WO2020188136A1 - Panel de citoquinas/quimiocinas para el diagnóstico diferencial en el síndrome vestibular episódico - Google Patents

Panel de citoquinas/quimiocinas para el diagnóstico diferencial en el síndrome vestibular episódico Download PDF

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WO2020188136A1
WO2020188136A1 PCT/ES2020/070193 ES2020070193W WO2020188136A1 WO 2020188136 A1 WO2020188136 A1 WO 2020188136A1 ES 2020070193 W ES2020070193 W ES 2020070193W WO 2020188136 A1 WO2020188136 A1 WO 2020188136A1
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ccl22
ccl3
cxcl1
disease
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PCT/ES2020/070193
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José Antonio LÓPEZ ESCÁMEZ
Marisa FLOOK PEREIRA
Lidia FREJO NAVARRO
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Servicio Andaluz De Salud
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/545—IL-1
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/49—Blood

Definitions

  • the present invention is within the field of biomedicine and biotechnology, and refers to the use of pro-inflammatory cytokines as a diagnostic marker in episodic vestibular syndrome, and especially refers to a method for the classification of patients presenting with episodic vestibular syndrome with migraine and / or hearing loss, and specifically the differential diagnosis of vestibular migraine and Meniere's disease.
  • VM Vestibular Migraine
  • MS Meniere's Disease
  • a cluster analysis carried out in a group of patients with MS identified 5 subgroups of patients with unilateral and bilateral MS, according to the presence / absence of an autoimmune disease, migraine, heredity and the type of onset of the disease. This suggests that there could be different cellular and / or molecular mechanisms at the base of the development of the disease, being the theories genetic, autoimmune or allergic the most accepted currently.
  • a subgroup of MS patients with elevated proinflammatory cytokine levels was identified, particularly I L-1 b.
  • MS The treatment of MS is symptomatic and its objective is to reduce the frequency and severity of vertigo crises, minimally impacting the auditory function, being desirable also an improvement in hearing and tinnitus.
  • Treatment recommendations for MS are primarily lifestyle changes, such as reducing caffeine, alcohol, and tobacco use and adopting a low-salt diet.
  • vestibular rehabilitation and psychotherapy may also be used as a first line of treatment.
  • drug treatment the first option is the use of diuretics and betahistine. When this therapeutic line does not work, intratympanic injections of spheroids can be done.
  • Fig. 1 Interleukin 1 b levels in mononuclear cell supernatant from Meniere's disease patients and Vestibular Migraine patients after in vitro mononuclear cell assay.
  • Fig. 2 CCL22 levels in mononuclear cell supernatant from Meniere's disease patients and Vestibular Migraine patients after in vitro mononuclear cell assay.
  • Fig. 3 CCL3 levels in mononuclear cell supernatant from Meniere's disease patients and Vestibular Migraine patients after in vitro mononuclear cell assay.
  • Fig. 4 CXCL1 levels in mononuclear cell supernatant from Meniere's disease patients and Vestibular migraine patients after in vitro mononuclear cell assay.
  • Table 1 Summary of the different multivariate or univariate models using the cytokines: IL-Ib, CCL22, CCL3 and CXCL1.
  • I L-1 b, CCL22, CCL3 and CXCL1 are useful markers to differentiate a disease that presents with episodic vestibular syndrome (vertigo attacks) with migraine symptoms (headache and / or sensory aura) and / or Sensorineural hearing loss, preferably MS and MV.
  • MS can present migraine symptoms, including headache
  • MV can present sensorineural hearing loss, being indistinguishable in the early stages of the disease.
  • a first aspect of the invention refers to the use of IL-Ib, CCL22, CCL3 and CXCL1, or any of their combinations, to obtain useful data for the diagnosis of a disease that presents with episodic vestibular syndrome.
  • said markers are used simultaneously.
  • the disease associated with vestibular syndrome is Vestibular Migraine (VM).
  • a disease that occurs with episodic vestibular syndrome is understood to be one in which the patient presents recurrent signs and symptoms that indicate an alteration in vestibular function, such as vertigo, ataxia, imbalance, nystagmus or oscillopsia. These symptoms can be associated with auditory symptoms or headaches of various origins.
  • Macheére's disease is understood to be the syndrome characterized by unilateral or bilateral sensorineural hearing loss that affects low frequencies and mean ( ⁇ 2000Hz) and associated with episodes of vertigo and auditory symptoms, such as tinnitus, or otic fullness.
  • Vestibular Migraine is understood to be the syndrome characterized by a history of migraines with or without aura and the occurrence of migraine symptoms (photophobia, phonophobia, headache and / or aura) in at least 50% of vertigo episodes.
  • IL-Ib, CCL22, CCL3, and CXCL1 are pro-inflammatory cytokines
  • cytokines IL-Ib, CCL22, CCL3 and CXCL1 refers to any form, and preferably, to the determination of their expression product, be it the determination of nucleic acids or proteins. More preferably the expression product is determined in the form of proteins.
  • the determination of pro-inflammatory cytokines is carried out in vitro in human mononuclear cells.
  • MS can present migraine symptoms, including headache, and MV can present sensorineural hearing loss, being indistinguishable in the early stages of the disease.
  • IL-Ib the determination of IL-Ib, CCL22, CCL3 and CXCL1 allows the differential diagnosis between MS and MV:
  • IL-Ib IL-Ib
  • CCL22 CCL3 and CXCL1
  • MV MV
  • the expression levels of the genes will give a certain profile of gene expression.
  • level “expression level”, also called “gene product quantity” refers to the biochemical material, be it RNA or protein, resulting from the expression of a gene. Sometimes a measure of the amount of gene product is used to infer how active a gene is.
  • gene expression profile is understood the gene profile obtained after quantifying the mRNA and / or protein produced by the genes of interest or biomarkers, that is, by the genes used as biological markers in the present invention, in a sample isolated biological.
  • the gene expression profile is preferably carried out by determining the level of mRNA derived from their transcription, after extracting the Total RNA present in the isolated biological sample, which can be done using protocols known in the state of the art.
  • the determination of the level of mRNA derived from the transcription of the genes used as biological markers in the present invention can be carried out, for example, but not limited to, by amplification by polymerase chain reaction (PCR), reverse transcription in combination with polymerase chain reaction (RT-PCR), quantitative RT-PCR (qPCR), reverse transcription in combination with ligase chain reaction (RT-LCR), or any other nucleic acid amplification method; serial analysis of gene expression (SAGE, SuperSAGE); DNA chips made from oligonucleotides deposited by any mechanism; DNA microarrays made with oligonucleotides synthesized in situ by photolithography or any other mechanism; in situ hybridization using specific probes labeled with any labeling method; using electrophoresis gels; by membrane blotting and hybridization with a specific probe; by nuclear magnetic resonance or any other diagnostic imaging technique using paramagnetic nanoparticles or any other type of detectable nanoparticles functionalized with antibodies or by any other means.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the gene expression profile could also be obtained by detecting and / or quantifying the proteins produced by the translation of the mRNA derived from the transcription of the genes used as biological markers in the present invention, through, for example, but not limited to, immunodetection by western blot.
  • the quantitative detection of the expression of the genes used as biological markers in the present invention can more preferably be carried out by means of real-time PCR (RT-PCR or RTqPCR). Real-time detection of amplified products can be carried out by using fluorescent molecules that are intercalated in double-stranded DNA or by hybridization with different types of probes.
  • the level or levels of proteins are detected, it can be done, as in the case of genes, by any of the techniques known to those skilled in the art.
  • the detection of the expression levels is carried out by an immunological technique.
  • the immunological techniques are based on precipitation reactions, agglutination, immunolabeling, radioimmunoassay and radioimmunometric techniques, preferably ELISA (Enzyme Linked ImmunoadSorbent Assay), or Western blot or in any of their combinations.
  • diagnostic refers to the greater or lesser risk of suffering Vestibular Migraine or the greater or lesser risk of suffering from Meniere's Disease.
  • the confidence intervals are at least 90%, at least 95%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%.
  • the p-value is less than 0.05, 0.01, 0.005, or 0.0001.
  • the present invention makes it possible to correctly detect predisposition to disease or disease differentially by at least 60%, more preferably at least 70%, much more preferably at least 80%, or still much more preferably in at least 90% of the subjects of a certain group or population analyzed.
  • 'V.-7/3 (also called in the literature Interleukin 1 beta IL-1; IL1 F2; IL1-BETA) refers to both the human gene and protein. It is a cytokine that is a very important mediator in the inflammatory response, and is involved in a wide variety of cellular activities, including cell activation, proliferation, differentiation and apoptosis. The increase in the production of this cytokine is observed in different autoimmune / autoinflammatory diseases such as autoimmune disease of the inner ear, Muckle Wells syndrome, type 1 diabetes, and inflammatory arthritis.
  • IL-7/3 is also defined by a sequence of nucleotides or polynucleotides, which constitutes the sequence "IL-Ib", and which would comprise various variants derived from: a) nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2,
  • nucleic acid molecules whose complementary hybrid strand with the polynucleotide sequence of a),
  • nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code
  • nucleic acid molecules that encode a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 2 in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the IL-1b protein.
  • SEQ ID NO: 1 Other possible nucleotide sequences encoding COL1A2 include, but are not limited to, SEQ ID NO: 1.
  • CCL22 (also called in the literature CC motif chemokine ligand 22, MDC; ABCD-1; SCYA22; STCP-1; DC / B-CK; A-152E5. 1) refers to both the gene and the protein human.
  • This cytokine or chemokine also designated MDC (macrophage-derived chemokine)
  • MDC macrophage-derived chemokine
  • This protein is important in the trafficking of activated T lymphocytes in inflammatory foci.
  • An increase in CCL22 has already been associated with allergy and skin inflammatory responses.
  • an overexpression of CCL22 in pancreatic b cells in type 1 diabetes has a protective role, since it prevents an autoimmune attack with the recruitment of Treg cells.
  • CTL22 is also defined by a sequence of nucleotides or polynucleotides, which constitutes the sequence "CCL22”, and which would comprise various variants derived from:
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4,
  • nucleic acid molecules whose complementary hybrid strand with the polynucleotide sequence of a) c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code
  • nucleic acid molecules that encode a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 4 in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the CCL22 protein.
  • SEQ ID NO: 4 Other possible nucleotide sequences encoding C3 include, but are not limited to, SEQ ID NO: 3.
  • CCL3 also called in the literature CC motif chemokine ligand 3, MIP1A; SCYA3; G0S19-1; LD78ALPHA; MIP-1-alpha refers to both the human gene and protein.
  • This monokine also designated MIP1A (Macrophage Inflammatory Protein 1 alpha)
  • MIP1A Macrophage Inflammatory Protein 1 alpha
  • CCL3 is crucial in the recruitment of macrophages and T lymphocytes to the foci of inflammation, orchestrating acute and chronic inflammatory responses. Therefore, it is important in the development of various inflammatory and autoimmune pathologies, such as rheumatoid arthritis, Sjógren's syndrome, sarcoidosis, and periodontitis.
  • CTL3 is also defined by a sequence of nucleotides or polynucleotides, which constitutes the sequence "CCL3”, and which would comprise various variants derived from:
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6,
  • nucleic acid molecules whose complementary hybrid strand with the polynucleotide sequence of a),
  • nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code
  • nucleic acid molecules encoding a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 6 in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the CCL3 protein.
  • SEQ ID NO: 6 Other possible nucleotide sequences encoding CCL3 include, but are not limited to, SEQ ID NO: 5.
  • CXCL also called in the literature CXC motif chemokine ligand 1, FSP; GR01; GROa; MGSA; NAP-3; SCYB1; MGSA-a
  • This chemokine promotes adhesion from neutrophils to endothelial cells and their subsequent migration to inflammatory foci. In addition, it has chemotactic activity or may act as an activating factor in basophils, eosinophils, monocytes, smooth muscle cells and lymphocytes. Elevated CXCL1 levels have already been reported in diseases such as type 2 diabetes and multiple sclerosis.
  • CXCL1 is also defined by a sequence of nucleotides or polynucleotides, which constitutes the sequence "CXCL1", and which would comprise various variants originating from:
  • nucleic acid molecules that encode a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8,
  • nucleic acid molecules whose complementary hybrid strand with the polynucleotide sequence of a),
  • nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and / or b) due to the degeneracy of the genetic code
  • nucleic acid molecules that encode a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 80%, 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 8 in which the polypeptide encoded by said nucleic acids possesses the activity and structural characteristics of the CXCL1 protein.
  • SEQ ID NO: 8 Other possible nucleotide sequences encoding CXCL1 include, but are not limited to, SEQ ID NO: 7.
  • a second aspect of the invention refers to a method for obtaining useful data for the diagnosis of a disease that causes episodic vestibular syndrome, hereinafter the first method of the invention, comprising:
  • step (b) comparing the levels of IL-Ib, CCL22, CCL3 and CXCL1 detected in step (a), with a reference sample.
  • biological sample refers to, but is not limited to, cells, tissues and / or biological fluids of an organism, obtained by any method known to a person skilled in the art; that is, any one selected from the group of body fluids or cells, or from a cell extract or the cell culture supernatant of said cells, and / or liquid biopsy (blood, serum, plasma, urine, ).
  • the isolated sample in step (a) is peripheral blood, and even more preferably are mononuclear cells obtained from peripheral blood.
  • a “reference sample”, as used herein, means a sample obtained from a group of healthy subjects who do not have a particular disease state or phenotype. Appropriate reference levels of gene expression can be determined by measuring the expression levels of such genes in various suitable subjects, and those reference levels can be adjusted to specific populations (for example, a reference level may be age-related, so that comparisons can be made between expression levels in samples of subjects of a certain age and reference levels for a particular disease, phenotype, or lack thereof in a given age group ). In a preferred embodiment, the reference sample is obtained from several healthy subjects or patients with no previous history of T2DM. One skilled in the art will appreciate that the type of reference sample may vary depending on the specific method to be performed.
  • the expression profile of the genes in the reference sample can preferably be generated from a population of two or more people.
  • the population for example, can contain 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 or more people.
  • the expression profile of the genes in the reference sample and in the sample of the person to be diagnosed according to the methods of the present invention can be generated from the same person, provided that the profiles are analyzed and the reference profile are generated from biological samples taken at different times and compared with each other. For example, a sample from an individual can be obtained at the beginning of a study period. A reference biomarker profile from this sample can be compared to biomarker profiles generated from subsequent samples from the same person.
  • the reference sample is a set of samples from various individuals.
  • the expression of a gene is considered increased in a sample of the subject under study when the levels of increase with respect to the reference sample are at least 5%, at least 10%, at least 15%, by at least 20%, at least 25%, at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 55 %, at least 60%, at least at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90 %, at least 95%, at least 100%, at least 1 10%, at least 120%, at least 130%, at least 140%, at least 150%, or more.
  • the expression of a gene is considered decreased when its levels decrease with respect to the reference sample by at least 5%, at least 10%, at least 15%, at least 20%, by at least 25%, at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 55%, at least the 60%), at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95 %, at least 100% (that is, absent).
  • the reference sample is the basal levels in an individual with MS.
  • the classification of the disease presenting with vestibular syndrome allows the obtaining of useful data for the differential diagnosis between MS and MV.
  • a third aspect of the invention refers to a method for the diagnosis of MV, hereinafter the second method of the invention, which comprises steps (a) and (b) of the first method of the invention, and further comprises:
  • c1) include the individual from step (a) in the group of individuals with MV with at least 90% probability, when they present levels lower than 0.75 pg / mL of I L-1 b, higher than 200.00 pg / mL of CXCL1, greater than 90.00 pg / mL of CCL22 and less than 5.40 pg / mL of CCL3; c2) include the individual from step (a) in the group of individuals with MV with at least 95% probability, when they present levels lower than 0.7 pg / mL of I L-1 b, higher than 250.00 pg / mL of CXCL1, greater than 80.00 pg / mL of CCL22 and less than 5.20 pg / mL of CCL3; c3) include the individual from step (a) in the group of individuals with MV with at least 99% probability, when they present levels lower than 0.28 pg / mL of I L-1 b, higher than 328.00
  • the second aspect of the invention comprises including the individual from step (a) in the group of individuals with MV, when the result of the following equation is greater than 0.50: 1.321 - 1.857 X [IL1B] pg / mL + 0.018 X [CXCL1] pg / mL + 0.046 X [CCL22] pg / mL - 0.993 X [CCL3] pg / mL
  • biological sample refers to, but is not limited to, cells, tissues and / or biological fluids of an organism, obtained by any method known to a person skilled in the art; that is, any one selected from the group of body fluids or cells, or from a cell extract or the cell culture supernatant of said cells, and / or liquid biopsy (blood, serum, plasma, urine, ).
  • the isolated sample in step (a) is peripheral blood, and even more preferably are mononuclear cells obtained from peripheral blood.
  • the term “individual” in this specification is synonymous with “patient”, and is not intended to be limiting in any respect, and it may be of any age, sex and physical condition.
  • Steps (a), (b), and of the methods described above can be fully or partially automated, for example, by means of a robotic sensor equipment for the quantification of step (a) or the computerized calculation of any of the indices of steps (b), (c) and / or (d), or the computerized classification in steps
  • kits or devices for the diagnosis and classification of a disease that causes episodic vestibular syndrome which comprises the elements necessary to determine the levels of IL -Ib, CCL22, CCL3 and CXCL1 in a biological sample isolated from an individual.
  • the isolated sample is peripheral blood, and even more preferably they are mononuclear cells obtained from peripheral blood.
  • the kit or device of the invention comprises primers, probes and / or antibodies capable of detecting and quantifying the pro-inflammatory cytokines Mb, CCL22, CCL3 and CXCL1 in an isolated biological sample.
  • the kit or device comprises the elements necessary to quantify the expression levels of the genes, and where:
  • the primers or primers are polynucleotide sequences of between 10 and 30 base pairs, more preferably between 15 and 25 base pairs, even more preferably between 18 and 22 base pairs, and even more preferably around 20 pairs of bases, having an identity of at least 80%, more preferably at least 90%, still more preferably at least 95%, still much more preferably at least 98%, and particularly 100% , with a fragment of the sequences complementary to SEQ ID N ° 1 (II ⁇ 1b), SEQ ID N °: 3 (CCL22), SEQ ID N ° 5 (CCL3), and SEQ ID N ° 7 (CXCL1),
  • the probes are polynucleotide sequences of between 80 and 1100 base pairs, more preferably between 100 and 1000 base pairs, and even more preferably between 200 and 500 base pairs, exhibiting an identity of at least 80% , more preferably at least 90%, even more preferably at least 95%, still much more preferably at least 98%, and particularly 100%, with a fragment of the sequences complementary to SEQ ID N 1 (IL1 / .3), SEQ ID No: 3 (CCL22), SEQ ID No 5 (CCL3), and SEQ ID No 7 (CXCL1),
  • the antibodies are capable of specifically binding to a region formed by any of the amino acid sequences SEQ ID N ° 2 (IL1 ⁇ 3), SEQ ID N ° 4 (CCL22), SEQ ID N ° 6 (CCL3), and / or SEQ ID No. 8 (CXCL1).
  • the detection of the levels of pro-inflammatory cytokines is carried out by immunological techniques, with antibodies, and even more preferably by ELISA.
  • the antibodies are modified.
  • the antibody is human, humanized, or synthetic.
  • the antibody is monoclonal and / or is labeled with a fluorochrome.
  • the fluorochrome is selected from the list comprising Fluorescein (FITC), Tetramethylrhodamine and derivatives, Phycoerythrin (PE), PerCP, Cy5, Texas, allophycocyanin, or any combination thereof.
  • the antibodies of the kit of the invention are conjugated to molecules that emit detectable signals such as a radioactive isotope, an enzyme, a fluorescent particle or a chemiluminescent substance or tests that are measured by light scattering or direct visualization such as they are precipitation, agglutination or radial diffusion.
  • Said kit or device may contain all those reagents necessary to determine the cytokines of the invention by means of any of the methods existing in the state of the art and / or described in this document.
  • the kit can also include, without any limitation, buffers, agents to prevent contamination, inhibitors of protein degradation, etc.
  • the kit can include all the supports and containers necessary for its start-up and optimization.
  • the kit further comprises instructions for carrying out any of the methods of the invention.
  • the kit comprises a microarray, or microarray of the invention.
  • An antibody microarray is a matrix on a solid substrate (usually a glass slide or a thin film silicon cell). Detection is carried out colorimetrically by the interaction of a chromogenic substrate and an enzyme that has been coupled to a detector antibody. Each spot contains the antibody (s).
  • the matrix is customized for the methods of the invention.
  • said custom matrix comprises fifty spots or less, such as thirty spots or less, including twenty spots or less. Therefore, another aspect of the invention relates to a matrix comprising the antibody (s) of the invention.
  • Synthesis in situ on a solid support could be done using ink-jet technology, which requires longer probes.
  • Supports could be, but are not limited to, NC or nylon (charged) filters or membranes, silicon, or glass microscope slides covered with aminosilanes, polylysines, aldehydes, or epoxy.
  • a fifth aspect of the invention refers to the use of the kit of the invention, for the diagnosis and classification of a disease that causes episodic vestibular syndrome.
  • the disease associated with vestibular syndrome is MS or MV, being used for the differential diagnosis of MS and MV, and more specifically, for the diagnosis of MV.
  • the invention also extends to computer programs adapted so that any processing means can carry out the methods of the invention.
  • Such programs may be in the form of source code, object code, an intermediate source of code and object code, for example, as in partially compiled form, or in any other form suitable for use in implementing the processes according to the invention.
  • Computer programs also cover cloud applications based on this procedure.
  • Another aspect of the invention relates to a computer program comprising instructions for carrying out the procedure according to any of the methods of the invention.
  • the invention encompasses computer programs arranged on or within a carrier.
  • the carrier can be any entity or device capable of supporting the program.
  • the carrier could be an integrated circuit in which the program is included and which has been adapted to execute, or to be used in the execution of the corresponding processes.
  • the programs could be embedded in a storage medium, such as a ROM memory, a CD ROM memory or a semiconductor ROM memory, a USB memory stick, or a magnetic recording medium, for example a floppy disk or a disk. Lasted.
  • the programs could be supported on a transmittable carrier signal; for example, it could be an electrical or optical signal that could be carried via electrical or optical cable, by radio, or by any other means.
  • the invention also extends to computer programs adapted so that any processing means can carry out the methods of the invention.
  • Computer programs also cover cloud applications based on this procedure.
  • aspects of the invention relate to the readable storage medium and to the transmittable signal comprising program instructions necessary for the execution of the inventive method by a computer.
  • Another aspect of the invention relates to a transmittable signal comprising program instructions capable of causing a computer to carry out the steps of any of the methods of the invention.
  • polynucleotide and “nucleic acid” are used interchangeably herein, referring to polymeric forms of nucleotides of any length, both ribonucleotides (RNA or RNA) and deoxyribonucleotides (DNA or DNA).
  • amino acid sequence refers to a polymeric form of amino acids of any length, which may be coding or non-coding, chemically or biochemically modified.
  • the present study included a total of 48 patients with Meniere's disease and 16 patients with vestibular migraine.
  • the patients were included in 6 centers: Granada University Hospital, Getafe University Hospital, Santiago de Compostela Clinical Hospital, Salamanca University Hospital, Lucus Augusti de Lugo University Hospital, Montecelo de Pontevedra Hospital between November 2014 and March 2018.
  • Peripheral blood samples were obtained for the separation of Mononuclear cells and cytokine determination after in vitro assay. These samples were obtained from patients who had not had vertigo attacks currently, nor had they presented it at least 30 days before the date of obtaining the sample.
  • AAO-HNS American Academy of Otolaryngology-Head and Neck Surgery
  • the auditory stage for each patient with definitive MS is defined as the mean of the average of four tones of 0.5, 1, 2 and 3 kHz according to the criteria of the AAO-HNS: stage 1, £ 25 dB; stage 2, 26-40dB, stage 3, 41-70dB, and stage 4,> 70 dB.
  • the diagnosis of migraine was made using the criteria of the International Headache Society and the diagnosis of vestibular migraine using the criteria of the Barany Society (2012).
  • Peripheral blood mononuclear cells were isolated using Ficoll density gradients and cultured in RPMI1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum, 1% pyruvate and 1% essential amino acids, plated at 1x10 6 cells / ml in 6-well plates. and incubated 16h at 37 ° C at 7% CO2. At the end of the incubation the cells were centrifuged, the supernatant was saved and the RNA and proteins were extracted from the cells.
  • the levels of the cytokines I L-1 b, CCL22, CCL3 and CXCL1 in the supernatant were simultaneously quantified by an immunoassay with magnetic beads. (EMD Millipore, Billerica, MA, USA) using a Luminex 2000 reader (Luminex Corp., Austin, TX, USA) and analyzed with Luminex x PONENT 3.1 software (Luminex Corp., Austin, TX, USA).
  • the diagnostic yield of I L-1b, CCL22, CCL3 and CXCL1 was assessed to discriminate between MV and EM, obtaining a sensitivity of 93.8%, a specificity of 95.8%, a positive predictive value of 97.83% and a negative predictive value of 11.76 %.
  • Table 1 Summary of the different multivariate or univariate models using the cytokines: II_-1b, CCL22, CCL3 and CXCL1.

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Abstract

Panel de citoquinas/quimiocinas para el diagnóstico diferencial en el Síndrome Vestibular Episódico Método y kit de diagnóstico que emplea la determinación de citoquinas proinflamatorias para la clasificación de pacientes que presentan síndrome vestibular episódico con migraña y/o hipoacusia, y en concreto parta el diagnóstico diferencial de la migraña vestibular y la enfermedad de Meniere.

Description

PANEL DE CITOQUINAS/QUIMIOCINAS PARA EL DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL EN EL SÍNDROME VESTIBULAR EPISÓDICO
La presente invención se encuentra dentro del campo de la biomedicina y la biotecnología, y se refiere al empleo de citoquinas proinflamatorias como marcador diagnóstico en el síndrome vestibular episódico, y especialmente se refiere a un método para la clasificación de pacientes que presentan síndrome vestibular episódico con migraña y/o hipoacusia, y en concreto parta el diagnóstico diferencial de la migraña vestibular y la enfermedad de Meniere.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
Recientemente, se ha llegado a un consenso para los criterios de diagnostico de la Migraña Vestibular (MV) y de la Enfermedad de Meniere (EM). Para el diagnóstico de la MV, los episodios de vértigo deberán estar asociados a síntomas migrañosos (cefaleas, fotofobia, fonofobia, aura visual). Por otro lado, para el diagnóstico de EM los episodios de vértigo deberán estar asociados a pérdida auditiva. Sin embargo, hay pacientes que presentan episodios de vértigo acompañado de ambos tipos de síntomas, y por lo tanto no pueden ser categorizados en estas enfermedades. Además, existen pacientes con un fenotipo incompleto que no cumplen los criterios clínicos y que podrían ser formas parciales de la enfermedad.
Pacientes con MV responden a tratamiento antimigrañoso, suportando que la enfermedad tenga un mecanismo migrañoso. Sin embrago, estas evidencias son insuficientes, ya que basado en series de casos clínicos no controlados, pudiendo la eficacia ser debido a otros factores, como por ejemplo el efecto placebo. Por otro lado, hay la posibilidad de la MV tener un mecanismo fisiopatológico compartido con EM, una vez que la prevalencia de migraña es superior en EM do que en la población general.
Un análisis cluster realizado en un grupo de pacientes con EM identificó 5 subgrupos de pacientes con EM unilateral y bilateral, de acuerdo con la presencia/ausencia de una enfermedad autoinmune, migraña, herencia y el tipo de inicio de la enfermedad. Esto sugiere que podrían existir diferentes mecanismos celulares y/o moleculares en la base del desarrollo de la enfermedad, siendo las teorías genética, autoinmune o alérgica las más aceptadas actualmente. Además, fue identificado un subgrupo de pacientes con EM con niveles citoquinas proinflamatorias elevados, en particular I L- 1 b .
El tratamiento de la EM es sintomático y su objetivo es reducir la frecuencia y severidad de las crisis de vértigo, impactando mínimamente la función auditiva, siendo deseable también una mejoría de la audición y de los acufenos. Las recomendaciones de tratamiento para EM son principalmente cambios de estilo de vida, como por ejemplo la disminución de consumo de cafeína, alcohol y tabaco y adoptar una dieta baja en sal. Además, como primera línea de tratamiento también se podrá recurrir a rehabilitación vestibular y psicoterapia. Con respecto al tratamiento medicamentoso, la primera opción es el uso de diuréticos y betahistina. Cuando esta línea terapéutica no funciona, se pueden hacer inyecciones intratimpánica de esferoides. Con todo, hay pacientes que no responden a las opciones anteriores, por lo tanto, se usan tratamientos más drásticos, que pueden tener alto risco de causar pérdida auditiva, tales como la inyección intratimpánica de gentamicina y cirugías ablativas (por ejemplo, la laberintectomía).
Así, el correcto diagnóstico diferencial entre la MV y la EM permitiría evitar tratamientos inadecuados y potencialmente agresivos en pacientes mal diagnosticados.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1. Niveles de interleuquina 1 b en el sobrenadante de células mononucleares de pacientes con enfermedad de Meniere y pacientes con Migraña Vestibular tras el ensayo de células mononucleares in vitro.
Fig. 2. Niveles de CCL22 en el sobrenadante de células mononucleares de pacientes con enfermedad de Meniere y pacientes con Migraña Vestibular tras el ensayo de células mononucleares in vitro.
Fig. 3. Niveles de CCL3 en el sobrenadante de células mononucleares de pacientes con enfermedad de Meniere y pacientes con Migraña Vestibular tras el ensayo de células mononucleares in vitro.
Fig. 4. Niveles de CXCL1 en el sobrenadante de células mononucleares de pacientes con enfermedad de Meniere y pacientes con Migraña Vestibular tras el ensayo de células mononucleares in vitro. Fig. 5. Curva ROC que permite discriminar a los pacientes de acuerdo con su enfermedad. Permite el diagnóstico de migraña vestibular mediante la determinación de I L- 1 b , CXCL1 , CCL3 and CCL22. AUC (área bajo la curva)=0.993
DESCRIPCIÓN DE LA TABLA
Tabla 1. Resumen de los distintos modelos multivariantes o univariantes utilizando las citoquinas: IL-Ib, CCL22, CCL3 y CXCL1.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Los ejemplos de la invención muestran que I L- 1 b , CCL22, CCL3 y CXCL1 son marcadores útiles para diferenciar una enfermedad que cursa con síndrome vestibular episódico (ataques de vértigo) con síntomas migrañosos (cefalea y/o aura sensorial) y/o hipoacusia neurosensorial, preferiblemente la EM y la MV. La EM puede presentar síntomas migrañosos, incluyendo cefalea y la MV puede presentar hipoacusia neurosensorial, siendo indistinguibles en fases iniciales de la enfermedad.
Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere al uso IL-Ib, CCL22, CCL3 y CXCL1, o cualquiera de sus combinaciones, para la obtención de datos útiles para el diagnóstico de una enfermedad que cursa con síndrome vestibular episódico. En una realización preferida dichos marcadores se usan simultáneamente. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la enfermedad que cursa con síndrome vestibular es la Migraña Vestibular (MV).
En esta memoria se entiende por enfermedad que cursa con síndrome vestibular episódico aquella en la que el paciente presenta signos y síntomas recurrentes que indican una alteración de la función vestibular, tales como vértigo, ataxia, desequilibrio, nistagmo o oscilopsia. Estos síntomas pueden ir asociados con síntomas auditivos o cefalea de diverso origen.
En esta memoria se entiende por enfermedad de Méniére al síndrome caracterizado por hipoacusia neurosensorial uní o bilateral que afecta a las frecuencias bajas y medias (< 2000Hz) y asociada a episodios de vértigo y síntomas auditivos, tales como acufenos, o plenitud ótica.
En esta memoria se entiende por Migraña Vestibular al síndrome caracterizado por un historial de migrañas con o sin aura y la ocurrencia de síntomas migrañosos (fotofobia, fonofobia, cefalea y/o aura) en por lo menos 50% de los episodios de vértigo.
IL-Ib, CCL22, CCL3 y CXCL1 son citoquinas proinflamatorias
En esta memoria el uso de las citoquinas IL-Ib, CCL22, CCL3 y CXCL1 se refiere a cualquier forma, y preferiblemente, a la determinación de su producto de expresión, bien sea la determinación de los ácidos nucléicos o de las proteínas. Más preferiblemente se determina el producto de expresión en forma de proteínas.
En otra realización preferida, la determinación de las citoquinas proinflamatorias se realiza in vitro en células mononucleares humanas.
La EM puede presentar síntomas migrañosos, incluyendo cefalea y la MV puede presentar hipoacusia neurosensorial, siendo indistinguibles en fases iniciales de la enfermedad. Sin embargo, los autores de la presente invención han demostrado que la determinación de IL-Ib, CCL22, CCL3 y CXCL1 permite el diagnóstico diferencial entre la EM y la MV:
En otra realización aún más preferida, el uso de IL-Ib, CCL22, CCL3 y CXCL1 permite la obtención de datos útiles para el diagnóstico diferencial entre la EM y la MV, y más concretamente, permite el diagnóstico de la MV.
Los niveles de expresión de los genes van a dar un determinado perfil de expresión génica. El término "nivel", "nivel de expresión", también denominado "cantidad producto génico" se refiere al material bioquímico, ya sea ARN o proteína, resultado de la expresión de un gen. Algunas veces se usa una medida de la cantidad de producto génico para inferir qué tan activo es un gen. Se entiende por "perfil de expresión génica" el perfil génico obtenido tras la cuantificación del ARNm y/o de proteína producida por los genes de interés o biomarcadores, es decir, por los genes empleados como marcadores biológicos en la presente invención, en una muestra biológica aislada. El perfil de expresión de los genes se realiza, preferiblemente, determinando el nivel de ARNm derivado de su transcripción, previa extracción del ARN total presente en la muestra biológica aislada, lo cual puede realizarse mediante protocolos conocidos en el estado de la técnica. La determinación del nivel de ARNm derivado de la transcripción de los genes empleados como marcadores biológicos en la presente invención, puede realizarse, por ejemplo, aunque sin limitarnos, mediante amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), RT-PCR cuantitativa (qPCR), retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la ligasa (RT-LCR), o cualquier otro método de amplificación de ácidos nucleicos; análisis en serie de la expresión génica (SAGE, SuperSAGE); chips de ADN elaborados con oligonucleótidos depositados por cualquier mecanismo; microarrays de ADN elaborados con oligonucleótidos sintetizados in situ mediante fotolitografía o por cualquier otro mecanismo; hibridación in situ utilizando sondas específicas marcadas con cualquier método de mareaje; mediante geles de electroforesis; mediante transferencia a membrana e hibridación con una sonda específica; mediante resonancia magnética nuclear o cualquier otra técnica de diagnóstico por imagen utilizando nanopartículas paramagnéticas o cualquier otro tipo de nanopartículas detectables funcionalizadas con anticuerpos o por cualquier otro medio. El perfil de expresión génica también podría obtenerse mediante la detección y/o cuantificación de las proteínas producto de la traducción del ARNm derivado de la transcripción de los genes empleados como marcadores biológicos en la presente invención, mediante por ejemplo, pero sin limitarnos, inmunodetección por western blot. La detección cuantitativa de la expresión de los genes empleados como marcadores biológicos en la presente invención puede realizarse más preferiblemente mediante PCR en tiempo real (RT-PCR ó RTqPCR). La detección en tiempo real de los productos amplificados puede llevarse a cabo mediante la utilización de moléculas fluorescentes que se intercalan en el ADN de cadena doble o mediante hibridación con diferentes tipos de sondas.
En el caso de que se detecte el nivel o los niveles de proteínas puede hacerse, al igual que en el caso de los genes, por cualquiera de las técnicas conocidas por el experto en la materia. Así, en otra realización preferida de este aspecto de la invención, la detección de los niveles de expresión se realiza por una técnica inmunológica.
En una realización más preferida, las técnicas inmunológicas están basadas en reacciones de precipitación, de aglutinación, inmunomarcación, radioinmunoanálisis y técnicas radioinmunométricas, preferentemente ELISA (Enzime Linked ImmunoadSorbent Assay), o Western blot o en cualquiera de sus combinaciones. El término“diagnóstico”, tal y como se utiliza en la presente invención, al mayor o menor riesgo a padecer la Migraña Vestibular o al mayor o menor riesgo a padecer la Enfermedad de Meniere.
A su vez, atendiendo al método de la presente invención, se podrían establecer otras subclasificaciones dentro de esta principal, facilitando, por tanto, la elección y el establecimiento de regímenes terapéuticos adecuados. Esta discriminación tal y como es entendida por un experto en la materia no pretende ser correcta en un 100% de las muestras analizadas. Sin embargo, requiere que una cantidad estadísticamente significativa de las muestras analizadas sean clasificadas correctamente. La cantidad que es estadísticamente significativa puede ser establecida por un experto en la materia mediante el uso de diferentes herramientas estadísticas, por ejemplo, pero sin limitarse, mediante la determinación de intervalos de confianza, determinación del valor significación P, test de Student o funciones discriminantes de Fisher, medidas no paramétricas de Mann Whitney, correlación de Spearman, regresión logística, regresión lineal, área bajo la curva de ROC (AUC). Preferiblemente, los intervalos de confianza son al menos del 90%, al menos del 95%, al menos del 97%, al menos del 98% o al menos del 99%. Preferiblemente, el valor de p es menor de 0,05, de 0,01 , de 0,005 o de 0,0001. Preferiblemente, la presente invención permite detectar correctamente la predisposición a la enfermedad o la enfermedad de forma diferencial en al menos el 60%, más preferiblemente en al menos el 70%, mucho más preferiblemente en al menos el 80%, o aún mucho más preferiblemente en al menos el 90% de los sujetos de un determinado grupo o población analizada.
El término 'V .-7/3" (también llamado en la literatura Interleuquina 1 beta IL-1 ; IL1 F2; IL1-BETA) se refiere tanto al gen como a la proteína humana. Es una citoquina es un mediador muy importante en la respuesta inflamatoria, y está involucrada en una gran variedad de actividades celulares, incluyendo la activación, proliferación, diferenciación y apoptosis celular. El aumento en la producción de esta citoquina se observa en distintas enfermedades autoinmunes/ autoinflamatorias como la enfermedad autoinmune del oído interno, síndrome de Muckle Wells, diabetes tipo 1 y artritis inflamatoria.
En el contexto de la presente invención,“IL- 7/3” se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótidos, que constituye la secuencia “IL-Ib”, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 2,
b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a),
c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,
d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 2 en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína IL- 1b. Entre otras posibles secuencias nucleotídicas que codifican COL1A2 se encuentra, pero sin limitarse, la SEQ ID NO: 1.
Gene ID: 3553
Localización del gen: 2q14.1
SEQ ID N° 1
ATTTCTCAGCCTCCTACTTCTGCTTTTGAAAGCCATAAAAACAGCGAGGGAGAAAC TGGCAGATACCAAACCTCTTCGAGGCACAAGGCACAACAGGCTGCTCTGGGATTC T CTT CAGCCAAT CTT CATT GCT C AAT GGCAAT G AGG AT G ACTT GTTCTTT GAAGCT GATGGCCCT AAACAGAT GAAGT GCTCCTTCCAGGACCTGGACCTCT GCCCTCT GG ATGGCGGCATCCAGCTACGAATCTCCGACCACCACTACAGCAAGGGCTTCAGGC AGGCCGCGTCAGTTGTTGTGGCCATGGACAAGCTGAGGAAGATGCTGGTTCCCT GCCCACAG ACCTTCCAGG AGAAT G ACCT G AGCACCTT CTTTCCCTT CAT CTTT G AA G AAG AACCT AT CTT CTTCG ACACAT GGG AT AACGAGGCTT AT GTGCACG AT GC AC CT GT ACGATCACT GAACT GCACGCTCCGGGACTCACAGCAAAAAAGCTT GGT GAT GTCTGGTCCATATGAACTGAAAGCTCTCCACCTCCAGGGACAGGATATGGAGCAA CAAGTGGT GTT CTCCAT GTCCTTT GT ACAAGG AGAAG AAAGT AAT GACAAAAT ACC T GT GGCCTTGGGCCTCAAGGAAAAGAATCT GT ACCT GTCCT GCGT GTT GAAAGAT GAT AAGCCCACT CT ACAGCTGG AG AGT GT AG ATCCCAAAAATT ACCCAAAGAAG A AGATGGAAAAGCG ATTT GT CTT CAACAAGAT AGAAAT CAAT AAC AAGCTGGAATTT GAGTCTGCCCAGTTCCCCAACTGGTACATCAGCACCTCTCAAGCAGAAAACATGC CCGTCTTCCTGGGAGGGACCAAAGGCGGCCAGGATATAACTGACTTCACCATGC AATTT GT GTCTTCCT AAAGAG AGCT GT ACCCAG AGAGTCCT GTGCT G AAT GTGGA CTCAATCCCTAGGGCTGGCAGAAAGGGAACAGAAAGGTTTTTGAGTACGGCTATA GCCTGGACTTTCCT GTT GTCT ACACCAATGCCCAACTGCCTGCCTT AGGGT AGT G CTAAGAGGATCTCCTGTCCATCAGCCAGGACAGTCAGCTCTCTCCTTTCAGGGCC AATCCCCAGCCCTTTTGTTGAGCCAGGCCTCTCTCACCTCTCCTACTCACTTAAAG CCCGCCTGACAGAAACCACGGCCACATTTGGTTCTAAGAAACCCTCTGTCATTCG CTCCCACATT CT G AT G AGCAACCGCTTCCCT ATTT ATTT ATTT ATTT GTTT GTTT GTT TT ATT CATTGGT CT AATTT ATT CAAAGGGGGCAAGAAGT AGCAGTGTCTGT AAAAG AGCCT AGTTTTT AAT AGCT ATGGAAT CAATT CAATTTGGACTGGT GTGCT CT CTTT A AAT CAAGTCCTTT AATT AAGACT G AAAAT AT AT AAGCT CAG ATT ATTT AAAT GGG AA T ATTT AT AAAT G AGCAAAT AT CAT ACT GTT CAATGGTT CT GAAAT AAACTT CACT GA AGAA
SEQ ID N° 2
MKCSFQDLDLCPLDGGIQLRISDHHYSKGFRQAASVVVAMDKLRKMLVPCPQTFQEN
DLSTFFPFIFEEEPIFFDTWDNEAYVHDAPVRSLNCTLRDSQQKSLVMSGPYELKALH
LQGQDMEQQWFSMSFVQGEESNDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDP
KNYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFESAQFPNWYISTSQAENMPVFLGGTKGGQDITD
FTMQFVSS
El término "CCL22" (también llamado en la literatura C-C motif chemokine ligand 22, MDC; ABCD-1; SCYA22; STCP-1; DC/B-CK; A-152E5. 1) se refiere tanto al gen como a la proteína humana. Esta citoquina o quimioquina, también designada MDC (Quimioquina derivada de macrófagos, del inglés macrophage-derived chemokine), tiene una actividad quimiotáctica para monocitos, células dendríticas, células NK y linfocitos T crónicamente activados. Esta proteína es importante en el tráfico de linfocitos T activados en los focos inflamatorios. Un aumento en CCL22 ya fue asociado a alergia y a respuestas inflamatorias cutáneas. Por otro lado, se ha visto en ratones que una sobreexpresión de CCL22 en células b pancreáticas en diabetes tipo 1 tiene un papel protector, una vez que previne un ataque autoinmune con el reclutamiento de células Treg.
En el contexto de la presente invención,“CCL22” se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótidos, que constituye la secuencia “CCL22”, y que comprendería diversas variantes procedentes de:
a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 4,
b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,
d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 4 en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína CCL22. Entre otras posibles secuencias nucleotídicas que codifican C3 se encuentra, pero sin limitarse, la SEQ ID NO: 3.
Gene ID: 6367
Localización del gen: 16q21
SEQ ID N° 3
GCAGACACCT GGGCT GAGACAT ACAGGACAGAGCAT GGATCGCCT ACAGACTGC
ACTCCTGGTTGTCCTCGTCCTCCTTGCTGTGGCGCTTCAAGCAACTGAGGCAGGC
CCCTACGGCGCCAACATGGAAGACAGCGTCTGCTGCCGTGATTACGTCCGTTAC
CGTCTGCCCCTGCGCGTGGTGAAACACTTCTACTGGACCTCAGACTCCTGCCCGA
GGCCTGGCGTGGTGTTGCTAACCTTCAGGGATAAGGAGATCTGTGCCGATCCCA
GAGTGCCCTGGGT GAAGAT GATTCTCAAT AAGCT GAGCCAAT GAAGAGCCT ACTC
TGATGACCGTGGCCTTGGCTCCTCCAGGAAGGCTCAGGAGCCCTACCTCCCTGC
CATTATAGCTGCTCCCCGCCAGAAGCCTGTGCCAACTCTCTGCATTCCCTGATCT
CCATCCCTGTGGCTGTCACCCTTGGTCACCTCCGTGCTGTCACTGCCATCTCCCC
CCTGACCCCTCTAACCCATCCTCTGCCTCCCTCCCTGCAGTCAGAGGGTCCTGTT
CCCATCAGCGATTCCCCTGCTT AAACCCTTCCAT GACTCCCCACTGCCCT AAGCT
GAGGTCAGTCTCCCAAGCCTGGCATGTGGCCCTCTGGATCTGGGTTCCATCTCTG
TCTCCAGCCTGCCCACTTCCCTTCATGAATGTTGGGTTCTAGCTCCCTGTTCTCCA
AACCCAT ACT ACACATCCCACTTCTGGGTCTTT GCCT GGGAT GTTGCT GACACCC
AGAAAGTCCCACCACCT GCACAT GT GT AGCCCCACCAGCCCTCCAAGGCATTGCT
CGCCCAAGCAGCTGGTAATTCCATTTCATGTATTAGATGTCCCCTGGCCCTCTGTC
CCCTCTTAATAACCCTAGTCACAGTCTCCGCAGATTCTTGGGATTTGGGGGTTTTC
TCCCCCACCTCTCCACTAGTTGGACCAAGGTTTCTAGCTAAGTTACTCTAGTCTCC
AAGCCTCTAGCATAGAGCACTGCAGACAGGCCCTGGCTCAGAATCAGAGCCCAG
AAAGTGGCTGCAGACAAAATCAATAAAACTAATGTCCCTCCCCTCTCCCTGCCAAA
AGGCAGTT ACAT ATCAAT ACAGAGACTCAAGGTCACT AGAAATGGGCCAGCT GGG
T CAAT GT G AAGCCCCAAATTTGCCCAG ATT CACCTTT CTTCCCCCACTCCCTTTTTT
TTTTTTTTTTT GAGAT GGAGTTTCGCTCTT GTCACCCACGCTGGAGTGCAATGGT G TGGTCTTGGCTTATTGAAGCCTCTGCCTCCTGGGTTCAAGTGATTCTCTTGCCTCA
GCCTCCT GAGT AGCT GGGATT ACAGGTTCCTGCT ACCACGCCCAGCT AATTTTT G
T ATTTTT AGT AGAGACGAGGCTTCACCAT GTTGGCCAGGCTGGTCTCGAACTCCT
GTCCTCAGGTAATCCGCCCACCTCAGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCGT
GAGCCACAGTGCCTGGCCTCTTCCCTCTCCCCACCCCCCCCCCAACTTTTTTTTTT
TTTTATGGCAGGGTCTCACTCTGTCGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGGCGTGATCTC
GGCTCACTACAACCTCGACCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCCACCCCAGCCTCC
CAAGTAGCTGGGATTACAGGTGTGTGCCACTACGGCTGGCTAATTTTTGTATTTTT
AGT AGAGACAGGTTTCACCAT ATTGGCCAGGCT GGTCTT GAACTCCT GACCTCAA
GT GATCCACCTTCCTT GTGCTCCCAAAGT GCT G AGATT AC AGGCGT G AGCT AT CA
CACCCAGCCTCCCCCTTTTTTTCCT AAT AGG AG ACTCCT GT ACCTTT CTTCGTTTT A
CCTATGTGTCGTGTCTGCTTACATTTCCTTCTCCCCTCAGGCTTTTTTTGGGTGGT
CCTCCAACCTCCAATACCCAGGCCTGGCCTCTTCAGAGTACCCCCCATTCCACTT
TCCCTGCCTCCTTCCTT AAAT AGCT GACAAT CAAATT CAT GCTATGGTGT G AAAGA
CT ACCTTT GACTTGGT ATT AT AAGCT GGAGTT AT AT AT GT ATTT GAAAACAGAGT AA
AT ACTT AAGAGGCCAAAT AGAT GAATGGAAGAATTTT AGGAACT GT GAGAGGGGG
ACAAGGTGGAGCTTTCCTGGCCCTGGGAGGAAGCTGGCTGTGGTAGCGTAGCGC
TCTCTCTCTCTGTCTGTGGCAGGAGGCAAAGAGTAGGGTGTAATTGAGTGAAGGA
ATCCT GGGT AGAGACCATTCTCAGGTGGTTGGGCCAGGCT AAAGACT GGGATTT G
GGTCT ATCT ATGCCTTTCTGGCT GATTTTT GT AGAGACGGGGTTTT GCCAT GTT AC
CCAGGCTGGTCTCAAACTCCTGGGCTCAAGCGATCCTCCTGGCTCAGCCTCCCAA
AGTGCTGGGATTACAGGCGTGAGTCACTGCGCCTGGCTTCCTCTTCCTCTTGAGA
AAT ATTCTTTTCAT ACAGCAAGT AT GGGACAGCAGT GTCCCAGGT AAAGGACAT AA
ATGTTACAAGTGTCTGGTCCTTTCTGAGGGAGGCTGGTGCCGCTCTGCAGGGTAT
TT GAACCT GTGGAATT GGAGGAGGCCATTTCACTCCCT GAACCCAGCCT GACAAA
TCACAGT GAGAAT GTTCACCTT AT AGGCTT GCT GTGGGGCTCAGGTT GAAAGT GT
GGGGAGTGACACTGCCTAGGCATCCAGCTCAGTGTCATCCAGGGCCTGTGTCCC
TCCCGAACCCAGGGTCAACCTGCCTACCACAGGCACTAGAAGGACGAATCTGCC
TACTGCCCATGAACGGGGCCCTCAAGCGTCCTGGGATCTCCTTCTCCCTCCTGTC
CT GTCCTTGCCCCT CAGGACTGCT GG AAAAT AAATCCTTT AAAAT AGT AAAAAAAA
AAAAAAA
SEQ ID N° 4
MDRLQTALLVVLVLLAVALQATEAGPYGANMEDSVCCRDYVRYRLPLRVVKHFYWTS
DSCPRPGVVLLTFRDKEICADPRVPWVKMILNKLSQ El término "CCL3" (también llamado en la literatura C-C motif chemokine ligand 3, MIP1A; SCYA3; G0S19-1; LD78ALPHA; MIP-1-alpha) se refiere tanto al gen como a la proteína humana. Esta monoquina, también designada MIP1A (Proteína Inflamatoria Macrofágica 1 alpha, del inglés Macrophage Inflammatory Protein 1 alpha), tiene un papel clave en la activación y regulación de la respuesta inflamatoria y de defensa del anfitrión. CCL3 es crucial en el reclutamiento de macrófagos y linfocitos T hacia los focos de inflamación, orquestando respuestas inflamatorias agudas y crónicas. Por tanto, es importante en el desarrollo de varias patologías inflamatorias y autoinmunes, tales como artritis reumatoide, síndrome de Sjógren, sarcoidosis y periodontitis.
En el contexto de la presente invención,“CCL3” se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótidos, que constituye la secuencia “CCL3”, y que comprendería diversas variantes procedentes de:
a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 6,
b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a),
c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,
d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 6 en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína CCL3. Entre otras posibles secuencias nucleotídicas que codifican CCL3 se encuentra, pero sin limitarse, la SEQ ID NO: 5.
Gene ID: 6348
Localización del gen: 17q12
SEQ ID N° 5
TGATCCATCCACCTCGGCCAGTCAAAGTGCTGGGATTACAGGCATGAGCCACTGC ACCCAGCCGAT ACT ACT AT ATCCCCATTTT ACAGAT GAGCACATGGGCAAATT GAG GGT AAGGCACT GACCCAT GATCAT ACAGCT GAGAAGT GGCAAAGGCAGGATTT GA ACCT AG AACCT CTGGCTCCACACACT AGT AATCT AAACC ACT CTCCCT ACAAT ACA ACAT ACGT GGT AAAGAT GT GTGGT GGGCACGCAATCAACGT AGGTCCCTTCACAG TTGCTGGGAGAGGCAGGAATTTGCAGTTCCTCCGCGTTCTCCTCCTCCGCTGCCC ACCTGTCCTGGGTCATTCCTGCAGCCTGCCCTGCCCTGCCTGGTCTCACCCTCCC TCTGCCAACAGAAGTCTGGGCAGGGTTTTATGGGCTCTGATAAGGCCCTGGCAG
GGCCGAAGTTCATGAGCACTTCCTCTTTGCAGGAGGGCGTAGGGGAGGGGACCC
AGGTGATTTGGGTCCTGGCTGGTCACCAGGGAAGCTGGCAAGGGAAGGGAGACT
AGGGTGCGCTCTAGGAGAAGCCGACAGCCTGAGAGTCCCAGAAGAGGAGCCCT
GTGGACCCTCCCCTGCCAGCCACTCCCTTACCCTGGGTATAAGAGCCACCACCG
CCTGCCATCCGCCACCATCTCCCACTCCTGCAGCTCTTCTCACAGGACCAGCCAC
TAGCGCAGCCTCGAGCGATGGCCTATGTCCCCGCACCGGGCTACCAGCCCACCT
ACAACCCGACGCTGCCTTACTACCAGCCCATCCCGGGCGGGCTCAACGTGGGAA
TGTCTGTTTACATCCAAGGAGTGGCCAGCGAGCACATGAAGCGGTGGTGGTAAAT
GGAAATCCCTTCT AT GAGT ACGGGCACCGGCTTCCCCT ACAGATGGTCACCCACC
TGCAAGTGGATGGGGATCTGCAACTTCAATCAATCAACTTCATCGGAGGCCAGCC
CCTCCGGCCCCAGGGACCCCCGATGATGCCACCTTACCCTGGTCCCGGACATTG
CCATCAACAGCTGAACAGCCTGCCCACCATGGAAGGACCCCCAACCTTCAACCC
GCCTGTGCCATATTTCGGGAGGCTGCAAGGAGGGCTCACAGCTCGAAGAACCAT
CATCATCAAGGGCTATGTGCCTCCCACAGGCAAGAGCTTTGCTATCAACTTCAAG
GTGGGCTCCTCAGGGGACATAGCTCTGCACATTAATCCCCGCATGGGCAACGGT
ACCGTGGTCCGGAACAGCCTTCTGAATGGCTCGTGGGGATCCGAGGAGAAGAAG
AT CACCC ACAACCCATTTGGTCCCGGACAGTT CTTT G ATCT GTCCATTCGCT GTGG
CTTGGATCGCTTCAAGGTTTACGCCAATGGCCAGCACCTCTTTGACTTTGCCCATC
GCCTCTCGGCCTTCCAGAGGGTGGACACATTGGAAATCCAGGGTGATGTCACCTT
GTCCTATGTCCAGATCTAATCTATTCCTGGGGCCATAACTCATGGGAAAACAGAAT
TATCCCCTAGGACTCCTTTCTAAGCCCCTAATAAAATGTCTGAGGGTGTCTCATGA
SEQ ID N° 6
MVTHLQVDGDLQLQSINFIGGQPLRPQGPPMMPPYPGPGHCHQQLNSLPTMEGPPT
FNPPVPYFGRLQGGLTARRTIIIKGYVPPTGKSFAINFKVGSSGDIALHINPRMGNGTV
VRNSLLNGSWGSEEKKITHNPFGPGQFFDLSIRCGLDRFKVYANGQHLFDFAHRLSA
FQRVDTLEIQGDVTLSYVQI
El término "CXCL (también llamado en la literatura C-X-C motif chemokine ligand 1, FSP; GR01; GROa; MGSA; NAP-3; SCYB1; MGSA-a ) se refiere tanto al gen como a la proteína humana. Esta quimioquina promueve la adhesión de los neutrófilos a las células endoteliales y su subsecuente migración a los focos inflamatorios. Además, presenta actividad quimiotáctica o puede actuar como factor de activación en basófilos, eosinófilos, monocitos, células musculares lisas y linfocitos. Niveles elevados de CXCL1 ya han sido reportados en enfermedades como diabetes tipo 2 y esclerosis múltiple.
En el contexto de la presente invención,“CXCL1” se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótidos, que constituye la secuencia “CXCL1”, y que comprendería diversas variantes procedentes de:
a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 8,
b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a),
c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,
d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 8 en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína CXCL1. Entre otras posibles secuencias nucleotídicas que codifican CXCL1 se encuentra, pero sin limitarse, la SEQ ID NO: 7.
Gene ID: 2919
Localización del gen: 4q13.3
SEQ ID N° 7
CACAGAGCCCGGGCCGCAGGCACCTCCTCGCCAGCTCTTCCGCTCCTCTCACAG CCGCCAGACCCGCCTGCTGAGCCCCATGGCCCGCGCTGCTCTCTCCGCCGCCC CCAGCAATCCCCGGCTCCTGCGAGTGGCACTGCTGCTCCTGCTCCTGGTAGCCG CTGGCCGGCGCGCAGCAGGAGCGTCCGTGGCCACTGAACTGCGCTGCCAGTGC TTGCAGACCCTGCAGGGAATTCACCCCAAGAACATCCAAAGTGTGAACGTGAAGT CCCCCGGACCCCACTGCGCCCAAACCGAAGTCATAGCCACACTCAAGAATGGGC GGAAAGCTTGCCT CAATCCTGCATCCCCCAT AGTT AAG AAAAT CATCG AAAAG AT G CT GAACAGT GACAAATCCAACT GACCAGAAGGGAGGAGGAAGCTCACT GGTGGC T GTTCCT GAAGGAGGCCCTGCCCTT AT AGGAACAGAAGAGGAAAGAGAGACACA GCTGCAGAGGCCACCT GGATT GTGCCT AAT GT GTTT GAGCATCGCTT AGGAGAAG T CTT CT ATTT ATTT ATTT ATT CATT AGTTTT G AAG ATT CT AT GTT AAT ATTTT AGGT GT AAAAT AATT AAGGGTAT G ATT AACT CTACCT GC ACACT GTCCT ATT AT ATT CATT CT TTTT G AAAT GT CAACCCCAAGTT AGTT CAATCT GGATT CAT ATTT AATTT G AAGGT A G AAT GTTTT CAAAT GTT CTCCAGTCATT AT GTT AAT ATTTCT GAGG AGCCT GCAACA TGCCAGCCACT GT GAT AGAGGCTGGCGGATCCAAGCAAATGGCCAAT GAGATCAT T GT GAAGGCAGGGGAAT GT AT GTGCACAT CT GTTTT GT AACT GTTT AGAT GAAT GT CAGTT GTT ATTT ATT G AAAT GATTT CACAGT GT GTGGTCAACATTT CT CAT GTT G AA ACTTT AAG AACT AAAAT GTT CT AAAT ATCCCTTGG ACATTTT AT GT CTTTCTT GT AAG GCATACTGCCTTGTTTAATGGTAGTTTTACAGTGTTTCTGGCTTAGAACAAAGGGG CTT AATT ATT G AT GTTTT CAT AG AG AAT AT AAAAAT AAAGCACTT AT AG AAAAAACT C GTTTGATTTTTGGGGGGAAACAAGGGCTACCTTTACTGGAAAATCTGGTGATTTAT AAAAAAAAAAAAAAAA SEQ ID N° 8
MARAALSAAPSNPRLLRVALLLLLLVAAGRRAAGASVATELRCQCLQTLQGIHPKNIQ
SVNVKSPGPHCAQTEVIATLKNGRKACLNPASPIVKKIIEKMLNSDKSN
MÉTODOS DE LA INVENCIÓN
Un segundo aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico de una enfermedad que cursa con síndrome vestibular episódico, de ahora en adelante primer método de la invención, que comprende:
a) detectar los niveles del producto de expresión de IL-Ib, CCL22, CCL3 y CXCL1 en una muestra biológica aislada de un individuo,
b) comparar los niveles de IL-Ib, CCL22, CCL3 y CXCL1 detectados en el paso (a), con una muestra de referencia.
En la presente invención "muestra biológica", tal como aquí se utiliza, se refiere, pero no se limita, a células, tejidos y/o fluidos biológicos de un organismo, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia; es decir, cualquiera seleccionada del grupo de fluidos corporales o células, o de un extracto celular o el sobrenadante del cultivo celular de dichas células, y/o biopsia líquida (sangre, suero, plasma, orina, ... ).
En una realización preferida de este aspecto la invención, la muestra aislada en el paso (a) es sangre periférica, y aún más preferiblemente son células mononucleares obtenidas de sangre periférica.
Una "muestra de referencia", como se usa aquí, significa una muestra obtenida de un grupo de sujetos sanos que no tiene un estado de enfermedad o fenotipo particular. Los niveles de referencia adecuada expresión de los genes puede ser determinada mediante la medición de los niveles de expresión de dichos genes en varios temas adecuados, y esos niveles de referencia se puede ajustar a las poblaciones específicas (por ejemplo, un nivel de referencia puede estar relacionada con la edad, por lo que las comparaciones se puede hacer entre los niveles de expresión en las muestras de los sujetos de una cierta edad y niveles de referencia para una enfermedad particular, el fenotipo, o falta de ella en un determinado grupo de edad). En una realización preferida, la muestra de referencia se obtiene de varios sujetos sanos o pacientes sin historia previa de DMT2. El experto en la técnica apreciará que el tipo de muestra de referencia puede variar dependiendo del método específico a realizar.
El perfil de expresión de los genes en la muestra de referencia de preferencia puede ser generados a partir de una población de dos o más personas. La población, por ejemplo, pueden contener 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 o más personas. Además, el perfil de expresión de los genes en la muestra de referencia y en la muestra de la persona que va a ser diagnosticada de acuerdo con los métodos de la presente invención pueden ser generados a partir de la misma persona, siempre que los perfiles sean analizados y el perfil de referencia son generados a partir de las muestras biológicas tomadas en diferentes momentos y se comparan entre sí. Por ejemplo, una muestra de un individuo puede obtener en el inicio de un período de estudio. Un perfil de marcador biológico de referencia de esta muestra se puede comparar con los perfiles de biomarcadores generados a partir de las muestras posteriores de la misma persona. En una realización preferida, la muestra de referencia es un conjunto de muestras de varios individuos.
Una vez que los niveles de expresión de los genes marcadores en relación con los valores de referencia para dichos genes se han determinado, es necesario identificar si existen alteraciones en la expresión de dichos genes (aumento o disminución de la expresión). La expresión de un gen se considera aumentada en una muestra de la materia objeto de estudio cuando los niveles de incremento con respecto a la muestra de referencia son al menos de un 5%, por lo menos 10%, por lo menos 15%, por lo menos el 20%, al menos un 25%, por lo menos 30%, por lo menos el 35%, por lo menos el 40%, por lo menos 45%, por lo menos el 50%, por lo menos el 55%, por lo menos el 60%, por menos por lo menos 65%, por lo menos el 70%, por lo menos el 75%, por lo menos el 80%, por lo menos el 85%, por lo menos el 90%, por lo menos el 95%, por lo menos 100%, por lo menos 1 10 %, por lo menos 120%, por lo menos 130%, por lo menos 140%, por lo menos 150%, o más. Del mismo modo, la expresión de un gen se considerada disminuida cuando sus niveles disminuyen con respecto a la muestra de referencia en al menos un 5%, por lo menos 10%, por lo menos 15%, por lo menos el 20%, por lo menos el 25%, al menos un 30%, por lo menos el 35%, por lo menos el 40%, por lo menos 45%, por lo menos el 50%, por lo menos el 55%, por lo menos el 60%), por lo menos el 65%, por lo menos 70%, por lo menos el 75%, por lo menos el 80%, por lo menos el 85%, por lo menos el 90%, por lo menos el 95%, por lo menos 100% (es decir, ausente).
En otra realización preferida de este aspecto de la invención la muestra de referencia son los niveles básales en un individuo con EM.
En otra realización aún más preferida, la clasificación de la enfermedad que cursa con síndrome vestibular permite la obtención de datos útiles para el diagnóstico diferencial entre la EM y la MV.
Un tercer aspecto de la invención se refiere a un método para el diagnóstico de MV, de ahora en adelante segundo método de la invención, que comprende los pasos (a) y (b) del primer método de la invención, y además comprende:
c1) incluir al individuo del paso (a) en el grupo de individuos con MV con al menos 90% de probabilidad, cuando presentan unos niveles inferiores a 0,75 pg/mL de I L- 1 b , superiores a 200,00 pg/mL de CXCL1 , superiores a 90,00 pg/mL de CCL22 y inferiores 5,40 pg/mL de CCL3; c2) incluir al individuo del paso (a) en el grupo de individuos con MV con al menos 95% de probabilidad, cuando presentan unos niveles inferiores a 0,7 pg/mL de I L- 1 b , superiores a 250,00 pg/mL de CXCL1 , superiores a 80,00 pg/mL de CCL22 y inferiores 5,20 pg/mL de CCL3; c3) incluir al individuo del paso (a) en el grupo de individuos con MV con al menos 99% de probabilidad, cuando presentan unos niveles inferiores a 0,28 pg/mL de I L- 1 b , superiores a 328,00 pg/mL de CXCL1 , superiores a 70,00 pg/mL de CCL22 y inferiores 3,00 pg/mL de CCL3
En una realización aún más preferida, el segundo aspecto de la invención comprende incluir al individuo del paso (a) en el grupo de individuos con MV, cuando el resultado de la siguiente ecuación sea superior a 0,50: 1,321 - 1,857 X [IL1B] pg/mL + 0,018 X [CXCL1] pg/mL + 0,046 X [CCL22] pg/mL — 0,993 X [CCL3] pg/mL
En la presente invención "muestra biológica", tal como aquí se utiliza, se refiere, pero no se limita, a células, tejidos y/o fluidos biológicos de un organismo, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia; es decir, cualquiera seleccionada del grupo de fluidos corporales o células, o de un extracto celular o el sobrenadante del cultivo celular de dichas células, y/o biopsia líquida (sangre, suero, plasma, orina,...). En una realización preferida de este aspecto la invención, la muestra aislada en el paso (a) es sangre periférica, y aún más preferiblemente son células mononucleares obtenidas de sangre periférica.
El término“individuo”, tal y como se utiliza en la descripción, se refiere a animales, preferiblemente mamíferos, y más preferiblemente, humanos. El término“individuo” en esta memoria, es sinónimo de “paciente”, y no pretende ser limitativo en ningún aspecto, pudiendo ser éste de cualquier edad, sexo y condición física.
Los pasos (a), (b), y de los métodos descritos anteriormente pueden ser total o parcialmente automatizados, por ejemplo, por medio de un equipo robótico sensor para la cuantificación del paso (a) o el cálculo computarizado de cualquiera de los índices de los pasos (b), (c) y/o (d), o la clasificación computarizada en los pasos
KIT O DISPOSITIVO DE LA INVENCIÓN Y USOS
Un cuarto aspecto de la invención se refiere a un kit o dispositivo para el diagnóstico y clasificación de una enfermedad que cursa con síndrome vestibular episódico, de ahora en adelante kit o dispositivo de la invención, que comprende los elementos necesarios para determinar los niveles de IL-Ib, CCL22, CCL3 y CXCL1 en una muestra biológica aislada de un individuo. En una realización preferida de este aspecto la invención, la muestra aislada es sangre periférica, y aún más preferiblemente son células mononucleares obtenidas de sangre periférica. En otra realización preferida de este aspecto, el kit o dispositivo de la invención comprende cebadores, sondas y/o anticuerpos capaces de detectar y cuantificar las citoquinas proinflamatorias Mb, CCL22, CCL3 y CXCL1 en una muestra biológica aislada. En otra realización preferida el kit o dispositivo comprende los elementos necesarios para cuantificar los niveles de expresión de los genes, y donde:
los cebadores o primers son secuencias de polinucleótidos de entre 10 y 30 pares de bases, más preferiblemente de entre 15 y 25 pares de bases, aún más preferiblemente de entre 18 y 22 pares de bases, y aún mucho más preferiblemente de alrededor de 20 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID N° 1 (II~1b), SEQ ID N°: 3 ( CCL22 ), SEQ ID N° 5 ( CCL3 ), y SEQ ID N° 7 ( CXCL1 ),
- las sondas son secuencias de polinucleótidos de entre 80 y 1100 pares de bases, más preferiblemente de entre 100 y 1000 pares de bases, y aún más preferiblemente de entre 200 y 500 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID N° 1 (IL1/.3), SEQ ID N°: 3 ( CCL22 ), SEQ ID N° 5 ( CCL3 ), y SEQ ID N° 7 ( CXCL1 ),
- los anticuerpos son capaces de unirse específicamente a una región formada por cualquiera de las secuencias aminoacídicas SEQ ID N° 2 (IL1¡ 3), SEQ ID N° 4 (CCL22), SEQ ID N° 6 (CCL3), y/o SEQ ID N° 8 (CXCL1).
Aún más preferiblemente, la detección de los niveles de las citoquinas proinflamatorias se realiza mediante técnicas inmunológicas, con anticuerpos, y aún más preferiblemente mediante ELISA. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, los anticuerpos están modificados. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el anticuerpo es humano, humanizado o sintético. En otra realización preferida, el anticuerpo es monoclonal y/o se encuentra marcado con un fluorocromo. Preferiblemente, el fluorocromo se selecciona de la lista que comprende Fluoresceína (FITC), Tetrametilrodamina y derivados, Ficoeritrina (PE), PerCP, Cy5, Texas, aloficocianina, o cualquiera de sus combinaciones.
Por tanto, preferiblemente, los anticuerpos del kit de la invención se encuentran conjugados a moléculas que emiten señales detectables como un isótopo radioactivo, una enzima, una partícula fluorescente o una sustancia quimioluminiscente o bien ensayos que son medidos por dispersión de luz o visualización directa como son la precipitación, aglutinación o la difusión radial. Dicho kit o dispositivo puede contener todos aquellos reactivos necesarios para determinar las citoquinas de la invención por medio de cualquiera de los métodos existentes en el estado de la técnica y/o descritos en este documento. El kit además puede incluir, sin ningún tipo de limitación, tampones, agentes para prevenir la contaminación, inhibidores de la degradación de las proteínas, etc. Por otro lado el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo cualquiera de los métodos de la invención.
Es también posible que el(los) anticuerpo(s) estén inmovilizados sobre una superficie (preferiblemente sólida). En una de sus realizaciones, el kit comprende una micromatriz, o micromatriz de la invención. Una micromatriz de anticuerpos es una matriz sobre un sustrato sólido (normalmente un porta de vidrio o una celda de una película fina de silicio). La detección se realiza colorimétricamente por la interacción de un sustrato cromogénico y una enzima que ha sido acoplada a un anticuerpo detector. Cada mancha contiene el(los) anticuerpo(s). Aunque el número de manchas no está limitado de manera alguna, existe una realización preferida en que la matriz se personaliza para los procedimientos de la invención. En una realización, dicha matriz personalizada comprende cincuenta manchas o menos, tal como treinta manchas o menos, incluyendo veinte manchas o menos. Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere a una matriz que comprende el(los) anticuerpo(s) de la invención.
La síntesis in situ sobre un soporte sólido (por ejemplo, vidrio), podría hacerse mediante la tecnología chorro de tinta (ink-jet), lo que requiere sondas más largas. Los soportes podrían ser, pero sin limitarse, filtros o membranas de NC o nylon (cargadas), silicio, o portas de vidrio para microscopios cubiertos con aminosilanos, polilisinas, aldehidos o epoxy.
Un quinto aspecto de la invención se refiere al uso del kit de la invención, para el diagnóstico y clasificación de una enfermedad que cursa con síndrome vestibular episódico. En una realización preferida de este aspecto de la invención, la enfermedad que cursa con síndrome vestibular es la EM o la MV, empleándose para el diagnóstico diferencial de EM y MV, y más concretamente, para el diagnóstico de la MV.
AUTOMATIZACIÓN DEL MÉTODO DE LA INVENCIÓN IMPLEMENTÁNDOLO EN UN PROGRAMA DE ORDENADOR La invención se extiende también a programas de ordenador adaptados para que cualquier medio de procesamiento pueda llevar a la práctica los métodos de la invención. Tales programas pueden tener la forma de código fuente, código objeto, una fuente intermedia de código y código objeto, por ejemplo, como en forma parcialmente compilada, o en cualquier otra forma adecuada para uso en la puesta en práctica de los procesos según la invención. Los programas de ordenador también abarcan aplicaciones en la nube basadas en dicho procedimiento.
Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere a un programa de ordenador que comprende instrucciones para realizar el procedimiento de acuerdo con cualquiera de los métodos de la invención.
En particular, la invención abarca programas de ordenador dispuestos sobre o dentro de una portadora. La portadora puede ser cualquier entidad o dispositivo capaz de soportar el programa. Como variante, la portadora podría ser un circuito integrado en el que va incluido el programa y que se haya adaptado para ejecutar, o para ser utilizado en la ejecución de los procesos correspondientes.
Por ejemplo, los programas podrían estar incorporados en un medio de almacenamiento, como una memoria ROM, una memoria CD ROM o una memoria ROM de semiconductor, una memoria USB, o un soporte de grabación magnética, por ejemplo, un disco flexible o un disco duro. Alternativamente, los programas podrían estar soportados en una señal portadora transmisible; por ejemplo, podría tratarse de una señal eléctrica u óptica que podría transportarse a través de cable eléctrico u óptico, por radio o por cualesquiera otros medios.
La invención se extiende también a programas de ordenador adaptados para que cualquier medio de procesamiento pueda llevar a la práctica los métodos de la invención. Los programas de ordenador también abarcan aplicaciones en la nube basadas en dicho procedimiento.
Otros aspectos de la invención se refieren al medio de almacenamiento legible y a la señal transmisible que comprende instrucciones de programa necesarias para la ejecución del método de invención por un ordenador. Otro aspecto de la invención se refiere a una señal transmisible que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.
Los términos “polinucleótido” y “ácido nucleico” se usan aquí de manera intercambiable, refiriéndose a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, tanto ribonucleótidos (ARN ó RNA) como desoxirribonucleótidos (ADN ó DNA).
Los términos “secuencia aminoacídica”, “péptido”, “oligopéptido”, “polipéptido” y “proteína” se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden ser codificantes o no codificantes, química o bioquímicamente modificados.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
EJEMPLOS DE LA INVENCIÓN
A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores.
Materiales y Métodos Sujetos y muestras
El presente estudio incluyó un total de 48 pacientes con la enfermedad de Meniere y 16 pacientes con migraña vestibular. Los pacientes fueron incluidos en 6 centros: Hospital Universitario de Granada, Hospital Universitario de Getafe, Hospital Clínico de Santiago de Compostela, Hospital Universitario de Salamanca, Hospital Universitario Lucus Augusti de Lugo, Hospital Montecelo de Pontevedra entre noviembre de 2014 y marzo de 2018. Se obtuvieron muestras de sangre periférica para la separación de células mononucleares y la determinación de citoquinas tras el ensayo in vitro. Estas muestras se obtuvieron en pacientes que no habían tenido crisis de vértigo actualmente, ni la habían presentado al menos 30 días antes de la fecha de la obtención de la muestra. Los pacientes fueron diagnosticados mediante la escala de diagnóstico de la Academia Americana de Otorrinolaringología-Cirugía de Cabeza y Cuello (AAO-HNS) (Committee on Hearing and Equilibrium guidelines for the diagnosis and evaluation of therapy in Meniere’s disease. American Academy of Otolaryngology- Head and Neck Foundation, Inc. Otolaryngol Head Neck Surg. 1995. 113, 181-185).
Un examen básico neurotológico incluyendo la audiometría de tonos puros, nistagmo en posición primaria, nistagmo evocado por la mirada, nistagmo de agitación cefálica y prueba calórica estándar se realizó en todos los pacientes. El estadio auditivo para cada paciente con EM definitiva se define como la media del promedio de cuatro tonos de 0,5, 1 , 2 y 3 kHz de acuerdo con los criterios de la AAO-HNS: estadio 1 , £ 25 dB; estadio 2, 26-40dB, estadio 3, 41-70dB, y estadio 4, > 70 dB. El diagnóstico de migraña se realizó mediante los criterios de la International Headache Society y el diagnostico de migraña vestibular mediante los criterios de la Barany Society (2012).
El estudio se llevó a cabo de acuerdo con los principios de la Declaración de Helsinki para la investigación con seres humanos. El comité de investigación del hospital aprobó el protocolo de investigación. Las células mononucleares de sangre periférica se aislaron mediante gradiente de Ficoll. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado para el estudio.
Ensayo in vitro de células mononucleares.
Las células mononucleares de sangre periférica fueron aisladas mediante gradientes de densidad con Ficoll y cultivadas en medio RPMI1640 suplementado con un 10% de suero bovino fetal, 1% piruvato y 1 % aminoácidos esenciales, plaqueadas a 1x106 células/ml en placas de 6 pocilios e incubadas 16h a 37°C a un 7% de CO2. Al final de la incubación las células se centrifugaron, se guardó el sobrenadante y se extrajo el ARN y las proteínas de las células.
Medición de citoquinas en sobrenadante mediante placas Multiplex
Los niveles de las citoquinas I L- 1 b , CCL22, CCL3 y CXCL1 en lo sobrenadante se cuantificaron simultáneamente mediante un inmunoensayo con bolitas magnéticas (EMD Millipore, Billerica, MA, USA) utilizando un lector Luminex 2000 (Luminex Corp., Austin, TX, USA) y analizado con el software Luminex x PONENT 3.1 (Luminex Corp., Austin, TX, USA).
Análisis estadístico.
Se hizo un análisis estadístico descriptivo utilizando el programa SPSS v.22 (SPSS Inc, Chicago, IL, USA). Las variables se compararon utilizando el teste de Mann- Whitney.
Se hizo una regresión logística y con esas probabilidades se diseñó una curva ROC (Receiver operating characteristic), utilizando el programa SPSS v.22 (SPSS Inc, Chicago, IL, USA).
Resultados
Los individuos con migraña vestibular (I L-1 b = 1.66 ± 0.88 pg/mL; CCL22 = 193.85 ± 37.49 pg/mL; CCL3 = 7.69 ± 1.34 pg/mL; CXCL1 = 555.68 ± 84.58 pg/mL) presentaban niveles de CCL22 y CXCL1 superiores a los individuos con Enfermedad de Meniere y los niveles de IL-1 b y CCL3 inferiores a los individuos con Enfermedad de Meniere (IL-I b = 12.68 ± 2.19 pg/mL; CCL22 = 75.78 ± 11.15 pg/mL; CCL3 = 41.61 ± 9.40 pg/mL; CXCL1 = 379.81 ± 73.40 pg/mL).
Se valoró la rentabilidad diagnóstica de I L- 1 b , CCL22, CCL3 y CXCL1 para discriminar entre MV y EM obteniéndose una sensibilidad del 93.8%, una especificidad del 95.8%, un valor predictivo positivo del 97.83% y un valor predictivo negativo del 11.76%.
Tabla 1. Resumen de los distintos modelos multivariantes o univariantes utilizando las citoquinas: II_-1b, CCL22, CCL3 y CXCL1.
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Claims

REIVINDICACIONES
1. Uso simultáneo de Mb, CCL22, CCL3 y CXCL1 para la obtención de datos útiles para el diagnóstico de una enfermedad que cursa con síndrome vestibular episódico.
2. Un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico de una enfermedad que cursa con síndrome vestibular episódico, que comprende:
a) detectar los niveles del producto de expresión de Mb, CCL22, CCL3 y CXCL1 en una muestra biológica aislada de un individuo, y
b) comparar los niveles de Mb, CCL22, CCL3 y CXCL1 detectados en el paso (a), con los niveles detectados en una muestra de referencia, preferiblemente la muestra de referencia son los niveles básales en un individuo con Enfermedad de Meniere.
3. Un método para el diagnóstico y clasificación de una enfermedad que cursa con síndrome vestibular episódico comprende los pasos (a) y (b) según la reivindicación anterior, y además comprende:
c1. incluir al individuo del paso (a) en el grupo de individuos con MV con al menos 90% de probabilidad, cuando presentan unos niveles inferiores a 0,75 pg/mL de I L- 1 b , superiores a 200,00 pg/mL de CXCL1 , superiores a 90,00 pg/mL de CCL22 y inferiores 5,40 pg/mL de CCL3; y/o c2) incluir al individuo del paso (a) en el grupo de individuos con MV con al menos 95% de probabilidad, cuando presentan unos niveles inferiores a 0,7 pg/mL de I L- 1 b , superiores a 250,00 pg/mL de CXCL1 , superiores a 80,00 pg/mL de CCL22 y inferiores 5,20 pg/mL de CCL3; y/o c3) incluir al individuo del paso (a) en el grupo de individuos con MV con al menos 99% de probabilidad, cuando presentan unos niveles inferiores a 0,28 pg/mL de I L- 1 b , superiores a 328,00 pg/mL de CXCL1 , superiores a 70,00 pg/mL de CCL22 y inferiores 3,00 pg/mL de CCL3.
4. El método según cualquiera de las reivindicaciones 2-3, que comprende incluir al individuo del paso (a) en el grupo de individuos con MV, cuando el resultado de la siguiente ecuación es superior a 0,50:
1,321 - 1,857 X [IL1B] pg/mL + 0,018 X [CXCL1] pg/mL
+ 0,046 X [CCL22] pg/mL— 0,993 X [CCL3] pg/mL
5. El método según cualquiera de las reivindicaciones 2-4, donde la muestra aislada en el paso (a) es sangre periférica.
6. El método según cualquiera de las reivindicaciones 2-5, donde la muestra aislada en el paso (a) son células mononucleares obtenidas de sangre periférica.
7. El método según cualquiera de las reivindicaciones 2-6, donde la determinación de citoquinas de la invención se realiza mediante técnicas inmunológicas (basadas en la interacción antígeno-anticuerpo).
8. El método según cualquiera de las reivindicaciones 2-7, donde las técnicas inmunológicas se seleccionan de entre: inmunoensayo, western blot, inmunoprecipitación, inmunohistoquímica o inmunofluorescencia.
9. Un kit o dispositivo que comprende los elementos necesarios para cuantificar los niveles de expresión de los genes, y donde:
los cebadores o primers son secuencias de polinucleótidos de entre 10 y 30 pares de bases, más preferiblemente de entre 15 y 25 pares de bases, aún más preferiblemente de entre 18 y 22 pares de bases, y aún mucho más preferiblemente de alrededor de 20 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID N° 1 (I L1 b), SEQ ID N°: 3 (CCL22), SEQ ID N° 5 (CCL3), y SEQ ID N° 7 (CXCL1), ,
- las sondas son secuencias de polinucleótidos de entre 80 y 1100 pares de bases, más preferiblemente de entre 100 y 1000 pares de bases, y aún más preferiblemente de entre 200 y 500 pares de bases, que presentan una identidad de al menos un 80%, más preferiblemente de al menos un 90%, aún más preferiblemente de al menos un 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos un 98%, y particularmente de un 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a la SEQ ID N° 1 (I L1 b), SEQ ID N°: 3 (CCL22), SEQ ID N° 5 (CCL3), y SEQ ID N° 7 (CXCL1),
- los anticuerpos son capaces de unirse específicamente a una región formada por cualquiera de las secuencias aminoacídicas SEQ ID N° 2 (IL1 b), SEQ ID N° 4(CCL22), SEQ ID N° 6 (CCL3), y/o SEQ ID N° 8 (CXCL1)..
10. El uso de un kit o dispositivo según la reivindicación anterior, para el diagnóstico de una enfermedad que cursa con síndrome vestibular episódico.
11. El uso de un kit o dispositivo según la reivindicación 10, donde la enfermedad que cursa con síndrome vestibular episódico es la MV.
PCT/ES2020/070193 2019-03-20 2020-03-19 Panel de citoquinas/quimiocinas para el diagnóstico diferencial en el síndrome vestibular episódico WO2020188136A1 (es)

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WO2017207859A1 (es) * 2016-06-03 2017-12-07 Servicio Andaluz De Salud Citoquinas proinflamatorias como marcador diagnóstico en el síndrome vestibular episódico.

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