KR100468352B1 - 신규 피라졸로피리미딘계 유도체, 그의 제조방법 및 이를 유효성분으로 하는 약학적 조성물 - Google Patents

신규 피라졸로피리미딘계 유도체, 그의 제조방법 및 이를 유효성분으로 하는 약학적 조성물 Download PDF

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
    • C07D487/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D487/04—Ortho-condensed systems

Abstract

본 발명은 신규 피라졸로피리미딘계 유도체, 그의 제조방법 및 이를 유효성분으로 하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 하기 화학식 1로 표시되는 피라졸로피리미딘계 유도체는 세포분열주기를 조절하는 사이클린 의존 카이네이즈(CDK)를 억제함으로서 종래 사이클린 의존 카이네이즈 저해제와 비교하여 유의성 있는 효과를 나타내며, 독성이 낮아 항종양제로 유용하게 사용될 수 있다.
화학식 1
(상기 식에서, R1, R2, R3및 n은 하기 명세서에서 정의된 바와 같다.)

Description

신규 피라졸로피리미딘계 유도체, 그의 제조방법 및 이를 유효성분으로 하는 약학적 조성물{NEW PYRAZOLOPYRIMIDINE DERIVATIVES, PROCESS FOR THEIR PREPARATION AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING THE SAME}
본 발명은 신규 피라졸로피리미딘계 유도체, 그의 제조방법 및 이를 유효성분으로 하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
세포 성장의 외부 또는 내부 조절의 파괴는 비조절 증식 및 암, 종양 형성을 유인할 수 있다. 이러한 제어 상실은 다양한 수준으로 발생할 수 있으며 게다가 대부분 종양에서 다양한 수준으로 발생한다. 나아가, 비록 종양 세포가 더이상 자신의 증식을 제어할 수 없다고 하더라도, 여전히 성장 및 복제를 하기 위해서는 정상세포가 사용하는 동일한 기본적인 세포 기구를 사용하여야 한다.
G1상에서 S상으로의 정상 세포 사이클 및 G2상에서 M상으로의 정상 세포사이클의 진전은 CDK(사이클린 의존 카이네이즈)들에 의존한다. 다른 카이네이즈와 마찬가지로, CDK들은 아데노신 트리포스페이트(ATP)의 말단 포스페이트를 기질 단백질에 전달하는 것을 용이하게 함으로써 세포 내 분자수준의 사건을 조절한다. 분리된 CDK들은 사이클린이라 불리는 제2서브유닛과의 연결을 필요로 한다. 사이클린은 CDK 활성 부위에서의 형태 변화를 야기시켜, ATP가 접근하고 기질단백질과 상호작용 하도록 한다. 합성 및 분해 사이의 속도 균형은 사이클 중 임의의 지점에서 각 사이클린의 수준을 제어한다. 세포 사이클 상 사이클린/CDK 활성의영향 및 세포 변화가표 1에 요약되어 있다.
정상 세포에서, 서로 얽킨 경로는 세포의 외부 환경에 반응하고 내부 확인지점은 세포내 조건들을 모니터하여 사이클린/CDK 복합체의 활성을 제어한다. 사이클린/CDK 활성의 정상적인 제어가 파괴되면 비제어된 증식을 야기할 수 있다는 합리적인 가설이 있다. 이러한 가설은 사이클린이 상승된 수준으로 발현되는 다수의 종양 유형에서 지지되는 것처럼 보인다(표 1). 사이클린/CDK 활성의 음성 조절자(단백질)를 암호화하는 유전자가 종양에서 돌연변이되어 있다고 밝혀졌다. Cip 패밀리의 CDK 저해제 일원들은 사이클린/CDK와 3원 복합체를 형성하고 사이클린 A, 사이클린 E 또는 사이클린 D로의 결합을 필요로 한다. 대조적으로, Ink 패밀리 일원은 CDK 4 또는 CDK 6과 2원 복합체를 형성하고 사이클린 D의 결합을 방해한다.
사이클린과 암의 연관
사이클린 세포 사이클 역할 관련 CDK 암
A S,G2에서 M으로 CDK1,CDK2 간세포 암종
B1/B2 G2에서 M으로 CDK1 -
D1 G1 CDK4,CDK6 부갑상선 선종, 중심세포 B세포 림프종, 식도암종, 인상 세포 암종, 간세포 암종
D2 G1 CDK4,CDK6 결장직장 암종
E G1에서 S로 CDK2 유방암, 위암종, 결장직장 암종
상술한 바와 같이, 타이로신 카이네이즈의 적절치 못한 활성화가 세포 증식을 유도하여 암을 유발한다는 수많은 증거들이 과거 십수년간 계속적으로 보고되고 있다. 지나치게 활성화된 프로테인 카이네이즈만을 억제할 것을 목적으로 하는 항암요법은 해당 타이로신 카이네이즈가 연루된 신호전달체계만을 무력화시켜 비정상적인 세포의 성장을 억제하는 반면에, 다른 카이네이즈에 의하여 유지되는 필요불가분한 신호전달체계는 손상시키지 않을 것이다. 이러한 타이로신 카이네이즈 저해제는 암세포의 외과절제수술 후의 잔여 암세포의 제거 및 억제 등을 목적으로 사용되거나, 기존 항암제의 보조치료제로서 병용 사용될 가능성이 있다.
사이클린 의존 카이네이즈(CDK)는 세포분열주기를 조절하는 핵심적인 효소로서 ATP 결합 자리에 경쟁적으로 결합하는 저해제의 경우 ATP를 이용하는 효소들과의 선택성 문제를 내포하고 있음에도 불구하고 ATP 결합 자리에 경쟁적으로 결합하는 퓨린계의 저해제의 개발이 많이 연구되어졌다[Bridges, A. J.et al. Science 1994,265, 1093; Meijer, L.et al. Eur. J. Biochem. 1994,224, 771]. 퓨린계의 대표적인 화합물로는 올로무신 [2-(2-히드록시에틸아미노)-6-벤질아미노-9-메틸퓨린] 및 라스코비틴 [2-{2-(1-에틸-2-히드록시메틸아미노)}-6-벤질아미노-9-이소프로필퓨린]이 알려져 있다.
이에, 본 발명자들은 사이클린 의존 카이네이즈에 우수한 저해작용을 하는 신규의 피라졸로피리미딘 유도체를 합성하였으며, 본 발명의 피라졸로피리미딘 유도체가 종래 사이클린 의존 카이네이즈 저해제와 비교하여 유의성 있는 효과를 나타내며, 제조가 용이하고 또한 독성이 낮음을 알게 되어 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 피라졸로피리미딘계 유도체 및 약학적으로 허용되는 그의 염, 그의 제조방법 및 상기 유도체를 유효성분으로 하는 사이클린 의존 카이네이즈 활성에 의해 야기되는 질병치료제를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 피라졸로피리미딘계 유도체 및 약학적으로 허용되는 그의 염을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유도체를 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유도체를 유효성분으로 하는 사이클린 의존 카이네이즈 활성에 의해 야기되는 질병치료제를 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 피라졸로피리미딘 유도체 및 약학적으로 허용되는 그의 염을 포함한다.
(상기 식에서,
R1은 오르토, 메타 또는 파라 치환체를 포함하고 브로모, 클로로, 플루오로, 메톡시, 수소, 니트로 또는 아미노기이며,
R2는 수소 또는 C3이하의 저급 알킬기이며, 바람직하게는 메틸, 에틸 또는 이소프로필기이며,
R3는 수소 또는 C3이하의 저급 알킬기, 히드록시에틸기이며,
n은 0 또는 1이다.
상기 화학식 1로 표시되는 피라졸로피리미딘 유도체를 보다 구체적으로 예시하면 다음과 같다.
1)4-벤질아미노-6-(2-히드록시에틸아미노)피라졸로[3,4-d]피리미딘,
2)4-벤질아미노-6-[디-(2-히드록시에틸아미노)]피라졸로[3,4-d]피리미딘,
3)4-벤질아미노-1-메틸-6-(2-히드록시에틸아미노)피라졸로[3,4-d]피리미딘,
4)4-벤질아미노-1-메틸-6-[디-(2-히드록시에틸아미노)]피라졸로[3,4-d]피리미딘,
5)4-벤질아미노-1-이소프로필-6-(2-히드록시에틸아미노)피라졸로[3,4-d]피리미딘,
6)4-벤질아미노-1-이소프로필-6-[디-(2-히드록시에틸아미노)]피라졸로[3,4-d]피리미딘,
7)4-(4-니트로벤질아미노)-1-메틸-6-(2-히드록시에틸아미노)피라졸로[3,4-d] 피리미딘,
8)4-(4-니트로벤질아미노)-1-이소프로필-6-(2-히드록시에틸아미노)피라졸로[3,4-d] 피리미딘,
9)4-(4-아미노벤질아미노)-1-메틸-6-(2-히드록시에틸아미노)피라졸로[3,4-d] 피리미딘
10)4-(4-아미노벤질아미노)-1-이소프로필-6-(2-히드록시에틸아미노)피라졸로[3,4-d] 피리미딘,
11)4-(3-브로모아닐리노)-6-(2-히드록시에틸아미노)피라졸로[3,4-d]피리미딘,
12)4-(3-브로모아닐리노)-6-[디-(2-히드록시에틸아미노)]피라졸로[3,4-d]피리미딘,
13)4-(3-브로모아닐리노)-1-메틸-6-(2-히드록시에틸아미노)피라졸로[3,4-d]피리미딘,
14)4-(3-브로모아닐리노)-1-메틸-6-[디-(2-히드록시에틸아미노)]피라졸로[3,4-d]피리미딘,
15)4-(3-브로모아닐리노)-1-이소프로필-6-(2-히드록시에틸아미노)피라졸로[3,4-d]피리미딘,
16)4-(3-브로모아닐리노)-1-이소프로필-6-[디-(2-히드록시에틸아미노)]피라졸로[3,4-d]피리미딘,
17)4-(3-플루오로아닐리노)-6-(2-히드록시에틸아미노)피라졸로[3,4-d]피리미딘,
18)4-(3-플루오로아닐리노)-6-[디-(2-히드록시에틸아미노)]피라졸로[3,4-d]피리미딘,
19)4-(3-플루오로아닐리노)-1-메틸-6-(2-히드록시에틸아미노)피라졸로[3,4-d]피리미딘,
20)4-(3-플루오로아닐리노)-1-메틸-6-[디-(2-히드록시에틸아미노)]피라졸로[3,4-d]피리미딘,
21)4-(3-플루오로아닐리노)-1-이소프로필-6-(2-히드록시에틸아미노)피라졸로[3,4-d]피리미딘,
22)4-(3-플루오로아닐리노)-1-이소프로필-6-[디-(2-히드록시에틸아미노)]피라졸로[3,4-d]피리미딘,
23)4-(3-메톡시아닐리노)-6-(2-히드록시에틸아미노)피라졸로[3,4-d]피리미딘,
24)4-(3-메톡시아닐리노)-6-[디-(2-히드록시에틸아미노)]피라졸로[3,4-d]피리미딘,
25)4-(3-메톡시아닐리노)-1-메틸-6-(2-히드록시에틸아미노)피라졸로[3,4-d]피리미딘,
26)4-(3-메톡시아닐리노)-1-메틸-6-[디-(2-히드록시에틸아미노)]피라졸로[3,4-d]피리미딘,
27)4-(3-메톡시아닐리노)-1-이소프로필-6-(2-히드록시에틸아미노)피라졸로[3,4-d]피리미딘,
28)4-(3-메톡시아닐리노)-1-이소프로필-6-[디-(2-히드록시에틸아미노)]피라졸로[3,4-d]피리미딘.
본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 피라졸로피리미딘 유도체 및 약학적 으로 허용되는 그의 염뿐만 아니라 그로부터 제조될 수 있는 가능한 용매화물 및 수화물을 모두 포함한다.
본 발명의 화학식 1의 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬화수소, 인산, 황산, 황산수소나트륨, 질산, 탄산 또는 주석산 등을 사용할 수 있으며, 유기산으로는 개미산(formic acid), 게스티스산, 락토비온산, 살리실산, 아세틸살리실산, 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산(propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산 또는 하이드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 화학식 1의 화합물을 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다.
동량의 화학식 1의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올(예, 글르콜 모노메틸 에테르)을 가열하고, 이어서 이 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나 또는 석출된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속 염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속 염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
본 발명은 하기 반응식 1과 같이, 화학식 1로 표시되는 피라졸로피리미딘 유도체의 제조방법을 포함한다.
(상기 식에서, R1, R2, R3및 n은 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같다.)
상기 반응식 1에서 보는 바와 같이, 피라졸로피리미딘 유도체(화학식 1)의 제조방법은 화학식 (II)의 6-메틸술포닐피라졸로피리미딘 화합물을 저급 알코올인 이소프로판올 또는 n-부탄올과 극성 용매인 디메틸술폭시드 또는 디메틸포름아미드의 혼합 유기용매 존재하에서 화학식 (III)의 히드록시에틸아민 화합물과 70∼100℃에서 1∼6시간 동안 친핵성 치환반응을 수행하여 얻는다.
상기 반응식 1의 화학식 (II)의 화합물은 하기 반응식 2에서 보는 바와 같이, 화학식 (IV)의 6-메틸메르캅토피라졸로피리미딘 화합물로부터 얻어진다.
(상기 식에서, R1, R2및 n은 화학식 1에서 정의한 바와 같다.)
상기 반응식 2에서 나타낸 바와 같이, 화학식 (IV)의 6-메틸메르캅토피라졸로피리미딘 화합물을 유기용매인 클로로포름 또는 디클로로메탄에서 메타-클로로퍼벤조산 화합물과 -10∼10℃의 저온에서 2∼5 시간 동안 반응시킨 후 상온에서 3∼12시간 동안 반응시키면 C-6위치의 메틸메르캅토기 보다 친핵성 치환반응에 대하여 훨씬 큰 반응성을 가지는 메틸술로닐기로 치환된 화학식 (II)의 6-메틸술포닐피라졸로피리미딘계 화합물이 제조된다.
본 발명에 따르는 화학식 (IV)의 화합물은 공지의 방법(Robins, R. K.et al. J. Am. Chem. Soc. 1956,78, 784; Robins, R. K.et al. J. Am. Chem. Soc. 1957,79, 6407)으로 합성된 화학식 (V)의 4-클로로-6-메틸메르캅토피라졸로[3,4-d]피리미딘 화합물로부터 제조된다.
(상기 식에서, R1, R2및 n은 화학식 1에서 정의한 바와 같다.)
상기 반응식 3에서 보는 바와 같이,
1) 화학식 (V)의 4-클로로-6-메틸메르캅토피라졸로[3,4-d]피리미딘 화합물을 트리에틸아민 또는 디이소프로필 염기 존재하에 저급 알코올인 이소프로판올 또는 n-부탄올 용매에서 화학식 (VI)의 아민 화합물과 40∼60℃에서 12∼24시간 동안 반응하여 화학식 (VII)의 4-벤질아미노(또는 4-아닐리노)피라졸로피리미딘 화합물을 제조하고,
2) 화학식 (VII)의 4-벤질아미노(또는 4-아닐리노)피라졸로피리미딘 화합물을 트리페닐포스핀 및 디에틸 아조디카르복시산 에스테르 존재하에 테트라히드로푸란과 클로로포름 또는 디클로로메탄의 혼합 유기용매에서 화학식 (VIII)의 알코올 화합물과 상온에서 3∼5시간 동안 반응하여 화학식 (IV)의 4-벤질아미노(또는 4-아닐리노)-1-알킬-피라졸로피리미딘 화합물이 제조된다.
또한, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 피라졸로피리미딘 유도체 및 약학적으로 허용되는 그의 염을 유효성분으로 하는 사이클린 의존 카이네이즈 활성에 의해야기되는 질병 치료제를 포함한다.
본 발명의 화학식 1로 표시되는 피라졸로피리미딘 유도체 및 약학적으로 허용되는 그의 염은 사이클린 의존 카이네이즈 저해 활성을 나타낸다. 구체적으로, 하기표 3에서 보는 바와 같이, 4-아닐리노피라졸로피리미딘 화합물들이 4-벤질피라졸로피리미딘 화합물들 보다 우수한 CDK2 저해 활성을 나타내었다. 특히, 피라졸로피리미딘 구조의 C-4에서 3-플루오로아닐린기를 가지는 실시예 46의 화합물은 대조물질인 올로무신 및 라스코비틴과 비교하여 우월하거나 동등한 CDK2 저해 활성를 나타내었었다. 일반적으로, N-1에서 치환기를 가지지 않는 실시예 11, 12, 46, 47, 52, 53 화합물들은 치환기를 가지는 실시예 44, 45, 48, 49 화합물들 보다 강력한 CDK2 저해 활성을 나타내었다. 한편, 실시예 44, 45 화합물들은 시험 세포주에 대하여 우수한 세포독성을 나타내었다. 이에, 본 발명의 피라졸로피리미딘 유도체 및 그의 염을 유효성분으로 함유하는 사이클린 의존 카이네이즈 저해제로 사용할 수 있으며, 상기 사이클린 의존 카이네이즈 저해로 인해 상기 카이네이즈의 활성으로 인해 야기되는 간암, 유방암, 위암, 결장암 또는 직장암 등을 예방 및 치료할 수 있다.
상기 화학식 1의 화합물은 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환자, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 화학식 1의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.01∼100 ㎎/일이며, 바람직하게는 1∼50 ㎎/일이며, 또한 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다.
단 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 4-벤질아미노-6-메틸메르캅토피라졸로[3,4-d]피리미딘의 제조
4-클로로-6-메틸메르캅토피라졸로[3,4-d]피리미딘 (1.0 g, 5.1 mmol), 벤질아민 (0.56 ㎖, 5.1 mmol) 및 디이소프로필에틸아민 (1.6 ㎖, 9.2 mmol)을 n-부탄올 (80 ㎖)에 가하고 50℃에서 24시간 동안 교반하였다. n-부탄올을 감압증류하여 제거하고 잔사를 물과 에틸 아세테이트로 추출하여 유기층을 무수 황산 나트륨으로 건조하였다. 황산 나트륨을 여과하여 제거하고 에틸 아세테이트를 감압증류하여 관 크로마토그래피법 (실리카겔, n-헥산/에틸 아세테이트=1.5:1)로 정제하여 4-벤질아미노-6-메틸메르캅토피라졸로[3,4-d]피리미딘 1.3 g (94.8%)을 얻었다.
mp 212∼214℃
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ8.77 (t, 1H, J=5.7 Hz), 8.09 (s, 1H), 7.37-7.23 (m, 5H), 4.71 (d, 2H, J=5.7 Hz), 2.44 (s, 3H).
<실시예 2> 4-벤질아미노-1-메틸-6-메틸메르캅토피라졸로[3,4-d]피리미딘의 제조
트리페닐포스핀 (1.3 g, 5.0 mmol)을 테트라히드로퓨란 (2.5 ㎖)과 디클로로메탄 (2.5 ㎖)의 혼합용매에 가하여 완전히 용해시키고 디에틸 아조디카르복시산 에스테르 (394 ㎕, 2.5 mmol)를 0℃에서 서서히 적가하여 1시간 동안 교반하였다. 화합물 4-벤질아미노-6-메틸메르캅토피라졸로[3,4-d]피리미딘 (0.5 g, 2.0 mmol)과 메탄올 (81 ㎕, 2.0 mmol)를 테트라히드로퓨란 (2.5 ㎖)과 디클로로메탄 (2.5 ㎖)의 혼합용매에 용해하여 캐눌라를 이용하여 0℃를 유지하며 앞서 준비한 용액에 가하고 상온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응이 완결되면 반응혼합물의 용매를 감압증류하여 제거하고 잔사를 관 크로마토그래피법 (실리카겔, n-헥산/에틸 아세테이트=2:1)로 정제하여 4-벤질아미노-1-메틸-6-메틸메르캅토피라졸로[3,4-d]피리미딘 0.53 g (96.0%)를 얻었다.
mp 94∼95℃
1H NMR (300 MHz DMSO-d6) δ7.71 (s, 1H), 7.36-7.31 (m, 5H), 4.81 (d, 2H), 3.94 (s, 3H), 2.58 (s, 3H).
<실시예 3> 4-벤질아미노-6-메틸술포닐피라졸로[3,4-d]피리미딘의 제조
4-벤질아미노-6-메틸메르캅토피라졸로[3,4-d]피리미딘 (0.36 g, 1.4 mmol)을 디클로로메탄 (100 ㎖)에 용해하고 0℃에서 3-클로로퍼벤조산 (70%, 0.74 g, 3.0 mmol)를 가하여 3 시간 동안 교반하고 다시 상온에서 3 시간 동안 교반하였다. 반응이 완결되면 에틸 아세테이트와 포화 중조수용액으로 추출하고 유기층을 포화 중조 수용액, 물 및 소금물로 세척하였다. 유기층을 무수 황산 나트륨으로 건조한 후, 황산 나트륨을 여과하여 제거하고 에틸 아세테이트를 감압증류하여 관 크로마토그래피법 (실리카겔, n-헥산/에틸 아세테이트=2:1)로 정제하여 4-벤질아미노-6-메틸술포닐피라졸로[3,4-d]피리미딘 0.32 g (84.8%)을 얻었다.
mp 205∼208℃
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ9.43 (s, 1H), 8.30 (s, 1H), 7.40-7.27 (m, 5H), 4.78 (s, 2H), 3.29 (s, 3H).
<실시예 4> 4-벤질아미노-1-메틸-6-메틸술포닐피라졸로[3,4-d]피리미딘의 제조
4-벤질아미노-1-메틸-6-메틸메르캅토피라졸로[3,4-d]피리미딘 (0.39 g, 1.4 mmol)을 디클로로메탄 (100 ㎖)에 용해하고 0℃에서 3-클로로퍼벤조산 (70%, 0.74 g, 3.0 mmol)를 가하여 3 시간 동안 교반하고 다시 상온에서 3 시간 동안 교반하였다. 반응이 완결되면 에틸 아세테이트와 포화 중조수용액으로 추출하고 유기층을 포화 중조수용액, 물 및 소금물로 세척하였다. 유기층을 무수 황산 나트륨으로 건조한 후, 황산 나트륨을 여과하여 제거하고 에틸 아세테이트를 감압증류하여 관 크로마토그래피법 (실리카겔, n-헥산/에틸 아세테이트=2:1)로 정제하여 4-벤질아미노-1-메틸-6-메틸술포닐피라졸로[3,4-d]피리미딘 0.39 g (87.2%)을 얻었다.
mp 110∼115℃
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ9.46 (s, 1H), 8.25 (s, 1H), 7.41-7.27 (m, 5H), 4.78 (d, 2H, J=5.1 Hz), 3.95 (s, 3H), 3.30 (s, 3H).
<실시예 5> 4-벤질아미노-6-(2-히드록시에틸아미노)피라졸로[3,4-d]피리미딘의 제조
4-벤질아미노-6-메틸술포닐피라졸로[3,4-d]피리미딘 (0.29 g, 1.0 mmol)과 에탄올아민 (180 ㎕)을 n-부탄올 (16 ㎖)과 디메틸술폭시드 (4 ㎖)에 가하고 90℃에서 12시간 동안 교반하였다. 반응이 완결되면 물과 에틸 아세테이트로 추출하여 유기층을 물로 세척하였다. 유기층을 무수 황산 나트륨으로 건조한 후, 황산 나트륨을 여과하여 제거하고 에틸 아세테이트를 감압증류하여 관 크로마토그래피법 (실리카겔, 디클로로메탄/메탄올=20:1)로 정제하여 4-벤질아미노-6-(2-히드록시에틸아미노)피라졸로[3,4-d]피리미딘 0.20 g (75.0%)을 얻었다.
mp 230∼234℃
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ12.53 (s, 1H), 8.21 (s, 1H), 7.85 (s, 1H), 7.34-7.23 (m, 5H), 6.39 (s, 1H), 4.67 (d, 2H), 3.51-3.31 (m, 4H).
<실시예 6> 4-벤질아미노-6-[디-(2-히드록시에틸아미노)]피라졸로[3,4-d]피리미딘의 제조
4-벤질아미노-6-메틸술포닐피라졸로[3,4-d]피리미딘 (0.29 g, 1.0 mmol)과 디에탄올아민 (350 ㎕)을 n-부탄올 (16 ㎖)과 디메틸술폭시드 (4 ㎖)에 가하고 90℃에서 12시간 동안 교반하였다. 반응이 완결되면 물과 에틸 아세테이트로 추출하여 유기층을 물로 세척하였다. 유기층을 무수 황산 나트륨으로 건조한 후, 황산 나트륨을 여과하여 제거하고 에틸 아세테이트를 감압증류하여 에틸 아세테이트를 감압증류하여 관 크로마토그래피법 (실리카겔, 디클로로메탄/메탄올=20:1)로 정제하여 4-벤질아미노-6-[디-(2-히드록시에틸아미노)]피라졸로[3,4-d]피리미딘 0.15 g (44.7%)을 얻었다.
mp 242∼245 ℃
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ8.32 (s, 1H), 7.83 (s, 1H), 7.37-7.23 (m, 5H), 4.62 (m, 3H), 3.60-3.46 (m, 8H).
<실시예 7> 4-(3-브로모아닐리노)-6-메틸메르캅토피라졸로[3,4-d]피리미딘의 제조
4-클로로-6-메틸메르캅토피라졸로[3,4-d]피리미딘 (1.0 g, 5.1 mmol), 3-브로모아닐린 (0.55 ㎖, 5.1 mmol) 및 디이소프로필에틸아민 (1.6 ㎖, 9.2 mmol)을 n-부탄올 (80 ㎖)에 가하고 50℃에서 24시간 동안 교반하였다. n-부탄올을 감압증류하여 제거하고 잔사를 물과 에틸 아세테이트로 추출하여 유기층을 무수 황산 나트륨으로 건조하였다. 황산 나트륨을 여과하여 제거하고 에틸 아세테이트를 감압증류하여 관 크로마토그래피법 (실리카겔, n-헥산/에틸 아세테이트=1.5:1)로 정제하여 4-(3-브로모아닐리노)-6-메틸메르캅토피라졸로[3,4-d]피리미딘 1.4 g (82.3%)을 얻었다.
mp > 250℃
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ10.33 (s, 1H), 8.29 (s, 1H), 8.31-7.29 (m, 4H), 2.54 (s, 3H).
<실시예 8> 4-(3-브로모아닐리노)-1-메틸-6-메틸메르캅토피라졸로[3,4-d]피리미딘의 제조
트리페닐포스핀 (1.3 g, 5.0 mmol)을 테트라히드로퓨란 (2.5 ㎖)과 디클로로메탄 (2.5 ㎖)의 혼합용매에 가하여 완전히 용해시키고 디에틸 아조디카르복시산 에스테르 (394 ㎕, 2.5 mmole)를 0℃에서 서서히 적가하여 1시간 동안 교반하였다. 화합물 4-(3-브로모아닐리노)-6-메틸메르캅토피라졸로[3,4-d]피리미딘 (0.67 g, 2.0 mmol)과 메탄올 (81 ㎕, 2.0 mmol)를 테트라히드로퓨란 (2.5 ㎖)과 디클로로메탄 (2.5 ㎖)의 혼합용매에 용해하여 캐눌라를 이용하여 0℃를 유지하며 앞서 준비한 용액에 가하고 상온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응이 완결되면 반응혼합물의 용매를 감압증류하여 제거하고 잔사를 관 크로마토그래피법 (실리카겔, n-헥산/에틸 아세테이트=2:1)로 정제하여 4-(3-브로모아닐리노)-1-메틸-6-메틸메르캅토피라졸로[3,4-d]피리미딘 0.22 g (63.1%)을 얻었다.
mp 141∼144℃
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ10.22 (s, 1H), 8.19 (s, 1H), 8.30-7.27 (m, 4H), 3.89 (s, 3H), 2.57 (s, 3H).
<실시예 9> 4-(3-브로모아닐리노)-6-메틸술포닐피라졸로[3,4-d]피리미딘의 제조
4-(3-브로모아닐리노)-6-메틸메르캅토피라졸로[3,4-d]피리미딘 (0.47 g, 1.4 mmol)을 디클로로메탄 (100 ㎖)에 용해하고 0℃에서 3-클로로퍼벤조산 (70%, 0.74 g, 3.0 mmol)를 가하여 3 시간 동안 교반하고 다시 상온에서 3 시간 동안 교반하였다. 반응이 완결되면 에틸 아세테이트와 포화 중조수용액으로 추출하고 유기층을 포화 중조수용액, 물 및 소금물로 세척하였다. 유기층을 무수 황산 나트륨으로 건조한 후, 황산 나트륨을 여과하여 제거하고 에틸 아세테이트를 감압증류하여 관 크로마토그래피법 (실리카겔, n-헥산/에틸 아세테이트=2:1)로 정제하여 4-(3-브로모아닐리노)-6-메틸술포닐피라졸로[3,4-d]피리미딘 0.38 g (74.8%)을 얻었다.
mp 208∼210℃
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ7.90 (s, 1H), 8.12-7.15 (m, 4H), 3.30 (s, 3H).
<실시예 10> 4-(3-브로모아닐리노)-1-메틸-6-메틸술포닐피라졸로[3,4-d]피리미딘의 제조
4-(3-브로모아닐리노)-1-메틸-6-메틸메르캅토피라졸로[3,4-d]피리미딘 (0.50 g, 1.4 mmol)을 디클로로메탄 (100 ㎖)에 용해하고 0℃에서 3-클로로퍼벤조산 (70%, 0.74 g, 3.0 mmol)를 가하여 3 시간 동안 교반하고 다시 상온에서 3 시간 동안 교반하였다. 반응이 완결되면 에틸 아세테이트와 포화 중조수용액으로 추출하고 유기층을 포화 중조수용액, 물 및 소금물로 세척하였다. 유기층을 무수 황산 나트륨으로 건조한 후, 황산 나트륨을 여과하여 제거하고 에틸 아세테이트를 감압증류하여 관 크로마토그래피법 (실리카겔, n-헥산/에틸 아세테이트=2:1)로 정제하여 4-(3-브로모아닐리노)-1-메틸-6-메틸술포닐피라졸로[3,4-d]피리미딘 0.30g (78.8%)을 얻었다.
mp > 260℃
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ10.73 (s, 1H), 8.34-7.33 (m, 5H), 3.99 (s, 3H), 3.41 (s, 3H).
<실시예 11> 4-(3-브로모아닐리노)-6-(2-히드록시에틸아미노)피라졸로[3,4-d]피리미딘의 제조
4-(3-브로모아닐리노)-6-메틸술포닐피라졸로[3,4-d]피리미딘 (0.37 g, 1.0 mmol)과 에탄올아민(180 ㎕)을 n-부탄올 (16 ㎖)과 디메틸술폭시드 (4 ㎖)에 가하고 90℃에서 12시간 동안 교반하였다. 반응이 완결되면 물과 에틸 아세테이트로 추출하여 유기층을 물로 세척하였다. 유기층을 무수 황산 나트륨으로 건조한 후, 황산 나트륨을 여과하여 제거하고 에틸 아세테이트를 감압증류하여 관 크로마토그래피법 (실리카겔, 디클로로메탄/메탄올=20:1)로 정제하여 4-(3-브로모아닐리노)-6-(2-히드록시에틸아미노)피라졸로[3,4-d]피리미딘 0.24 g (70.4%)을 얻었다.
mp > 260℃
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ7.85 (s, 1H), 8.22-7.09 (m, 4H), 3.66 (t, 2H), 3.47 (t, 2H).
<실시예 12> 4-(3-브로모아닐리노)-6-[디-(2-히드록시에틸아미노)]피라졸로[3,4-d]피리미딘의 제조
4-(3-브로모아닐리노)-6-메틸술포닐피라졸로[3,4-d]피리미딘 (0.37 g, 1.0 mmol)과 디에탄올아민 (350 ㎕)을 n-부탄올 (16 ㎖)과 디메틸술폭시드 (4 ㎖)에 가하고 90℃에서 12시간 동안 교반하였다. 반응이 완결되면 물과 에틸 아세테이트로 추출하여 유기층을 물로 세척하였다. 유기층을 무수 황산 나트륨으로 건조한 후, 황산 나트륨을 여과하여 제거하고 에틸 아세테이트를 감압증류하여 관 크로마토그래피법 (실리카겔, 디클로로메탄/메탄올=20:1)로 정제하여 4-(3-브로모아닐리노)-6-[디-(2-히드록시에틸아미노)]피라졸로[3,4- d]피리미딘 0.20 g (50.2%)을 얻었다.
mp 254∼257℃
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ7.82 (s, 1H), 8.21-7.10 (m, 4H), 3.77 (m, 4H), 3.49 (m, 4H).
<실시예 13∼33>
화학식 (VII), (IV) 및 (II)로 표시되는 화합물 중 화학식 (V)의4-클로로-6-메틸메르캅토피라졸로[3,4-d]피리미딘 화합물을 출발물질하여 상기 실시예 1∼10에 따라표 2의 화합물을 얻었으며, 이들 화합물의 구조 확인시험 결과는 하기와 같다.
(실시예 13 화합물) 4-(4-니트로벤질아미노)-6-메틸메르캅토피라졸로[3,4-d]피리미딘
수율 86.0%
mp 208∼210℃ (dec.)
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ13.3 (s, 1H), 8.92 (t, 1H), 8.21 (d, 2H, J=8.6 Hz), 8.06 (s, 1H), 7.60 (d, 2H, J=8.6 Hz), 4.82 (d, 2H, J=5.7 Hz), 2.39 (s, 3H).
(실시예 14 화합물) 4-벤질아미노-1-이소프로필-6-메틸메르캅토피라졸로[3,4-d]피리미딘
수율 93.8%
mp 166∼167℃
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ7.75 (s, 1H), 7.38-7.28 (m, 5H), 5.09 (m, 1H, J=6.6 Hz), 4.83 (d, 2H, J=5.5 Hz), 2.60 (s, 3H), 1.54 (d, 6H, J=6.6 Hz).
(실시예 15 화합물)4-(4-니트로벤질아미노)-1-메틸-6-메틸메르캅토피라졸로[3,4-d]피리미딘
수율 88.0%
mp 195∼197℃
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ8.17 (d, 2H, J=8.6 Hz), 7.76 (s, 1H), 7.52 (d, 2H, J=8.6 Hz), 4.94 (d, 2H, J=6.1 Hz), 3.96 (s, 3H), 2.55 (s, 3H).
(실시예 16 화합물) 4-(4-니트로벤질아미노)-1-이소프로필-6-메틸메르캅토피라졸로[3,4-d]피리미딘
수율 86.0%
mp 116∼120℃
1H NMR (300 MHz CDCl3) δ8.18 (d, 2H, J=8.4 Hz), 7.78 (s, 1H), 7.53 (d, 2H, J=8.7 Hz), 5.07 (m, 1H, J=6.6 Hz), 4.94 (d, 2H, J=6.3 Hz), 2.54 (s, 3H), 1.52 (d, 6H, J=6.6 Hz).
(실시예 17 화합물) 4-벤질아미노-1-이소프로필-6-메틸술포닐피라졸로[3,4-d]피리미딘
수율 84.5%
mp 122∼124℃
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ7.98 (s, 1H), 7.37-7.27 (m, 5H), 5.19 (m, 1H, J=6.6 Hz), 4.87 (d, 2H, J=5.6 Hz), 3.31 (s, 3H), 1.54 (d, 6H, J=6.6 Hz).
(실시예 18 화합물) 4-(4-니트로벤질아미노)-1-메틸-6-메틸술포닐피라졸로[3,4-d]피리미딘
수율 61.0%
mp 190∼193℃
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ8.21 (d, 2H, J=8.6 Hz), 8.15 (s, 1H), 7.67 (d, 2H, J=8.6 Hz), 4.96 (s, 2H), 4.05 (s, 3H), 3.27 (s, 3H).
(실시예 19 화합물) 4-(4-니트로벤질아미노)-1-이소프로필-6-메틸술포닐피라졸로[3,4-d]피리미딘
수율 56.0%)
mp 85∼90℃ (dec)
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ8.12 (s, 1H), 7.98 (d, 2H, J=7.2 Hz), 7.45 (d, 2H, J=8.4 Hz), 7.16 (s, 1H), 5.00 (m, 1H, J=6.6 Hz), 4.84 (s, 2H), 3.21 (s, 3H), 1.48 (d, 6H, J=6.7 Hz).
(실시예 20 화합물) 4-(3-플루오로아닐리노)-6-메틸메르캅토피라졸로[3,4-d]피리미딘
수율 85.1%
mp 242∼247℃
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ10.19 (s, 1H), 8.22 (s, 1H), 7.93-6.87 (m, 4H), 2.51 (s, 3H).
(실시예 21 화합물) 4-(3-메톡시아닐리노)-6-메틸메르캅토피라졸로[3,4-d]피리미딘
수율 79.4%
mp 218∼222℃
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ10.04 (s, 1H), 8.21 (s, 1H), 7.60-6.70 (m, 4H), 3.80 (s, 3H), 2.54 (s, 3H).
(실시예 22 화합물) 4-(3-브로모아닐리노)-1-이소프로필-6-메틸메르캅토피라졸로[3,4-d]피리미딘
수율 69.8%
mp 110∼115℃
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ7.89 (s, 1H), 7.49-7.26 (m, 4H), 5.08 (m, 1H, J=6.7 Hz), 2.64 (s, 3H), 1.52 (d, 6H, J=6.7 Hz).
(실시예 23 화합물) 4-(3-플루오로아닐리노)-1-메틸-6-메틸메르캅토피라졸로[3,4-d]피리미딘
수율 65.4%
mp 172∼173℃
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ10.25 (s, 1H), 8.17 (s, 1H), 7.92-6.87 (m, 4H), 3.86 (s, 3H), 2.53 (s, 3H).
(실시예 24 화합물) 4-(3-플루오로아닐리노)-1-이소프로필-6-메틸메르캅토피라졸로[3,4-d]피리미딘
수율 65.0%
mp 118∼120℃
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ7.53-6.94 (m, 4H), 7.48 (s, 1H), 5.10 (m, 1H, J=6.7 Hz), 2.62 (s, 3H), 1.54 (d, 6H, J=6.7 Hz).
(실시예 25 화합물)4-(3-메톡시아닐리노)-1-메틸-6-메틸메르캅토피라졸로[3,4-d]피리미딘
수율 54.4%
mp 129∼131℃
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ10.04 (s, 1H), 8.15 (s, 1H), 7.55-6.68 (m, 4H), 3.88 (s, 3H), 3.78 (s, 1H), 2.56 (s, 3H).
(실시예 26 화합물) 4-(3-메톡시아닐리노)-1-이소프로필-6-메틸메르캅토피라졸로[3,4-d]피리미딘
수율 64.7%
mp 125∼128℃
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ7.32-6.83 (m, 5H), 5.08 (m, 1H), 3.82 (s, 3H), 2.63 (s, 3H), 1.52 (d, 6H).
(실시예 27 화합물) 4-(3-브로모아닐리노)-1-1-이소프로필-6-메틸술포닐피라졸로[3,4-d]피리미딘
수율 94.1%
mp 200∼204℃
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ8.39 (s, 1H), 7.36-6.80 (m, 4H), 5.06 (m, 1H,J=6.7 Hz), 3.33 (s, 3H), 1.42 (d, 6H, J=6.7 Hz).
(실시예 28 화합물) 4-(3-플루오로아닐리노)-6-메틸술포닐피라졸로[3,4-d]피리미딘
수율 72.0%
mp 234∼237℃ (dec)
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ10.78 (s, 1H), 8.45 (s, 1H), 7.95-6.96 (m, 4H), 3.38 (s, 3H).
(실시예 29 화합물) 4-(3-플루오로아닐리노)-1-메틸-6-메틸술포닐피라졸로[3,4-d]피리미딘
수율 82.9%
mp >260℃
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ7.93 (s, 1H), 7.61-7.00 (m, 4H), 4.04 (s, 3H), 3.39 (s, 3H).
(실시예 30 화합물) 4-(3-플루오로아닐리노)-1-이소프로필-6-메틸술포닐피라졸로[3,4-d]피리미딘
수율 84.7%
mp 170∼172℃
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ10.83 (s, 1H), 8.46 (s, 1H), 7.93-6.98 (m, 4H), 5.08 (m, 1H), 3.40 (s, 3H), 1.50 (d, 6H).
(실시예 31 화합물) 4-(3-메톡시아닐리노)-6-메틸술포닐피라졸로[3,4-d]피리미딘
수율 76.0%
mp 150∼153℃
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ7.91 (s, 1H), 8.38-7.05 (m, 4H), 4.08 (s, 3H), 3.36 (s, 3H).
(실시예 32 화합물) 4-(3-메톡시아닐리노)-1-메틸-6-메틸술포닐피라졸로[3,4-d]피리미딘
수율 60.4%
mp 211∼213℃
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ7.76 (s, 1H), 7.40-6.91 (m, 4H), 4.04 (s, 3H), 3.84 (s, 3H), 3.38 (s, 3H).
(실시예 33 화합물) 4-(3-메톡시아닐리노)-1-이소프로필-6-메틸술포닐피라졸로[3,4-d]피리미딘
수율 64.3%
mp 186∼188℃
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ8.17 (s, 1H), 7.45-6.96 (m, 4H), 5.24 (m, 1H), 3.91 (s, 3H), 3.47 (s, 3H), 1.59 (d, 6H).
화학식
n R1 R2 R3
실시예 13 1 NO2 H SMe
실시예 14 1 H i-Pr SMe
실시예 15 1 NO2 Me SMe
실시예 16 1 NO2 i-Pr SMe
실시예 17 1 H i-Pr SO2Me
실시예 18 1 NO2 Me SO2Me
실시예 19 1 NO2 i-Pr SO2Me
실시예 20 0 F H SMe
실시예 21 0 OMe H SMe
실시예 22 0 Br i-Pr SMe
실시예 23 0 F Me SMe
실시예 24 0 F i-Pr SMe
실시예 25 0 OMe Me SMe
실시예 26 0 OMe i-Pr SMe
실시예 27 0 Br i-Pr SO2Me
실시예 28 0 F H SO2Me
실시예 29 0 F Me SO2Me
실시예 30 0 F i-Pr SO2Me
실시예 31 0 OMe H SO2Me
실시예 32 0 OMe Me SO2Me
실시예 33 0 OMe i-Pr SO2Me
<실시예 34∼57>
화학식 1로 표시되는 화합물 중 화학식 (II)를 출발물로하여 상기 예시된 실시예 11∼12에 따라표 3의 화합물을 얻었으며, 이들 화합물의 구조 확인시험 결과는 하기와 같다.
(실시예 34 화합물) 4-벤질아미노-1-메틸-6-(2-히드록시에틸아미노)피라졸로[3,4-d]피리미딘
수율 80.2%
mp 94∼95℃
1H NMR (300 MHz, CD3OD) δ7.80 (s, 1H), 7.37-7.20 (m, 5H), 4.72 (d, 2H), 3.77 (s, 3H), 3.70 (t, 2H,J=5.4 Hz), 3.54 (t, 2H,J=5.5 Hz) 3.57 (t, 2H).
(실시예 35 화합물) 4-벤질아미노-1-메틸-6-[디-(2-히드록시에틸아미노)]피라졸로[3,4-d]피리미딘
수율 40.9%
mp 130∼135℃
1H NMR (CD3OD) δ7.79 (s, 1H), 7.36-7.23(m, 5H), 4.70 (d, 2H), 3.77 (s, 11H).
(실시예 36 화합물) 4-벤질아미노-1-이소프로필-6-(2-히드록시에틸아미노)피라졸로[3,4-d]피리미딘
수율 77.5%
mp 122∼123℃
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ7.71 (s, 1H), 7.22-7.12 (m, 5H), 6.33 (s, 1H), 4.63-4.52 (m, 3H), 3.39-3.27 (m, 8H), 1.26 (d, 6H).
(실시예 37 화합물) 4-벤질아미노-1-이소프로필-6-[디-(2-히드록시에틸아미노)]피라졸로[3,4-d]피리미딘
수율 49.5%
mp 112∼113℃
1H NMR (300MHz, CD3OD) δ7.89 (s, 1H), 7.45-7.31 (m, 5H), 4.81 (d, 2H), 3.77 (t, 4H), 3.61 (t, 4H).
(실시예 38 화합물) 4-(4-니트로벤질아미노)-1-메틸-6-(2-히드록시에틸아미노)피라졸로[3,4-d]피리미딘
수율 40.3%
mp 125∼130℃
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ8.18 (d, 2H), 7.64 (s, 1H), 7.49 (d, 2H), 5.78 (bs, 1H), 5.41 (t, 1H), 4.85 (d, 2H), 3.84 (s, 3H), 3.82 (t, 2H), 3.59 (t, 2H).
(실시예 39 화합물) 4-(4-니트로벤질아미노)-1-이소프로필-6-(2-히드록시에틸아미노)피라졸로[3,4-d]피리미딘
수율 35.2%
mp 155∼157℃
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ8.19 (d, 2H), 7.68 (s, 1H), 7.50 (d, 2H), 5.87 (bs, 1H), 5.40 (t, 1H), 4.84 (m, 2H), 4.84 (m, 1H), 3.82 (t, 2H), 3.59 (t, 2H), 1.49 (d, 6H).
(실시예 40 화합물) 4-(4-아미노벤질아미노)-1-메틸-6-(2-히드록시에틸아미노)피라졸로[3,4-d]피리미딘
수율 72.0%
mp 91∼93℃
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ7.60 (s, 1H), 7.13 (d, 2H), 6.66 (d, 2H), 5.39 (s, 1H), 4.59 (d, 2H), 3.83 (s, 3H), 3.84-3.58 (m, 4H).
(실시예 41 화합물) 4-(4-아미노벤질아미노)-1-이소프로필-6-(2-히드록시에틸아미노)피라졸로[3,4-d]피리미딘
수율 42.1%
mp 105∼110℃
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ8.22 (t, 1H), 7.64 (s, 1H), 7.11 (d, 2H), 6.59 (d, 2H), 4.80 (m, 1H), 4.59 (d, 2H), 4.45 (bs, 2H), 3.80 (t, 2H), 3.52(t, 2H), 1.48 (d, 6H).
(실시예 42 화합물) 4-(3-브로모아닐리노)-1-메틸-6-(2-히드록시에틸아미노)피라졸로[3,4-d]피리미딘
수율 83.2%
mp 173∼174℃
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ9.67 (s, 1H), 8.00-6.94 (m, 5H), 4.70 (s, 1H), 3.74 (s, 3H), 3.59 (q, 2H), 3.43 (q, 2H).
(실시예 43 화합물) 4-(3-브로모아닐리노)-1-메틸-6-[디-(2-히드록시에틸아미노)]피라졸로[3,4-d]피리미딘
수율 40.0%
mp 218∼220℃
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ9.78 (s, 1H), 8.32-7.19 (m, 5H), 4.82 (s, 2H), 3.75-3.72 (m, 11H).
(실시예 44 화합물) 4-(3-브로모아닐리노)-1-이소프로필-6-(2-히드록시에틸아미노)피라졸로[3,4-d]피리미딘
수율 85.7%
mp 159∼162℃
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ9.67 (s, 1H), 8.19-6.89 (m, 5H), 4.82 (m, 1H), 3.70 (s, 1H), 3.61-3.37 (m, 4H), 1.41 (d, 6H).
(실시예 45 화합물) 4-(3-브로모아닐리노)-1-이소프로필-6-[디-(2-히드록시에틸아미노)]피라졸로[3,4-d]피리미딘
수율 39.7%
mp 145∼148℃
1H NMR (300 MHz, CD3OD) δ7.99 (s, 1H), 8.33-7.21 (m, 4H), 4.94 (m, 1H), 3.90 (s, 8H), 1.51 (d, 6H).
(실시예 46 화합물) 4-(3-플루오로아닐리노)-6-(2-히드록시에틸아미노)피라졸로[3,4-d]피리미딘
수율 67.0%
mp > 260℃
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ12.79 (s, 1H), 9.69 (s, 1H), 8.14-6.79 (m, 5H), 4.73 (t, 2H), 3.60-3.37 (m, 4H).
(실시예 47 화합물) 4-(3-플루오로아닐리노)-6-[디-(2-히드록시에틸아미노)]피라졸로[3,4-d]피리미딘
수율 45.3%
mp > 260℃
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ12.82 (s, 1H), 9.80 (s, 1H), 8.05 (s, 1H), 7.95-6.81 (m, 4H), 4.01 (s, 1H), 3.71-3.64 (m, 8H).
(실시예 48 화합물) 4-(3-플루오로아닐리노)-1-메틸-6-(2-히드록시에틸아미노)피라졸로[3,4-d]피리미딘
수율 82.1%
mp 176∼179℃
1H NMR (300 MHz, CD3OD) δ7.96-6.79 (m, 5H), 3.81 (s, 3H), 3.79-3.60 (m, 4H).
(실시예 49 화합물) 4-(3-플루오로아닐리노)-1-메틸-6-[디-(2-히드록시에틸아미노)]피라졸로[3,4-d]피리미딘
수율 42.1%
mp 213∼215℃
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ9.81 (s, 1H), 8.03 (s, 1H), 7.90-6.81 (m, 4H), 4.80 (s, 2H), 3.84 (m, 3H), 3.80-3.57 (m, 8H).
(실시예 50 화합물) 4-(3-플루오로아닐리노)-1-이소프로필-6-(2-히드록시에틸아미노)피라졸로[3,4-d]피리미딘
수율 75.9%
mp 174∼175℃
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ7.60-6.85 (m, 4H), 7.50(s, 1H), 5.52(t, 1H), 4.86 (m, 1H, J=6.7 Hz), 3.88(t, 2H), 3.65(m, 2H), 1.50 (d, 6H, J=6.7 Hz).
(실시예 51 화합물) 4-(3-플루오로아닐리노)-1-이소프로필-6-[디-(2-히드록시에틸아미노)]피라졸로[3,4-d]피리미딘
수율 64.2%
mp 210∼212℃
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ8.79 (s, 1H), 8.04 (s, 1H), 7.91-6.81 (m, 4H), 4.81 (m, 3H, J=6.7 Hz), 3,73-3.57 (m, 8H), 1.42 (d, 6H, J=6.7 Hz).
(실시예 52 화합물) 4-(3-메톡시아닐리노)-6-(2-히드록시에틸아미노)피라졸로[3,4-d]피리미딘
수율 64.2%
mp 254∼256℃
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ9.48 (s, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.60-6.59 (m, 5H), 4.72 (s, 1H), 3.77 (s, 3H), 3.55 (t, 2H), 3.36 (s, 2H).
(실시예 53 화합물) 4-(3-메톡시아닐리노)-6-[디-(2-히드록시에틸아미노)]피라졸로[3,4-d]피리미딘
수율 47.0%
mp > 260℃
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ9.51 (s, 1H), 8.01 (s, 1H), 7.48-6.58 (m, 4H), 4.73 (s, 2H), 3.75 (s, 3H), 3.74-3.62 (m, 8H).
(실시예 54 화합물) 4-(3-메톡시아닐리노)-1-메틸-6-(2-히드록시에틸아미노)피라졸로[3,4-d]피리미딘
수율 87.2%
mp 184∼188℃
1H NMR (300 MHz, CD3OD) δ7.89 (s, 1H), 7.53-6.67 (m, 4H), 3.83 (s,3H), 3.81 (s, 3H), 3.77 (t, 2H), 3.61 (t, 2H).
(실시예 55 화합물) 4-(3-메톡시아닐리노)-1-메틸-6-[디-(2-히드록시에틸아미노)]피라졸로[3,4-d]피리미딘
수율 53.3%
mp 171∼175℃
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ9.59 (s, 1H), 8.04 (1H, s), 7.51-6.60 (m, 4H), 4.80 (brs, 2H), 3.78-3.67 (m, 14H).
(실시예 56 화합물) 4-(3-메톡시아닐리노)-1-이소프로필-6-(2-히드록시에틸아미노)피라졸로[3,4-d]피리미딘
수율 70.5%
mp 135∼139℃
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ7.31-6.77 (m, 5H), 5.54 (s, 1H), 4.86 (m, 5H, J=6.7 Hz) 3.87-3.81 (m, 5H), 3.63 (q, 2H), 1.48 (d, 6H, J=6.7 Hz).
(실시예 57 화합물) 4-(3-메톡시아닐리노)-1-이소프로필-6-[디-(2-히드록시에틸아미노)]피라졸로[3,4-d]피리미딘
수율 59.6%
mp 108∼110℃
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ9.57 (s, 1H), 8.05 (s, 1H), 7.52-6.60 (m, 4H), 4.80 (m, 3H), 3.78 (m, 3H), 3.77-3.68 (m, 8H).
<실험예 1> 사이클린 의존 카이네이즈 저해 실험
(1)사이클린 의존 카이네이즈 저해 실험
사이클린 의존 카이네이즈 저해 시험법으로는 통상적인 효소 활성 저해 시험법(Enzymatic activity inhibition assay)을 사용하였다.
구체적으로, 사이클린 의존 카이네이즈 2의 억제 실험을 수행하였다.
세포 주기 의존적 카이네이즈 2의 활성 억제 실험은 감염된 sf21 곤충 세포로부터 분리·정제된 CDK2/사이클린 A 효소를 사용하여 수행하였다. 배큘로바이러스를 이용한 단백질의 과발현을 조사하기 위하여, 본 발명자들은 N-말단에 여섯 개의 히스티딘이 태그(tag)된 인간 CDK2 cDNA 및 인간 사이클린 A cDNA를 pBacPak 8 발현 벡터(Clon Tech, USA)에 각각 서브클로닝(subcloning)하였다. 상기 유전자를 포함하는 배큘로바이러스는 클론 테크사로부터 구입한 배큘로바이러스 제조 키트를 사용하여 제조하였다. CDK2/사이클린 A 효소는 Ni2+-친화 레진(Novagen, USA)을 사용하여 CDK2와 사이클린 A를 포함하는 배큘로바이러스로 동시형질전환된 sf21 곤충 세포 배양액으로부터 정제하였다. 효소의 분석은 10 μM의 ATP, 0,2 μCi의 γ-P32ATP, 10 mM의 MgCl2, 5 mM의 DTT를 포함하는 50 mM Tris-HCl 20 ㎕에서 수행하였으며, 이때 4 ㎍의 히스톤 H1(Calbiochem, USA)을 기질로 사용하였다. 억제제의 존재하에서 10분동안 반응을 실시하였으며, 30% 인산(phosphoric acid) 10 ㎕를 첨가함으로써 반응을 종결시켰다. 반응이 끝난 혼합액을 P81 종이(Whatman, USA)에 스팟(spot)한 후, 0.1 M NaCl을 포함하는 10 mM Tris-HCl(pH 8.0)을 이용하여 5회 세척하였다. 각 스팟의 방사능을 BAS 이미저(Kodak, USA)를 사용하여 정량하였으며, 활성을 50% 억제할 때의 억제제의 농도를 IC50수치로 결정하였다.
(2)세포독성 검정 실험
세포독성 검정 시험법(cancer cell growth inhibition assay)에 대한 시험 세포주로서 A431 (인간 폐종양 세포주), A549 (인간 폐종양 세포주), SNU638 (인간 위종양 세포주), 및 HCT116 (인간 대장종양 세포주)의 4종에 대하여in vitro활성시험을 수행하였다. 시험의 대조군으로 올로무신, 라스코비틴 및 독소루비신을 사용하였다.
구체적으로, 인간 암세포주 A431, A549, SNU638 및 HCT116을 서울대학교 의과대학내 한국세포주은행에서 얻었다. 상기 세포들을 10 % FBS(fetal bovine serum)를 함유한 RPMI 1640 배지에서 37℃, 5 % CO2에서 배양하였다. 각각의 화합물로 처리하기 전에 하루 동안 96 well plate 위에 천개의 세포들을 분주하였다. 다양한 농도의 화합물로 처리한 후 세포들을 2일동안 방치시킨 후 동일한 양의 4 % 포르말린(Sigma)을 첨가하여 30 분동안 고정시켰다. 상기 고정된 세포들을 수돗물로 5회 세척하고 30 분동안 0.1 % 설포로다민 B(Sigma)으로 염색하였다. 각 well을 1 % 아세트산으로 4회 세척하고 0.1 M 트리스-HCl(pH 8.0) 100 ㎖를 첨가한 후 10 분동안 교반하여 세포에 부착된 염색시약을 제거하였다. 마이크로평판 판독기(Molecular Dynamics)를 이용하여 520 ㎚의 파장에서 흡광도를 측정하였다.상기 흡광도는 각 well의 세포수와 비례한다. 상기 측정을 3회 실시하여 평균값을 얻었다. 화합물 처리 직후의 세포들의 흡광도를 0 %로 나타내었으며, 화합물 처리되지 않고 2일동안 성장한 세포들의 흡광도로 100 %로 나타내었다. 상기 GI50값은 2일간 화합물 처리하는 동안 50 % 세포성장 억제를 나타내는 화합물의 농도를 나타낸다.
사이클린 의존 카이네이즈 저해도 및 세포독성의 활성도는 각각 효소 및 단백질의 합성을 50% 저해하는데 요구되는 화합물의 농도를 μM로 표시하였다 (IC50및 GI50).
하기표 4는 본 발명의 피라졸로피리미딘 유도체의 사이클린 의존 카이네이즈 저해 실험 결과 및 세포독성 실험 결과를 나타낸 것이다.
실시예 IC50(μM) GI50(μM)
CDK2 A431 A549 SNU638 HCT116
5 29.5 26,56 23.39 20.77 4.50
6 37.2 >100 43.27 28.98 93.63
11 8.1 >100 >100 69.22 >100
12 3.8 >100 70.89 38.88 >100
34 >100 42.67 53.21 37.08 >100
35 >100 24.28 27.89 25.28 53.44
36 >100 35.60 28.47 25.17 57.60
37 >100 21.88 30.27 26.11 47.68
38 17.8 23.36 43.35 24.92 48.52
39 46.8 32.02 75.15 23.45 77.71
40 >100 58.88 >100 96.75 >100
41 >100 55.27 62.58 38.20 >100
42 >100 31.86 78.85 18.16 >100
43 >100 2.94 3.96 6.20 16.61
44 28.2 2.19 3.31 4.28 6.46
45 29.5 2.58 3.72 4.10 5.06
46 0.5 28.85 >100 >100 >100
47 0.9 54.33 >100 >100 >100
48 21.4 16.29 14.93 15.84 28.24
49 36.3 3.94 4.28 2.56 8.89
50 49.0 7.80 11.31 7.57 19.28
51 47.9 6.25 7.84 7.95 10.88
52 3.1 >100 17.04 17.07 38.19
53 10.2 >100 > 100 >100 >100
54 >100 19.14 12.95 21.73 90.44
55 57.5 12.94 5.44 10.49 17.19
56 >100 13.08 15.17 7.55 21.44
57 66.0 4.43 11.16 7.92 12.56
olomoucine 7.0 16.60 16.79 16.62 12.05
roscovitine 0.5 - - - -
doxorubicine - 0.18 - - 0.13
상기표 4에서 보는 바와 같이, 4-아닐리노피라졸로피리미딘 화합물들이 4-벤질피라졸로피리미딘 화합물들 보다 우수한 CDK2 저해 활성을 나타내었다. 특히, 피라졸로피리미딘 구조의 C-4에서 3-플루오로아닐린기를 가지는 실시예 46의 화합물은 대조물질인 올로무신 및 라스코비틴과 비교하여 우월하거나 동등한 CDK2 저해 활성를 나타내었었다. 일반적으로, N-1에서 치환기를 가지지 않는 실시예 11, 12, 46, 47, 52, 53 화합물들은 치환기를 가지는 실시예 44, 45, 48, 49 화합물들 보다 강력한 CDK2 저해 활성을 나타내었다. 한편, 실시예 44, 45 화합물들은 시험 세포주에 대하여 우수한 세포독성을 나타내었다.
<실험예 2> 랫트에 대한 경구투여 급성 독성실험
한편, 화학식 1의 화합물의 급성 독성을 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
6주령의 특정병원부재(SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 2 마리씩의 동물에 실시예 1∼57로부터 얻어진 화합물을 각각 0.5 % 메틸셀룰로오스 용액에 현탁하여 50 ㎎/㎏/15㎖의 용량으로 단회 경구 투여하였다.
시험물질 투여 후 동물의 폐사 여부, 임상증상 및 체중변화 등을 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.
시험 결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상은 없었고 폐사된 동물도 없었으며, 또한 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과 실험된 화합물은 모두 랫트에서 50 ㎎/㎏까지 독성변화를 나타내지 않으며 경구 투여 최소치사량 (LD50)은 100 ㎎/㎏ 이상인 안전한 물질로 판단되었다.
한편, 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 목적에 따라 여러 형태로 제제화가 가능하다. 하기는 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 활성성분으로 함유시킨 몇몇 제제화 방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
<제제예 1> 정제(직접 가압)
활성성분 5.0 ㎎을 체로 친 후, 락토스 14.1 ㎎, 크로스포비돈 USNF 0.8 ㎎ 및 마그네슘 스테아레이트 0.1 ㎎을 혼합하고 가압하여 정제로 제조하였다.
<제제예 2> 정제(습식 조립)
활성성분 5.0 ㎎을 체로 친 후, 락토스 16.0 ㎎과 녹말 4.0 ㎎을 섞었다. 폴리솔베이트 80 0.3 ㎎을 순수한 물에 녹인 후 이 용액의 적당량을 첨가한 다음, 미립화하였다. 건조 후에 미립을 체질한 후 콜로이달 실리콘 디옥사이드 2.7 ㎎ 및 마그네슘 스테아레이트 2.0 ㎎과 섞었다. 미립을 가압하여 정제로 제조하였다.
<제제예 3> 분말과 캡슐제
활성성분 5.0 ㎎을 체로 친 후에, 락토스 14.8 ㎎, 폴리비닐 피롤리돈 10.0 ㎎, 마그네슘 스테아레이트 0.2 ㎎와 함께 혼합하였다. 상기 혼합물을 적당한 장치를 사용하여 단단한 No. 5 젤라틴 캡슐에 채웠다.
<제제예 4> 주사제
활성성분으로서 100 mg을 함유시키고, 그 밖에도 만니톨 180 mg,Na2HPO4·12H2O 26 mg 및 증류수 2974 mg를 함유시켜 주사제를 제조하였다.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 피라졸로피리미딘 유도체는 세포분열주기를 조절하는 사이클린 의존 카이네이즈(CDK)를 억제함으로서 사이클린 의존 카이네이즈의 활성에 의해 야기되는 간암, 유방암, 위암, 결장암 또는 직장암의 예방 및 치료에 유용하게 이용할 수 있다.

Claims (10)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 피라졸로피리미딘 유도체 및 그의 약학적으로 허용되는 염.
    화학식 1
    (상기 식에서,
    R1은 오르토, 메타 또는 파라 치환체를 포함하고, 브로모, 클로로, 플루오로, 메톡시, 수소, 니트로 또는 아미노기이며,
    R2는 수소 또는 C3이하의 저급 알킬기이며,
    R3는 수소 또는 C3이하의 저급 알킬기, 히드록시에틸기이며,
    n은 0 또는 1이다.)
  2. 제 1항에 있어서, 상기 피라졸로피리미딘 유도체가
    1)4-벤질아미노-6-(2-히드록시에틸아미노)피라졸로[3,4-d]피리미딘,
    2)4-벤질아미노-6-[디-(2-히드록시에틸아미노)]피라졸로[3,4-d]피리미딘,
    3)4-벤질아미노-1-메틸-6-(2-히드록시에틸아미노)피라졸로[3,4-d]피리미딘,
    4)4-벤질아미노-1-메틸-6-[디-(2-히드록시에틸아미노)]피라졸로[3,4-d]피리미딘,
    5)4-벤질아미노-1-이소프로필-6-(2-히드록시에틸아미노)피라졸로[3,4-d]피리미딘,
    6)4-벤질아미노-1-이소프로필-6-[디-(2-히드록시에틸아미노)]피라졸로[3,4-d]피리미딘,
    7)4-(4-니트로벤질아미노)-1-메틸-6-(2-히드록시에틸아미노)피라졸로[3,4-d] 피리미딘,
    8)4-(4-니트로벤질아미노)-1-이소프로필-6-(2-히드록시에틸아미노)피라졸로[3,4-d] 피리미딘,
    9)4-(4-아미노벤질아미노)-1-메틸-6-(2-히드록시에틸아미노)피라졸로[3,4-d] 피리미딘
    10)4-(4-아미노벤질아미노)-1-이소프로필-6-(2-히드록시에틸아미노)피라졸로[3,4-d] 피리미딘,
    11)4-(3-브로모아닐리노)-6-(2-히드록시에틸아미노)피라졸로[3,4-d]피리미딘,
    12)4-(3-브로모아닐리노)-6-[디-(2-히드록시에틸아미노)]피라졸로[3,4-d]피리미딘,
    13)4-(3-브로모아닐리노)-1-메틸-6-(2-히드록시에틸아미노)피라졸로[3,4-d]피리미딘,
    14)4-(3-브로모아닐리노)-1-메틸-6-[디-(2-히드록시에틸아미노)]피라졸로[3,4-d]피리미딘,
    15)4-(3-브로모아닐리노)-1-이소프로필-6-(2-히드록시에틸아미노)피라졸로[3,4-d]피리미딘,
    16)4-(3-브로모아닐리노)-1-이소프로필-6-[디-(2-히드록시에틸아미노)]피라졸로[3,4-d]피리미딘,
    17)4-(3-플루오로아닐리노)-6-(2-히드록시에틸아미노)피라졸로[3,4-d]피리미딘,
    18)4-(3-플루오로아닐리노)-6-[디-(2-히드록시에틸아미노)]피라졸로[3,4-d]피리미딘,
    19)4-(3-플루오로아닐리노)-1-메틸-6-(2-히드록시에틸아미노)피라졸로[3,4-d]피리미딘,
    20)4-(3-플루오로아닐리노)-1-메틸-6-[디-(2-히드록시에틸아미노)]피라졸로[3,4-d]피리미딘,
    21)4-(3-플루오로아닐리노)-1-이소프로필-6-(2-히드록시에틸아미노)피라졸로[3,4-d]피리미딘,
    22)4-(3-플루오로아닐리노)-1-이소프로필-6-[디-(2-히드록시에틸아미노)]피라졸로[3,4-d]피리미딘,
    23)4-(3-메톡시아닐리노)-6-(2-히드록시에틸아미노)피라졸로[3,4-d]피리미딘,
    24)4-(3-메톡시아닐리노)-6-[디-(2-히드록시에틸아미노)]피라졸로[3,4-d]피리미딘,
    25)4-(3-메톡시아닐리노)-1-메틸-6-(2-히드록시에틸아미노)피라졸로[3,4-d]피리미딘,
    26)4-(3-메톡시아닐리노)-1-메틸-6-[디-(2-히드록시에틸아미노)]피라졸로[3,4-d]피리미딘,
    27)4-(3-메톡시아닐리노)-1-이소프로필-6-(2-히드록시에틸아미노)피라졸로[3,4-d]피리미딘,
    28)4-(3-메톡시아닐리노)-1-이소프로필-6-[디-(2-히드록시에틸아미노)]피라졸로[3,4-d]피리미딘인 것을 특징으로 하는 피라졸로피리미딘 유도체 및 그의 약학적으로 허용되는 염.
  3. 하기 반응식 1로 표시되는 피라졸로피리미딘 유도체(화학식 1)의 제조방법에 있어서,
    화학식 (II)의 6-메틸술포닐피라졸로피리미딘계 화합물을 이소프로판올 또는 n-부탄올 중에서 선택된 1종 이상의 알콜과 디메틸술폭시드 또는 디메틸포름아미드 중에서 선택된 1종 이상의 극성 용매의 혼합 유기용매 존재하에 화학식 (III)의 히드록시에틸아민 화합물과 친핵성 치환반응시켜 C-6 위치에 아민기로 치환된 화학식 (I)의 피라졸로피리미딘 유도체를 제조하는 것을 포함하는 제 1항의 피라졸로피리미딘 유도체의 제조방법.
    반응식 1
    (상기 식에서, R1, R2, R3및 n은 청구항 1에서 정의한 바와 같다.)
  4. 삭제
  5. 제 3항에 있어서, 상기 반응이 70∼100℃에서 1∼6시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 피라졸로피리미딘 유도체의 제조방법.
  6. 제 3항에 있어서, 추가로 하기 반응식 2와 같이 상기 화학식 (II)의 6-메틸술포닐피라졸로피리미딘계 화합물이 유기용매 존재하에서 화학식 (IV)의 6-메틸메르캅토피라졸로피리미딘 화합물과 메타-클로로퍼벤조산 화합물을 반응시켜 얻어지는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 피라졸로피리미딘 유도체의 제조방법.
    반응식 2
    (상기 식에서, R1, R2및 n은 청구항 1에서 정의한 바와 같다.)
  7. 제 6항에 있어서, 상기 반응용매가 클로로포름 또는 디클로로메탄인 것을 특징으로 하는 피라졸로피리미딘의 제조방법.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 반응이 -10∼10℃에서 2∼5 시간 동안 반응시키고, 다시 상온에서 3∼12시간 동안 반응시키는 것을 특징으로 하는 피라졸로피리미딘의 제조방법.
  9. 삭제
  10. 제 1항의 피라졸로피리미딘 유도체 및 그의 염을 유효성분으로 함유하는 간암, 유방암, 위암, 결장암 또는 직장암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
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