WO2021015471A1 - 생체 이식용 스캐폴드 - Google Patents

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WO2021015471A1
WO2021015471A1 PCT/KR2020/009126 KR2020009126W WO2021015471A1 WO 2021015471 A1 WO2021015471 A1 WO 2021015471A1 KR 2020009126 W KR2020009126 W KR 2020009126W WO 2021015471 A1 WO2021015471 A1 WO 2021015471A1
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WO
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scaffold
bioglass
biotransplantation
strut
degrees
Prior art date
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PCT/KR2020/009126
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임준영
김용복
유현승
Original Assignee
㈜시지바이오
주식회사 바이오알파
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Publication date
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Priority claimed from KR1020190151855A external-priority patent/KR102148615B1/ko
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    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
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    • B33Y10/00—Processes of additive manufacturing

Definitions

  • the present invention relates to a scaffold for transplantation in a living body.
  • a 3D printer refers to a facility that produces a real three-dimensional shape as it is by melting materials such as polymers and metals or laminating powders based on 3D drawings.
  • 3D printers have the advantage of being able to easily mold and manufacture products with complex structures according to the designed design, the scope of use is gradually expanding to prototypes, and the market is expected to expand further.
  • 3D printing technology in the medical/bio field is 3D bioprinting that produces artificial organs such as liver, kidneys, and heart using bio-ink as a raw material, tissue engineering for the regeneration of artificial tissues or organs, It is applied to personalized medicine.
  • 3D printing technology is basically divided into 7 methods based on the 3D digital model: photopolymerization (PP), material extrusion (ME), adhesive spraying (Binder Jetting, BJ), and material spraying.
  • Method Motion Jetting, MJ
  • Direct Energy Deposition DED
  • Powder Bed Fusion PPF
  • Sheet Lamination SL
  • fused direct deposition (hereinafter referred to as'FDM'), which is one of the material spraying methods, is widely used.
  • the FDM method refers to a method of 3D printing by melting a resin in the form of a filament like a fine thread in a nozzle using an injectable resin, and laminating it further through printing. At this time, the nozzle melts the plastic filament with high heat, and the discharged filament is cured at room temperature to form a strut.
  • the FDM type 3D printer is a technology that can be applied to various materials, has excellent accuracy and repeatability, and has a product that is robust, durable, and dimensional stability is superior above all.
  • Korean Patent Registration No. 10-1912839 discloses a composition for FDM 3D printer in the form of a paste containing ceramic powder and a binder containing CaO and SiO 2 as a main component, and enables rapid molding without melting, and provides various geometric structures. As it can be accurately implemented, it is disclosed that it can be used as a medical biomaterial.
  • the ceramic powder has problems such as cracking or cracking easily even under external pressure or impact due to its inherent brittleness.
  • natural polymers as a binder used together have excellent biocompatibility and do not cause cytotoxicity, but by themselves, mechanical strength is weak and processing is difficult.
  • a new composition capable of improving the disadvantages of brittleness was developed, and when the composition is applied to the FDM 3D printing method to produce a scaffold for biotransplantation, the toughness and stiffness are improved at the same time, and the surface properties are improved. It was able to achieve both the mechanical properties and biological well activity required for
  • an object of the present invention is to provide a scaffold for transplantation in a living body.
  • the present invention provides a scaffold for biotransplantation having a structure in which a plurality of struts that are essentially disposed on top of each other and cross each other up and down to create pores are stacked in multiple layers.
  • the strut includes a bioglass and a biocompatible polymer, and has a stacked structure of two or more layers.
  • the struts are connected or disconnected from each other in the same layer, and are formed in parallel in a regular pattern including a linear, wavy, lattice, zigzag, spiral, or irregular pattern.
  • the strut has a diameter of 300 ⁇ m to 500 ⁇ m.
  • the strut has an average strain angle between the layers in the range of 30 degrees to 60 degrees.
  • the scaffold for biotransplantation has a bimodal pore size distribution, a porosity of 30% to 60%, and satisfies the following physical properties:
  • the bioglass constituting the strut is a sintered bioglass.
  • the scaffold for biotransplantation is manufactured by mixing sintered bioglass and a biocompatible polymer and then injection molding.
  • injection molding is performed using a 3D printer using a thermal melting lamination method.
  • the scaffold for biotransplantation according to the present invention optimizes the toughness and stiffness of the scaffold by optimizing the content ratio of sintered bioglass and biocompatible polymer, thereby solving problems such as cracking due to the inherent brittleness of conventional bioglass. I can.
  • the scaffold for biotransplantation is preferably a scaffold required in the medical/bio field, as the surface properties and hydrophilic properties are improved, so that protein absorption is excellent during biotransplantation, and has the effect of activating cell proliferation and bone formation. Applicable.
  • FIG. 1 is an image showing an example of stacking struts according to the present invention.
  • FIG. 3 is a view showing the scaffolds and struts manufactured in Examples 1 to 3 and Comparative Examples 1 to 2.
  • thermogravimetric analysis and X-ray diffraction analysis are graphs of thermogravimetric analysis and X-ray diffraction analysis of the compositions used in the scaffold fabrication of Examples 1 to 3 and Comparative Examples 1 to 2.
  • Layer by layer (LbL) lamination technique is a technology to obtain a 3D shape product by laminating one by one.
  • a scaffold for a living body is manufactured by applying the LbL lamination technique.
  • the scaffold for biotransplantation of the present invention has a structure in which a plurality of struts that are essentially disposed on top of each other and cross each other up and down to create pores are stacked in a multilayer (layer-by-layer) structure.
  • the external shape and dimensions of the biotransplantation scaffold can be selected according to the respective application purpose, which may be suitable for the purpose required in the application field.
  • the living body implantable scaffold may include, for example, an elongated shape, for example, a cylindrical shape, a polygonal column, such as a triangular column or an ingot (ingot) shape; Or plate, or polygonal, for example square, cubic, square, pyramidal, pentagonal, dodecagonal, octagonal, rhombohedral, prismatic or spherical, for example ball, hollow, spherical lens or cylindrical lens shape, And it may have an external shape selected from a disk shape or a ring shape. This shape can be achieved through lamination of struts.
  • FIG. 1 is an image showing an example of stacking struts according to the present invention.
  • it is referred to as a cuboid-shaped living body scaffold.
  • Struts constituting the scaffold for biotransplantation are composed of at least two or more, three or more, four or more, and n or more multilayers, and the number of stacks may be changed according to the purpose of use of the scaffold.
  • the scaffold is formed in a structure in which four or more struts are stacked, it is advantageous to secure physical properties as a scaffold.
  • the strut forming one layer is a structure in which filaments of substantially one composition are extended and formed, and a structure that is disconnected from each other such as a grid pattern is also included.
  • the strut may extend in various shapes within the same layer, and to increase the contact area with cells and fluids, regular or irregular patterns such as linear, wavy, lattice, zigzag, spiral can be formed. I can. It is preferable to form a regular pattern such as a lattice, which is advantageous for controlling physical properties and porosity of the scaffold.
  • the strut has a diameter in the range of 300 ⁇ m to 500 ⁇ m, 350 ⁇ m to 470 ⁇ m, 380 ⁇ m to 450 ⁇ m, and more preferably in the range of 390 ⁇ m to 425 ⁇ m in order to satisfy the physical properties to have as a scaffold. Has. If the diameter is less than the above range, it is difficult to secure physical properties such as strength due to the thin thickness.On the contrary, if it is too thick, the size of the pores is relatively small, and a sufficient level of porosity for cell growth or fluid flow cannot be achieved. .
  • the struts stacked in two or more layers are arranged so that each of the adjacent layers is twisted at a predetermined angle to form a deformation angle between the layers.
  • the strut is formed through an injection process, and in this case, the injection may be performed in a nozzle mounted on a 3D transfer mechanism that is positioned in three directions XYZ. Accordingly, the direction mentioned below means an injection direction.
  • the first layer is formed in parallel at regular intervals in the X-axis direction, and the second layer is parallel to the X-axis of the first layer at regular intervals to form a predetermined angle. Is formed.
  • the layer formed in parallel in the second layer is reset to the X'axis, and the third layer is formed parallel to the X'axis to form a predetermined angle.
  • the layer formed in parallel in the third layer is reset to the X" axis, and the fourth layer is formed parallel to the X" axis to form a predetermined angle.
  • This deformation angle can be referred to as a twist angle, and the average deformation angle between each layer of the n-layered struts ranges from 5 degrees to 355 degrees, 10 degrees to 350 degrees, 15 degrees to 345 degrees, and 20 degrees to 330 degrees. . More preferably, it has a range of 5 degrees to 180 degrees, 5 degrees to 160 degrees, and 10 degrees to 150 degrees.
  • the average deformation angle is an interlayer deformation angle, and when each layer is arranged at a deformation angle of 60 degrees in a four-layer stacked structure, the deformation angle between the first layer and the fourth layer may be 180 degrees.
  • the deformation angle is an average value, and the deformation angle between each layer in the n-layer stack structure may be formed equally or at different angles.
  • the second layer when the reference is to be the first layer, the second layer may have a deformation angle of 5 degrees to 180 degrees compared to the first layer, and the third layer may have a deformation angle of 10 degrees to 340 degrees compared to the first layer.
  • the deformation angle between the first layer and the n-th layer may be 0 degrees to 360 degrees.
  • the second layer is arranged twisted at 30 degrees to 60 degrees relative to the first layer
  • the third layer is twisted at 75 degrees to 105 degrees compared to the first layer
  • the fourth The layers are arranged by twisting 120 to 150 degrees compared to the first layer.
  • the second layer is twisted at 40 degrees to 50 degrees compared to the first layer
  • the third layer is twisted at 85 degrees to 95 degrees compared to the first layer
  • the fourth The layers are arranged by twisting 130 to 140 degrees compared to the first layer.
  • pores formed by lamination of upper and lower struts, and pores formed according to the spacing between struts arranged in the same strut layer.
  • the size of the pores may vary depending on the stacked structure and the spacing, and the two have a plurality of pore distributions such as the same or different ranges (bimodal) or trimodal (trimodal).
  • the pores exist independently or have the form of a channel (ie, an interconnected pore structure) that is connected up and down, thereby allowing the fluid to move freely.
  • the mechanical properties of the final obtained scaffold for biotransplantation are deteriorated, and it is not easy to control the size and porosity of the pores, which is not suitable for biotransplantation. Accordingly, by arranging multiple layers in a twisted structure as described above, it is possible to fabricate a scaffold having a geometric laminate structure, and effects such as mechanical properties and cell growth can be secured from this structure.
  • the scaffold for a living body has a first pore of 380 ⁇ m to 430 ⁇ m, preferably 410 ⁇ m to 420 ⁇ m, and 200 ⁇ m to 250 ⁇ m It has a bimodal pore distribution in which the second pores of are formed.
  • the porosity of the scaffold for biotransplantation may vary depending on the stacking method and diameter of the struts, but ranges from 30% to 60%, 35% to 55%, 40% to 50%, and 40% to 45%.
  • the pore size and porosity of the scaffold for transplantation in a living body are within a range that enables cell proliferation and differentiation, and bone formation.
  • the above range is within the above range so that the fluids for tissue regeneration passing through it and the cells adhere well, control the engraftment rate by preventing the loss of cells, and meet the physical properties required for the scaffold for biotransplantation. Freely adjustable.
  • the scaffold for a living body according to the present invention can be applied to various fields.
  • various methods for fabricating a conventional scaffold for a living body and among them, the present invention is suitable for an injection molding method using a 3D printer to which FDM technology is applied.
  • the physical properties required for the scaffold for biotransplantation through the FDM method can be applied to the FDM method, and the physical properties (eg, biocompatibility, strength, etc.) of the scaffold manufactured through this method must be excellent. Things to consider.
  • the problem of biocompatibility can be solved through the mixed use of sintered bioglass and biocompatible polymer, and physical properties, in particular, stiffness and strength can be achieved through the stacked structure of the struts.
  • Stiffness means a property that does not deform in response to an external force
  • toughness means a property that withstands strong impacts well. If both of them have improved values at the same time, the scaffold for biotransplantation has increased resistance to pressure or impact, and cracking does not occur easily. Due to this, the brittleness of the ceramic material of the bioglass can be compensated.
  • Toughness measurements were performed by a 3-point bending test, and toughness, maximum bending moment and maximum bending stress, three parameters were obtained.
  • Toughness has a range of 50 kPa/mm3 to 850 kPa/mm3, 70 kPa/mm3 to 800 kPa/mm3, and 100 kPa/mm3 to 800 kPa/mm3, preferably 600 kPa/mm3 to 800 kPa/mm3 Has.
  • the maximum bending moment is in the range of 25 Nmm to 70 Nmm, 30 Nmm to 65 Nmm, 35 Nmm to 650 Nmm, preferably 45 Nmm to 60 Nmm Has.
  • the maximum bending stress ranges from 3 MPa to 9 MPa, 3.5 MPa to 8.5 MPa, 4 MPa to 8 MPa, and most preferably 4.5 MPa to 7.5 MPa.
  • Stiffness can be measured using a compression tester, and three parameters are obtained: stiffness, yield displacement and yield stress.
  • the stiffness ranges from 1.5 N/mm to 20 N/mm, 1.8 N/mm to 15 N/mm, 2.0 N/mm to 10 N/mm, preferably 2.0 N/mm to 5 N/mm.
  • the yield displacement ranges from 0.3 mm to 0.8 mm, from 0.35 mm to 0.7 mm, preferably from 0.4 mm to 0.65 mm.
  • the yield stress ranges from 3 MPa to 20 MPa, 4 MPa to 15 MPa, 4.5 MPa to 10 MPa, preferably 5 MPa to 10 MPa.
  • the scaffold for biotransplantation of the present invention simultaneously has various activities such as surface properties and bioactivity mentioned below.
  • the roughness (Ra) of the surface of the scaffold measured with a surface roughness meter ranges from 130 nm to 260 nm, 135 nm to 250 nm, and 140 nm to 240 nm.
  • the water contact angle is a method of measuring the water contact angle by placing 10 ⁇ L of water droplets on the surface of the scaffold and using a Sessile drop at room temperature (25° C.), and the lower the value, the more hydrophilicity is.
  • the scaffold for biotransplantation of the present invention has a range of 0.19 to 0.6 OD (optical density) when looking at the absorbance related to protein absorption using BCA (Bicinchoninic acid) protein analysis (Pierce Kit, Thermo Scientific), It has the following range accordingly.
  • the scaffold for ex vivo transplantation of the present invention has a cell proliferation absorbance after 7 days of culture related to the cell proliferation rate measured by a related cell proliferation reaction assay (MTT Assay) in the following range. At this time, the higher the value, the better the cell proliferation occurs.
  • MTT Assay cell proliferation reaction assay
  • the F-Actin area ratio of the scaffold for ex vivo transplantation of the present invention has a range of 22% or more, 25% or more, 28% or more, 28% to 60%, and 30% to 55%.
  • the physical properties may be achieved through a combination of a sintered bioglass and a biocompatible polymer and adjusting the content ratio.
  • Bio-glass is one of bioceramics that is embedded in a living body, does not form a fibrous film around it, but directly contacts the surrounding bones to form a strong chemical bond.
  • the bioglass may include those selected from the group consisting of CaO, SiO 2 , P 2 O 5 , B 2 O 3 and combinations thereof.
  • the bioglass of the present invention is non-toxic and superior to hydroxyapatite, a basic mineral component of bone in human mesenchymal stem cells, including those selected from the group consisting of CaO, SiO 2 , P 2 O 5 , B 2 O 3 and combinations thereof. It has the effect of inducing osteoblast differentiation. In addition, since it has twice the compressive strength of hydroxyapatite, it can be used as a biocompatible material in the intervertebral space.
  • the CaO is a material contributing to the fluidity, durability and water resistance of the entire composition due to its easy fusion with other ceramic components, and the CaO is preferably 20 to 60% by weight, and more preferably, based on the total weight of the bioglass. 40 to 50% by weight, but not limited thereto.
  • the CaO is less than 20% by weight based on the total weight of the bioglass, the durability and water resistance of the 3D printer molded article may be inferior, and when the CaO exceeds 60% by weight based on the total weight of the bioglass, the 3D printer There is a problem in that the brittleness of the molded article is increased or the fluidity of the entire composition is poor, so that the composition is unevenly discharged during 3D printing.
  • the SiO 2 is a material that has transparency, viscosity, durability, and a low fusion temperature and contributes to the stabilization of the entire composition, and the SiO 2 is preferably 15 to 40% by weight, more preferably, based on the total weight of the bioglass. 30 to 40% by weight, but is not limited thereto. When the SiO 2 content is used within a corresponding range, bioactivity may be improved and glass crystallization may be excellent.
  • the P 2 O 5 can inhibit the propagation of bacteria such as streptococcus mutans, thereby increasing bioactivity.
  • bacteria such as streptococcus mutans
  • the P 2 O 5 is preferably 6 to 20% by weight, more preferably 12 to 16% by weight, based on the total weight of the bioglass, but is not limited thereto.
  • the content of P 2 O 5 is less than 6% by weight based on the total weight of the bioglass, the effect of inhibiting bacterial growth and the effect of forming a glass matrix is weak, and the content of P 2 O 5 exceeds 20% by weight. In this case, brittleness may increase and a problem may occur.
  • the B 2 O 3 may improve glass crystallization to further increase mechanical strength and thermal expansion rate.
  • the B 2 O 3 is preferably 1% by weight or less, more preferably 0.5% by weight or less, based on the total weight of the bioglass, but is not limited thereto.
  • the bioglass of the present invention does not use a material having the above composition as it is, but uses a material crystallized through sintering.
  • the bioglass undergoes crystallization through sintering, and the inherent strength and hardness of a 3D printer molded article to be produced afterwards can be improved.
  • the rigidity and toughness of the final molded product can be improved even if the sintering process, which was essentially performed to improve the strength of the conventional molded product, can be improved, and the low brittleness problem of the conventional bioglass can be solved.
  • the sintering temperature can be variously changed in consideration of the glass transition temperature inherent in bioglass.
  • the temperature is gradually increased at a heating rate of 0.01 to 0.8° C./min, and after reaching the highest point temperature of 800 to 1200° C., the highest point temperature may be sintered for 160 to 200 minutes. .
  • the sudden change in temperature makes it difficult to maintain the shape in which the sintered bioglass is injected through the 3D printer, and cracks and voids may be generated, and the strength may be significantly reduced.
  • the peak temperature of the sintering step affects the strength of the final scaffold, and it is preferable to sinter at 800 to 1200° C. for use as a substitute for living hard tissue. If the maximum temperature is less than 800°C, the compressive strength is low and it cannot be used as a substitute for hard tissue. When the peak temperature exceeds 1200°C, cracks may occur.
  • the biocompatible polymer mixed with the above-described sintered bioglass serves as a binder.
  • the binder bonds fine particles of sintered bioglass to each other to give aggregation and viscosity, while allowing the bioglass to have excellent toughness to overcome the problem of intrinsic brittleness.
  • a composition in which a sintered bioglass and a biocompatible polymer serving as a binder is mixed is melted, fluidity and flowability are imparted to the composition, so that injection can be facilitated.
  • biocompatible polymers include poly(epsilon-caprolactone) (PCL, poly( ⁇ -caprolactone)), polyethylene (PE, Polyethylene), polymethyl methacrylate (PMMA, Poly(methyl methacrylate)), and polylac.
  • PCL poly(epsilon-caprolactone)
  • PE poly( ⁇ -caprolactone)
  • PE polyethylene
  • PMMA polymethyl methacrylate
  • polylac polylac
  • Poly lactic acid (PLA), poly-L-lactic acid (PLLA), polyglycolide (PGA), polylactic acid-glycolic acid copolymer (PLGA, Poly lactic- co-glycolic acid), polyvinyl chloride (PVC), polytetrafluoroethylene (PTFE), polyethylene terephthalate (PET), polyurethane (polyurethane), polyacetal (polyacetal), poly Polyamide, polyamide elastomer, polyester, polyester elastomer, polypropylene, polyacrylonitrile, polysulfone, polyorthoester (Polyorthoester), polyanhydrides, chitosan, gelatin, collagen, and may include those selected from the group consisting of a combination thereof.
  • the present invention may be a biodegradable polymer.
  • the biodegradable polymer is capable of controlling mechanical strength, is easy to process, and is capable of controlling the rate of biodegradation according to the synthesis conditions, so that the material can be effectively utilized.
  • the biodegradable polymer is a group consisting of poly(epsilon-caprolactone), polylactic acid, poly-L-lactic acid, polyglycolide, polylactic acid-glycolic acid copolymer, and combinations thereof
  • poly(epsilon-caprolactone) One type selected from is possible, and more preferably poly(epsilon-caprolactone) is used.
  • the content between the sintered bioglass and the biocompatible polymer is controlled in order to satisfy not only the toughness and rigidity of the scaffold, but also properties such as surface roughness, hydrophilicity, and protein absorption.
  • the sintered bioglass is used in an amount of 10 to 70% by weight, preferably 30 to 50% by weight, and 35 to 45% by weight based on the total weight of the composition. If the sintered bioglass is less than the above range, mechanical properties inherent to the bioglass such as compressive strength may be weakened. Conversely, when the content exceeds the above range, it is difficult to inject the composition due to the high viscosity.
  • the biocompatible polymer is used in an amount of 30 to 90% by weight, 50 to 70% by weight, and 55 to 65% by weight based on the total weight of the composition. If the content of the biocompatible polymer is less than the above range, the bonding strength between the sintered bioglasses is insufficient, or it is difficult to improve the brittleness of the sintered bioglass. On the contrary, if it exceeds the above range, the content of the sintered bioglass is relatively low, and thus there is a concern that the physical properties of the finally fabricated scaffold may be deteriorated.
  • the content ratio of the sintered bioglass and the biocompatible polymer is related to the viscosity ( ⁇ * , complex viscosity) when the scaffold is manufactured using an FDM 3D printer. That is, the sintered bioglass has a non-viscoelastic property, and as its content increases, the viscosity of the melt during injection molding increases.
  • the high viscosity melt affects the shape of the strut and the quality of the process after injection, so it may be difficult to ensure uniformity in the diameter or thickness of the strut, and there is a risk of clogging the nozzle.
  • an appropriate viscosity range can be secured through the content ratio of the sintered bioglass and biocompatible polymer presented above, and the preferred viscosity range is 110 to 800 Pa ⁇ s, 120 to 700 Pa ⁇ s, and 150 to 500 Pa ⁇ s. Has a viscosity.
  • the sintered bioglass may be crushed before and after sintering.
  • the average particle size of the sintered bioglass after pulverization is adjusted to be 1.5 to 2.5 ⁇ m.
  • the average particle size is calculated from the value measured by the particle size analysis equipment (APA2000, MALVERN) (accumulated 50% of the average particle diameter distribution).
  • the pulverization process may be performed using any known pulverizer, and as an example, a freezer mill is used.
  • the biocompatible polymer may be used after pulverizing in a similar range to the sintered bioglass in advance, or a pulverization process may be performed during the mixing process.
  • the pulverized composition is injection-molded to prepare a scaffold for transplantation.
  • FDM 3D printing method can be used for injection molding.
  • FDM Fused Deposition Modeling
  • FFF Fused Filament Fabrication
  • composition for an FDM 3D printer according to the present invention is in the form of a paste having fluidity, flowability and viscosity. That is, the composition for an FDM 3D printer according to the present invention can be applied to any 3D printing equipment capable of injection, regardless of its name, and thus can be used for commercially available FDM and FFF 3D printers.
  • the heating device connected to the 3D printer operates in a temperature range of 25 to 250°C, and can melt the pulverized composition.
  • the sintered bioglass and the biocompatible polymer, respectively, which were in a solid state are melted and transformed into a paste form, fluidity and flowability are imparted to the composition, so that injection can be facilitated.
  • the strut size ( ⁇ m) of each scaffold can decrease.
  • the strut size may decrease as the nozzle speed increases.
  • the nozzle speed may decrease as the content of the sintered bioglass increases.
  • the strut size ( ⁇ m) of each scaffold may increase.
  • the air pressure increases as shown in FIG. 1B, which was tested at a temperature of 120° C. and a nozzle speed of 5 mm/s, the strut size may increase due to a large flow rate and a low viscosity of the composition.
  • the air pressure may increase as the content of the sintered bioglass increases.
  • the strut size ( ⁇ m) of each scaffold can increase.
  • the strut size may increase due to a large flow rate and a low viscosity of the composition.
  • the temperature may increase as the content of the sintered bioglass increases.
  • the sintering process is essentially performed to improve the strength of the molded article after injection molding, whereas in the present invention, the stiffness and toughness are sufficiently satisfied due to the use of sintered bioglass and biocompatible polymer. As a result, the sintering process may be excluded. This is obtained by the use and content control of the sintered bioglass, and in the case of using the conventional unsintered, that is, bioglass, it is possible to prevent cracking of the molded article due to low brittleness. As such sintering process is excluded, the process can be simplified and cost can be reduced.
  • the sintering process refers to a process of heating an injection-molded molded product to 1000°C or higher or 500°C or higher to improve strength, but contained ceramics Since the sintering temperature may be changed according to the type and content of, it is not limited thereto.
  • the scaffold for biotransplantation according to the present invention can be used for artificial bone, artificial joint, oral and maxillofacial bone, skull, or dental artificial tooth root, and used as a disc-shaped artificial bone that can be used for spinal fusion or an artificial bone used for facial reconstruction. It is possible.
  • Each of the dry powders of CaO 139.8g, SiO 2 113.7g, P 2 O 5 45.6 g, and B 2 O 3 0.9 g was injected into a container and mixed to prepare a bioglass having a total weight of 300 g.
  • the obtained bioglass was sintered under the following conditions to obtain a sintered bioglass.
  • the bioglass obtained in Preparation Example 1 was put into a ball mill (High-Energy Ball Mill, FRITSCH), and pulverized to have an average particle size of 2.1 ⁇ m.
  • the pulverized bioglass was mixed with poly( ⁇ -caprolactone) (PURASORB PC12, CorbionPurac, hereinafter referred to as'PCL') and a composition having a total weight of 100 g, respectively, in the composition ratio shown in Table 1 below. .
  • the composition was placed in a Freezer Mill (6875D, SPEX Sampleprep), and pulverized to have an average particle size of 2.1 ⁇ m.
  • the pulverized composition was melted using a heating device connected to an FDM 3D printer (DTR3-331S-EX, Dasa Robot System). Subsequently, the obtained paste composition was filled in the nozzle (diameter: 500 ⁇ m) in the printer, and the composition was injected in a size of 6 x 6 x 2 mm 3 through an ejection opening and laminated in a layer-by-layer method on the top surface of the worktable. .
  • the composition is injected in a layer-by-layer method. Based on the injection direction of the first layer, the injection direction of the second layer is 45°, the injection direction of the third layer is 90°, and the injection direction of the fourth layer is 135°.
  • a scaffold having struts in four directions as shown in FIG. 1 was prepared.
  • Example 1 Sintered bioglass (% by weight) PCL (% by weight) Melting temperature(°C) Process time (min) Nozzle speed (mm/s) Air pressure (kPa)
  • Example 1 20 80 120 2 5 320
  • Example 2 40 60 120 2 5 450
  • Example 3 60 40 140 2 5 500 Comparative Example 1 100 0 25 2 5 430 Comparative Example 2 0 100 100 2 5 480
  • the diameter of the strut is affected by the nozzle speed, the content of the sintered bioglass, and the melting temperature. For example, as the content of sintered bioglass increases, the diameter of the strut decreases, and as the air pressure and the content of bioglass increase, the diameter of the strut tends to increase.
  • FIG. 2(d) The viscosity of FIG. 2(d) was measured using a rotational viscometer (Bohlin Gemini HR Nano, Malvern Instruments, Surrey, UK) installed in a parallel plate shape with a diameter of 20 mm and a gap of 2 mm, and a frequency sweep was 1 % Strain and at 140°C. Referring to FIG. 2(d), it can be seen that the viscosity increases as the content of the sintered bioglass increases.
  • the process conditions suitable for the optimal strut diameter (390-425 ⁇ m) for application to the scaffold for biotransplantation were set by adjusting the content of the sintered bioglass/PCL, which was performed as described above. It was reflected in the example process conditions.
  • the strut diameter, pore size, and porosity of the scaffolds prepared in Examples 1 to 3 and Comparative Examples 1 to 2 were measured, and the results are shown in Table 2 below.
  • the pore size was measured using a scanning electron microscope (SEM, SNE-3000M, SEC Inc., Korea), and the porosity was determined by the following formula and bulk density ( ⁇ ) (PCL (1.135 g/cm 3 ) / bioglass (3.05 g) /cm 3 ) was calculated using the value.
  • Porosity (%) (1-(1/ ⁇ s ) x (W s /V a )) x 100
  • Example 1 424.3 ⁇ 7.7 400.7 ⁇ 10.2 214.3 ⁇ 14.1 42.5 ⁇ 2.1
  • Example 3 420.7 ⁇ 9.2 412.1 ⁇ 7.0 216.4 ⁇ 20.5 42.3 ⁇ 1.2
  • Comparative Example 1 392.5 ⁇ 20.1 391.5 ⁇ 9.1 207.7 ⁇ 20.7 46.8 ⁇ 3.0
  • Comparative Example 2 400.7 ⁇ 4.7 439.3 ⁇ 14.3 221.4 ⁇ 13.6 43.1 ⁇ 1.5
  • the strut has a diameter of 390 to 425 ⁇ m, a bimodal pore, and a porosity of 42 to 47%.
  • FIG. 3 is a view showing the scaffolds and struts manufactured in Examples 1 to 3 and Comparative Examples 1 to 2.
  • the image in the first line of FIG. 3 is an optical microscope image (BX FM-32, Olympus, Tokyo, Japan), and it can be seen that a scaffold in which four layers of struts are stacked was produced.
  • the images in the second to fourth lines of FIG. 3 are scanning electron microscopy (SEM, SNE-3000M, SEC Inc., Korea) images, in which multi-layered struts are each arranged at a predetermined twist angle, and pores are pores on the surface. It can be seen that is formed.
  • the pores of the strut surface provide a rough surface capable of promoting cell adhesion and bone tissue differentiation during tissue regeneration.
  • the images in the fifth and sixth lines of FIG. 3 are EDS (Energy-dispersive Spectroscopy) test results and Ca and Si distribution maps (Mapping) using a field emission scanning electron microscope (JSM7500F, JEOL LTD.). From these images, it can be seen that the strut contains Ca and Si, and the concentration of Ca and Si in the strut increases as the bioglass composition ratio increases.
  • thermogravimetric analysis was performed using a thermogravimetric analyzer (TGA-2050, TA-Instruments) under nitrogen conditions.
  • Figure 4(a) is a TGA graph of the composition used to prepare the scaffolds of Examples 1 to 3 and Comparative Examples 1 to 2.
  • 4(a) in the case of Comparative Example 1 consisting of only sintered bioglass, there was no change in weight due to the absence of PCL, and in the case of Comparative Example 2 consisting of only PCL, it can be seen that thermal decomposition was completely performed at 500°C. . In comparison, it was confirmed that the compositions of Examples 1 to 3 remained as much as the weight of the mixed sintered bioglass.
  • 4(b) is an X-ray diffraction spectrum of a composition used to prepare the scaffolds of Examples 1 to 3 and Comparative Examples 1 to 2.
  • Example 1 Example 2 Example 3 Comparative Example 1 Comparative Example 2 3-point bending test Bending moment (N mm) 55.8 ⁇ 0.5 47.6 ⁇ 0.9 38.1 ⁇ 0.5 74.7 ⁇ 6.8 37.3 ⁇ 1.8 Bending stress (MPa) 6.3 ⁇ 0.1 5.6 ⁇ 0.2 4.3 ⁇ 0.2 7.8 ⁇ 0.7 4.6 ⁇ 0.2 Toughness (kPa mm_3) 760 ⁇ 41.7 710 ⁇ 5.48 100 ⁇ 22.7 5.9 ⁇ 0.9 480 ⁇ 46.2 Compression test Stiffness (N/mm) 2.5 ⁇ 0.1 2.9 ⁇ 0.1 2.9 ⁇ 0.2 25.9 ⁇ 6.3 1.1 ⁇ 0.1 Yield displacement (mm) 0.6 ⁇ 0.03 0.5 ⁇ 0.04 0.5 ⁇ 0.06 0.2 ⁇ 0.01 0.4 ⁇ 0.02 Yield stress (MPa) 6.1 ⁇ 0.2 6.6 ⁇ 0.1 5.8 ⁇ 0.6 21.2 ⁇ 5.8 2.6 ⁇ 0.2
  • the stiffness was very high, but the toughness was very low.
  • the scaffold of Comparative Example 2 using PCL alone exhibited a low value of stiffness and a high value of toughness, as opposed to Comparative Example 1.
  • the stiffness and toughness values should not be skewed to one side as in Comparative Examples 1 and 2, but should be properly balanced. Accordingly, in the case of the scaffolds of Examples 1 to 3, the toughness in the range of about 50 to 850 (kPa/mm3) and the range of 2 to 3 N/m were simultaneously satisfied.
  • a 3D surface topography image was obtained using a phase shift interferometer to analyze the surface roughness of the scaffold. 6, it was confirmed that the surfaces of the scaffolds of Examples 1 to 3 and Comparative Example 1 were rougher.
  • a surface roughness value (R a ) was obtained by the following equation using a surface roughness meter (Nanoview-m4151p, Korea).
  • Ra [ ⁇
  • the hydrophilicity evaluation was carried out by placing 10 ⁇ L of water droplets on the surface of each scaffold and measuring the water contact angle using a Sessile drop at room temperature (25°C).
  • BCA Bactetinic acid
  • PBS phosphate buffer saline
  • Triton X-100 25 ⁇ L of the lysate was added to 200 ⁇ L of the BCA working reagent.
  • the mixture was incubated at 37° C. for 30 minutes. Absorbance was measured at 562 nm using a micro plate reader (EL800, Bio-Tek Instruments, Winooski, VT).
  • the scaffolds of Comparative Examples 1 and 1 to 3 including sintered bioglass showed a tendency of increasing protein absorption as time passed.
  • the absorption of protein increased. This result is due to the irreversible interaction of electrostatic forces between the amine group of the protein and the negatively charged component of the sintered bioglass in the scaffold.
  • the scaffolds (6 ⁇ 6 ⁇ 2 mm 3) prepared in Examples 1 to 3 and Comparative Examples 1 to 2 were sterilized with 70% ethanol (Ethanol) under UV light.
  • Rat progenitor bone tissue (MC3T3-E1) was sprayed onto each scaffold at a density of 1 ⁇ 10 5 cells/mL, followed by 10% fetal bovine serum (Gemini Bio-Products, USA) and 1% antibiotic (Antimycotic). , Cellgro, USA).
  • the scaffold was placed on a 24-well plate containing ⁇ -minimum essential medium (Life Sciences, USA). The samples were incubated at 5% CO 2 and 37°C, and the incubator was changed every day.
  • Viable cells were determined through the cell proliferation response assay (MTT Assay) (Cell Proliferation Kit I, Boehringer Mannheim). 0.5mg/mL of MTT was added to the sample and incubated for 4 hours at 37°C. Then, absorbance was measured at 570 nm using a microplate reader (EL800, Bio-Tek Instruments, Winooski, VT).
  • MTT Assay cell proliferation response assay
  • the scaffold was exposed to fluorescence staining of Diamidino-2-phenylindole (DAPI, Invitrogen, Carlsbad, CA).
  • DAPI Diamidino-2-phenylindole
  • Phalloidin Alexa Fluor 594; Invitrogen, Carlsbad, CA
  • LSM 700 Carl Zeiss, Germany
  • the area of F-Actin gradually increases by increasing the content of the sintered bioglass as described above.
  • Gene-specific primers are runx2 (forward: 5′- ACATCCCCATCCATCCAT-3′, reverse: 5′-GGTGCTGGGTTCTGAATCTG-3′), OPN (forward: 5′-GGAGGAAACCAGCCAAGG-3′, reverse: 5′- TGCCAGAATCAGTCACTTTCAC-3′), OCN (forward: 5′-CCCTCCTGAAGGTCTCACAA-3′, reverse: 5′-GCTGTCTCCCTCATGTGTTG-3′), Col-I (forward: 5′-ACTCAGCCGTCTGTGCCTCA-3′, reverse: 5′-GGAGGCCTCGGTGGACATTA- 3′), ALP (forward: 5′-GCCCAGTGCCTTCTGATTT-3′, reverse: 5′-GGGCAGCGTCAGATGTTAAT-3′), BMP2 (forward: 5′- AGA TCT GTA CCG CAG GCACT-3′, reverse: 5′-GTTCCTCCACGGCTTCTTC -3′), the housekeeping gene mouse G
  • the scaffolds produced in the above Examples and Comparative Examples were evaluated and plotted to evaluate the toughness, cell seeding efficiency, cell proliferation rate, and consumption-related transcription factors to be suitable for biotransplantation, and each optical image was shown.
  • FIG. 8 is a diagram showing a comprehensive evaluation of the scaffolds of Comparative Example 2 and Examples 1 to 3.
  • the scaffolds of Examples 1 to 3 containing sintered bioglass/PCL at the same time exhibited an overall superior tendency compared to Comparative Example 2.
  • the scaffold of Examples 1 to 2, more preferably Example 2 is the most excellent in terms of overall evaluation.

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Abstract

본 발명은 소결 바이오 글라스와 생체적합성 고분자를 포함하여 열용해 적층방법을 이용한 3D 프린터를 이용하여 물성이 개선된 생체 이식용 스캐폴드를 개시한다.

Description

생체 이식용 스캐폴드
본 발명은 생체 이식용 스캐폴드에 관한 것이다.
3D　프린터는 3D도면을 바탕으로 폴리머, 금속 등의 소재를 용융하거나 파우더를 적층하는 방식으로 실제 입체의 형상을 그대로 제작하는 설비를 말한다.
3D　프린터는 설계한 디자인대로 복잡한 구조의 제품을 손쉽게 성형 및 제작할 수 있다는 장점을 지닌다는 점에서 시제품까지 그 활용범위가 점차 확대되고 있고, 그 시장은 더욱 확대될 것으로 기대한다.
의료/바이오 분야에서의 3D 프린팅 기술은 간이나 콩팥, 심장과 같은 인공장기를 바이오잉크(Bio-ink)를 원료로 하여 생산해내는 3D 바이오 프린팅, 인공 조직 또는 장기의 재생을 목적으로 하는 조직 공학, 개인 맞춤형 의료에 적용되고 있다.
3D 프린팅 기술은 기본적으로 3D디지털 모델을 기반으로 하여 총 7가지 방식으로 나뉜다: 광중합 방식 (Photopolymerization, PP), 재료 압출 방식 (Material Extrusion, ME), 접착제 분사 방식 (Binder Jetting, BJ), 재료 분사 방식 (Material Jetting, MJ), 고에너지 직접 조사 방식 (Direct Energy Deposition, DED), 분말 적층 용융 방식 (Powder Bed Fusion, PBF), 시트 적층 방식 (Sheet Lamination, SL).
이 중에서도 재료 분사 방식 중 하나인 열용해 적층 방식(Fused direct deposition, 이하 'FDM'이라 한다)이 널리 사용되고 있다.
FDM 방식은 사출 가능한 수지를 사용하여 가는 실 같은 필라멘트 형태의 수지를 노즐 안에서 녹여 출력을 통해 한층 한층 적층하면서 3D 프린팅하는 방법을 의미한다. 이때 노즐은 고열로 플라스틱 필라멘트를 녹이며, 토출된 필라멘트는 상온에서 경화되어 스트럿을 형성한다.
FDM 방식의 3D 프린터는 다양한 소재 적용이 가능하고, 정확성과 반복성이 우수하고, 제조된 제품이 견고하고 내구성이 탁월하며 치수 안정성이 무엇보다 우수한 제품을 제작할 수 있는 기술이다.
FDM 방식의 3D 프린팅 기술을 의료/바이오 분야에 적용할 경우 그 응용 가능성이 매우 높으며, 이중에서도 생체 이식용 스캐폴드에 대한 연구가 진행되고 있다.
대한민국 등록특허 제10-1912839호에서는 CaO 및 SiO2를 주성분으로 하는 세라믹 분말 및 바인더를 포함하는 페이스트 형태의 FDM 3D 프린터용 조성물을 개시하면서, 용융 과정 없이 빠르게 성형품을 제작할 수 있고, 다양한 기하학적 구조를 정밀하게 구현할 수 있어 의료용 생체 대체재로 활용 가능하다고 개시하고 있다.
그러나 상기 세라믹 분말은 내재적인 취성으로 인해 외부 압력 또는 충격에도 쉽게 깨지거나 크랙이 발생하는 등의 문제를 안고 있다. 또한, 함께 사용하는 바인더로서의 천연 고분자의 경우 생체적합성이 우수하고 세포독성을 유발시키지 않으나, 그 자체만으로는 기계적 강도가 약하고 가공이 어려운 단점이 있다.
생체 이식용 스캐폴드에 적용을 위해선, 스캐폴드의 기하학적 구조를 정밀하게 가공하는 기술이외에 기계적 물성 및 생체적합성에 대한 이슈가 먼저 해결되어야 한다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
대한민국 등록특허 제10-1912839호
본 발명에서는 취성의 단점을 개선할 수 있는 새로운 조성을 개발하였고, 상기 조성물을 FDM 3D 프린팅 방식을 적용하여 생체 이식용 스캐폴드를 제작할 경우, 인성 및 강성이 동시에 개선되고, 표면 특성이 향상되어 스캐폴드에 요구되는 기계적 물성과 생물학정 활성을 동시에 달성할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 목적은 생체 이식용 스캐폴드를 제공하는데 있다.
본 발명은 서로의 위에 필수적으로 배치되고, 상하로 서로 교차하면서 기공을 만드는 복수 개의 스트럿이 다층으로 적층된 구조를 갖는 생체 이식용 스캐폴드를 제공한다.
이때 상기 스트럿이 바이오 글라스와 생체적합성 고분자를 포함하며, 2층 이상의 적층 구조로 이루어진다.
상기 스트럿은 동일 층 내에서 서로 연결되거나 단절된 상태로, 선형, 파형, 격자형, 지그재그형, 나선형을 포함하는 규칙적인 패턴, 또는 불규칙 패턴으로 평행하게 형성된다.
또한, 상기 스트럿은 300㎛ 내지 500㎛의 직경을 갖는다.
상기 스트럿은 층 간 평균 변형각이 30도 내지 60도의 범위를 갖는다.
상기 생체 이식용 스캐폴드는 바이모달 형태의 기공 크기 분포를 가지며, 기공율이 30% 내지 60%이며, 하기 물성을 만족한다:
(1) 인성: 50 kPa/㎣ 내지 850 kPa/㎣
(2) 강성: 1.5 N/mm 내지 20 N/mm.
(3) 거칠기도(Ra): 130 nm 내지 260 nm
(4) 180초 이후 수접촉각: 75도 이하
(5) 24시간 이후 단백질 증식 흡광도: 0.25 내지 0.6 O.D.
(6) 세포 파종 효율: 37% 이상
(7) 7일 배양 후 세포 증식 흡광도: 0.22 O.D. 이상
(8) F-Actin이 가지는 영역비: 22% 이상
상기 스트럿을 구성하는 바이오 글라스는 소결 바이오 글라스이다.
또한, 상기 생체 이식용 스캐폴드는 소결 바이오 글라스와 생체적합성 고분자를 혼합한 후 사출 성형하여 제조한다.
이때 사출 성형은 열용해 적층방법을 이용한 3D 프린터를 이용하여 수행한다.
본 발명에 따른 생체 이식용 스캐폴드는 소결 바이오 글라스 및 생체적합성 고분자의 함량비를 최적화함에 따라 스캐폴드의 인성 및 강성을 최적화하여, 종래 바이오 글라스의 내재적 취성에 따른 크랙 발생 등의 문제를 해소할 수 있다.
또한, 상기 생체 이식용 스캐폴드는 표면 특성 및 친수성 특성이 개선되어 생체 이식시 단백질 흡수력이 우수하고, 세포 증식과 골 형성의 활성화 효과를 가짐에 따라 의료/바이오 분야에서 요구되는 스캐폴드로서 바람직하게 적용 가능하다.
특히, 종래 세라믹이 함유된 성형품의 강도 향상을 위해 필수적으로 수행하던 소결 공정의 제외가 가능하며, 이 소결 공정을 제외하더라도 소결 바이오 글라스를 사용함에 따라 최종 성형품의 강성 및 인성을 향상시킬 수 있고, 종래 바이오 글라스의 낮은 취성 문제를 해소할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 스트럿의 적층 예시를 보여주는 이미지이다.
도 2는 실시예 1~3, 비교예 1~2에서 제조한 공정 파라미터 대비 스트럿의 물성 변화를 보여주는 그래프이다.
도 3은 실시예 1~3 및 비교예 1~2에서 제작된 스캐폴드 및 스트럿을 보여주는 도면이다.
도 4(a)는 실시예 1~3 및 비교예 1~2의 스캐폴드 제작에 사용된 조성물의 열중량 분석 및 X-선 회절 분석 그래프이다.
도 5는 실시예 1~3 및 비교예 1~2의 스캐폴드 제작에 사용된 조성물의 인성 및 압축 시험 결과를 보여주는 그래프이다.
도 6은 실시예 1 내지 3 및 비교예 1에서 제작한 스캐폴드의 3D 표면 지형 이미지이다.
도 7은 세포배양 3일 후에 청색으로 염색된 세포핵과 적색의 F-Actin의 이미지이다.
도 8은 비교예 1, 실시예 1~3의 스캐폴드의 종합 평가를 보여주는 도면이다.
Layer by layer(LbL) 적층 기법은 한층씩 적층되어 3D형상의 제품을 얻는 기술이다. 본 발명은 상기 LbL 적층 기법을 적용하여 생체 이식용 스캐폴드를 제조한다.
구체적으로, 본 발명의 생체 이식용 스캐폴드는 서로의 위에 필수적으로 배치되고, 상하로 서로 교차하면서 기공을 만드는 복수 개의 스트럿이 다층으로 적층된(layer-by-layer) 구조를 갖는다.
생체 이식용 스캐폴드의 외부 형상 및 치수를 각각의 적용 목적에 따라 선택할 수 있으며 이는 적용 분야에 요구되는 목적에 적합할 수 있다. 상기 생체 이식용 스캐폴드는 예를 들어 신장된 형상, 예를 들어 원통형, 다각 기둥, 예를 들어 삼각기둥 또는 잉곳(ingot) 형상; 또는 판상, 또는 다각형, 예를 들어 사각형, 입방형, 사각형, 피라미드형, 오각형, 12각형, 20각형, 능면체형, 프리즘형 또는 구형, 예를 들어 공형, 중공형, 구면 렌즈 또는 원통형 렌즈형상, 및 원반형 또는 고리형 중에서 선택되는 외부 형상을 가질 수 있다. 이러한 형상은 스트럿의 적층을 통해 달성될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 스트럿의 적층 예시를 보여주는 이미지이다. 본 발명에서는 편의상 직육면체 형상의 생체 이식용 스캐폴드로 언급한다.
생체 이식용 스캐폴드를 구성하는 스트럿은 적어도 2층 이상, 3층 이상, 4층 이상 및 n층 이상의 다층으로 구성되며, 스캐폴드의 사용 목적에 따라 적층 갯수를 변화시킬 수 있다. 바람직하기로 4층 이상 스트럿이 적층된 구조로 스캐폴드를 형성할 경우 스캐폴드로서의 물성 확보에 유리하다.
한 층을 이루는 스트럿은 실질적으로 한 조성의 필라멘트가 연장 형성된 구조로, 격자 무늬와 같이 서로 단절된 구조도 포함된다. 상기 스트럿은 동일 층 내에서 다양한 형상으로 연장 형성될 수 있으며, 세포 및 유체와의 접촉 면적을 높일 목적으로 선형, 파형, 격자형, 지그재그형, 나선형과 같은 규칙적인 패턴 또는 불규칙적인 패턴이 형성될 수 있다. 바람직하기로는 격자와 같은 규칙적인 패턴을 형성하는 것이, 스캐폴드의 물성 및 기공율 등의 제어에 유리하다.
또한, 스트럿은 스캐폴드로서 가져야 할 물성을 만족하기 위해, 직경이 300㎛ 내지 500㎛, 350㎛ 내지 470㎛, 380㎛ 내지 450㎛의 범위를 가지고, 더욱 바람직하기로는 390㎛ 내지 425㎛의 범위를 갖는다. 상기 범위 미만의 직경을 갖는 경우, 얇은 두께로 인해 강도와 같은 물성 확보가 어렵고, 반대로 너무 두꺼울 경우 기공의 크기가 상대적으로 작아 세포가 성장하거나 유체가 흐를 수 있는 충분한 수준의 기공율을 달성할 수 없다.
2층 이상으로 적층된 스트럿은 서로 인접하는 각 층들이 소정의 각도로 뒤틀리도록 배열되어 이들 층 사이 변형각을 이룬다. 후속에서 설명되는 바와 같이, 스트럿은 사출 공정을 통해 형성되고, 이때 사출은 XYZ 세가지 방향으로 위치 조절되는 3D이송기구에 탑재된 노즐에서 수행될 수 있다. 이에 하기에서 언급하는 방향은 사출 방향을 의미한다.
예를 들면, 스트럿이 4층으로 적층된 구조의 경우, 첫번째 층이 X축 방향으로 일정한 간격을 두고 평행하게 형성되며, 두번째 층은 첫번째 층의 X축에 소정의 각도를 이루도록 일정한 간격을 두고 평행하게 형성된다. 이때 두번째 층에서의 평행하게 형성된 층을 X'축으로 재설정하고, 세번째 층은 X' 축과 소정의 각도를 이루도록 평행하게 형성된다. 또한, 세번째 층에서의 평행하게 형성된 층을 X"축으로 재설정하고, 네번째 층은 X"축과 소정의 각도를 이루도록 평행하게 형성된다.
이러한 변형각은 뒤틀림각이라고 할 수 있으며, n층 적층된 스트럿의 각 층 간 평균 변형각은 5도 내지 355도, 10도 내지 350도, 15도 내지 345도, 20도 내지 330도의 범위를 갖는다. 보다 바람직하기로는 5도 내지 180도, 5도 내지 160도, 10도 내지 150도의 범위를 갖는다. 상기 평균 변형각은 각 층간 변형각으로, 4층 적층 구조에서 각 층간을 60도의 변형각으로 배열할 경우, 첫번째 층과 네번째 층 간 변형각은 180도가 될 수 있다. 상기 변형각은 평균 수치로, n층 적층 구조에서 각 층 사이의 변형각을 동일하게 형성하거나, 서로 다른 각도로 형성할 수 있다.
한편, 변형각과 관련하여, 기준을 첫번째 층으로 할 경우, 첫번째 층 대비 두번째 층은 5도 내지 180도, 세번째 층은 첫번째 층 대비 10도 내지 340도와 같은 변형각을 가질 수 있다. 이때 첫번째 층과 n번째 층 간의 변형각은 0도 내지 360도일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 4층으로 적층된 스트럿 구조의 경우, 첫번째 층 대비 두번째 층은 30도 내지 60도로 뒤틀어 배열하고, 세번째 층은 첫번째 층 대비 75도 내지 105도로 뒤틀어 배열하고, 네번째 층은 첫번째 층 대비 120도 내지 150도로 뒤틀어 배열한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 4층으로 적층된 스트럿 구조의 경우, 첫번째 층 대비 두번째 층은 40도 내지 50도로 뒤틀어 배열하고, 세번째 층은 첫번째 층 대비 85도 내지 95도로 뒤틀어 배열하고, 네번째 층은 첫번째 층 대비 130도 내지 140도로 뒤틀어 배열한다.
상기 스트럿의 뒤틀린 배열로 인해, 각 층을 구성하는 스트럿 사이가 교차하고, 이를 통해 기공을 형성한다. 기공은 크게 상하 스트럿의 적층에 의해 형성되는 기공과 동일 스트럿 층에서 배열되는 스트럿 사이의 간격에 따라 형성되는 기공의 두 종류 이상으로 존재한다. 상기 기공의 크기는 상기 적층 구조 및 간격에 따라 달라질 수 있으며, 이 둘은 서로 같거나 다른 범위(bimodal) 또는 트리모달(trimodal)과 같은 복수 개의 기공 분포도를 갖는다. 또한, 사이 기공은 독립적으로 존재하거나 상하 연결된 채널(즉, 상호 연결된 공극 구조) 형태를 가져, 유체의 이동을 자유롭게 한다.
만약, 상기 각도를 벗어나 스트럿을 적층할 경우, 최종 얻어지는 생체 이식용 스캐폴드의 기계적 물성이 저하될뿐만 아니라, 기공의 크기 및 기공율의 제어가 용이하지 않아 생체 이식에 적합하지 않다. 이에 상기와 같이 비틀린 구조로 다층 배열함으로써 기하학적 적층 구조를 갖는 스캐폴드의 제작이 가능하고, 이 구조로부터 기계적 물성 및 세포 성장 등의 효과를 확보할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 스트럿이 4층으로 적층된 구조의 경우 생체 이식용 스캐폴드는 380㎛ 내지 430㎛, 바람직하기로 410㎛ 내지 420㎛의 제1공극과, 200㎛ 내지 250㎛의 제2공극이 형성되는 바이모달 형태의 기공 분포도를 갖는다. 이때 생체 이식용 스캐폴드의 기공율은 스트럿의 적층 방식 및 직경에 따라 달라질 수 있으나, 30% 내지 60%, 35% 내지 55%, 40% 내지 50%, 40% 내지 45%의 범위를 갖는다.
생체 이식용 스캐폴드의 기공 크기와 기공율은 세포 증식 및 분화, 그리고 골 형성이 잘될 수 있도록 하는 범위이다. 또한, 상기 범위는 이를 통과하는 조직 재생을 위한 유체들의 이동 및 세포를 잘 부착하고, 세포의 유실을 막아 생착율을 조절하고, 생체 이식용 스캐폴드에 요구되는 물성에 부합될 수 있도록 상기 범위 내에서 자유롭게 조절 가능하다.
본 발명에 따른 생체 이식용 스캐폴드는 다양한 분야에 적용 가능하다. 종래 생체 이식용 스캐폴드의 제작은 다양한 방법이 있으며, 이 중에서도 본 발명에서는 FDM 기술을 적용한 3D프린터를 이용한 사출 성형 방법에 적합하다.
FDM 방식을 통한 생체 이식용 스캐폴드에 요구되는 물성은 FDM 방식으로의 적용이 가능할 것과, 이 방식을 통해 제조된 스캐폴드의 물성(예, 생체적합성, 강도 등)이 우수할 것, 크게 이 두 가지 내용을 고려하여야 한다.
본 발명에서는 소결 바이오 글라스와 생체적합성 고분자와의 혼합 사용을 통해 생체적합성의 문제를 해소하고, 상기 스트럿의 적층 구조를 통해 물성, 특히 강성(Stiffness) 및 강도(Strength)를 달성할 수 있다.
강성은 외력에 대응하여 변형되지 않는 성질을 의미하고, 인성은 강한 충격에 잘 견디는 성질을 의미한다. 이 둘이 동시에 향상된 수치를 가질 경우 생체 이식용 스캐폴드는 압력 또는 충격에 의한 내성이 증가하여 쉽게 크랙 등이 발생하지 않는다. 이로 인해 바이오 글라스의 세라믹 재질이 갖는 취성을 보완할 수 있다.
인성 측정은 3점 굽힘 시험(3-point bending test)에 의해 수행하였고, 인성, 최대 굽힘 모멘트 및 최대 굽힘 응력, 3가지 파라미터를 얻는다.
인성은 50 kPa/㎣ 내지 850 kPa/㎣, 70 kPa/㎣ 내지 800 kPa/㎣, 100 kPa/㎣ 내지 800 kPa/㎣의 범위를 가지며, 바람직하기로는 600 kPa/㎣ 내지 800 kPa/㎣의 범위를 갖는다.
이때 최대 굽힘 모멘트는 25 N·mm 내지 70 N·mm, 30 N·mm 내지 65 N·mm, 35 N·mm 내지 650 N·mm이고, 바람직하기로는 45 N·mm 내지 60 N·mm의 범위를 갖는다.
또한, 최대 굽힘 응력은 3 MPa 내지 9 MPa, 3.5 MPa 내지 8.5 MPa, 4 MPa 내지 8 MPa, 가장 바람직하기로는 4.5 MPa 내지 7.5 MPa의 범위를 갖는다.
강성은 압축 시험기를 이용하여 측정할 수 있으며, 강성, 항복 변위 및 항복 응력, 3가지 파라미터를 얻는다.
강성은 1.5 N/mm 내지 20 N/mm, 1.8 N/mm 내지 15 N/mm, 2.0 N/mm 내지 10 N/mm, 바람직하기로 2.0 N/mm 내지 5 N/mm의 범위를 갖는다.
항복 변위는 0.3 mm 내지 0.8 mm, 0.35 mm 내지 0.7 mm, 바람직하기로 0.4 mm 내지 0.65 mm의 범위를 갖는다.
항복 응력은 3 MPa 내지 20 MPa, 4 MPa 내지 15 MPa, 4.5 MPa 내지 10 MPa, 바람직하기로 5 MPa 내지 10 MPa의 범위를 갖는다.
상기 물성과 함께, 본 발명의 생체 이식용 스캐폴드는 하기 언급하는 표면 특성 및 생체 활성 등의 여러 가지 활성을 동시에 갖는다.
일례로, 스캐폴드의 표면을 표면 거칠기 측정기(Nanoview-m4151p, Korea)로 측정한 거칠기도(Ra)가 130 nm 내지 260 nm, 135 nm 내지 250 nm, 140 nm 내지 240 nm의 범위를 갖는다.
또한, 친수성과 관련된 수접촉각 수치를 보면, 하기 수치를 갖는다. 상기 수접촉각은 스캐폴드 표면에 10 μL의 물방울을 놓고 상온(25℃)에서 정적법(Sessile drop)을 사용하여 수 접촉각을 측정하는 방식으로, 그 수치가 낮을수록 친수성을 가짐을 의미한다.
- 1초 후: 90도 이하, 40도~90도, 70도 이하, 43~70도
- 30초 후: 80도 이하, 0도~80도, 60도 이하, 20도~60도
- 180초 후: 75도 이하, 0도~75도, 30도 이하, 10도~30도
그리고, 본 발명의 생체 이식용 스캐폴드는 BCA(Bicinchoninic acid) 단백질 분석법(Pierce Kit, Thermo Scientific)을 이용하여 단백질 흡수력과 관련된 흡광도를 보면 0.19 내지 0.6 O.D.(광학밀도)의 범위를 가지며, 시간에 따라 하기 범위를 갖는다.
- 1시간 후 (O.D.): 0.19 이상 0.19~0.27, 0.22~0.25
- 6시간 후 (O.D.): 0.23 이상, 0.23~0.38, 0.26~0.35
- 12시간 후 (O.D.): 0.24 이상, 0.24~0.43, 0.30~0.39
- 24시간 후 (O.D.): 0.25 이상, 0.25~0.60, 0.40~0.59
세포 활성과 관련된 파라미터인 세포 파종 효율을 보면, 37% 이상, 40% 이상, 45% 이상의 수치를 나타낸다. 이때 상기 수치가 크면 클수록 세포 부착, 성장 및 분화가 잘 일어나 세포 활성이 활발해짐을 의미한다.
또한, 본 발명의 생체 이식용 스캐폴드는 관련된 세포증식반응 측정법(MTT Assay)에 의해 측정된 세포 증식율과 관련된 7일 배양 후 세포 증식 흡광도는 하기 범위를 갖는다. 이때 그 수치가 높을수록 세포 증식이 잘 일어남을 의미한다.
- 1일 후(%): 0.17 이상, 0.19 이상, 0.19~0.3
- 3일 후(%): 0.19 이상, 0.21 이상, 0.21~0.3
- 7일 후(%): 0.22 이상, 0.25 이상, 0.25~0.4
그리고, 본 발명의 생체 이식용 스캐폴드의 F-Actin 영역비를 보면, 22% 이상, 25% 이상, 28% 이상, 28% 내지 60%, 30% 내지 55%의 범위를 갖는다.
본 발명에 따른 생체 이식용 스캐폴드는
a) 소결 바이오 글라스와 생체적합성 고분자를 혼합하는 단계; 및
b) 사출 성형 단계를 포함하여 제조한다.
이하 각 단계별로 상세히 설명한다.
a) 혼합 단계
상기 물성은 소결 바이오 글라스와 생체적합성 고분자의 조합 및 함량비 조절을 통해 달성될 수 있다.
바이오 글라스란, 바이오 세라믹스 중 하나로 생체 내에 매립되어 주위에 섬유성 피막을 전혀 만들지 않고 주위의 뼈와 직접 접촉하여 강한 화학결합을 이루는 생체활성 세라믹 중 하나이다.
바이오 글라스는 CaO, SiO2, P2O5, B2O3 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 바이오 글라스는 CaO, SiO2, P2O5, B2O3 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하여, 무독성 및 인간 간엽줄기세포에서 뼈의 기본적인 미네랄 성분인 수산화인회석보다 우수하게 조골세포 분화를 유도하는 효과를 가진다. 또한 수산화인회석 대비 2배의 압축강도를 지니고 있어, 척추 사이 공간에 생체적합물질로 사용될 수 있다.
상기 CaO는 다른 세라믹 성분과 융합이 용이하여 전체 조성물의 유동성, 내구성 및 내수성에 기여하는 물질로써, 상기 바이오 글라스 총 중량에 대하여, 상기 CaO는 20 내지 60중량%인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 40 내지 50중량%이나, 이에 제한하지 않는다. 상기 CaO가 상기 바이오 글라스 총 중량에 대하여 20중량% 미만일 경우에 3D 프린터 성형품의 내구성 및 내수성이 떨어지는 효과를 나타낼 수 있으며, 상기 CaO가 상기 바이오 글라스 총 중량에 대하여 60중량% 초과할 경우에 3D 프린터 성형품의 취성이 높아지거나, 전체 조성물의 유동성이 떨어져 3D 프린팅 시 상기 조성물이 불균일하게 토출되는 문제점이 있다.
상기 SiO2는 투명성, 점도, 내구성, 낮은 융합 온도를 갖고 전체 조성물의 안정화에 기여하는 물질로써, 상기 바이오 글라스 총 중량에 대하여, 상기 SiO2는 15 내지 40 중량%인 바람직하며, 더욱 바람직하게는 30 내지 40 중량%이나, 이에 제한되지 않는다. 상기 SiO2는 해당 범위 내의 함량을 사용할 경우 생체활성도를 향상시키고 글라스 결정화를 우수하게 할 수 있다.
상기 P2O5는 스트렙토코커스 뮤탄스(streptococcus mutans)와 같은 세균의 번식을 억제할 수 있어 생체활성도를 높일 수 있다. 특히, 자연치아 또는 뼈에 많이 함유되어 있는 성분으로 유리상의 기지(glass matrix)를 형성할 수 있으며, 투과성을 높일 수 있다. 상기 P2O5는 상기 바이오 글라스 총 중량에 대하여, 6 내지 20중량%인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 12 내지 16중량%이나, 이에 제한되지 않는다. 상기 P2O5의 함량이 바이오 글라스 총 중량에 대하여 6중량% 미만일 경우에는 세균번식을 억제하는 효과와 유리상의 기지를 형성하는 효과가 미약하고, P2O5의 함량이 20중량%를 초과하는 경우에는 취성이 높아져 문제가 발생할 수 있다.
상기 B2O3는 유리 결정화를 향상시켜 기계적 강도 및 열 팽창율을 더욱 높일 수 있다. 상기 B2O3는 상기 바이오 글라스 총 중량에 대하여, 1중량% 이하인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 0.5중량% 이하이나, 이에 제한되지 않는다.
특히, 본 발명의 바이오 글라스는 상기 조성을 갖는 재질을 그대로 사용하는 것이 아니라 소결을 통해 결정화된 재질을 사용한다.
구체적으로, 바이오 글라스는 소결을 통해 결정화가 진행되며, 이후 제작되는 3D 프린터 성형품 고유의 강도와 경도를 증진시킬 수 있다. 이러한 소결 바이오 글라스의 사용을 통해 종래 성형품의 강도 향상을 위해 필수적으로 수행하던 소결 공정을 제외하더라도 최종 성형품의 강성 및 인성을 향상시킬 수 있고, 종래 바이오 글라스의 낮은 취성 문제를 해소할 수 있다.
소결 온도는 바이오 글라스 고유의 유리전이온도를 고려하여 다양하게 변경될 수 있다. 예를 들어, 소결하는 단계의 가열단계는 0.01 내지 0.8℃/min의 승온 속도로 온도를 점진적으로 상승시켜, 최고점 온도 800 내지 1200℃에 도달한 후, 최고점 온도에서 160 내지 200분간 소결시킬 수 있다. 급격한 온도 변화는 3D 프린터를 통해 소결 바이오 글라스가 사출된 형태의 유지를 어렵게 하여, 크랙 및 공극을 발생시키고 강도를 현저히 떨어지게 할 수 있다.
또한 소결하는 단계의 냉각단계에서 최고점 온도부터 10 내지 35℃까지 성형품의 온도를 냉각시킬 때에도, 0.01 내지 0.8℃/min의 냉각속도로 점진적으로 냉각시키는 것이 바람직하다. 0.8℃/min를 초과하여 온도를 냉각시킬 경우, 크랙이 발생하거나 공극이 발생하여 강도가 현저히 떨어지게 된다.
소결 단계의 최고점 온도는 최종 스캐폴드의 강도에 영향을 미치며, 생체 경조직 대체재로 사용하기 위해서는 800 내지 1200℃에서 소결되는 것이 바람직하다. 최고점 온도가 800℃ 미만일 경우, 압축강도가 떨어져 경조직 대체재로 사용이 불가능하다. 최고점 온도가 1200℃를 초과할 경우, 크랙이 발생될 수 있다.
생체 이식용 스캐폴드 제작 시 사출 성형 이후 소결 공정이 수행됨에 따라 소결 바이오 글라스가 아닌 소결하지 않은 바이오 글라스를 사용할 경우, 최종 얻어진 스캐폴드는 생체적합성 고분자 없이 소결 바이오 글라스만이 잔류한다. 이 경우, 높은 취성으로 인해 외부 충격이나 압력에 쉽게 크랙이 발생하여 스캐폴드로서 사용이 적절치 않다.
한편, 전술한 소결 바이오 글라스와 함께 혼합하는 생체적합성 고분자는 바인더 역할을 한다. 바인더는 미세한 입자의 소결 바이오 글라스를 서로 결합시켜 응집 및 점성을 갖게 하는 한편, 바이오 글라스가 우수한 인성을 가지도록 하여 내재적 취성의 문제를 극복할 수 있다. 또한, 소결 바이오 글라스와 바인더 역할을 하는 생체적합성 고분자가 혼합된 조성물을 용융시키면, 조성물에 유동성과 흐름성이 부여되어 사출이 용이할 수 있다.
대표적으로, 생체적합성 고분자로는 폴리(입실론-카프로락톤)(PCL, poly(ε-caprolactone)), 폴리에틸렌(PE, Polyethylene), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA, Poly(methyl methacrylate)), 폴리락틱산(PLA, Poly lactic acid), 폴리-L-락틱산(PLLA, Poly-L-lactic acid), 폴리글라이콜라이드(PGA, Polyglycolide), 폴리락틱산-글리콜산 공중합체(PLGA, Poly lactic-co-glycolic acid), 폴리염화비닐(PVC, Polyvinyl chloride), 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE, Polytetrafluoroethylene), 폴리에틸렌테레프탈레이트(PET, Polyethylene terephthalate), 폴리우레탄(Polyurethane), 폴리아세탈(Polyacetal), 폴리아미드(Polyamide), 폴리아미드 엘라스토머(Polyamide elastomer), 폴리에스터(Polyester), 폴리에스터 엘라스토머(Polyester elastomer), 폴리프로필렌(Polypropylene), 폴리아크릴로니트릴(Polyacrylonitrile), 폴리설폰(Polysulfone), 폴리오르토에스터(Polyorthoester), 폴리안하이드라이드(Polyanhydrides), 키토산, 젤라틴, 콜라겐 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함할 수 있다.
상기 생체적합성 고분자 중 바람직하기로 본 발명은 생분해성 고분자일 수 있다. 상기 생분해성 고분자는 기계적 강도조절이 가능하고, 가공이 용이하며, 합성조건에 따라 생분해 속도 조절이 가능하므로, 재료를 유용하게 활용할 수 있다. 바람직하기로, 상기 생분해성 고분자로는 폴리(입실론-카프로락톤), 폴리락틱산, 폴리-L-락틱산, 폴리글라이콜라이드, 폴리락틱산-글리콜산 공중합체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종이 가능하며, 더욱 바람직하기로는 폴리(입실론-카프로락톤)을 사용한다.
특히, 본 발명에서는 스캐폴드의 인성 및 강성뿐만 아니라 표면 거칠기도, 친수성, 단백질 흡수력 등의 특성을 만족시키기 위해, 상기 소결 바이오 글라스와 생체적합성 고분자 간의 함량을 제어한다.
바람직하기로, 소결 바이오 글라스는 조성물 총 중량대비 10 내지 70중량%, 바람직하게는 30 내지 50중량%, 35 내지 45중량%의 함량으로 사용한다. 만약 소결 바이오 글라스가 상기 범위 미만인 경우, 압축강도 등 바이오 글라스 고유의 기계적 물성이 약화될 수 있다. 반대로, 그 함량이 상기 범위를 초과하는 경우, 높은 점도로 인하여 조성물을 사출하기 어렵다.
또한, 생체적합성 고분자는 조성물 총 중량대비 30 내지 90중량%, 50 내지 70중량%, 55 내지 65중량%의 함량으로 사용한다. 만약 생체적합성 고분자의 함량이 상기 범위 미만인 경우 소결 바이오 글라스들 간의 결합력이 부족하거나, 상기 소결 바이오 글라스의 취성 개선이 어렵다. 반대로, 상기 범위를 초과할 경우 상대적으로 소결 바이오 글라스의 함량이 낮아져 최종 제작된 스캐폴드의 물성이 저하될 우려가 있다.
또한, 소결 바이오 글라스와 생체적합성 고분자의 함량 비는 FDM 3D 프린터를 이용하여 스캐폴드 제조시 점도(η*, Complex viscosity)에 관여한다. 즉, 소결 바이오 글라스는 비점탄성 특성을 가지며 그 함량이 증가할수록 사출 성형시 용융물의 점도가 증가한다. 높은 점도의 용융물은 사출 후 스트럿의 형상 및 공정의 품질에 영향을 줘, 스트럿의 직경 또는 두께 균일성의 확보가 어려울 수 있고, 노즐이 막힐 우려가 있다. 이에 상기 제시한 소결 바이오 글라스 및 생체적합성 고분자의 함량비를 통해 적절한 점도 범위를 확보할 수 있으며, 바람직한 점도 범위는 110 내지 800 Pa·s, 120 내지 700 Pa·s, 150 내지 500 Pa·s의 점도를 갖는다.
상기 소결 바이오 글라스는 소결 전후에서 분쇄 공정을 수행할 수 있다. 특히, 분쇄 후 소결 바이오 글라스의 평균 입도가 1.5 내지 2.5㎛이 되도록 조절한다. 이때 평균 입도는 입도 분석장비(APA2000, MALVERN)에 의해 측정된 값으로부터 (입자의 평균 직경 분포 중 누적된 50% 지점) 계산된다.
상기 분쇄 공정은 공지된 분쇄기면 어느 것이든 사용 가능하고, 일례로 동결 분쇄기(Freezer Mill)를 이용하여 수행한다.
또한, 소결 바이오 글라스와 생체적합성 고분자와의 균일한 혼합을 위해, 상기 생체적합성 고분자는 미리 소결 바이오 글라스와 유사한 범위로 분쇄한 후 사용하거나, 혼합 공정 중 분쇄 공정을 함께 수행할 수 있다.
b) 사출 성형 단계
다음으로, 상기 분쇄된 조성물을 사출 성형을 수행하여 생체 이식용 스캐폴드를 제작한다.
사출 성형은 FDM 3D 프린팅 방법이 사용될 수 있다.
FDM(Fused Deposition Modeling) 3D 프린터라 함은, 현재 상용되고 있는 FDM 3D 프린터 및 FFF(Fused Filament Fabrication) 3D 프린터를 포함하는 것으로, 용융과정을 거쳐 유동성 및 흐름성을 갖는 원료를 사출 및 적층하여 입체 성형품을 제작하는 3D 프린터를 가리킨다.
본 발명에 따른 FDM 3D 프린터용 조성물은 유동성, 흐름성 및 점성을 갖는 페이스트 형태이다. 즉, 본 발명에 따른 FDM 3D 프린터용 조성물은 사출이 가능한 3D 프린팅 장비라면 그 명칭을 불문하고 모두 적용될 수 있으므로, 상용되고 있는 FDM 및 FFF 3D 프린터에도 사용 가능하다.
3D 프린터에 연결된 가열장치는 25 내지 250℃의 온도 범위에서 작동하며, 상기 분쇄된 조성물을 용융시킬 수 있다. 각각 고체상태였던 소결 바이오 글라스와 생체적합성 고분자가 용융되어 페이스트 형태로 변형되면서, 조성물에 유동성과 흐름성이 부여되어 사출이 용이해질 수 있다.
사출 성형을 통한 스트럿의 기하학적 크기의 동일성 또는 유사성을 높이기 위해, 노즐 속도(Nozzle speed), 공기압(Pneumatic pressure) 및 가열온도(Processing temperature)와 같은 공정 파리미터의 최적화가 요구된다.
노즐 속도(mm/s)가 증가할수록, 각 스캐폴드의 스트럿 크기(μm)는 감소할 수 있다. 예를 들어, 120℃의 온도 및 400kPa의 공기압 조건에서 실험한 도 1a와 같이, 노즐 속도가 증가할수록 스트럿 크기는 감소할 수 있다. 또한 동일한 스트럿 크기를 제작하기 위해서는, 소결 바이오 글라스의 함량이 증가할수록 노즐 속도가 감소할 수 있다.
또한, 공기압(kPa)이 증가할수록, 각 스캐폴드의 스트럿 크기(μm)는 증가할 수 있다. 예를 들어, 120℃의 온도 및 5mm/s의 노즐 속도에서 실험한 도 1b와 같이 공기압이 증가할수록, 큰 유량과 조성물의 낮은 점도로 인하여 스트럿 크기는 증가할 수 있다. 또한 동일한 스트럿 크기를 제작하기 위해서는, 소결 바이오 글라스의 함량이 증가할수록 공기압이 증가할 수 있다.
온도(℃)가 증가할수록, 각 스캐폴드의 스트럿 크기(μm)는 증가할 수 있다. 예를 들어, 5mm/s의 노즐 속도 및 400kPa의 공기압 조건에서 실험한 도 1c와 같이 온도가 증가할수록, 큰 유량과 조성물의 낮은 점도로 인하여 스트럿 크기는 증가할 수 있다. 또한 동일한 스트럿 크기를 제작하기 위해서는, 소결 바이오 글라스의 함량이 증가할수록 온도가 증가할 수 있다.
종래 생체 이식용 스캐폴드의 제작 과정을 보면 사출 성형 이후 성형품의 강도 향상을 위해 필수적으로 소결 공정을 수행하는데 비해, 본 발명에서는 소결 바이오 글라스 및 생체적합성 고분자의 사용으로 인해 강성 및 인성을 충분히 만족시킬 수 있어, 상기 소결 공정이 제외될 수 있다. 이는 소결 바이오 글라스의 사용 및 함량 제어에 의해 얻어지며, 종래 미소결된, 즉 바이오 글라스를 사용하는 경우 낮은 취성에 따른 성형품의 깨짐 현상 등을 방지할 수 있다. 이러한 소결 공정이 제외됨 따라 공정이 단순화되고 비용을 절감할 수 있는데, 여기서 소결 공정이라 함은 사출 성형된 성형품을 1000℃ 이상 또는 500℃ 이상으로 가열하여 강도를 향상시키는 공정을 가리키나, 함유된 세라믹의 종류 및 함량에 따라 소결 온도는 변경될 수 있으므로, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 생체 이식용 스캐폴드는 인공골, 인공관절, 구강 악안면 골, 두개골 또는 치과용 인공치근 등에 사용될 수 있고, 척추유합술에 활용 가능한 디스크 형태의 인공골 또는 안면 재건술에 사용되는 인공골로 활용 가능하다.
[실시예]
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해 바람직한 실시예를 제시하지만, 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1: 소결 바이오 글라스 제조
CaO 139.8g, SiO2 113.7g, P2O5 45.6g, B2O3 0.9g의 건조 분말 각각을 용기에 주입 후 혼합하여 총 중량 300g의 바이오 글라스를 제조하였다.
상기 얻어진 바이오 글라스를 하기 조건에 의해 소결을 수행하여 소결 바이오 글라스를 얻었다.
(소결 조건)
0 →600℃: 720분
600℃(Holding): 60 분
600→1000℃: 800 분
1000℃(Holding): 180 분
1000→600℃ 및 600℃(Holding): 800 분
600→20℃: 720분
실시예 및 비교예: 생체 이식용 스캐폴드 제조
(1) 혼합 단계
제조예 1에서 얻어진 바이오 글라스를 볼밀(Ball mill)(High-Energy Ball Mill, FRITSCH)에 넣고, 2.1㎛의 평균 입도를 가지도록 분쇄하였다. 분쇄된 바이오 글라스를 폴리(입실론-카프로락톤)(poly(ε-caprolactone)(PURASORB PC12, CorbionPurac, 이하 'PCL'이라 한다)과 하기 표 1의 조성비로 혼합하여 각각 총 중량 100g의 조성물을 제조하였다.
상기 조성물을 동결 분쇄기(Freezer Mill)(6875D, SPEX Sampleprep)에 넣고, 2.1㎛의 평균입도를 가지도록 분쇄하였다.
(2) 사출 성형 단계
분쇄된 조성물을 FDM 3D 프린터(DTR3-331S-EX, 다사로봇시스템)에 연결된 가열 장치를 이용하여 용융하였다. 이어, 얻어진 페이스트 상태의 조성물을 상기 프린터 내 노즐(직경: 500㎛)에 충진 후, 사출구를 통해 6 x 6 x 2 ㎣ 크기로 조성물을 사출 및 작업대 상면에 Layer-by-layer 방식으로 적층시켰다.
Layer-by-layer 방식으로 조성물을 사출하는데, 첫번째 층의 사출방향을 기준으로, 두번째 층의 사출방향은 45°, 세번째 층의 사출방향은 90° 및 네번째 층의 사출방향은 135°를 이루며 교차하는 도 1과 같은 4방향의 스트럿이 적층된 스캐폴드를 제작하였다.
소결 바이오 글라스 (중량%) PCL (중량%) 용융온도(℃) 공정시간(min) 노즐 속도(mm/s) 공기압(kPa)
실시예 1 20 80 120 2 5 320
실시예 2 40 60 120 2 5 450
실시예 3 60 40 140 2 5 500
비교예 1 100 0 25 2 5 430
비교예 2 0 100 100 2 5 480
실험예 1: 공정 파라미터 선정
실시예 1 내지 3의 조성을 이용하여 사출 성형 공정에서의 속도, 공기압, 온도 및 점도에 대한 시험을 수행하여 최적의 공정 파라미터를 선정하였다.
도 2는 실시예 1~3, 비교예 1~2에서 제조한 공정 파라미터 대비 스트럿의 물성 변화를 보여주는 그래프이다.
도 2(a) 내지 도 2(c)를 보면, 스트럿의 직경은 노즐 속도, 소결 바이오 글라스의 함량, 및 용융 온도에 영향을 받음을 알 수 있다. 일례로, 소결 바이오 글라스의 함량이 증가할수록 스트럿의 직경은 작아지고, 공기압과 바이오 글라스의 함량이 증가할수록 스트럿의 직경이 증가하는 경향을 보였다.
도 2(d)의 점도는 직경 20mm 및 갭 2mm의 평행한 플레이트 형상에 설치된 회전형 점도계(Bohlin Gemini HR Nano, Malvern Instruments, Surrey, UK)를 이용하여 측정하였으며, 주파수 스윕(frequency sweep)은 1%의 변형율 및 140℃에서 실시되었다. 도 2(d)를 참조하면, 소결 바이오 글라스의 함량이 증가할수록 점도가 높아짐을 알 수 있다.
도 2의 결과를 통해, 소결 바이오 글라스/PCL의 함량 조절에 의해 생체 이식용 스캐폴드에 적용하기 위한 최적의 스트럿 직경(Strut diameter, 390 - 425 ㎛)에 적합한 공정 조건을 설정하였으며, 이는 상기 실시예의 공정 조건에 반영하였다.
실험예 2: 스트럿 구조 분석
(1) 기공 특성
상기 실시예 1~3 및 비교예 1~2에서 제작된 스캐폴드의 스트럿 직경, 공극 크기 및 기공율을 측정하였고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 공극 크기는 주사 전자 현미경(SEM, SNE-3000M, SEC Inc., 대한민국)을 사용하여 측정하였고, 기공율은 하기 식 및 벌크밀도(ρ)(PCL(1.135 g/cm3) / 바이오 글라스(3.05 g/cm3)의 값을 이용하여 계산하였다.
[식 1]
기공율(%) = (1 - (1/ρs) x (Ws/Va)) x 100
(ρ: 벌크밀도, Ws: 구조의 무게, Va: 구조의 부피)
스트럿 직경(㎛) 첫번째 공극크기(㎛) 두번째 공극크기 (㎛) 기공율 (%)
실시예 1 424.3 ± 7.7 400.7 ± 10.2 214.3 ± 14.1 42.5 ± 2.1
실시예 2 401.4 ± 16.3 415.7 ± 14.4 222.9 ± 16.7 43.1 ± 1.0
실시예 3 420.7 ± 9.2 412.1 ± 7.0 216.4 ± 20.5 42.3 ± 1.2
비교예 1 392.5 ± 20.1 391.5 ± 9.1 207.7 ± 20.7 46.8 ± 3.0
비교예 2 400.7 ± 4.7 439.3 ± 14.3 221.4 ± 13.6 43.1 ± 1.5
상기 표 2를 보면, 스트럿은 직경이 390~425㎛를 가지고, 바이모달 형태의 기공을 가지며, 기공율이 42~47% 범위에 속함을 알 수 있다.
(2) 현미경 분석
도 3은 실시예 1~3 및 비교예 1~2에서 제작된 스캐폴드 및 스트럿을 보여주는 도면이다.
도 3의 첫줄의 이미지는 광학 현미경(BX FM-32, Olympus, Tokyo, Japan) 이미지로, 4층의 스트럿이 적층된 스캐폴드가 제작되었음을 알 수 있다.
도 3의 두번째줄 내지 네번째줄의 이미지는 주사 전자 현미경(SEM, SNE-3000M, SEC Inc., 대한민국) 이미지로, 다층의 스트럿이 각각 소정의 비틀림 각으로 배치되어 있으며, 그 표면에 기공이 기공이 형성되어 있음을 알 수 있다. 상기 스트럿 표면의 기공은 조직 재생 시 세포부착 및 뼈 조직 분화를 촉진할 수 있는 거친 표면을 제공한다.
도 3의 다섯번째줄 및 여섯번째줄의 이미지는 전계방사주사전자현미경(JSM7500F, JEOL LTD.)을 가지고 EDS(Energy-dispersive Spectroscopy) 시험 결과 및 Ca와 Si의 분포지도(Mapping)이다. 이 들 이미지를 보면, 스트럿은 Ca와 Si를 포함하고, 바이오 글라스 조성비가 증가할수록 스트럿 내 Ca와 Si의 농도가 증가한다는 것을 알 수 있다.
실험예 3: 조성물 분석
상기 실시예 1~3 및 비교예 1~2의 스캐폴드 제작에 사용된 조성물(분쇄 단계 이후)의 열중량 분석 및 X-선 회절 분석을 수행하였고, 얻어진 결과를 도 4에 나타내었다.
(1) 열중량 분석(TGA, Thermogravimetric analysis)
각각의 조성물 10mg을 20℃/min의 승온속도로 30℃에서 800℃까지 가열하여, 질소 조건하에서, 열중량분석기(TGA-2050, TA-Instruments)를 이용하여 열중량 분석을 실시하였다.
도 4(a)는 실시예 1~3 및 비교예 1~2의 스캐폴드 제작에 사용된 조성물의 TGA 그래프이다. 도 4(a)를 보면, 소결 바이오 글라스만으로 이루어진 비교예 1의 경우 PCL의 부재로 중량 변화가 없었으며, PCL로만 이루어진 비교예 2의 경우에는 500℃ 조건에서 열분해가 완전히 이루어졌음을 알 수 있다. 이와 비교하여, 실시예 1 내지 3의 조성물의 경우, 혼합된 소결 바이오 글라스의 중량만큼 잔류되어 있음을 확인하였다.
(2) X선 회절 분석(XRD, X-ray diffraction)
결정 크기를 측정하기 위해서, 40kV 및 20mA의 빔 조건에서 CuKα 방사선을 사용하는 X선 회절 분석기(Siemens D500 WAXD, Siemens)를 이용하였다. 2θ = 15-35°이고, 스텝크기(Step size)는 0.1°인 조건에서 상기 X선 회절 실험을 실시하였다.
도 4(b)는 실시예 1~3 및 비교예 1~2의 스캐폴드 제작에 사용된 조성물의 X-선 회절 스펙트럼이다. 도 4(b)를 보면, 비교예 2는 PCL의 결정면(110)과 (200)과 관련된 2θ= 21.3°, 23.7°에서 가장 강한 피크를 나타내었다. 또한 비교예 1은 소결 바이오 글라스 내 수산화인회석 구조의 결정면(211)과 관련된 2θ= 31.8°인 피크가 나타났다.
이와 비교하여, 실시예 1~3의 조성물의 경우 상기 피크들이 함께 포함되어 있어, 조성물 내에 소결 바이오 글라스와 PCL이 적절히 혼재되어 있음을 알 수 있다.
실험예 4: 스캐폴드: 물성 분석
상기 실시예 1~3 및 비교예 1~2에서 제작된 스캐폴드의 인성 관련 물성을 확인하기 위해, 하기와 같이 인성 및 강성에 대한 실험을 실시하였고, 얻어진 결과를 하기 표 3 및 도 5에 나타내었다.
- 최대 굽힘 모멘트, 최대 굽힘 응력 및 인성: 속도가 0.5mm/min인 3점 굽힘 실험 측정장치(MTS Bionix Tabletop Test System, MTS System Corp., MN, USA)를 통하여 굽힘 실험을 수행, 시료 (30 x 4 x 3㎣ 크기)
- 강성, 항복 변위 및 항복 응력: 압축율(Compression rate)이 0.5mm/min인 압축강도 측정장치(MTS Bionix Tabletop Test System, MTS System Corp., MN, USA)로 측정, 시료 (10 x 10 x 5㎣ 크기)
실시예 1 실시예 2 실시예 3 비교예 1 비교예 2
3점굽힘시험 최대굽힘모멘트(N mm) 55.8 ± 0.5 47.6 ± 0.9 38.1 ± 0.5 74.7 ± 6.8 37.3 ± 1.8
최대굽힘응력(MPa) 6.3 ± 0.1 5.6 ± 0.2 4.3 ± 0.2 7.8 ± 0.7 4.6 ± 0.2
인성(kPa mm_3) 760 ± 41.7 710 ± 5.48 100 ± 22.7 5.9 ± 0.9 480 ± 46.2
압축시험 강성(N/mm) 2.5 ± 0.1 2.9 ± 0.1 2.9 ± 0.2 25.9 ± 6.3 1.1 ± 0.1
항복변위(mm) 0.6 ± 0.03 0.5 ± 0.04 0.5 ± 0.06 0.2 ± 0.01 0.4 ± 0.02
항복응력(MPa) 6.1 ± 0.2 6.6 ± 0.1 5.8 ± 0.6 21.2 ± 5.8 2.6 ± 0.2
상기 표 3 및 도 5를 보면, 소결 바이오 글라스를 단독으로 사용한 비교예 1의 스캐폴드의 경우 강성은 매우 높으나 인성이 매우 낮은 결과를 보였다. 또한, PCL을 단독으로 사용한 비교예 2의 스캐폴드는 비교예 1과 반대로, 낮은 수치의 강성 및 높은 수치의 인성을 나타내었다. 생체 이식용 스캐폴드로 사용하기 위해선 강성 및 인성 수치는 비교예 1, 2와 같이 한쪽으로 치우친 것이 아니라, 이들의 적절한 조화가 이루어져야 한다. 이에 실시예 1 내지 3의 스캐폴드의 경우 약 50 내지 850 (kPa/㎣)범위의 인성과, 2 내지 3 N/m 범위를 동시에 만족시키는 결과를 보였다.
실험예 5: 스캐폴드: 표면 특성 분석
(1) 표면 거칠기(Surface roughness) / 3D 표면 지형 이미지(3D surface topographical images) 측정
위상 이동 간섭계를 사용하여 3D 표면 지형 이미지를 얻어 스캐폴드의 표면 거칠기에 대한 분석을 수행하였다. 도 6을 보면, 실시예 1 내지 3 및 비교예 1의 스캐폴드들의 표면이 더 거칠다는 것을 확인하였다.
이러한 거칠기도에 대한 정성 분석을 위해, 표면 거칠기 측정기(Nanoview-m4151p, Korea)를 이용하여 하기 식에 의해 표면 거칠기 값(Ra)을 얻었다.
[식 2]
Ra = [∫|Z(x)|dx]/L (Fig4(c)의 Z와 L은 거친 구조의 높이와 길이)
표면 거칠기(Ra) (단위: nm)
실시예 1 144.7 ± 31.9
실시예 2 168.1 ± 26.3
실시예 3 234.3 ± 41.7
비교예 1 284.6 ± 55.4
비교예 2 118.5 ± 14.9
상기 표 4를 보면, 생체적합성 고분자 단독으로 사용한 비교예 2 대비 바이오 글라스를 포함할수록 표면 거칠기도가 증가함을 알 수 있다. 이를 통해 표면 거칠기도는 사용하는 소결 바이오 글라스/PCL의 함량비에 따라 조절 가능함을 알 수 있다.
(2) 수 접촉각(water contact angle) 측정
수 접촉각 측정장치를 사용하여 실시예 1~3, 비교예 1~2에서 제작한 스캐폴드의 친수성을 평가하였고, 그 결과를 표 5에 나타내었다.
친수성 평가는 각각의 스캐폴드 표면에 10 μL의 물방울을 놓고 상온(25℃)에서 정적법(Sessile drop)을 사용하여 수 접촉각을 측정하는 방식으로 진행하였다.
수접촉각 1 초 30초 180초
실시예 1 67 ± 2° 58 ± 5° 26 ± 3°
실시예 2 46 ± 3° 34 ± 4° 20 ± 3°
실시예 3 45 ± 2° 26 ± 3° 14 ± 3°
비교예 1 39 ± 3° 0° 0°
비교예 2 93 ± 4° 82 ± 4° 78 ± 3°
상기 표 5를 보면, PCL 단독으로 사용한 비교예 2(78 ± 3 °) 대비 소결 바이오 글라스를 포함할수록 접촉각이 감소함을 알 수 있다. 소결 바이오 글라스를 20 중량% 함유한 실시예 1의 스캐폴드의 경우 수 접촉각이 26 ± 3 °를 나타내었다. 이를 통해 수접촉각, 즉, 스캐폴드의 친수성은 사용하는 소결 바이오 글라스/PCL의 함량비에 따라 조절 가능함을 알 수 있다.
실험예 6: 스캐폴드: 조직 재생 응용 가능성
상기 실시예 1~3 및 비교예 1~2에서 제작된 스캐폴드의 생체 적용을 확인하기 위해, 하기와 같이 분석을 실시하였고, 얻어진 결과를 하기에 나타내었다.
(1) 단백질 흡수력(protein absorption ability) 측정
단백질 흡수력을 측정하기 위하여, BCA(Bicinchoninic acid) 단백질 분석법(Pierce Kit, Thermo Scientific)이 사용되었다. 10%의 태아 소혈청(Gemini Bio-Products, USA)과 1%의 항생제(Antimycotic, Cellgro, USA)를 포함하는 α-최소 필수배지(Life Sciences, USA)를 포함하는 24-웰 플레이트(Well plate)에 스캐폴드를 놓았다. 그런 다음 각각의 스캐폴드를 1, 6, 12, 24시간 동안 37℃에서 배양했다. 흡광도를 측정하기 전에, 각각의 스캐폴드를 PBS(phosphate　buffer　saline)로 세정하고, 0.1 % Triton X-100으로 용해시켰다. 그런 다음 용해물 25μL를 BCA 작업시약 200μL에 첨가했다. 마지막으로, 혼합물을 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 마이크로 플레이트 판독기(EL800, Bio-Tek Instruments, Winooski, VT)를 사용하여 562nm에서 흡광도를 측정하였다.
1, 6, 12, 24시간 후, 실시예 1 내지 3 및 비교예 1 내지 2의 단백질 흡수력에 대한 측정 결과를 하기 표 6에 나타냈다.
흡광도(O.D.) 1 h 6 h 12 h 24 h
실시예 1 0.2215 ± 0.03339 0.274 ± 0.00726 0.31167 ± 0.05856 0.41133 ± 0.04027
실시예 2 0.22733 ± 0.0344 0.2945 ± 0.000866 0.36433 ± 0.01872 0.48367 ± 0.05622
실시예 3 0.24717 ± 0.02434 0.3425 ± 0.03339 0.389 ± 0.03205 0.57733 ± 0.03921
비교예 1 0.28033 ± 0.01892 0.38967 ± 0.04119 0.44533 ± 0.8969 0.62867 ± 0.04027
비교예 2 0.179 ± 0.02498 0.22327 ± 0.02839 0.23383 ± 0.04221 0.24183 ± 0.02811
표 6을 보면, PCL을 단독으로 사용한 비교예 2 대비, 소결 바이오 글라스를 포함하는 비교예 1과 실시예 1~3의 스캐폴드는 시간이 경과함에 따라서 단백질 흡수력이 증가하는 경향을 나타내었다. 특히, 소결 바이오 글라스의 함량이 증가할수록 단백질의 흡수력이 증가하였다. 이러한 결과는 단백질의 아민 그룹과 스캐폴드 내의 음전하를 띠는 소결 바이오 글라스의 성분 사이에 정전기력의 비가역적 상호 작용에 기인한다.
(2) 시험관 내 스캐폴드에서의 세포 활성
세포 파종 효율
실시예 1~3 및 비교예 1~2에서 제작한 스캐폴드(6×6×2㎣)를 자외선 하에서 70% 농도의 에탄올(Ethanol)로 멸균하였다. 각각의 스캐폴드에 쥐 전조골세포조직(MC3T3-E1)이 1×105cells/mL의 밀도로 뿌려진 다음, 10%의 태아 소혈청(Gemini Bio-Products, USA)과 1%의 항생제(Antimycotic, Cellgro, USA)를 포함하는 α-최소 필수배지(Life Sciences, USA)를 포함하는 24-웰 플레이트(Well plate)에 스캐폴드를 놓았다. 표본은 5% CO2 및 37℃ 조건에서 배양되었으며, 배양기는 매일마다 교체하였다.
세포 파종 효율(%)
비교예 2 36.97689 ± 3.32317
실시예 1 45.75389 ± 2.59645
실시예 2 57.15178 ± 6.38773
실시예 3 62.14866 ± 5.10196
상기 표 7을 보면, 소결 바이오 글라스를 함유할수록 스캐폴드의 세포 파종 효율이 증가하는 경향을 나타내었다. 이는 소결 바이오 글라스로 인해 스캐폴드의 표면 거칠기도, 친수성이 증가하고, 단백질 흡수력과 생화학적 특성에 기인하는 것으로, 상기 소결 바이오 글라스/PCL의 함량비에 따라 단백질 흡수 능력 향상 및 초기 세포부착, 성장, 분화와 같은 다양한 세포 활동이 활발해져 세포 부착 능력의 조절이 가능함을 알 수 있다.
세포 증식 효율
세포증식반응 측정법(MTT Assay)(Cell Proliferation Kit I, Boehringer Mannheim)을 통해서 생존 세포를 결정하였다. Sample에는 0.5mg/mL의 MTT를 가하고 37℃ 조건에서 4시간 동안 배양하였다. 그 후, 570nm에서 마이크로 플레이트 리더(EL800, Bio-Tek Instruments, Winooski, VT)를 사용하여 흡광도를 측정하였다.
흡광도(O.D.) 1일 후 3일 후 7일 후
비교예 2 0.16675 ± 0.00768 0.1845 ± 0.0058 0.21375 ± 0.01053
실시예 1 0.19175 ± 0.0075 0.21725 ± 0.00806 0.25025 ± 0.01415
실시예 2 0.243 ± 0.02574 0.26775 ± 0.01276 0.334 ± 0.02099
실시예 3 0.265 ± 0.03238 0.2885 ± 0.02927 0.368 ± 0.03735
표 8의 MTT 분석결과를 보면, 상기 표 7의 세포 파종 효율과 유사하게 소결 바이오 글라스의 함량이 증가할수록 세포 증식 또한 증가하는 경향을 확인하였다. 이를 통해 소결 바이오 글라스/PCL의 함량비에 따라 세포 증식 경향을 조절할 수 있음을 알 수 있다.
F-Actin
세포핵을 검출하기 위하여, 스캐폴드를 Diamidino-2-phenylindole(DAPI, Invitrogen, Carlsbad, CA)의 형광 염색에 노출시켰다. 또한 액틴 세포골격을 시각화하기 위해서 Phalloidin(Alexa Fluor 594; Invitrogen, Carlsbad, CA)의 염색을 실시하고, 상기 염색된 세포를 공초점현미경(LSM 700; Carl Zeiss, Germany)을 통해 관찰하였다.
도 7은 세포배양 3일 후에 청색으로 염색된 세포핵과 적색의 F-Actin의 이미지이고, 하기 표 9는 F-Actin이 가지는 영역비를 보여준다.
F-Actin 영역비(%)
비교예 2 21.52767 ± 2.47724
실시예 1 30.97167 ± 6.79412
실시예 2 43.029 ± 3.09069
실시예 3 53.644 ± 5.98447
도 7 및 표 9를 보면, 상기와 같이 소결 바이오 글라스의 함량 증가에 의해 F-Actin의 영역이 점진적으로 증가한다.
(3) 유전자 발현 측정
Type-I collagen(Col-I), Runt-related transcription factor(Runx2), Alkaline phosphatase(ALP), Osteopontin(OPN), Osteocalcin(OCN), Bone Morphogenic Protein 2(BMP2)의 상대적인 발현 정도 측정을 위해서, 각각의 스캐폴드에서 7일 동안 배양된 상기 MC3T3-E1 세포의 실시간 중합효소연쇄반응을 실시하였다.
TRIzol 시약(Sigma-Aldrich)을 사용하여 배양된 스캐폴드로부터 Total RNA를 분리하였고, 이로부터 cDNA를 합성하였다. 역전사(Reverse Transcription) 반응에는 ReverTra Ace qPCR RT Master Mix(Toyobo, Japan)가 사용되었다. 또한 cDNA는 ABI Step One Plus를 사용하여 THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix(Toyobo, Japan)에 의해 증폭되었다. cDNA 증폭은 먼저, 95℃에서 1분간 변성 이후 95℃에서 15초, 60℃에서 60초, 72℃에서 15초간의 사이클을 40회 반복하고, 마지막으로 72℃에서 5분간 cDNA를 연장하였다.
유전자 특정 프라이머(Gene-specific primer)는 runx2 (forward: 5′- ACATCCCCATCCATCCAT-3′, reverse: 5′-GGTGCTGGGTTCTGAATCTG-3′), OPN (forward: 5′-GGAGGAAACCAGCCAAGG-3′, reverse: 5′-TGCCAGAATCAGTCACTTTCAC-3′), OCN (forward: 5′-CCCTCCTGAAGGTCTCACAA-3′, reverse: 5′-GCTGTCTCCCTCATGTGTTG-3′), Col-I (forward: 5′-ACTCAGCCGTCTGTGCCTCA-3′, reverse: 5′-GGAGGCCTCGGTGGACATTA-3′), ALP (forward: 5′-GCCCAGTGCCTTCTGATTT-3′, reverse: 5′-GGGCAGCGTCAGATGTTAAT-3′), BMP2 (forward: 5′- AGA TCT GTA CCG CAG GCACT-3′, reverse: 5′-GTTCCTCCACGGCTTCTTC-3′), the housekeeping gene mouse GAPDH (forward: 5′-CCTTGAGATCAACACGTACCAG-3′, reverse: 5′-CGCCTGTACACTCCACCAC-3′)이다.
구분 상대 발현도 (Relative expression)
ALP/GAPDH 비교예 2 1 ± 0.22087
실시예 1 1.33828 ± 0.38901
실시예 2 2.77655 ± 0.09479
실시예 3 3.58484 ± 0.40055
BMP-2/GAPDH 비교예 2 1 ± 0.35537
실시예 1 2.9804 ± 0.58307
실시예 2 4.81805 ± 0.66508
실시예 3 6.10637 ± 0.86176
Col/GAPDH 비교예 2 1 ± 0.06532
실시예 1 13.14175 ± 0.60236
실시예 2 18.40076 ± 0.88642
실시예 3 21.20035 ± 1.86857
OPN/GAPDH 비교예 2 1 ± 0.04191
실시예 1 3.93551 ± 0.31252
실시예 2 10.18773 ± 0.5399
실시예 3 13.43262 ± 3.01044
RUNX-2/GAPDH 비교예 2 1 ± 0.13509
실시예 1 18.59516 ± 0.55741
실시예 2 40.86318 ± 5.59465
실시예 3 48.70381 ± 10.47568
OCN/GAPDH 비교예 2 1 ± 0.02964
실시예 1 1.27795 ± 0.06102
실시예 2 2.40561 ± 0.24953
실시예 3 3.0789 ± 0.22572
상기 표 10을 보면, 실시예 1~3, 비교예 1~2의 스캐폴드의 경우 소결 바이오 글라스의 함량이 증가할 수록 유전자 발현 수준 또한 증가하는 경향을 나타내었다. 이를 통해 바이오 글라스가 골 형성 분화 및 생물학적 활성에 영향을 미치고, 높은 유전자 발현 수준을 확보하기 위해선 소결 바이오 글라스/PCL의 함량비 제어가 필요함을 알 수 있다.
실험예 7: 소결 바이오 글라스/PCL 최적 함량비
생체 이식 용도에 적합하도록 상기 실시예 및 비교예에서 제작한 스캐폴드의 인성, 세포 파종 효율, 세포증식 속도, 및 소모 관련 전사 요소를 평가하여 도식화하고 각각의 광학 이미지를 나타내었다.
도 8은 비교예 2, 실시예 1~3의 스캐폴드의 종합 평가를 보여주는 도면이다. 도 8을 보면, 소결 바이오 글라스/PCL을 동시에 함유한 실시예 1~3의 스캐폴드가 비교예 2 대비 전체적으로 우수한 경향을 나타내었다. 이 중에서도 실시예 1~2, 보다 바람직하기로 실시예 2의 스캐폴드의 경우 전체적인 평가 면에서 가장 우수함을 알 수 있다.

Claims (14)

  1. 서로의 위에 필수적으로 배치되고, 상하로 서로 교차하면서 기공을 만드는 복수 개의 스트럿이 다층으로 적층된 구조를 가지며,
    상기 스트럿이 소결 바이오 글라스 및 생체적합성 고분자를 포함하는 생체 이식용 스캐폴드.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 스트럿은 생체적합성 고분자 매트릭스 내에 소결 바이오 글라스 입자가 분산된, 생체 이식용 스캐폴드.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 소결 바이오 글라스 입자는 평균 입도가 1.5 내지 2.5㎛인, 생체 이식용 스캐폴드.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 스트럿은 직경이 300㎛ 내지 500㎛인, 생체 이식용 스캐폴드.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 스트럿은 2층 이상의 적층 구조를 갖는, 생체 이식용 스캐폴드.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 스트럿은 동일 층 내에서 서로 연결되거나 단절된 상태로, 선형, 파형, 격자형, 지그재그형, 나선형을 포함하는 규칙적인 패턴, 또는 불규칙 패턴으로 평행하게 형성된, 생체 이식용 스캐폴드.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 스트럿은 층 간 평균 변형각이 30도 내지 60도인, 생체 이식용 스캐폴드.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 생체 이식용 스캐폴드는 바이모달 형태의 기공 크기 분포를 가지며, 기공율이 30% 내지 60%인, 생체 이식용 스캐폴드.
  9. 제1항에 있어서,
    50 kPa/㎣ 내지 850 kPa/㎣의 인성 및 1.5 N/mm 내지 20 N/mm의 강성을 갖는, 생체 이식용 스캐폴드.
  10. 제1항에 있어서,
    130 nm 내지 260 nm의 거칠기도(Ra) 및 180초 이후 75도 이하의 수접촉각을 갖는, 생체 이식용 스캐폴드.
  11. 제1항에 있어서,
    24시간 이후 단백질 증식 흡광도가 0.25 O.D.이상이고,
    세포 파종 효율이 37% 이상이며,
    7일 배양 후 세포 증식 흡광도가 0.22 O.D.이상이고,
    F-Actin이 가지는 영역비가 22% 이상인, 생체 이식용 스캐폴드.
  12. 제1항에 있어서,
    소결 바이오 글라스와 생체적합성 고분자를 혼합한 후 사출 성형하여 제조하는 생체 이식용 스캐폴드.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 혼합은 소결 바이오 글라스 10 내지 70 중량%와 생체적합성 고분자 30 내지 90 중량%를 포함하는, 생체 이식용 스캐폴드.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 사출 성형은 열용해 적층방법을 이용한 3D 프린터로 수행하는, 생체 이식용 스캐폴드.
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