KR101506704B1 - 3d 프린팅에 의한 고밀도폴레에틸렌 기반의 안면 이식용 다공성 스캐폴드와 이의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 고밀도폴레에틸렌 기반의 안면 이식용 다공성 스캐폴드와 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 3D 프린팅에 의해 3차원 형상으로 성형함으로써 의도한 스캐폴드의 형상을 정확하게 구현할 수 있으며 기공의 크기와 형태까지 자유롭게 조절할 수 있는 안면 이식용 다공성 스캐폴드와 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 3D 프린팅에 의한 고밀도폴레에틸렌 기반의 안면 이식용 다공성 스캐폴드는 고밀도 폴리에틸렌(High density Polyethylene)과 생체활성물질을 혼합한 복합소재를 3D 프린팅에 의해 다공 구조로 형성한 다공성 지지체와, 플라즈마에 의해 표면처리되어 상기 다공성 지지체의 일면에 형성된 표면처리층을 구비한다.

Description

3D 프린팅에 의한 고밀도폴레에틸렌 기반의 안면 이식용 다공성 스캐폴드와 이의 제조방법{Porous scaffold based on high density poly ethylene using 3D printing and manufacturing method thereof}
본 발명은 고밀도폴레에틸렌 기반의 안면 이식용 다공성 스캐폴드와 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 3D 프린팅에 의해 3차원 형상으로 성형함으로써 의도한 스캐폴드의 형상을 정확하게 구현할 수 있으며 기공의 크기와 형태까지 자유롭게 조절할 수 있는 안면 이식용 다공성 스캐폴드와 이의 제조방법에 관한 것이다.
환자의 안면 또는 두부의 다른 부위 일부가 손상 또는 손실되었거나 외상, 선천적 결함으로 인해 결손된 경우 손상 또는 손실된 조직의 대체 또는 확대를 위해 물질을 체내에 완전히 이식하는 것이 유용하다. 또한, 미용상의 이유로 안면 특성을 개선하기 위한 물질을 이식하는 것이 바람직하다.
안면 및 두부 조직의 대체술 또는 확대술에 통상적으로 사용되는 물질은 환자의 두부, 안면 또는 신체의 다른 부분으로부터 얻어진 이식편이다.
이식편이 환자 자신의 신체로부터 얻어진 경우에는 자가이식편(autograft)으로서 언급된다. 자가이식편에 대한 대안은 동종이식편 (allograft)으로서, 이는 인간 공여자 조직으로부터 수거되어 전형적으로 감염 또는 자가면역 반응의 촉발을 최소화하기 위해 처리된 물질을 의미한다. 또 다른 대안은 이종이식편(xenograft)의 사용으로서, 이는 동물 조직 유래의 이식물을 의미한다. 또 다른 외과적 이식물질은 이물성형재(alloplast)로서 언급되며, 이는 합성 물질로부터 제조된 이식물을 의미한다.
자가이식편으로는 환자 신체의 다른 부분으로부터 외과적으로 수거된 물질이 요구되고, 따라서 물질을 수거하기 위해 필요한 제2의 또는 다수의 외과적 부위와 관련된 공여 부위 이환성 및 효용성 결여의 문제가 있다. 또한, 많은 경우에 자가이식편은 형상 변화, 수축 또는 흡수가 일어나 원하는 재건적 또는 심미적 결과가 손상될 수 있다.
동종이식편 및 이종이식편은 바이러스 감염 전달 또는 프리온 전달, 제한된 효용성의 가능성을 갖고, 또한 동종이식편 및 이종이식편도 형상 변화, 수축 또는 흡수가 일어나 원하는 재건적 또는 심미적 결과가 손상될 수 있다.
합성 이식물은 공여 부위 질병이 없고, 사용이 용이하고, 저가이며 준비가 용이한 이점을 갖는다. 가장 통상적인 합성 이식 물질은 티타늄, 실리콘, 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 폴리에틸렌이다.
티타늄, 실리콘, PMMA, PTFE 및 폴리에틸렌은 다양한 재건적 또는 심미적 요구에 적합한 다양한 형상 및 크기의 경질 또는 반-경질 형태로 제조될 수 있다. 이러한 이식물의 예로는 함몰(recessive) 턱 또는 광대뼈의 확대 형상물, 안와 또는 두개골의 결손된 뼈를 대체하기 위한 경직 시트, 또는 두개골, 안와 상악골 또는 그 밖의 부위의 결손된 뼈를 대체하기 위한 복합 맞춤 형상물을 들 수 있다. 이들 물질의 구조적 일체성은 많은 이식 용도에 있어서 중요한 특징이다.
합성 이식물 중의 하나가 스캐폴드(scaffold)이다. 인체 조직의 재생을 위해 사용되는 지지체인 스캐폴드 재료의 주된 요건은 다음과 같다. 먼저 가장 기본적으로는 조직세포가 잘 유착되어야 하며, 또한 조직세포가 재료 표면에 유착하여 3차원적 구조를 가진 조직을 형성할 수 있도록 기계적 강도를 가져야 한다. 또한 이식된 세포와 숙주세포 사이에 위치하는 중간 장벽으로서의 역할도 해야 하는데 이를 위해서는 이식 후 혈액응고나 염증반응이 일어나지 않는 무독성의 생체적합성이 있어야 한다.
3차원 스캐폴드를 제작하기 위한 기술로서 대한민국 공개특허 제2012-0045480호에 염침출법을 이용한 세포구조체의 제조 방법이 개시되어 있고, 대한민국 공개특허 제2001-0046941호에 생체조직공학용 다공성 생분해성 고분자 지지체의 제조 방법이 개시되어 있다.
상기와 같이 종래의 기술은 염침출법(solvent-casting particulate leaching), 염발포법(gas foaming), 섬유 메쉬/섬유 접착법(fiber meshes/fiber bonding), 상분리법 (phase separation), 용융 몰딩법(melt moulding), 동결 건조법(freeze drying) 등의 방법에 의해 스캐폴드를 제작한다.
그러나 종래의 스캐폴드는 3차원 형상이 제한적이며, 공극의 크기와 공극률 및 공극간 상호연결성을 설계자의 의도대로 정확히 제어할 수 없으며, 이로 인해 작업자의 숙련도와 제조 환경의 변화에 대한 의존도가 높고, 재생산성(reproducibility)이 현저하게 저하되는 문제점이 있다. 또한, 특정 위치에 이식될 때 이식부위와 형상이 정확하게 일치하지 않는 문제점이 있다.
1. 대한민국 공개특허 제2012-0045480호: 염침출법을 이용한 세포구조체의 제조 방법 2. 대한민국 공개특허 제2001-0046941호: 생체조직공학용 다공성 생분해성 고분자 지지체의 제조 방법
본 발명은 상기의 문제점을 개선하고자 창출된 것으로서, 3D 프린팅에 의해 3차원 형상으로 성형함으로써 의도한 스캐폴드의 형상을 정확하게 구현할 수 있으며 기공의 크기와 형태까지 자유롭게 조절할 수 있는 안면 이식용 다공성 스캐폴드와 이의 제조방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.
상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 3D 프린팅에 의한 고밀도폴레에틸렌 기반의 안면 이식용 다공성 스캐폴드는 고밀도 폴리에틸렌(High density Polyethylene)과 생체활성물질을 혼합한 복합소재를 3D 프린팅에 의해 다공 구조로 형성한 다공성 지지체와; 플라즈마에 의해 표면처리되어 상기 다공성 지지체의 일면에 형성된 표면처리층;을 구비하는 것을 특징으로 한다.
상기 생체활성물질은 수산화아파타이트(Hydroxyapatite)인 것을 특징으로 한다.
상기 복합소재는 상기 고밀도 폴리에틸렌 95 내지 98중량%와 상기 생체활성물질 2 내지 5중량%를 함유하는 것을 특징으로 한다.
상기 플라즈마는 산소 가스 또는 질소 가스를 방전시켜 형성한 것을 특징으로 한다.
상기 다공성 지지체의 내부로 상피세포가 유입되는 것을 방지하기 위해 상기 다공성 지지체의 타면에 형성된 배리어층;을 더 구비하는 것을 특징으로 한다.
상기 배리어층은 고밀도 폴리에틸렌으로 형성된 고분자 시트인 것을 특징으로 한다.
상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 3D 프린팅에 의한 고밀도폴레에틸렌 기반의 안면 이식용 다공성 스캐폴드의 제조방법은 고밀도 폴리에틸렌(High density Polyethylene)과 생체활성물질을 혼합하여 복합소재를 수득하는 혼합단계와; 3D 프린팅에 의해 상기 복합소재를 3차원 형상의 다공 구조로 성형하여 다공성 지지체를 형성하는 성형단계와; 상기 다공성 지지체의 일면에 플라즈마를 가해 표면처리층을 형성하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 표면처리층 형성 후 상피세포가 상기 다공성 지지체의 내부로 유입되는 것을 방지하기 위해 상기 다공성 지지체의 타면에 배리어층을 형성하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
상술한 바와 같이 본 발명에 의하면 다공성 지지체를 3D 프린팅에 의해 3차원 형상으로 성형함으로써 의도한 스캐폴드의 형상을 정확하게 구현할 수 있으며 복잡한 형상을 용이하게 제조할 수 있다. 또한, 본 발명은 스캐폴드에 형성된 기공의 크기와 형태까지 자유롭게 조절할 수 있어 골유착성을 향상시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 지지체의 일면에 배리어층을 형성함으로써 상피세포가 지지체 내부로 유입되어 증식하는 것을 방지하여 골세포의 내증식을 유리하도록 조성한다.
또한, 본 발명은 산소나 질소 중에서 방전시켜 형성한 플라즈마를 이용하여 지지체를 표면처리하여 골세포와의 유착을 향상시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시 예에 따른 스캐폴드의 단면도이고,
도 2는 플라즈마 기체로 산소를 이용하여 표면처리한 지지체의 SEM 사진이고,
도 3은 플라즈마 기체로 질소를 이용하여 표면처리한 지지체의 SEM 사진이고,
도 4는 표면처리하지 않은 지지체의 SEM 사진이고,
도 5는 플라즈마 기체로 산소를 이용하여 표면처리한 지지체의 부착된 세포의 모습을 나타낸 SEM 사진이고,
도 6은 플라즈마 기체로 질소를 이용하여 표면처리한 지지체의 부착된 세포의 모습을 나타낸 SEM 사진이고,
도 7은 표면처리하지 않은 지지체의 부착된 세포의 모습을 나타낸 SEM 사진이고,
도 8은 세포독성결과를 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 3D 프린팅에 의한 고밀도폴레에틸렌 기반의 안면 이식용 다공성 스캐폴드와 이의 제조방법에 대하여 구체적으로 설명한다.
본 발명의 일 실시 예에 따른 다공성 스캐폴드(scaffold)는 3D 프린팅에 의해 3차원 구조로 형성한다. 이러한 3D 프린팅에 의해 의도한 스캐폴드의 형상을 정확하게 구현할 수 있으며 기공의 크기와 형태까지 자유롭게 조절할 수 있다.
본 발명의 다공성 스캐폴드는 뼈를 대체하기 위해 이식된다. 가령, 인체의 안면 또는 두부의 일부가 손상 또는 손실되었거나 외상, 선천적 결함으로 인해 결손된 경우 체내에 이식된다. 또한, 미용상의 이유로 안면 특성을 개선하기 위해 이식될 수 있다.
본 발명의 다공성 스캐폴드의 일 예를 도 1에 도시하고 있다. 도시된 다공성 스캐폴드(10)는 지지체(20)와, 배리어층(30), 표면처리층(40)으로 이루어진다.
지지체는 3D 프린팅에 의해 3차원 형상으로 구현된다. 지지체는 턱, 코, 뺨 및 하악골 확대술을 위해 예비성형된 형상을 비롯한 해부학적 형상, 시트, 블럭 및 구형 등의 다양한 형상을 갖는 임의적 3차원 형상으로 제공된다.
지지체는 표면과 내부에 다수의 기공이 형성된 다공성 구조를 갖는다. 다공성 구조는 생체적합성, 구조적 강도, 경량성, 상호연결된 기공 구조, 취급 용이성, 및 블레이드, 가공의 용이성을 부여하며, 생체 조직과의 유착성 및 개선된 섬유혈관 내증식을 비롯한 이점들을 갖는다.
지지체에 형성된 기공(25)은 섬유혈관 내증식 또는 골 내증식이 허용되기에 충분한 크기를 갖는다. 이러한 세공 크기는 수십 내지 수백 마이크로미터 크기일 수 있다. 가령, 50 내지 500㎛이다. 무수하게 형성된 기공들은 상호 연결된다. 기공들 전체의 부피는 지지체 부피의 약 20 내지 60%일 수 있다. 지지체는 상호연결된 개방형 기공 구조로 인하여 골 내증식을 효과적으로 허용한다.
지지체의 소재로 고밀도 폴리에틸렌(High density Polyethylene)과 생체활성물질을 혼합한 복합소재를 이용한다.
폴리에틸렌은 불활성이고, 생체에 무해하다. 또한, 쉽게 성형될 수 있고, 이식부위에 적합하게 맞도록 형상화되거나, 원하는 형상으로 변형될 수 있다. 또한, 다공성 폴리에틸렌은 가요성이고, 유연하며 압축될 수 있다.
특히, 고밀도 폴리에틸렌은 견고성으로 인해 기공구조를 붕괴시키지 않으면서 3차원적 구조를 가진 조직을 형성할 수 있도록 기계적 강도를 유지시킬 수 있다.
고밀도 폴리에틸렌은 일 예로 중량평균분자량 150,000 내지 350,000이고, 밀도 0.93 내지 0.97g/ml(at 25℃)이다.
고밀도 폴리에틸렌과 혼합되는 생체활성물질은 다공성 지지체 내로의 섬유혈관 내증식 또는 골 내증식 속도를 가속화시키는 특성을 갖는다. 생체활성물질의 일 예로 수산화아파타이트(Hydroxyapatite: HA)를 이용한다. 수산화아파타이트는 생체흡수성 및 생체 적합성 소재인 인산칼슘 화합물이다. 수산화아파타이트는 Ca/P의 화학량론적 몰비가 1.6 내지 1.7의 범위, 바람직하게 1.67일 수 있다.
수산화아파타이트는 인간 신체의 뼈를 구성하는 물질과 성분이 매우 유사하기 때문에 인공뼈 이식물로 사용되는 천연 물질이고 감염에 대한 저항성이 있다. 수산화아파타이트는 다공성 구조를 갖고, 조직 내증식을 허용한다. 수산화아파타이트느 골 재생에 있어서 증가된 생물학적 수용력, 즉 개선된 세포 접착력, 조골세포의 기능 분화, 골 형성을 보여준다.
지지체를 제조하기 위한 복합소재는 고밀도 폴리에틸렌 95 내지 98중량%와 생체활성물질 2 내지 5중량%로 혼합될 수 있다. 생체활성물질이 2중량% 미만이면 세포 증식이나 부착 효과가 낮고, 5중량%를 초과하면 지지체의 물성을 저하시킨다.
복합소재는 입자 형태의 고밀도 폴리에틸렌과 입자 형태의 생체활성물질이 혼합된 것일 수 있다.
지지체(20)의 타면에는 플라즈마에 의해 표면처리된 표면처리층(40)이 형성될 수 있다. 표면처리층(40)은 뼈와 접촉하는 지지체(20)의 어느 한면에 형성된다.
표면처리층(40)은 지지체의 일면에 형성된다. 도시된 바와 같이 배리어층(30)이 지지체(20)의 상면에 형성되는 경우 표면처리층(40)은 지지체(20)의 하면에 형성된다.
인체에 이식되는 스캐폴드의 표면은 생체조직과 직접 접촉하여 반응하므로 표면의 특성은 골 유착성을 좌우하는 가장 중요한 요소이다. 따라서 본 발명은 골 유착성을 향상시키고자 플라즈마 처리에 의해 지지체의 표면의 특성을 제어하고자 한다.
플라즈마는 부분적으로 이온화되어 있으면서 전체적으로는 전기적인 중성인 기체상태를 말하며, 기체 또는 증기 내에서 방전에 의하여 발생되고, 이러한 플라즈마에는 전자, 광자, 이온화된 원자 및 분자, 자유 라디칼과 같은 반응종들이 존재하는데, 이러한 반응종들은 고체 표면에 있는 분자들의 물리화학적 특성을 변화시킨다.
플라즈마에 의해 표면처리된 지지체의 표면은 화학적 또는 물리적 변화에 의해 단백질 부착량이 증가되고, 세포 증식이 활성화되며, 골유착 특성이 향상된다.
플라즈마화 기체로 질소 또는 산소를 이용하는 것이 바람직하다. 플라즈마화 기체로서 기타 네온, 헬륨 등을 사용하면 표면처리의 효과를 거두기 어렵고 원자량이나 분자량이 큰 기체를 이용하는 경우에는 표면에 물리적인 손상을 줄 염려가 있기 때문에 바람직하지 않다.
플라즈마화 기체로 질소와 산소를 이용하면 지지체의 표면의 친수화가 유도되어 젖음성이 향상된다. 그리고 산소의 경우 플라즈마 방전압이 높아지면 에칭효과가 나타난 지지체의 비표면적을 증대시키는 효과를 갖는다. 그리고 질소를 이용할 경우 표면에 형성된 아민기에 의해 세포부착에 유리하다.
배리어층(30)은 지지체(20)의 타면에 형성된다. 가령, 지지체가 결손되거나 상실된 뼈 부위에 결합되는 경우 피부조직과 접하는 면에 배리어층(30)이 형성된다. 이는 골세포와 유착력을 향상시킬 수 있도록 피부조직의 상피세포가 지지체 내부로 유입되는 것을 방지하기 위함이다.
배리어층(30)은 고밀도 폴리에틸렌으로 형성된 고분자 시트이다. 배리어층(30)은 기공이 없는 구조이거나 상피세포가 통과할 수 없는 극히 미세한 기공이 형성된 구조일 수 있다. 배리어층(30)의 두께는 외과적 용도에 부합하도록 적절하게 조절될 수 있다. 가령, 배리어층의 두께는 약 0.1 내지 0.5mm일 수 있다.
상술한 본 발명의 스캐폴드를 안면에 이식하고자 하는 경우, 이식하고자 하는 영역을 덮고 있는 피부를 절개하여 박리시키는 외과적 절차를 수행한다. 적절한 형상으로 성형된 스캐폴드를 피부가 박리된 영역 내에 배치하여 결손되거나 부적절한 뼈 조직을 대체한다. 필요에 따라 외과용 스크류, 와이어, 봉합사 또는 다른 적절한 수단을 사용하여 스캐폴드를 고정시킬 수 있다. 스캐폴드 위를 피부 조직으로 다시 덮고, 적절한 외과 기술로 봉합한다.
한편, 본 발명의 다른 실시 예로 스캐폴드의 상면에 배리어층이 생략될 수 있다.
이하, 상술한 고밀도폴레에틸렌 기반의 안면 이식용 다공성 스캐폴드를 3D 프린팅에 의해 제조하는 방법을 대해 살펴본다.
먼저, 고밀도 폴리에틸렌(High density Polyethylene)과 생체활성물질을 혼합하여 복합소재를 수득한다. 고밀도 폴리에틸렌과 생체활성물질은 입자 형태로 준비하여 혼합한다. 생체활성물질로 수산화아파타이트(Hydroxyapatite: HA)를 이용할 수 있다.
고밀도 폴리에틸렌 95 내지 98중량%와 생체활성물질 2 내지 5중량%를 혼합하여 복합소재를 얻는다.
다음으로 3D 프린터를 이용하여 지지체를 제조한다.
3D 프린터는 복합소재를 용융시킨 다음 XYZ 방향으로 자유롭게 이동이 가능한 분사노즐을 통하여 용융된 복합소재를 분사하여 3차원의 형상의 다공성 지지체를 만든다. 3D 프린팅(3D printing) 방법에 의해 지지체를 제조할 경우 형상의 제한이 없으며, 의도한 형상을 정확하게 구현할 수 있고 기공의 크기와 형태까지 자유롭게 조절할 수 있다.
3D 프린팅으로 지지체를 제조하기 위해서는 3차원 정보를 수집한 다음 3차원 정보를 바탕으로 지지체의 3차원 이미지를 생성하여야 한다. 3차원 정보로 이용되는 것은 이식 부위의 3차원 CT 데이터, 3차원으로 스캔(scan)한 데이터 등을 포함한다. 수집하여 얻은 정보는 저장되어 3차원 이미지를 형성하는 기초로 이용된다.
형성된 3차원 이미지는 3D 프린터에 의해 의도된 3차원 형상의 지지체로 구현된다.
3D 프린터에 의해 3차원 형상의 지지체를 성형한 후 지지체의 일면에 플라즈마를 가해 표면처리층을 형성하는 단계를 수행한다.
도시되지 않았지만 플라즈마 발생장치는 챔버와, 챔버와 연결되어 챔버 내부를 진공시키기 위한 진공펌프와, 챔버의 내부에 이격되도록 설치되며 플라즈마 방전을 일으키기 위한 한 쌍의 전극과, 전극에 전력을 공급하여 플라즈마를 발생시키는 RF 제네레이터와, 챔버 내부로 질소, 산소 등을 공급하기 위한 가스저장탱크을 구비한다. 그리고 챔버에는 가스의 압력을 측정하기 위한 압력게이지, 챔버 내부 및 기체의 온도조절을 위한 히터와 냉각수단이 더 구비될 수 있다.
플라즈마 발생장치는 상술한 실시예에 의해 한정되지 않고 통상적인 플라즈마를 발생장치를 이용할 수 있음은 물론이다.
플라즈마 발생장치를 이용하여 지지체를 표면처리하기 위해서는 먼저 챔버의 내부에 지지체를 장착하고, 진공펌프를 이용하여 챔버의 내부에 진공을 형성한다. 그리고 지지체 표면의 세정을 위해 아르곤 가스를 챔버에 흘려주고 출력 150W를 인가하여 60초 동안 클리닝한다. 클리닝 후 챔버의 내부에 산소가스 또는 질소가스를 선택적으로 공급하고, RF 제네레이터로 전극들의 사이에서 저온 플라즈마를 발생시킨다. RF 제네레이터로 13.56㎒의 축전 결합형 플라즈마 타입의 장비를 이용하고, 표면처리시 RF 제네레이터의 출력은 50~200W인 것이 바람직하다.
플라즈마화 기체는 산소가스 또는 질소가스를 사용함이 바람직하다. 산소가스 또는 질소가스는 10~20sccm 유량으로 공급하며, 표면처리시 챔버 내부의 압력은 30~80mTorr, 표면처리시간은 150 내지 200초 범위인 것이 바람직하다.
플라즈마는 지지체 표면에 있는 분자들의 물리화학적 특성을 변화시켜 소수성을 개선하고 골유착 특성을 향상시킨다.
한편, 본 발명의 다른 예로 표면처리층 형성 후 지지체의 타면에 배리어층을 형성하는 단계를 더 수행할 수 있다.
배리어층의 일 예로 고밀도 폴리에틸렌으로 형성된 고분자 시트를 지지체의 타면에 부착하여 형성할 수 있다. 또한, 3D 프린터에 의해 배리어층을 지지체의 타면에 일정한 두께로 형성시킬 수 있음은 물론이다.
이하, 실시 예를 통하여 본 발명에 대해 설명하고자 한다. 다만, 하기의 실시 예는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를 하기의 실시 예로 한정하는 것은 아니다.
(실시예)
3D 프린터(Bio-plotter, M4T, Korea)를 이용하여 고밀도 폴리에틸렌(중량평균분자량 150,000 내지 350,000, 밀도 0.93 내지 0.97g/ml(at 25℃), Sigma Aldrich, USA) 96중량%, 수산화아파타이트(Ca/P 몰비 1.67, Sigma Aldrich, USA) 4중량%를 혼합한 복합소재를 용융시킨 후 분사하여 디스크 형상의 다공성 지지체(기공의 크기 150~350㎛)를 제조하였다.
그리고 제조한 지지체를 플라즈마 발생기(PlasmaMini, plasmart, Korea)를 이용하여 플라즈마로 표면처리하였다. 플라즈마 기체로 산소가스와 질소가스를 선택적으로 이용하였고, 각 표면처리조건은 하기 표 1에 정리하였다.
항목 산소 질소
flow rate 10sccm 12sccm
power 100W 80W
time 180초 180초
pressure 50mTorr 50mTorr
이하에서는 플라즈마 기체로 산소를 이용하여 표면처리한 지지체를 제 1시료, 질소를 이용하여 표면처리한 지지체를 제 2시료, 대조군으로서 표면처리하지 않은 지지체를 제 3시료로 구분하여 실험하였다.
<지지체의 표면 관찰>
주사전자현미경(SEM, S-4100, Hitachi, Japan)을 통하여 각 시료의 표면을 관찰하였다. 관찰결과를 도 2 내지 도 4에 나타내었다.
도 2는 제 1시료의 사진이고, 도 3은 제 2시료의 사진이고, 도 4는 제 3시료의 사진이다.
도 2 내지 도 4를 참조하면, 시료들 모두 3차원의 격자 구조로 다공성 지지체가 잘 형성되었음을 확인할 수 있었다. 그리고 제 3시료와 비교하여 제 1 및 제 2시료는 플라즈마 표면처리에 의한 표면의 물리적 변화는 크게 없는 것으로 나타났다.
<세포 부착 실험>
시료와 세포의 유착정도를 확인하기 위해 세포부착실험을 한 후 세포의 부착모습을 전자현미경으로 관찰하였다.
본 실험에 사용된 세포는 생쥐 두개골에서 유래한 조골모세포 MC3T3-E1을 ATCC에 구입하여 사용하였고, 세포배양은 α-MEM(alpha minimum essential medium with ribonucleosides, deoxyribonucleosides, 2mM L-glutamine and 1mM sodium pyruvate, but without ascorbic acid/GIBCO, Custom Product, Catalog NO. A1049001)배지에 growth factor를 제공하는 10%(w/v) fetal bovine sereum(FBS, PAA Laboratoris, Inc. A15-751)과 항생제(100 units/ml penicillin, 100 ㎍/ml streptomycin)가 혼합된 세포배양액을 제조하여 5%의 CO2가 공급되는 37℃ CO2 incubator에서 배양하였다. 그리고 3일 마다 계대 배양하여 3세대 세포를 실험에 사용하였다.
각 시료 위에 세포를 파종한 후 50분이 지나면, 2.5%의 Paraformaldehyde(Electron Microscopy Sciences 15714)와 Glutaraldehyde(SIGMA ALDRICH G5882)의 혼합용액으로 2시간 고정을 하여주었고 10분 동안 PBS을 이용하여 세척하여 준 후 Osmium tetroxide(SIGMA ALDRICH 201030)를 이용하여 30분 동안 고정을 진행하였다. 그리고 알콜을 준비하여 건조시킨 다음 HMDS(Fluka 52619)를 이용하여 시료 위에 남아있는 알콜을 제거한 후 주사전자 현미경을 이용하여 세포의 형태를 관찰하여 도 5 내지 도 7에 나타내었다.
도 5는 제 1시료의 사진이고, 도 6은 제 2시료의 사진이고, 도 7은 제 3시료의 사진이다.
도 5 내지 도 7을 참조하면, 표면처리하지 않은 제 3시료는 세포의 형태가 둥근 것으로 보아 지지체 표면에 세포가 고정화가 잘 이루어지지 않은 것으로 나타났다. 이에 반해 제 1시료와 제 2시료는 세포가 표면에 부착되어 전개되는 형태를 보였다. 특히, 제 2시료의 경우 주변부로 세포가 뻗어나가는 것을 관찰할 수 있어서 세포부착이 가장 양호한 것으로 확인되었다.
<세포독성실험>
시료를 대상으로 세포독성실험을 하였다. 세포 생존율 측정은 MTT assay 방법으로 측정하였다.
조골모세포 MC3T3-E1 증식은 MTT assay를 이용하여 평가하였으며, 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 배양된 MC3T3-E1 세포는 PBS(Phosphate buffered saline, Sigma, USA)를 이용하여 세척하였으며, trypsin/EDTA를 소량 첨가하여 배양접시로부터 분리시켰다. 분리된 세포에 FBS가 포함된 배지를 첨가하여 반응을 정지시킨 후 원심분리기를 이용하여 세포를 수집하였다. 세포에 배지를 첨가하여 다시 부유 시킨 후 준비된 시료가 담겨진 well plate에 각각 세포를 파종하였다. 1, 3, 5일이 되면 MTT(thiazolyl blue tetrazolium bromide, Sigma-aldrich, M2128)시약을 첨가하여 청자색의 결정이 생성되는 것을 확인하였다. 4 시간 후 DMSO(dimethyl sulfoxide, Junsei, 35535-0350)를 넣고 실온에서 30 분간 배양하였다.
흡광도를 측정하기 위해 반응액을 96-well plate에 분주한 후 ELISA reader(Thermal Fisher SCIENTIFIC)를 이용하여 540㎚에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존율을 확인하였다.
도 8을 참조하면, 시료 모두 세포독성이 없는 것을 관찰할 수 있었다. 그리고 4일 이후부터 플라즈마로 표면처리한 시료의 세포생존율이 제 3시료에 비해 더 높은 것으로 나타났고, 질소로 플라즈마 표면처리한 제 2시료가 산소로 플라즈마 표면처리한 제 1시료보다 세포증식이 더 우수한 것으로 나타났다.
도 8에서 그래프의 가로축 1, 4, 7은 1일, 4일, 7일을 의미하고, 'control'은 제 3시료, 'O2'는 제 1시료, 'N2'는 제 2시료를 의미한다.
이상, 본 발명은 일 실시 예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 실시 예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 보호 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 정해져야 할 것이다.
10: 스캐폴드 20: 지지체
25: 기공 30: 배리어층
40: 표면처리층

Claims (8)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 고밀도 폴리에틸렌(High density Polyethylene) 95 내지 98중량%와 생체활성물질 2 내지 5중량%를 혼합하여 복합소재를 수득하는 혼합단계와;
    3D 프린팅에 의해 상기 복합소재를 3차원 형상의 다공 구조로 성형하여 다공성 지지체를 형성하는 성형단계와;
    상기 다공성 지지체의 일면에 산소 가스 또는 질소 가스를 방전시켜 형성한 플라즈마를 가해 표면처리층을 형성하는 단계;를 포함하며,
    상기 표면처리층을 형성하는 단계는 출력 50 내지 200W, 챔버 내부압력 30 내지 80mTorr, 표면처리시간 150 내지 200초이고, 상기 산소가스 또는 상기 질소가스는 10 내지 20sccm 유량으로 공급하는 것을 특징으로 하는 고밀도폴레에틸렌 기반의 안면 이식용 다공성 스캐폴드의 제조방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 표면처리층 형성 후 상피세포가 상기 다공성 지지체의 내부로 유입되는 것을 방지하기 위해 상기 다공성 지지체의 타면에 배리어층을 형성하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 고밀도폴레에틸렌 기반의 안면 이식용 다공성 스캐폴드의 제조방법.
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