WO2020189990A1 - 세포 조성물, 이의 제조 방법 및 이를 포함하는 아토피 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

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황도원
박단비
김수민
이희경
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    • C12N2533/50—Proteins

Definitions

  • the present invention relates to a cell composition, a method for preparing the same, and a pharmaceutical composition for preventing or treating atopy comprising the same.
  • Atopic dermatitis is a chronic inflammatory disease with severe itching and characteristic skin findings that occur in infants and children, often persisting through adults.
  • the etiology of atopic dermatitis is known to be a combination of a variety of factors such as genetic background, immunological mechanism, and environmental factors, and the pathogenesis is very complex, and various hypotheses exist.
  • One of the most promising hypotheses is that Th2 cells become overactive as the homeostasis of Th1/Th2 cells is broken.
  • Th2 cells overactivated by a specific allergen secrete Th2 cytokines such as IL-4 and IL-31, and the secreted cytokines induce IgE secretion by B cells and degranulation of mast cells. And release several inflammatory substances.
  • IFN- ⁇ protein a type of Th1 cytokine
  • IFN- ⁇ protein has a limit in its therapeutic effect due to its extremely short half-life in the body.
  • An object of the present invention is to provide a cell composition in which the proportion of interferon-gamma-expressing cells is 60% or more.
  • the composition is KSP37 (Killer-specific secretory protein of 37 kDa), GNLY (Granulysin), CD74 (Cluster of Differentiation 74), ZBP1 (Z-DNA-binding protein 1), CCL5 (CC chemokine receptor type 5) and at least one gene selected from the group consisting of HCST (Hematopoietic Cell Signal Transducer) is expressed five times or more compared to peripheral blood mononuclear cells (PBMC).
  • KSP37 Killer-specific secretory protein of 37 kDa
  • GNLY Gramulysin
  • CD74 Cluster of Differentiation 74
  • ZBP1 Z-DNA-binding protein 1
  • CCL5 CC chemokine receptor type 5
  • at least one gene selected from the group consisting of HCST (Hematopoietic Cell Signal Transducer) is expressed five times or more compared to peripheral blood mononuclear cells (PBMC).
  • the culture is performed in three or more stages, and the first stage culture includes IL-2, IL-12 and IL-18 by inoculating the monocytes in a cell culture vessel coated with an anti-CD3 antibody.
  • the first stage culture is transferred to a cell culture container not coated with an anti-CD3 antibody and cultured by adding a medium containing IL-2, and the third stage culture is performed in the second stage.
  • the step culture is cultured in a medium comprising IL-2, IL-12 and IL-18.
  • the concentration of the anti-CD3 antibody is 1 to 10 ⁇ g / ml
  • IL-2 is 800 to 1200 IU / mg
  • IL-12 is 2 to 6 ng / ml
  • IL-18 is 20 To 60 ng/ml.
  • a mixture of heterologous cells which is a culture of human peripheral blood mononuclear cells, wherein the proportion of interferon-gamma-expressing cells among the total cells is 60% or more. Cell composition.
  • the composition is KSP37 (Killer-specific secretory protein of 37 kDa), GNLY (Granulysin), CD74 (Cluster of Differentiation 74), ZBP1 (Z-DNA-binding protein 1), CCL5 (CC chemokine receptor type 5) and at least one gene selected from the group consisting of HCST (Hematopoietic Cell Signal Transducer) is expressed five times or more compared to peripheral blood mononuclear cells (PBMC).
  • KSP37 Killer-specific secretory protein of 37 kDa
  • GNLY Gramulysin
  • CD74 Cluster of Differentiation 74
  • ZBP1 Z-DNA-binding protein 1
  • CCL5 CC chemokine receptor type 5
  • at least one gene selected from the group consisting of HCST (Hematopoietic Cell Signal Transducer) is expressed five times or more compared to peripheral blood mononuclear cells (PBMC).
  • the cell composition is a total number of cells 1 x 10 8 to 1 x 10 10 individual, cell composition.
  • the cell composition is cultured in a medium containing one or more selected from the group consisting of anti-CD3 antibodies, IL-2, IL-12, and IL-18 mononuclear cells isolated from human peripheral blood
  • a medium containing one or more selected from the group consisting of anti-CD3 antibodies, IL-2, IL-12, and IL-18 mononuclear cells isolated from human peripheral blood The cell composition obtained by doing.
  • the culture is performed in three or more stages, and the first stage culture includes IL-2, IL-12 and IL-18 by inoculating the monocytes into a cell culture vessel coated with an anti-CD3 antibody.
  • the first stage culture is transferred to a cell culture container not coated with an anti-CD3 antibody and cultured by adding a medium containing IL-2, and the third stage culture is performed in the second stage.
  • the step culture is cultured in a medium containing IL-2, IL-12 and IL-18, cell composition.
  • the concentration of the anti-CD3 antibody is 1 to 10 ⁇ g / ml
  • IL-2 is 800 to 1200 IU / mg
  • IL-12 is 2 to 6 ng / ml
  • IL-18 is 20 to 60 ng/ml
  • cell composition is 1 to 10 ⁇ g / ml
  • IL-2 is 800 to 1200 IU / mg
  • IL-12 is 2 to 6 ng / ml
  • IL-18 is 20 to 60 ng/ml
  • a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of atopic dermatitis comprising the cell composition of any one of the above 6 to 13.
  • the cell composition according to the present invention has an increase in the proportion of interferon-gamma-expressing cells among the total cells to 60% or more, and can significantly improve atopic dermatitis as the proportion of cells that continuously produce interferon-gamma increases. In addition, it is expected to be able to fundamentally treat immunological abnormalities of atopic dermatitis as it can be safely used for a long time without side effects.
  • Figure 4 is a measurement of the cumulative amount of interferon-gamma secretion according to the cell culture period of the cell composition of the present invention.
  • 5 is a measurement of the change in the amount of secretion of a specific activator secreted by cell culture period in the cell composition of the present invention.
  • 6 and 7 show the expression levels of Ksp37, GLNY, CD74, HCST, ZBP1, and CCL5 by day after activation by stimulating the cell composition of the present invention in vitro.
  • Figure 8 shows the effect of EBI on the improvement of atopic dermatitis induced by ovalbumin (OVA).
  • OVA 9 shows the effect of EBI on the improvement of the skin barrier of atopic dermatitis induced by ovalbumin (OVA).
  • Figure 10 shows the inhibitory effect of EBI on the inflammatory response induced by ovalbumin (OVA).
  • FIG 11 shows the inhibitory effect of EBI on cytokine expression induced by ovalbumin (OVA).
  • FIG 12 shows the effect of EBI on the improvement of pruritus caused by ovalbumin (OVA).
  • FIG. 13 shows the skin improvement effect of the cell composition administration group of the present invention in atopic dermatitis-induced mice.
  • FIG. 20 shows changes in atopic dermatitis-related cytokines and itching-related genes in skin tissue according to administration of the cell composition of the present invention.
  • 21 shows the amount of interferon-gamma secretion in the lymph nodes of the cell composition of the present invention.
  • the present invention relates to a method for preparing a cell composition.
  • the method for preparing the cell composition of the present invention includes the steps of obtaining by separating, respectively, monocytes and autologous plasma from human peripheral blood.
  • Ficoll is a compound obtained by polymerizing sugar and epichlorohydrin with each other, and generally uses a molecular weight of about 400,000. Ficoll is used as a material that forms a density gradient to separate cells, viruses and organelles because it changes into a solution ranging from low viscosity to high density when dissolved in water. Peripheral blood mononuclear cells are lighter than red blood cells, granulocytes, and dead cells contained in the blood and are heavier than plasma, so they are separated.
  • the monocyte may be isolated from and cultured from autologous blood of an individual to which the cell composition is applied. In the case of using monocytes separated from autologous blood, unnecessary autoimmune reactions are excluded, and atopic dermatitis can be efficiently treated without side effects such as inflammation.
  • the method for preparing the cell composition of the present invention includes culturing the monocytes in a medium containing at least one selected from the group consisting of anti-CD3 antibodies, IL-2, IL-12 and IL-18.
  • the anti-CD3 antibody may be coated on the medium.
  • the medium may further contain one or more selected from the group consisting of IL-2, IL-12 and IL-18.
  • the medium may contain anti-CD3 antibodies, IL-2, IL-12 and IL-18. More specifically, the anti-CD3 antibody is coated on a medium, and IL-2, IL-12, and IL-18 may be additionally included in the cell culture medium.
  • the anti-CD3 antibody may be used without limitation as long as it is an antibody having a property of binding to CD3.
  • the anti-CD3 antibody may be included in the range of 0.1 to 100 ⁇ g/ml, preferably 0.5 to 50 ⁇ g/ml, more preferably 1 to 10 ⁇ g/ml, but is not limited thereto. .
  • Interleukin is a generic term for proteinaceous biologically active substances produced by immune cells such as lymphocytes, monocytes, and macrophages.
  • the present invention is one selected from the group consisting of IL-2, IL-12 and IL-18 as cytokines of interleukins. It may include more than one.
  • IL-2 may be included in the range of 100 to 2000 IU/ml, preferably 500 to 1500 IU/ml, more preferably 800 to 1200 IU/ml, but is not limited thereto.
  • IL-12 may be included in the range of 0.5 to 10 ng/ml, preferably 1 to 8 ng/ml, more preferably 2 to 6 ng/ml, but is not limited thereto.
  • IL-18 may be included in the range of 1 to 100 ng/ml, preferably 10 to 80 ng/ml, more preferably 20 to 60 ng/ml, but is not limited thereto.
  • the interleukin is not limited thereto, and other interleukins known to those skilled in the art may be used without limitation as long as it meets the object of the present invention.
  • the medium may further contain L-glutamine.
  • concentration of the L-glutamine is not particularly limited, and may be, for example, 0.5 to 5 mM, and preferably 1 to 3 mM.
  • the medium may further contain components commonly used for culturing other monocytes.
  • components commonly used for culturing other monocytes For example, Glycine, L-Arginine, L-Asparagine, L-Aspartic acid, L-cystine 2HCl, L-glutamic acid (L-Glutamic Acid), L-Histidine, L-Hydroxyproline, L-Isoleucine, L-Leucine, L-Lysine Hydrochloride (L -Lysine hydrochloride), L-Methionine, L-Phenylalanine, L-Proline, L-Serine, L-Threonine, L-tryptophan, L-Tyrosine disodium salt dihydrate, L-Valine, Biotin, Choline chloride, D-Calcium pantothenate (D -Calcium pantothenate), folic acid, niacinamide, para-aminobenzoic acid, pyr
  • the medium may be cultured by adding an additional growth factor that supports the proliferation of serum or plasma and monocytes.
  • the type of serum or plasma to be added to the medium is not particularly limited, and commercially available products derived from various animals can be used, but those derived from humans are more preferably derived from themselves.
  • a method known to those of ordinary skill in the art can be used, such as adding a combination of cytokines or lectins that stimulate monocyte proliferation.
  • the medium may further include an additional growth factor supporting the proliferation of serum or plasma and monocytes, and may include serum or plasma itself.
  • the type of serum or plasma to be added to the medium is not particularly limited, and commercially available products derived from various animals can be used, but those derived from themselves (self) as human origin are preferable, for example, human AB serum or auto plasma. have.
  • the culture can be carried out in several steps. For example, it can be performed in two or three or more steps.
  • monocytes cultured in step 1 may be transferred to a new medium in step 2 and cultured.
  • the first stage medium contains plasma (autonomous), anti-CD3 antibody, L-glutamine, IL-2, IL-12 and IL-18
  • the second stage medium contains plasma (autonomous), It may contain L-glutamine, IL-2. More specifically, the first stage medium contains anti-CD3 antibodies and IL-2, IL-12, IL-18, and the second stage medium contains IL-2, but the anti-CD3 antibody, IL-12, IL-18 May not include.
  • the culture When performed in three or more steps, for example, after the second step culture, the culture may be transferred to a new medium and cultured.
  • the first stage medium contains plasma (autonomous), anti-CD3 antibody, L-glutamine, IL-2, IL-12 and IL-18
  • the second stage medium contains plasma (autonomous), L-glutamine, and IL-2
  • the third-stage medium may include plasma (autologous), L-glutamine, IL-2, IL-12, and IL-18.
  • the first stage medium contains anti-CD3 antibodies and IL-2, IL-12, IL-18
  • the second stage medium contains IL-2, but the anti-CD3 antibody, IL-12, IL-18 Does not include
  • the third stage medium includes IL-2, IL-12, and IL-18, but may not contain an anti-CD3 antibody.
  • Anti-CD3 antibody, L-glutamine, IL-2, IL-12 and IL-18 may be included at concentrations within the above-described range, and the above-described medium may be used.
  • Culture can be carried out in a general cell culture method, for example, in a CO 2 incubator.
  • the CO 2 concentration may be, for example, 1 to 10%, specifically 3 to 7%, and the temperature may be 30 to 40°C, specifically 35 to 38°C, but is not limited thereto.
  • the cultivation may be performed until the monocytes are sufficiently active and proliferated, and for example, 3 to 20 days, specifically 8 to 16 days, may be performed, but is not limited thereto.
  • the cycle of adding the medium may be added once every 1 to 10 days, specifically 1 to 7 days, for example, to prevent deterioration of the culture medium, but is not limited thereto.
  • the cell composition obtained by the method of the present invention is a heterogeneous cell mixture obtained by culturing monocytes derived from peripheral blood, and may contain cells of various phenotypes.
  • the phenotype may be, for example, CD3(+)CD56(-) cells (T cells), CD3(+)CD56(+) cells (NKT cells), CD3(-)CD56(+) cells (NK cells), etc. .
  • the cell composition obtained by the method of the present invention contains 60% or more of interferon-gamma-expressing cells.
  • Interferon-gamma-expressing cells are interferon-gamma-expressing cells (IFN- ⁇ (+) cells or IFN- ⁇ releasing cells) among the cells, and the cell composition has a very high proportion of interferon-gamma-expressing cells among the total cells. When administered to a subject with dermatitis, it can improve symptoms of atopic dermatitis.
  • the cell composition may have a proportion of interferon-gamma-expressing cells of 60% or more, specifically, 60% or more, 70% or more, and 80% or more.
  • the upper limit is not particularly limited, and may be less than 100%, and specifically may be 90% or less.
  • the cell composition may have a proportion of NKG2D-expressing cells of 60% or more.
  • NKG2D-expressing cells are NKG2D-expressing cells (NKG2D(+) or NKG2D releasing cells) among the cells, and the cell composition has a high proportion of NKG2D-expressing cells among the total cells, so Th1 plays a key role in regulating immune balance for atopic efficacy. It has a high therapeutic effect against atopic dermatitis through a high level of NKG2D, which is mainly expressed in cells.
  • the cell composition may have a ratio of NKG2D-expressing cells of 60% or more, specifically, 60% or more, 70% or more, and 80% or more.
  • the upper limit is not particularly limited, and may be less than 100%, and specifically may be 90% or less.
  • the cell composition may contain less than 10% of each of IL-4 and IL-13 expressing cells. Specifically, it may be less than 8% and less than 7%.
  • the cell composition is effective in preventing and treating atopy because the proportion of cells expressing IL-4 and IL-13 among the total cells is low, and the secretion of IL-4 and IL-13, which are cytokines that cause atopy, is low.
  • the cell composition may have a total number of cells, for example, 1 x 10 6 to 1 x 10 10 , specifically 1 x 10 8 to 1 x 10 10 .
  • the cell composition obtained by the method of the present invention can increase the expression of genes involved in immune activity.
  • Genes involved in the immune activity are KSP37 (Killer-specific secretory protein of 37 kDa), GNLY (Granulysin), CD74 (Cluster of Differentiation 74), ZBP1 (Z-DNA-binding protein 1), CCL5 (CC chemokine receptor type 5) and HCST (Hematopoietic Cell Signal Transducer) may include one or more selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the cell composition may be one in which the expression of the gene is increased by 5 times or more and 10 times or more compared to PBMC.
  • the expression of GNLY may be increased by 60 times or more.
  • KSP37 also known as FGFBP2 (Fibroblast Growth Factor Binding Protein 2), is a Th1/Tc1 cell-specific secreted protein. It is produced by a subset of NK cells, ⁇ / ⁇ T cells, effector CD8 T cells and Th1 cells and secreted into serum. Most of the Ksp37 expressing cells express perforin, suggesting that Ksp37 is involved in a major process of cytotoxic lymphocyte-mediated immunity.
  • FGFBP2 Fibroblast Growth Factor Binding Protein 2
  • GNLY also known as T-Cell Activation Protein 519, is a cytolytic and inflammatory protein present in cytotoxic cells (CTL) and cytolytic granules of NK cells along with perforin and granzymes.
  • CTL cytotoxic cells
  • GNLY is a member of the saposin-like protein (SAPLIP) family, exhibits broad antimicrobial activity and potent cytotoxic action against tumor cells, activates antigen presenting cells and acts as an immune alarmin.
  • SAPLIP saposin-like protein
  • GNLY is released when cytotoxic T cells and NK cells attach to infected cells and acts as a chemoattractant for T cells, monocytes and other inflammatory cells.
  • atopic dermatitis can be improved by removing the damaged and deformed inflammatory cells.
  • CD74 acts as a cell surface receptor for the cytokine macrophage migration inhibitory factor (MIF) that initiates survival pathways and cell proliferation when bound to the encoded protein.
  • MIF cytokine macrophage migration inhibitory factor
  • B1 high-mobility group protein B1
  • MIF can increase T cell activation and invasion.
  • ITAM Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif
  • Syk spleen tyrosine kinase
  • ZBP1 When ZBP1 is activated, it modulates interferon-beta, affecting the cytosolic pattern-recognition system and activating the immune response.
  • the increase in the activity and expression of the gene of ZBP1 is related to the activation of necroptosis.
  • Apoptosis is the removal of virus-infected cells or inhibiting the spread of the virus.DAMPs (DNA, HSPs, MSU) in the cell when apoptotic necrosis occur. Etc.) are released outside the cell, and at this time, some DAMPs stimulate dendritic cells (DCs). DCs matured by this stimulus activate T cells. Therefore, it is possible to induce immune activity by not only removing virus-infected cells due to cell necrosis involving ZBP1, but also maturing DCs and activating T cells.
  • DCs dendritic cells
  • CCL5 induces Th1 cell activity, and when acting together with interferon-gamma, it can induce proliferation and activity of NK cells.
  • atopy is caused by an immune imbalance caused by an immune dysfunction and is caused by excessive activation of Th2.
  • the cell composition obtained by the method of the present invention inhibits Th2 proliferation and activates Th1 cells to balance the immune system. It can improve atopy.
  • the present invention relates to a cell composition.
  • the cell composition of the present invention is a heterogeneous cell mixture obtained by culturing monocytes derived from peripheral blood, and may include cells of various phenotypes.
  • the phenotype may be, for example, CD3(+)CD56(-) cells (T cells), CD3(+)CD56(+) cells (NKT cells), CD3(-)CD56(+) cells (NK cells), etc. .
  • the cell composition of the present invention is a heterogeneous cell mixture that is a culture of human peripheral blood mononuclear cells, and the proportion of interferon-gamma cells among the total cells is 60% or more.
  • the cell composition may have a proportion of interferon-gamma-expressing cells of 60% or more, specifically, 60% or more, 70% or more, and 80% or more.
  • the upper limit is not particularly limited, and may be less than 100%, and specifically may be 90% or less.
  • the cell composition may have a ratio of NKG2D-expressing cells of 60% or more, specifically, 60% or more, 70% or more, and 80% or more.
  • the upper limit is not particularly limited, and may be less than 100%, and specifically may be 90% or less.
  • the cell composition is effective in the treatment of atopic dermatitis because the amount of interferon-gamma secreted is increased.
  • the cell composition may contain less than 10% of each of IL-4 and IL-13 expressing cells. Specifically, it may be less than 8% and less than 7%.
  • the cell composition is effective in preventing and treating atopy because the proportion of cells expressing IL-4 and IL-13 among the total cells is low, and the secretion of IL-4 and IL-13, which are cytokines that cause atopy, is low.
  • the cell composition may have a total number of cells, for example, 1 x 10 6 to 1 x 10 10 , specifically 1 x 10 8 to 1 x 10 10 .
  • the cell composition may be obtained by culturing monocytes isolated from human peripheral blood in a medium containing one or more selected from the group consisting of anti-CD3 antibodies, IL-2, IL-12, and IL-18.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating atopic dermatitis.
  • the present invention is effective in the prevention or treatment of atopic dermatitis since the amount of interferon-gamma secreted, including the cell composition, is large.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical composition of the present invention are commonly used in formulation, and are lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, gum acacia, calcium phosphate, alginate, gelatin, silicic acid. Calcium, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, etc. It is not.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, and the like in addition to the above components.
  • a suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).
  • a suitable dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on factors such as formulation method, mode of administration, age, weight, sex, degree of disease symptoms, food, administration time, route of administration, excretion rate, and response sensitivity. In general, a skilled practitioner can easily determine and prescribe an effective dosage for the desired treatment. Meanwhile, the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is not limited thereto, and may be 0.01-2000 mg/kg (body weight) per day.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally, and when administered parenterally, it may be administered by intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, transdermal administration, or the like. It is preferable that the route of administration of the pharmaceutical composition of the present invention is determined according to the type of disease to be applied. For example, since the pharmaceutical composition of the present invention is used for promoting hair growth or preventing and treating hair loss, it is preferable to be administered in a manner that is topically applied to the skin.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is prepared in a unit dosage form by formulating using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily carried out by a person having ordinary knowledge in the art Alternatively, it may be manufactured by placing it in a multi-volume container. At this time, the formulation may be in the form of a solution, suspension, or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of an extract, powder, granule, tablet or capsule, and may additionally include a dispersant or a stabilizer.
  • mice are male 6-week-old Balb/C supplied from Raon Bio (Yongin, Korea) and supply enough solid feed (no antibiotics) and water until the day of the experiment, temperature 23 ⁇ 2 °C, humidity 55 ⁇ 10%, 12 hours It was used for experiments after acclimating for 1 week in an environment of -12 hours (light-dark cycle). All animal testing procedures were carried out with the approval of the National Institutes of Health (NIH) Principles of Laboratory Animal Care and the Animal Experimental Ethics Committee of Chung-Ang University.
  • NASH National Institutes of Health
  • the blood was kept warm at room temperature, and then centrifuged twice for 3 minutes (Ace: 4, Dec: 3) at 2000 RPM.
  • Plasma of the supernatant is collected in a new 50 ml tube, and the blood cell layer is also collected in a new 50 ml tube.
  • Plasma was inactivated in a water bath at 56° C. for 30 minutes, followed by centrifugation at 2000 RPM for 3 minutes (Ace: 4, Dec: 3).
  • the supernatant was collected in a new 50 ml tube and used as plasma.
  • the blood cell layer collected in the 50 ml tube was diluted by adding ALyS505N-0 medium in a 1:1 ratio.
  • the total volume was adjusted to 50 ml with sterile physiological saline, and then centrifuged for 3 minutes (Ace: 4, Dec: 3) at 2000 RPM. Thereafter, the supernatant was removed, cells were released in 1 ml of ALyS505N-0 medium, and the cells were counted to calculate the total number of cells.
  • the flask was coated with 5 ⁇ l of anti-CD3 antibody (BD, Mouse anti-human, #555329), 500 ⁇ l of 10x HBSS, and 4.5 ml of sterile physiological saline to a T25 flask (37° C., 4 hours).
  • the coating solution was removed from the CD3 coated T25 flask and washed twice with sterile physiological saline.
  • Flasks and bags were used for cultivation of EBI.
  • PBMC seeding on the 3rd day in the T25 flask prepared by the above method, plasma (autogenous) 500 ⁇ l, L-Glutamine (2mM) 50 ⁇ l, IL-2 (1,000 IU/ml) 2.8 ⁇ l, ALyS505N- 4.5 ml of 0 medium was added.
  • plasma autogenous 500 ⁇ l
  • IL-2 1,000 IU/ml
  • ALyS505N- 4.5 ml of 0 medium was added.
  • On the 4th day of seeding it was transferred to a T75 flask, and 1 ml of plasma (self), 100 ⁇ l of L-Glutamine (2mM), 5.6 ⁇ l of IL-2 (1,000 IU/ml), and 9 ml of ALyS505N-0 medium were added.
  • the sample (EBI for each culture period) was centrifuged for 5 minutes at 400 xg at room temperature. After the supernatant was removed, the number of cells was adjusted to 2 X 10 6 cells/ml, and the cells were suspended with 500 ⁇ l of the culture solution. 500 ⁇ l of the culture solution was added to the microtube, and reagents were added as follows to prepare an activation solution. 500 ⁇ l of the cell suspension was added to one well of a 24-well plate, and 500 ⁇ l of the prepared activation solution was added. It was reacted for 4 hours in a CO 2 incubator under conditions of 5% CO 2 and 37°C.
  • the cell suspension in the well was transferred to a 15 ml tube, washed by adding 4 ml of 1X PBS, and then centrifuged at 400 xg for 5 minutes. After removing the supernatant, 5 ml of FCM staining buffer was added and washed, followed by centrifugation at 400 xg for 5 minutes. After removing the supernatant, 200 ⁇ l of FCM staining buffer was added to suspend the cells.
  • 1X Permeabilization buffer was prepared by diluting 10 X Permeabilization buffer 10 times with distilled water. After adding 1 ml of 1X Permeabilization buffer to each tube, centrifugation was performed at 400 x g for 5 minutes at room temperature. After removing the supernatant, 100 ⁇ l of 1X Permeabilization Buffer was added to each tube to suspend the pellet. Isotype antibody was added to the iso tube and FCM antibody was added to the sample tube. Each tube was gently mixed (vortexing), left for 30 minutes in the dark at room temperature, followed by dyeing. After standing, 1 ml of 1X Permeabilization Buffer was added to each tube, followed by centrifugation at 400 x g for 5 minutes at room temperature. After removing the supernatant, 300-400 ⁇ l of FCM staining buffer was added to each tube to suspend the pellet. At the time of measurement, it was measured in the order of iso tube and sample tube.
  • cytokine analysis the amount of 10 or more cytokines was simultaneously measured using a human cytokine array (ca. ARY005B). 2 ml of the analysis buffer was treated in a prepared 4 well multi-dish, and reacted for 1 hour in a rocking shaker. 1 ml of the sample was treated in the prepared assay buffer and the maximum total volume was adjusted to 1.5 ml. 15 ⁇ l of human cytokine array detection antibody cocktail was treated, mixed, and reacted at room temperature for 1 hour. Membrane was carefully removed and rinsed with 1 ml of 1x wash buffer.
  • Streptoavidin-HRP was diluted with 5 ml of assay buffer and 2 ml of diluted streptavidin-HRP was treated in each well. The amount of each cytokine was measured by exposing the membrane for 10 minutes with an X-ray film.
  • OVA ovalbumin
  • Alum aluminum hydroxide
  • the severity of atopic dermatitis is expressed as the sum of scores for each of the following five items.
  • the evaluation items were erythema, pruritus & dry skin, edema & excoriation, erosion, and lichenification. Each item was scored as no symptom (0 points), symptom weak (1 point), moderate (2 points), severe (3 points), and then at least 0 points (with no symptoms) by summing the scores of 5 items. ) To the maximum of 15 points (symptoms of all items are severe).
  • the scratching behavior was measured the day before the end of the experiment in order to evaluate the ability of EBI administration to suppress itching due to atopic dermatitis. Mice were observed in isolation for each individual, and the behavior of the mouse's hind paws up to the back and down to the floor was evaluated as a number of times. In addition, the continuous operation was considered as one time, and each case of scratching again after a brief interruption was included in the number of times.
  • Paraffin blocks were prepared after fixing the tissue in 10% NBF to measure the number of mast cells degranulated in the ear tissues of mice collected through toluidine blue staining. Each tissue block was sectioned to a thickness of 5 ⁇ m and washed with distilled water after deparaffining and hydration in alcohol. Sections after washing were stained with toluidine blue (pH 0.5) for 1 hour and washed with distilled water 3-4 times. Subsequently, the number of mast cells degranulated was measured with an optical microscope (DM750, Leica, Wetzlar, Germany) after sealing through dehydration and transparent processes.
  • DM750 optical microscope
  • the mouse skin tissue was fixed with 10% NBF and then made of paraffin blocks. Each tissue block was cut to a thickness of 5 ⁇ m, and the tissue sections were attached to the slides. After deparaffining each tissue slide with xylene, it was hydrated in alcohol and blocked in 5% normal serum for 1 hour. Then, the slides were treated overnight at 4° C. with filaggrin, loricrin, involucrin, occludin, TRPA1, and PGP9.5 antibodies to improve skin barrier.
  • biotinylated rabbit anti-goat IgG (1:100, Santa Cruz Biotec) was reacted at room temperature for 24 hours, and then reacted with an avidin-biotin complex kit (Vector Lab, USA) for 1 hour at room temperature. Made it. Color was developed in 0.05 M tris-HCl buffer solution (pH 7.4) containing 0.05% 3,3'-diaminobenzidine and 0.01% HCl, followed by counter staining with hematoxylin. Anti-TRPA1 and anti-PGP9.5 were treated with FITC-conjugated secondary antibody for 1 hour. Fluorescence images were acquired using Confocal microscopy (LSM 700, ZEISS, Jena, Germany).
  • Quansys Q-PlexTM mouse cytokine array from serum and lymph isolated for analysis of cytokines (IL-1 ⁇ , IL-4, IL-5, IL-6, IL-17, TNF- ⁇ , CCL2) in serum and lymph (DonginBio, Seoul, Korea) was used to analyze the content of each cytokine.
  • the capture antibody was diluted on the plate in a coating buffer (0.1 M sodium Carbonate, PH9.5), sealed with sealing tape, and attached overnight at 4°C.
  • Serum was diluted by 1/2 and the supernatant was collected for lymph, and a multiplex array was performed according to the manufacturer's instructions. 50 ⁇ l of antigen standard or sample was dispensed into each well in duplicate. After incubation for 1 hour, the plate was washed with a wash buffer, incubated with a detection mix for 1 hour, and reacted with straptavidin-HRP 1X for 15 minutes at room temperature. After washing the wells, substrates A and B were added, and the image of the plate was measured with a ChemiDoc XRS system (Bio-Rad Laboratories) and analyzed with Quansys image analysis software. To normalize cytokine data, protein concentration was determined using a Qubit® protein assay kit on a Qubit® 2.0 Fluorometer (LifeTechnologies) and cytokine levels were expressed as pg/ml of total protein.
  • the PCR used to amplify all genes was subjected to a denaturation process at 95°C for 10 minutes, and then 40 cycles (95°C 10 seconds, 60°C 15 seconds, 72°C 30 seconds). It was conducted a total of 40 times.
  • Expression data was calculated as a cycle threshold (Ct) value using the ⁇ Ct quantification method. It was quantified using GAPDH.
  • the separated skin tissue was dissolved in PRO-PREP (iNtRON, Seongnam, Korea), and then centrifuged at 14,000 g for 20 minutes, and the supernatant was used in the experiment. Protein concentration was quantified using a BCA kit (Fisher Scientific, hampton, NH, USA). The separated supernatant (total protein amount 30 ⁇ g) was transferred to a PVDF membrane (Millipore, Danvers, MA, USA) by electrophoresis using 8-12% gel SDS-PAGE.
  • the primary antibodies (filaggrin, loricrin, involucrin, PAR2, TSLP, TSLPR, TRPA1, ⁇ -actin) were reacted with the membrane at 4°C for 12 hours. After washing with TBST, a secondary antibody specific to the primary antibody was reacted at room temperature for 1 hour. After washing the membrane, the color was developed with ECL solution (Millipore), and then measured using ChemiDocTM XRS + System (Bio-RAD, Hercules, CA, USA).
  • the experimental results were expressed as mean ⁇ standard error mean (SEM), the significance test was performed by one way analysis of variance (ANOVA), and the post test between groups was performed using Turkey's HDS method, and the P value was less than 0.05 statistically. It was considered significant.
  • interferon-gamma-expressing cells IFN- ⁇ (+) cells, IFN- ⁇ releasing cells
  • Table 1 The ratio of interferon-gamma-expressing cells (IFN- ⁇ (+) cells, IFN- ⁇ releasing cells) is shown in Table 1 below.
  • NKG2D-expressing cells The ratio of NKG2D-expressing cells (NKG2D(+) cells) is shown in Table 2 below.
  • NKG2A-expressing cells The ratio of NKG2A-expressing cells (NKG2A(+) cells) is shown in Table 3 below.
  • IL-4(+) cells The proportion of cells expressing IL-4 (IL-4(+) cells) is shown in Table 4 below.
  • IL-13(+) cells The proportion of cells expressing IL-13 (IL-13(+) cells) is shown in Table 5 below.
  • EBI has a very high proportion of cells expressing interferon-gamma and NKG2D, and is effective in preventing and treating atopic dermatitis due to a low proportion of cells expressing IL-4 and IL-13. I can.
  • the levels of various immune factors involved in immune cell migration and activity increased more than 1000 times, and it was confirmed that IL8, IL16, and IL18 secretion rapidly increased after 7 days. It is possible to induce an environment in which the cell composition of the present invention can suppress the overactivated Th2 cells (immunosuppressor) generally known in atopic dermatitis through increased secretion of immune-active cell secretion factors, and is effective in atopic dermatitis. It was judged to be.
  • Th2 cells immunosuppressor
  • EBI can improve atopic dermatitis by inducing immune activity by overexpressing these genes.
  • Tables 7 and 8 are RNA sequencing and Real time PCR results for the expression levels of Ksp37, GLNY, and CD74 by date, respectively.
  • Tables 9 and 10 show RNA sequencing and qPCR results for the expression levels of HCST, ZBP1, and CCL5 by date, respectively.
  • OVA ovalbumin
  • EBI (1x10 6 cells/head) was injected intravenously for 6 weeks to mice in which atopic dermatitis-like lesions were induced by OVA skin sensitization, and the efficacy on the improvement of atopic dermatitis was confirmed.
  • the dermatological symptoms dry, erythema, soreness, swelling/hematoma, lichen
  • epidermal thickness with skin barrier collapse and inflammation were worsened, but the symptoms in the experimental group administered EBI Showed the effect of improving (FIGS. 8A to 8D ).
  • the skin tissue was stained with H&E and examined under a microscope to determine the effect of improving skin histology.
  • the control group induced by OVA had significantly increased epidermal thickness and skin barrier collapse compared to the normal group.
  • the epidermis and dermis were remarkably expanded due to edema, and it was confirmed that the epidermis was removed and the thickness was thickened.
  • EBI epidermal moisture loss
  • atopic dermatitis When atopic dermatitis occurs, the expression of proteins constituting the skin barrier decreases, resulting in barrier damage, and increases the risk of water loss, penetration by allergens, and infection.
  • Filaggrin, involucrin, and loricrin are major proteins that make up the epidermal layer of the skin and are important in improving the skin barrier.
  • occludin is one of the tight junction proteins and is reduced in skin diseases such as atopic dermatitis. It was confirmed that OVA-induced atopic dermatitis-like lesions were improved due to the administration of EBI, and the expression of these proteins increased (FIGS. 9B to 9D). The administration of EBI, along with the administration of CsA, improved the symptoms of dryness and was thought to effectively relieve the symptoms of atopic dermatitis by protecting the skin barrier.
  • OVA ovalbumin
  • FIG. 10A Through toluidine blue staining, phenomena related to inflammatory reactions, such as mast cells, could be confirmed as dark blue parts of the tissue (FIG. 10A).
  • FIG. 10B As a result of checking the tissue at 7 weeks (49 days) after OVA induction, in the OVA group, a lot of mast cells were infiltrated around the dermis, and the thickness of the epidermis was also thicker, whereas the EBI group had reduced mast cell infiltration compared to the control group. was observed (Figs. 10A and 10B).
  • the serum total IgE concentration (647.5 ng/mL) of the OVA sensitized group was significantly increased compared to the normal control (NOR, 220.0 ng/mL).
  • the increase in IgE was significantly reduced to 328.0 ng/mL and 320.5 ng/mL, respectively, by administration of CsA and EBI, showing a significant effect (Figs. 10C and 10D).
  • OVA ovalbumin
  • Th2 differentiation-inducing cytokines TSLP, IL-25, IL-33 and Th2 and Th17 related cytokines were significantly increased in the OVA-treated group compared to the NOR group.
  • IL-4 decreased by 46.8%, IL-13 by 47.3%, TSLP by 53.1%, and IL-33 by 49.2%.
  • the positive control group CsA treatment also decreased by 33.6, 35.4, 45.8, and 57.9%, respectively, showing that they inhibited Th2 cytokines (Fig. 11A).
  • IL-1 ⁇ , IL-4, IL-5, TNF- ⁇ , IL-17, IL-6, and CCL2 were analyzed by EBI administration.
  • EBI suppresses the expression of Th2 cell-related cytokines, and is thought to alleviate the symptoms of atopic dermatitis by inhibiting mast cell infiltration and IgE production.
  • TSLP is also a mediator of itching associated with atopic dermatitis, and itching is induced by a histamine-independent pathway.
  • TSLP accumulates calcium in c nerve fibers, which requires activation of TRPA1, and activation of the nerve causes itching. It was confirmed that administration of EBI reduced the expression of TRPA1 in nerve fibers in the epidermis of the skin, thereby reducing pruritus (Fig. 12C).
  • the distribution of nerve fibers exhibiting an immune response to PGP9.5 in the skin was significantly reduced in the group administered with EBI compared to the control group, consistent with the decrease in the number of neurons in the immune response of TRPA1 (Fig. 12C).
  • a cell number of 1 ⁇ 10 6 /head was administered once a week, a total of 6 times a week.
  • 1 ⁇ 10 6 /head was administered subcutaneously once a week, a total of 6 times.
  • PBMC a total of 6 times intravenously.

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Abstract

본 발명은 세포 조성물, 이의 제조 방법 및 이를 포함하는 아토피 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 세포 조성물은 전체 세포 중 인터페론-감마 발현 세포의 비율이 60% 이상으로 증가된 것으로, 인터페론-감마를 지속적으로 생산하는 세포 비율이 증가함에 따라 아토피 피부염을 현저히 개선시킬 수 있다. 또한, 부작용이 없고 안전하게 장기간 사용이 가능하여 아토피 피부염의 면역학적 이상을 근본적으로 치료할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

세포 조성물, 이의 제조 방법 및 이를 포함하는 아토피 예방 또는 치료용 약학 조성물
본 발명은 세포 조성물, 이의 제조 방법 및 이를 포함하는 아토피 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
아토피 피부염(atopic dermatitis)은 유소아에서 발생하여 흔히 성인까지 지속되는 심한 소양증과 특징적인 피부 소견을 보이는 만성 염증성 질환이다. 아토피 피부염의 병인으로는 유전적 배경, 면역학적 기전, 환경적 요인 등 다양한 인자가 복합되어 있는 것으로 알려져 있으며, 발병 기전이 매우 복잡하여 여러 가지 가설이 존재한다. 가장 유력한 가설 중 하나는 Th1/Th2 세포의 항상성이 깨지면서 Th2 세포가 과활성되는 것이다. 특정 알레르겐 (allergen)에 의해 과활성화된 Th2 세포는 IL-4 및 IL-31 과 같은 Th2 사이토카인을 분비하고, 분비된 사이토카인은 B 세포의 IgE 분비와 비만세포 (Mast cell)의 탈과립을 유도하여 여러 염증 물질을 방출시킨다.
그러나, 아토피 피부염의 치료에 있어 현재까지는 항염증제인 코르티코스테로이드 (Corticosteroid)와 같은 물질을 사용하여 면역세포의 전반적인 활성을 억제시키는 방법을 사용하고 있을 뿐이며, 위 방법은 지속기간이 매우 짧을 뿐만 아니라 심한 부작용을 내포하고 있어 적절한 치료방법으로는 권장되지 않는다. 또한, 최근 개발된 저분자 및 항체 치료제의 경우 한가지의 염증물질에 결합하는 수용체를 차단하는 수준이기 때문에 아토피와 같이 복잡한 염증 신호체계를 매개로 한 만성 피부염을 치료하기에는 한계가 있으며, 다른 경로를 통한 아토피 재발위험을 피하기 쉽지 않다. 최근에는 Th1 사이토카인의 일종인 IFN-γ 단백질을 이용하여 Th2 세포의 활성을 억제함으로써 아토피 피부염을 개선시키려는 시도들이 있었으나, IFN-γ 단백질은 체내 반감기가 극히 짧아 치료효과에 한계가 있다.
이에, 아토피의 병인에 부합하여 Th1/Th2 면역체계 균형화를 통한 근본적인 치료 접근을 통해 치료효과를 극대화하는 것이 매우 중요하며, 부작용을 유발하지 않는 아토피 피부염 치료제의 개발이 절실하다.
본 발명은 인터페론-감마 발현 세포의 비율이 60% 이상인 세포 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기 세포 조성물의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기 세포 조성물을 포함하는 아토피 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. 인간의 말초혈액으로부터 단핵구 및 자가혈장을 각각 분리하여 수득하는 단계; 항-CD3 항체로 세포 배양용기를 코팅하는 단계; 및 상기 단핵구를 상기 세포 배양용기에 접종하여 IL-2, IL-12 및 IL-18로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 배지에서 배양하는 단계;를 포함하는 인터페론-감마 발현 세포의 비율이 60% 이상인 세포 조성물의 제조 방법.
2. 위 1에 있어서, 상기 조성물 내 NKG2D 발현 세포의 비율이 60% 이상인, 방법.
3. 위 1에 있어서, 상기 조성물은 KSP37(Killer-specific secretory protein of 37 kDa), GNLY(Granulysin), CD74(Cluster of Differentiation 74), ZBP1(Z-DNA-binding protein 1), CCL5(C-C chemokine receptor type 5) 및 HCST (Hematopoietic Cell Signal Transducer)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 말초혈액단핵구(PBMC) 대비 5배 이상 발현되는 것인, 방법.
4. 위 1에 있어서, 상기 배양은 3단계 이상으로 수행되며, 1단계 배양은 상기 단핵구를 항-CD3 항체가 코팅된 세포 배양용기에 접종하여 IL-2, IL-12 및 IL-18를 포함하는 배지를 첨가하여 배양하고, 2단계 배양은 상기 1단계 배양물을 항-CD3 항체가 코팅되지 않은 세포 배양용기에 옮겨 IL-2를 포함하는 배지를 첨가하여 배양하며, 3단계 배양은 상기 2단계 배양물을 IL-2, IL-12 및 IL-18를 포함하는 배지에서 배양하는 것인, 방법.
5. 위 1에 있어서, 상기 항-CD3 항체의 농도는 1 내지 10 ㎍/㎖이고, IL-2는 800 내지 1200 IU/mg, IL-12는 2 내지 6 ng/㎖, IL-18은 20 내지 60 ng/㎖인, 방법.
6. 인간 말초혈액 단핵구의 배양물인 이종 세포 혼합물로서, 총 세포 중 인터페론-감마 발현 세포의 비율이 60% 이상인. 세포 조성물.
7. 위 6에 있어서, 상기 세포 조성물은 총 세포 중 인터페론-감마 발현 세포의 비율이 80% 이상인, 세포 조성물.
8. 위 6에 있어서, 상기 세포 조성물은 총 세포 중 NKG2D 발현 세포의 비율이 60% 이상인, 세포 조성물.
9. 위 6에 있어서, 상기 조성물은 KSP37(Killer-specific secretory protein of 37 kDa), GNLY(Granulysin), CD74(Cluster of Differentiation 74), ZBP1(Z-DNA-binding protein 1), CCL5(C-C chemokine receptor type 5) 및 HCST (Hematopoietic Cell Signal Transducer)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 말초혈액단핵구(PBMC) 대비 5배 이상 발현되는 것인, 세포 조성물.
10. 위 6에 있어서, 상기 세포 조성물은 총 세포 수가 1 x 10 8 내지 1 x 10 10개인, 세포 조성물.
11. 위 6에 있어서, 상기 세포 조성물은 인간의 말초혈액으로부터 분리한 단핵구를 항-CD3 항체, IL-2, IL-12 및 IL-18로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 배지에서 배양하여 얻어진 것인, 세포 조성물.
12. 위 11에 있어서, 상기 배양은 3단계 이상으로 수행되며, 1단계 배양은 상기 단핵구를 항-CD3 항체가 코팅된 세포 배양용기에 접종하여 IL-2, IL-12 및 IL-18를 포함하는 배지를 첨가하여 배양하고, 2단계 배양은 상기 1단계 배양물을 항-CD3 항체가 코팅되지 않은 세포 배양용기에 옮겨 IL-2를 포함하는 배지를 첨가하여 배양하며, 3단계 배양은 상기 2단계 배양물을 IL-2, IL-12 및 IL-18를 포함하는 배지에서 배양하는 것인, 세포 조성물.
13. 위 11에 있어서, 상기 항-CD3 항체의 농도는 1 내지 10 ㎍/㎖이고, IL-2는 800 내지 1200IU/mg, IL-12는 2 내지 6 ng/㎖, IL-18은 20 내지 60 ng/㎖인, 세포 조성물.
14. 위 6 내지 13 중 어느 한 항의 세포 조성물을 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
본 발명에 따른 세포 조성물은 전체 세포 중 인터페론-감마 발현 세포의 비율이 60% 이상으로 증가된 것으로, 인터페론-감마를 지속적으로 생산하는 세포 비율이 증가함에 따라 아토피 피부염을 현저히 개선시킬 수 있다. 또한, 부작용이 없고 안전하게 장기간 사용이 가능하여 아토피 피부염의 면역학적 이상을 근본적으로 치료할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 OVA 감작 아토피피부염 모델의 실험 스케쥴을 나타낸 것이다.
도 2 및 3은 본 발명의 세포 조성물의 세포 표현형을 분석한 결과이0다.
도 4는 본 발명의 세포 조성물의 세포 배양 기간에 따른 인터페론-감마 분비 누적양을 측정한 것이다.
도 5는 본 발명의 세포 조성물에서 세포 배양 기간별 분비하는 특정 활성인자의 분비양 변화를 측정한 것이다.
도 6 및 7은 본 발명의 세포 조성물을 체외 자극하여 활성 후 Ksp37, GLNY, CD74, HCST, ZBP1, CCL5의 날짜별 발현양을 확인한 것이다.
도 8은 오발부민 (OVA)로 유도된 아토피피부염 개선에 대한 EBI의 효과를 나타낸 것이다.
도 9는 오발부민 (OVA)로 유도된 아토피피부염 피부장벽 개선에 대한 EBI의 효과를 나타낸 것이다.
도 10은 오발부민 (OVA) 으로 유도된 염증반응에 대한 EBI의 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 11은 오발부민 (OVA) 으로 유도된 사이토카인 발현에 대한 EBI의 억제효과를 나타낸 것이다.
도 12는 오발부민 (OVA) 으로 인한 소양증 개선에 대한 EBI의 효과를 나타낸 것이다.
도 13은 아토피피부염 유도 마우스에서 본 발명의 세포 조성물 투여군의 피부 개선 효과를 확인한 것이다.
도 14는 세포 조성물의 투여경로에 따른 체중 변화를 확인한 것이다.
도 15 및 16은 본 발명의 세포 조성물 투여에 따른 경피두께 감소를 확인한 것이다.
도 17 및 18은 본 발명의 세포 조성물 투여에 따른 염증 반응 감소 효과를 확인한 것이다.
도 19는 본 발명의 세포 조성물 투여에 따른 혈액 내 IgE 감소를 확인한 것이다.
도 20은 본 발명의 세포 조성물 투여에 따른 피부 조직 내 아토피피부염 관련 사이토카인 및 가려움증(itching) 관련 유전자들의 변화를 확인한 것이다.
도 21은 본 발명의 세포 조성물의 림프절에서의 인터페론-감마 분비량을 확인한 것이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 세포 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 세포 조성물의 제조 방법은 인간의 말초혈액으로부터 단핵구 및 자가혈장을 각각 분리하여 수득하는 단계를 포함한다.
말초혈액으로부터 단핵구를 분리하는 방법은 공지의 방법을 사용할 수 있다. 일반적으로 피콜 (Ficoll) 방법을 사용하는데, 피콜은 설탕과 에피클로로히드린을 서로 중합시킨 화합물로 일반적으로 약 40만 분자량을 사용한다. 피콜은 물에 녹이면 저점도에서 고밀도에 이르는 용액으로 변하기 때문에 세포, 바이러스 및 세포 소기관 등을 분리하기 위한 밀도기울기를 형성시키는 물질로 사용한다. 말초혈액단핵구의 경우에는 혈액 속에 포함되어 있는 적혈구, 과립성백혈구 (granulocytes) 및 죽은 세포에 비해 가볍고 혈장 (plasma)보다는 무거우므로 분리가 된다.
상기 단핵구는 상기 세포 조성물의 적용 대상 개체의 자가 혈액으로부터 분리되어 배양된 것일 수 있다. 자가 혈액으로부터 분리된 단핵구를 이용할 경우, 불필요한 자가면역반응이 배제되어 염증 등의 부작용 없이 효율적으로 아토피 피부염을 치료할 수 있다.
본 발명의 세포 조성물의 제조 방법은 상기 단핵구를 항-CD3 항체, IL-2, IL-12 및 IL-18로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함한다.
상기 배지가 항-CD3 항체를 포함하는 경우, 항-CD3 항체는 배지에 코팅된 것일 수 있다. 항-CD3 항체가 배지에 코팅된 경우, 상기 배지는 IL-2, IL-12 및 IL-18로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
상기 배지는 항-CD3 항체, IL-2, IL-12 및 IL-18를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로 항-CD3 항체는 배지에 코팅되고, 상기 세포 배양용 배지에 IL-2, IL-12 및 IL-18가 추가로 포함될 수 있다.
항-CD3 항체는 CD3에 결합하는 특성을 가지는 항체라면 제한 없이 이용 가능할 수 있다. 항-CD3 항체는 0.1~100㎍/㎖의 범위로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 0.5~50 ㎍/㎖, 보다 바람직하게는 1~10 ㎍/㎖의 범위로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
인터루킨은 림프구나 단구 및 대식세포 등 면역담당 세포가 생산하는 단백질성 생물활성물질의 총칭으로 본 발명은 인터루킨류의 사이토카인으로서 IL-2, IL-12 및 IL-18로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다. IL-2는 100~2000 IU/㎖의 범위로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 500~1500 IU/㎖, 보다 바람직하게는 800~1200 IU/㎖를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. IL-12는 0.5~10 ng/㎖의 범위로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 1~8 ng/㎖, 보다 바람직하게는 2~6 ng/㎖ 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. IL-18은 1~100 ng/㎖의 범위로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 10~80 ng/㎖, 보다 바람직하게는 20~60 ng/㎖의 범위로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 인터루킨류는 이에 한정되지 않고, 통상의 기술자에게 공지된 다른 인터루킨류도 본 발명의 목적에 부합하는 한 제한 없이 이용 가능하다.
상기 배지는 L-glutamine을 더 포함할 수 있다. 상기 L-glutamine의 농도는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 0.5 내지 5 mM 일 수 있고, 바람직하게는 1 내지 3mM 일 수 있다.
상기 배지는 그 외 단핵구 배양을 위해 통상적으로 사용되는 성분을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 글라이신(Glycine), L-아르기닌(L-Arginine), L-아스파라긴(L-Asparagine), L-아스파르트산(L-Aspartic acid), L-시스틴 2HCl(LCystine 2HCl), L-글루탐산(L-Glutamic Acid), L-히스티딘(L-Histidine), L-히드록시프롤린(L-Hydroxyproline), L-이소류신(LIsoleucine), L-류신(L-Leucine), L-라이신 하이드로클로라이드(L-Lysine hydrochloride), L-메티오닌(L-Methionine), L-페닐알라닌(L-Phenylalanine), L-프롤린(L-Proline), L-세린(L-Serine), L-트레오닌(L-Threonine), L-트립토판(LTryptophan), L-타이로신 이나트륨 2수화물(L-Tyrosine disodium salt dihydrate), L-발린(L-Valine), 비오틴(Biotin), 염화콜린(Choline chloride), D- 판토텐산칼슘(D-Calcium pantothenate), 엽산(Folic Acid), 나이아신아마이드(Niacinamide), 파라-아미노벤조산(Para-Aminobenzoic Acid), 피리독신 하이드로클로라이드(Pyridoxine hydrochloride), 리보플라빈(Riboflavin), 티아민 하이드로클로라이드(Thiamine hydrochloride), 비타민 B12(Vitamin B12), i-이노시톨(i-Inositol), 질산칼슘(Calcium nitrate), 황산마그네슘(Magnesium Sulfate), 염화칼륨(Potassium Chloride), 중탄산나트륨(Sodium Bicarbonate), 염화나트륨(Sodium Chloride), 제일인산나트륨 수화물(Sodium Phosphate dibasic anhydrous), D-글루코스(DGlucose), 글루타티온(Glutathione), HEPES, 페놀레드(Phenol Red) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 배지는 혈청 또는 혈장과 단핵구의 증식을 지지하는 추가의 증식인자를 첨가하여 배양한 것일 수도 있다. 배지에 첨가하는 혈청 또는 혈장의 종류는 특별히 한정되지 않고, 시판의 각종 동물 유래의 것을 사용할 수 있지만, 인간 유래로서 본인 유래의 것이 더욱 바람직하다. 예를 들어, 사이토카인의 조합이나, 단핵구 증식을 자극하는 렉틴류 등을 첨가하는 등 통상의 기술자에게 알려져 있는 방법을 사용할 수 있다.
또한, 배지는 혈청 또는 혈장과 단핵구의 증식을 지지하는 추가의 증식인자를 더 포함하는 것일 수 있고, 혈청 또는 혈장 자체를 포함하는 것일 수 있다. 배지에 첨가하는 혈청 또는 혈장의 종류는 특별히 한정되지 않아, 시판의 각종 동물 유래의 것을 사용할 수 있지만, 인간 유래로서 본인 유래(자가)의 것이 바람직하며, 예를 들면 human AB serum 또는 auto plasma일 수 있다.
상기 배양은 여러 단계로 수행될 수 있다. 예를 들어 2단계 또는 3단계 이상으로 수행될 수 있다.
2단계 이상으로 수행되는 경우, 예를 들면 1단계에서 배양된 단핵구를 2단계에서 이를 새로운 배지로 옮겨 배양할 수 있다. 2단계 이상으로 수행되는 경우, 1단계 배지는 혈장(자가), 항-CD3 항체, L-glutamine, IL-2, IL-12 및 IL-18을 포함하고, 2단계 배지는 혈장(자가), L-glutamine, IL-2를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로 1단계 배지는 항-CD3 항체 및 IL-2, IL-12, IL-18을 포함하고, 2단계 배지는 IL-2를 포함하되, 항-CD3 항체, IL-12, IL-18을 포함하지 않을 수 있다.
3단계 이상으로 수행되는 경우, 예를 들면 상기 2단계 배양 후, 배양물을 새로운 배지로 옮겨 배양할 수 있다. 1단계 배지는 혈장(자가), 항-CD3 항체, L-glutamine, IL-2, IL-12 및 IL-18을 포함하고, 2단계 배지는 혈장(자가), L-glutamine, IL-2를 포함하며, 3단계 배지는 혈장(자가), L-glutamine, IL-2, IL-12 및 IL-18을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로 1단계 배지는 항-CD3 항체 및 IL-2, IL-12, IL-18을 포함하고, 2단계 배지는 IL-2를 포함하되, 항-CD3 항체, IL-12, IL-18을 포함하지 않으며, 3단계 배지는 IL-2, IL-12, IL-18을 포함하되, 항-CD3 항체를 포함하지 않을 수 있다.
항-CD3항체, L-glutamine, IL-2, IL-12 및 IL-18은 전술한 범위 내의 농도로 포함될 수 있으며, 앞서 예시한 배지를 사용할 수 있다.
배양은 일반적인 세포배양방법, 예를 들면 CO 2 인큐베이터 내에서 행해질 수 있다. CO 2 농도는 예를 들면 1 내지 10%, 구체적으로는 3 내지 7% 일 수 있고, 온도는 30 내지 40℃, 구체적으로 35 내지 38℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
배양은 단핵구가 충분히 활성, 증식할 때까지 수행될 수 있으며 예를 들면 3일 내지 20일, 구체적으로 8일 내지 16일간 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
배양 효율 개선을 위해, 배양 동안 세포 수 증가에 맞추어 배지를 추가해주는 것이 바람직하다. 배지 추가의 주기는 배양액의 열화 방지를 위해 예를 들면 1 내지 10일, 구체적으로 1 내지 7일에 1회씩 추가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 방법으로 얻어지는 세포 조성물은 말초혈액 유래 단핵구를 배양하여 얻어진 이종 세포 혼합물로서, 여러 표현형의 세포를 포함할 수 있다.
그 표현형은 예를 들면 CD3(+)CD56(-) 세포(T 세포), CD3(+)CD56(+) 세포(NKT 세포), CD3(-)CD56(+) 세포(NK 세포) 등일 수 있다.
본 발명의 방법으로 얻어지는 세포 조성물은 인터페론-감마 발현 세포의 비율이 60% 이상이다.
인터페론-감마 발현 세포는 그 세포 중 인터페론 감마를 발현하는 세포(IFN-γ(+) 세포 또는 IFN-γ releasing cell)로서, 상기 세포 조성물은 총 세포 중 인터페론-감마 발현 세포의 비율이 매우 높아 아토피 피부염 개체에 투여 시 아토피 피부염 증상을 개선시킬 수 있다.
상기 세포 조성물은 인터페론-감마 발현 세포의 비율이 60% 이상으로, 구체적으로, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상일 수 있다. 그 상한은 특별히 한정되지 않고, 100% 미만일 수 있으며, 구체적으로 90% 이하일 수 있다.
상기 세포 조성물은 NKG2D 발현 세포의 비율이 60% 이상일 수 있다.
NKG2D 발현 세포는 그 세포 중 NKG2D를 발현하는 세포(NKG2D(+) 또는 NKG2D releasing cell)로서, 상기 세포 조성물은 총 세포 중 NKG2D 발현 세포의 비율이 높아 아토피 효능을 핵심적인 면역균형 조절 역할을 하는 Th1세포에서 주로 발현하는 높은 NKG2D수치를 통해 아토피 피부염에 대한 높은 치료 효과가 있다.
상기 세포 조성물은 NKG2D 발현 세포의 비율이 60% 이상으로, 구체적으로, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상일 수 있다. 그 상한은 특별히 한정되지 않고, 100% 미만일 수 있으며, 구체적으로 90% 이하일 수 있다.
상기 세포 조성물은 IL-4 및 IL-13 발현 세포의 비율이 각각 10% 미만일 수 있다. 구체적으로, 8% 미만, 7% 미만일 수 있다. 상기 세포 조성물은 총 세포 중 IL-4 및 IL-13 발현 세포의 비율이 낮아 아토피를 유발하는 사이토카인인 IL-4 및 IL-13의 분비량이 낮으므로, 아토피 예방 및 치료에 효과적이다.
상기 세포 조성물은 총 세포 수가 예를 들면 1 x 10 6 내지 1 x 10 10개, 구체적으로 1 x 10 8 내지 1 x 10 10개 일 수 있다.
본 발명의 방법으로 얻어지는 세포 조성물은 면역활성에 관여하는 유전자 발현을 증가시킬 수 있다. 상기 면역활성에 관여하는 유전자는 KSP37(Killer-specific secretory protein of 37 kDa), GNLY(Granulysin), CD74(Cluster of Differentiation 74), ZBP1(Z-DNA-binding protein 1), CCL5(C-C chemokine receptor type 5) 및 HCST (Hematopoietic Cell Signal Transducer)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
세포 조성물은 상기 유전자의 발현이 PBMC에 비해 5배 이상, 10배 이상 증가된 것일 수 있다. 예를 들어, GNLY의 발현이 60배 이상 증가된 것일 수 있다.
KSP37은 FGFBP2 (Fibroblast Growth Factor Binding Protein 2)로도 알려져 있으며, Th1/Tc1 세포 특이적 분비 단백질이다. NK세포, γ/δ T세포, effector CD8 T세포 및 Th1 세포의 subset에 의해 생성되어 혈청으로 분비된다. 대부분의 Ksp37 발현 세포는 퍼포린(perforin)을 발현하고, 이는 Ksp37이 세포 독성 림프구-매개 면역의 주요 과정에 관여하고 있음을 시사한다.
GNLY는 T-Cell Activation Protein 519 라고도 알려져 있으며, 퍼포린 및 그랜자임(granzymes)과 함께 세포 독성 세포(CTL)와 NK cell의 세포 분해 과립에 존재하는 세포 용해성 및 염증성 단백질이다. GNLY는 saposin-유사 단백질(SAPLIP) family의 구성원으로 광범위한 항균 활성과 종양 세포에 대한 강력한 세포 독성 작용을 나타내며 항원 제시 세포를 활성화시키고 면역 알람인(immune alarmin) 역할을 한다. GNLY는 세포 독성 T 세포와 NK 세포가 감염된 세포에 부착될 때 방출되며 T 세포, 단핵구 및 기타 염증 세포의 화학 유인 물질로서 작용한다. 또한, RANTES, IL-1, IL-6, IL-10 및 IFN-γ를 포함한 여러 사이토카인의 발현을 자극하기 때문에 면역균형을 유도할 수 있으며, 표적세포를 살상하는 생물학적 기능으로 인해 아토피 피부 내에서 손상받아 변형된 염증세포를 제거하여 아토피 피부염 증상이 개선될 수 있다.
CD74는 코딩된 단백질에 결합될 때 생존 경로 및 세포 증식을 개시하는 사이토카인 대식세포 이동 억제 인자(cytokine macrophage migration inhibitory factor, MIF)에 대한 세포 표면 수용체로서 작용한다. MIF는 피부 염증을 유도하는 전 염증성 사이토카인이며, 손상된 세포로부터 분비될 수 있고, 고 이동성 그룹 단백질 B1(high-mobility group protein B1)과 같은 손상 관련 분자를 방출시킨다. 또한, MIF는 T 세포 활성화 및 침윤을 증가시킬 수 있다.
HCST(=DAP10)는 CD8+ T 세포에서 발현하는 NKG2D 신호의 전달에 관여하는 어댑터 분자이며, NKG2D와 HCST의 결합은 ITAM(Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif)의 인산화를 유도하고, Syk(spleen tyrosine kinase)와 Zap70(Zeta-chain-associated protein kinase 70)의 신호 cascade를 유도하여 인터페론-감마와 같은 Th1 사이토카인을 분비하는 면역 활성에 관여하는 단백질이다.
ZBP1은 활성화되면 인터페론-베타를 조절함으로써, cytosolic pattern-recognition system에 영향을 미쳐 면역반응을 활성화 시킨다. ZBP1의 유전자의 활성 및 발현 증가는 세포괴사(Necroptosis) 활성화와 관련이 있는데, 세포괴사는 바이러스에 감염된 세포를 제거하거나 바이러스가 퍼지는 것을 억제하는 것으로, 세포괴사될 때 세포 안의 DAMPs(DNA, HSPs, MSU 등)가 세포 밖으로 방출되고 이때, 일부 DAMPs는 수지상세포(dendritic cells, DCs)를 자극한다. 이 자극에 의해 성숙된 DCs는 T 세포를 활성화 시킨다. 따라서, ZBP1이 관여하는 세포괴사에 의해 바이러스 감염된 세포를 제거할 뿐만 아니라 DCs를 성숙시키고, T 세포를 활성화시켜 면역 활성을 유도할 수 있다.
CCL5는 Th1 세포 활성을 유도하고, 인터페론-감마와 함께 작용하는 경우, NK cell의 증식과 활성을 유도할 수 있다.
이와 같이 아토피는 면역기능 장애를 통해 야기된 면역불균형에 의한 것으로 Th2가 과도하게 활성화되어 발생하는 것인데, 본 발명의 방법으로 얻어진 세포 조성물은 Th2 증식을 억제하고 Th1 세포를 활성화하여 면역체계를 균형화시켜 아토피를 개선시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 세포 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 세포 조성물은 말초혈액 유래 단핵구를 배양하여 얻어진 이종 세포 혼합물로서, 여러 표현형의 세포를 포함할 수 있다.
그 표현형은 예를 들면 CD3(+)CD56(-) 세포(T 세포), CD3(+)CD56(+) 세포(NKT 세포), CD3(-)CD56(+) 세포(NK 세포) 등일 수 있다.
본 발명의 세포조성물은 인간 말초혈액 단핵구의 배양물인 이종 세포 혼합물로서, 총 세포 중 인터페론-감마 세포의 비율이 60% 이상이다.
상기 세포 조성물은 인터페론-감마 발현 세포의 비율이 60% 이상으로, 구체적으로, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상일 수 있다. 그 상한은 특별히 한정되지 않고, 100% 미만일 수 있으며, 구체적으로 90% 이하일 수 있다.
상기 세포 조성물은 NKG2D 발현 세포의 비율이 60% 이상으로, 구체적으로, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상일 수 있다. 그 상한은 특별히 한정되지 않고, 100% 미만일 수 있으며, 구체적으로 90% 이하일 수 있다.
상기 세포 조성물은 인터페론-감마가 분비량이 증가되므로, 아토피 피부염의 치료에 효과적이다.
상기 세포 조성물은 IL-4 및 IL-13 발현 세포의 비율이 각각 10% 미만일 수 있다. 구체적으로, 8% 미만, 7% 미만일 수 있다. 상기 세포 조성물은 총 세포 중 IL-4 및 IL-13 발현 세포의 비율이 낮아 아토피를 유발하는 사이토카인인 IL-4 및 IL-13의 분비량이 낮으므로, 아토피 예방 및 치료에 효과적이다.
상기 세포 조성물은 총 세포 수가 예를 들면 1 x 10 6 내지 1 x 10 10개, 구체적으로 1 x 10 8 내지 1 x 10 10개 일 수 있다.
상기 세포 조성물은 인간의 말초혈액으로부터 분리한 단핵구를 항-CD3 항체, IL-2, IL-12 및 IL-18로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 배지에서 배양하여 얻어진 것일 수 있다.
그 외 배지 조성 및 배양방법 등은 전술한 바와 같다.
또한, 본 발명은 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 상기 세포 조성물을 포함하여 인터페론-감마가 분비량이 많으므로, 아토피 피부염의 예방 또는 치료에 효과적이다.
세포 조성물에 관한 사항은 전술한 바와 같다.
본 발명의 약학 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다. 본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 한편, 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 이에 한정되는 것이 아니며 1일 당 0.01-2000 mg/kg(체중)일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구로 투여되는 경우, 정맥내 주입, 피하주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 적용되는 질환의 종류에 따라, 투여경로가 결정되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물은 발모 촉진 또는 탈모의 예방 및 치료에 사용되기 때문에 피부에 국소적으로 적용되는 방식으로 투여되는 것이 바람직하다.
본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.
실험 재료
실험동물은 수컷 6주령의 Balb/C는 라온바이오 (yongin, Korea)에서 공급받아 실험 당일까지 고형사료 (항생제 무첨가)와 물을 충분히 공급하고 온도 23 ± 2 ℃, 습도 55 ± 10%, 12시간-12시간 (light-dark cycle)의 환경에서 1주 간 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 모든 동물실험 과정은 NIH (National Institutes of Health)의 실험동물관리 규정 (Principle of Laboratory Animal Care)과 중앙대학교 동물실험윤리위원회의 승인을 받아 수행되었다.
실시예
실험방법
1. 체외증강 면역세포(Ex-vivo Boosted Imuune cell, EBI)의 배양
혈액을 상온에서 보온시킨 후, 2000 RPM, 3분(Ace : 4, Dec : 3) 동안 2회 원심분리 하였다. 상층액의 혈장을 새로운 50 ㎖ 튜브에 수집하고, 혈구층도 새로운 50 ㎖ tube에 모아준다. 혈장을 56 ℃ 수조에서 30분 간 불활성화 처리한 뒤, 2000 RPM, 3분 (Ace : 4, Dec : 3)동안 원심분리하였다. 상층액을 새로운 50 ㎖ tube에 모아서 혈장으로 사용하였다. 50 ㎖ tube에 모아둔 혈구층은 1:1 비율로 ALyS505N-0 배지를 가하여 희석시켰다. 15 ㎖ tube에 피콜 4 ㎖을 넣고, 그 위에 혈액-배지 혼합물(Blood-media mix)을 8 ㎖을 올려준 후 400 RCF, 30분(Ace : 4, Dec : 0) 동안 원심분리하였다. 상위층의 혈장(약 3 ㎖)을 버리고, 혈장과 피콜층 사이의 PBMC 층을 최대한 분리하여 50 ㎖ tube에 옮겨 총 부피 50 ㎖에 맞춰 멸균생리식염수를 넣어준 후, 2000 RPM, 3분(Ace : 4, Dec : 3) 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후, 10 ㎖의 RBC Lysis buffer를 이용하여 셀을 풀어준 후, 흔들면서 3분 동안 반응시켰다. 반응이 끝나면 멸균생리식염수를 이용하여 총 부피를 50 ㎖로 맞춰준 후, 2000 RPM, 3분(Ace : 4, Dec : 3) 동안 원심분리하였다. 그 후, 상층액을 제거하고, ALyS505N-0 배지 1 ㎖에 세포를 풀어준 뒤에 셀 카운팅하여 총 세포 수를 계산하였다.
T25 플라스크에 항-CD3 항체(BD, Mouse anti-human, #555329) 5 ㎕, 10x HBSS 500 ㎕, 멸균생리식염수 4.5 ㎖을 넣어 플라스크를 코팅하였다(37 ℃, 4 시간). CD3 코팅된 T25 플라스크에 코팅용액을 제거하 고 멸균생리식염수를 이용하여 두 차례 세척하였다. 세척한 T25 플라스크에 PBMC 1x 10 7 cells/5㎖를 시딩한 후, 혈장(자가) 500 ㎕, L-Glutamine (2mM) 50 ㎕, IL-2 (1,000 IU/㎖) 2.8 ㎕, IL-12 (3 ng/㎖) 1.5 ㎕, IL-18 (30ng/㎖) 1.5 ㎕, ALyS505N-0 배지 4.5 ㎖를 첨가하고, 37 ℃에서 5% CO 2 조건에서 배양하였다.
EBI의 배양에는 플라스크 및 백을 사용하였다. 플라스크를 이용한 배양 시, 상기 방법으로 제조된 T25 플라스크에서 PBMC 시딩 3일 차, 혈장(자가) 500 ㎕, L-Glutamine (2mM) 50 ㎕, IL-2 (1,000 IU/㎖) 2.8 ㎕, ALyS505N-0 배지 4.5 ㎖를 첨가하였다. 시딩 4일차, T75 플라스크로 옮기고, 혈장(자가) 1 ㎖, L-Glutamine (2mM) 100 ㎕, IL-2 (1,000 IU/㎖) 5.6 ㎕, ALyS505N-0 배지 9 ㎖를 첨가하였다. 시딩 5일차, 혈장(자가) 2 ㎖, L-Glutamine (2mM) 200 ㎕, IL-2 (1,000 IU/㎖) 11.2 ㎕, ALyS505N-0 배지 18 ㎖를 첨가하였다. 시딩 6일차, T150 플라스크로 옮기고 L-Glutamine (2mM) 400 ㎕, IL-2 (1,000 IU/㎖) 22.4 ㎕, IL-12 (3 ng/㎖) 12 ㎕, IL-18 (30ng/㎖) 12 ㎕, ALyS505N-0 배지 40 ㎖를 첨가하였다. 시딩 7일차, L-Glutamine (2mM) 500 ㎕, IL-2 (1,000 IU/㎖) 28 ㎕, IL-12 (3 ng/㎖) 15 ㎕, IL-18 (30ng/㎖) 15 ㎕, ALyS505N-0 배지 50 ㎖를 첨가하였다.
시딩 8일차, 배양 백에 IL-2 (200IU/㎖)를 5 ㎖를 넣고 백을 마사지하였다. 배양 백의 1/3 지점을 클램프로 고정한 후, 약 30 ㎖ 배지를 빼놓았다. T150 플라스크의 세포들을 스크래퍼를 이용하여 떼어낸 후, 백으로 옮겼다. 빼놓았던 배지를 이용하여 플라스크를 세척하여 백에 넣어주었다. 배양기 챔버 하나에 한 백만 넣어 평평하게 해주었다(37 ℃, 5 % CO 2). 시딩 10일차, 백 마사지 후에 백의 2/3 지점을 클램프로 고정하고 1/3 지점의 클램프를 제거하였다. 시딩 12일차, 백 마사지 후에 백의 2/3 지점의 클램프를 제거하였다. 시딩 14일차, 백 마사지 후에 걸쇠에 고정시켰다. 세포를 수확할 tube line을 70% EtOH로 닦아주었고, 250 ㎖, 50 ㎖ tube를 이용하여 세포를 수확한 후, 2000 RPM, 3분(Ace : 4, Dec : 3) 동안 원심분리하였다. 상층액을 50 ㎖ 튜브에 일부 덜어 두고, 배양 배지를 이용하여 50 ㎖ tube로 세포를 모아서 총 부피 50 ㎖로 만들어 2000 RPM, 3분(Ace : 4, Dec : 3) 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후, 배양 배지 1 ㎖에 세포 펠릿을 풀어주고, 셀 카운팅을 하였다.
2. 배양 기간에 따른 세포 표현형 측정
(1)세포 활성화
검체(배양기간 별 EBI)를 상온에서 400 x g로 5분 간 원심분리하였다. 상등액을 제거한 후 세포수가 2 X 10 6개/㎖가 되도록 한 뒤, 배양액 500 ㎕로 세포를 부유시켰다. Microtube에 배양액 500 ㎕를 넣고 하기와 같이 시약을 첨가하여 활성화 용액을 제조하였다. 24-well plate 1개의 well에 세포 부유액 500 ㎕를 넣고 제조된 활성화 용액 500 ㎕를 넣었다. 5% CO 2, 37 ℃ 조건의 CO 2 배양기에서 4시간 동안 반응시켰다. Well에 있는 세포 부유액을 15㎖ tube로 옮긴 다음, 1X PBS 4 ㎖를 첨가하여 세척한 후 400 x g으로 5분 간 원심분리하였다. 상등액을 제거한 후, FCM 염색 버퍼 5 ㎖를 첨가하여 세척한 후 400 x g으로 5분 간 원심분리하였다. 상등액을 제거한 후 FCM 염색 버퍼 200 ㎕를 첨가하여 세포를 현탁하였다.
(2)표면 항원 염색
FCM tube를 검체(배양기간 별 EBI) 당 2개씩 준비하고 각각의 tube를 iso tube, sample tube라고 한다. 각 tube에 CD45-FITC 항체 2㎕를 넣었다. 각 tube에 (1)의 세포 현탁액을 100 ㎕씩 분주한 후, 마이크로 피펫으로 잘 섞어주었다. 상온 암소에 30분 동안 방치하여 염색하였다. 방치가 끝나면 각 tube에 FCM 염색 버퍼 1㎖을 첨가한 후, 상온에서 400 x g으로 5분간 원심분리하였다. 상등액을 제거한 후, 각 tube에 FCM 염색 버퍼 100 ㎕를 첨가하여 펠릿을 현탁시켰다. 각 tube에 IC 고정 버퍼 100 ㎕를 첨가한 후, 상온 암소에서 20분 이상 반응시켰다(이때, 1시간을 넘기지 않도록 한다.)
(3)세포 내 염색(Intracelluar straining)
10 X Permeabilization buffer를 증류수로 10배 희석하여 1X Permeabilization buffer를 제조하였다. 각 tube에 1X Permeabilization buffer 1 ㎖를 첨가한 후, 상온에서 400 x g으로 5분 간 원심분리하였다. 상등액을 제거한 후, 각 tube에 1X Permeabilization buffer 100 ㎕를 첨가하여 펠릿을 현탁시켰다. Iso tube에는 Isotype 항체, sample tube에는 FCM 항체를 첨가하였다. 각 tube들을 약하게 섞어주고(vortexing), 상온 암소에 30분 동안 방치하여 염색하였다. 방치가 끝나면 각 tube에 1X Permeabilization buffer 1 ㎖를 첨가한 후, 상온에서 400 x g으로 5분 동안 원심분리하였다. 상등액을 제거한 후, 각 tube에 FCM 염색 버퍼 300~400 ㎕를 첨가하여 펠릿을 현탁시켰다. 측정 시에는 iso tube, sample tube 순서로 측정하였다.
3. 사이토카인 분석
사이토카인 분석은 human cytokine array(ca. ARY005B)을 이용하여 10개 이상의 사이토카인 양을 동시에 측정하였다. 분석 버퍼 2 ㎖를 준비된 4 well multi-dish에 처리하고, Rocking shaker에서 1시간 동안 반응시켰다. 1 ㎖의 샘플을 준비된 분석 버퍼에 처리하고 최총 부피를 1.5 ㎖로 맞췄다. 15 ㎕의 human cytokine array detection antibody cocktail을 처리하고 혼합한 후 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. Membrane을 조심히 제거하고 1x 세척 버퍼 1 ㎖로 세척(rinsing)하였다. Streptoavidin-HRP를 분석 버퍼 5 ㎖로 희석시키고 2 ㎖의 희석된 streptavidin-HRP를 각 well에 처리하였다. X-ray film으로 10분 동안 membrane을 노출시켜 각 사이토카인 양을 측정하였다.
4. 아토피성 피부염 오발부민(OVA) 감작 아토피 모델
7주령의 암컷 Balb/c 마우스에 ovalbumin (OVA, grade V, Sigma, St. Louis, MO, USA) 20 ㎍과 immunologic adjuvant인 알루미늄수산화물 aluminum hydroxide (Alum, Sigma) 1 mg을 saline에 희석하여 일주일에 한번씩 2주 간 복강에 투여하여 아토피피부염 감작을 유도하였다. OVA 복강투여 2주 후 OVA 100 ㎍을 제모한 등 피부에 1 × 1 cm patch로 1주 감작 후 2주 휴식을 3회 반복시켜 국소부위에 피부염을 유도하였다. OVA 감작 2주 후부터 EBI (1 x 10 6 cells/animal)와 양성대조군 Cyclosporin A (CsA, 2 mg/kg) 를 미정맥주사방법 (tail i.v. injection) 으로 6주 간 주사하였다.
Normal (NOR) 군과 OVA군은 생리식염수 (100 ㎕) 를 주사하였다. 실험이 끝난 후 혈액을 채혈하고, 등 피부를 적출하였다(도 1).
5. 관능 평가 시험(피부병변의 평가)
아토피피부염에서 일반적으로 사용되는 임상적 육안 평가법으로서 아토피피부염의 심각성 정도를 다음 5가지 항목을 각각 평가한 점수의 총합으로 나타낸다. 평가 항목은 홍반 (erythema), 가려움과 피부건조 (pruritus & dry skin), 부종과 혈종 (edema & excoriation), 짓무름 (erosion), 그리고 태선화 (lichenification) 등이다. 각각의 항목에 대해 증상이 없음 (0점), 증상 약함 (1점), 보통 (2점), 심함 (3점)으로 채점한 후 5항목의 점수를 합산함으로써 최소 0점(아무 증상 없는 상태)에서 최고 15점 (모든 항목의 증상이 심한 상태) 사이의 평가 점수를 부여한다.
피부상태는 실험 종료 직후 디지털카메라 (Canon, Tokyo, Japan)를 사용하여 사진을 찍어 조사하였다.
6. 가려움증 억제력 평가
EBI 투여가 아토피성 피부염으로 인한 가려움 억제력을 평가하기 위해 실험 종료 전날에 scratching behavior를 측정하였다. 마우스는 개체 별로 격리되어 관찰되었으며, 마우스의 뒷발이 등 부위로 올라갔다 바닥에 내려올 때까지의 행동을 1번의 횟수로 평가 하였다. 또한 연속동작은 1회로 간주하였고, 잠시라도 중단 후 다시 긁는 경우는 각각을 횟수에 포함하였다.
7. 조직학적 검사
1) Hematoxylin & Eosin 염색법
알레르겐의 피부노출에 의하여 유도되는 염증 반응을 확인하기 위하여 Hematoxylin & Eosin 염색법으로 형태학적 분석을 실시하였다. 실험 종료 후 실험동물의 등 조직을 10% Neutral Buffered Formalin (NBF)에 고정하고, 저농도에서부터 고농도 에탄올 용액으로 단계적인 탈수 과정을 거친 뒤 파라핀 블록을 제작하였다. 각 조직 블록을 5 μm의 두께로 박절하여 슬라이드에 조직 절편을 붙인 후, 각 조직 슬라이드를 xylene으로 탈파라핀을 한 뒤에 알코올에 함수시켰다. Hematoxylin 시약을 슬라이드에 1분, Eosin 시약은 3분 처리하여 염색하였으며, 염색이 끝나고 탈수시켜 봉입하고 광학현미경 (DM750, Leica, Wetzlar, Germany)을 이용해 관찰하였다.
2) Toluidine blue 염색법
Toluidine blue 염색을 통해 채취한 생쥐의 귀 조직에 탈과립된 비만세포 수를 측정하기 위해 10% NBF에 조직을 고정한 후에 파라핀 블록을 제작하였다. 각 조직 블록은 5 μm의 두께로 절편을 만들어, 탈파라핀 과정과 알코올에 함수과정을 거쳐서 증류수로 세척하였다. 세척이 완료된 절편은 1시간 동안 toluidine blue (pH 0.5)로 염색한 후 3~4회 증류수로 세척하였다. 이후 탈수와 투명과정을 거쳐 봉입한 후 광학현미경(DM750, Leica, Wetzlar, Germany)으로 탈과립된 비만세포의 수를 측정하였다.
3) 면역 조직 화학 염색법
마우스 피부조직을 10% NBF로 고정한 후 파라핀 블록으로 제작하였다. 각 조직 블록을 5μm의두께로 박절하여 슬라이드에 조직절편을 붙인 후, 각 조직 슬라이드를 xylene으로 탈파라핀을 한 뒤에 알코올에 함수시킨 후 5% normal serum에 1시간 동안 blocking하였다. 그 후 슬라이드를 피부장벽 개선 filaggrin, loricrin, involucrin, occludin, TRPA1, 및 PGP9.5 항체로 각각 4 ℃에서 overnight 처리하였다. PBST로 세척 후, 2차 항체인 biotinylated rabbit anti-goat IgG (1:100, Santa Cruz Biotec)에 실온에서 24시간 반응시켰고, avidin-biotin complex kit (Vector Lab, USA)에 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 0.05% 3,3'-diaminobenzidine과 0.01% HCl이 포함된 0.05 M tris-HCl 완충용액(pH 7.4)에서 발색시킨 후, hematoxylin으로 대조염색 하였다. Anti-TRPA1 및 anti-PGP9.5는 FITC가 결합된 2차 항체와 함께 1시간 동안 처리하였다. 형광 이미지는 Confocal microscopy (LSM 700, ZEISS, Jena, Germany)을 사용하여 획득하였다.
8. 혈중 총 IgE 측정
채혈한 생쥐의 혈액 1.5 mL를 tube에 담아 4 ℃, 3,000 rpm에서 30분 간 원심 분리하였다. 원심분리 후 상등액은 측정 전까지 -70 ℃에 보관하였다. 혈중 IgE는 효소결합면역흡착법 (Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)을 이용하여 측정하였다. Mouse IgE ELISA Set (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)을 이용하여 각 시료를 1차 항체가 처리된 96-well plate에 넣은 후 working solution으로 4회 세척하였다. 세척 후 2차 항체인 HRP-conjugated goat anti mouse IgE (1:10,000)에 1시간 동안 처리한 다음 color development reagent로 발색하였다. 발색완료 후 stop solution으로 반응을 중지시킨 후 ELISA를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
9. ELISA
혈청 및 림프 내 사이토카인 (IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-17, TNF-α, CCL2) 분석을 위해 분리된 혈청 및 림프에서 Quansys Q-Plex™ mouse cytokine array (DonginBio, Seoul, Korea)를 사용하여 각 사이토카인 함량을 분석하였다. plate에 capture 항체를 코팅 버퍼 (0.1 M sodium Carbonate, PH9.5)에 희석시켜 실링 테이프로 밀봉하여 4 ℃에서 하룻밤 동안 부착시켰다. 200㎕의 assay diluent를 각 well에 분주하여 1시간 동안 plate shaker에서 blocking하고 농도 별 사이토카인 표준액과 혈청을 각 well에 100 ㎕씩 분주하고 다시 2시간 동안 실온에서 반응시켰다. 반응이 끝나고 검출 항체 용액을 100 ㎕씩 분주하여 1시간, 그 후 Avidin-HRP solution을 30분 반응시켰다. 마지막 세척 과정을 제외한 각 단계 사이의 모든 plate의 세척은 wash buffer (0.05 % PBS-Tween 20)를 이용하여 4회 실시하였다. 최종 세척은 wash buffer를 이용하여 5회 실시하였으며, 세척이 끝나고 발색을 위해 100㎕의 TMB substrate를 각 well에 분주하고 20분 동안 반응 시켰다. stop solution (2NH2SO4)을 100 ㎕ 분주하여 반응을 종료시킨 후 microplate reader를 이용하여 450 nm 파장의 흡광도를 측정한 값으로 각 사이토카인의 함량을 분석하였다.
혈청은 1/2로 희석시켰으며 림프는 상층액을 수집하여 multiplex array를 제조자의 지시에 따라 수행하였다. 50㎕의 항원 표준 또는 샘플을 duplicate로 각 well에 분주하였다. 1시간 인큐베이션한 후, 플레이트를 세척 완충액(wash buffer)으로 세척하고, 검출 혼합물 (detection mix)과 함께 1시간 동안 배양하고, straptavidin-HRP 1X로 15분 동안 실온에서 반응시켰다. Well을 세척 후에 기질 A와 B를 첨가 하고 플레이트의 이미지를 ChemiDoc XRS 시스템 (Bio-Rad Laboratories)으로 측정하고 Quansys 이미지 분석 소프트웨어로 분석했다. 사이토카인 데이터를 표준화하기 위해, Qubit® 2.0 형광 측정기 (LifeTechnologies) 상의 Qubit® 단백질 분석 키트를 사용하여 단백질 농도를 결정하였고, 사이토카인 수준을 총 단백질의 pg / ㎖로 나타내었다.
10. RNA 추출 및 Real-time PCR
아토피피부염에 관여하는 사이토카인의 유전자 발현 변화를 real-time PCR을 이용하여 비교 분석하였다. 총 RNA는 Tri-RNA Reagent (Favorgen biotech, Taiwan)을 사용하여 분리된 피부조직 및 배양된 세포로부터 추출하였다. 전체 RNA 주형으로부터 단일 가닥 cDNA 합성은 PrimeScript TM RT Master Mix (Takara, Tokyo, Japan)로 수행하였다. 생성된 cDNA를 CFX-96 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)과 함께 qPCR 2x PreMIX SYBR (Enzynomics, Seoul, Korea)을 사용하여 real time PCR을 실시하였다. 모든 유전자를 증폭하는데 사용된 PCR은 95℃에서 10분 간 denaturation 과정을 거친 후, 40 cycle (95℃ 10초, 60℃ 15초, 72℃ 30초) 의 조건으로 수행되었다. 총 40회 실시하였다. 발현 데이터는 ΔCt 정량화 방법을 사용하여 사이클 임계치 (Ct) 값으로 계산하였다. GAPDH를 이용하여 정량화 하였다.
11. 면역블롯 분석(Immunoblot assay)
분리된 피부조직을 PRO-PREP (iNtRON, Seongnam, Korea)에 용해시킨 후, 14,000 g에서 20분간 원심 분리하여 상층액을 실험에 사용하였다. 단백질 농도는 BCA kit (Fisher Scientific, hampton, NH, USA)를 사용하여 정량 하였다. 분리된 상층액 (총 단백질량 30 ㎍)을 8~12 % gel SDS-PAGE를 이용하여 전기영동으로 분리된 단백질은 PVDF membrane (Millipore, Danvers, MA, USA)에 transfer하였다. Transfer된 PVDF membrane을 5 % 탈지분유에 1시간 동안 blocking 한 다음 1차 항체 (filaggrin, loricrin, involucrin, PAR2, TSLP, TSLPR, TRPA1, β-actin)를 membrane과 4℃에서 12시간 동안 반응시키고. TBST로 세척한 후 1차 항체에 대한 특이적 2차 항체를 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. Membrane 세척 후 ECL용액 (Millipore)으로 발색 후 ChemiDoc™ XRS +System (Bio-RAD, Hercules, CA, USA)을 이용하여 측정하였다.
12. 통계분석
실험 결과는 mean ± standard error mean (S.E.M) 으로 나타내었고, 유의성 검정은 One way analysis of variance (ANOVA)로 수행하였으며, 집단 간 사후검정은 Turkey's HDS법을 이용하였으며 P값이 0.05 이하를 통계학적으로 유의한 것으로 간주하였다.
실험결과
1. 배양 기간에 따른 세포 표현형 평가
실시예에 따른 세포 조성물의 세포 표현형을 확인하기 위하여, 각 배양 기간별 세포의 샘플을 일부 채취하여 표현형을 분석하였고, NKG2A, NKG2D 항체를 사용하였다.
그 결과는 도 2 및 도 3에 나타내었다.
인터페론-감마를 발현하는 세포(IFN-γ(+) cell, IFN-γ releasing cell)의 비율은 하기 표 1에 나타내었다.
Day 0 7 10 14 21 28
% 18.38 74.31 75.50 72.04 89.52 67.13
NKG2D를 발현하는 세포(NKG2D(+) cell)의 비율은 하기 표 2에 나타내었다.
Day 0 7 10 14 21 28
% 39.21 36.30 45.98 84.19 93.04 85.17
NKG2A를 발현하는 세포(NKG2A(+) cell)의 비율은 하기 표 3에 나타내었다.
Day 0 7 10 14 21 28
% 9.22 33.13 34.64 41.86 33.48 34.78
IL-4를 발현하는 세포(IL-4(+) cell)의 비율은 하기 표 4에 나타내었다.
Day 0 7 10 14 21 28
% 1.51 3.58 5.78 2.33 4.78 3.97
IL-13을 발현하는 세포(IL-13(+) cell)의 비율은 하기 표 5에 나타내었다.
Day 0 7 10 14 21 28
% 0.94 2.71 5.43 3.77 4.22 3.59
표 1 내지 표 5를 참조하면, EBI는 인터페론-감마 및 NKG2D를 발현하는 세포의 비율이 매우 높으며, IL-4 및 IL-13을 발현하는 세포의 비율이 낮아 아토피 피부염 예방 및 치료에 효과적임을 알 수 있다.
2. 인터페론-감마 생산량 측정
도 4 및 하기 표 6은 배양 기간에 따른 세포 외 인터페론-감마 분비 누적양을 측정한 것이다. 배양기간에 따라 분비량이 증가하는 것을 알 수 있다.
Day 0 7 10 14 21 28
㎍ 0.00 15.23 68.64 86.15 367.97 331.67
3. 사이토카인 분석
본 발명의 세포 조성물의 배양 기간별 분비하는 특정 활성인자들 분비양 변화를 측정하였다(도 5).
면역세포 이동 및 활성에 관여하는 다양한 면역인자들의 수치가 1000배 이상 증가하였고, 7일 이후 IL8, IL16, IL18 분비가 급격히 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 본 발명의 세포 조성물은 면역활성 세포분비인자의 분비 증가를 통해 아토피 피부염에서 일반적으로 알려져 있는 과활성화된 Th2세포(면역억제담당)를 억제할 수 있는 환경을 유도할 수 있으며, 아토피 피부염 약효가 있을 것으로 판단되었다.
4. RNA sequencing
아토피 면역세포 활성 3일, 7일, 14일에 6개의 유전자(Ksp37, GLNY, CD74, HCST, ZBP1, CCL5)를 날짜별 발현양을 확인하였다(도 6 및 7),
특히 GLNY는 EBI에서 14일 째에 60배 이상이 증가함을 알 수 있었다. EBI는 상기 유전자들을 과발현함으로써 면역활성을 유도하여 아토피 피부염을 개선할 수 있다.
표 7 및 표 8은 각각 Ksp37, GLNY, CD74의 날짜별 발현양에 대한 RNA sequencing 및 Real time PCR 결과이다.
표 9 및 표 10은 각각 HCST, ZBP1, CCL5의 날짜별 발현양에 대한 RNA sequencing 및 qPCR 결과이다.
KSP37 GNLY CD74
Normal EBI 3day 1 1 1
AD EBI 3day 0.81 0.25 0.22
AD EBI 7day 3.93 6.70 4.21
AD EBI 14day 14.79 61.61 7.41
KSP37 GNLY CD74
Normal EBI 3day 0.013 0.042 0.012
AD EBI 3day 0.046 0.021 0.058
AD EBI 7day 0.038 0.032 0.018
AD EBI 14day 0.044 0.065 0.060
DAY3 DAY7 DAY14
CCL5 0.780 1.731 11.304
ZBP1 0.858 1.417 11.399
HCST 0.839 1.498 4.491
DAY3 Normal DAY3 DAY7 DAY14
CCL5 1 0.233990063978693 2.89226076232993 19.1779129711944
ZBP1 1 0.92965471902282 0.808622145717317 5.2267601934814
HCST 1 0.302538103781026 3.15134111406133 8.7150560904635
5. 오발부민 (OVA)로 유도된 아토피피부염 개선에 대한 EBI의 효과
BALB/c 마우스를 대상으로 OVA 피부감작으로 아토피피부염 유사병변이 유발된 마우스에 EBI (1x10 6 cells/head)를 6주 간 정맥주사하여 아토피성 피부염의 개선에 대한 효능을 확인하였다.
도 8과 같이 EBI를 투여한 군에서 피부병변 형태, 피부두께 등 아토피피부염의 임상적 특징이 개선되는 우수한 효과를 보였다.
정상마우스에 비하여 OVA로 유발된 대조군의 경우 피부장벽 붕괴 및 염증을 동반한 피부학적 증상 (건조, 홍반, 짓무름, 부종/혈종, 태선)과 표피두께가 심화된데 비해서 EBI를 투여한 실험군에서 증상들이 개선되는 효과를 보였다 (도 8A 내지 8D). 이러한 평가 후 피부조직학적 개선효과를 알아보기 위하여 H&E로 피부조직을 염색하여 현미경으로 검경한 결과 OVA로 유발된 대조군은 정상군에 피해서 표피 두께와 피부장벽붕괴가 매우 증가되었다. 표피(epidermis)와 진피(dermis)가 부종으로 현저하게 확장되었고, epidermis의 탈락과 두께의 두꺼워짐을 확인할 수 있었다. 그러나 EBI를 투여한 군에서는 대조군에 비해서 피부조직학적 특징이 개선되는 효과를 보였다. 과각화증(hyperkeratosis), 이상각화증(parakeratosis)은 전반적으로 감소하였고, 표피(epidermis)의 두께도 줄어듬으로써 표피과다형성 (hyperplasia) 및 표피해면화 (spongiosis)도 줄어들었다. 또한 염증성 반응으로 두꺼워진 진피(dermis)의 두께도 얇아졌고, 퇴화되었던 모낭도 새로 형성되고 있음을 알 수 있다 (도 8A, 8B).
또한 EBI를 투여한 군에서 대조군에 비해 아토피피부염의 심각성 정도(AD severity score)가 개선되었으며 (도 8C), 긁는 행동이 상대적으로 감소하면서 소양감이 현저히 감소하였다 (도 8D). 몸무게 변화를 측정하여 동물에 미치는 영향을 관찰한 결과, EBI 투여는 마우스의 체중에 영향을 주지 않았다 (도 8E).
6. 오발부민 (OVA)로 유도된 아토피피부염 피부장벽 개선에 대한 EBI의 효과
표피수분손실량 (TEWL)이 EBI의 투여로 인해 상당히 개선되는 것을 확인하였다 (도 9A). 또한 표피세포의 과다증식의 변화를 보기 위해 keratin 1 (K1) 유전자의 발현변화를 측정한 결과 EBI가 투여된 마우스에서 뚜렷한 감소를 보였다 (도 9B). 즉, EBI가 OVA 유도에 의한 아토피-유사병변에서 표피세포의 증식능을 억제시키는 효과를 가지고 있음을 보인다. 그리고 피부장벽 개선의 효과를 측정하기 위해 피부장벽을 구성하고 있는 단백질들의 변화를 관찰하였다. 아토피피부염이 발생하면 피부장벽을 구성하는 단백질들이 발현이 줄어들고 결국 장벽손상이 발생되며 수분손실과 항원 (allergen)에 의한 침투, 감염 위험이 증가하게 된다. Filaggrin, involucrin, loricrin은 피부표피층을 구성하고 있는 주요단백질로서 피부장벽개선에 중요하다. 또한 occludin은 tight junction 단백질중의 하나로써 아토피피부염과 같은 피부질환에서 감소하게 된다. EBI의 투여로 인해 OVA로 유발된 아토피피부염 유사병변이 개선되면서 이들 단백질의 발현이 증가함을 확인하였다 (도 9B 내지 9D). EBI의 투여는 CsA 투여와 더불어 건조증상을 개선시켰으며 피부장벽을 보호함으로써 효과적으로 아토피피부염 증상을 완화시키는 것으로 사료된다.
7. 오발부민 (OVA) 으로 유도된 염증반응 억제에 대한 EBI의 효과
Toluidine blue 염색을 통해 비만세포(mast cell) 등 염증반응과 관계된 현상을 조직에서 검푸른 부분으로 확인할 수 있었다(도 10A). OVA 유도 후 7주차(49일)의 조직을 확인한 결과, OVA군에서 dermis 주변에 비만세포가 많이 침윤되어 있고, epidermis의 두께도 두꺼워져 있는 반면, EBI투여군은 대조군에 비하여 비만세포 침윤이 감소되어 있는 것이 관찰되었다(도 10A 및 10B).
또한, OVA유도 아토피피부염 모델에서 OVA 감작군의 혈청 total IgE 농도(647.5ng/mL)는 정상대조군(NOR, 220.0ng/mL)에 비하여 크게 증가하였다. 이러한 IgE의 증가는 CsA와 EBI 투여에 의해 각각 328.0ng/mL과 320.5 ng/mL의 수준으로 유의하게 감소하면서 유의한 효과를 보였다(도 10C 및 10D).
8. 오발부민 (OVA) 으로 유도된 사이토카인 발현억제에 대한 EBI의 효과
EBI-M의 알레르기 피부반응 및 IgE 억제 효과가 Th2 면역반응과 관련이 있는 지 확인하기 위해 OVA에 감작된 마우스로부터 피부조직을 분리하여 Th2 사이토카인의 mRNA 발현수준을 확인하였다. 실험결과, NOR군에 비해 OVA 처리군에서 Th2 분화유도 사이토카인 TSLP, IL-25, IL-33과 Th2 및 Th17 관련 사이토카인의 발현이 현저하게 증가하였다. 반면에 CsA 및 EBI 투여 마우스에서는 IL-4가 46.8%, IL-13이 47.3%, TSLP가 53.1%, IL-33이 49.2%가 감소하는 등 유의적으로 억제되었다. 양성대조군인 CsA처리군도 각각 33.6, 35.4, 45.8, 57.9% 감소하여 Th2 사이토카인을 억제함을 보여주었다(도 11A). 또한, 혈청 및 림프에 존재하는 염증성 사이토카인의 분석결과 IL-1β, IL-4, IL-5, TNF-α, IL-17, IL-6, 및 CCL2(MCP-1)가 EBI 투여에 의해 상당히 줄어들었다(도 11B 및 11C). 따라서 EBI는 Th2 세포 관련 사이토카인의 발현을 억제시켜주며, 비만세포 침윤 및 IgE 생성 억제등을 통해 아토피피부염 증상을 완화시키는 것으로 사료된다.
9. 오발부민 (OVA) 으로 인한 소양증 개선에 대한 EBI의 효과
OVA로 유발시킨 아토피피부염 유사병변 피부에서 소양증의 개선에 EBI의 효과를 관찰하기 위해 소양증에 관여된다고 알려진 다양한 사이토카인 및 인자들의 발현을 조사하였다. EBI를 투여한 마우스에서 IL-31 signaling에 관련된 유전자들의 발현이 줄어드는 것을 볼 수 있다(도 12A). 또한, 가려움증 자극은 히스타민-의존경로와 히스타민-비의존경로 2가지로 나뉘는데 EBI의 투여의 결과로 H1R, TRPV1, TRPA1, TGF5, NK1R, MrgpA3, 및 TSLP, TSLPR 등 가려움증 자극signaling에 관련된 유전자들의 발현이 현저히 감소됨을 확인하였다(도 12A). 이 결과는 단백질 발현수준에서도 확인이 되었다(도 12B).
TSLP 또한 아토피피부염과 연관된 가려움증 매개체로 히스타민-비의존적경로에 의해 가려움증이 유발된다. TSLP는 c신경섬유에 칼슘을 축적하는데 이때 TRPA1의 활성화가 요구되며, 신경의 활성화는 가려움증을 유발한다. EBI의 투여는 이러한 피부 표피내의 신경섬유에 TRPA1의 발현을 줄어들게함으로써 소양감을 감소시켜주고 있음을 확인하였다(도 12C). 또한 TRPA1 면역반응 신경세포수의 감소와 일치하게 피부에서 PGP9.5에 면역반응을 보이는 신경섬유의 분포가 대조군에 비해 EBI를 투여한 군에서 현저히 감소되었다(도 12C).
10. PBMC 투여군과 EBI 투여군 간의 비교
OVA유도 아토피피부염 모델을 대상으로 EBI의 경우, 세포수 1x10 6/head를 주 1회, 총 6회 정맥을 통해 투여하였다. S.C그룹의 경우 1x10 6/head을 주 1회, 총 6회 피하를 통해 투여하였다. PBMC의 경우 1x10 6/head을 주 1회, 총 6회 정맥을 통해 투여하였다.
(1) 아토피 피부염 개선 효과 확인
그 결과는 도 13에 나타내었다.
인터페론-감마를 분비하지 않는 PBMC 투여군과 비교해서 인터페론-감마 및 NKG2D 발현율이 높은 EBI 투여군에서 피부 개선 효과가 뛰어남을 알 수 있다.
(2) 세포 조성물 투여에 따른 체중 변화 확인
그 결과는 도 14에 나타내었다. 모든 실험군에서 눈에 띄는 체중 변화는 없었다.
(3) 세포 조성물 투여에 따른 경피 두께 감소 효과 확인
그 결과는 도 15 및 16에 나타내었다. PBMC 투여군과 비교하여 인터페론-감마 및 NKG2D 발현율이 높은 EBI 투여군의 모든 투여경로에서 경피두께가 감소하였다.
(4) 염증반응 감소 효과 확인
그 결과는 도 17 및 18에 나타내었으며, 인터페론-감마를 분비하지 않는 PBMC 투여군과 비교해서 인터페론-감마 및 NKG2D 발현율이 높은 EBI 투여군의 모든 투여경로에서 비만세포가 감소하여 염증반응이 감소되었다.
(5) 혈액 내 IgE 감소 확인
그 결과는 도 19와 같다. 인터페론-감마를 분비하지 않는 PBMC 투여군과 비교해서 인터페론-감마 및 NKG2D 발현율이 높은 EBI 투여군의 모든 투여경로에서 IgE가 감소되었다.
(6) 피부 조직 내 아토피피부염 관련 사이토카인 및 가려움증(itching) 관련 유전자의 발현 분석
그 결과 PBMC 투여군과 비교하여 인터페론-감마 및 NKG2D 발현율이 높은 EBI 투여군의 모든 투여경로에서 염증성 사이토카인 및 가려움증 관련 유전자 발현이 감소하였으며, 1x10 6개의 세포를 포함하는 EBI 투여군에서 가장 효과적임을 알 수 있다(도 20). 또한, 인터페론-감마는 림프절 내에서 높은 분비량을 나타내었다(도 21)

Claims (14)

  1. 인간의 말초혈액으로부터 단핵구 및 자가혈장을 각각 분리하여 수득하는 단계;
    항-CD3 항체로 세포 배양용기를 코팅하는 단계; 및
    상기 단핵구를 상기 세포 배양용기에 접종하여 IL-2, IL-12 및 IL-18로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 배지에서 배양하는 단계;를 포함하는 인터페론-감마 발현 세포의 비율이 60% 이상인 세포 조성물의 제조 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물 내 NKG2D 발현 세포의 비율이 60% 이상인, 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 KSP37(Killer-specific secretory protein of 37 kDa), GNLY(Granulysin), CD74(Cluster of Differentiation 74), ZBP1(Z-DNA-binding protein 1), CCL5(C-C chemokine receptor type 5) 및 HCST (Hematopoietic Cell Signal Transducer)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 말초혈액단핵구(PBMC) 대비 5배 이상 발현되는 것인, 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 배양은 3단계 이상으로 수행되며,
    1단계 배양은 상기 단핵구를 항-CD3 항체가 코팅된 세포 배양용기에 접종하여 IL-2, IL-12 및 IL-18를 포함하는 배지를 첨가하여 배양하고,
    2단계 배양은 상기 1단계 배양물을 항-CD3 항체가 코팅되지 않은 세포 배양용기에 옮겨 IL-2를 포함하는 배지를 첨가하여 배양하며,
    3단계 배양은 상기 2단계 배양물을 IL-2, IL-12 및 IL-18를 포함하는 배지에서 배양하는 것인, 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 항-CD3 항체의 농도는 1 내지 10 ㎍/㎖이고, IL-2는 800 내지 1200 IU/mg, IL-12는 2 내지 6 ng/㎖, IL-18은 20 내지 60 ng/㎖인, 방법.
  6. 인간 말초혈액 단핵구의 배양물인 이종 세포 혼합물로서, 총 세포 중 인터페론-감마 발현 세포의 비율이 60% 이상인. 세포 조성물.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 세포 조성물은 총 세포 중 인터페론-감마 발현 세포의 비율이 80% 이상인, 세포 조성물.
  8. 청구항 6에 있어서, 상기 세포 조성물은 총 세포 중 NKG2D 발현 세포의 비율이 60% 이상인, 세포 조성물.
  9. 청구항 6에 있어서, 상기 조성물은 KSP37(Killer-specific secretory protein of 37 kDa), GNLY(Granulysin), CD74(Cluster of Differentiation 74), ZBP1(Z-DNA-binding protein 1), CCL5(C-C chemokine receptor type 5) 및 HCST (Hematopoietic Cell Signal Transducer)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 말초혈액단핵구(PBMC) 대비 5배 이상 발현되는 것인, 세포 조성물.
  10. 청구항 6에 있어서, 상기 세포 조성물은 총 세포 수가 1 x 10 8 내지 1 x 10 10개인, 세포 조성물.
  11. 청구항 6에 있어서, 상기 세포 조성물은 인간의 말초혈액으로부터 분리한 단핵구를 항-CD3 항체, IL-2, IL-12 및 IL-18로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 배지에서 배양하여 얻어진 것인, 세포 조성물.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 배양은 3단계 이상으로 수행되며,
    1단계 배양은 상기 단핵구를 항-CD3 항체가 코팅된 세포 배양용기에 접종하여 IL-2, IL-12 및 IL-18를 포함하는 배지를 첨가하여 배양하고,
    2단계 배양은 상기 1단계 배양물을 항-CD3 항체가 코팅되지 않은 세포 배양용기에 옮겨 IL-2를 포함하는 배지를 첨가하여 배양하며,
    3단계 배양은 상기 2단계 배양물을 IL-2, IL-12 및 IL-18를 포함하는 배지에서 배양하는 것인, 세포 조성물.
  13. 청구항 11에 있어서, 상기 항-CD3 항체의 농도는 1 내지 10 ㎍/㎖이고, IL-2는 800 내지 1200IU/mg, IL-12는 2 내지 6 ng/㎖, IL-18은 20 내지 60 ng/㎖인, 세포 조성물.
  14. 청구항 6 내지 13 중 어느 한 항의 세포 조성물을 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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