WO2020251163A1 - 생산성이 향상된 비독성 프로테아제 - Google Patents

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WO2020251163A1
WO2020251163A1 PCT/KR2020/005623 KR2020005623W WO2020251163A1 WO 2020251163 A1 WO2020251163 A1 WO 2020251163A1 KR 2020005623 W KR2020005623 W KR 2020005623W WO 2020251163 A1 WO2020251163 A1 WO 2020251163A1
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toxic
toxic protease
mutant
peptide
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손영덕
김호준
권의중
김종탁
김경수
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주식회사 앤씨비아이티
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    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli

Definitions

  • the present invention relates to a non-toxic protease with improved productivity, and more particularly, to a non-toxic protease with improved productivity by inhibiting irreversible protein aggregation and improving refolding efficiency by introducing a point mutation.
  • Clostridial neurotoxins e.g., Dysport TM , Neurobloc TM , and Botox TM
  • botulinum neurotoxin sold under the same name.
  • the non-toxic protease domain that constitutes it is zinc-endpopeptidase, a well-known group of proteases that act on target cells by incapacitating the secretory function of cellular physiological substances.
  • non-toxic protease domains alone do not kill the target cells they act on.
  • Non-toxic protease domains act by proteolytically-cleaving SNARE proteins (e.g., SNAP-25, VAMP, or an intracellular transport protein known as syntaxin).
  • SNARE proteins e.g., SNAP-25, VAMP, or an intracellular transport protein known as syntaxin.
  • the abbreviation SNARE is derived from Soluble NSF Attachment Receptor, and NSF is N-ethylmaleimide-sensitive factor (Nethylmaleimide- Sensitive Factor)
  • SNARE protein is essential for the formation of intracellular vesicles, and thus is essential for the secretion of molecules through vesicle transport of cells, so, after delivery to the desired target cells, the non-toxic protease is the target. It can inhibit cell secretion by cells.
  • Clostridium neurotoxins represent the main group of non-toxic toxin molecules and consist of two polypeptide chains linked together by disulfide bonds.
  • the two chains are referred to as a heavy chain (H-chain) having a molecular weight of about 100 kDa, and a light chain (L-chain) having a molecular weight of about 50 kDa.
  • Plasma membrane associated (SNARE) proteins e.g., synaptobrevin, syntaxin
  • SNARE synaptobrevin, syntaxin
  • This substrate is an important component of the secretory machinery of cells (Korea Patent Laid-Open No. 10-2014-0036239).
  • Non-toxic proteases can temporarily inhibit muscle contraction in vivo, and therefore, it is used as a bio-drug for the treatment of some myopathy or muscle contraction disorders. In other words, non-toxic protease inhibits muscle contraction by temporarily inhibiting acetylcholine release. Recently, non-toxic proteases have been successfully used as an injectable biological agent in the treatment of various muscle contraction disorders such as blepharopathy, migraines, and facial wrinkle reduction (Mauskop A. The use of Botulinum Toxin in the treatment of headaches. Curr Pain Headache Rep. 2002; 6:320-3; Mauskop A. Botulinum toxin in headache treatment: The end of the road?
  • non-toxic proteases can be used for various purposes and are highly commercially available, and there have been attempts to mass-produce non-toxic proteases using recombinant microorganisms.
  • the recombinant non-toxic protease expressed in a recombinant microorganism transformed with a recombinant expression vector exhibits a phenomenon of aggregation in the form of an inclusion body in a large part of the insoluble fraction depending on the composition and structure of the protein.
  • urea After dissolving the protein as much as possible with a solution such as guanidiium chloride, surfactant, and reducing agent, centrifugation, dialysis, ion exchange, hydrophobic interaction, reverse phase and gel filtration, various column chromatography filled with appropriate types of resin, etc.
  • the solution used in such a complex purification process changes the structure of the protein, resulting in loss of the activity of non-toxic proteases, and refolding the purified protein to restore the protease activity.
  • Even with the introduction of a complicated additional process there was a problem that most of the parts of the enclosure could not be recovered due to poor restoration efficiency (Saffarian, BIOENGINEERED 2016, VOL. 7, NO. 6, 478-483).
  • such a refolding process is diluted or dialyzed with a buffer solution without a reducing/denaturing agent to induce disulfide bonds between cysteine amino acids inside the protein through oxidation, and then filter or centrifuge to induce soluble and insoluble.
  • the fraction is separated and the process proceeds to recover only the protein whose three-dimensional structure of the protein has been restored. Even with such a complicated process, the recovery rate of the non-toxic protease refolded from the insoluble fraction is considerably low (Cabrita, 2004, Biotechnology Annual Review, 10:31-50; Clark, Current Opinion in Biotechnology 1998, 9:157-163; Yamaguchi, Biomolecules 2014, 4, 235-251).
  • the present inventors are polite to recover the refolded non-toxic protease effectively even in the insoluble fraction, where most of the non-toxic proteases exist when producing non-toxic proteases using recombinant microorganisms, but they are irreversibly aggregated into inclusion bodies and thus cannot be recovered.
  • point mutations were induced in some amino acids of non-toxic proteases, they were reversibly aggregated into inclusion bodies and thus effectively refolded even in insoluble fractions and active non-toxic proteases could be recovered, and the productivity of non-toxic proteases could be maximized.
  • An object of the present invention is to provide a mutant non-toxic protease with improved yield in a production process using a recombinant microorganism and a method for producing the same.
  • the present invention provides a mutant non-toxic protease in which cysteine (Cys), which is the 430th amino acid of the non-toxic protease represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, is substituted with an amino acid other than cysteine.
  • cysteine Cys
  • the present invention also includes the mutant non-toxic protease
  • iii) Provides a fusion non-toxic protease in which any one or more peptides selected from the group consisting of cell targeting peptides are fused.
  • the present invention also includes the mutant non-toxic protease
  • yeast secretion signal peptide i) yeast secretion signal peptide
  • the present invention also provides a mutant gene encoding the mutant non-toxic protease.
  • the present invention also includes the mutant gene,
  • nucleic acids encoding cell penetrating peptides
  • iii) Provides a gene construct comprising any one or more nucleic acids selected from the group consisting of nucleic acids encoding cell targeting peptides.
  • the present invention also includes the mutant gene,
  • iii) Provides a gene construct comprising any one or more nucleic acids selected from the group consisting of nucleic acids encoding cell targeting peptides.
  • the present invention also provides a recombinant vector into which the mutant gene has been introduced.
  • the present invention also provides a recombinant microorganism into which the recombinant vector has been introduced.
  • the present invention also,
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for treating muscular dystrophy comprising the mutant or fusion non-toxic protease as an active ingredient.
  • the present invention also provides a hyaluronic acid microneedle patch containing the mutant or fusion non-toxic protease.
  • the present invention also provides a method for improving or treating myopathy symptoms comprising administering the mutant or fusion non-toxic protease to a subject in need of improvement or treatment of myopathy symptoms.
  • the present invention also provides the use of the mutant or fusion non-toxic protease for the manufacture of a pharmaceutical product for use in the improvement or treatment of symptoms of myopathy.
  • the present invention also provides the mutant or fusion non-toxic protease for use in a method of improving or treating myopathy symptoms.
  • 1 is a schematic diagram of the structural difference between the mutant non-toxic protease and the wild-type non-toxic protease according to the present invention.
  • Figure 2 is a schematic diagram showing the formation of an irreversible insoluble inclusion body according to the expression of a wild-type non-toxic protease and its inhibition principle in the mutant non-toxic protease according to the present invention.
  • FIG. 3 is a schematic diagram of the structure of a mutant non-toxic protease and a fusion non-toxic protease according to various embodiments of the present invention.
  • Figure 4 is a schematic diagram of the position of a restriction enzyme used in recombinant vector cloning to produce various non-toxic mutant proteases and non-toxic fusion mutant proteases according to the present invention.
  • FIG. 6 is a schematic diagram of the structure of a fusion non-toxic protease for expression in the yeast Pichia pastoris .
  • 11 is a result of confirming the expression pattern in E. coli by codon-optimizing the fusion non-toxic protease of various embodiments according to the present invention to be suitable for expression in E. coli by Coomassie blue staining.
  • FIG. 12 is a diagram illustrating an E. coli cell expressing a mutant non-toxic protease according to various embodiments of the present invention, and after separating it into a soluble fraction and an insoluble fraction, the amount of non-toxic protease in each fraction was determined by Coomassie blue staining and Western blotting. This is the result of checking
  • FIG. 13 is a schematic diagram of the production process according to the present invention.
  • FIG. 16 is a result of comparing the amount of wild-type and mutant non-toxic protease present in the insoluble fraction (A) and the amount of wild-type and mutant non-toxic protease that can be recovered by refolding (B).
  • Figure 17 shows the result of expression and purification in E. coli by fusion of SNAP25, an enzyme active substrate of non-toxic protease, with ANNEXIN V in order to analyze the cleavage activity of mutant non-toxic protease and fusion non-toxic protease according to the present invention. This is the result of checking.
  • 19 is a result of expressing and purifying a fusion non-toxic protease in Pichia pastoris , a recombinant yeast transformed with a fusion non-toxic protease according to the present invention, and confirming by Western blotting.
  • Figure 20 is a schematic diagram of the process of fermenting and purifying a non-toxic protease according to the present invention in large quantities.
  • Fig. 21 is a result of mass fermentation and purification of wild-type non-toxic protease, electrophoresis by SDS-PAGE, and Coomassie staining.
  • C430S mutant non-toxic protease
  • C430A mutant non-toxic protease
  • C430G mutant non-toxic protease
  • C430G-BFGFRP fusion non-toxic protease
  • 26 is a graph comparing the water-soluble protease formation rate and purification yield of wild-type non-toxic protease and mutant non-toxic protease according to the present invention.
  • a mutation in the cysteine residue which is the 430th amino acid of the wild-type non-toxic protease.
  • induction it was confirmed that the aggregation phenomenon due to the formation of inclusion bodies was improved while maintaining protease activity, so that non-toxic proteases contained in the insoluble fraction can be recovered with only a simple refolding process.
  • various functional peptides are attached to the variant It was also confirmed that high productivity can be maintained.
  • the present invention relates to a mutant non-toxic protease in which cysteine (Cys), which is the 430th amino acid of the non-toxic protease represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, is substituted with an amino acid other than cysteine.
  • cysteine Cys
  • cysteine which is the 430th amino acid of the non-toxic protease, is substituted with any amino acid other than cysteine so as not to form inappropriate disulfide bonds with other cysteines, and may be substituted with amino acids that do not form disulfide bonds without limitation.
  • cysteine (Cys) may be characterized in that it is substituted with glycine (Gly), alanine (Ala), or serine (Ser).
  • the present invention in another aspect, as an embodiment, and the mutant non-toxic protease;
  • iii It relates to a fusion non-toxic protease in which any one or more peptides selected from the group consisting of cell targeting peptides are fused.
  • the cell-penetrating peptide is represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3
  • the belt domain fragment peptide is represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5
  • the cell targeting peptide is represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 It may be characterized, but is not limited thereto.
  • the fusion non-toxic protease is for expression in E. coli.
  • the mutant non-toxic protease in another aspect of the present invention, as an embodiment, the mutant non-toxic protease
  • yeast secretion signal peptide i) yeast secretion signal peptide
  • fusion non-toxic protease in which any one or more peptides selected from the group consisting of cell targeting peptides are fused.
  • the fusion non-toxic protease is for expression in yeast.
  • the yeast secretion signal peptide is represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46
  • the cell penetration peptide is represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3
  • the cell targeting peptide is represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 It may be characterized as a fusion non-toxic protease characterized, but is not limited thereto.
  • the non-toxic protease constituting the fusion non-toxic protease when the non-toxic protease constituting the fusion non-toxic protease is fused with another peptide at its N-terminus, the first amino acid, methionine, can be removed and fused.
  • the mutant non-toxic protease or fusion non-toxic protease may be characterized in that the tag peptide for purification is further fused.
  • the tag peptide for purification is glutathione-S-transferase (GST), C-myc tag, chitin-binding domain, streptavidin binding protein (SBP), cellulose-binding domain, calmodulin-binding peptide, S-tag , Strep-tag II, FLA, protein A, protein G, histidine affinity tag (HAT), poly-His, Thioredoxin, pelB leader, and maltose binding protein (MBP).
  • GST glutathione-S-transferase
  • C-myc tag C-myc tag
  • chitin-binding domain chitin-binding domain
  • streptavidin binding protein (SBP) streptavidin binding protein
  • calmodulin-binding peptide S-tag
  • Strep-tag II FLA
  • the present invention is not limited thereto, and any purification tag peptides used in the art may be used in the process of expressing and purifying proteins in microorganisms.
  • the purification peptide can be cleaved according to a method known in the art after purification is completed, and a mutant non-toxic protease or fusion non-toxic protease from which the tag peptide for purification is detached can be used for its original use. Will be self-explanatory.
  • any one of the peptides may be characterized in that it is fused to a non-toxic protease directly or by a linker, and the linker sequence is about 3 to 20 amino acids, More preferably about 3 to 10 amino acids.
  • the linker sequence is preferably flexible such that the non-toxic protease is not maintained in an undesirable form.
  • the linker sequence can be used, for example, to separate the non-toxic protease site from the fused peptide.
  • the peptide linker sequence is Molecular flexibility can be provided by appropriate placement as needed between the toxic protease and the peptide and/or between any two or more selected peptides.
  • the linker predominantly comprises amino acids having small side chains, such as glycine, alanine and serine, in order to provide flexibility.
  • Preferably at least about 80 or 90 percent of the linker sequence comprises glycine, alanine or serine residues, especially glycine or serine residues.
  • One suitable linker sequence may be characterized in that it is a peptide linker preferably represented by (Gly) N (wherein N is an integer of 3 to 10), but is not limited thereto.
  • the present invention is a protease for cleavage between the C-terminus of the non-toxic protease and the N-terminus of a peptide selected from the group consisting of a cell penetrating peptide, a belt domain fragment peptide, a cell targeting peptide, a yeast secretion signal peptide, and a tag peptide for purification. It may be characterized in that it further comprises a peptide sequence cleavable by.
  • the cleavable peptide sequence may be LVPRGS, which is one of the cleavage sequences of the thrombin-like enzyme batroxobin, but is not limited thereto.
  • the cleavable peptide sequence is derived from the cleavage sequence of the human fibrinogen alpha chain, one of the cleavage sequences of the thrombin-like enzyme batroxobin, which is a protein cleavage enzyme, and is a non-toxic protease by the cleavage sequence.
  • the non-toxic protease may form a hetero dimer connected to the cleaved peptide by a disulfide bond.
  • any protease that will cleave a peptide fused with a non-toxic protease is trypsin, pepsin, Lys-C endoproteinase, Lys-N endoproteinase, arginyl endopeptidase, without limitation, as described in EP2524963. Plasmin, omphtin and clostridial proteases.
  • the protease for cleavage is trypsin or Lys-C endoproteinase.
  • the protease is a protease that cleaves a non-toxic protease non-native (ie exogenous) cleavage site.
  • Non-native proteases that can be utilized include enterokinase (DDDDK ⁇ ) (SEQ ID NO: 50), factor Xa (IEGR ⁇ (SEQ ID NO: 51)/IDGR ⁇ ) (SEQ ID NO: 52), TEV (tobacco etch virus) (ENLYFQ ⁇ G) (SEQ ID NO: 53), thrombin (LVPR ⁇ GS) (SEQ ID NO: 54) and pre-cutting (LEVLFQ ⁇ GP) (SEQ ID NO: 55), ( ⁇ indicates a cut site), but is not limited thereto.
  • the cell penetrating peptide is Protein-derived Penetration (RQIKIWFQNRRMKWKK) (SEQ ID NO: 56), Tat peptide (GRKKRRQRRRPPQ) (SEQ ID NO: 57), pVEC (LLIILRRRIRKQAHAHSK) (SEQ ID NO: 58), Chimeric Transportan (GWTLLANSAGYLLKI) (SEQ ID NO: 59), MPG (GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV) (SEQ ID NO: 60), Pep-1 (KETWWETWWTEWSQPKKKRKV) (SEQ ID NO: 61), synthetic Polyarginines ((R)n; 6 ⁇ n ⁇ 12), MAP (KLALKLALKALKAALKLA) 62), and R 6 W 3 (RRWWRRWRR) (SEQ ID NO: 63) may be selected from the group consisting of, but is not limited thereto. (See C. Bechara et al.
  • the cell targeting peptide is NH2-Thr-Tyr-Arg-Ser-, a basic fibroblast growth factor related peptide derived from the amino acid sequence 105 to 115 of the human basic fibroblast growth factor as an embodiment.
  • Arg-Lys-Tyr-(Thr or Ser)-Ser-Trp-Tyr-COOH; [TYRSRKY(S/T)SWY] may be characterized, but is not limited thereto, and those skilled in the art lectin wheat germ agglutinin, All peptides used as targeting moieties for conventional non-toxic proteases, such as nerve growth factor (NGF), epidermal growth factor, antibody fragment, and a growth hormone releasing hormone (GHRH) ligand (Elena Fonfria et al., Toxins (Basel). 2018 Jul; 10(7): 278.) can be used in fusion with the non-toxic protease of the present invention.
  • NGF nerve growth factor
  • GHRH growth hormone releasing hormone
  • the present invention relates to a mutant gene encoding the mutant non-toxic protease.
  • the mutant gene may be characterized in that it is represented by a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 30, 32 and 34.
  • mutant gene in another aspect of the present invention, the mutant gene and,
  • nucleic acids encoding cell penetrating peptides
  • iii It relates to a gene construct comprising any one or more nucleic acids selected from the group consisting of nucleic acids encoding cell targeting peptides.
  • the nucleic acid encoding the cell penetrating peptide is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4
  • the nucleic acid encoding the belt domain fragment peptide is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6
  • the nucleic acid encoding the cell targeting peptide May be characterized by being represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8, but is not limited thereto.
  • mutant gene in another aspect of the present invention, the mutant gene and,
  • iii It relates to a gene construct comprising any one or more nucleic acids selected from the group consisting of nucleic acids encoding cell targeting peptides.
  • the nucleic acid encoding the yeast secretion signal peptide is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 47
  • the sequence encoding the cell penetrating peptide is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4
  • the nucleic acid encoding the cell targeting peptide is It may be characterized by being represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8, but is not limited thereto.
  • the mutant gene or gene construct may be characterized in that it further contains a nucleic acid encoding a tag peptide for purification.
  • the tag peptide for purification is glutathione-S-transferase (GST), C-myc tag, chitin-binding domain, streptavidin binding protein (SBP), cellulose-binding domain, calmodulin-binding peptide, S-tag , Strep-tag II, FLA, protein A, protein G, histidine affinity tag (HAT), poly-His, Thioredoxin, pelB leader, and maltose binding protein (MBP).
  • GST glutathione-S-transferase
  • C-myc tag C-myc tag
  • chitin-binding domain chitin-binding domain
  • streptavidin binding protein (SBP) streptavidin binding protein
  • calmodulin-binding peptide S-tag
  • Strep-tag II FLA, protein A,
  • the gene construct may further comprise a nucleic acid encoding a linker peptide that fuses the non-toxic protease and the peptide, and the nucleic acid encoding the linker peptide is a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 26 It may be characterized by being represented by.
  • the present invention is a protease for cleavage between the C-terminus of the non-toxic protease and the N-terminus of a peptide selected from the group consisting of a cell penetrating peptide, a belt domain fragment peptide, a cell targeting peptide, a yeast secretion signal peptide, and a tag peptide for purification It may be characterized in that it contains a nucleic acid encoding a peptide sequence cleavable by.
  • the nucleic acid encoding the cleavable peptide sequence may be characterized by being represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 28, but is not limited thereto.
  • the present invention includes fragments and variants thereof for polypeptides (proteins) and genes (nucleic acids) provided in specific sequences as long as they retain their original structural and/or functional characteristics. That is, it may have 90% or more, more preferably 95% or more, and most preferably 97% or more or 99% or more sequence homology with the sequence provided by the present invention.
  • the present invention relates to a recombinant vector into which the mutant gene or gene construct is introduced.
  • the recombinant vector can be used without limitation, a vector known in the art that can be introduced into a bacterial cell, a yeast cell, a mammalian cell, an insect cell, a plant cell, or an amphibian cell and used for overexpression of a recombinant protein. And, preferably, it is possible to use a recombinant vector that can be introduced into bacterial cells or yeast cells and used for overexpression of the recombinant protein.
  • pET22b(+) (Novagen, Merk Millipore) vector for expression in E. coli, and pPIC9 vector for expression in yeast may be used, but the usable vector is not limited to these vectors, and known in the art. It is apparent to those skilled in the art that the vector is applicable to the expression of the mutant non-toxic protease or fusion non-toxic protease of the present invention.
  • the present invention relates to a recombinant microorganism into which the recombinant vector has been introduced.
  • the recombinant microorganism may be characterized in that it is a bacterium or yeast, but is not limited thereto.
  • the present invention relates to a method for producing a mutant non-toxic protease or a fusion non-toxic protease comprising the following steps:
  • the step (a) may be performed in two stages of main culture (ie, culture for fermentation) after seed culture.
  • the step (a) may be characterized in that after culturing the recombinant microorganism at 30-38°C, lowering the culture temperature to 16-20°C when the OD 600 of the recombinant microorganism is 0.2 to 0.4 have.
  • the culture temperature is increased when the OD 600 of the recombinant microorganism is 0.25 to 0.35 after culturing the recombinant microorganism at 36-38°C, more preferably 36.5-37.5°C. It may be characterized by further culturing by lowering to 17-19 °C.
  • the mutant non-toxic protease or fusion non-toxic protease according to the present invention significantly increases the amount of recovery in the soluble fraction, which is initially cultivated at a high temperature to rapidly increase the amount of recombinant microorganisms and then recombination.
  • the microorganism When the microorganism reaches a certain amount, it slows the metabolism of the recombinant microorganism by lowering the culture temperature of the recombinant microorganism, and by adding a small amount of IPTG, the expression of the non-toxic protease is gradually induced to increase the refolding efficiency of the non-toxic protease. This is the result derived from the present invention so that most of the toxic protease can be included in the soluble fraction.
  • Such an effect of increasing the expression level in the soluble fraction is particularly pronounced in C430G, a mutant protease derived from the present invention, which induces disulfide bonds between cysteines in the case of wild-type mutant proteases, and in some cases in the case of other mutant proteases C430S and C430A. It is believed that this is because non-specific disulfide bonds are induced.
  • step (c) may be characterized in that the recombinant microorganism lysate is centrifuged to separate the soluble fraction and the insoluble fraction, and independently purify the mutant non-toxic protease or the fusion non-toxic protease from each fraction. .
  • the step (c) may be characterized in that the recombinant microorganism lysate is centrifuged to separate the soluble fraction and the insoluble fraction, and the mutant non-toxic protease or the fusion non-toxic protease is purified from the soluble fraction.
  • the appropriate medium and culture conditions for culturing the recombinant microorganism can use a method known in the art, for example, after inoculation in an appropriate medium for transformed E. coli or yeast and culture, suitable conditions, e.g. In E. coli, isopropyl- ⁇ -D-thiogalactoside, a gene expression inducing agent (isopropyl- ⁇ or methyl alcohol in methanol-magnetized yeast, can be supplied to induce protein expression. Induction of protein expression When the cultivation step is completed) , After recovering the culture or culture medium, the “pure recombinant protein” can be recovered therefrom.
  • suitable conditions e.g. In E. coli, isopropyl- ⁇ -D-thiogalactoside, a gene expression inducing agent (isopropyl- ⁇ or methyl alcohol in methanol-magnetized yeast, can be supplied to induce protein expression. Induction of protein expression When the cultivation step is completed) , After recovering the culture or culture medium, the “
  • the term “pure recombinant protein” refers to host cells other than the recombinant protein of the present invention and a protein derived from the DNA sequence encoding the same. It means not containing 5% or more, preferably 1% or more, of any other protein derived from.
  • Purification of the recombinant protein expressed in the transformed microorganism can be performed by various methods known in the art, and in general, the cell lysate or culture medium is centrifuged to remove cell debris and culture impurities. Then, precipitation, for example, salting out (precipitation of ammonium sulfate and precipitation of sodium phosphate), precipitation of solvents (precipitation of protein fractions using acetone, ethanol, isopropyl alcohol, etc.) can be performed, and dialysis, electrophoresis, and various Column chromatography and the like can be performed. As the chromatography, techniques such as ion exchange chromatography, gel-filtration chromatography, HPLC, reverse phase-HPLC, adsorption chromatography, affinity column chromatography, and ultrafiltration may be used alone or in combination.
  • the non-toxic protease is a peptide containing a light chain domain of a natural botulinum type A toxin having a remarkably reduced toxicity and having protease activity by removing the heavy chain domain of the natural botulinum type A toxin, and a concept including a mutation thereof.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for improving or treating muscular dystrophy comprising the mutant or fusion non-toxic protease as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition may be characterized for transdermal administration, but is not limited thereto.
  • the present invention relates to a method for improving or treating myopathy symptoms comprising administering the mutant or fusion non-toxic protease to a subject in need of improvement or treatment of myopathy symptoms.
  • the present invention relates to the use of the mutant or fusion non-toxic protease for the manufacture of a pharmaceutical product for use in the improvement or treatment of symptoms of myopathy.
  • the present invention relates to the mutant or fusion non-toxic protease for use in a method of improving or treating myopathy symptoms.
  • the myocardial dysfunction is facial cramps, eyelid cramps, quadrant, blepharospasm, cervical dystonia (spasmodictorticollis, cervical dystonia), central pharyngeal dystonia (oromandibular dystonia), spastic dystonia spasmodic dysphonia), migraine, anal pruritus, and hyperhidrosis (hyperhidrosis) may be selected from the group, but is not limited thereto.
  • the present invention relates to a hyaluronic acid microneedle patch containing the mutant or fusion non-toxic protease.
  • the microneedle patch is a facial spasm, eyelid spasm, stiffness, blepharospasm, cervical dystonia (spasmodictorticollis, cervical dystonia), central pharyngeal dystonia (oromandibular dystonia), spastic dystonia. (spasmodic dysphonia), migraine, anal pruritus and hyperhidrosis (hyperhidrosis) may be characterized in that it is for the treatment or alleviation of symptoms selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the term'treating' reverses, alleviates, or inhibits the progression of the disease or disease to which the term applies, or one or more symptoms of the disease or disease, Or it means to prevent, and the term'treatment' used in the present invention refers to an act of treating when'treating' is defined as above.
  • the treatment or therapy of the disease may include one or more of the following:
  • the term "effective amount (or effective amount)” means an amount that is very sufficient to deliver the desired effect, but sufficiently small enough to prevent serious side effects within the scope of medical judgment.
  • the amount of the composition to be administered into the body by the composition of the present invention may be appropriately adjusted in consideration of the route of administration and the object to be administered.
  • composition of the present invention may be administered to a subject once a day, once a day, once every several months, or more than once every several years.
  • Unit dosage means physically separate units suitable for unit administration for human subjects and other mammals, each unit containing a suitable pharmaceutical carrier and containing a predetermined amount of the protease of the present invention that exhibits a therapeutic effect. .
  • the dosage varies depending on the severity of the patient's disease and the active and auxiliary active ingredients used.
  • the total daily dose can be divided into several times and continuously administered as necessary. Accordingly, the above dosage range does not limit the scope of the present invention in any way.
  • pharmaceutically acceptable refers to a composition that is physiologically acceptable and does not usually cause allergic reactions such as gastrointestinal disorders or dizziness or similar reactions when administered to humans.
  • compositions of the present invention may be formulated using methods known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to a mammal.
  • the formulation may be in the form of a powder, granule, tablet, emulsion, syrup, aerosol, soft or hard gelatin capsule, sterile injectable solution, sterile powder, or patch.
  • the composition for preventing or treating diseases according to the present invention may be administered through various routes including oral, transdermal, subcutaneous, intravenous or muscle, and the dosage of the active ingredient is the route of administration, the patient's age, sex, and weight. And it may be appropriately selected according to various factors such as the severity of the patient, and may be administered in parallel with a known compound having an effect of preventing, improving, or treating the symptom.
  • Example 1 Construction of mutant non-toxic protease and fusion non-toxic protease expression vector
  • An expression vector for producing the mutant non-toxic protease and fusion non-toxic protease shown in FIG. 3 was constructed.
  • the nucleotide sequence encoding the wild-type non-toxic protease (BTX-LC) represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 2), the nucleotide sequence encoding the cell penetrating peptide (PEP1) (SEQ ID NO: 4), belt A nucleotide sequence encoding a domain peptide fragment (belt') (SEQ ID NO: 6) and a nucleotide sequence encoding a targeting peptide (SEQ ID NO: 8) were synthesized.
  • BTX-LC and PEP1-( ⁇ M)BTX-L-His were added to the multi-cloning site (MCS) downstream of the T7 promoter-lac operator of E. coli expression vector pET22b with restriction enzymes NdeI and XhoI. It was cloned. Thereafter, codon-optimized PEP1-( ⁇ )BTX-L-His ( E.coli codon optimization; Theoretical pI/Mw: 8.66 / 55003.59 Da) to improve the expression efficiency in E.
  • the expression vectors for E. coli constructed in Example 1 were transformed into BL21 (DE3) strain, which is an E. coli host for gene expression, to produce recombinant E. coli, and Mpicillin-resistant colonies were inoculated into LB culture medium and cultured with shaking at 37°C.
  • BL21 DE3
  • 0.5 mM IPTG is added, followed by inducing the expression of non-toxic protease at 18 ⁇ 25°C depending on the conditions and incubating for 6 ⁇ 12 hours to centrifuge the recombinant E. coli cells (3000 rpm 20 Minutes).
  • the collected recombinant E. coli cells were suspended in a 50mM Tris HCl, pH7.8, 0.1mM EDTA, 25% sucrose solution, and 0.2 mg/ml of lysozyme was added and treated for 1.5 hours at 4'C, and then 1.5 times the volume of the suspension was dissolved. After adding a buffer (lysis buffer, 20mM Tris HCl, pH7.8, 0.2M NaCl, 1% DCA, 1.6% NP-40 (or 1% SDS), 2mM EDTA, 0.5mM DTT), ultrasound at 4°C After crushing by using, the protein was quantified, loaded on an SDS-PAGE gel, and stained with Coomassie blue.
  • lysis buffer 20mM Tris HCl, pH7.8, 0.2M NaCl, 1% DCA, 1.6% NP-40 (or 1% SDS), 2mM EDTA, 0.5mM DTT
  • the wild-type and mutant non-toxic proteases were effectively expressed according to IPTG induction as shown in FIG. 7, and as shown in FIG. 8, the non-toxic protease was only in the whole cell lysate and the pellet. It was found to exist mostly insoluble.
  • SDS-PAGE of the wild-type non-toxic protease under non-reducing and reducing conditions it was found to exist in the form of a high molecular weight under non-reducing conditions, and it could be predicted that disulfide bonds affect the formation of aggregates ( Fig. 9).
  • the wild-type and mutant non-toxic proteases were codon-optimized to be suitable for E. coli expression, the amount of expression could be significantly increased (FIGS. 10 and 11).
  • the recombinant E. coli cells were collected by centrifugation (3000 rpm, 20 minutes). Collected cells were suspended in 50mM Tris HCl, pH7.8, 0.1mM EDTA, 25% sucrose, 2 ml of cell suspension solution based on 1 gram (g), and treated at 4°C for 1.5 hours by adding 0.2 mg/ml of lysozyme.
  • solution buffer 1.5 times the volume of the suspension (lysis buffer, 20mM Tris HCl, pH7.8, 0.2M NaCl, 1% DCA, 1.6% NP-40 (or 1% SDS), 2mM EDTA, 0.5mM DTT) was added and pulverized until the viscosity of the cell lysis reaction disappeared with the naked eye using an ultrasonic crusher.
  • the reaction product in which cells were sufficiently disrupted was centrifuged at 12000 rpm and 4° C. for 15 minutes to separate a soluble fraction and an insoluble fraction.
  • the non-toxic protease present in the soluble fraction was loaded on the Ni 2+ -IDA affinity column (iminodiacetic acid). 10 times of the column's binding buffer (50mM potassium phosphate buffer (pH 8.0) + 300mM NaCl + 1mM PMSF + 1mM ⁇ -mercatoethanol) and 6 times of washing buffer (50mM potassium phosphate buffer (pH 8.0) + 300mM NaCl + 1mM PMSF +1mM) ⁇ -mercatoethanol + 10mM Imidazole), and then an elution buffer containing 200, 300, 500 mM imidazole (50mM potassium phosphate buffer (pH 8.0) + 300mM NaCl + 1mM PMSF + 1mM ⁇ -mercatoethanol) It was eluted step by step.
  • the non-toxic protease precipitate of the insoluble fraction was used as a 5 ml washing solution (washing buffer, 2 ⁇ 4 M urea, 0.5% Triton X100, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) in the same volume as the supernatant. Washed twice and the supernatant was removed. The precipitate thus recovered was denatured with 1 ml urea solution (8M urea 20mM Tris HCl, pH7.8, 20uM DTT)), followed by a dialysis membrane (molecular weight cutoff 12,000, Sigma, cat no: D-0530, USA).
  • Example 3 As a result of purifying and refolding the insoluble fraction of Example 3, as shown in FIG. 15, in the case of the wild-type non-toxic protease, it was confirmed that even after refolding by dialysis, an aggregation phenomenon still appeared, but the mutant non-toxic protease or mutation In the case of the fusion non-toxic protease, it was confirmed that almost no aggregation phenomenon appeared after refolding.
  • a substrate for analyzing whether or not cleavage by the non-toxic protease was synthesized.
  • ANNEXIN V protein was fused to and expressed at the C-terminus of SNAP25 (Table 3), and the nucleotide sequence expressing the protein was cloned into a pET22b (+) expression vector, and this was cloned into the E. coli strain BL21 (DE3). Transformed. The transformed E. coli was cultured with shaking at 37° C.
  • the cleavage was tested using the purified SANP25-ANNEXIN V as a substrate.
  • the prepared SNAP25-ANNEXiN V and non-toxic protease were added to the enzyme reaction solution (HEPES pH7.4 100 mM, NaCl 1 mM, ZnCl 2 20 uM, DTT 2 mM) in a substrate (SNAP25-ANNEXINV) versus enzyme (protease) 20:1
  • the mixture was mixed at a ratio of (w/w) and the enzyme reaction was carried out at 37°C for 5 hours.
  • Transforming the vector into a Pichia pastoris strain was then cultured in a histidine deficient medium formed recombinant yeast colonies methanol magnetization yeast culture medium of BM (buffered minimal media: 100 mM potassium phosphate, pH 6.0 1.34% Yeast Nitrogen Base, 4 ⁇ 10 - 5 % biotin) was supplied as a carbon source for glycerol (1%) and cultured, and then the carbon source was replaced with methanol (0.5%) to induce the expression of non-toxic protease. The culture medium was recovered and the non-toxic protease expressed therefrom was purified with His-Tag, and a botulinum light chain antibody) cat no.
  • the non-toxic protease was effectively expressed and purified in yeast, and in yeast, it was confirmed as a multi-band non-toxic protease with an increased molecular weight by glycosylation. A non-toxic protease of the band was observed.
  • lysis buffer 50mM Tris-HCl (pH 8.0), 150mM NaCl, 10% glycerol
  • 1L of fermented culture medium about 5g by wet weight
  • a buffer for cell disruption was added to the cell suspension at a final concentration of 1 mM PMSF, 1 mM ⁇ -ME (beta-mercaptoethanol), 0.1% Triton-X 100, and sonication was performed for 4 min, pulse on/off: 4 sec. /8sec, power: 65% was performed 5 times using a Sonics Vibracell ultrasonic crusher.
  • the cell lysate was centrifuged at 12000 rpm at 4° C. for 30 minutes to separate the supernatant containing soluble protein from the cell lysate precipitate.
  • Ni-IDA column (WorkbeadsTM 40 Ni-IDA, 40-650-001, Bio-Works, Sweden) is filled, and the Equilibration buffer (50mM Tris-Hcl (pH 8.0) is 10 times the volume of the column (CV)). ), 150mM NaCl, 10% glycerol, 0.1% TritonX-100, 1mM PMSF, 1mM ⁇ -ME). Ni-IDA resin was added to the centrifuged supernatant containing the soluble protein to induce a binding reaction with the his-tag of the non-toxic protease for 2 hours at 4° C., and the column was filled again.
  • Washing buffer A (washing buffer A: 50mM Tris-HCl (pH 8.0), 150mM NaCl, 10% glycerol, 1mM ⁇ -ME) 20 times the column volume (CV), and 20 times the column volume (CV) Washing solution (50mM Tris-HCl (pH 8.0), 150mM NaCl, 50mM Imidazole, 10% glycerol, 1mM - ⁇ -ME) was washed a second time.
  • Elution buffers containing high imidazole concentrations 100/200/300/500/700mM Imidazole, 50mM Tris-Hcl (pH 8.0), 150mM NaCl, 10% glycerol, 1mM ⁇ -ME) sequentially It was eluted with 1.5 times the column volume (CV). EDTA was added to the eluted fraction to reach a final 1 mM.
  • the purity of the eluted fraction was confirmed by SDS-PAGE, and the eluted fraction was collected with an elution buffer to which 500-700 mM imidazole, which is a high-purity fraction, was added, and the cut-off value was in the range of 10-30 kDa using a dialysis membrane with a PBS buffer solution. Other chemical components were removed by dialysis replacement, and the purified non-toxic protease was recovered. For cryopreservation of the non-toxic protease, dialysis was performed with a PBS buffer solution containing 10% glycerol (FIG. 20).
  • the effect of increasing the expression and purification efficiency of the mutant non-toxic protease as a soluble protein was higher than that of the wild-type non-toxic protease even when the BFGFRP domain of fibroblast modifier was fused, and other peptides were fused to the mutant non-toxic protease. It was found that high expression efficiency and purification efficiency were maintained even in the case of Specifically, 15-80 mg/L of fusion non-toxic protease obtained by substituting cysteine for glycine at amino acid 430 of non-toxic protease and fusion of BFGFRP was recovered.
  • mice In order to confirm whether the toxicity of the non-toxic protease to be used in the present invention is reduced, single-time toxicity was evaluated in mice. This experiment was conducted using a wild-type non-toxic protease represented by SEQ ID NO: 1 of the present invention, and commissioned by KPC Co., Ltd. (212-9, Opo-ro, Opo-eup, Gwangju-si, Gyeonggi-do), Single dose intraperitoneal administration toxicity test”.
  • mice were purchased from ORIENTBIO Inc, Korea. The experiment was conducted with 35 males aged 6 weeks, and animals with no apparent abnormality were brought into the breeding area and allowed to acclimatize in the animal room where the test was conducted for 7 days. Healthy animals were selected after a 7-day quarantine and acclimatization period, confirming their health and suitability for conducting experiments.
  • filter tap water with a filter oil-water sterilizer irradiate with ultraviolet rays, and freely ingest using a drinking water bottle made of polycarbonate (250 mL), and feed rodent feed for experimental animals provided by Cargill Eggri Purina Co., Ltd. It was free.
  • test group G7 120 ug/mouse is equivalent to about 3.6 mg/kg when converted to the previously reported weight of mice.
  • the half lethal dose (LD50) in rodent mice identified so far is about 0.3ng/kg, and in humans, the half lethal dose (LD50) is about 1ng/kg, and only 1ug of 70kg adults is known as the lethal dose.
  • LD50 half lethal dose
  • the present invention improves the aggregation phenomenon into an inclusion body that generally occurs in the process of producing a wild-type non-toxic protease into a recombinant microorganism, thereby soluble and insoluble recovered by crushing the recombinant microorganism.
  • it is possible to obtain an active mutant non-toxic protease only by a simple dialysis/refolding process, and thus there is an advantage of producing a non-toxic protease in a high yield.

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Abstract

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 비독성 프로테아제의 430번째 아미노산인 시스테인(Cys)이 시스테인 이외의 아미노산으로 치환되어 있는 변이 비독성 프로테아제에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 종래 회수가 거의 불가능하던 불용성 분획에서 리폴딩된 비독성 프로테아제의 회수가 가능하여 비독성 프로테아제의 생산성을 현저히 향상시킬 수 있는 효과가 있다.

Description

생산성이 향상된 비독성 프로테아제
본 발명은 생산성이 향상된 비독성 프로테아제에 관한 것으로, 더 상세하게는 점 돌연변이 도입으로 비가역적 단백질 응집 현상이 억제되고 재접힘 효율이 개선되어 생산성이 향상된 비독성 프로테아제에 관한 것이다.
표적 세포에서 세포 생리물질의 분비 기능을 무력화하는 것에 의해 작용하는 물질로 가장 잘 알려진 예로 신경세포에 대해 클로스티리디움 신경독소(clostridial neurotoxins) (예를 들면, DysportTM, NeuroblocTM, 및 BotoxTM와 같은 이름으로 판매되는 보툴리눔 신경독소(botulinum neurotoxin))가 있다. 이를 구성하는 비독성 프로테아제 (non-toxic protease) 도메인은 zinc-엔도펩티다아제 (zinc-endpopeptidase)로서 세포 생리물질의 분비 기능을 무력화하는 것에 의해 표적 세포에 작용하는, 프로테아제의 잘 알려진 그룹이다. 흥미롭게도, 비독성 프로테아제 도메인 만으로는 그들이 작용하는 표적 세포를 죽이지 않는다.
비독성 프로테아제 도메인은 SNARE 단백질(예를 들면, SNAP-25, VAMP, 또는 신택신(syntaxin)으로 알려진 세포내 수송 단백질(intracellular transport protein)을 단백질 분해-절단(proteolytically-cleaving)하는 것에 의해 작용한다(Gerald K (2002) "Cell and Molecular Biology" (4th edition) John Wiley & Sons, Inc 참조). 약어 SNARE는 Soluble NSF Attachment Receptor에서 유래하였으며, NSF는 N-에틸말레이미드-민강성 인자(Nethylmaleimide-Sensitive Factor)를 의미한다. SNARE 단백질은 세포내 소포(vesicle) 형성에 필수적이고, 따라서 세포의 소포 수송을 통한 분자의 분비에 필수적이다. 따라서, 원하는 표적 세포에 전달된 후, 비독성 프로테아제는 표적 세포의 세포 분비를 억제할 수 있다.
클로스트리디움 신경독소는 비독성 독소 분자의 주된 그룹을 대표하며, 이황화 결합에 의해 서로 결합된 두 개의 폴리펩티드 사슬로 이루어진다. 두 개의 사슬은 약 100 kDa의 분자량을 갖는 중쇄(H-chain), 및 약 50kDa의 분자량을 갖는 경쇄(L-chain)로 지칭된다. 프로테아제 기능을 보유하고 엑소사이토시스 과정(exocytic process)에 관여하는, 소포 및/또는 세포막 결합(plasma membrane associated) (SNARE) 단백질(예를 들면, 시냅토브레빈(synaptobrevin), 신택신(syntaxin), SNAP 및/또는 VAMP)에 대한 높은 기질 특이성을 나타내는 것은 경쇄이다. 이러한 기질은 세포의 분비 기구의 중요한 구성성분이다 (대한민국 공개특허 10-2014-0036239).
비독성 프로테아제는 생체 내에서 일시적으로 근육 수축을 억제할 수 있으며, 따라서 이는 일부 근이상증이나 근육 수축 장애 치료용 바이오 약물로 활용된다. 즉, 비독성 프로테아제는 일시적으로 아세틸콜린 방출을 억제함으로써 근육 수축을 억제한다. 최근 눈꺼풀 패종증, 편두통, 얼굴 주름 감소 등과 같은 다양한 근육 수축 장애 치료에서 비독성 프로테아제는 주사용 생물학적 약제로 성공적으로 사용되고 있다 (Mauskop A. The use of Botulinum Toxin in the treatment of headaches. Curr Pain Headache Rep 2002; 6:320-3; Mauskop A. Botulinum toxin in headache treatment: The end of the road? Cephalalgia 2007; 27:468; Verheyden J, Blitzer A.. Other noncosmetic uses of Botox. Dis Mon 2002; 48:357-66; Dhaked RK, Singh MK, Singh P, Gupta P.. Botulinum toxin: Bioweapon & magic drug. Indian J Med Res 2010; 132:489-503; Turton K, Chaddock JA, Acharya KR.. Botulinum and tetanus neurotoxins: structure, function and therapeutic utility. Trends Biochem Sci 2002; 27:552-8; Masuyer G, Chaddock JA, Foster KA, Acharya KR.. Engineered botulinum neurotoxins as new therapeutics. Annu Rev Pharmacol Toxicol 2014; 54:27-51).
비독성 프로테아제는 상기와 같이 다양한 용도로 활용이 가능하고 상업성이 높아, 비독성 프로테아제를 재조합 미생물을 이용하여 대량 생산하고자 하는 시도가 있어왔다. 그러나 재조합 발현 벡터로 형질전환된 재조합 미생물에서 발현된 재조합 비독성 프로테아제는 단백질의 구성 및 구조에 따라 상당 부분 불용성 분획에서 봉입체(inclusion body)의 형태로 응집(aggregation)되는 현상을 나타내고, 이 경우 우레아, 구아니디움 클로라이드, 계면활성제, 환원제 등의 용액으로 최대한 단백질을 용해시킨 후, 원심분리, 투석, 이온교환, 소수성 상호작용, 역상 및 겔 여과, 적절한 종류의 레진이 충진된 각종 컬럼 크로마토그래피 등을 통하여 정제하게 되는데, 이와 같은 복잡한 정제 공정에서 사용되는 용액은 단백질의 구조를 변형시켜 비독성 프로테아제의 활성을 상실하는 결과를 야기하고, 프로테아제 활성을 복원하기 위하여 정제된 단백질을 리폴딩 (refolding)하는 복잡한 추가 공정을 도입하여도 복원 효율이 저조하여 봉입체 부분을 대부분 회수하지 못하는 문제점이 있었다(Saffarian, BIOENGINEERED 2016, VOL. 7, NO. 6, 478-483). 이와 같은 리폴딩 공정은 일반적으로 단백질의 크기에 따라 환원/변성제가 없는 완충용액으로 희석 또는 투석하여 산화 작용으로 단백질 내부의 시스테인 아미노산 간의 이황화 결합을 유도한 후, 다시 필터 또는 원심분리로 용해성 및 불용성 분획을 분리하고, 이를 통해 단백질 고유의 3차원 구조가 복원된 단백질만을 회수하는 공정으로 진행되는데, 이러한 복잡한 공정을 진행하여도 불용성 분획에서 리폴딩된 비독성 프로테아제 회수율은 상당히 낮다(Cabrita, 2004, Biotechnology Annual Review, 10:31-50; Clark, Current Opinion in Biotechnology 1998, 9:157-163; Yamaguchi, Biomolecules 2014, 4, 235-251).
이에, 본 발명자들은 재조합 미생물을 이용하여 비독성 프로테아제를 생산할 때 비독성 프로테아제의 대부분이 존재하지만 봉입체로 비가역적으로 응집되어 거의 회수가 불가능했던 불용성 분획에서도 효과적으로 리폴딩된 비독성 프로테아제를 회수하고자 예의 노력한 결과, 비독성 프로테아제의 일부 아미노산에 점 돌연변이를 유도하는 경우 가역적으로 봉입체로 응집되어 불용성 분획에서도 효과적으로 리폴딩되고 활성을 갖는 비독성 프로테아제가 회수 가능함을 확인하고 비독성 프로테아제의 생산성을 극대화 할 수 있는 본 발명을 완성하였다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 재조합 미생물을 이용한 생산 공정에서 수율이 향상된 변이 비독성 프로테아제 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 비독성 프로테아제의 430번째 아미노산인 시스테인(Cys)이 시스테인 이외의 아미노산으로 치환되어 있는 변이 비독성 프로테아제를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 변이 비독성 프로테아제와;
i) 세포 침투 펩타이드,
ii) 벨트 도메인 단편 펩타이드 및
iii) 세포 표적화 펩타이드로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 펩타이드가 융합되어 있는 융합 비독성 프로테아제를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 변이 비독성 프로테아제와;
i) 효모 분비 시그널 펩타이드,
ii) 세포 침투 펩타이드 및
ii) 세포 표적화 펩타이드로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 펩타이드가 융합되어 있는 융합 비독성 프로테아제를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 변이 비독성 프로테아제를 암호화하는 변이 유전자를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 변이 유전자와,
i) 세포 침투 펩타이드를 암호화하는 핵산;
ii) 벨트 도메인 단편 펩타이드를 암호화하는 핵산; 및
iii) 세포 표적화 펩타이드를 암호화하는 핵산으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 핵산을 포함하는 유전자 구조체를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 변이 유전자와,
i) 효모 분비 시그널 펩타이드를 암호화하는 핵산;
ii) 세포 침투 펩타이드를 암호화하는 핵산; 및
iii) 세포 표적화 펩타이드를 암호화하는 핵산으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 핵산을 포함하는 유전자 구조체를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 변이 유전자가 도입되어 있는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한,
다음 단계를 포함하는 변이 비독성 프로테아제 또는 융합 비독성 프로테아제의 제조방법을 제공한다:
(a) 상기 재조합 미생물을 배양하여 변이 비독성 프로테아제 또는 융합 비독성 프로테아제를 생성하는 단계;
(b) 재조합 미생물을 파쇄하는 단계; 및
(c) 재조합 미생물 파쇄물에서 변이 비독성 프로테아제 또는 융합 비독성 프로테아제를 정제하는 단계.
본 발명은 또한 상기 변이 또는 융합 비독성 프로테아제를 유효성분으로 포함하는 근이상증 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 변이 또는 융합 비독성 프로테아제를 함유하는 히알루론산 미세침 패치를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 변이 또는 융합 비독성 프로테아제를 근이상증 증상의 개선 또는 치료가 필요한 객체에게 투여하는 단계를 포함하는 근이상증 증상의 개선 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 근이상증 증상의 개선 또는 치료에 사용하기 위한 의약품 제조를 위한 상기 변이 또는 융합 비독성 프로테아제의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 근이상증 증상의 개선 또는 치료방법에 사용하기 위한 상기 변이 또는 융합 비독성 프로테아제를 제공한다.
도 1은 본 발명에 따른 변이 비독성 프로테아제와 야생형 비독성 프로테아제의 구조 차이를 도식화한 것이다.
도 2는 야생형 비독성 프로테아제의 발현에 따른 비가역적 불용성 봉입체(insoluble inclusion body)의 형성과 본 발명에 따른 변이 비독성 프로테아제에서의 이의 억제 원리를 보여주는 도식화한 것이다.
도 3은 본 발명의 다양한 실시 양태에 따른 변이 비독성 프로테아제 및 융합 비독성 프로테아제의 구조를 도식화한 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 다양한 변이 비독성 프로테아제 및 융합 변이 비독성 프로테아제를 제조하기 위하여 재조합 벡터 클로닝에 사용된 제한효소 위치를 도식화한 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 융합 변이 비-세포독성 프로테아제에서 변이 비-세포독성 프로테아제와 펩타이드(융합 파트너) 간의 융합 부위에 구조적 유연성을 부여할 수 있도록 (Gly)4 및 변이 비-세포독성 프로테아제와 펩타이드(융합 파트너)를 절단하여 이황화 결합으로 연결된 헤테로다이머를 형성할 수 있도록 단백질 절단효소인 트롬빈 유사효소 바트록소빈(batroxobin)의 절단 서열 중 하나인 LVPRGS 아미노산 서열이 도입된 융합 비-세포독성 프로테아제의 구조를 도식화한 것이다.
도 6은 효모 Pichia pastoris에서의 발현을 위한 융합 비독성 프로테아제의 구조를 도식화한 것이다.
도 7은 본 발명의 다양한 실시양태에 따른 변이 비독성 프로테아제의 대장균에서의 발현 양상을 쿠마시 블루 염색으로 확인한 결과이다.
도 8은 야생형 비독성 프로테아제를 대장균에서 발현시키고, 상등액과 침전물에서의 발현 양상을 쿠마시 블루 염색 및 웨스턴 블라팅으로 확인한 결과이다.
도 9는 야생형 비독성 프로테아제를 대장균에서 발현시키고, 비환원 및 환원 조건에서 야생형 비독성 프로테아제의 응집(aggregation) 양상을 쿠마시 블루 염색 및 웨스턴 블라팅으로 확인한 결과이다.
도 10은 본 발명에 따른 다양한 실시 양태의 변이 비독성 프로테아제를 대장균에서 발현에 적합하도록 코돈 최적화한 후 대장균에서의 발현 양상을 쿠마시 블루 염색으로 확인한 결과이다.
도 11은 본 발명에 따른 다양한 실시 양태의 융합 비독성 프로테아제를 대장균에서 발현에 적합하도록 코돈 최적화한 후 대장균에서의 발현 양상을 쿠마시 블루 염색으로 확인한 결과이다.
도 12는 본 발명에 따른 다양한 실시 양태의 변이 비독성 프로테아제를 발현하는 대장균 세포를 파쇄하고 용해성 분획과 불용성 분획으로 분리한 후, 각 분획에서의 비독성 프로테아제의 양을 쿠마시 블루 염색 및 웨스턴 블라팅으로 확인한 결과이다
도 13는 본 발명에 따른 생산 공정을 도식화한 것이다.
도 14는 본 발명에 따른 다양한 실시 양태의 변이 비독성 프로테아제 및 융합 비독성 프로테아제를 정제 후, 쿠마시 블루 염색 및 웨스턴 블라팅으로 확인한 결과이다.
도 15은 본 발명에 따른 다양한 실시 양태의 변이 비독성 프로테아제 및 융합 비독성 프로테아제의 우수한 리폴딩 효과를 확인한 결과이다.
도 16은 불용성 분획에 존재하는 야생형 및 변이 비독성 프로테아제의 양(A)과 리폴딩에 의해 회수 가능한 야생형 및 변이 비독성 프로테아제의 양(B)을 비교한 결과이다.
도 17은 본 발명에 따른 변이 비독성 프로테아제 및 융합 비독성 프로테아제의 절단 활성을 분석하기 위하여 비독성 프로테아제의 효소 활성 기질인 SNAP25를 ANNEXIN V와 융합하여 대장균에서 발현 및 정제한 결과를 쿠마시 블루 염색으로 확인한 결과이다.
도 18은 본 발명에 따른 변이 비독성 프로테아제 및 융합 비독성 프로테아제의 절단 활성을 SNAP25-ANNEXIN V 융합 단백질을 이용하여 쿠마시 블루 염색으로 확인한 결과이다.
도 19는 본 발명에 따른 융합 비독성 프로테아제가 형질전환된 재조합 효모인 Pichia pastoris에서 융합 비독성 프로테아제를 발현하고 정제하여 웨스턴 블라팅으로 확인한 결과이다.
도 20은 본 발명에 따른 비독성 프로테아제를 대량으로 발효 및 정제하는 공정을 도식화한 것이다.
도 21은 야생형 비독성 프로테아제를 대량 발효 정제한 후 SDS-PAGE로 전기영동하고 쿠마시 염색한 결과이다.
도 22는 본 발명에 따른 변이 비독성 프로테아제(C430S)를 대량 발효 정제한 후 SDS-PAGE로 전기영동하고 쿠마시 염색한 결과이다.
도 23은 본 발명에 따른 변이 비독성 프로테아제(C430A)를 대량 발효 정제한 후 SDS-PAGE로 전기영동하고 쿠마시 염색한 결과이다.
도 24는 본 발명에 따른 변이 비독성 프로테아제(C430G)를 대량 발효 정제한 후 SDS-PAGE로 전기영동하고 쿠마시 염색한 결과이다.
도 25는 본 발명에 따른 융합 비독성 프로테아제(C430G-BFGFRP) 를 대량 발효 정제한 후 SDS-PAGE로 전기영동하고 쿠마시 염색한 결과이다.
도 26은 본 발명에 따른 야생형 비독성 프로테아제와 변이 비독성 프로테아제의 수용성 프로테아제 형성율 및 정제 수율을 비교한 그래프이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 비독성 프로테아제를 재조합 미생물을 이용하여 생산하는 공정에서 야생형 비독성 프로테아제 정제시 빈번하게 발생하는 응집 현상에 따른 생산성 감소를 개선하고자, 야생형 비독성 프로테아제의 430번째 아미노산인 시스테인 잔기에 변이를 유도하는 경우 프로테아제 활성은 유지하면서도, 봉입체 형성에 따른 응집 현상이 개선되어 간단한 리폴딩 공정만으로 불용성 분획에 포함된 비독성 프로테아제를 회수할 수 있음을 확인하였고, 또한 상기 변이체에 다양한 기능성 펩타이드를 부착하여도 높은 생산성을 유지할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 비독성 프로테아제의 430번째 아미노산인 시스테인(Cys)이 시스테인 이외의 아미노산으로 치환되어 있는 변이 비독성 프로테아제에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 비독성 프로테아제의 430번째 아미노산인 시스테인은 다른 시스테인과 부적절한 이황화 결합을 형성하지 못하도록 시스테인 이외의 임의의 아미노산으로 치환되어 있는 것으로, 이황화 결합을 형성하지 못하는 아미노산으로 제한없이 치환될 수 있으나, 바람직하게는 시스테인(Cys)이 글리신(Gly), 알라닌(Ala) 또는 세린(Ser)으로 치환되는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 본 발명은 다른 관점에서, 일 실시양태로서, 상기 변이 비독성 프로테아제와;
i) 세포 침투 펩타이드,
ii) 벨트 도메인 단편 펩타이드 및
iii) 세포 표적화 펩타이드로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 펩타이드가 융합되어 있는 융합 비독성 프로테아제에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 침투 펩타이드는 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되고, 상기 벨트 도메인 단편 펩타이드는 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되며, 상기 세포 표적화 펩타이드는 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 바람직하게 상기 융합 비독성 프로테아제는 대장균에서 발현하기 위한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에 있어서, 일 실시양태로서, 상기 변이 비독성 프로테아제와;
i) 효모 분비 시그널 펩타이드,
ii) 세포 침투 펩타이드 및
iii) 세포 표적화 펩타이드로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 펩타이드가 융합되어 있는 융합 비독성 프로테아제에 관한 것이다. 바람직하게 상기 융합 비독성 프로테아제는 효모에서 발현하기 위한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 효모 분비 시그널 펩타이드는 서열번호 46의 아미노산 서열로 표시되고, 세포 침투 펩타이드는 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되며, 상기 세포 표적화 펩타이드는 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 융합 비독성 프로테아제인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 융합 비독성 프로테아제를 구성하는 비독성 프로테아제는 그 N-말단에 다른 펩타이드와 융합되는 경우, 첫번째 아미노산인 메티오닌을 제거하고 융합시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 변이 비독성 프로테아제 또는 융합 비독성 프로테아제는 정제용 태그 펩타이드가 추가로 융합되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 정제용 태그 펩타이드는 글루타티온 -S-트랜스퍼라제 (GST), C-myc 태그, 키틴-결합 도메인, 스트렙타비딘 결합 단백질 (SBP), 셀룰로오스-결합 도메인, 칼모둘린-결합 펩타이드, S-태그, Strep-태그 II, FLA, 단백질 A, 단백질 G, 히스티딘 친화도 태그 (HAT), 폴리-His, Thioredoxin, pelB leader 및 말토오스 결합 단백질 (MBP)로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않으며, 미생물에서 단백질을 발현시켜 정제하는 공정에서 당업계에서 사용하는 모든 정제용 태그 펩타이드를 사용할 수 있을 것이다. 상기 정제용 펩타이드는 정제가 완료된 후 당업계에 공지된 방법에 따라 절단할 수 있고, 정제용 태그 펩타이드가 탈착된 변이 비독성 프로테아제 또는 융합 비독성 프로테아제를 그 본래의 용도를 위해 사용할 수 있음은 당업자에게 자명하다 할 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 어느 하나의 펩타이드(즉, 융합용 또는 정제용 펩타이드)는 직접 또는 링커에 의해 비독성 프로테아제에 융합되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 링커 서열은 약 3 내지 20 개의 아미노산, 보다 바람직하게는 약 3 내지 10 개의 아미노산을 포함한다. 상기 링커 서열은 바람직하게는 상기 비독성 프로테아제가 바람직하지 못한 형태로 유지되지 않도록 가요성(flexible)이다. 상기 링커 서열을, 예를 들어 상기 융합된 펩타이드로부터 비독성 프로테아제 부위를 이격시키기 위해 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 비독성 프로테아제와 세포침투 펩타이드, 벨트 도메인 단편 펩타이드, 세포 표적화 펩타이드, 효모 분비 시그널 펩타이드 및 정제용 태그 펩타이드로 구성된 군에서 선택되는 두 개 이상의 펩타이드를 융합하는 경우 상기 펩타이드 링커 서열을 비독성 프로테아제와 펩타이드 사이 및/또는 선택된 임의의 두 개 이상의 펩타이드 사이에 필요에 따라 적절히 배치시켜, 분자 가요성을 제공할 수 있다. 상기 링커는 가요성을 제공하기 위해서, 바람직하게는 작은 측쇄를 갖는 아미노산, 예를 들어 글리신, 알라닌 및 세린을 우세하게 포함한다. 바람직하게는 상기 링커 서열의 약 80 또는 90 퍼센트 이상이 글리신, 알라닌 또는 세린 잔기, 특히 글리신 또는 세린 잔기를 포함한다. 하나의 적합 링커 서열은, 바람직하게는 (Gly)N(여기서, N은 3내지 10의 정수)으로 표시되는 펩타이드 링커인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명은 상기 비독성 프로테아제의 C-말단과 세포침투 펩타이드, 벨트 도메인 단편 펩타이드, 세포 표적화 펩타이드, 효모 분비 시그널 펩타이드 및 정제용 태그 펩타이드로 구성된 군에서 선택되는 펩타이드의 N-말단 사이에 절단용 프로테아제에 의해 절단 가능한 펩타이드 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 절단 가능한 펩타이드 서열은 트롬빈 유사효소 바트록소빈(batroxobin)의 절단 서열 중 하나인 LVPRGS인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 일 실시양태로서, 상기 절단 가능한 펩타이드 서열은 단백질 절단효소인 트롬빈 유사효소 바트록소빈(batroxobin)의 절단 서열중의 하나인 인간 피브리노겐 알파체인의 절단 서열로부터 유래한 것으로, 절단서열에 의해 비독성 프로테아제와 융합된 펩타이드가 절단되면, 상기 비독성 프로테아제는 상기 절단된 펩타이드와 이황화결합으로 연결된 이형이중체 (hetero dimer)를 형성할 수 있다.
그러나, 비독성 프로테아제와 융합된 펩타이드를 절단시킬 임의의 프로테아제는 EP2524963에서 기재된 바와 같이 제한 없이 트립신, 펩신, Lys-C 엔도프로테이나제, Lys-N 엔도프로테이나제, 아르기닐 엔도펩티다아제, 플라스민, 옴프틴 및 클로스트리디알 프로테아제를 포함한다. 일 실시양태에서, 절단용 프로테아제는 트립신 또는 Lys-C 엔도프로테이나제이다. 일 실시양태에서, 프로테아제는 비독성 프로테아제 비-원상태(즉 외인성) 절단 부위를 절단시키는 프로테아제이다. 활용될 수 있는 비-원상태 프로테아제는 엔테로키나제 (DDDDK↓)(서열번호 50), 인자 Xa(IEGR↓(서열번호 51)/IDGR↓)(서열번호 52), TEV(담배 식각 바이러스) (ENLYFQ↓G)(서열번호 53), 트롬빈 (LVPR↓GS)(서열번호 54) 및 사전절단 (LEVLFQ↓GP)(서열번호 55), (↓는 절단 부위를 나타낸다) 등일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.본 발명에 있어서, 상기 세포 침투 펩타이드는 Protein-derived Penetration (RQIKIWFQNRRMKWKK)(서열번호 56), Tat peptide(GRKKRRQRRRPPQ)(서열번호 57), pVEC (LLIILRRRIRKQAHAHSK)(서열번호 58), Chimeric Transportan (GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL)(서열번호 59), MPG (GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV)(서열번호 60), Pep-1 (KETWWETWWTEWSQPKKKRKV)(서열번호 61), synthetic Polyarginines ((R)n; 6<n<12), MAP (KLALKLALKALKAALKLA)(서열번호 62), 및 R6W3 (RRWWRRWRR)(서열번호 63)로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. (C. Bechara et al. FEBS Letter 587 (2013) 1693-1702 참조).
본 발명에 있어서, 상기 세포 표적화 펩타이드는 일 양태로서 인간 염기성 섬유아세포 성장인자의 105번에서 115번 아미노산 서열에서 유래된 펩타이드 (basic fibroblast growth factor related peptide) 인 NH2- Thr-Tyr-Arg-Ser-Arg-Lys-Tyr-(Thr또는Ser)-Ser-Trp-Tyr-COOH;[TYRSRKY(S/T)SWY]인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자는 lectin wheat germ agglutinin, nerve growth factor (NGF), epidermal growth factor, 항체 단편, a growth hormone releasing hormone (GHRH) ligand 등 종래 비독성 프로테아제의 타겟팅 모이어티로 활용되는 모든 펩타이드(Elena Fonfria et al., Toxins (Basel). 2018 Jul; 10(7): 278. 참조)를 본 발명의 비독성 프로테아제와 융합하여 사용할 수 있음은 당업자에게 자명하다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 변이 비독성 프로테아제를 암호화하는 변이 유전자에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 변이 유전자는 서열번호 30, 32 및 34로 구성된 군에서 선택되는 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에 있어서, 상기 변이 유전자와,
i) 세포 침투 펩타이드를 암호화하는 핵산;
ii) 벨트 도메인 단편 펩타이드를 암호화하는 핵산; 및
iii) 세포 표적화 펩타이드를 암호화하는 핵산으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 핵산을 포함하는 유전자 구조체에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 침투 펩타이드를 암호화하는 핵산은 서열번호 4의 염기서열로 표시되고, 벨트 도메인 단편 펩타이드를 암호화하는 핵산은 서열번호 6의 염기서열로 표시되며, 세포 표적화 펩타이드를 암호화하는 핵산은 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 변이 유전자와,
i) 효모 분비 시그널 펩타이드를 암호화하는 핵산;
ii) 세포 침투 펩타이드를 암호화하는 핵산; 및
iii) 세포 표적화 펩타이드를 암호화하는 핵산으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 핵산을 포함하는 유전자 구조체에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 효모 분비 시그널 펩타이드를 암호화하는 핵산은 서열번호 47의 염기서열로 표시되고, 세포 침투 펩타이드를 암호화하는 서열은 서열번호 4의 염기서열로 표시되며 세포 표적화 펩타이드를 암호화하는 핵산은 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 변이 유전자 또는 유전자 구조체는 정제용 태그 펩타이드를 암호화하는 핵산이 추가로 포함되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 정제용 태그 펩타이드는 글루타티온 -S-트랜스퍼라제 (GST), C-myc 태그, 키틴-결합 도메인, 스트렙타비딘 결합 단백질 (SBP), 셀룰로오스-결합 도메인, 칼모둘린-결합 펩타이드, S-태그, Strep-태그 II, FLA, 단백질 A, 단백질 G, 히스티딘 친화도 태그 (HAT), 폴리-His, Thioredoxin, pelB leader 및 말토오스 결합 단백질 (MBP)로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않으며, 미생물에서 단백질을 발현시켜 정제하는 공정에서 당업계에서 사용하는 모든 정제용 태그 펩타이드를 사용할 수 있을 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 유전자 구조체는 상기 비독성 프로테아제와 상기 펩타이드를 융합하는 링커 펩타이드를 암호화하는 핵산을 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 링커 펩타이드를 암호화하는 핵산은 서열번호 26의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 상기 비독성 프로테아제의 C-말단과 세포침투 펩타이드, 벨트 도메인 단편 펩타이드, 세포 표적화 펩타이드, 효모 분비 시그널 펩타이드, 정제용 태그 펩타이드로 구성된 군에서 선택되는 펩타이드의 N-말단 사이에 절단용 프로테아제에 의해 절단 가능한 펩타이드 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 절단 가능한 펩타이드 서열을 암호화하는 핵산은 서열번호 28의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명은 구체적 서열로 제공하는 폴리펩타이드(단백질)와 유전자(핵산)에 있어서 이들이 그들 본래의 구조적 및/또는 기능적 특징을 유지하는 한, 그의 단편 및 변이체를 포함한다. 즉, 본 발명에서 제공하는 서열과 90% 이상, 더 바람직하게는 95% 이상, 및 가장 바람직하게는 97% 이상 또는 99% 이상의 서열 상동성을 가질 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서 상기 변이 유전자 또는 유전자 구조체가 도입되어 있는 재조합 벡터에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터는 박테리아 세포, 효모 세포, 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 또는 양서류 세포에 도입하여 재조합 단백질의 과발현에 사용될 수 있는 당업계에 공지된 벡터를 제한없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 박테리아 세포 또는 효모 세포에 도입하여 재조합 단백질의 과발현에 사용할 수 있는 재조합 벡터를 사용할 수 있다. 바람직하게는 대장균에서의 발현을 위해 pET22b(+) (Novagen, Merk Millipore) 벡터, 효모에서의 발현을 위해 pPIC9 벡터를 사용할 수 있으나, 사용 가능한 벡터가 이들 벡터에 한정되는 것은 아니며, 당업계에 알려진 벡터를 본 발명의 변이 비독성 프로테아제 또는 융합 비독성 프로테아제 발현에 적용 가능함은 당업자에게 자명하다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물은 박테리아 또는 효모인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 다음 단계를 포함하는 변이 비독성 프로테아제 또는 융합 비독성 프로테아제의 제조방법에 관한 것이다:
(a) 상기 재조합 미생물을 배양하여 변이 비독성 프로테아제 또는 융합 비독성 프로테아제를 생성하는 단계;
(b) 재조합 미생물을 파쇄하는 단계; 및
(c) 재조합 미생물 파쇄물에서 변이 비독성 프로테아제 또는 융합 비독성 프로테아제를 정제하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 종배양 후 본배양 (즉, 발효를 위한 배양)의 2 단계로 진행될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는 30 - 38℃에서 재조합 미생물을 배양한 후 재조합 미생물의 OD600가 0.2 내지 0.4 일 때 배양 온도를 16 - 20 ℃로 낮추어 추가 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는, 상기 (a) 단계 중 본배양 단계는 단계는 36 - 38℃, 더욱 바람직하게는 36.5 - 37.5 ℃에서 재조합 미생물을 배양한 후 재조합 미생물의 OD600가 0.25 내지 0.35 일 때 배양 온도를 17 - 19 ℃로 낮추어 추가 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이 경우, OD600가 0.5 내지 0.7일 때 0.4 - 0.6 mM IPTG를 배양액에 첨가하여 단백질의 발현을 유도할 수 있다. 이와 같은 공정에 의해 본 발명에 따른 변이 비독성 프로테아제 또는 융합 비독성 프로테아제는 용해성 분획에서 회수량이 현저히 증가하게 되는데, 이는 초기에는 재조합 미생물의 양을 급격히 증가시키기 위하여 높은 온도에서 배양을 진행하다가 재조합 미생물이 일정 양에 도달하면 재조합 미생물의 배양 온도를 낮추어 줌으로써 재조합 미생물의 대사를 둔화시키고, IPTG의 양도 소량 첨가함으로써 비독성 프로테아제의 발현을 서서히 유도하여 비독성 프로테아제의 재접힘 효율을 증가시키고 이로써 비독성 프로테아제의 대부분이 용해성 분획에 포함될 수 있도록 본원발명에서 도출한 결과이다.
이와 같은 용해성 분획에서의 발현량 증가 효과는 본원발명에서 유도된 변이 프로테아제인 C430G에서 특히 두드러지게 나타나는데, 이는 야생형 변이 프로테아제의 경우 시스테인 간의 이황화 결합이 유도되고, 다른 변이 프로테아제인 C430S 및 C430A의 경우 일부 비특이적 이황화 결합이 유도되기 때문인 것으로 판단된다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계는 재조합 미생물 파쇄물을 원심분리하여 용해성 분획 및 불용성 분획을 분리하고, 각 분획에서 독립적으로 변이 비독성 프로테아제 또는 융합 비독성 프로테아제를 정제하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계는 재조합 미생물 파쇄물을 원심분리하여 용해성 분획 및 불용성 분획을 분리하고, 용해성 분획에서 변이 비독성 프로테아제 또는 융합 비독성 프로테아제를 정제하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서, 재조합 미생물을 배양하기 위한 적정한 배지 및 배양조건은 당업계에 공지되어 있는 방법을 활용할 수 있으며, 예를 들면 형질전환 대장균 또는 효모에 대한 적정한 배지에 접종하여 배양 후, 적합한 조건, 예로서 대장균에서는 유전자 발현 유도제인 아이소프로필-β-D-티오갈락토사이드 (isopropyl-β또는 메탄올 자화 효모에서는 메틸알콜등을 공급하여 단백질의 발현을 유도할 수 있다. 단백질 발현 유도 배양 단계가 종료되면, 그 배양체 또는 배양액을 회수하고부터 그로부터 “순수한 재조합 단백질”을 회수할 수 있다. 본 발명에서 용어 "순수한 재조합 단백질"은 본 발명의 재조합 단백질 및 이를 코딩하는 DNA의 서열로부터 유래된 단백질 이외에는 숙주세포로부터 유래된 어떠한 다른 단백질을 5% 이상, 바람직하게는 1% 이상 포함하지 않는 것을 의미한다.
상기 형질전환된 미생물에서 발현된 재조합 단백질의 정제는 당해 분야에 공지된 다양한 방법으로 수행할 수 있으며, 통상적으로 세포 조각(cell debris), 배양 불순물 등을 제거하기 위하여 세포 용해물 또는 배양액을 원심 분리한 후, 침전, 예를 들어, 염석(황산암모늄 침전 및 인산나트륨 침전), 용매 침전(아세톤, 에탄올, 이소프로필 알콜 등을 이용한 단백질 분획 침전) 등을 수행할 수 있고, 투석, 전기영동 및 각종 컬럼 크로마토그래피 등을 수행할 수 있다. 상기 크로마토그래피로는 이온교환 크로마토그래피, 겔-여과 크로마토그래피, HPLC, 역상-HPLC, 흡착 크로마토그래피, 친화성(affinity) 컬럼 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 병용하여 이용할 수 있다.
본 발명에서 비독성 프로테아제는 천연 보툴리눔 A형 독소의 중쇄 도메인이 제거되어 독성이 현저히 감소되어 있고 프로테아제 활성을 갖는 천연 보툴리눔 A형 독소의 경쇄 도메인을 포함하는 펩타이드로, 이의 변이를 포함하는 개념이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 변이 또는 융합 비독성 프로테아제를 유효성분으로 포함하는 근이상증 개선 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 경피 투여용인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명은 또 다른 관점에서 상기 변이 또는 융합 비독성 프로테아제를 근이상증 증상의 개선 또는 치료가 필요한 객체에게 투여하는 단계를 포함하는 근이상증 증상의 개선 또는 치료방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 근이상증 증상의 개선 또는 치료에 사용하기 위한 의약품 제조를 위한 상기 변이 또는 융합 비독성 프로테아제의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 근이상증 증상의 개선 또는 치료방법에 사용하기 위한 상기 변이 또는 융합 비독성 프로테아제에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 근이상증은 안면경련, 눈꺼풀 경련, 사경(斜頸), 안검경련(blepharospasm), 경부 근긴장 이상증(spasmodictorticollis, cervical dystonia), 인두 중앙부 근긴장 이상증(oromandibular dystonia), 경련성 발성 장애(spasmodic dysphonia), 편두통, 항문 소양증 및 다한증(hyperhidrosis)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명은 또 다른 관점에서 상기 변이 또는 융합 비독성 프로테아제를 함유하는 히알루론산 미세침 패치에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 미세침 패치는 안면경련, 눈꺼풀 경련, 사경(斜頸), 안검경련(blepharospasm), 경부 근긴장 이상증(spasmodictorticollis, cervical dystonia), 인두 중앙부 근긴장 이상증(oromandibular dystonia), 경련성 발성 장애(spasmodic dysphonia), 편두통, 항문 소양증 및 다한증(hyperhidrosis)으로 구성된 군에서 선택되는 증상의 치료 또는 완화용인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에서, 상기 '치료하는'이란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본 발명에서 사용된 상기 '치료'란 용어는 '치료하는' 이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다. 따라서 포유동물에 있어서 상기 질환의 치료 또는 치료요법은 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:
(1) 질환의 발달을 저지시킴,
(2) 질환의 확산을 예방함,
(3) 질환을 경감시킴.
(4) 질환의 재발을 예방함, 및
(5) 질환의 증상을 완화함(palliating)
본 발명에서, 용어 "유효량(또는, 유효한 양)"은 바람직한 효과를 전달하기에는 매우 충분하지만 의학적 판단 범위 내에서 심각한 부작용을 충분히 방지할 정도로 적은 양을 의미한다. 본 발명의 조성물에 의하여 체내에 투여되는 조성물의 양은 투여 경로, 투여 대상을 고려하여 적절하게 조정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 대상 개체에 매일 일회, 수일에 1회, 수개월에 1회, 또는 수년에 1회 이상 투여될 수 있다. 단위 투여량은 사람 피험자 및 다른 포유동물을 위한 단위 투여에 적합하게 물리적으로 분리된 단위를 의미하며, 각 단위는 적절한 약제학적 담체를 포함하며 치료 효과를 나타내는 본 발명의 프로테아제의 예정된 양을 함유한다. 투여량은 환자의 질환의 심각도 및 사용되는 유효 성분과 보조 유효 성분에 따라 가변적이다. 또한, 일일 총 투여량을 여러 횟수로 분할하여 필요에 따라 연속적으로 투여할 수 있다. 따라서, 상기 투여량 범위는 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하지 아니한다.
또한, 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다.
본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화 될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말, 패치의 형태일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있고, 해당 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 변이 비독성 프로테아제 및 융합 비독성 프로테아제 발현 벡터 구축
도 3에 도시된 변이 비독성 프로테아제 및 융합 비독성 프로테아제를 생산하기 위한 발현 벡터를 구축하였다. 이를 위하여, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 야생형 비독성 프로테아제(BTX-LC)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 2), 세포 침투 펩타이드(PEP1)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 4), 벨트 도메인 펩타이드 단편(belt')을 암호화하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 6), 표적화 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 8)을 합성하였다.
상기 합성된 뉴클레오티드 서열을 기반으로 대장균용 발현 벡터 pET22b의 T7 프로모터-lac 오퍼레이터 하류의 멀티 클로닝 부위 (MCS)에 제한효소 NdeI과 XhoI로 BTX-LC과 PEP1-(△M)BTX-L-His을 클로닝하였다. 이후, 제한 효소 EcoRI 과 XhoI을 이용하여 대장균에서의 발현 효율을 향상시킬 수 있도록 코돈 최적화된 PEP1-(△)BTX-L-His(E.coli codon optimization; Theoretical pI/Mw: 8.66 / 55003.59 Da ), 야생형 비독성 프로테아제의 430번째 아미노산을 시스테인(Cys)에서 각각 글리신(Gly), 알라닌(Ala), 세린(Ser)으로 치환한 변이 비독성 프로테아제, PEP1-(△M)BTX-L-BFGFRP-His (Theoretical pI/Mw: 8.95 / 56436.13) 융합 비독성 프로테아제 등 표 1에 따른 다양한 비독성 프로테아제를 발현할 수 있도록 재조합 벡터를 제작하였다. 야생형 비독성 프로테아제의 430번째 아미노산의 점 돌연변이를 위한 클로닝에 사용된 서열(변이 비독성 프로테아제 클로닝용 유전자 카세트)은 표 2에 나타내었다.
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실시예 2. 대장균에서 비독성 프로테아제의 발현
실시예 1에서 구축된 대장균용 발현벡터들을 유전자 발현용 대장균 숙주인 BL21 (DE3) 균주에 형질전환하여 재조합 대장균을 제작하고 엠피실린 저항성 콜로니를 LB 배양액에 접종하여 37℃로 진탕 배양하였다. 600 nm 흡광도가 0.6 ~ 0.7에 도달하면 IPTG 0.5 mM을 첨가한 후, 조건에 따라 18 ~ 25℃로 비독성 프로테아제의 발현을 유도하고 6 ~ 12 시간 배양하여 재조합 대장균 균체를 원심 분리(3000 rpm 20 분간)로 수거하였다.
수거된 재조합 대장균 균체를 50mM Tris HCl, pH7.8, 0.1mM EDTA, 25% sucrose 용액에 현탁시키고, 라이소자임 0.2 mg/ml을 첨가하여 4'C에서 1.5 시간 처리한 후 현탁액 체적의 1.5배의 용해완충액 (lysis buffer, 20mM Tris HCl, pH7.8, 0.2M NaCl, 1% DCA, 1.6% NP-40 (또는 1% SDS), 2mM EDTA, 0.5mM DTT)을 첨가한 후, 4℃에서 초음파를 이용하여 파쇄하였고, 단백질을 정량하여 SDS-PAGE 겔에 로딩한 후, 쿠마시 블루 염색하였다.
그 결과, 도 7에서와 같이 IPTG 유도에 따라 야생형과 변이형의 비독성 프로테아제가 효과적으로 발현됨을 확인할 수 있었고, 도 8에서와 같이 비독성 프로테아제는 전체 세포 파쇄액(lysate)과 펠릿(pellet)에서만 나타나 대부분 불용성으로 존재하는 것으로 확인되었다. 또한, 야생형 비독성 프로테아제를 비환원 조건 및 환원 조건에서 SDS-PAGE를 진행한 결과, 비환원 조건에서는 높은 분자량의 형태로 존재하는 것으로 나타나, 이황화 결합이 응집체 형성에 영향을 미치는 것을 예측할 수 있었다(도 9). 한편, 야생형과 변이형의 비독성 프로테아제를 대장균 발현에 적합하도록 코돈 최적화한 경우 발현량을 현저히 증가시킬 수 있었다(도 10 및 도 11).
실시예 3. 비독성 프로테아제의 정제
비독성 프로테아제를 정제하기 위하여, 실시예 2의 방법으로 재조합 대장균을 배양한 후 재조합 대장균 균체를 원심 분리(3000rpm, 20분)로 수거하였다. 수거된 균체는 1 그람(g) 기준으로 2ml의 세포현탁용액인 50mM Tris HCl, pH7.8, 0.1mM EDTA, 25% sucrose에 현탁시키고, 라이소자임 0.2 mg/ml을 첨가하여 4℃에서 1.5 시간 처리한 후 현탁액 체적의 1.5배의 용해완충액 3ml (lysis buffer, 20mM Tris HCl, pH7.8, 0.2M NaCl, 1% DCA, 1.6% NP-40 (또는 1% SDS), 2mM EDTA, 0.5mM DTT)을 첨가하고 초음파 파쇄기를 이용하여 육안으로 세포 용해반응물의 점성이 없어질 때까지 파쇄하였다. 세포가 충분히 파쇄된 반응물을 12000 rpm, 4℃에서 15분 동안 원심분리하여 용해성 분획과 불용성 분획을 분리하였다.
이를 SDS-PAGE 후 쿠마시 블루 염색 또는 웨스턴 블라팅으로 관찰해 본 결과, 야생형과 변이형 모두에서 비독성 프로테아제가 불용성 분획에 상당 부분 존재하는 것으로 확인되었다.
용해성 분획에 존재하는 비독성 프로테아제는 Ni2+-IDA 친화컬럼(iminodiacetic acid)에 로딩하였다. 컬럼의 10배의 결합 완충액(50mM potassium phosphate buffer (pH 8.0) + 300mM NaCl+ 1mM PMSF +1mM β-mercatoethanol) 과 6배의 세척완충액(50mM potassium phosphate buffer (pH 8.0) + 300mM NaCl + 1mM PMSF +1mM β-mercatoethanol + 10mM Imidazole)으로 세척한 뒤, 200, 300, 500 mM의 이미다졸(Imidazole)을 포함하는 용출 완충액 (50mM potassium phosphate buffer (pH 8.0) + 300mM NaCl + 1mM PMSF + 1mM β-mercatoethanol)으로 단계별로 용출하였다.
한편, 용해성 분획을 분리한 후, 불용성 분획의 비독성 프로테아제 침전물을 상등액과 동일 부피인 5 ml의 세척용액(washing buffer, 2 ~ 4 M urea, 0.5% Triton X100, 1mM EDTA, 1mM DTT)으로 3회 반복 세척하고 상등액을 제거하였다. 이렇게 회수된 침전물을 1 ml 우레아 용액(8M 우레아 (urea) 20mM Tris HCl, pH7.8, 20uM DTT))으로 변성시킨 후, 투석막 (분자량 cutoff 12,000, Sigma, cat no: D-0530, USA)으로 옮겨, 투석완충용액 (0.08 mM NaCl, 20mM Tris HCl, pH 7.8, 0.03% tween 20)으로 우레아 용액 부피의 100배 부피로 3회 투석하여 단백질 리폴딩(refolding)을 수행하며, 필요에 따라 10-20 uM ZnCl2 를 첨가하였다. Ni2+-IDA 친화컬럼(iminodiacetic acid)에 로딩하고, 컬럼 부피 10배의 결합 완충액(50mM potassium phosphate buffer (pH 8.0) + 300mM NaCl+ 1mM PMSF +1mM β-mercatoethanol)과 컬럼 부피 6배의 세척완충액 (50mM potassium phosphate buffer (pH 8.0) + 300mM NaCl + 1mM PMSF +1mM β-mercatoethanol + 10mM Imidazole)으로 단계적으로 세척한 뒤, 200, 300, 500 mM의 이미다졸(Imidazole)을 포함하는 용출 완충액 (50mM potassium phosphate buffer (pH 8.0) + 300mM NaCl + 1mM PMSF + 1mM β-mercatoethanol)으로 단계별로 용출하였다. 각 분획들을 모아 PD-10 컬럼 (GE Healthcare, USA)으로 염을 제거하였다. 단백질 농도는 소 혈청 알부민을 표준으로 하여 BCA 단백질 정량법 (BCA protein assay)으로 측정하였다.
그 결과, 도 14에서와 같이 야생형 및 변이 비독성 프로테아제, 융합 비독성 프로테아제가 효과적으로 정제됨을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 비독성 프로테아제의 폴딩/리폴딩 효율 분석
실시예 3의 불용성 분획에 대해 정제 및 리폴딩 과정을 진행한 결과, 도 15에서와 같이 야생형 비독성 프로테아제의 경우 투석에 의한 리폴딩 후에도 여전히 응집 현상이 나타나는 것으로 확인되었으나, 변이 비독성 프로테아제나 변이 융합 비독성 프로테아제의 경우 리폴딩 후 응집 현상이 거의 나타나지 않는 것으로 확인되었다.
한편, 12000 rpm에서 15분간 원심 분리한 후, 용해성 분획(soluble fraction) 및 불용성 분획(pellet fraction, aggregation)에서의 비독성 프로테아제 함유 %를 SDS-PAGE 후 쿠마시 염색하여 확인해 본 결과, 도 16에서와 같이 야생형과 변이 비독성-프로테아제 모두에서 약 60~90%가 불용성 분획에 존재하여, 대부분의 비독성 프로테아제는 용해성 분획보다는 불용성 분획에 존재하는 것으로 확인되었다. 하지만, 리폴딩 과정을 통해 회수되는 경향은 야생형과 변이형에서 전혀 상이하였는데, 즉, 리폴딩 과정을 진행하여도 야생형 비독성-프로테아제는 거의 침전된 봉입체 상태로 존재하여 회수 불가능한 반면, 변이 비독성-프로테아제는 거의 대부분 리폴딩되어 회수 가능하였다.
실시예 5. 비독성 프로테아제의 효소 활성 분석
본 발명에 따른 비독성 프로테아제과 그 변이체들의 효소 활성을 분석하고자, 비독성 프로테아제에 의한 절단 여부를 분석하기 위한 기질을 합성하였다. 기질로는 SNAP25의 C-말단에 ANNEXIN V 단백질이 융합되어 발현되도록 하였고(표 3), 해당 단백질을 발현하는 뉴클레오티드 서열을 pET22b (+) 발현 벡터에 클로닝하고, 이를 대장균 균주인 BL21 (DE3)에 형질 전환하였다. 형질 전환된 대장균을 LB 배지에서 37℃진탕 배양하고 O.D600 0.6 - 0.7 시점에 0.5-1 mM의 IPTG 를 첨가하여 6시간 발현 배양하였다. 세포를 초음파 파쇄기로 파쇄한 후 용해성 분획(supernatant)만을 회수하고 실시예 3의 방법과 유사하게 SNAP25-ANNEXIN V에 포함된 his-6 tag을 이용하여 정제하였다. 그 결과, 도 17에서와 같이 SNAP25-ANNEXIN V가 효과적으로 발현되고 정제되는 것을 확인하였다.
본 발명에 따라 정제된 비독성 프로테아제는 모두 야생형 비독성 프로테아제와 같은 효소 활성을 유지하는지 확인하고자, 정제된 SANP25-ANNEXIN V을 기질로 하여 그 절단 여부를 실험하였다. 이를 위하여 준비된 SNAP25-ANNEXiN V와 비독성 프로테아제를 효소 반응 용액 (HEPES pH7.4 100 mM, NaCl 1mM, ZnCl2 20 uM, DTT 2 mM)에 기질(SNAP25-ANNEXINV) 대 효소(프로테아제) 20:1(w/w)의 비율로 혼합하여 37℃에서 5시간 동안 효소 반응을 진행하였다. 반응 종결 후 시료를 SDS-PAGE 분석한 결과, 도 18에서와 같이 본 발명에 따른 비독성 프로테아제는 모두 50kDa의 SNAP25-ANNEXiN V을 절단하여, 36kDa과 14kDa의 단백질 밴드를 형성하는 것을 확인하여, 생산성이 향상된 변이 비독성 프로테아제는 효소 활성은 그대로 유지하고 있음을 입증하였다.
Figure PCTKR2020005623-appb-T000003
Figure PCTKR2020005623-appb-I000018
실시예 6. 효모에서 비독성 프로테아제의 발현
또 다른 실시양태로 대장균 이외에 효모에서 비독성 프로테아제를 발현하고자, 표 4와 같은 서열을 pPIC9의 AOX1 프로모터 하류에 BamHI과 NotI 제한 효소를 이용하여 서브클로닝하였다. 한편, 비독성 프로테아제의 정제를 위하여 his 6-tag을 도입하고, 정제 이후 his 6-tag을 제거하기 위하여 TEV 절단효소 펩타이드 서열을 추가한 Pichia pastoris 발현용 벡터를 구축하였다.
상기 벡터를 Pichia pastoris 균주에 형질전환 시키고 히스티딘 결손 배지에서 배양한 후 형성된 재조합 효모 콜로니를 메탄올 자화 효모 배지인 BM (buffered minimal media: 100 mM potassium phosphate, pH 6.0 1.34% Yeast Nitrogen Base, 4 × 10-5% biotin)에서 글라이세롤(1%)을 탄소원으로 공급하여 배양시킨 뒤 메탄올(0.5%)로 탄소원을 교체함으로서 비독성 프로테아제를 발현 유도하였다. 배양 배지를 회수하여 이로부터 발현된 비독성 프로테아제를 His-Tag으로 정제하고, 보툴리눔 경쇄 항체)cat no. PA5-48053, (ThermoFisher Scientific, USA) 제조사 기재바랍니다.로 웨스턴 블라팅하였다. 한편, 효모에서는 당쇄화 (glycosylation)에 의해 분자량이 증가된 비독성 프로테아제로 발현되는바, 당쇄를 단백질로부터 절단하는 효소인 PNGaseF(cat no P0704S, New England Bio Lab USA)를 제조자 방식에 따라 반응시켜 비당쇄화한 후, SDS-PAGE 후 보툴리눔 경쇄 항체로 웨스턴 블라팅 하였다.
그 결과, 도 19에서와 같이, 효모에서 비독성 프로테아제이 효과적으로 발현 및 정제되었으며, 효모에서는 당쇄화 (glycosylation)에 의해 분자량이 증가된 다중 밴드의 비독성 프로테아제로 확인되고, 비당쇄화를 진행하자 단일 밴드의 비독성 프로테아제가 관찰되었다.
Figure PCTKR2020005623-appb-T000004
Figure PCTKR2020005623-appb-I000019
Figure PCTKR2020005623-appb-I000020
실시예 7. 비독성 프로테아제의 대량 발효 및 정제
실시예 2에서 제작된 재조합 대장균을 대량으로 발효 및 정제하고자 하였다. 이를 위하여 재조합 균주 각각의 원액 (Stock)을 앰피실린이 첨가된 LB 배지에 접종하여 밤새 (overnight) 37℃, 200RPM으로 진탕 배양하였다 (Seed Culture). 50ug/ml의 앰피실린이 첨가된 LB 배지 3-4L를 7L 발효용기 (Jar fermenter)에 넣고 50ppm의 Antiform B emulsion을 첨가한 후 상기 밤샘 배양한 균주 30 mL을 접종하고, 37℃에서 impeller 속도 250RPM, filtered air 2L/min의 공기압으로 발효를 진행하였다. 균주의 OD600이 0.3이 되면 발효기의 쿨러로 배양기 내부 온도를 18℃로 낮추어 배양하고, 균주의 OD600이 0.6-0.7이 되면 0.5mM IPTG를 첨가하고 18℃에서 밤새(16-18시간) 배양하였다.
발효 배양된 배지 1L의 세포 침전액 (습중량으로 약 5g)에 200ml의 용해 버퍼 (50mM Tris-HCl(pH 8.0), 150mM NaCl, 10% glycerol)를 넣고 세포를 완전히 풀어주었다. 상기 세포 현탁액에 세포 파쇄를 위한 버퍼를 최종농도 1mM PMSF, 1mM β-ME (beta-mercaptoethanol), 0.1% Triton-X 100가 되도록 첨가하고, 세포파쇄(sonication)를 4min, pulse on/off: 4sec/8sec, power: 65%가 되도록 Sonics Vibracell 초음파파쇄기를 이용하여 5회 실시하였다. 세포 파쇄액은 4℃에서 12000 rpm으로 30 분간 원심분리하여 용해성 단백질을 포함하는 상층액과 세포 파쇄 침전물을 분리하였다.
한편, Ni-IDA 컬럼 (WorkbeadsTM 40 Ni-IDA, 40-650-001, Bio-Works, Sweden) 을 충진하고, 컬럼 부피(CV)의 10배 용량이 되는 Equilibration buffer(50mM Tris-Hcl(pH 8.0), 150mM NaCl, 10% glycerol, 0.1% TritonX-100, 1mM PMSF, 1mM β-ME)로 컬럼을 평형화하였다. 상기 원심분리한 용해성 단백질을 포함하는 상층액에 Ni-IDA 레진을 추가하여 비독성 프로테아제의 his-tag과 4℃에서 2시간 동안 결합반응을 유도하고, 이를 컬럼에 다시 충진하였다. 컬럼 부피(CV)의 20배 세척액 A (washing buffer A: 50mM Tris-HCl(pH 8.0), 150mM NaCl, 10% glycerol, 1mM β-ME)로 1차 세척하고, 컬럼 부피(CV)의 20배 세척액 (50mM Tris-HCl(pH 8.0), 150mM NaCl, 50mM Imidazole, 10% glycerol, 1mM -β-ME) 로 2차 세척하였다. 각각 낮은 이미다졸 농도로부터 높은 이미다졸 농도를 포함하는 용출 버퍼 (100/200/300/500/700mM Imidazole, 50mM Tris-Hcl(pH 8.0), 150mM NaCl, 10% glycerol, 1mM β-ME)를 순차적으로 이용하여 1.5배 컬럼 부피(CV)로 용출하였다. 용출된 분액에는 최종 1mM이 되도록 EDTA를 첨가하였다. 용출된 분획의 순도를 SDS-PAGE로 확인하고 고순도 분획인 500-700mM 이미다졸이 첨가된 용출 버퍼로 용출된 분액을 모아 컷-오프 값이 10-30 kDa 범위인 투석막을 이용하여 PBS 완충용액으로 투석 교체하여 다른 화학성분을 제거하고 정제된 비독성 프로테아제를 회수하였다. 비독성 프로테아제의 냉동 보전을 위해서는 10% glycerol 포함된 PBS 완충용액으로 투석을 진행하였다 (도 20).
그 결과는 도 21-26에서와 같으며, 야생형 비독성 프로테아제의 경우 용해성 분획에서 3-6mg/L가 회수되었고, 비독성 프로테아제의 430번재 아미노산을 시스테인에서 세린으로 치환한 경우는 용해성 분획에서 8-12mg/L가 회수되었으며, 비독성 프로테아제의 430번째 아미노산을 시스테인에서 알라닌으로 치환한 경우 용해성 분획에서 15-20mg/L 회수된 반면, 비독성 프로테아제의 430번째 아미노산을 시스테인에서 글리신으로 치환한 경우는 40-60mg/L 회수되어, 특히 시스테인에서 글리신으로 치환이 비독성 프로테아제의 용해성 분획에서의 회수율을 현저히 증가시키는 것을 확인하였다. 이와 같이 용해성 분획에서 비독성 프로테아제의 회수율을 향상시킬 수 있는 이유는, 비독성 프로테아제의 시스테인을 글리신으로 치환하여 이황화 결합을 억제하고, 또한 37℃ 배양으로 대장균의 양을 늘린 후 적정 O.D에서 온도를 18℃까지 낮추어 대장균의 대사를 둔화시키고, IPTG의 양도 0.5mM로 낮추어 첨가함으로써 단백질의 발현이 상대적으로 천천히 유도되어 재조합 미생물내에서 재접힘(folding) 효율이 증가된 결과인 것으로 판단된다. 한편, 시스테인을 알라닌이나 세린으로 치환한 경우는 비특이적 이황화 결합이 유도될 수 있어, 용해성 분획에서의 비독성 프로테아제의 생산 효율이 글리신으로 치환한 경우에 비해 낮게 나타나는 것으로 판단되었다.
이와 같은 변이 비독성 프로테아제의 용해성 단백질로의 발현 효율과 정제 효율 증대 효과는 섬유아세포성정인자의 BFGFRP 도메인을 융합시키는 경우에도 야생형 비독성 프로테아제에 비해 높게 나타난 바, 변이 비독성 프로테아제에 다른 펩타이드를 융합시키는 경우에도 높은 발현 효율과 정제 효율이 유지되는 것을 알 수 있었다. 구체적으로, 비독성 프로테아제의 430번째 아미노산을 시스테인에서 글리신으로 치환하고 BFGFRP를 융합시킨 융합 비독성 프로테아제는 15-80mg/L 회수되었다.
실시예 8. 비독성 프로테아제의 단회독성 검토
본 발명에서 사용하고자 하는 비독성 프로테아제의 독성 감소 여부를 확인하고자, 마우스에서 단회독성을 평가해 보았다. 이는 본원발명의 서열번호 1로 표시되는 야생형 비독성 프로테아제를 이용하여 실험을 진행하였고, 동물시험기관인 (주)케이피씨 (경기도 광주시 오포읍 오포로 212-9)에 의뢰하여, “마우스에서 시험물질의 단회 복강투여 독성시험”으로 진행하였다.
실험동물이 ICR 마우스는 ORIENTBIO Inc, Korea에서 구입하였다. 실험은 6주령의 수컷 35마리로 진행하였으며, 외관적으로 이상이 없는 동물들을 사육구역으로 반입하여 7 일간 시험을 실시하는 동물실내에서 순화시켰다. 7 일간의 검역·순화기간을 거치며 건강 및 실험의 실시에 적합성 여부를 확인하여 건강한 동물을 선별하였다. 음수는 상수도수를 필터유수살균기로 여과 후 자외선을 조사하고, 폴리카보네이트 재질의 음수병 (250 mL)을 이용하여 자유섭취시키고, 급이는 ㈜카길 에그리 퓨리나에서 제공하는 실험동물용 설치류 사료를 자유급이하였다.
Figure PCTKR2020005623-appb-T000005
표 5에 기재된 바에 따라 시험물질인 중쇄(heavy chain) 도메인이 제거된 야생형 비독성 프로테아제 본원발명에 따라 단백질 정제하여 1ug에서 120ug까지 ICR 마우스(체중 평균 34g/각 농도별 n=5)에 복강 주사한 결과, 표 6에서와 같이 모든 마우스에서 생존함을 확인하였다. 이 중 시험군 G7 (120ug/mouse)을 종래 보고된 마우스의 체중으로 환산하면 약 3.6mg/kg에 해당한다. 현재까지 확인된 설치류 마우스에서의 반치사량 (LD50)은 약 0.3ng/kg 이며 인간에서는 반치사량(LD50) 약 1ng/kg으로 통상 70kg 성인의 겨우 1ug이 치사량으로 알려져 있다. Annu. Rev. Microbiol. 1999. 53:551-75, Eric A. Johnson, CLOSTRIDIAL TOXINS AS THERAPEUTIC AGENTS: Benefits of Nature’s Most Toxic Proteins). 따라서, 본원발명에서 사용된 야생형 비독성 프로테아제는 보고된 천연 보툴리눔 A형 독소의 마우스의 반치사량(LD50)인 0.3ng/kg에 비교하면 1.2 x 107 배로 독성이 감소되어 있음을 확인하였고, 본원발명에서의 변이 비독성 프로테아제도 유사한 수준의 현저히 감소된 마우스의 반치사량(LD50)을 가지고 있음을 알 수 있었다.
Figure PCTKR2020005623-appb-T000006
이상에서와 같이 본 발명을 상기의 실시예를 통해 설명하였지만 본 발명이 반드시 여기에만 한정되는 것은 아니며 본 발명의 범주와 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형실시가 가능함은 물론이다. 따라서, 본 발명의 보호범위는 본 발명에 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 형태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
본 발명은 야생형 비독성 프로테아제를 재조합 미생물로 생산하는 공정에서 일반적으로 발생하는 봉입체(inclusion body)로의 응집(aggregation) 현상을 개선하여, 재조합 미생물을 파쇄하여 회수되는 용해성(soluble) 및 불용성(insoluble) 분획 모두에서 단순한 투석/리폴딩 과정만으로 활성형 변이 비독성 프로테아제를 수득할 수 있어, 높은 수율의 비독성 프로테아제를 생산할 수 있는 장점이 있다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (25)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 비독성 프로테아제의 430번째 아미노산인 시스테인(Cys)이 글리신(Gly), 알라닌(Ala) 또는 세린(Ser)으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산으로 치환되어 있는 변이 비독성 프로테아제.
  2. 제1항의 변이 비독성 프로테아제와;
    i) 세포 침투 펩타이드,
    ii) 벨트 도메인 단편 펩타이드 및
    iii) 세포 표적화 펩타이드로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 펩타이드가 융합되어 있는 융합 비독성 프로테아제.
  3. 제1항 또는 제2항의 비독성 프로테아제에 정제용 태그 펩타이드가 추가로 융합되어 있는 융합 비독성 프로테아제.
  4. 제2항에 있어서, 상기 세포 침투 펩타이드는 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되고, 상기 벨트 도메인 단편 펩타이드는 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되며, 상기 세포 표적화 펩타이드는 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 융합 비독성 프로테아제.
  5. 제2항에 있어서, 상기 어느 하나의 펩타이드는 직접 또는 링커에 의해 상기 변이 비독성 프로테아제에 융합되는 것을 특징으로 하는 융합 비독성 프로테아제.
  6. 제5항에 있어서, 상기 링커는 (Gly)N(여기서, N은 3내지 10의 정수)으로 표시되는 펩타이드 링커인 것을 특징으로 하는 융합 비독성 프로테아제.
  7. 2항에 있어서, 상기 변이 비독성 프로테아제의 C-말단과 상기 융합되어 있는 펩타이드의 N-말단 사이에 절단용 프로테아제에 의해 절단 가능한 펩타이드 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 비독성 프로테아제.
  8. 제7항에 있어서, 상기 절단 가능한 펩타이드 서열은 서열번호 27의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 융합 비독성 프로테아제.
  9. 제1항의 변이 비독성 프로테아제를 암호화하는 변이 유전자.
  10. 제9항에 있어서, 상기 변이 유전자는 서열번호 30, 32 및 34로 구성된 군에서 선택되는 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 변이 유전자.
  11. 9항의 변이 유전자와,
    i) 세포 침투 펩타이드를 암호화하는 핵산;
    ii) 벨트 도메인 단편 펩타이드를 암호화하는 핵산; 및
    iii) 세포 표적화 펩타이드를 암호화하는 핵산으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 핵산을 포함하는 유전자 구조체.
  12. 제11항에 있어서, 상기 세포 침투 펩타이드를 암호화하는 핵산은 서열번호 4의 염기서열로 표시되고, 벨트 도메인 단편 펩타이드를 암호화하는 핵산은 서열번호 6의 염기서열로 표시되며, 세포 표적화 펩타이드를 암호화하는 핵산은 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 유전자 구조체.
  13. 제11항에 있어서, 상기 유전자 구조체는 상기 변이 비독성 프로테아제를 암호화하는 변이 유전자와 상기 어느 하나 이상의 핵산 사이에 링커 펩타이드를 암호화하는 핵산을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 구조체.
  14. 제13항에 있어서, 상기 링커 펩타이드를 암호화하는 핵산은 서열번호 26의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 유전자 구조체.
  15. 제11항에 있어서, 상기 변이 비독성 프로테아제를 암호화하는 변이 유전자와 상기 하나 이상의 핵산 사이에 절단용 프로테아제에 의해 절단 가능한 펩타이드 서열을 암호화하는 핵산을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 구조체.
  16. 제9항 또는 제10항의 변이 유전자 또는 제11항 내지 제15항 중 어느 한 한의 유전자 구조체가 도입되어 있는 재조합 벡터.
  17. 제16항의 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물.
  18. 다음 단계를 포함하는 변이 비독성 프로테아제 또는 융합 비독성 프로테아제의 제조방법:
    (a) 제17항의 재조합 미생물을 배양하여 변이 비독성 프로테아제 또는 융합 비독성 프로테아제를 생성하는 단계;
    (b) 재조합 미생물을 파쇄하는 단계; 및
    (c) 재조합 미생물 파쇄물에서 변이 비독성 프로테아제 또는 융합 비독성 프로테아제를 정제하는 단계.
  19. 제18항에 있어서, 상기 (c) 단계는 재조합 미생물 파쇄물을 원심분리하여 용해성 분획 및 불용성 분획을 분리하고, 각 분획에서 독립적으로 변이 비독성 프로테아제 또는 융합 비독성 프로테아제를 정제하는 것을 특징으로 하는 변이 비독성 프로테아제 또는 융합 비독성 프로테아제의 제조방법.
  20. 제18항에 있어서, 상기 (a) 단계는 30 - 38℃에서 재조합 미생물을 배양한 후 재조합 미생물의 OD600가 0.2 내지 0.4 일 때 배양 온도를 16 - 20 ℃로 낮추어 추가 배양하는 것을 특징으로 하는 변이 비독성 프로테아제 또는 융합 비독성 프로테아제의 제조방법.
  21. 제1항 또는 제2항의 비독성 프로테아제를 유효성분으로 포함하는 근이상증 치료용 약학적 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 근이상증은 안면경련, 눈꺼풀 경련, 사경(斜頸), 안검경련(blepharospasm), 경부 근긴장 이상증(spasmodictorticollis, cervical dystonia), 인두 중앙부 근긴장 이상증(oromandibular dystonia), 경련성 발성 장애(spasmodic dysphonia), 편두통, 항문 소양증 및 다한증(hyperhidrosis)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 경피 투여용인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  24. 제1항 또는 제2항의 비독성 프로테아제를 함유하는 히알루론산 미세침 패치.
  25. 제24항에 있어서, 상기 미세침 패치는 안면경련, 눈꺼풀 경련, 사경(斜頸), 안검경련(blepharospasm), 경부 근긴장 이상증(spasmodictorticollis, cervical dystonia), 인두 중앙부 근긴장 이상증(oromandibular dystonia), 경련성 발성 장애(spasmodic dysphonia), 편두통, 항문 소양증 및 다한증(hyperhidrosis)으로 구성된 군에서 선택되는 증상의 치료 또는 완화용인 것을 특징으로 하는 미세침 패치.
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