WO2021007636A1 - Estereoisômeros do composto 3-(benzo[d][1,3]dioxol-5-il)-7-(1-hidroxipropan-2-il)-1-(1 h-indol-3-il)-6,7-dihidro-3 h-oxazol[3,4-a]pirazina-5,8-diona e seu uso como antitumoral e inibidor da enzima fosfodiesterase - Google Patents

Estereoisômeros do composto 3-(benzo[d][1,3]dioxol-5-il)-7-(1-hidroxipropan-2-il)-1-(1 h-indol-3-il)-6,7-dihidro-3 h-oxazol[3,4-a]pirazina-5,8-diona e seu uso como antitumoral e inibidor da enzima fosfodiesterase Download PDF

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Sérgio Luiz SACURAI
Carlos Eduardo Da Costa Touzarim
Fabiano Travanca TOLEDO
Renan DOS SANTOS FERRARINI
Débora Rocha HELFSTEIN
Tiago ZAMINELLI
Julio Alejandro Rojas MOSCOSO
Márcio Fernando DAS VIRGENS
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    • C07D498/04—Ortho-condensed systems

Definitions

  • the present patent application relates, in a first aspect, to phosphodiesterase (PDE) inhibitor compounds.
  • PDE phosphodiesterase
  • the present patent application relates, in a second aspect, to antiproliferative and anti-tumor compounds.
  • Such compounds can be used, for example, as anti-inflammatories, vasodilators, stimulants and inotropes in heart failure and lung diseases.
  • PDE inhibitors have been shown to be useful in the treatment of erectile dysfunction in men.
  • such compounds can be used as antiproliferative and anti-tumor agents.
  • Phosphodiesterase inhibiting compounds are the main agents used in medical practice for the treatment and / or prevention of erectile dysfunction, disorders and / or conditions treatable with tissue relaxation and other diseases treatable with phosphodiesterase inhibitors. In the case of erectile dysfunction, PDE-5 inhibitors are the most used in medical practice.
  • Erectile dysfunction more commonly known as sexual impotence is one of the diseases that most impairs a man's quality of life. For a long time, erectile dysfunction haunted men without much possibility of effective treatment.
  • cGMP-PDE inhibitors More specifically PDE-5 inhibitors.
  • the precursor of these compounds was 5- [2-ethoxy-5- (4-methylpiperazinylsulfonyl) phenyl] -1-methyl-3-n-propyl-1,6-dihydro-7H-pyrazolo [4, 3-d] pyrimidine -7-one, or sildenafil, with vasodilating properties and which potentiates the effects of nitric oxide.
  • the sildenafil molecule was originally described in US patent US5250534.
  • tissue relaxing compounds have been used to promote relaxation of various tissues with a focus on treating or acting as an adjunct to treatment, procedure or surgery related to lithiasis (Korkes, F. et al, J Bras Nefrol. (2009) 31 (1): 55), prostate enlargement (eg, benign prostatic hyperplasia, prostatitis) (WO 9911279) and urethral constriction (Van der wasf et al, BJU International (2002) 90: 588).
  • Other treatable disorders and / or conditions of tissue relaxation are known and described in the prior art.
  • the compounds now claimed are placed as alternatives for the treatment of various diseases and medical conditions that benefit from PDE inhibition, such as erectile dysfunction, heart failure, pulmonary hypertension and for the treatment of various diseases and conditions that benefit from its antiproliferative and anti-tumor effects.
  • the present patent application relates, in one aspect, to the compound 3- (benzo [d] [1, 3] dioxol-5-yl) -7- (1-hydroxypropan-2-yl) -1- (1H- indol-3-yl) - 6,7-dihydro-3H-oxazol [3,4-a] pyrazine-5,8-dione of formula (I), and its stereoisomers,
  • said stereoisomers of the compound of formula (I) are in their separate individual forms and / or in the forms of racemic mixtures or mixtures non-racemic with diastereoisomeric excess in any proportions.
  • stereoisomers are the compounds of formulas (II) and (III)
  • the present patent application relates to the isolated stereoisomers named by the formulas (IV), (V), (VI) and (VII), below:
  • Another aspect of the present patent application relates to mixtures of stereoisomers of compound 3-
  • the present patent application seeks protection for non-racemic mixtures with diastereoisomeric excess in any proportions.
  • the diastereoisomeric ratio is in the range of 1:99 to 99: 1.
  • the mixture is in the range of 1:50 to 50: 1, alternatively in the range of 1:25 to 25: 1.
  • mixtures non-racemic with diastereoisomeric excess are in the range of 1: 2 to 2: 1, alternatively in the proportion of 1: 1.
  • the present patent application relates to the mixture of diastereoisomers described in formulas (VIII) and (IX), the mixture being able to contain any proportion of the diastereoisomers.
  • the diastereoisomeric ratio is in the range of 1:99 to 99: 1.
  • the mixture is in the range of 1:50 to 50: 1, more preferable in the range of 1:25 to 25: 1.
  • the mixture is in the range of 1: 2 to 2: 1, more preferred in the proportion of 1: 1.
  • the mixture of diastereoisomers of formula (IX) is called (R) -3- (benzo [d] [1, 3] dioxol-5-yl) -7- ((S) -1- hydroxypropan-2-yl) - 1- (1H-indol-3-yl) -6,7-dihydro-3H-oxazole [3,4-a] pyrazine-5,8-dione with (S) -3- (benzo [d] [1, 3] dioxol-5-yl) -7- ((S) -1-hydroxypropan-2-yl) -1- (1H-indo1-3-yl) - 6,7-dihydro-3H-oxazole [3,4 -a] pyrazine-5, 8-dione (BL-241), and has the following structure: BL-241
  • the diastereoisomeric ratio is in the range of 1:99 to 99: 1.
  • the mixture is in the range of 1:50 to 50: 1, alternatively in the range of 1:25 to 25: 1.
  • the mixture is in the range of 1: 2 to 2: 1, alternatively in the proportion of 1: 1.
  • Diastereoisomers and their mixtures, objects of the present patent application can be prepared, for example, according to the reaction schemes below:
  • compositions comprising said stereoisomers of the compound of formula (I) in their separate individual forms and / or in the forms of racemic mixtures or non-racemic mixtures with excess stereoisomers in any proportions and medicaments comprising said stereoisomers.
  • Such compositions can be prepared according to known methods of pharmaceutical technology, using pharmaceutically acceptable diluents, excipients or carriers.
  • Another aspect of the present patent application is the use of the compound of formula (I) and its stereoisomers as antitumor and inhibitors of the phosphodiesterase enzyme, more specifically as antitumor and inhibitors of the type 5 phosphodiesterase enzyme (PDE-5); and the use of said stereoisomers in the treatment of benign prostatic hyperplasia and cancer, more specifically prostate cancer.
  • PDE-5 type 5 phosphodiesterase enzyme
  • a preferred aspect of the present patent application concerns the use of the mixture defined by formula (VIII) and named as (R) -3- (benzo [d] [1, 3] dioxol-5-yl) -7- ( (R) -1- hydroxypropan-2-yl) -1- (1H-indol-3-yl) -6,7-dihydro-3H-oxazol [3,4-a] pyrazine-5,8-dione with ( S) -3-
  • Another preferred aspect of the present patent application concerns the use of isolated stereoisomers defined by formulas (IV), (V), (VI) and (VII) and named, respectively, as: (S) -3- (benzo [ d] [1, 3] dioxol-5-yl) -7-
  • Also used in the present patent application are the uses of the compound of formula (I) and its stereoisomers, salts, esters, prodrugs, as described herein, in the preparation of antiproliferative, anti-tumor and anti-tumor drugs phosphodiesterase enzyme, more specifically phosphodiesterase type 5 (PDE-5) inhibitors; and the use of said stereoisomers in the preparation of medications for the treatment of diseases and conditions, such as inflammatory, cardiovascular, pulmonary diseases and conditions, erectile dysfunction in men, benign prostatic hyperplasia and cancer, more specifically prostate cancer.
  • diseases and conditions such as inflammatory, cardiovascular, pulmonary diseases and conditions, erectile dysfunction in men, benign prostatic hyperplasia and cancer, more specifically prostate cancer.
  • the present patent application also describes a method of treating cancer, such as benign prostatic hyperplasia and cancer, more specifically prostate cancer, using the stereoisomers of the compound of formula (I), its salts, solvates, hydrates, prodrugs and pharmaceutically acceptable esters; where stereoisomers are in their separate individual forms and / or in the forms of racemic mixtures or non-racemic mixtures with diastereoisomeric excess in any proportions.
  • cancer such as benign prostatic hyperplasia and cancer, more specifically prostate cancer
  • Such uses and treatment methods described above include providing a therapeutically effective amount of the compounds, and their respective salts, solvates, prodrugs, stereoisomers and racemic mixtures thereof.
  • Another object of the present patent application is the process of producing the stereoisomers of compound 3- (benzo [d] [1,3] dioxol-5-yl) -7- (1-hydroxypropan-2-yl) -1- ( 1H-indol-3-yl) -6,7-dihydro-3H-oxazol [3,4-a] pyrazine-5,8-dione of formula (I), as described in the above schemes and examples below.
  • Example 1 Preparation of the Compound of formula (VI II)
  • the intermediate compound (E) -methyl 2- ((benzo [d] [1, 3] dioxol-5-yl methylene) amino was added to a 500 mL flask with mechanical stirring, addition funnel and drying tube containing CaCl2 ) -3- (1H-indol-3-yl) -3-oxopropanoate of formula (A) (5.0 g, 13.7 mmol), dry THF (90 ml) and dry pyridine (5.5 ml) which was stirred for 30 minutes.
  • the flask was cooled to room temperature and subsequently between 0 and 5 ° C, and stirred for 2 h at this temperature.
  • the solid was placed in a 100 ml flask and 30 ml of ethanol was added; the mixture was stirred for a period of 30 minutes. After this period, the solid was filtered and dried under vacuum, leading to the formation of the compound of formula (VIII), constituted by the mixture of the corresponding compounds (VI) and (VII) in 41% yield.
  • the compound obtained by this process has IUPAC nomenclature (R) -3- (benzo [d] [1, 3] dioxol-5-yl) -7- ((R) -1- hydroxypropan-2-yl) -1- (1H-indol-3-yl) -6,7-dihydro-3H-oxazole [3,4-a] pyrazine-5,8-dione with (S) -3-
  • reaction intermediates the following compounds were used: (E) -methyl 2- ((benzo [d] [1, 3] dioxol-5-yl methylene) amino) -3- (1H-indol-3-yl) -3- oxopropanoate, described by the chemical structure (A); compound (R) -2-aminopropane-1-ol (3), and 2-chloroacetyl chloride (1), as exemplified below and in scheme 1.
  • the compound obtained by this process has IUPAC nomenclature (R) -3- (benzo [d] [1, 3] dioxol-5-yl) -7- ((S) -1- hydroxypropan-2-yl) -1- (1H-indol-3-yl) -6,7-dihydro-3H-oxazole [3,4-a] pyrazine-5,8-dione with (S) -3-
  • reaction intermediates the following compounds were used: (E) -methyl 2- ((benzo [d] [1, 3] dioxol-5-yl methylene) amino) -3- (1H-indol-3-yl) -3- oxopropanoate, described by the chemical structure (A); and compound (S) -2-aminopropane-1-ol (4) and chloroacetyl chloride (1), as exemplified below and in scheme 2.
  • the mother water from the previous filtration was returned to the reaction flask and 200 mL of H2O was added slowly, leading to a turbidity of the reaction medium, which was stirred for 1 hour at room temperature.
  • the suspension was filtered in vacuo and washed with 50 ml of ethanol.
  • Example 7 In vitro evaluation of the inhibitory potential of compounds under the activity of the human phosphosdiesterase 5 enzyme.
  • the evaluation of the compound is studied using an enzymatic assay kit from BPS Bioscience (catalog 60350).
  • the PDE5A1 assay kit allows identification of PDE5A1 inhibitors using fluorescence polarization.
  • the assay is based on the binding of a fluorescent nucleotide monophosphate generated by the PDE5A1 enzyme to the binding agent.
  • test compounds are diluted with 100% DMSO (v / v) to a concentration of 1000 mM and then diluted in 0.9% sodium chloride solution to obtain the concentration curve of interest for the test.
  • the compounds are diluted in concentrations of: 10 nM, 30 nM, 50 nM, 100 nM, 300 nM, 500 nM, 1 mM, 3 mM, 5 mM (10% v / v DMSO).
  • the study is composed of the groups: (i) substrate control; (ii) positive control (KIT); (iii) samples in various concentrations; (iv) tadalafil (comparative control). Each parameter (group) is plated in triplicate.
  • the reaction is stopped by adding 100 ml of the binding agent solution to all wells and the microplate is incubated for 30 minutes, under gentle agitation, at room temperature.
  • the microplate reading is performed in Polarized Fluorescence (475-495 nm - excitation and 518-538 nm - emission detection) 500 nanoseconds of integration time.
  • concentrations of 10 nM, 30 nM, 50 nM, 100 nM, 300 nM, 500 nM, 1 mM (1000 nM), 3 mM (3000 nM) and 5 mM (5000 nM) were prepared. Based on the results obtained (Table 1) it is possible to observe that the compound BL-380 was effective in inhibiting PDE5 in a dose dependent manner, however this inhibition was only observed from the concentration of 300 nM of BL-380.
  • BL-241 compound concentrations of 500 nM, 1 mM (1000 nM) and 3 mM (3000 nM) were prepared. Based on the results obtained, (table 2) it is possible to observe that the compound BL-241 was also effective in inhibiting PDE5 in a dose dependent manner.
  • Example 6 Evaluation of the antiproliferative effect of compounds in cell cultures of human prostate, stomach and bladder cancer lineages.
  • the compounds are diluted in 100% DMSO (v / v) to a concentration of 1000 mM and then diluted in 0.9% sodium chloride solution to obtain the stock solutions of interest for use in the tests.
  • the final concentration of interest will be diluted directly in the cell culture medium.
  • the following tumor cell lines are used for the experiment: PC3-human prostate cancer; LNCAP- human prostate cancer; DU145-human prostate cancer; MNK45-human stomach cancer and RT4-human bladder cancer.
  • Tumor cell lines are maintained in culture according to standard procedures established by the Rio de Janeiro Cell Bank (place of origin of the lines). Procedure:
  • tumor cells are seeded at a concentration of 10,000 cells per well (final reaction volume 200. Ml), the plate is incubated for 8 hours so that the cells adhere to the wall of the wells. After this period, the plaque is divided into groups:
  • test group added 20 mL of samples (test compound) at the concentrations of interest;
  • negative control group added 200 ml of culture medium and 20 ml of the vehicle used to dilute the compounds (without cells - zero proliferation);
  • control group added 20 mL of the vehicle used to dilute the compounds. This group is important for assessing whether the vehicle used interferes with cell proliferation.
  • the treatment with the concentrations of the samples (test compounds) and controls are carried out in triplicate.
  • stock solutions are prepared in the concentrations of: 100 nM, 1 mM, 3 mM, 5 mM, 10 mM and 30 mM (DMSO 10% v / v).
  • the final concentrations in the test are: 10 nM, 100 nM, 300 nM, 500 nM, 1000 nM and 3000 nM (in DMSO 1% v / v).

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Abstract

A presente invenção se refere ao composto 3-(benzo[d] [1,3]dioxol-5-il)-7-(1-hidroxipropan-2-il)-1-(1H-indol-3-il)-6,7-dihidro-3H-oxazol [3,4-a] pirazina-5,8-diona de formula (I), bem como aos seus estereoisômeros, sais, solvatos, hidratos, pró-drogas e ésteres farmaceuticamente aceitáveis; onde os estereoisômeros estão nas suas formas individuais separadas e/ou nas formas de misturas racêmicas ou misturas não-racêmicas com excesso diastereoisomérico em quaisquer proporções, composição farmacêutica compreendendo pelo menos um dos compostos descritos, o uso dos estereoisômeros como um agente antitumoral ou como um inibidor da enzima fosfodiesterase e o uso desses estereoisômeros no tratamento da hiperplasia benigna da próstata e câncer, mais especificamente o câncer de próstata

Description

"Estereoisômeros do composto 3- (benzo [d] [1 ,3]dioxol-5-il) -7- (1-hidroxipropan-2-il) -1- (lH-indol-3-il) -6 , 7-dihidro-3H- oxazol [3 , 4 -a] pirazina-5 , 8-diona e seu uso como antitumoral e inibidor da enzima fosfodiesterase" .
ÁREA TECNOLÓGICA
0 presente pedido de patente se refere, em um primeiro aspecto, a compostos inibidores da enzima fosfodiesterase ( PDE ) .
0 presente pedido de patente se refere, em um segundo aspecto, a compostos antiproliferativos e antitumorais .
Tais compostos podem ser usados, por exemplo, como anti- inflamatórios, vasodilatadores , estimulantes e inotrópicos na insuficiência cardíaca e doenças pulmonares. Notadamente, inibidores da PDE têm se mostrado úteis no tratamento da disfunção erétil no homem. Além disso, tais compostos podem ser utilizados como antiproliferativos e antitumorais.
ESTADO DA TÉCNICA
Os compostos inibidores de fosfodiesterases são os principais agentes utilizados na clínica médica para o tratamento e/ou prevenção de disfunção erétil, desordens e/ou condições tratáveis com relaxamento de tecidos e outras doenças tratáveis com inibidores de fosfodiesterases . No caso da disfunção erétil, os inibidores de PDE-5 são os mais utilizados na clínica médica.
A disfunção erétil, mais comumente conhecida como impotência sexual é uma das doenças que mais prejudica a qualidade de vida de um homem. Durante muito tempo, a disfunção erétil assombrou os homens sem muita possibilidade de tratamento efetivo.
Antes dos anos 1970, a quase totalidade dos casos de disfunção erétil era considerada como resultante de causas psicológicas, e os tratamentos consistiam na administração empírica de testosterona ou encaminhamento para um psiquiatra.
O tratamento oral surgiu de pesquisa clínica sobre o uso de inibidores de cGMP-PDE, mais especificamente inibidores da PDE-5. O precursor desses compostos foi a 5- [2-etoxi-5- (4- metilpiperazinilsulfonil ) fenil] -1-metil-3-n-propil-1, 6- dihidro-7H-pirazolo [ 4 , 3-d] pirimidina-7-ona, ou sildenafila, com propriedades vasodilatadoras e que potencializa os efeitos do óxido nítrico. A molécula de sildenafila foi originalmente descrita na patente americana US5250534.
Posteriormente, outros compostos inibidores da enzima PDE-5 foram desenvolvidos e são citados em grande número de publicações da literatura técnica, bem como em publicações de patentes. Dentre os compostos conhecidos destacamos: a molécula do vardenafila, descrito originalmente na patente US3635178; a tadalafila, descrito originalmente na patente americana US5859006; os compostos BL-106, BL-230 e BL-236 ainda não comercializados, descritos originalmente nas patentes americanas US8338432 e US9359378 e desenvolvidos pela mesma equipe de pesquisadores do presente pedido de patente.
Adicionalmente, os pesquisadores verificaram que compostos relaxantes de tecido têm sido usados para promover o relaxamento de vários tecidos com o foco em tratar ou atuar como adjuvante no tratamento, procedimento ou cirurgia relacionada à litíase (Korkes, F. et al, J Bras Nefrol. (2009) 31(1) : 55), aumento de próstata (por exemplo, hiperplasia prostática benigna, prostatite) (WO 9911279) e constrição uretral (Van der werf et al, BJU International (2002) 90:588) . Outras desordens e/ou condições tratáveis de relaxamento de tecido são conhecidas e descritas no estado da técnica .
Frente a este cenário e buscando novas alternativas de compostos inibidores de fosfodiesterases , mais especificamente como inibidores da PDE-5, para o tratamento da disfunção erétil, desordens e/ou condições tratáveis com relaxamento de tecidos e outras doenças tratáveis com inibidores de fos fodiesterases , os pesquisadores da presente invenção desenvolveram novos compostos ora descritos e reivindicados, compreendendo o composto 3- (benzo [d] [ 1 , 3] dioxol-5-il ) -7- ( 1- hidroxipropan-2-il ) -1- (1H-indol-3-il) -6, 7-dihidro-3H- oxazol [3, 4-a] pirazina-5, 8-diona e seus estereoisômeros que apresentaram, juntos e separadamente, atividades proeminentes como inibidores de PDE, antiproliferativos e anti -tumorais .
Dessa forma, sob um aspecto, os compostos ora reivindicados se colocam como alternativas para o tratamento de diversas doenças e condições médicas que se beneficie da inibição de PDE, como disfunção erétil, insuficiência cardíaca, hipertensão pulmonar e para o tratamento de diversas doenças e condições médicas que se beneficie de seus efeitos antiproliferativos e antitumorais .
DECRÇÃO DEALHDAA
O presente pedido de patente se refere, em um aspecto, ao composto 3- (benzo [d] [ 1 , 3 ] dioxol-5-il ) -7- (1-hidroxipropan-2- il ) -1- (1H-indol-3-il ) - 6, 7-dihidro-3H-oxazol [3, 4-a]pirazina- 5, 8-diona de formula (I), e seus estereoisômeros,
Figure imgf000005_0001
bem como aos seus sais, solvatos, hidratos, pró drogas e ésteres farmaceuticamente aceitáveis;
Em aspectos alternativos, os referidos estereoisômeros do composto de formula (I) estão nas suas formas individuais separadas e/ou nas formas de misturas racêmicas ou misturas não-racêmicas com excesso diastereoisomérico em quaisquer proporções .
Em aspectos específicos, os estereoisômeros são os compostos de fórmulas (II) e (III)
Figure imgf000006_0001
O composto de fórmula (II) é denominado 3-
(benzo [ d] [1,3] dioxol-5-il ) -7- ( ( S) 1-hidroxipropan-2-il ) -1- ( 1H- indol-3-il ) - 6, 7-dihidro-3H-oxazol [3, 4-a]pirazina-5, 8-diona (BL-236) e o composto de fórmula (III) é denominado 3-
(benzo [ d] [1,3] dioxol-5-il ) -7- ( (R) 1-hidroxipropan-2-il ) -1- ( 1H- indol-3-il ) - 6, 7-dihidro-3H-oxazol [3, 4-a]pirazina-5, 8-diona (BL-239) .
Em um aspecto preferencial, o presente pedido de patente se refere aos estereoisômeros isolados denominados pelas fórmulas (IV), (V), (VI) e (VII), abaixo:
Figure imgf000006_0002
Figure imgf000007_0001
Os estereoisômeros descritos acima são denominados:
composto de fórmula (IV): ( S) -3- (benzo [ d] [ 1 , 3 ] dioxol-5- il) -7- ( (S) -1-hidroxipropan-2-il ) -1- (1H-indol-3-il ) -6, 7- dihidro-3-oxazol [ 3 , 4-a] pirazina-5, 8-diona (BL-236A) ;
composto de fórmula (V): (R) -3- (benzo [ d] [ 1 , 3 ] dioxol-5- il) -7- ( (S) -1-hidroxipropan-2-il ) -1- (1H-indol-3-il ) -6, 7- dihidro-3H-oxazol [ 3 , 4-a] pirazina-5, 8-diona (BL-236B) ;
composto de fórmula (VI): ( S) -3- (benzo [ d] [ 1 , 3 ] dioxol-5- il) -7- ( (R) -1-hidroxipropan-2-il ) -1- ( 1H-indol-3-il ) -6, 7- dihidro-3H-oxazol [ 3 , 4-a] pirazina-5, 8-diona (BL-239A) ; e
composto de fórmula (VII): (R) -3- (benzo [ d] [ 1 , 3 ] dioxol-5- il) -7- ( (R) -1-hidroxipropan-2-il ) -1- ( 1H-indol-3-il ) -6, 7- dihidro-3H-oxazol [ 3 , 4-a] pirazina-5, 8-diona (BL-239B) .
Outro aspecto do presente pedido de patente refere-se a misturas de estereoisômeros do composto 3-
(benzo [ d] [1,3] dioxol-5-il ) -7- ( 1-hidroxipropan-2-il ) -1- ( 1H- indol-3-il ) - 6, 7-dihidro-3H-oxazol [3, 4-a] pirazina-5, 8-diona de formula (I), onde as misturas podem ser uma mistura racêmica ou mistura não-racêmica .
Preferencialmente, o presente pedido de patente busca proteção para misturas não-racêmicas com excesso diastereoisomérico em quaisquer proporções.
Mais especificamente , a proporção diastereoisomérica está na faixa de 1:99 a 99:1. Em outro aspecto preferencial, a mistura está na faixa de 1:50 a 50:1, alternativamente na faixa de 1:25 a 25:1. Em um aspecto mais preferencial, as misturas não-racêmicas com excesso diastereoisomérico estão na faixa de 1:2 a 2:1, alternativamente na proporção de 1:1.
Em outro aspecto preferencial, o presente pedido de patente se refere a mistura dos diastereoisômeros descrita nas fórmulas (VIII) e (IX), sendo que a mistura pode conter quaisquer proporções dos diastereoisômeros.
A mistura de diastereoisômeros de fórmula (VIII) é denominada ( R) -3- (benzo [d] [1, 3] dioxol-5-il) -7- ( ( R) -1- hidroxipropan-2-il ) -1- ( 1H-indol-3-il ) -6, 7-dihidro-3H- oxazol [3, 4-a] pirazina-5, 8-diona com (S)-3-
(benzo [ d] [1,3] dioxol-5-il ) -7- ( ( R) -1-hidroxipropan-2-il ) -1- (1H-indol-3-il ) - 6, 7-dihidro-3H-oxazol [3, 4-a]pirazina-5, 8- diona (BL-380) e apresenta a seguinte estrutura:
Figure imgf000008_0001
onde a proporção diastereoisomérica está na faixa de 1:99 a 99:1. Em outro aspecto preferencial, a mistura está na faixa de 1:50 a 50:1, mais preferencial na faixa de 1:25 a 25:1. Em um aspecto mais preferencial, a mistura está na faixa de 1:2 a 2:1, mais preferencial na proporção de 1:1.
A mistura de diastereoisômeros de fórmula (IX) é denominada ( R) -3- (benzo [d] [1, 3] dioxol-5-il) -7- ( (S) -1- hidroxipropan-2-il ) -1- ( 1H-indol-3-il ) -6, 7-dihidro-3H- oxazol [3, 4-a] pirazina-5, 8-diona com (S)-3- (benzo [ d] [1,3] dioxol-5-il ) -7- ( ( S) -1-hidroxipropan-2-il ) -1- (1H-indo1-3-il ) - 6, 7-dihidro-3H-oxazol [3, 4-a]pirazina-5, 8- diona (BL-241), e apresenta a seguinte estrutura: BL-241
onde a proporção diastereoisomérica está na faixa de 1:99 a 99:1. Em outro aspecto preferencial, a mistura está na faixa de 1:50 a 50:1, alternativamente na faixa de 1:25 a 25:1. Em mais um aspecto preferencial, a mistura está na faixa de 1:2 a 2:1, alternativamente na proporção de 1:1.
Os diastereoisômeros e suas misturas, objetos do presente pedido de patente, podem ser preparados, por exemplo, de acordo com os esquemas reacionais abaixo:
Esquema 1: Procedimento de preparação do composto de fórmula
(VIII) (R)-3- (benzo [d] [1, 3] dioxol-5-il) -7- ( (R) -1- hidroxipropan-2-il ) -1- ( 1H-indol-3-il ) -6, 7-dihidro-3H- oxazolo[3,4-a]pirazina-5, 8-diona com (S) -3-
(benzo [ d] [1,3] dioxol-5-il ) -7- ( (R) -1-hidroxipropan-2-il ) -1- ( 1H-indol-3-il ) -6, 7-dihidro-3H-oxazol [3, 4-a]pirazina-5, 8- diona (BL-380) .
Figure imgf000009_0001
E squema 2 : Procedimento de preparação do composto de fórmula
( IX) - (R) -3- (benzo [d] [1, 3] dioxol-5-il) -7- ( (S) -1- hidroxipropan-2-il ) -1- ( 1H-indol-3-il ) -6, 7-dihidro-3H- oxazol [3, 4-a] pirazina-5, 8-diona com (S)-3- (benzo [ d] [1,3] dioxol-5-il ) -7- ( ( S) -1-hidroxipropan-2-il ) -1- ( 1H-indol-3-il ) -6, 7-dihidro-3H-oxazol [3, 4-a]pirazina-5, 8- diona ( BL-24 1 ) .
Figure imgf000010_0001
0 presente pedido de patente também abrange as composições farmacêuticas compreendendo os referidos estereoisômeros do composto de fórmula (I) nas suas formas individuais separadas e/ou nas formas de misturas racêmicas ou misturas não-racêmicas com excesso estereoisômeros em quaisquer proporções e medicamentos compreendendo os referidos estereoisômeros. Tais composições podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos de tecnologia farmacêutica, utilizando-se de diluentes, excipientes ou carreadores farmaceuticamente aceitáveis .
Outro aspecto do presente pedido de patente trata-se do uso do composto de fórmula (I) e dos seus estereoisômeros como antitumorais e inibidores da enzima fosfodiesterase, mais especificamente como antitumorais e inibidores da enzima fosfodiesterase de tipo 5 (PDE-5) ; e ao uso dos referidos estereoisômeros no tratamento de hiperplasia prostática benigna e câncer, mais especificamente o câncer de próstata. Um aspecto preferencial do presente pedido de patente refere-se ao uso da mistura definida pela fórmula (VIII) e denominada como (R) -3- (benzo [ d] [ 1 , 3 ] dioxol-5-il ) -7- ( (R) -1- hidroxipropan-2-il ) -1- ( 1H-indol-3-il ) -6, 7-dihidro-3H- oxazol [3, 4-a] pirazina-5, 8-diona com (S)-3-
(benzo [ d] [1,3] dioxol-5-il ) -7- ( (R) -1-hidroxipropan-2-il ) -1- ( 1H-indol-3-il ) -6, 7-dihidro-3H-oxazol [3, 4-a]pirazina-5, 8- diona (BL-380), em qualquer proporção dos diastereoisômeros , como agente antitumoral e para o tratamento de desordens tratáveis com inibidores da PDE-5 em mamíferos. Em particular para o tratamento de câncer de próstata e hiperplasia prostática benigna.
Outro aspecto preferencial do presente pedido de patente refere-se ao uso dos estereoisômeros isolados definidos pelas fórmulas (IV), (V), (VI) e (VII) e denominados, respectivamente, como: ( S) -3- (benzo [ d] [ 1 , 3 ] dioxol-5-il ) -7-
( ( S) -1-hidroxipropan-2-il ) - 1- ( 1H-indol-3-il ) - 6, 7-dihidro-3H- oxazol [3, 4-a] pirazina-5, 8-diona ( BL-236A) ; (R)-3-
(benzo [ d] [1,3] dioxol-5-il ) -7- ( ( S) -1-hidroxipropan-2-il ) -1- ( 1H-indol-3-il ) - 6, 7-dihidro-3H-oxazol [3, 4-a]pirazina-5, 8- diona ( BL-236B ) ; ( S) -3- (benzo [ d] [ 1 , 3 ] dioxol-5-il ) -7- ( (R) -1- hidroxipropan-2-il ) -1- ( 1H-indol-3-il ) -6, 7-dihidro-3H- oxazol [3, 4-a] pirazina-5, 8-diona ( BL-239A) ; e (R) -3-
(benzo [ d] [1,3] dioxol-5-il ) -7- ( (R) -1-hidroxipropan-2-il ) -1- ( 1H-indo1-3-il ) - 6, 7-dihidro-3H-oxazol [3, 4-a]pirazina-5, 8- diona ( BL-239B ) , como agente antitumoral e para o tratamento de desordens tratáveis com inibidores da PDE-5 em mamíferos. Em particular para o tratamento de câncer de próstata e hiperplasia prostática benigna.
Também são objetos do presente pedido de patente usos do composto de fórmula (I) e seus estereoisômeros, sais, ésteres, pró drogas, conforme aqui descritos, na preparação de medicamentos antiproliferativos, antitumorais e inibidores da enzima fosfodiesterase, mais especificamente inibidores da enzima fosfodiesterase de tipo 5 (PDE-5) ; e ao uso dos referidos estereoisômeros na preparação de medicamentos para o tratamento de doenças e condições, como doenças e condições inflamatórias, cardiovasculares, pulmonares, disfunção erétil no homem, hiperplasia prostática benigna e câncer, mais especificamente o câncer de próstata.
O presente pedido de patente também descreve um método de tratamento de câncer, como a hiperplasia prostática benigna e câncer, mais especificamente o câncer de próstata, usando os estereoisômeros do composto de fórmula (I), seus sais, solvatos, hidratos, pró-drogas e ésteres farmaceuticamente aceitáveis; onde os estereoisômeros estão nas suas formas individuais separadas e/ou nas formas de misturas racêmicas ou misturas não-racêmicas com excesso diastereoisomérico em quaisquer proporções.
Tais usos e métodos de tratamento descritos acima compreendem o fornecimento de uma quantidade terapeuticamente efetiva dos compostos, e seus respectivos sais, solvatos, pro- fármacos, estereoisômeros e misturas racêmicas dos mesmos.
Outro objeto do presente pedido de patente é o processo de produção dos estereoisômeros do composto 3- (benzo [ d] [1,3] dioxol-5-il ) -7- ( 1-hidroxipropan-2-il ) -1- ( 1H- indol-3-il ) -6, 7-dihidro-3H-oxazol [3, 4-a]pirazina-5, 8-diona de fórmula (I) , conforme descrito nos esquemas acima e exemplos a seguir.
EXEMPLOS :
Deve ser entendido que os exemplos e concretizações aqui descritos detalhadamente ilustram O presente pedido de patente sem, todavia, limitar seu escopo.
Exemplo 1 : Preparação do Composto de fórmula (VI I I ) Em um balão de 500 mL munido de agitação mecânica, funil de adição e tubo secante contendo CaCl2 foram adicionados o composto intermediário (E) -metil 2- ((benzo [d] [ 1 , 3 ] dioxol-5-il metileno) amino) -3- ( 1H-indol-3-il ) -3-oxopropanoato de fórmula (A) (5,0 g, 13,7 mmol), THF seco (90 mL) e piridina seca (5,5 mL) que foi agitada por 30 minutos. A esta suspensão foi adicionada lentamente, aproximadamente 2 h, uma solução de cloreto de cloroacetila (1,5 mL, 19,2 mmol) em THF seco (23 mL) . Após adição, a mistura reacional foi reagida por um período de 4 h à temperatura ambiente. Ao término deste período, foi adicionado ( R) -2-aminopropano-1-ol (23,7 g, 315,1 mmol) ao meio e, a mistura agitada por um período de 16 h. Ao fim deste tempo, 100 mL de etanol foi adicionado. O sistema foi submetido a destilação à vácuo, e o excesso de solvente removido até a precipitação do produto. O balão foi resfriado à temperatura ambiente e posteriormente entre 0 e 5 °C, e agitado por 2 h nesta temperatura. O sólido foi colocado em um balão de 100 mL e adicionou-se 30 mL de etanol; a mistura foi agitada por um período de 30 minutos. Terminado esse período, o sólido foi filtrado e seco à vácuo, levando a formação do composto de fórmula (VIII), constituído da mistura dos compostos (VI) e (VII) correspondentes em 41% de rendimento .
O composto obtido por esse processo apresenta nomenclatura IUPAC ( R) -3- (benzo [ d] [ 1 , 3 ] dioxol-5-il ) -7- ( ( R) -1- hidroxipropan-2-il ) -1- ( 1H-indol-3-il ) -6, 7-dihidro-3H- oxazol [3, 4-a] pirazina-5, 8-diona com (S)-3-
(benzo [ d] [1,3] dioxol-5-il ) -7- ( ( R) -1-hidroxipropan-2-il ) -1- ( 1H-indol-3-il ) - 6, 7-dihidro-3H-oxazol [3, 4-a]pirazina-5, 8- diona ( BL-380 ) , representado pela estrutura química (VIII) :
Figure imgf000014_0002
e apresenta as seguintes características : sólido amarelo; ponto de fusão 256-262 °C; NMR íH (500 MHz, DMSO-d6) : d 11.84 (ls, 2H) , 8.97-8.95 (m, 2H) , 7.87-7.85 (m, 2H) , 7.47-7.46 (m, 2H) , 7.17-7.09 (m, 8H) , 7.08-7.04 (m, 2H),6.04 (s, 4H) , 4.84 (t, J= 5.8 Hz, 1H) , 4.80 (t, J= 5.8 Hz, 1H) , 4.67-4.60 (m, 2H) , 4.14-4.03 (m, 4H) , 3.57-3.42 (m, 4H) , 1.11 (d, J= 7.0 Hz, 3H) , 1.08 (d, J= 7.0 Hz, 3H) ; NMR isC (125 MHz, DMSO-d6) : d 159.0, 158.7, 157.0, 156.7, 148,3, 147.6, 147.57, 147,55,
135.77, 135.76, 131.1 131.0, 130.9, 130.8, 125.2, 122.1, 121.3, 120.50, 120.49, 120.44, 120.36, 112.1, 108.3, 108.2, 106.5,
106.4, 105.2, 105.1, 102.3, 101.4, 90.3, 90.1, 61.8, 61.4,
49.4, 49.3, 46.3, 46.1, 13.2, 13.1. HRMS (EI) m/z calculated for C24H21N3O6: [447.1430]+ found: 448.1542 [M+H] + .
Como intermediários reacionais foram utilizados os compostos: (E) -metil 2- ( (benzo [ d] [ 1, 3 ] dioxol-5-il metileno) amino) -3- ( 1H-indol-3-il ) -3-oxopropanoato , descrito pela estrutura química (A); o composto ( R) -2-aminopropano-1- ol (3), e o 2- cloreto de cloroacetila (1), conforme exemplificado abaixo e no esquema 1.
Figure imgf000014_0001
Exemplo 2 : Preparação do Composto de fórmula (IX)
Em um balão de 500 mL munido de agitação mecânica, funil de adição e tubo secante contendo CaCl2 foram adicionados o composto intermediário (E) -metil 2- ((benzo [d] [ 1 , 3 ] dioxol-5-il metileno) amino) -3- ( 1H-indol-3-il ) -3-oxopropanoato de fórmula (A) (5,0 g, 13,7 mmol), THF seco (90 mL) e piridina seca (5,5 mL) que foi agitada por 30 minutos. A esta suspensão foi adicionada lentamente, por aproximadamente 2 h, uma solução de cloreto de cloroacetila (1,5 mL, 19,2 mmol) em THF seco (23 mL) . Após a adição, a mistura reacional foi reagida por um período de 4 h à temperatura ambiente. Ao término deste período, foi adicionado ( S) -2-aminopropano-1-ol (23,7 g, 315,1 mmol) ao meio e, a mistura agitada por um período de 16 h. Ao fim deste tempo, 100 mL de etanol foi adicionado. O sistema foi submetido a destilação à vácuo, e o excesso de solvente removido até a precipitação do produto. O balão foi resfriado à temperatura ambiente e posteriormente entre 0 e 5 °C, e agitado por 2 h nesta temperatura. O sólido foi colocado em um balão de 100 mL e adicionou-se 30 mL de etanol; a mistura foi agitada por um período de 30 minutos. Terminado esse período, o sólido foi filtrado e seco à vácuo, levando a formação do composto de fórmula (IX), constituído da mistura dos compostos (IV) e (V) correspondentes em 40% de rendimento.
O composto obtido por esse processo apresenta nomenclatura IUPAC ( R) -3- (benzo [ d] [ 1 , 3 ] dioxol-5-il ) -7- ( ( S) -1- hidroxipropan-2-il ) -1- ( 1H-indol-3-il ) -6, 7-dihidro-3H- oxazol [3, 4-a] pirazina-5, 8-diona com (S)-3-
(benzo [ d] [1,3] dioxol-5-il ) -7- ( ( S) -1-hidroxipropan-2-il ) -1- ( 1H-indol-3-il ) - 6, 7-dihidro-3H-oxazol [3, 4-a]pirazina-5, 8- diona (BL-241), representado pela estrutura química (IX) :
e apresenta as seguintes características : sólido amarelo; ponto de fusão 256-261 °C; NMR íH (500 MHz, DMSO-d6) : d 11.84 (is, 2H) , 8.97-8.95 (m, 2H) , 7.88-7.85 (m, 2H) , 7.47-7.46 (m, 2H) , 7.17-7.05 (m, 10H) , 6.98-6.96 (m, 2H) , 6.04 (s, 4H) , 4.84 (t, J= 5.5 Hz, 1H) , 4.80 (t, J= 5.5 Hz, 1H) , 4.67-4.60 (m, 2H) , 4.14-4.03 (m, 4H) , 3.57-3.42 (m, 4H) , 1.11 (d, J= 7.0 Hz, 3H) , 1.08 (d, J= 7.0 Hz, 3H) ; NMR 13C (125 MHz, DMSO-d6): d 159.0, 158.7, 157.0, 156.8, 148,3, 147.6, 147.57, 147,55,
135.8, 135.78, 135.77, 131.1 131.0, 130.9, 130.8, 125.2, 122.1, 121.3, 120.5, 120.49, 120.44, 120.36, 112.1, 108.3, 108.2, 106.5, 106.4, 105.2, 105.1, 102.3, 101.4, 90.3, 90.1, 61.8,
61.4, 49.4, 49.3, 46.3, 46.1, 13.2, 13.1. HRMS (EI) m/z calculated for C24H21N3O6: [447.1430]+ found: 448.1541 [M+H] + .
Como intermediários reacionais foram utilizados os compostos: (E) -metil 2- ( (benzo [ d] [ 1, 3 ] dioxol-5-il metileno) amino) -3- ( 1H-indol-3-il ) -3-oxopropanoato, descrito pela estrutura química (A); e o composto ( S) -2-aminopropano- 1-ol (4) e o cloreto de cloroacetila (1), conforme exemplificado abaixo e no esquema 2.
Figure imgf000017_0001
Exemplo 3: Processo de purificação dos diastereoisômeros de fórmulas (IV) e (V)
Em um balão de 1,0 L, foi adicionado 4,5 g do composto de fórmula (IX) (R) -3- (benzo [d] [1, 3] dioxol-5-il) -7- ( (S) -1- hidroxipropan-2-il ) -1- ( 1H-indol-3-il ) -6, 7-dihidro-3H- oxazol [3, 4-a] pirazina-5, 8-diona com (S)-3-
(benzo [ d] [1,3] dioxol-5-il ) -7- ( ( S) -1-hidroxipropan-2-il ) -1- ( 1H-indo1-3-il ) - 6, 7-dihidro-3H-oxazol [3, 4-a]pirazina-5, 8- diona (BL-241), e 75 mL de uma mistura de THF/H2O (8:2) . A suspensão foi aquecida à 50 °C até a solubilização . Após a solubilização, 560 mL de metanol foi adicionado ao meio e agitado por 2 horas à temperatura ambiente. 0 sólido formado foi filtrado à vácuo, lavado com 50 mL de metanol, e seco em estufa a 100°C por 4 horas. Está etapa gerou o isolamento de um dos compostos BL-236A ou BL-236B, o qual apresenta as seguintes caracteristicas : sólido amarelo, ponto de fusão: 227-231°C; NMR 1H (300 MHz , DMS0-d6) : d 11.89 (ls, 1H) , 8.97 (d, J= 1.8 Hz, 1H) , 7.86 (d, J= 7.9 Hz, 1H) , 7.46 (d, J= 7.9
Hz, 1H) , 7.18-7.03 (m, 5H) , 6.98 (dd, J= 7.4 Hz, J= 1.0 Hz,
1H) , 6.04 (s, 2H) , 4.88 (t, J= 5.5 Hz, 1H) , 4.69-4.58 (m, 1H) , 4.07 (dd, J= 22.5 Hz, J= 17.5 Hz, 2H) , 3.58-3.41 (m, 2H) , 1.07 (d, J= 6.9 Hz, 3H) ; NMR 13C (75 MHz, DMSO-d6) : d 159.9, 157.1, 148.4, 147.7, 147.6, 135.8, 131.2, 130.9, 125.3, 122.2, 121.4,
120.6, 120.5, 112.3, 108.4, 106.6, 105.2, 102.5, 101.5, 90.2, 61.4, 49.4, 46.1, 13.2; HRMS (EI) m/ z calculated for C24H21N3O6:
[447.1430]+, found: 448.1321 [M+H]+. A estrutura química do composto foi elucidada por análise de ressonância magnética nuclear, massas de alta resolução e cristalografia de raio-X.
A água mãe da filtração anterior foi retornada para o balão reacional e adicionada lentamente 200 mL de H2O, levando à turvação do meio reacional, a qual foi agitada por uma hora à temperatura ambiente. A suspensão foi filtrada à vácuo e lavada com 50 mL de etanol. O sólido obtido foi ressuspendido em 50 mL de etanol e novamente filtrado, o qual foi posteriormente foi seco em estufa a 100°C por 4 horas, levando ao isolamento do outro composto do BL-236) , o qual apresenta as seguintes características : sólido amarelo, ponto de fusão: 221-225°C; NMR 1H (300 MHz , DMSO-d6) : d 11.90 (is, 1H) , 8.96
(s, 1H) , 7.85 (d, J= 7.9 Hz, 1H) , 7.46 (d, J= 7.9 Hz, 1H) , 7.18-7.03 (m, 5H) , 6.97 (d, J= 7.9 Hz, 1H) , 6.04 (s, 2H) , 4.83 (t, J= 5.7 Hz, 1H) , 4.67-4.60 (m, 1H) , 4.09 (dd, J= 25.7 Hz,
J= 17.6 Hz, 2H) , 3.56-3.41 (m, 2H) , 1.10 (d, J= 6.9 Hz, 3H) ;
NMR 13C (75 MHz, DMSO-d6) : d 158.7, 156.8, 148.4, 147.6 (2C) , 135.8, 131.1, 130.9, 125.3, 122.2, 121.4, 120.6, 120.5, 112.2, 108.3, 106.6, 105.2, 102.4, 101.5, 90.4, 61.8, 49.4, 46.3, 13.3; HRMS (EI) m/ z calculated for C24H21N3O6: [447.1430]+, found: 448.1530 [M+H]+. A estrutura química do composto foi elucidada por análise de ressonância magnética nuclear, massas de alta resolução e cristalografia de raio-X.
Com esse processo temos a separação dos compostos (S) 3- (benzo [ d] [1,3] dioxol-5-il ) -7- ( ( S) -1-hidroxipropan-2-il ) -1- ( 1H-indol-3-il ) - 6, 7-dihidro-3H-oxazol [3, 4-a]pirazina-5, 8- diona (BL-236A) e (R) -3- (benzo [d] [1, 3] dioxol-5-il )—7— ( (57)— 1— hidroxipropan-2-il ) -1- ( 1H-indol-3-il ) -6, 7-dihidro-3H- oxazol [3, 4-a] pirazina-5, 8-diona (BL-236B) , representados pelas estruturas (IV) e (V), respectivamente .
Figure imgf000019_0001
Exemplo 4 : Processo de purificação dos diastereoisômeros de fórmulas (VI) e (VII)
Em um balão de 1,0 L foi adicionado 4,5 g do composto de fórmula (VIII) (R) -3- (benzo [d] [1, 3] dioxol-5-il) -7- ( (R) -1- hidroxipropan-2-il ) -1- ( 1H-indol-3-il ) -6, 7-dihidro-3H- oxazol [3, 4-a] pirazina-5, 8-diona com (S)-3-
(benzo [ d] [1,3] dioxol-5-il ) -7- ( (R) -1-hidroxipropan-2-il ) -1- ( 1H- indo 1-3- il ) - 6, 7-dihidro-3H-oxazol [3, 4-a]pirazina-5, 8- diona (BL-380), e 75 mL uma mistura de THF/H2O (8:2) . A suspensão foi aquecida à 50°C até a solubilização . Após a solubilização, 560 mL de metanol foi adicionada ao meio, e agitado por 2 horas à temperatura ambiente. O sólido formado foi filtrado à vácuo, lavado com 50 m de metanol, e seco em estufa a 100°C por 4 horas. Está etapa gerou o isolamento de um dos compostos BL-239A ou BL-239B, o qual apresenta as seguintes caracteristicas : Sólido amarelo, ponto de fusão: 233- 236 ° C ; NMR 1H (300 MHz , DMSO-d6) : d 11.89 (ls, 1H) , 8.97 (d, J= 2.4 Hz, 1H) , 7.86 (d, J= 7.9 Hz, 1H) , 7.46 (d, J= 8.0 Hz, 1H) , 7.18-7.04 (m, 5H) , 6.98 (d, J= 8.3 Hz, 1H) , 6.04 (s, 2H) , 4.88 (t, J= 5.7 Hz, 1H) , 4.67-4.60 (m, 1H) , 4.07 (dd, J= 22.5
Hz, J= 17.5 Hz, 2H) , 3.58-3.41 (m, 2H) , 1.06 (d, J= 6.9 Hz, 3H) ; NMR 13C (75 MHz, DMSO-d6) : d 159.1, 157.1, 148.4, 147.7, 147.6, 135.8, 131.2, 130.9, 125.3, 122.2, 121.4, 120.6, 120.5, 112.3, 108.4, 106.6, 105.2, 102.4, 101.5, 90.2, 61.4, 49.4,
46.1, 13.2; HRMS (EI) m/ z calculated for C24H21N3O6: [447.1430]+, found: 448.1540 [M+H]+. A estrutura química do composto foi elucidada por análise de ressonância magnética nuclear, massas de alta resolução e cristalografia de raio-X.
A água mãe da filtração anterior foi retornada para o balão reacional e adicionada lentamente 200 mL de H2O, levando à turvação do meio reacional, a qual foi agitada por 1 hora à temperatura ambiente. A suspensão foi filtrada à vácuo e lavada com 50 mL de etanol. O sólido obtido foi ressuspendido em 50 mL de etanol e novamente filtrado, o qual foi posteriormente seco em estufa a 100°C por 4 horas, levando ao produto de interesse (outra molécula de BL-239) Sólido amarelo, ponto de fusão: 223- 225 ° C ; NMR 1H (300 MHz , DMSO-d6) : d 11.90 (ls, 1H) , 8.96 (s, 1H) , 7.85 (d, J= 8.2 Hz, 1H) , 7.47 (d, J= 8.2 Hz, 1H) , 7.18-
7.03 (m, 5H) , 6.98 (d, J= 8.0 Hz, 1H) , 6.04 (s, 2H) , 4.84 (t, J= 5.6 Hz, 1H) , 4.69-4.58 (m, 1H) , 4.09 (dd, J= 25.7 Hz, J=
17.6 Hz, 2H) , 3.55-3.41 (m, 2H) , 1.10 (d, J= 6.7 Hz, 3H) ; NMR
13C (75 MHz, DMSO-d6) : d 158.7, 156.8, 148.4, 147.6 (2C), 135.8, 131.1, 130.9, 125.3, 122.2, 121.4, 120.6, 120.5, 112.2, 108.3, 106.6, 105.2, 102.4, 101.5, 90.4, 61.8, 49.4, 46.3, 13.3; HRMS (EI) m/ z calculated for C24H21N3O6: [447.1430]+, found: 448.1529, [M+H]+. A estrutura química do composto foi elucidada por análise de ressonância magnética nuclear, massas de alta resolução e cristalografia de raio-X.
Com esse processo temos o isolamento dos compostos (S)- 3-(benzo[d] [l,3]dioxol-5-il)-7-( (R) -l-hidroxipropan-2-il ) -1- (1H-indol-3-il ) - 6, 7-dihidro-3H-oxazol [3, 4-a]pirazina-5, 8- diona (BL-239A) e (R) -3- (benzo [ d] [ 1 , 3 ] dioxol-5-il ) -7- ( (R) -1- hidroxipropan-2-il ) -1- ( 1H-indol-3-il ) -6, 7-dihidro-3H- oxazol [3, 4-a] pirazina-5, 8-diona (BL-239B) , representados pelas estruturas (VI) e (VII), respectivamente .
Figure imgf000021_0001
Exemplo 7 : Avaliação, in vitro, do potencial inibitório dos compostos sob a atividade da enzima fosfosdiesterase 5 humana.
A avaliação do composto é estudada utilizando kit de ensaio enzimático da BPS Bioscience (catálogo 60350) . 0 kit de ensaio PDE5A1 permite identificar inibidores de PDE5A1 usando polarização de fluorescência. O ensaio baseia-se na ligação de um monofosfato nucleotidico fluorescente gerado pela enzima PDE5A1 ao agente de ligação.
Nesta metodologia apenas duas etapas simples, em uma placa de microtitulação , são necessárias para as reações da PDE5A1. Primeiro, o GMPc marcado com fluorescência é incubado com PDE5A1 durante 1 hora. Na sequência, o agente de ligação é adicionado à mistura reacional para produzir uma alteração na polarização fluorescente que pode então ser medida utilizando um leitor de fluorescência equipado para a medição da polarização de fluorescência.
Para o ensaio é diluído o reagente estoque FAM-Cyclic-
3',5'-GMP (20mM) com tampão de PDE para chegar à solução com concentração de 200 mM; a enzima PDE5A1 é descongelada e diluída com tampão de PDE obtendo uma solução de PDE5A1 a 10 pg/mL.
Os compostos para teste são diluídos com DMSO 100% (v/v) a uma concentração de 1000 mM e depois diluído em solução de cloreto de Sódio 0,9% para obter a curva de concentrações de interesse para o teste. Os compostos são diluído nas concentrações de: 10 nM, 30 nM, 50 nM, 100 nM, 300 nM, 500 nM, 1 mM, 3 mM, 5 mM (DMSO 10% v/v) .
O estudo é composto dos grupos: (i) controle de substrato; (ii) controle positivo (KIT); (iii) amostras em várias concentrações; (iv) tadalafila (controle comparativo) . Cada parâmetro (grupo) é plaqueado em triplicada.
Procedimento do ensaio ;
• Para os 4 grupos é adicionado, a cada poço da microplaca, 25 mL do reagente FAM-Cyclic-3 ' , 5' -GMP (200 mM) .
• Ao grupo controle de substrato é adicionado, a cada poço, 5 mL de Veiculo (DMSO 10% v/v) e 20 mL de Tampão de PDE .
• Ao grupo controle positivo é adicionado, a cada poço, 5 mL de Veiculo (DMSO 10% v/v) .
• Ao grupo do tadalafila: é adicionado 5 mL da solução nas concentrações de interesse
• Ao grupo teste é adicionado 5 mL da solução da amostra
(composto de teste)
OBSERVAÇÃO : Os parâmetros testados estão em triplicata.
Para inicio da reação, adicionar 20 mL da enzima PDE5A1 (diluída conforme descrito acima) aos poços da microplaca designados como Controle Positivo e Amostras (teste e tadalafila) , e incubar a microplaca, por 1 hora, à temperatura de 25 ° C .
Após o período de incubação, a reação é interrompida pela adição, em todos os poços, de 100 mL da solução do agente de ligação e a microplaca é incubada por 30 minutos, sob agitação leve, em temperatura ambiente. A leitura da microplaca é realizada em Fluorescência Polarizada (475-495 nm - excitação e 518-538 nm - detecção de emissão) 500 nanosegundos de tempo de integração .
Para o composto BL-380 foi preparada as concentrações de 10 nM, 30 nM, 50 nM, 100 nM, 300 nM, 500 nM, 1 mM (1000 nM) , 3 mM (3000 nM) e 5 mM (5000 nM) . Com base nos resultados obtidos, (tabela 1) é possível observar que o composto BL-380 foi eficaz em inibir a PDE5 de forma dose dependente, porém essa inibição só foi observada a partir da concentração de 300 nM de BL-380.
EA - Porcentagem de inibição da enzima PDE5 pelo composto
Figure imgf000023_0001
BL-380.
Figure imgf000023_0002
Para o composto BL-241 foi preparada as concentrações de 500 nM, 1 mM (1000 nM) e 3 mM (3000 nM) . Com base nos resultados obtidos, (tabela 2) é possível observar que o composto BL-241 também foi eficaz em inibir a PDE5 de forma dose dependente.
TABELA 2 - Porcentagem de inibição da enzima PDE5 pelo composto BL-241.
Figure imgf000023_0003
Exemplo 6 : Avaliação do efeito antiproliferativo dos compostos em culturas de células de linhagens humanas de câncer de próstata, estômago e bexiga.
Para a realização do ensaio, os compostos são diluídos em DMSO 100% (v/v) a uma concentração de 1000 mM e depois diluído em solução de Cloreto de Sódio 0,9% para obter as soluções estoques de interesse para uso nos ensaios. A concentração final de interesse será diluída diretamente no meio de cultura das células .
Para o experimento são utilizadas as seguintes linhagens de células tumorais: PC3-câncer de próstata humano; LNCAP- câncer de próstata humano; DU145-câncer de próstata humano; MNK45-câncer de estômago humano e RT4-câncer de bexiga humano.
As linhagens de células tumorais são mantidas em cultura conforme procedimentos padrões estabelecidos pelo Banco de Células do Rio de Janeiro (local de origem das linhagens) . Procedimento :
• Para o ensaio, as células tumorais são semeadas na concentração de 10.000 células por poço (volume final de reação de 200. mL), a placa é incubada por 8 horas, para que as células aderirem à parede dos poços. Após esse período, a placa é dividida em grupos:
(a) grupo teste: adicionado 20 mL das amostras (composto teste) nas concentrações de interesse;
(b) grupo controle positivo: adicionado 20 mL de meio de cultura (100% de proliferação das células) ;
(c) grupo controle negativo: adicionado 200 mL de meio de cultura e 20 mL do veículo utilizado para diluir os compostos (sem células - proliferação zero) ;
(d) grupo controle: adicionado 20 mL do veículo utilizado para diluir os compostos . Esse grupo é importante por avaliar se o veículo utilizado interfere na proliferação celular . OBSERVAÇÃO : O tratamento com as concentrações das amostras (compostos de teste) e dos controles são realizados em triplicata .
• Incubar a placa por 72 horas em estufa de CO2 a 37°C.
• Após o período de incubação, adicionar 100mL /poço da solução com marcador de DNA do Kit CYQuant e incubar a placa, por 60 minutos, em estufa de CO2 a 37°C. A intensidade de fluorescência é determinada usando um leitor de microplacas de fluorescência com excitação 485 nm e detecção de emissão de 530 nm. Os resultados obtidos foram normalizados em relação ao grupo controle positivo (100% de proliferação) .
Para os compostos são preparadas as soluções estoques nas concentrações de: 100 nM, 1 mM, 3 mM, 5 mM, 10 mM e 30 mM (DMSO 10% v/v) . Sendo que as concentrações finais no teste são de: 10 nM, 100 nM, 300 nM, 500 nM, 1000 nM e 3000 nM (em DMSO 1% v/v) .
Os resultados obtidos demonstram que o composto BL-380 apresentou efeito antiproliferativo para as 3 linhagens tumorais de câncer de próstata testadas (PC3, LNCAP e DU145) e para a linhagem tumoral de câncer de bexiga (RT4), como pode ser observado na tabela 3. E o composto BL-241 apresentou efeito antiproliferativo para as 3 linhagens tumorais de câncer de próstata testadas (PC3, LNCAP e DU145) e para a linhagem tumoral de câncer de bexiga (RT4), como pode ser observado na tabela 4. TABELA 3 - Porcentagem de inibição da proliferação celular - composto BL-380.
Figure imgf000026_0001
TABELA 4 - Porcentagem de inibição da proliferação celular - composto BL-241
Figure imgf000026_0002

Claims

RE VINDICAÇÕES
1. Composto caracterizado por ser 3- (benzo [d] [ 1, 3 ] dioxol-5- il ) -7- ( 1-hidroxipropan-2-il ) -1- ( 1H-indol-3-il ) -6, 7-dihidro- 3H-oxazol [3, 4-a] pirazina-5, 8-diona de formula (I), ou seus estereoisômeros , sais, solvatos, hidratos, pró-drogas e ésteres farmaceuticamente aceitáveis
Figure imgf000027_0002
2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os estereoisômeros estão nas suas formas individuais separadas e/ou nas formas de misturas racêmicas ou misturas não-racêmicas com excesso diastereoisomérico em quaisquer proporções. 3. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser 3- (benzo [ d] [ 1 ,
3 ] dioxol-5-il ) -7- ( ( S) -1-hidroxipropan- 2-il ) -1- (1H-indol-3-il ) - 6, 7-dihidro-3H-oxazol [3, 4-a]pirazina- 5, 8-diona (BL-236) , representado pela fórmula (II) :
Figure imgf000027_0001
4. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser 3- (benzo [ d] [ 1 , 3 ] dioxol-5-il ) -7- ( (R) -1-hidroxipropan- 2-il ) -1- ( 1H-indol-3-il ) - 6, 7-dihidro-3H-oxazol [3, 4-a]pirazina- 5, 8-diona (BL-239) , representado pela fórmula (III) :
Figure imgf000028_0001
5. Composto, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por ser ( S) -3- (benzo [ d] [ 1 , 3 ] dioxol-5-il ) -7- ( ( S) -1- hidroxipropan-2-il ) -1- ( 1H-indol-3-il ) -6, 7-dihidro-3H- oxazol [3, 4-a] pirazina-5, 8-diona (BL-236A) , representado pela fórmula ( IV) :
Figure imgf000028_0002
6. Composto, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por ser (R) - 3- (benzo [d] [1,3] dioxol-5-il ) - 7- ( ( S) -1- hidroxipropan-2-il ) -1- ( 1H-indol-3-il ) -6, 7-dihidro-3H- oxazol [3, 4-a] pirazina-5, 8-diona (BL-236B) , representado pela fórmula (V) :
Figure imgf000029_0002
7. Composto, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por ser (S) -3- (benzo [d] [1,3] dioxol-5-il ) -7- ( (R) -1- hidroxipropan-2-il ) -1- ( 1H-indol-3-il ) -6, 7-dihidro-3H- oxazol [3, 4-a] pirazina-5, 8-diona (BL-239A) , representado pela fórmula (VI ) :
Figure imgf000029_0001
8. Composto, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por ser (R) -3- (benzo [d] [1,3] dioxol-5-il ) -7- ( (R) -1- hidroxipropan-2-il ) -1- ( 1H-indol-3-il ) -6, 7-dihidro-3H- oxazol [3, 4-a] pirazina-5, 8-diona (BL-239B) , representado pela fórmula (VII) :
Figure imgf000029_0003
9. Composto, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por ser uma mistura de dias tereoisômeros de 3-
(benzo[d] [l,3]dioxol-5-il)-7-( 1-hidroxipropan-2-il ) - 1- (1H- indol-3-il ) - 6, 7-dihidro-3H-oxazol [3, 4-a] pirazina-5, 8 -diona .
10. Composto, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por ser a mistura de (R) -3- (benzo [ d] [ 1 , 3 ] dioxol-5-il ) -7- ( (R) - 1-hidroxipropan-2-il ) - 1- (1H-indol-3-il ) - 6, 7-dihidro-3H- oxazol [3, 4-a] pirazina-5, 8-diona com (S)-3-
(benzo [ d] [1,3] dioxol-5-il ) -7- ( (R) -1-hidroxipropan-2-il ) -1- ( 1H- indo 1-3- il ) - 6, 7-dihidro-3H-oxazol [3, 4-a]pirazina-5, 8- diona (BL-380), representado pela fórmula (VIII) :
Figure imgf000030_0001
11. Composto, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por ser a mistura de (R) -3- (benzo [ d] [ 1 , 3 ] dioxol-5-il ) -7- ( (S) - 1-hidroxipropan-2-il ) - 1- ( 1H-indol-3-il ) - 6, 7-dihidro-3H- oxazol [3, 4-a] pirazina-5, 8-diona com (S)-3- (benzo [ d] [1,3] dioxol-5-il ) -7- ( ( S) -1-hidroxipropano-2-il ) - 1-
( 1H-indol-3-il ) - 6, 7-dihidro-3H-oxazol [3, 4-a]pirazina-5, 8- diona ( BL-24 1 ) , representado pela fórmula (IX) :
12. Mistura de estereoisômeros conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 2 a 11 caracterizada pelo fato de ser uma mistura racêmica ou mistura não-racêmica .
13. Mistura de estereoisômeros, de acordo com a reivindicação
12, caracterizada pelo fato de que as misturas são misturas não-racêmicas , com excesso diastereo isomérico em quaisquer proporções.
14. Mistura de estereoisômeros, de acordo com a reivindicação
13, caracterizada pelo fato da proporção diastereoisomérica está na faixa de 1:99 a 99:1.
15.Mistura de estereoisômeros, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato da proporção diastereoisomérica está na faixa de 1:2 a 2:1.
16. Mistura de estereoisômeros , de acordo com a reivindicação
13, caracterizada pelo fato da proporção diastereoisomérica é preferencialmente 1:1.
17. Mistura de estereoisômeros, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada por ser a mistura de (R)-3-
(benzo [ d] [1,3] dioxol-5-il ) -7- ( (R) -1-hidroxipropan-2-il ) -1- ( 1H-indo1-3-il ) - 6, 7-dihidro-3H-oxazol [3, 4-a]pirazina-5, 8- diona com (S) -3- (benzo [d] [1, 3] dioxol-5-il) -7- ( (R) -1- hidroxipropan-2-il ) -1- ( 1H-indol-3-il ) -6, 7-dihidro-3H- oxazol [3, 4-a] pirazina-5, 8-diona (BL-380), representado pela fórmula (VIII ) :
Figure imgf000032_0002
(VIII) ,
onde a proporção diastereoisomérica está na faixa de 1:99 a 99:1.
18. Mistura de estereoisômeros , de acordo com a reivindicação 12, caracterizada ser a mistura de ( R) -3- (benzo [ d] [l,3]dioxol-
5-il) -7- ( (S) -1-hidroxipropan-2-il) -1- ( 1H-indol-3-il ) -6, 7- dihidro-3H-oxazol [ 3 , 4-a] pirazina-5, 8-diona com (S)-3-
(benzo [ d] [1,3] dioxol-5-il ) -7- ( ( S) -1-hidroxipropano-2-il ) - 1- ( 1H-indol-3-il ) - 6, 7-dihidro-3H-oxazol [3, 4-a]pirazina-5, 8- diona (BL-241), representado pela fórmula (IX) :
Figure imgf000032_0001
onde a proporção diastereoisomérica está na faixa de 1:99 a 99:1.
19. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA caracterizada por compreender uma quantidade terapeuticamente efetiva de um ou mais compostos descritos em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, ou misturas dos mesmos conforme definidas nas reivindicações 12 a 18, e um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
20. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada por compreender como ingrediente ativo pelo menos um dos seguintes estereoisômeros selecionados do grupo constituído por:
(S)-3-(benzo[d] [1,3] dioxol-5-il ) -7- ( ( S) -1-hidroxipropan-2- il ) -1- ( 1H-indol-3-il ) - 6, 7-dihidro-3H-oxazol [3, 4-a]pirazina- 5, 8-diona (BL-236A) ;
(R)-3-(benzo[d] [1,3] dioxol-5-il ) -7- ( ( S) -1-hidroxipropan-2- il ) -1- ( 1H-indol-3-il ) - 6, 7-dihidro-3H-oxazol [3, 4-a]pirazina- 5, 8-diona (BL-236B) ;
(S)-3-(benzo[d] [1,3] dioxol-5-il ) -7- ( ( R) -1-hidroxipropan-2- il ) -1- ( 1H-indol-3-il ) - 6, 7-dihidro-3H-oxazol [3, 4-a]pirazina- 5, 8-diona (BL-239A) ; e
(R)-3-(benzo[d] [1,3] dioxol-5-il ) -7- ( ( R) -1-hidroxipropan-2- il ) -1- ( 1H-indol-3-il ) - 6, 7-dihidro-3H-oxazol [3, 4-a]pirazina- 5, 8-diona (BL-239B) ;
seus sais, solvatos, hidratos, pró-drogas e ésteres farmaceuticamente aceitáveis; onde os estereoisômeros estão nas suas formas individuais separadas e/ou nas formas de misturas racêmicas ou misturas não-racêmicas com excesso diastereoisomérico em quaisquer proporções; e um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis .
21. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada por compreender como ingrediente ativo pelo menos uma mistura de estereoisômeros selecionados do grupo constituído por:
(R) -3- (benzo [d] [1,3] dioxol-5-il ) -7- ( (R) -1-hidroxipropan-2- il ) -1- ( 1H-indol-3-il ) - 6, 7-dihidro-3H-oxazol [3, 4-a]pirazina- 5, 8-diona com (S) -3- (benzo [d] [1, 3] dioxol-5-il) -7- ( (R) -1- hidroxipropan-2-il ) -1- ( 1H-indol-3-il ) -6, 7-dihidro-3H- oxazol [3, 4-a] pirazina-5, 8-diona (BL-380) ; e
(R)-3-(benzo[d] [1,3] dioxol-5-il ) -7- ( ( S) -1-hidroxipropan-2- il ) -1- ( 1H-indol-3-il ) - 6, 7-dihidro-3H-oxazol [3, 4-a]pirazina- 5, 8-diona com (S) -3- (benzo [ d] [1, 3] dioxol-5-il) -7- ( (S) -1- hidroxipropano-2-il ) -1- ( 1H-indol-3-il ) -6, 7-dihidro-3H- oxazol [3, 4-a]pirazina-5, 8-diona (BL-241) ;
onde os diastereoisômeros podem estar em quaisquer proporções; e um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis .
22. Composição farmacêutica, de acordo com as reivindicações 19 a 21, caracterizada por ser para administração oral, tópica, injetável, nasal e retal.
23. Composição farmacêutica compreendendo um composto conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 11, ou mistura dos mesmos, conforme definidas nas reivindicações 12 a 18, caracterizada por ser usada como inibidora das enzimas fos fosdiesterases e anti-tumoral .
24. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada por ser usada no tratamento de hiperplasia prostática benigna, câncer, desordens e/ou condições tratáveis com relaxamento de tecidos e desordens tratáveis com inibidores de fosfodiesterases .
25. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada por ser para tratamento de câncer de próstata.
26. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada por ser para o tratamento de hiperplasia prostática benigna e câncer de próstata.
27. Uso dos compostos conforme definidos em qualquer uma das reivindicações de 1 a 11, ou mistura conforme definida na reivindicação 12 a 18, caracterizado por ser para a preparação de uma composição farmacêutica para inibição de enzimas fos fodiesterases .
28. Uso dos compostos conforme definidos em qualquer uma das reivindicações de 1 a 11, ou mistura conforme definida na reivindicação 12 a 18, caracterizado por ser para a preparação de uma composição farmacêutica antitumoral.
29. Uso, dos compostos conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, ou mistura conforme definida em qualquer uma das reivindicações 12 a 18, caracterizado por ser para o preparo de composições farmacêuticas para o tratamento de hiperplasia prostática benigna, câncer, desordens e/ou condições tratáveis com relaxamento de tecidos e desordens tratáveis com inibidores de fosfodiesterases .
30. Uso da composição farmacêutica definida em qualquer uma das reivindicações 19 a 22, caracterizado por ser para o tratamento de hiperplasia prostática benigna e câncer de próstata .
31. Uso, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado por ser para tratamento de câncer de próstata.
32. Método de tratamento ou prevenção de disfunções associadas à atividade das fosfodiesterases e câncer, caracterizado pela administração de uma quantidade efetiva de pelo menos um dos compostos conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11 ou mistura conforme definida em qualquer uma das reivindicações 12 a 18.
32. Método de acordo com as reivindicações 31, caracterizado por ser para o tratamento e/ ou profilaxia de hiperplasia prostática benigna e/ou câncer de próstata.
33. Método de tratamento ou prevenção de hiperplasia prostática benigna e/ou câncer de próstata, caracterizado por administrar uma quantidade efetiva de pelo menos um dos compostos conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11 ou mistura conforme definida em qualquer uma das reivindicações 12 a 18.
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