし最高１００倍に、あるいはグラム陽性細菌を分析する場合は１０倍ないし最高１００倍に希釈される。このさらなる希釈は、とりわけ、自動化され得、それゆえ、チューブ４が分析機器中に載置された後に、測定機器によって実行され得る。明らかに、使用されるプロトコルに応じて、濁度の他の指定された範囲が使用され得る。所望の希釈は、上記の例の場合のように、１つの手順で、または２つ以上の手順で得られ得る。

その場合、コンジット５の一方の端部が、チューブ４中での準備から生じたある量の接種材料３に浸され、全体が、分析機器の中に導入される。明らかに、これらの準備ステップのうちのいずれかまたはすべては、自動化され得る。接種材料は、コンジット５を通って進み、次いで、分析カード１中に形成された流体流回路を介して、分析レセプタクル５の間で分配される。コンジット５および分析カード１中での接種材料のこの動きは、毛管作用によって、および／またはチューブ４の開放端部に存在する空気の圧力の低減によってもたらされ得る。たとえば、減圧の場合、大気圧にある、分析カード１中に存在する空気は、チューブ５を介して接種材料３を通って分析カード１の中から出て、接種材料３のための空間を空にし、接種材料３は、これにより、分析カード１の中にチューブ５を通って上昇する。逆に、接種材料３がチューブ５を上の方へ上昇することを引き起こすために、チューブ４の開放端部を介して接種材料に空気圧力を加えることが可能である。接種材料からなる生体サンプルは、次いで、分析レセプタクル２中に載置される。

分析機器は、視野をもつホログラフィック撮像システムを備え、この視野のホログラフィック画像を収集するように構成される。ホログラフィック画像の収集は、大きい被写界深度を提供し、結果として、生物剤を検出するための極めて高い感度を提供する。ホログラフィック画像の収集のために、ホログラフィック撮像システムは、分析レセプタクル２に面して位置決めされる。非限定的な例として、図２は、インラインホログラフィック撮像システム１０を概略的に示し、インラインホログラフィック撮像システム１０は、前記ホログラフィック撮像システム１０の視野１１が、分析レセプタクル２中に含まれている生体サンプルの体積内に含まれているように配置される。分析カード１、およびそれゆえ、分析カード１が備える分析レセプタクル２は、ホログラフィック撮像システム１０の対物平面中に載置される。ホログラフィック撮像システム１０は、撮像軸１６を定義し、撮像軸１６は、ここでは、光軸に対応する直線として簡略化されるが、撮像軸１６は、ホログラフィック撮像システム１０の光学構成要素の構成に応じて、光路を定義する連続する直線のセットからなり得る。

分析レセプタクル２の一方の側に、この場合は光軸１６上に、十分にコヒーレントな光の照明ビームによってホログラフィック撮像システム１０の視野中の分析レセプタクル２を照らすように構成された光源１４がある。光源１４は、照明光をもたらし得るか、または単に、場合によってはダイヤフラムまたはアイリスが設けられた、この照明光を誘導する光ファイバーの終端であり得る。照明ビームは、任意の特定の追加の制約なしに、ホログラフィック撮像のための従来の特性を有する。照明ビームは、これにより、（たとえば、約６４０ｎｍ～６７０ｎｍの波長をもつ）単色であり得るか、または場合によっては、たとえば順々に使用される複数の波長から構成され得る。

分析レセプタクル２の反対側に、この場合は光軸１６上に、ＣＭＯＳまたはＣＣＤセンサーなどのデジタルセンサーである、画像センサー１２がある。画像センサー１２は、ホログラフィック撮像システム１０の画像平面上に載置され、ホログラム、すなわち、視野１１中に載置された接種材料と照明ビームとの間の相互作用によって引き起こされた干渉の強度の空間的分布を収集するように構成される。

ホログラフィック撮像システム１０は、ここでは、分析レセプタクル２とデジタル画像センサー１２との間に配置された光学部材１８のセット、たとえば、図示されている例では顕微鏡対物レンズ１８ａとチューブレンズ１８ｂとが設けられる。しかしながら、顕微鏡対物レンズ１８などの光学部材は、本発明がレンズベースのホログラフィック顕微鏡法に限定されないので、随意である。明らかに、ここで説明される配置は、非限定的な例である。（顕微鏡対物レンズをもつまたはもたないなど）異なる光学部材をもつ任意のホログラフィック撮像システム１０が使用され得る。これにより、ホログラフィック撮像システム１０が、生体サンプルによって生成された干渉パターンがその中で見える画像を収集することがあるとすれば、このホログラフィック撮像システムは、方法の実装に好適である。しかしながら、好ましくは、ホログラフィック撮像システム１０は、収集２０の各焦点平面の周りの光軸１６の方向に少なくとも１００μｍ被写界深度、好ましくは少なくとも１５０μｍの深度、なお一層好ましくは少なくとも２５０μｍの深度を定義するように構成される。一般的に、分析レセプタクル２は、光軸１６に沿って配置された２つの対向する透明面を備え、被写界深度は、分析レセプタクルの２つの対向する透明面の間で少なくとも１００μｍだけ、好ましくは少なくとも１５０μｍだけ、なお一層好ましくは少なくとも２５０μｍだけ延びる。視野１１は、生物剤の存在が、前記視野１１を画像化するホログラムに基づいてその中で決定され得る、空間の形態で延びる。

測定機器は、プロセッサ、メモリ、通信バスなど、データを処理するための構成要素をも備える。これらの他の構成要素は、それらの構成要素が実装する方法およびそれらの構成要素が含んでいる命令に関するものを除いて固有ではないので、それらの構成要素は、さらに詳述されない。

図３は、上記で詳述された、ホログラフィック撮像システム１０の視野１１中の分析レセプタクル２中への生体サンプルの予備載置（ステップＳ１）に後続する、分析の方法のステップを図示する図である。

各測定サイクルは、測定の瞬間における生体サンプルのホログラフィック画像の収集（ステップＳ０２）を備える。

ホログラフィック画像の収集のために、ホログラフィック撮像システムは、大きい被写界深度、および結果として、生体サンプル中の生物剤を検出するための極めて高い感度を提供するという利点を有するホログラムを収集する。ホログラムの収集のために、光源１４は、撮像軸１６に沿った方向Ｚに伝搬する平坦な参照波によって指し示され得る参照照明ビームを発する。分析レセプタクル２中の視野１１中に存在する生物剤は、生物剤の回折性質のために入射参照光を拡散させる。生物剤による拡散波および参照波は、画像センサー１２上で干渉し、ホログラムを形成する。画像センサー１２は、電磁界強度にのみ反応するので、ホログラムは、各ピクセルのグレーレベル値によって指し示される、拡散波と参照波との加算に対応する合計界の強度の空間的分布に対応する。使用されるホログラフィック画像は、ホログラムであり得るか、またはたとえば、レイリーゾンマーフェルト回折理論に基づいて、伝搬アルゴリズムを使用して、ホログラムに基づくバックプロパゲーション計算によって再構成された画像であり得る。ホログラムと同じやり方で、そのような再構成された画像は、各ピクセルのグレーレベルによって定義される。再構成なしのホログラムを使用することによって、各生物剤は、前記生物剤の存在によって引き起こされた干渉パターンに対応する輪によって囲まれたホログラム中で見え、それにより、これらの生物剤の存在の検出を容易にするので、高い検出感度から恩恵を受けることが可能である。その上、再構成の省略は、時間および計算リソースに関して節約を生ずる。しかしながら、再構成された画像の使用は、再構成された画像中で見える生物剤を、場合によっては３次元において、正確に位置特定する能力など、他の利点を有する。

すべての場合において、ホログラフィック画像は、前記ホログラフィック画像の各ピクセルに強度値を関連付ける。これらの強度値は、最小強度値と最大強度値との間にわたる強度の範囲内にある。強度値は、一般的に、グレーレベル値である。グレーレベルが、８ビットで符号化される場合、強度値は、黒色に対応する最小強度値０と、白色に対応する最大強度値２５５との間の範囲内の整数であり得る。明らかに、強度値の他の符号化が使用され得る。

図４は、このようにして収集されたホログラフィック画像、この場合、ホログラムから再構築された画像の例を示す。これは、約２００μｍの被写界深度をもつおよそ１．５ｍｍ^２にわたる視野１１をカバーする２４００×２５００ピクセルの画像である。グレーレベルは、８ビットで符号化され（２５６個のグレーレベル）、０が黒色であり、２５５が白色である。ここでの生体サンプルは、生物剤としての緑膿菌の食塩水からなる。アーテファクトは生体サンプルのこの画像上で見え、視野１１のかなりの部分をカバーする。最初に、画像上の黒色で見える気泡２０が識別される。泡の内部の空気の屈折率と食塩水の屈折率との間の差のために、および泡の壁を形成する空気と水との間の境界面の丸い形状のために、入射光線の一部は反射され、他の光線は拡散され、それにより、光軸１６に平行な、泡の中央の入射光線のみが、泡を通過し、画像センサー１２に到着することができる。結果として、任意の光度の不在下で、気泡２０は、本質的に、黒色であるが数個の発光トレースをもつ形状として見える。また、分析レセプタクル２を密封して２つの対向する透明面を形成する透明フィルムの非平坦度によって引き起こされた暗色トレース２１が、画像中で識別可能である。たとえば、折り目などのレリーフ要素があり得る。気泡２０またはこれらの暗色トレース２１などのアーテファクトは、そのアーテファクトが、撮像されるべき生物剤ではないにもかかわらず、ホログラフィック画像中で見える。これらのアーテファクトは、それゆえ、ホログラフィック画像によって生体サンプルの正しい分析を実施するために、排除されなければならない。

この目的で、ホログラフィック画像が収集された後、ホログラフィック画像に基づいて画像マスクが決定される（ステップＳ０３）。画像マスクは、ホログラフィック画像の各ピクセルにアクティブまたは非アクティブ状態を関連付ける。画像マスクは、それゆえ、ホログラフィック画像と同数のピクセルを備える。ホログラフィック画像のピクセルのアクティブまたは非アクティブ状態は、ホログラフィック画像のピクセルの強度値に基づいて決定される。画像マスクは、非アクティブ状態が、生物剤以外の視野中に存在する要素によって引き起こされたアーテファクトに対応するホログラフィック画像のピクセルに関連付けられるように決定される。

ホログラフィック画像中のアーテファクトは、しばしば、強度範囲のサブセットを形成するマスキング範囲内の強度値を有するピクセルの接続されたセットの形態をとるので、非アクティブ状態は、少なくとも、このマスキング範囲内の強度値を有する隣接ピクセルのセットのピクセルに関連付けられる。このマスキング範囲は、少なくとも１つのマスキングしきい値によって、好ましくはマスキングしきい値、すなわち、下側マスキングしきい値と、下側マスキングしきい値よりも高い上側マスキングしきい値とによって画定される。

たとえば、下側マスキングしきい値は、強度範囲の広がりの５％と２５％との間、好ましくは、強度範囲の広がりの１０％と２０％との間の値に対応する。強度範囲は、最小強度値と最大強度値との間にわたる。８ビットで（したがって、０から２５５までの範囲で）符号化されるグレーレベルの例に戻ると、下側マスキングしきい値は、たとえば、１３と６４との間、好ましくは２５と５０との間である。たとえば、下側マスキングしきい値は、強度範囲の広がりの７５％と９５％との間、好ましくは強度範囲の広がりの８０％と９０％との間の値に対応する。８ビットで（したがって、０から２５５までの範囲で）符号化されるグレーレベルの例に戻ると、上側マスキングしきい値は、たとえば、１９１と２４３との間、好ましくは２０４と２３０との間である。好ましくは、下側マスキングしきい値および上側マスキングしきい値は、強度範囲の広がりの少なくとも６０％だけ、好ましくは少なくとも７０％だけ、好ましくは強度範囲の広がりの少なくとも８０％だけ分離される。

画像マスクの決定は、たとえば、しきい値処理または数理形態学の適用などの一連の非線形演算を備え得る。これにより、マスクのピクセルの状態は、少なくとも１つのマスキングしきい値に対する前記ピクセルの強度値によって決定され得る。たとえば、画像マスクの生成において、ホログラフィック画像の各ピクセルの各強度値と、少なくとも１つのマスキングしきい値との間の比較の結果に応じて、ピクセルの非アクティブ状態を指し示す第１のマスク値が、前記ピクセルに関連付けられるか、または前記ピクセルのアクティブ状態を指し示す第２のマスク値が、前記ピクセルに関連付けられるのいずれかである。画像マスクは、一般的に強度範囲の少なくとも一方の端部に近いマスキング範囲中の強度値を有するピクセルに非アクティブ状態を関連付け、強度範囲の一方の端部への近接度は、マスキングしきい値によって定義される。これにより、ピクセルの強度値が、下側マスキングしきい値を下回る場合、非アクティブ状態が、前記ピクセルに関連付けられる。同様に、ピクセルの強度値が、上側マスキングしきい値を上回る場合、非アクティブ状態が、前記ピクセルに関連付けられる。逆に、それの強度値が、マスキング範囲の外側にある、すなわち、下側マスキングしきい値と上側マスキングしきい値との間にある、または下側マスキングしきい値が、使用される唯一のマスキングしきい値である場合、単に下側マスキングしきい値を上回る、または上側マスキングしきい値が、マスキング範囲を定義するために使用される唯一のマスキングしきい値である場合、単に上側マスキングしきい値を下回るピクセルに、アクティブ状態が関連付けられる。

各ピクセルにアクティブ状態または非アクティブ状態のいずれかを関連付ける画像マスクは、それゆえ、２値画像を定義するものとして解釈され得る。図５は、非アクティブ状態にあるピクセルが、黒色で表されており、非アクティブ状態にあるピクセルが、白色で表されている、図４のホログラフィック画像に基づいて決定された画像マスクのグラフィック表現の例を示す。この例では、画像マスクは、４０にある、すなわち、グレーレベル値の広がり０～２５５の約１５．７％にあるただ１つの下側マスキングしきい値を使用することによって生成された。４０に等しいかまたはそれ以下のグレーレベル値を有するピクセルは、画像マスクの画像中の黒色の非アクティブ状態に関連付けられており、４０超のグレーレベル値を有するピクセルは、画像マスクの画像中の白色のアクティブ状態に関連付けられている。

気泡の丸い形状２２が、図４のホログラフィック画像の暗色トレース２１に対応する黒色トレース２３とともに、画像マスク上で黒色で見つけられ得る。しかしながら、光線の光学経路中の不規則性によって引き起こされるか、たとえば折り目によって引き起こされるか、または気泡を通過することが可能であった光線に対応していることがある、気泡の丸い形状２２の内部の白色トレース２４も見られる。加えて、黒色トレース２３は、暗色トレース２１の影響を受けたいくつかのピクセルが、画像マスクにおいて考慮に入れられないという事実により、不連続性を呈し得、これは、マスキングしきい値の使用の不可避な結果である。

画像マスクの決定は、特に以下で説明される少なくとも１つのマスキングしきい値との比較の後に、数理形態学の実装を備え得る。数理形態学演算の目的は、とりわけ、ピクセルの接続されたセットの形状を正規化するために、ピクセルの接続されたセットの形状をローカルに変更することであり得る。たとえば、画像マスク中のアーテファクトの連続性を改善するために、好ましくは、画像マスクに形態学的拡張が適用され、その後に形態学的浸食、すなわち、形態学的閉鎖の適用が続く。これらの形態学的演算において使用される構造化要素のサイズは、望まれる形態学的閉鎖のレベルに依存し、画像マスクの特性にも依存する。たとえば、高い値をもつ下側マスキングしきい値は、低い値をもつ下側マスキングしきい値よりも少ない程度の形態学的閉鎖演算を必要とする。

図６は、あるサイズのウィンドウによって表された構造化要素を用いた、形態学的拡張と、その後に続く形態学的浸食との適用から生じた画像マスクを示す。白色トレース２４は、気泡の丸い形状２２の内部で見られ得ない。これは、形態学的閉鎖が、黒色形状中に隔離された小さい白色トレースが黒色で埋められることを引き起こすからである。加えて、黒色トレース２３は、いくぶんより規則的である。

画像マスクの決定は、マスキング範囲中の強度値を有するピクセルの接続されたセットのサイズまたは形状の基準を、ピクセルの前記セットのピクセルにアクティブまたは非アクティブ状態を割り当てる目的で考慮に入れ、および／あるいは同様のアクティブまたは非アクティブ状態を有するピクセルの接続されたセットのサイズまたは形状の基準を、ピクセルの前記セットのピクセルのアクティブまたは非アクティブ状態を変更する目的で考慮に入れ得る。たとえば、マスキングしきい値との比較および／または数理形態学の適用に加えて、非アクティブ状態とのピクセルの関連付けのために、ピクセルが、ある表面区域を表す、マスキング範囲中の強度値を有するピクセルの接続されたセットの一部を形成すべきであることを指定することが可能である。たとえば、気泡２０のアーテファクトなどのアーテファクトは、規則的な丸い形状でもあり得る、延ばされたおよび接続された形状によって表される。非アクティブ状態に変更されるべきピクセルの接続されたセットのための最小サイズまたは形状の規則性の基準を指定することによって、非アクティブ状態は、たとえば、気泡２０のピクセルに選択的に制限され得る。

画像マスクを決定する目的で、生物剤以外の視野中に存在する要素によって引き起こされたアーテファクトに対応するホログラフィック画像のピクセルに非アクティブ状態を関連付けるように事前構成されたニューラルネットワークを使用することも可能である。より正確には、ニューラルネットワークは、ホログラフィック画像と、対応する画像マスクとのペアから形成された学習データベース上で事前トレーニングされ、画像マスクは、たとえば、非アクティブ状態が、生物剤以外の視野中に存在する要素によって引き起こされたアーテファクトに対応するホログラフィック画像のピクセルに関連付けられるように、上記で解説されたように、または別のやり方で決定される。次いで、使用中に、ニューラルネットワークは、それの入力において、画像マスクがそれについて決定されるべきであるホログラフィック画像を受け取り、それの出力において、生物剤以外の視野中に存在する要素によって引き起こされたアーテファクトに対応するホログラフィック画像のピクセルに非アクティブ状態を関連付ける、対応する画像マスクを供給する。上記で述べられたように、ホログラフィック画像中のアーテファクトは、しばしば、マスキング範囲内の強度値を有するピクセルの接続されたセットの形態をとる。それゆえ、非アクティブ状態は、少なくとも、マスキング範囲内の強度値を有するピクセルの接続されたセットのピクセルにも関連付けられる。

画像マスクが得られると、画像マスクは、ホログラフィック画像に適用される（ステップＳ０４）。マスクは、画像マスクのピクセルのアクティブおよび非アクティブ状態が、ホログラフィック画像に対して実行される後続の処理を制限するために使用されるように適用され、次いで、画像マスク中のアクティブ状態に対応するホログラフィック画像のピクセルのみが使用され、ピクセルの状態に対するアクティブおよび非アクティブの指定を生じる。たとえば、画像マスク中の非アクティブ状態に対応するホログラフィック画像のピクセルは、ホログラフィック画像から取り除かれ得、その場合、これらの取り除かれたピクセルの座標は、アトリビュートされない。そのような適用の結果が、画像マスク中の非アクティブ状態に対応するホログラフィック画像のピクセルが考慮に入れられないことであるとすれば、画像マスクを適用する他のやり方が想定され得る。

次いで、方法は、画像マスクによって定義されたアクティブ状態を呈するホログラフィック画像のピクセルのみに基づく、視野１１中の生物剤の定量空間的分布を表す少なくとも１つのバイオマスパラメータの値の決定（ステップＳ０５）を備える。非アクティブ状態にあるピクセルは、バイオマスパラメータの値の決定のために考慮に入れられない。アクティブ状態にある十分なピクセルが、それゆえ、方法が実装されることを可能にするために保持されなければならない。結果として、画像マスクは、好ましくは、ホログラフィック画像のピクセルの少なくとも２５％に、好ましくはホログラフィック画像のピクセルの少なくとも３５％にアクティブ状態を関連付ける。アクティブ状態にあるピクセルの数に、または非アクティブ状態にあるピクセルの最大数に対応するアクティビティしきい値が設定され得る。たとえば、画像マスクが有するアクティブ状態にあるピクセルが少な過ぎるので、画像マスクが、このアクティビティしきい値を満たさない場合、数個の可能な解決策がある。

しきい値が満たされないという事実は、ホログラフィック画像が、本質的に、アーテファクトから構成され、それゆえ、生体サンプルの高信頼の分析を可能にしないことを意味し得る。この場合、不適合警告が、オペレータに送信され得る。生体サンプルについての不適合警告は、いくつかの形態を取り得る。たとえば、分析機器は、電気音響変換器を備え得、不適合警告の送信は、不適合についてオペレータに警告するためのオペレータへの音の送信を備える。同様に、不適合警告の送信は、オペレータへの光信号の送信を備え得る。分析機器は、一般的に、ディスプレイスクリーンが設けられた人間機械インターフェースを備え、不適合警告の送信は、生体サンプルの不適合についてオペレータに警告するメッセージの、スクリーン上での表示を備え得る。そのような警告は、特にその警告が測定期間の開始時の測定の瞬間の間に行われるとき、分析レセプタクル２の正しくない充填など、生体サンプルの正しい分析を妨げる問題を警告することを可能にし得、測定期間が、培養の数時間にわたり得ると仮定すれば、オペレータが、測定期間の終わりを待つことなしに問題を検出し、生体サンプルを交換することを可能にし得る。不適合警告はまた、好ましくは分析結果のうちの測定の瞬間の指示を伴う、不適合の検出のシンプルな記述の形態をとり得る。これは、気泡が、一般に、測定期間または培養期間中に成長し、以前の測定値が使用されることを可能にしながら、後続の測定値を考慮に入れることを回避するために、泡の成長が高信頼の測定値を得ることを不可能にした瞬間を知ることは、有利であり得るからである。他のタイプの警告が、提供され得る。アクティビティしきい値が、画像マスクによって満たされない場合、これはまた、使用されるマスキングしきい値が好適でないことを指し示し得る。それゆえ、変更されたマスキングしきい値をもつ画像マスクの生成が、考えられ得る。

バイオマスパラメータは、視野１１中の生物剤の定量空間的分布が考慮に入れられることを可能にする、任意のタイプのものであり得る。とりわけ、バイオマスパラメータの値は、ホログラフィック画像のアクティブピクセル中で見える生物剤の数から導出され得る。図７は、図４のホログラフィック画像への図６の画像マスクの適用の結果の例を示す。白色トレース２４がない、気泡に対応する丸い黒色形状２５、および黒色トレース２６が、ここでは見られ得る。これらのピクセルは、非アクティブであると考えられ、考慮に入れられない。アクティブピクセルの領域２６の略図が描かれており、この領域の拡大図が、図８中に示されている。この図は、アクティブピクセルのこの領域２６中の生物剤３０の存在を示す。生物剤は、小さい円の形態で、明確におよび明瞭に見える。それゆえ、これらの生物剤の存在を検出すること、さらにはその生物剤を定量化することが可能である。バイオマスパラメータは、たとえば、視野中の生物剤の数、またはたとえば、生物剤によって占有されたホログラフィック画像の広がりの割合である。たとえば、ホログラフィック画像中の生物剤の数が計数され得る。ホログラフィック画像が、ホログラムである場合、干渉パターンは、一般的に、生物剤の周りの輪の形態で見える。輪は、形状認識アルゴリズムを用いて特に同定しやすい形状であり、ホログラフィック画像は、それゆえ、同数の生物剤に対応する、そこで見えるすべての輪をリストするように分析され得る。

低信頼の結果を伴う、時間がかかり、リソースを必要とするプロシージャであり得る、生物剤の数を計数することの代わりに、バイオマスパラメータの値を決定することは、ホログラフィック画像のアクティブピクセルの複数の区域（一般的に、数千個の区域）の各々について、アクティブピクセルの前記区域中の生物剤の存在または不在を決定することを備え得る。バイオマスパラメータは、その場合、生物剤がその中で存在するアクティブピクセルの区域の数または割合に対応し得るか、またはより容易に、より実証しやすい、生物剤が不在である区域の数に対応し得る。区域のサイズは、生物剤が隔離されることを可能にするのに十分に小さいが、必ずしもこれらの因子の表現を削減することがないように選ばれる。たとえば、区域は、探される生物剤の一般的なサイズよりも５倍から２０倍大きいものであり得る。一例では、アクティブピクセルの各区域は、２０×２０ピクセルにわたる。しかしながら、他のサイズが、たとえば、それの存在が検出されるべきである生物剤のサイズに従って、あるいは代替的に所望の正確度または利用可能なデータ処理手段およびデータ処理の速度に従って選ばれ得る。

ホログラフィック画像の区域中の生物剤の存在または不在は、たとえば、区域中の平均グレーレベル（または光度レベル）をグレーレベルしきい値と比較することによって決定され得る。区域のパターンを、生物剤の複数の外観に対応する参照パターンのデータベースと比較し、区域パターンに対して最も大きい類似度を有する参照パターンを同定することも可能である。この参照パターンに関連付けられた特性は、区域パターンの特性であると考えられ、これにより、区域中の生物剤の存在を検出することを可能にするだけでなく、データベースに記録された外観の特性に従って、生物剤の個々の増殖など、追加の特性を推定することをも可能にする。

ホログラフィック画像の収集およびバイオマスパラメータの値の決定は、画像マスクの決定とともに、測定サイクルを構成する。方法は、それゆえ、分析結果を得る目的で、測定期間の測定の複数の瞬間の間に反復様式で実装されるステップ（Ｓ０２、Ｓ０３、Ｓ０４、Ｓ０５）からなる複数の測定サイクルを備える。これらの測定サイクルは、一般的に、分析機器の速度、並列に処理される生体サンプルの数、およびたとえば、分析カード１中の分析レセプタクル２の数に応じて、ならびに場合によっては、生物剤と試薬との間の相互作用の速度に応じて、１分から３０分に及ぶ期間にわたって繰り返される。測定期間は、数時間、一般的に１０時間超にわたり、それにより、数１０個の、さらには数１００個の測定の瞬間がある。方法は、それゆえ一般的に、この測定期間中に測定の１０個超のサイクル、好ましくは２０個超のサイクルを備える。各測定サイクルは、それゆえ、視野中の生物剤の定量空間的分布を表すバイオマスパラメータの値を得るために使用され得る。

分析の方法は、分析結果のうちのバイオマスパラメータの少なくとも１つの値を供給する最終ステップを備える。一般的に、分析結果は、経時的な視野１１中の生物剤の定量空間的分布の変化の監視を可能にするために、バイオマスパラメータの値の時系列による編成を備える。好ましくは、バイオマスパラメータの値の供給は、曲線、画像または表など、グラフィック表現の形態をとり、バイオマスパラメータの値が、オペレータに通信され、オペレータによって解釈されることを可能にする。グラフィック表現は、たとえば、グラフィック表現の表示を可能にするフォーマットにされ、ディスプレイスクリーン上に表示され得るか、またはグラフィック表現が印刷され得るようにプリンタに送信され得る。

本発明は、説明され、添付図中に表された実施形態に限定されない。変更が、それにより本発明の保護の範囲から逸脱することなく、とりわけ様々な特徴的な技法の組み合わせに関して、または技術的等価物の置き換えによって行われ得る。

Claims (11)

1. 分析機器によって生体サンプルを分析するための方法であって、前記生体サンプルが、生物剤を備え、ホログラフィック撮像システム（１０）の視野（１１）中の分析レセプタクル（２）中に配置され、前記方法は、
   － 測定の瞬間における前記生体サンプルのホログラフィック画像を収集すること（Ｓ０２）であって、前記ホログラフィック画像が、前記ホログラフィック画像の各ピクセルに強度値を関連付け、前記強度値が、最小強度値と最大強度値との間にわたる強度の範囲内にある、ホログラフィック画像を収集すること（Ｓ０２）と、
   － 収集された前記ホログラフィック画像から、前記ホログラフィック画像の前記ピクセルの前記強度値に従って前記ホログラフィック画像の各ピクセルにアクティブまたは非アクティブ状態を、非アクティブ状態が、生物剤以外の前記視野中に存在する要素によって引き起こされたアーテファクトに対応する前記ホログラフィック画像のピクセルに関連付けられるように、関連付ける画像マスクを決定すること（Ｓ０３）であって、前記画像マスクは、前記非アクティブ状態が、前記強度範囲のサブセットを形成するマスキング範囲内の強度値を有するピクセルの接続されたセットの少なくともいくつかのピクセルに関連付けられるように決定され、前記マスキング範囲が、少なくとも１つのマスキングしきい値によって画定され、前記画像マスクの前記決定が、前記ホログラフィック画像の前記ピクセルの強度値と前記少なくとも１つのマスキングしきい値との比較と、前記比較の結果に従う、各ピクセルとの、前記ピクセルの前記非アクティブ状態を指し示す第１のマスク値または前記ピクセルの前記アクティブ状態を指し示す第２のマスク値の関連付けとを備える、画像マスクを決定すること（Ｓ０３）と、
   － 前記画像マスクによって定義されたアクティブ状態を呈する前記ホログラフィック画像のピクセルのみに基づいて、前記視野（１１）中の生物剤の定量空間的分布を表す少なくとも１つのバイオマスパラメータの値を決定すること（Ｓ０５）と、
   － 分析結果のうちの前記バイオマスパラメータの前記値を供給すること（Ｓ０６）と
   を備える、方法。
2. 前記マスキング範囲が、少なくとも、前記強度範囲の広がりの５％と２５％との間、好ましくは前記強度範囲の前記広がりの１０％と２０％との間の値に対応する下側マスキングしきい値によって画定される、請求項１に記載の分析の方法。
3. 前記マスキング範囲が、少なくとも、前記強度範囲の前記広がりの７５％と９５％との間、好ましくは前記強度範囲の前記広がりの８０％と９０％との間の値に対応する上側マスキングしきい値によって画定される、請求項１または２に記載の分析の方法。
4. 前記画像マスクの前記決定が、前記マスキング範囲中の強度値を有するピクセルの接続されたセットのサイズまたは形状の基準を、ピクセルの前記セットの前記ピクセルにアクティブまたは非アクティブ状態を割り当てる目的で考慮に入れ、および／あるいは同様のアクティブまたは非アクティブ状態を有するピクセルの接続されたセットのサイズまたは形状の基準を、ピクセルの前記セットの前記ピクセルのアクティブまたは非アクティブ状態を変更する目的で考慮に入れる、請求項１から３のいずれか一項に記載の分析の方法。
5. 前記画像マスクの前記決定が、数理形態学の実装を備える、請求項１から４のいずれか一項に記載の分析の方法。
6. 前記画像マスクの前記決定が、生物剤以外の前記視野（１１）中に存在する要素によって引き起こされたアーテファクトに対応する前記ホログラフィック画像のピクセルに非アクティブ状態を関連付けるように事前構成されたニューラルネットワークの使用を備える、請求項１から５のいずれか一項に記載の分析の方法。
7. 前記バイオマスパラメータの前記値が、前記ホログラフィック画像のアクティブピクセル中で見える生物剤の数から導出される、請求項１から６のいずれか一項に記載の分析の方法。
8. 前記バイオマスパラメータの前記値の前記決定が、前記ホログラフィック画像のアクティブピクセルの複数の区域の各々についての、アクティブピクセルの前記区域中の生物剤の存在または不在の決定を備える、請求項１から７のいずれか一項に記載の分析の方法。
9. アクティブピクセルの区域中の生物剤の前記存在または不在が、前記区域のグレーレベル値をしきい値と比較することによって、または前記区域のパターンをデータベース中の参照パターンと比較することによって決定される、請求項８に記載の分析の方法。
10. 前記画像マスクが、前記ホログラフィック画像の前記ピクセルの少なくとも２５％に、好ましくは前記ホログラフィック画像の前記ピクセルの少なくとも３５％にアクティブ状態を関連付ける、請求項１から９のいずれか一項に記載の分析の方法。
11. ホログラフィック画像を収集するように構成された視野（１１）をもつホログラフィックシステム（１０）と、データ処理手段とを備える分析機器であって、前記分析機器が、前記ホログラフィックシステム（１０）の前記視野（１１）中の分析レセプタクル（２）中で生体サンプルを受け取るように、および請求項１から１０のいずれか一項に記載の分析の方法のステップを実装するように構成された、分析機器。

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