ES2967073T3 - Biomarcadores de lesión cerebral traumática - Google Patents
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Abstract
Se proporciona un método para diagnosticar y/o monitorear una lesión cerebral traumática (TBI) en un sujeto. El método comprende determinar un nivel de al menos un miARN en una muestra de fluido del sujeto. El miARN puede seleccionarse entre miR-425-5p, miR-502, miR-21 y miR-335. El método puede implicar determinar si un sujeto sufre un TBI leve o un TBI de moderado a grave. También se proporciona un elemento sensor, un sistema de detección, una composición y un kit para diagnosticar y/o monitorear una TBI, y un método para determinar un tratamiento apropiado para un sujeto con sospecha de TBI. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Biomarcadores de lesión cerebral traumática
Campo de la invención
La presente invención se refiere a métodos para diagnosticar y/o monitorear lesiones cerebrales traumáticas leves (mTBI) y al uso de composiciones, kits, sistemas para diagnosticar y/o monitorear lesiones cerebrales traumáticas leves (mTBI). Más particularmente, la presente invención se refiere al diagnóstico y monitoreo de TBI usando biomarcadores miARN, incluyendo miR-502.
Antecedentes de la invención
La lesión cerebral traumática (TBI) es la principal causa de muerte y discapacidad en personas menores de 45 años en los países occidentales. Se espera que su carga sanitaria y sus costos sociales sigan aumentando y, para 2020, la Organización Mundial de la Salud proyecta que la TBI se convierta en la tercera causa principal de discapacidad en todo el mundo.
A pesar de muchos estudios, no se ha encontrado ningún biomarcador fiable que evalúe la gravedad de la TBI y prediga la recuperación. Esto es especialmente cierto para el TBI leve (mTBI), que actualmente sigue siendo difícil de evaluar en la práctica clínica. Aunque los pacientes con TBI son evaluados inicialmente por la Escala de coma de Glasgow (GCS) y las técnicas de neuroimágenes, las herramientas diagnósticas actuales carecen de la capacidad de definir y cuantificar con precisión la gravedad real de la lesión cerebral, lo que conduce a una fácil detección de TBI grave, pero no de mTBI, que representa la gran mayoría de los casos (75-90 %).
El diagnóstico correcto de la mTBI es particularmente importante en pacientes, tales como atletas, soldados y niños, quienes corren un mayor riesgo de mTBI repetitiva y una forma catastrófica de lesión cerebral conocida como síndrome de segundo impacto (SIS), en donde los efectos sinérgicos de la TBI repetida causan un daño profundo e incluso la muerte. El diagnóstico temprano y la evaluación de la gravedad de la TBI se convierten, por lo tanto, en cruciales para el bienestar de los pacientes y, en última instancia, para salvar su vida.
La búsqueda de biomarcadores de TBI ha recibido un impulso significativo por el aumento del perfil de la conmoción cerebral deportiva en los medios de comunicación. En los últimos años, muchos estudios se han centrado en biomarcadores que pueden apoyar la toma de decisiones clínicas a pie de campo o en una clínica deportiva. Sin embargo, los biomarcadores proteicos reportados en la literatura carecen de especificidad o sensibilidad, o no son detectables durante algún tiempo después de la lesión. Esto puede deberse al hecho de que después de la conmoción cerebral, que es una forma de TBI, los compuestos derivados del cerebro sólo se liberan en cantidades muy pequeñas y la barrera hematoencefálica permanece en su mayoría cerrada.
Los microARN (miARN) son una clase abundante de moléculas de ARN altamente conservadas y no codificantes de aproximadamente 22 nucleótidos de longitud que inducen la degradación del ARNm, la represión traslacional o ambos mediante el emparejamiento con sitios parcialmente complementarios en la UTR 3' de los genes objetivo. El genoma humano codifica más de 2000 miARN, que pueden dirigirse a aproximadamente el 60 % de todos los genes. Sin embargo, a pesar de la abundancia de miARN, sus funciones biomoleculares y su participación en la patología aún no están completamente esclarecidas. Desempeñan un papel central en muchos procesos biológicos, incluyendo el ciclo celular, el metabolismo celular, la apoptosis y las respuestas inmunitarias, y están atrayendo un creciente interés en la investigación clínica como biomarcadores potenciales para la detección, identificación y clasificación de cánceres y otros estados de la enfermedad, incluyendo enfermedades neurodegenerativas.
WO 2015/196191 A1 divulga un método para diagnosticar y/o monitorear mTBI en un sujeto, en donde el método comprende determinar un nivel de al menos un miARN en una muestra de fluido del sujeto, en donde el nivel de al menos un miARN se determina en una muestra de fluido obtenida del sujeto no más de 48 horas después de la lesión, en donde la muestra de fluido comprende saliva, sangre, plasma o suero.
El presente invento fue ideado teniendo en cuenta estas cuestiones.
Breve descripción de la invención
La presente invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas. En un primer aspecto de la invención, el método comprende i) diagnosticar una lesión cerebral traumática leve (mTBI) en un sujeto, en donde el método comprende determinar el nivel de miR-502 en una muestra de fluido obtenida de la muestra hasta 48 horas después de la lesión, y/o ii) monitorear la lesión cerebral traumática leve en un sujeto, en donde el método comprende determinar el nivel de miR-502 en una muestra de fluido obtenida del sujeto al menos 2 días después de la lesión, en donde la muestra de fluido comprende suero.
La presente divulgación proporciona un método para diagnosticar o monitorear la lesión cerebral traumática (TBI) en un sujeto.
La divulgación se refiere a un método para diagnosticar y/o monitorear una lesión cerebral traumática (TBI) en un sujeto, en donde el método comprende detectar la presencia de y/o determinar un nivel de al menos un miARN en una muestra del sujeto.
Al menos un miARN (también denominado en la presente “miR”) puede seleccionarse del grupo que consiste en miR-505, miR-203, miR-654-3p, miR-655, miR-184, miR-301b, miR-425-5p, miR-502, miR-21, miR-let-7g, miR-335, miR-126*, miR-193a-5p, miR-144*, miR-190, miR-194, miR-365, miR-590-3p, miR-624, miR-625*, miR-671-3p, hsa-let-7c-5p, hsa-let-7i-5p miR-142-3p, miR-148a-3p, miR-15b-5p, miR-16-5p, miR-181a-5p, miR-20a-5p, miR-20b-5p, miR-221-3p, miR-24-3p, miR-27b-3p, miR-29a-3p, miR-29c-3p, miR-424-5p, miR-30a-5p; miR-107; miR-135b-5p; miR-199b-5p; miR-324-5p; miR-652-3p; miR-10a, miR-132, miR-223, miR-143, miR-148b, miR-18a, miR-192, miR-429, miR-618, miR-95, miR-130a, miR-152, miR-27b, miR-301, miR-326, miR-345, miR-361, miR-422a, miR-579, miR-642, miR-99a, miR-520D-3p y miR-629. Estos miARN pueden denominarse en la presente miARN de interés o miARN de objetivo. En la presente invención, al menos un miARN comprende miR-502.
En algunas modalidades, al menos un miARN se selecciona del grupo que consiste en miR-505, miR-203, miR-654-3p, miR-655, miR-184, miR-301b, miR-425-5p, miR-502, miR-21, miR-let-7g, miR-335, hsa-miR-126*, miR-193a-5p, miR-144*, miR-190, miR-194, miR-365, miR-590-3p, miR-624, miR-625*, y miR-671-3p, en donde el al menos un miARN comprende miR-502. Se ha encontrado que estos microARN son biomarcadores expresados en todos los pacientes con TBI (leve o grave).
En algunas modalidades, al menos un miARN se selecciona del grupo que consiste en miR-505, miR-203, miR-654-3p, miR-655, miR-184, miR-301b, miR-425-5p, miR-502, miR-21, miR-let-7g y miR-335, en donde al menos un miARN comprende miR-502.
En algunos ejemplos de referencia divulgados en la presente sólo como referencia, al menos un miARN se selecciona del grupo que consiste en let-7c-5p, let-7i-5p, miR-142-3p, miR-148a-3p, miR-15b-5p, miR-16-5p, miR-181a-5p, miR-20a-5p, miR-20b-5p, miR-221-3p, miR-24-3p, miR-27b-3p, miR-29a-3p, miR-29c-3p, y miR-424-5p; miR-30a-5p; miR-107; miR-135b-5p; miR-199b-5p; miR-324-5p; miR-652-3p.
En algunos ejemplos de referencia divulgados en la presente sólo como referencia, al menos un miARN se selecciona del grupo que consiste en miR-10a, miR-132, miR-223, miR-143, miR-148b, miR-18a, miR-192, miR-429, miR-618, miR-95, miR-130a, miR-152, miR-194, miR-27b, miR-301, miR-326, miR-345, miR-361, miR-422a, miR-579, miR-642, miR-99a, miR-520D-3p y miR-629.
Para evitar dudas, y en la presente divulgación, se entenderá que “al menos un miARN se selecciona de un grupo de miARN”, como se utiliza en la presente, significa que el método en cuestión, ya sea realizado para un diagnóstico, pronóstico, o propósito terapéutico, puede llevarse a cabo con cualquiera de los miARN enumerados o con cualquier pluralidad de los miARN enumerados (por ejemplo, dos, tres, cuatro o más de los miARN enumerados). De ello se deduce que cualquiera o más de los miARN enumerados pueden excluirse explícitamente. Por ejemplo, en donde se selecciona al menos un miARN del grupo que consiste en miR-505, miR-203, miR-654-3p, miR-655, miR-184, miR-301b, miR-425-5p, miR-502, miR-21, miR-let-7g y miR-335, el método puede incluir la detección y/o evaluación del nivel de cualquier combinación de miR-505, miR-203, miR-654-3p, miR-655, miR-184, miR-301b, miR-425-5p, miR-502, miR-21 y miR-let-7g, con la exclusión de miR-335. En la presente invención, al menos un miARN comprende miR-502.
De acuerdo con la invención, se proporciona un método para i) diagnosticar una lesión cerebral traumática leve (mTBI) en un sujeto, el método comprende determinar el nivel de al menos un miARN en una muestra de fluido obtenida del sujeto hasta 48 horas después de la lesión, y/o ii) monitorear la mTBI en un sujeto, en donde el método comprende determinar el nivel de miR-502 en una muestra de fluido obtenida del sujeto al menos 2 días después de la lesión, en donde el miARN se selecciona del grupo que consiste en: miR-425-5p; miR-502; miR-21; y miR-335, siempre que el miARN comprenda miR-502.
La lesión cerebral traumática ocurre cuando una fuerza externa lesiona el cerebro de forma traumática. Existen diferentes sistemas para clasificar la TBI en función de , por ejemplo, la gravedad, el tipo de lesión y el pronóstico. El sistema más comúnmente utilizado para clasificar la TBI es la Escala de Coma de Glasgow (GCS), que califica el nivel de conciencia de una persona en una escala de 3-15 con base en reacciones verbales, motoras y que abren los ojos a los estímulos. En general, una TBI con un puntaje GCS de 13 o más se define como leve, 9-12 como moderada y 8 o menos como grave. Otro sistema, el Sistema de Clasificación de Mayo, tiene tres clasificaciones principales que incluyen una TBI moderada-grave definida, TBI leve probable y posible<t>B<i>. En cada diagnóstico se utilizan múltiples criterios, tal como pérdida del conocimiento, amnesia postraumática, fractura de cráneo y evidencia de anomalías neurorradiológicas, tal como hematoma subdural, contusión cerebral y contusión hemorrágica. La clasificación de TBI utilizando los sistemas GCS o MAYO será conocida por aquellos expertos en la técnica
Como se utiliza en la presente, las referencias a TBI “leve”, “moderada” y “grave” se hacen de acuerdo con la GCS. Las referencias de en la presente a la TBI “moderada a grave” abarcan tanto la TBI moderada como la grave de acuerdo con la GCS.
Se espera que el diagnóstico y/o el monitoreo de la TBI mediante los biomarcadores de la presente invención apoyen la toma de decisiones clínicas y los regímenes de tratamiento en una variedad de contextos, incluyendo las siguientes situaciones: como parte del valoración inicial de los paramédicos para determinar si los pacientes deben ser transportados a un centro con experiencia en neurocirugía, a un centro de traumatología importante, o a una unidad local de traumatología; en el departamento de urgencias de los hospitales para determinar el tratamiento adecuado, incluyendo la necesidad de una tomografía computarizada cerebral; a pie de campo, para ayudar a la toma de decisiones en cuanto a la eliminación de un jugador del juego y valorar la necesidad de llevar a un jugador al hospital; en las clínicas deportivas, para confirmar un evento de conmoción cerebral y permitir la toma de decisiones con respecto a volver al juego; en situaciones de combate, para determinar la necesidad de enviar un equipo de rescate y evacuar a una víctima. Por lo tanto, los sujetos para quienes la presente invención proporciona un beneficio particular incluyen víctimas de accidentes, jugadores deportivos y personal militar. En cualquier caso, pero tal vez particularmente cuando el sujeto está en mayor riesgo de una TBI (por ejemplo, cuando el sujeto es un atleta profesional o está alistado en el ejército), se puede obtener una muestra del sujeto en un momento previo a cualquier trauma conocido o reciente (por ejemplo, cerca del comienzo de una carrera deportiva o antes de un despliegue militar) y cualquier miARN de interés se puede evaluar en ese momento o más tarde, cuando el sujeto ha experimentado una posible TBI. Tales muestras pueden proporcionar así un estándar de referencia interno. En algunas modalidades, el sujeto es un humano.
En otros ejemplos de referencia divulgados en la presente sólo como referencia, la TBI es una TBI de moderada a grave (m-sTBI). En otros ejemplos de referencia divulgados en la presente sólo como referencia, la TBI es una TBI moderada o una TBI grave (sTBI). El nivel del miARN o de cada miARN en la muestra se puede determinar cuantitativa o semicuantitativamente. Por “cuantitativamente”, se entenderá que se determina la cantidad o concentración absoluta del miARN o de cada miARN en la muestra. La cantidad absoluta de miARN o de cada miARN en la muestra puede entonces compararse con un umbral predeterminado (por ejemplo, un valor de la literatura publicada para los niveles normales esperados), un nivel conocido del mismo o un miARN de referencia en una muestra de control tomada de un sujeto sano, o la cantidad de un miARN de referencia en la muestra tomada del sujeto. En algunas modalidades, se diagnostica que el sujeto tiene una TBI cuando el nivel del miARN está por debajo del umbral predeterminado, o disminuye en relación con una muestra de referencia o control. En otras modalidades, se diagnostica que el sujeto tiene una TBI cuando el nivel del miARN está aumentado en comparación con el umbral predeterminado.
Por “semicuantitativamente”, se entenderá que el nivel del o cada miARN de interés se mide en relación con una referencia.
La referencia puede ser un miARN invariante, es decir, un miARN que tiene un nivel de expresión que permanece sustancialmente sin cambios entre los sujetos sanos y aquellos que tienen una TBI. Se puede diagnosticar que un sujeto sufre de una TBI si el nivel del miARN o de cada miARN de interés se incrementa o disminuye en relación con el de un miARN invariante. Los miARN invariantes adecuados incluyen miR-331, miR-223*, miR-23a-3p y miR148b-3p. miR-23a-3p y miR148b-3pson invariantes sólo en saliva.
En algunas modalidades, el nivel del miARN o de cada miARN en la muestra obtenida del sujeto puede ser de aproximadamente 0,01 veces a aproximadamente 100 times, aproximadamente 0,05 veces a aproximadamente 50 times, aproximadamente 0,1 veces a aproximadamente 10 times, aproximadamente 0,5 veces a aproximadamente 5 times, aproximadamente 1,0 a aproximadamente 3 times, o aproximadamente 1,5 veces a aproximadamente 2,0 veces más bajo o más alto que el nivel en la muestra de control, el nivel de referencia o el valor publicado.
Cuando se emplea un dispositivo o método para generar un valor, podemos calificar ese valor con el término “aproximadamente” para capturar el valor declarado y cualquier variación de ese valor inherente al dispositivo o método empleado. Cuando los valores o rangos de valores se divulgan específicamente, “aproximadamente” puede significar más o menos el 10 % del valor o rango indicado. Por ejemplo, aproximadamente 10 minutos puede significar 9-11 minutos.
El nivel del miARN o de cada miARN de interés se puede determinar utilizando métodos conocidos por los expertos en la técnica. En algunas modalidades, determinar el nivel del miARN o de cada miARN de interés comprende amplificar el miARN. En algunas modalidades, el miARN total puede aislarse primero de la muestra utilizando técnicas estándar, por ejemplo, utilizando el mini kit miRNeasy (Qiagen). La cantidad del miARN de interés puede entonces ser determinada. En algunas modalidades, el nivel del miARN o de cada miARN de interés en la muestra se determina mediante PCR ( reacción en cadena de la polimerasa). Por ejemplo, la PCR cuantitativa puede utilizarse para la determinación cuantitativa del nivel del miARN o de cada miARN de interés. La PCR también se puede utilizar para la determinación semicuantitativa, comparando el nivel del miARN o de cada miARN de interés en la muestra con el de una referencia (por ejemplo, un miARN invariante).
Las técnicas adecuadas para la detección y/o cuantificación de miARN, que serán conocidas por los expertos en la técnica, incluyen qPCR, ensayos de miARN, secuenciación de última generación (NGS) y ensayos de perfiles de miARN multiplex.
En algunas modalidades, el nivel del miARN o de cada miARN de interés se determina mediante hibridaciónin situ,por ejemplo, utilizando una sonda (por ejemplo, una sonda etiquetada) específica para el miARN.
El nivel de miARN puede determinarse en una muestra que se obtuvo del sujeto inmediatamente después de la lesión (es decir, menos de 1 hora después de la lesión), y/o en una muestra obtenida en uno o más puntos de tiempo unas horas o días después de la lesión. Por lo tanto, los cambios en el nivel de miARN se pueden detectar con el tiempo para permitir el monitoreo de una TBI. En caso de que los niveles de miARN cambien con el tiempo, los métodos descritos en la presente para monitorear la TBI pueden ampliarse para incluir el mantenimiento o ajuste del régimen de tratamiento del sujeto en consecuencia. En la presente invención, el método comprende i) diagnosticar una lesión cerebral traumática leve (mTBI) en un sujeto, en donde el método comprende determinar el nivel de miR-502 en una muestra de fluido obtenida del sujeto hasta 48 horas después de la lesión, y/o ii) monitorear la lesión cerebral traumática leve en un sujeto, en donde el método comprende determinar el nivel de miR-502 en una muestra de fluido obtenida del sujeto al menos 2 días después de la lesión, en donde la muestra de fluido comprende suero.
Dependiendo del miARN específico y del tipo de TBI, el nivel de miARN en el sujeto puede cambiar significativamente con el tiempo. En algunas modalidades, por lo tanto, puede ser ventajoso medir el miARN relativamente pronto después de la lesión para permitir un diagnóstico preciso. En algunas modalidades, el nivel de miARN se determina en una muestra obtenida del sujeto no más de 72 horas, no más de 48 horas, no más de 36 horas, no más de 24 horas, no más de 12 horas, no más de 6 horas, no más de 4 horas, no más de 2 horas o no más de 1 hora después de la lesión.
El nivel de algunos miARN es sustancialmente estable con el tiempo, lo que permite realizar un diagnóstico unas pocas horas, días o incluso semanas después de la lesión. En algunas modalidades, el nivel de miARN se determina en una muestra obtenida del sujeto hasta 20, 18, 15, 12, 10, 8, 5 o 2 días a partir de la lesión. En algunas modalidades, el nivel de miARN se determina en una muestra obtenida del sujeto inmediatamente después de la lesión (por ejemplo, a T= 0 h), a las 4-12 horas después de la lesión, a las 48-72 horas después de la lesión, o a los 15 días después de la lesión.
En la presente invención, la TBI es una TBI leve (mTBI) y al menos un miARN se selecciona del grupo que consiste en miR-505, miR-203, miR-654-3p, miR-655, miR-184, miR-301b, miR-425-5p, miR-502, miR-21, miR-let-7g, miR-335, hsamiR-126*, miR-193a-5p, miR-144*, miR-190, miR-194, miR-365, miR-590-3p, miR-624, miR-625*, y miR-671-3p, en donde el al menos un miARN comprende miR-502.
En la presente invención, la TBI es TBI leve (mTBI) y el miRNA se selecciona del grupo que consiste en miR-425-5p y miR-502, siempre que el miRNA comprenda miR-502. Se puede diagnosticar que el sujeto presenta mTBI si se determina que el nivel de miR-502 (u opcionalmente miR-425-5p y miR-502) está por debajo de un umbral predeterminado o está reducido en relación con una referencia.
En algunas modalidades, un nivel de miR-502 (u opcionalmente miR-425-5p y miR-502) que está por debajo de un umbral predeterminado, o disminuido en relación con una referencia, es diagnóstico de mTBI cuando el nivel se determina en una muestra obtenida menos de 48 horas después de la lesión.
En algunos ejemplos de referencia divulgados en la presente sólo como referencia, la TBI es TBI moderada a grave (msTBI) y el miARN se selecciona del grupo que consiste en miR-21 y miR-335. Se puede diagnosticar que el sujeto presenta TBI de moderada a grave si se determina que el nivel de miR-21 y/o miR-335 está por encima de un umbral predeterminado, o se ha aumentado en relación con una referencia. En algunos ejemplos de referencia, un nivel de miR-21 y/o miR-335 que está por encima de un umbral predeterminado, o aumentado en relación con una referencia, es diagnóstico de TBI de moderada a grave cuando el nivel se determina en una muestra obtenida hasta 15 días después de la lesión.
En algunos ejemplos de referencia divulgados en la presente sólo como referencia, la TBI es una TBI de moderada a grave (m-sTBI) y al menos un miARN se selecciona del grupo que consiste en miR-10a, miR-132, miR-223, miR-143, miR-148b, miR-18a, miR-192, miR-429, miR-618, miR-95, miR-130a, miR-152, miR-194, miR-27b, miR-301, miR-326, miR-345, miR-361, miR-422a, miR-579, miR-642, miR-99a, miR-520D-3p y miR-629. El paciente puede ser diagnosticado con m-sTBI si el nivel de miR-10a, miR-132, miR-223, miR-143, miR-148b, miR-18a, miR-618, miR-95, miR-130a, miR-152, miR-194, miR-27b, miR-301, miR-326, miR-345, miR-361, miR-422a, miR-579, miR-642 y/o miR-99a se determina que está por encima de un umbral predeterminado, o está aumentado en relación con una referencia. Se puede diagnosticar que el sujeto presenta m-sTBI si se determina que el nivel de miR-192, miR-429, miR-520D-3p y/o miR-629 está por debajo de un umbral predeterminado o está reducido en relación con una referencia.
Los miARN se pueden utilizar individualmente para diagnosticar la TBI. Por ejemplo, en la conmoción cerebral deportiva, miR-502 o miR-425-5p podrían usarse para confirmar que se ha producido una lesión cerebral traumática.
En la presente también se divulga, pero no forma parte de la invención, un método para determinar la gravedad de la TBI, y los pasos de este método se pueden repetir para monitorear al sujeto a lo largo del tiempo. Se entenderá que un resultado positivo para un solo miARN (por ejemplo, se determina que el nivel de un solo miARN está por encima/por debajo de un umbral predeterminado, o que aumenta/disminuye en relación con una referencia) es suficiente para determinar la gravedad de la TBI. Por ejemplo, si el nivel de miR-425-5p está por debajo de un umbral predeterminado, o disminuye en relación con una referencia, se determina que la gravedad de la TBI es leve (mTBI). Sin embargo, puede ser conveniente combinar diferentes miARN (por ejemplo, en un panel prueba) para facilitar la valoración de gravedad de TBI.
En algunas modalidades, el método comprende la determinación de un nivel de una pluralidad (por ejemplo, dos o más) miARN en la muestra. En algunas modalidades, los dos o más miARN se seleccionan del grupo que consiste en: miR-425-5p; miR-502; miR-21; y miR-335, siempre que los dos o más miARN comprendan miR-502.
En algunas modalidades, el método comprende determinar el nivel de:
(i) un primer miARN que es miR-502; y
(ii) un segundo miARN seleccionado de miR-21 y miR-335.
Un sujeto puede ser diagnosticado con una TBI si se determina que el nivel de miR-502 está por debajo de un umbral predeterminado, o reducido en relación con una referencia, o si se determina que el nivel de miR-21 o miR-335 está por encima de un umbral predeterminado, o aumentado en relación con una referencia.
En algunos ejemplos de referencia que se divulgan en la presente sólo como referencia, la TBI es una TBI leve (mTBI) y al menos un miARN se selecciona del grupo que consiste en let-7c-5p, let-7i-5p, miR-142-3p, miR-148a-3p, miR-15b-5p, miR-16-5p, miR-181a-5p, miR-20a-5p, miR-20b-5p, miR-221-3p, miRmmiR-29a-3p, miR-29c-3p, miR-424-5p, miR-30a-5p, miR-107, miR-135b-5p, miR-199b-5p, miR-324-5p y miR-652-3p, o una combinación de los mismos. El sujeto puede ser diagnosticado con una mTBI si hay un cambio en número de veces de al menos 0,5, al menos 1,0, al menos 1,5, al menos 2,0, al menos 2,5, al menos 3,0, al menos 3,5 o al menos 4,0 en el nivel del microARN en comparación con una referencia. En algunas modalidades, se diagnostica que el sujeto tiene mTBI si el nivel o niveles del microARN están aumentados en comparación con una referencia.
Las secuencias y los números de acceso para los miARN descritos en la presente se proporcionan en la Tabla 1:
Tabla 1
Convenientemente, en la presente invención, la muestra es una muestra de fluido obtenida del sujeto. En la presente invención, la muestra es una muestra de fluido que comprende suero. En algunos ejemplos de referencia divulgados en la presente sólo como referencia, la muestra biológica puede comprender al menos uno del grupo que consiste en: orina, saliva, sangre entera, plasma, esputo, semen, heces, un hisopo nasal, lágrimas, un hisopo vaginal, un hisopo rectal, un frotis cervical, una biopsia de tejido y un hisopo uretral. Se entenderá que en algunas modalidades el proceso de obtención de la muestra no forma parte de la invención descrita en la presente.
En la presente invención, la muestra comprende o está constituida por suero. El suero no sólo tiene ventajas prácticas, sino que también está libre de anticoagulantes, tal como la heparina, un posible inhibidor de las reacciones de PCR. El suero también puede verse menos afectado por la hemólisis, en comparación con el plasma.
En algunos ejemplos de referencia divulgados en la presente sólo como referencia, la muestra es saliva. La saliva puede obtenerse fácilmente del paciente (por ejemplo, a pie de campo o en el campo), sin necesidad de formación especializada ni equipos médicos. Los miARN que se han encontrado como indicativos de mTBI en la saliva incluyen: hsa-let-7ca-5p, hsa-let-7i-5p, hsa-miR-1421-3p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-20b-5p, hsa-miR-221-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-27b-3p, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-340-5p, hsa-miR-424-5p; miR-30a-5p; miR-107; miR-135b-5p; miR-199b se selecciona del grupo que consiste en -5p; miR-324-5p; y miR-652-3p.
Los niveles de miARN se pueden utilizar para rastrear la recuperación de un sujeto de una lesión. Así, la presente invención abarca el monitoreo de la recuperación de un sujeto de TBI, como alternativa o además del diagnóstico inicial.
En algunas modalidades, el método comprende el monitoreo de la TBI y el nivel de al menos un miARN se determina en una muestra obtenida del sujeto al menos 2, al menos 3, al menos 5, al menos 7, al menos 10 o al menos 14 días después de la lesión (es decir, en donde al menos un miARN comprende miR-502). En algunas modalidades, el nivel de al menos un miARN se determina en una muestra obtenida del sujeto 15 días después de la lesión. En algunas modalidades, el nivel de al menos un miARN se determina en al menos dos muestras obtenidas en diferentes intervalos de tiempo después de la lesión, lo que permite monitorear la recuperación. Por ejemplo, los niveles de miARN podrían determinarse a los 7 y 14 días después de la lesión, o a los 5, 10 y 15 días después de la lesión. Un retorno de los niveles de miARN a la normalidad puede ser indicativo de la recuperación del sujeto de la TBI.
En algunas modalidades, se determina que un sujeto se ha recuperado de una mTBI si el nivel de miR-miR-502 (u opcionalmente miR-502 y miR-425-5p) ya no está por debajo de un umbral predeterminado o ya no ha disminuido en relación con una referencia.
En algunos ejemplos de referencia divulgados en la presente sólo como referencia, se determina que un sujeto se ha recuperado de una TBI de moderada a grave si el nivel de miR-21 y/o miR-335 ya no está por encima de un umbral predeterminado o ya no ha aumentado en relación con una referencia.
El diagnóstico de un sujeto que sufre de una TBI, y en particular el diagnóstico de TBI leve o TBI moderada a grave, puede facilitar la determinación de un tratamiento adecuado. Por lo tanto, la presente invención proporciona un prueba que permite a los trabajadores de la salud, tales como médicos, clínicos, paramédicos e incluso personal no médico (por ejemplo, profesores, entrenadores deportivos, personal militar) decidir sobre la acción adecuada para un sujeto con sospechas de tener una TBI. Por lo tanto, un sujeto que se determine que tiene una TBI puede recibir el tratamiento más adecuado como resultado de un diagnóstico. La divulgación también abarca la terapia apropiada para el uso en el método de tratamiento de TBI, el método comprendiendo además dirigir la terapia apropiada a un sujeto diagnosticado con una TBI.
Un sujeto diagnosticado con TBI puede ser evaluado más a fondo, por ejemplo, mediante exploración por CT. En algunas modalidades, el sujeto es ingresado en el hospital. En algunas modalidades, si se puede descartar una TBI de moderada a grave, es posible que no sea necesario que el sujeto sea admitido en el hospital para su evaluación. Un sujeto diagnosticado con TBI de moderada a grave puede ser ingresado en el hospital o en un centro especializado en neurotraumatismos.
Un sujeto diagnosticado con una TBI (particularmente mTBI) fuera de un entorno hospitalario, por ejemplo, en un evento deportivo, durante un combate o durante un juego, puede ser retirado del juego o combate inmediatamente. Posteriormente, el sujeto puede iniciar un regreso gradual al juego o combate. En un aspecto adicional, se proporciona un método para determinar si es apropiado administrar a un sujeto una terapia para aliviar la TBI, en donde el método comprende:
determinar un nivel de al menos un miARN (es decir, que comprende miR-502) en una muestra del sujeto; y determinar si es apropiado o no administrar una terapia para aliviar la TBI, en función del nivel de al menos un miARN (es decir, que comprende miR-502).
Se entenderá que el paso de administrar la terapia al sujeto no forma parte del método reivindicado.
En algunas modalidades un tratamiento apropiado puede ser para uso en el método, en donde el método puede comprender además administrar al sujeto un tratamiento apropiado. En algunas modalidades, el tratamiento puede comprender una terapia para aliviar la TBI. En consecuencia, la invención presenta un tratamiento para su uso en métodos para diagnosticar y tratar la TBI en un sujeto, en donde el método comprende los pasos de (a) obtener una muestra del sujeto; (b) detectar uno o más miARN (seleccionados de los descritos en la presente, y que comprenden miR-502); diagnosticar que el paciente tiene una TBI cuando los niveles de miARN difierewn de un estándar de referencia (como se describe en la presente); y administrar un tratamiento para la TBI.
En un aspecto adicional que no forma parte de la invención, la descripción proporciona un método para determinar un tratamiento apropiado a un sujeto sospechoso de sufrir una TBI, en donde el método que comprende identificar si el sujeto tiene o no una TBI mediante la determinación de un nivel de al menos un miARN (es decir, que comprende miR-502) en una muestra del sujeto.
Si se identifica que un sujeto tiene una TBI, un tratamiento apropiado puede incluir uno o más de los siguientes: evaluación adicional del sujeto, por ejemplo, mediante pruebas adicionales (por ejemplo, pruebas verbales, cognitivas, motoras y/u ópticas), tomografía computarizada y/o resonancia magnética; retirar al sujeto de la actividad (por ejemplo, la actividad durante la cual se incurrió la TBI); admitir al sujeto en el hospital o en una clínica especializada; cirugía; y administrar una terapia para aliviar la TBI al sujeto.
La terapia para aliviar la TBI puede incluir fármacos neuroprotectores, por ejemplo, fármacos para tratar la hinchazón cerebral, tal como el manitol y la disolución salina hipertónica, y/u otras medidas neuroprotectoras, tal como evitar la reanimación hipertensiva y el uso de sedación.
En algunas modalidades, el sujeto puede ser monitoreado posteriormente para realizar un seguimiento de su recuperación, por ejemplo, en un hospital o clínica.
De acuerdo con otro aspecto que no forma parte de la invención, se proporciona un método para detectar y/o determinar un nivel de un miARN objetivo en un sujeto (es decir, miR-502), en donde el método comprende los pasos de (a) obtener una muestra del sujeto; y (b) detectar y/o determinar el nivel del miARN objetivo en la muestra poniendo en contacto la muestra con una sonda específica para el miARN objetivo, es decir, una sonda específica para miR-502, en donde la sonda comprende un ácido nucleico, y en donde el ácido nucleico comprende una secuencia que es al menos 80 % idéntica a una secuencia que es el complemento de SEQ ID NO:3.
La muestra es una muestra de fluido obtenida del sujeto, tal como se ha definido anteriormente, que comprende o es suero.
En algunas modalidades, el método puede comprender la determinación del nivel de dos o más miARN objetivo en la muestra (es decir, en donde los dos o más miARN objetivo comprenden miR-502).
En la presente divulgación, también se proporciona una terapia para aliviar la TBI para su uso en un método de tratamiento de un sujeto que lo necesita, en donde se identifica que dicho sujeto tiene una<t>B<i>mediante la determinación de un nivel de al menos un miARN (es decir, que comprende miR-502) en una muestra del sujeto.
El paso para determinar el nivel del miARN objetivo (es decir, miR-502) puede consistir en poner en contacto la muestra con un sustrato funcionalizado con la sonda, por ejemplo, un chip que comprende la sonda. El sustrato o chip puede incluir cómodamente varias sondas, cada una específica para un miARN objetivo diferente.
El sujeto puede haber sufrido una lesión, en particular una lesión en la cabeza. Se puede sospechar que el sujeto tiene una TBI. En algunas modalidades, la muestra se obtiene no más de 72 horas, no más de 48 horas, no más de 36 horas, no más de 24 horas, no más de 12 horas, no más de 6 horas, no más de 4 horas, no más de 2 horas o no más de 1 hora después de la lesión. En la presente invención, el método comprende i) diagnosticar una lesión cerebral traumática leve (mTBI) en un sujeto, en donde el método comprende determinar el nivel de miR-502 en una muestra de fluido obtenida del sujeto hasta 48 horas después de la lesión, y/o ii) monitorear la lesión cerebral traumática leve en un sujeto, en donde el método comprende determinar el nivel de miR-502 en una muestra de fluido obtenida del sujeto al menos 2 días después de la lesión, en donde la muestra de fluido comprende suero.
En algunas modalidades, el método comprende además tratar al sujeto. El tratamiento puede incluir uno o más de los siguientes: evaluación adicional del sujeto, por ejemplo, mediante pruebas adicionales (por ejemplo, pruebas verbales, cognitivas, motoras y/u ópticas), tomografía computarizada y/o resonancia magnética; retirar al sujeto de la actividad (por ejemplo, la actividad durante la cual se incurrió la TBI); admitir al sujeto en el hospital o en una clínica especializada. En la presente también se divulga una terapia para su uso en un método para aliviar la TBI en el sujeto. En algunas modalidades, el tratamiento comprende la administración de un cantidad eficaz de un fármaco neuroprotector.
En la presente también se divulga un método de tratamiento de una TBI, que comprende:
determinar un nivel de al menos un miARN (es decir, miR-502) en una muestra del sujeto; y
Si el nivel de al menos un miARN es indicativo de mTBI, administrar un tratamiento apropiado para mTBI; o
Si el nivel de al menos un miARN es indicativo de m-sTBI, administrar un tratamiento apropiado para m-sTBI.
Los expertos en la técnica entenderán que diferentes vías de tratamiento pueden ser utilizados para mTBI y m-sTBI.
Un tratamiento apropiado para mTBI puede incluir: retirar al sujeto de la actividad; tratamientoin situo en la comunidad; evaluación adicional del sujeto en el hospital sin ingreso durante la noche (por lo general, los pacientes con mTBI se dan de alta de inmediato con asesoramiento sobre lesiones en la cabeza); o ingreso al hospital durante un período de observación (por lo general, 1-2 días). El sujeto puede ser evaluado más a fondo mediante pruebas (por ejemplo, pruebas verbales, cognitivas, motoras y/o ópticas). Por lo general, la tomografía computarizada sólo es necesaria si existen ciertas indicaciones, incluyendo sospecha de fractura de cráneo, convulsión postraumática, déficit neurológico focal, vómitos repetidos, puntaje de la escala de Glasgow inferior a 13 en la evaluación inicial (menos de 14 para niños, o menos de 15 para bebés menores de 1 año), de acuerdo con los lineamientos NICE.
Un tratamiento apropiado para m-sTBI puede incluir: Resonancia magnética o tomografía computarizada (sobre todo en la hora siguiente a la lesión); ingreso hospitalario (que puede incluir el ingreso en cuidados intensivos y/o el traslado a una clínica especializada o a un centro de traumatología mayor con instalaciones neuroquirúrgicas); neuromonitoreo; cirugía. En la presente también se divulga una terapia (es decir, fármacos neuroprotectores, por ejemplo, fármacos para tratar la inflamación cerebral, tal como manitol y disolución salina hipertónica, y/u otras medidas neuroprotectoras, tales como evitar la reanimación hipertensiva y el uso de sedación) para su uso en un método para aliviar la TBI, ya que el método comprende la administración de fármacos neuroprotectores, por ejemplo, fármacos para tratar la inflamación cerebral, tal como manitol y disolución salina hipertónica, y/u otras medidas neuroprotectoras, tal como evitar la reanimación hipertensiva y el uso de sedación.
Por lo tanto, la presente invención permite que los sujetos con una TBI puedan estratificarse rápidamente en mTBI o msTBI, para que puedan recibir el tratamiento más adecuado.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona el uso de un sistema de detección en el método de la invención para diagnosticar y/o monitorear la TBI, en donde el sistema de detección comprende un elemento sensor que comprende un sustrato funcionalizado con una sonda específica para un miARN objetivo, es decir, específica para miR-502, en donde la sonda comprende un ácido nucleico, y en donde el ácido nucleico comprende una secuencia que es al menos 80 % idéntica a una secuencia que es el complemento de SEQ ID NO:3. El sistema de detección puede comprender además un dispositivo de detección que es capaz de detectar la unión de un miARN objetivo a la sonda.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona el uso de un elemento sensor en el método de la invención para diagnosticar y/o monitorear la TBI, en donde el elemento sensor comprende un sustrato funcionalizado con una sonda específica para un miARN objetivo, es decir, específica para miR-502, en donde la sonda comprende un ácido nucleico, y en donde el ácido nucleico comprende una secuencia que es al menos 80 % idéntica a una secuencia que es el complemento de SEQ ID NO:3.
El elemento sensor puede comprender además una zona de adición de muestras para recibir una muestra (una muestra de fluido).
La sonda es capaz de unirse selectivamente al miARN de interés (es decir, que comprende miR-502). El sustrato puede ser funcionalizado con una pluralidad de sondas. Las sondas pueden ser todas iguales, o se pueden proporcionar dos o más sondas diferentes. Por ejemplo, en algunas modalidades, el sustrato puede ser funcionalizado con una primera sonda específica para un primer miARN, y una segunda sonda específica para un segundo miARN. La primera y la segunda sonda pueden agruparse, por ejemplo, en diferentes porciones del elemento sensor.
En un aspecto adicional de la invención, se proporciona el uso de una composición en el método de la invención para diagnosticar y/o monitorear la lesión cerebral traumática leve (mTBI) en un sujeto, en donde la composición comprende una sonda específica para un miRNA objetivo (es decir, miR-502). La composición puede comprender miR-502 o cualquier pluralidad de los miARN enumerados (por ejemplo, dos, tres, cuatro o más de los miARN enumerados).
El miARN objetivo puede seleccionarse del grupo que consiste en miR-505, miR-203, miR-654-3p, miR-655, miR-184, miR-301b, miR-425-5p, miR-502, miR-21, miR-let-7g, miR-335, miR-126*, miR-193a-5p, miR-144*, miR-190, miR-194, miR-365, miR-590-3p, miR-624, miR-625*, miR-671-3p, hsa-let-7c-5p, hsa-let-7i-5p, miR-142-3p, miR-148a-3p, miR-15b-5p, miR-16-5p, miR-181a-5p, miR-20a-5p, miR-20b-5p, miR-221-3p, miR-24-3p, miR-27b-3p, miR-29a-3p, miR-29c-3p, miR-30a-5p; miR-107; miR-135b-5p; miR-199b-5p; miR-324-5p; miR-652-3p, miR-424-5p, miR-10a, miR-132, miR-223, miR-143, miR-148b, miR-18a, miR-192, miR-429, miR-618, miR-95, miR-130a, miR-152, miR-27b, miR-301, miR-326, miR-345, miR-361, miR-422a, miR-579, miR-642, miR-99a, miR-520D-3p y miR-629, en donde el miARN objetivo comprende miR-502
En algunas modalidades, el miARN objetivo se selecciona del grupo que consiste en miR-505, miR-203, miR-654-3p, miR-655, miR-184, miR-301b, miR-425-5p, miR-502, miR-21, miR-let-7g, miR-335, hsa-miR-126*, miR-193a-5p, miR-144*, miR-190, miR-194, miR-365, miR-590-3p, miR-624, miR-625*, y miR-671-3p, en donde el miARN objetivo comprende miR-502. Se ha encontrado que estos microARN son biomarcadores expresados en todos los pacientes con TBI (leve o grave).
En algunas modalidades, el miARN objetivo se selecciona del grupo que consiste en miR-505, miR-203, miR-654-3p, miR-655, miR-184, miR-301b, miR-425-5p, miR-502, miR-21, miR-let-7g y miR-335, en donde el miARN objetivo comprende miR-502.
En algunos ejemplos de referencia divulgados en la presente sólo como referencia, el miARN objetivo se selecciona del grupo que consiste en let-7c-5p, let-7i-5p, miR-142-3p, miR-148a-3p, miR-15b-5p, miR-16-5p, miR-181a-5p, miR-20a-5p, miR-20b-5p, miR-221-3p, miR-24-3p, miR-27b-3p, miR-29a-3p, miR-29c-3p, y miR-424-5p; miR-30a-5p; miR-107; miR-135b-5p; miR-199b-5p; miR-324-5p; miR-652-3p.
En algunos ejemplos de referencia divulgados en la presente sólo como referencia, el miARN objetivo se selecciona del grupo que consiste en miR-10a, miR-132, miR-223, miR-143, miR-148b, miR-18a, miR-192, miR-429, miR-618, miR-95, miR-130a, miR-152, miR-194, miR-27b, miR-301, miR-326, miR-345, miR-361, miR-422a, miR-579, miR-642, miR-99a, miR-520D-3p y miR-629.
En algunas modalidades, el miARN objetivo se selecciona del grupo que consiste en miR-425-5p, miR-502, miR-21 y miR-335, siempre que el miARN objetivo comprenda miR-502.
La sonda puede comprender una molécula biológica, tal como una proteína (por ejemplo, un anticuerpo) o un ácido nucleico. La sonda comprende un ácido nucleico. El ácido nucleico
comprende una secuencia que es al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % idéntica a una secuencia que es el complemento de la secuencia de longitud completa del miARN objetivo.
En la presente invención, el miARN objetivo comprende miR-502. En algunas modalidades, el ácido nucleico comprende una secuencia que es 100 % idéntica a una secuencia que es el complemento de la secuencia del miARN objetivo (es decir, el receptor comprende una secuencia de ácido nucleico que es el complemento exacto de la secuencia del miARN objetivo).
Las sondas se pueden unir a una superficie del sustrato por cualquier medio adecuado, tal como, por ejemplo, mediante el acoplamiento de la química conocida por los expertos en la técnica. En algunas modalidades, cada sonda está unida a una superficie del sustrato mediante un enlazador. En algunas modalidades, la sonda comprende una fracción para inmovilizar la sonda en el sustrato o para conectar la sonda a un enlazador inmovilizado en el sustrato.
Alternativa o adicionalmente, la sonda puede comprender una etiqueta detectable. La etiqueta detectable puede ser, por ejemplo, radioactiva, fluorescente, luminiscente, o a base de anticuerpos (por ejemplo, puede constituir un anticuerpo tetramérico convencional o un fragmento detectable del mismo).
El sustrato del elemento sensor puede estar formado por cualquier material adecuado. En algunas modalidades, el sustrato comprende o está formado por metal, plástico, vidrio, sílice, silicio, grafito, grafeno, o cualquier combinación de los mismos. En algunas modalidades, el sustrato comprende múltiples capas. Por ejemplo, un sustrato puede prepararse formando una superficie o capa de grafeno sobre una capa de carburo de silicio o sílice. La superficie del grafeno puede modificarse químicamente, por ejemplo, a óxido de grafeno (GO) o a grafeno-amina (GA). Los métodos para formar capas de grafeno, tal como el crecimiento epitaxial y el crecimiento de sublimación, serán conocidos por los expertos en la técnica.
Convenientemente, las sondas compuestas o constituidas por un ácido nucleico se pueden unir a una superficie GO mediante un enlazador, utilizando un reactivo de acoplamiento de amida (por ejemplo, (hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N,N'-tetrametiluronio (HATU)). Un elemento sensor que comprende una superficie funcionalizada con una sonda de ácido nucleico puede utilizarse para detectar selectivamente su miARN complementario.
Los enlazadores adecuados pueden comprender una fracción de anilina (o un derivado de la misma), una resto de ácido benzoico (o un derivado del mismo) o una fracción de etendiamina (o un derivado de la misma). Un enlazador de anilina se puede formar mediante la unión de una molécula de nitrobenceno (o derivado) a una superficie de grafeno (por ejemplo, utilizando una sal de diazonio), y la reducción del nitrobenceno a anilina. El grupo de aminas de la anilina puede utilizarse para fijarse a la sonda. Del mismo modo, se puede utilizar una sal de diazonio (por ejemplo, tetrafluoroborato de diazonio de ácido 4-benzoico) para unir un ácido benzoico o derivado de ácido benzoico a una superficie de grafeno. Una fracción de etanediamina se puede unir al grafeno carboxilado o al óxido de grafeno.
El elemento sensor puede estar compuesto por una tira de prueba. La tira de prueba puede ser desechable.
El dispositivo de detección puede configurarse para detectar la unión de un miARN objetivo al receptor por cualquier medio adecuado conocido por los expertos en la técnica, por ejemplo, mediante la detección de cambios en la impedancia eléctrica, la concentración de iones de hidrógeno, o los cambios conformacionales resultantes de la hibridación.
El dispositivo de detección puede incluir además una interfaz de usuario para enviar datos a un usuario.
En algunas modalidades, el dispositivo de detección incluye una base de datos de información sobre el tratamiento. El dispositivo puede ser capaz de identificar las opciones de tratamiento adecuadas de la base de datos en función de los niveles de miARN de interés. La información del tratamiento puede ser proporcionada al usuario a través de la interfaz de usuario.
Convenientemente, el dispositivo de detección puede ser portátil, por ejemplo, de mano. El dispositivo de detección puede comprender una unidad de almacenamiento de datos para almacenar los niveles de miARN y otra información relacionada con el sujeto. En algunas modalidades, el dispositivo comprende un medio de comunicación de datos para comunicar datos a otros dispositivos. Por ejemplo, el dispositivo puede comunicar datos de forma inalámbrica a través de WiFi, 3G, 4G, Bluetooth, o a través de una aplicación móvil. Esto puede permitir convenientemente que los profesionales médicos puedan acceder fácilmente a los datos si es necesario.
Por lo tanto, se prevé que el uso del dispositivo de detección de la invención proporcione un medio asequible y portátil para el diagnóstico y el monitoreo de la TBI de forma no invasiva. El dispositivo puede ser utilizado por equipos de ambulancias, militares, escuelas, clubes deportivos y profesionales de la salud, lo que permite la valoración correcta y el triage de pacientes con sospechas de tener una TBI.
En un aspecto adicional se proporciona el uso de un kit en los presentes métodos. El kit puede comprender al menos una sonda (por ejemplo, una proteína, tal como un anticuerpo, o un ácido nucleico) que sea capaz de unirse selectivamente al miARN de interés, es decir, que comprenda al menos una sonda específica para miR-502, en donde la muestra de fluido comprende suero, y en donde la sonda comprende un ácido nucleico, en donde el ácido nucleico comprende una secuencia que es al menos 80 % idéntica a una secuencia que es el complemento de la secuencia de SEQ ID NO: 3. En algunas modalidades, el kit comprende una matriz formada por una pluralidad de sondas. En algunas modalidades, al menos una sonda es un cebador para llevar a cabo la PCR. El kit puede incluir además instrucciones de uso, por ejemplo, instrucciones de uso en el diagnóstico y/o monitoreo de la TBI. El kit puede incluir además disoluciones amortiguadoras y reactivos adecuados, tales como cebadores de amplificación y enzimas (por ejemplo, ADN polimerasa, transcriptasa inversa para la conversión de miARN en ADNc).
Se entenderá que las declaraciones hechas en la presente en relación con cualquier aspecto de la invención pueden aplicarse igualmente a cualquier otro aspecto de la invención, según corresponda.
Descripción detallada de la invención
Las modalidades de la invención y los ejemplos de referencia divulgados en la presente con fines meramente ilustrativos se describirán a continuaicón a modo de ejemplo y con referencia a las Figuras adjuntas:
Figura 1: expresión de miR-425-5p y miR-502 en 3 categorías diferentes de trauma y HVexpresión de miR-425-5p y miR-502 en 10 HV, 10 mTBI+EC (1 día), 10 mTBI+EC (15 días), 10 EC (1 día), 10 EC (15 días), 10 sTBI+EC (1 día) y 10 sTBI+EC (15 días) pacientes, detectado mediante análisis qRT-PCR. Se observó una disminución notable de la expresión de miR-425-5p en mTBI+EC (1 día) en comparación con H<v>(p<0,01), mTBI+EC (15 días) (p<0,001) y sTBI+EC (1 día) (p<0,01) (Figura 1A). Se observó una disminución notable de la expresión de miR-502 en mTBI+EC (1 día) en comparación con HV (p<0,05), mTBI+EC (15 días) (p<0,01) y sTBI+EC (1 día) (p<0,05) (Figura 1B).
Figura 2: expresión de miR-21 y miR-335 en 3 categorías diferentes de trauma y HVexpresión de miR-21 y miR-335 en 10 HV, 10 mTBI+EC (1 día), 10 mTBI+EC (15 días), 10 EC (1 día), 10 EC (15 días), 10 sTBI+EC (1 día) y 10 sTBI+EC (15 días) pacientes, detectado mediante análisis qRT-PCR. Se observó que la expresión de miR-21 estaba regulada al alza significativamente en sTBI+EC (1 día y 15 días) en comparación con HV (p<0,01) (Figura 2A). Se observó que la expresión de miR-335 estaba regulada al alza notablemente en sTBI+EC (1 día) en comparación con HV (p<0,001), EC (15 días) (p<0,001) y mTBI+EC (1 día) (p<0,05) (Figura 2B).
Figura 3: Evolución temporal de la expresión de miR-425-5p (Figura 3A) y miR-502 (Figura 3B) en 3 categorías diferentes de traumatismos y HV
Expresión de miR-425-5p y miR-502 en 30 HV, 30 mTBI+EC, 30 EC, 30 sTBI+EC pacientes en diferentes puntos de tiempo de la lesión (T0, T4-12 h, T48-72 h, 15 días) detectada mediante análisis qRT-PCR. Se observó una disminución notable de la expresión de miR-425-5p en mTBI+EC a T0 y T4-12 h en comparación con HV, sTBI+EC y EC (p<0,05). Se observó una disminución notable de la expresión de miR-502 en mTBI+EC a T0 y T4-12 h en comparación con HV, sTBI+EC y EC (p<0,05). Los valores de P se determinaron mediante la prueba post-hoc de Tukey.
* significativamente diferente de HV
Figura 4: Evolución temporal de la expresión de miR-21 (Figura 4A) y miR-335 (Figura 4B) en 3 categorías diferentes de traumatismos y HV
Expresión de miR-21 y miR-335 en 30 HV, 30 mTBI+EC, 30 EC y 30 sTBI+EC pacientes en diferentes puntos de tiempo de la lesión (T0, T4-12 h, T48-72 h, 15 días) detectada mediante análisis qRT-PCR. Se observó que la expresión de miR-21 estaba regulada al alza significativamente sTBI+EC a los T4-12 h, T48-72 h y 15 días en comparación con HV (p<0,01).
Se observó que la expresión de miR-335 estaba regulada al alza notablemente en sTBI+EC a los T0, T4-12 h, T48-72 h y 15 días en comparación con HV y mTBI+EC (p<0,001), pero no sólo EC. Los valores de P se determinaron mediante la prueba post-hoc de Tukey.
* significativamente diferente de HV
Ejemplos y ejemplos de referencia
A medida que los miARN emergen como biomarcadores prometedores en una variedad de patologías diferentes, los inventores actuales trataron de explorar su papel en la TBI.
La presente invención proporciona un método para i) diagnosticar una lesión cerebral traumática leve (mTBI) en un sujeto, en donde el método comprende determinar el nivel de miR-502 en una muestra de fluido obtenida del sujeto hasta 48 horas después de la lesión, y/o ii) monitorear la lesión cerebral traumática leve en un sujeto, en donde el método comprende determinar el nivel de miR-502 en una muestra de fluido obtenida del sujeto al menos 2 días después de la lesión, en donde la muestra de fluido comprende suero. A continuación se describen otros ejemplos de referencia con fines meramente ilustrativos.
Ejemplo 1
Materiales y métodos
Pacientes y recolección de muestras
Los participantes del estudio fueron reclutados del Centro de Investigación de Reconstrucción Quirúrgica y Microbiología (SRMRC), en el Hospital Queen Elizabeth de Birmingham (Reino Unido), como parte del estudio de biomarcadores cerebrales después de un trauma (The Golden Hour Study) (Ethics Ref. 13/WA/0399).
En primer lugar, se realizó la selección de 754 miARN en 5 pacientes con mTBI con lesiones extracraneales (EC), 5 pacientes con lesiones sTBI+EC y voluntarios sanos (HV) a 1 día y 15 días de la lesión con el objetivo de seleccionar biomarcadores candidatos específicos capaces de discriminar la TBI leve de la grave y predecir la recuperación de mTBI después de 15 días. A partir de esta información (Tabla 2), se pudo confirmar los resultados del estudio en una cohorte ampliada de pacientes de 40 individuos agrupados en 4 categorías diferentes: HV (n=10), EC (n=10), mTBI+EC (n=10), sTB i+EC (n=10). Los voluntarios sanos dieron su consentimiento y se inscribieron en el estudio RECOS. Los pacientes con lesiones de EC tenían fracturas confirmadas radiográficamente, sin traumatismo craneal, sin infección, sin antecedentes de trastornos neurológicos o psiquiátricos y sin dependencia al alcohol o fármacos. La TBI leve con EC incluyó a aquellos con traumatismo craneal no penetrante y puntaje de la escala de coma de Glasgow (GCS) >13. La TBI grave con EC incluyó a pacientes con puntaje GCS de 8 o menos. Todos los pacientes tenían sexo y edad emparejados con HV.
Procesamiento de muestras
Se tomaron muestras de sangre periférica a 1 día y 15 días de la lesión en cada paciente. Las muestras de sangre se procesaron para el aislamiento del suero dentro de las 2 h siguientes a la extracción. La sangre entera se dejó reposar durante aproximadamente 30' a temperatura ambiente antes de ser centrifugada a 3000 rpm durante 10' a 4 °C. El suero se dividió en alícuotas y se almacenó a -80 °C hasta el análisis.
Aislamiento de ARN, transcripción inversa y perfiles de miARN mediante matriz TaqMan de baja densidad (TLDA)Se realizó la selección inicial (conjunto de descubrimiento) en 5 pacientes mTBI+EC y 5 pacientes sTBI+EC, que se compararon con los HV en los dos puntos de tiempo diferentes (1 día y 15 días desde la lesión). Se utilizó el suero de estos pacientes para perfilar el transcriptoma de 754 miARN. Las muestras de suero se centrifugaron a 2000 rpm durante 10' para granular y eliminar cualquier célula o residuo circulante. Los miARN se extrajeron de 400 pl de muestras de suero utilizando el mini kit de Qiagen miRNeasy (Qiagen, GmbH, Hilden, Alemania), de acuerdo con el protocolo complementario de Qiagen para la purificación de ARN pequeños de suero y plasma, y finalmente se eluyeron en 30 pl de volumen de agua libre de ARNasa. La concentración y pureza del ARN resultante se determinó con un espectrofotómetro ND-1000 UV-Vis (NanoDrop). 20 ng de ARN sérico se retrotranscribieron y pre-amplificaron, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los productos preamplificados se cargaron en TLDA, matriz de microARN humano TaqMan v3,0 A y B (Applied Biosystems LifeTechnologies™). Las PCR en TLDA se realizaron en el sistema 7900HT Fast RealTime<p>C<r>(Applied Biosystem, LifeTechnologies™).
Análisis de datos
Para obtener un perfil miARN preciso, se utilizó el método de normalización global de mediana. De forma similar al análisis de micromatrices, los valores de Ct de cada muestra se normalizaron con la mediana de Ct de la matriz. Además, calculando la correlación de Pearson entre los medianos de Ct y las medias de cada matriz y Ct de cada miARN, identificamos dos miARN que mostraron un perfil de expresión cercano a la mediana y media de los TLDA, es decir, miR-331 y miR-223*. También se confirmó que estos miARN están entre los más estables en TLDA mediante la aplicación de dos métodos diferentes [software DataAssistv.3 (AppliedBiosystem Life Technologies™)] y el algoritmo geNorm. En consecuencia, se utilizaron miR-331 y miR-223* como genes de referencia para la validación mediante ensayos TaqMan individuales. Los cambios en número de veces de la expresión se calcularon mediante el método 2-AACT. Los miARN expresados diferencialmente (DE miARN) fueron identificados mediante análisis de significancia de micromatrices (SAM) computado por el visor Multi Experiment v4.8.1, aplicando un prueba de dos clases no emparejada entre ACt y usando un valor p basado en permutaciones 100; motor de imputación: K-vecinos más cercanos (10 vecinos); la tasa de descubrimiento falso <0,15 se utilizó como corrección para comparaciones múltiples. Aceptamos como fiables sólo los miARN DE concordantes mediante el uso de todos los controles endógenos.
Ensayos TaqMan individuales
Se eligieron diez miARN expresados diferencialmente de los arreglos como posibles biomarcadores candidatos con el objetivo de discriminar la TBI leve de la grave y monitorear la recuperación de TBI leve. Estos candidatos se utilizaron para validar los datos en una cohorte ampliada de 30 pacientes (conjunto de validación) agrupados en 3 categorías diferentes (mTBI+EC, sTBI+EC y EC solamente) y 10 controles (HV) en dos puntos de tiempo diferentes (1 y 15 días desde la lesión) mediante ensayos TaqMan individuales (AppliedBiosystems, Life Technologies™). Las muestras se extrajeron y retrotranscribieron como se describió anteriormente y el análisis de RT-qPCR se realizó en el Sistema de Detección de PCR en Tiempo Real Bio-Rad iQ5 (Bio-Rad, CA, EE. UU.). Los cambios en número de veces de la expresión se calcularon mediante el método 2-AACT.
Análisis estadístico
Los datos se revisaron con respecto a la distribución normal y se transformaron para realizar pruebas paramétricas. Las comparaciones entre grupos en cada momento y dentro de los grupos a lo largo del tiempo se realizaron mediante el análisis de varianza unidireccional y la prueba post-hoc de Tukey sobre los datos transformados. Se utilizó un análisis de características operativas del receptor para calcular la sensibilidad y la especificidad de cada biomarcador en el diagnóstico de mTBI or sTBI que se expresan como área bajo la curva (ABC). Todos los análisis se llevaron a cabo en SPSS v.20 (IBM). Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas con un valor p < 0,05.
RESULTADOS
Perfiles de expresión mediante matriz de baja densidad TaqMan (TLDA)
A partir de 754 miARN de TLDA, se identificaron diez miARN circulantes a 1 día y 13 a 15 días en mTBI+EC, 19 a 1 día y 22 a 15 días en sTBI+EC expresados diferencialmente (Tabla 2). De esta lista, se excluyeron hsa-miR-126*, miR-193a-5p, miR-144*, miR-190, miR-194, miR-365, miR-590-3p, miR-624, miR-625* y miR-671-3p para análisis adicionales debido a que se expresaron en la mayoría de los pacientes, por lo que no eran biomarcadores candidatos adecuados sólo para traumatismos leves o graves. Sin embargo, los microARN anteriores pueden identificar la TBI de cualquier gravedad y, por lo tanto, son biomarcadores útiles de TBI. Por otro lado, miR-184, miR-301b, miR-502 y miR-505 expresados única y diferencialmente en mTBI+EC a 1 día, fueron seleccionados como biomarcadores candidatos tempranos de mTBI. Además, miR-203, miR-425-5p, miR-654-3p y miR-655 expresados diferencialmente a los 15 días posteriores a mTBI+EC fueron seleccionados como biomarcadores candidatos capaces de rastrear la recuperación de mTBI.
Finalmente, se seleccionaron dos miARN, miR-21 y miR-335, expresados constantemente en ambos momentos en sTBI+EC, para estudios posteriores.
Tabla 2: Cambio en número de veces de microARN expresado diferencialmente en 5 pacientes mTBI+EC (1 y 15 días) y 5 pacientes sTBI+EC 1 15 días , frente a 5 HV detectado por TLDA.
Ensayo de TaqMan individual para biomarcadores candidatos de mTBI
Para validar estos hallazgos, posteriormente probamos la expresión de miARN seleccionados en tres grupos separados e independientes (10 mTBI E<c>, 10 sTBI EC, 10 EC) en los dos puntos de tiempo elegidos (1 y 15 días desde la lesión) mediante el uso de ensayos TaqMan individuales. Los resultados se compararon con 10 HV. Los cambios en número de veces se calcularon mediante el método 2-AACT, utilizando miR-331 y miR-223* como genes de referencia.
Entre los biomarcadores candidatos de mTBI en ambos puntos de tiempo (miR-184, miR-301b, miR-502, miR-505, miR-203, miR-425-5p, miR-654-3p y miR-655), dos mostraron resultados interesantes y se expresaron de manera significativa y diferenciada en las tres categorías diferentes en comparación con HV. En particular, miR-425-5p y miR-502 mostraron una tendencia similar (Figura 1). Ambos fueron significativamente regulados a la baja en mTBI+EC ( media de 0,387±0,201 y 0,314±0,146) respectivamente a 1 día de la lesión en comparación con V (p<0,001), EC (p<0,001) y sTBI+EC (p<0,001). A los 15 días de la lesión leve, miR425-5p y miR-502 volvieron a los niveles normales (0,886±0,310 y 1,157±0,258). La expresión de miR-425-5p y miR-502 también se encontró similar a la de HV en muestras de EC a 1 día y 15 días de la lesión, lo que sugiere que estos dos biomarcadores se expresan de manera diferencial sólo en pacientes con lesión cerebral. Además, ninguno de ellos mostró diferencia significativa en sTBI+EC en comparación con HV en ambos puntos de tiempo. Por lo tanto, miR-425-5p y miR-502 podrían ser considerados los biomarcadores candidatos más prometedores para el diagnóstico temprano y el monitoreo de mTBI a los 15 días después del trauma. Las ABC para estos biomarcadores se muestran en la Tabla 3.
Ensayo de TaqMan individual para biomarcadores candidatos de sTBI
Se analizaron miR-21 y miR-335 como posibles biomarcadores de sTBI, ya que ambos aparecieron regulados al alza en ambos puntos de tiempo de sTBI+EC en la selección inicial. También demostraron ser candidatos fuertes en el segundo conjunto de datos de pacientes (Figura 2). miR-21 estaba regulado al alza significativamente en ambos puntos de tiempo en sTBI con EC (7,106±4,192 y 4,012±1,577) con respecto a HV (p,0,001), EC (p<0,001) y mTBI (p<0,001). No se encontraron diferencias significativas en las categorías restantes en comparación con HV. miR-335 mostró una regulación al alza en sTBI+EC y en ambos puntos de tiempo (16,824±14,195 y 12,324±8,931, respectivamente). En el día 1, este grupo fue significativamente diferente de los controles (p=0,001) y mTBI+EC (p=0,031), pero no EC. Curiosamente, se observó un aumento significativo en los pacientes con EC a 1 día (7,951±4,870), pero no a los 15 días de la lesión (1,260±0,531). Por esta razón, el día 15, miR-335 fue significativamente mayor en el grupo de sTBI+EC con respecto a HV (p=0,002), EC (p=0,007) y mTBI+EC (p=0,001). miR-335 no mostró ninguna diferencia significativa en mTBI+EC en ambos puntos de tiempo en comparación con HV. Las ABC para estos biomarcadores también se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3: Área bao la curva
Discusión
El presente estudio investigó si los cambios en los niveles de miARN pueden aplicarse al diagnóstico de TBI, y evaluando su gravedad. Se identificaron cuatro miARN expresados diferencialmente en TBI; miR-425-5p, miR 502, miR-21 y miR-335.
miR-425-5p mostró resultados significativos en el día 1 en mTBI+EC en comparación con HV y resultados similares se obtuvieron en todas las demás categorías. Su regulación a la baja dentro de las primeras 24 h de la lesión leve y su regreso a los niveles normales después de 15 días, hace de miR-425-5p un biomarcador candidato adecuado para el trauma leve.
También se encontró que el miR-502 se expresaba de forma diferenciada en mTBI+EC. La tendencia de este miARN fue muy similar a miR-425-5p. Mostró especificidad para los pacientes con lesiones cerebrales y también podría usarse para rastrear la recuperación, ya que vuelve a su valor normal después de 15 días de la lesión leve.
Después de la sTBI, se observó que 2 miARN (miR-21, miR-335) se expresaron a los 1 y 15 días y, por lo tanto, se seleccionaron como biomarcadores potenciales para la sTBI. miR-21 y miR-335 estaban regulados al alza significativamente en ambos puntos de tiempo en comparación con los controles en sTBI+EC. Por lo tanto, la sobreexpresión confirmó los resultados de la matriz y mostró el potencial de estas moléculas como biomarcadores de sTBI.
El panel seleccionado de miARN tiene el potencial de diagnosticar la TBI con precisión y permitir la estratificación de los pacientes de acuerdo con la gravedad que, a su vez, permite el suministro del tratamiento más adecuado.
Ejemplo 2
Pacientes y recolección de muestras
Los participantes en el estudio fueron reclutados en el Centro de Investigación de Microbiología y Reconstrucción Quirúrgica (SRMRC) del Hospital Queen Elizabeth de Birmingham (Reino Unido) como parte del estudio SIR (Los esteroides y la inmunidad desde las lesiones hasta rehabilitación) (Ethics Ref. 11/SW/0177), estudio ReCoS (The REpetitive COncussion in Sport) (Ethics Ref. 11-0429AP28) y estudio Golden Hour (Ethics Ref. 13/WA/0399). Se recibió el consentimiento informado por escrito de los participantes o de un representante válido (familia o profesional que no participó directamente en el estudio) antes de su inclusión en el estudio.
El segundo conjunto de datos de muestras utilizó muestras de suero de un total de 120 individuos agrupados en 4 categorías diferentes: HV (n=30), EC (n=30), mTBI+EC (n=30), sTBI+EC (n=30), y se tomó sangre en diferentes momentos (T0-1 h, T4-12 h, T48-72 h, 15 días) en cada paciente. Los voluntarios sanos dieron su consentimiento y se inscribieron en el estudio ReCoS. Los pacientes con lesiones de EC tenían fracturas ortopédicas confirmadas radiográficamente, sin traumatismo craneal, sin infección, sin antecedentes de trastornos neurológicos o psiquiátricos y sin dependencia al alcohol o fármacos. La TBI leve con EC incluyó a aquellos con traumatismo craneal no penetrante y puntaje de la Escala de coma de Glasgow (GCS) >13. La TBI grave con EC incluyó a pacientes con GCS<8.
Procesamiento de muestras
Las muestras de sangre se procesaron para el aislamiento del suero dentro de las 2 h siguientes a la extracción. La sangre entera se dejó reposar durante aproximadamente 30' a temperatura ambiente antes de ser centrifugada a 3000 rpm durante 10' a 4 °C. El suero se dividió en alícuotas y se almacenó a -80 °C hasta el análisis.
El aislamiento de ARN, el análisis de datos, los ensayos y el análisis estadístico se llevaron a cabo como se describe en el Ejemplo 1.
RESULTADOS
Ensayo de TaqMan individual para biomarcadores candidatos de mTBI
Para validar los hallazgos del Ejemplo 1, se midió la expresión de miARN seleccionados en 3 grupos separados e independientes (30 mTBI EC, 30 sTBI EC, 30 EC) en diferentes puntos de tiempo (T0, T4-12 h, t 48-72 h y 15 días desde la lesión) mediante el uso de ensayos TaqMan individuales. Los resultados se compararon con 10 HV. Los cambios en número de veces se calcularon mediante el método 2-AACT, utilizando miR-331 y miR-223* como referencia.
Entre los biomarcadores candidatos de mTBI en ambos puntos de tiempo (miR-184, miR-502, miR-505, miR-301b, miR-203, miR-425-5p, miR-654-3p y miR-655), sólo dos mostraron resultados interesantes y se expresaron de manera significativa y diferenciada en las 3 categorías diferentes en comparación con HV. Específicamente, miR-425-5p y miR-502 mostraron una tendencia similar (Figura 3). Ambos estaban regulados a la baja significativamente en mTBI+EC, miR-425-5p a T0-1 h (p=0,01845), y a T4-12 h (p=0,01962), respectivamente, en comparación con HV, o EC y sTBI+EC (p<0,05), y miR-502 a T0-1h y a T4-12 h en comparación con HV (p=0,02538 y p=0,03718, respectivamente), o EC y sTBI+EC (p<0,01). Después de 48 h de una lesión leve, miR425-5p y miR-502 volvieron a los niveles normales. La expresión de miR-425-5p y miR-502 también se encontró en el grupo EC a un nivel comparable a HV, lo que sugiere que estos dos biomarcadores están regulados a la baja sólo en pacientes con lesiones cerebrales. Por otra parte, ninguno de ellos mostró ninguna regulación a la baja significativa en sTBl+EC en comparación con HV en todos los puntos de tiempo. Por lo tanto, miR-425-5p y miR-502 podrían ser considerados los biomarcadores candidatos más prometedores para el diagnóstico temprano y el monitoreo de mTBI. Las ABC para estos biomarcadores en los puntos de tiempo más relevantes, se muestran en la Tabla 4.
Ensayo de TaqMan individual para biomarcadores candidatos de sTBI
Se analizaron miR-21 y miR-335 como posibles biomarcadores de sTBI, ya que ambos aparecieron regulados al alza en ambos puntos de tiempo de sTBI+EC en la selección inicial. Demostraron ser candidatos fuertes en el segundo conjunto de datos de pacientes también (Figura 4). El miR-21 estaba regulado al alza significativamente en sTBI con EC en todos los puntos de tiempo después de 4 h de la lesión con respecto a HV, EC y mTBI+EC (p=0,00306 a T4-12 h, p=0,00844 a T48-72 h y p=0,00077 a 15 días). No se encontraron diferencias significativas en las categorías restantes en comparación con HV. MiR-335 mostró una regulación ascendente en sTBI+EC y en todos los puntos de tiempo en comparación con HV p=0,00109 a T0-1 h, p=0,00284 a T4-12 h, p=0,00012 T48-72 h y p=0,01284 a 15 días) y mTBI+EC, pero no se encontró una regulación al alza significativa en comparación con EC. Las ABC para estos biomarcadores también se muestran en la Tabla 4.
Tabla 4: Área bao la curva de los cuatro biomarcadores candidatos de TBI en diferentes puntos de tiempo.
Discusión
Este estudio validó el hallazgo previo de que los cambios en los niveles de miARN se pueden aplicar al diagnóstico de TBI, y evaluando su gravedad. El estudio confirmó que los siguientes cuatro miARN se expresan diferencialmente en TBI; miR-425-5p, miR 502, miR-21 y miR-335.
miR-425-5p mostró resultados significativos en T0 y T4-12 h en mTBI+EC en comparación con HV y resultados similares se obtuvieron en todas las demás categorías. Su regulación a la baja vuelve a los niveles normales después de T48-72 h, y confirma que el miR-425-5p es un candidato biomarcador adecuado de trauma leve.
También se confirmó que el miR-502 se expresaba de forma diferenciada en mTBI+EC. La tendencia de este miARN fue muy similar a miR-425-5p. Mostró especificidad para pacientes con lesiones cerebrales y también podría usarse para rastrear la recuperación, ya que vuelve a su valor normal después de T48-72 h de la lesión leve.
Después de la sTBI, se observó que 2 miARN (miR-21, miR-335) se expresaron en todos los puntos de tiempo analizados y, por lo tanto, se confirmaron como posibles biomarcadores para la sTBI. miR-21 y miR-335 estaban regulados al alza significativamente en comparación con los controles en sTBI+EC. Por lo tanto, la sobreexpresión confirmó el potencial de estas moléculas como biomarcadores de sTBI.
Ejemplo 3
Se recolectaron muestras de saliva de atletas profesionales conmocionados después de 2-3 días de lesión y se analizaron los microARN presentes en la saliva. Los atletas fueron diagnosticados clínicamente con mTBI.
Materiales y métodos
Los microARN se analizaron utilizando la tecnología nCounter (nanoString Technologies®), que utiliza códigos de barras moleculares y imagenología microscópicos para detectar y contar hasta varios cientos de transcripciones únicas en una reacción de hibridación. Cada código de barras codificado por colores se conecta a una única sonda específica del objetivo correspondiente a un microARN de interés.
El análisis se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo del fabricante que incluye los siguientes pasos:
Hibridación:La tecnología emplea dos sondas de ~20 bases por microARN que se hibridan en disolución. Una sonda indicadora lleva la señal, mientras que una sonda de captura permite inmovilizar el complejo para la recopilación de datos.
Purificación e inmovilización:Después de la hibridación, las sondas sobrantes se retiran y los complejos sonda/objetivo se alinean e inmovilizan en el cartucho nCounter.
Recolección de datos:Los cartuchos de muestras se colocan en un instrumento analizador digital para la recolección de datos. Los códigos de color en la superficie del cartucho se cuentan y tabulan para cada molécula objetivo.
RESULTADOS
La Tabla 4 a continuación es una lista de microARN que se encontró que se expresaron de manera significativa y diferenciada en atletas con conmoción cerebral en comparación con voluntarios sanos. La tabla muestra el cambio en número de veces en la expresión de los microARN en los pacientes en comparación con el grupo de control. Los cambios en número de veces se calcularon utilizando miR-23a-3p y miR-148b-3p como genes de referencia.
Tabla 4
Discusión
Este estudio muestra que los microARN presentes en la saliva son un indicador de conmoción cerebral/mTBI. Esto es significativo debido a que la saliva se obtiene más fácilmente que la sangre, y, por lo tanto, la detección de microARN salivales ofrece un medio rápido y conveniente para diagnosticar la TBI, particularmente a pie de campo.
Claims (14)
- REIVINDICACIONES 1. Un método para i) diagnosticar una lesión cerebral traumática leve (mTBI) en un sujeto, en donde el método comprende determinar el nivel de miR-502 en una muestra de fluido obtenida del sujeto hasta 48 horas después de la lesión, y/o ii) monitorear la lesión cerebral traumática leve en un sujeto, en donde el método comprende determinar el nivel de miR-502 en una muestra de fluido obtenida del sujeto al menos 2 días después de la lesión, en donde la muestra de fluido comprende suero.
- 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el método comprende además comparar el nivel de miR-502 con un umbral predeterminado o un nivel de referencia, opcionalmente, en donde el nivel de referencia es el nivel de un miARN de referencia en una muestra de control tomada de un sujeto sano o el nivel de un miARN de referencia en una muestra tomada del sujeto.
- 3. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, en donde comprende además determinar el nivel de al menos un miARN adicional, en donde al menos un miARN adicional se selecciona del grupo que consiste en: (a) miR-425-5p; (b) miR-425-5p, miR-21 y miR-335, o cualquier combinación de los mismos; (c) miR-505, miR-203, miR-654-3p, miR-655, miR-184, miR-301b, miR-425-5p, miR-21, miR-let-7g, miR-335, miR-126*, miR-193a-5p, miR-144*, miR-190, miR-194, miR-365, miR-590-3p, miR-624, miR-625*, miR-671-3p, hsa-let-7c-5p, hsalet-7i-5p miR-142-3p, miR-148a-3p, miR-15b-5p, miR-16-5p, miR-181a-5p, miR-20a-5p, miR-20b-5p, miR-221-3p, miR-24-3p, miR-27b-3p, miR-29a-3p, miR-29c-3p, miR-424-5p, miR-30a-5p; miR-107; miR-135b-5p; miR-199b-5p; miR-324-5p; miR-652-3p; miR-10a, miR-132, miR-223, miR-143, miR-148b, miR-18a, miR-192, miR-429, miR-618, miR-95, miR-130a, miR-152, miR-27b, miR-301, miR-326, miR-345, miR-361, miR-422a, miR-579, miR-642, miR-99a, miR-520D-3p y miR-629, o cualquier combinación de los mismos. (d) miR-505, miR-203, miR-654-3p, miR-655, miR-184, miR-301b, miR-425-5p, miR-21, miR-let-7g, miR-335, hsa-miR-126*, miR-193a-5p, miR-144*, miR-190, miR-194, miR-365, miR-590-3p, miR-624, miR-625*, y miR-671-3p, o cualquier combinación de los mismos; y (e) miR-505, miR-203, miR-654-3p, miR-655, miR-184, miR-301b, miR-425-5p, miR-21, miR-let-7g, y miR-335, o cualquier combinación de los mismos;
- 4. El método de conformidad con la reivindicación 3, en donde comprende determinar el nivel de dos, tres, cuatro o más miARN.
- 5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde se diagnostica que el sujeto tiene mTBI si se determina que el nivel de miR-502 está por debajo de un umbral predeterminado o disminuido en relación con una referencia.
- 6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el método comprende determinar el nivel de: (i) miR-502; y (ii) un segundo miARN seleccionado de miR-21 y miR-335, opcionalmente, en donde al sujeto se le diagnostica una TBI de cualquier gravedad si se determina que el nivel de miR-425-5p o miR-502 está por debajo de un umbral predeterminado, o reducido en relación con una referencia, y si se determina que el nivel de miR-21 o miR-335 está por encima de un umbral predeterminado, o está aumentado en relación con una referencia.
- 7. El método de conformidad con cualquier reivindicación anterior, en donde la muestra de fluido que comprende suero se obtuvo del sujeto: (a) no más de 48 horas después de la lesión; o (b) no más de 24 horas después de la lesión.
- 8. Un uso de un elemento sensor en el método para diagnosticar y/o monitorear mTBI de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el elemento sensor comprende un sustrato funcionalizado con al menos una sonda específica para miR-502, en donde la sonda comprende un ácido nucleico, y en donde el ácido nucleico comprende una secuencia que es al menos 80 % idéntica a una secuencia que es el complemento de SEQ ID NO: 3.
- 9. El uso del elemento sensor de conformidad con la reivindicación 8, en donde el sustrato está hecho de metal, plástico, vidrio, sílice, silicio, grafito o grafeno, o cualquier combinación de los mismos.
- 10. Un uso de un sistema de detección en el método para diagnosticar y/o monitorear mTBI de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el sistema de detección comprende: - un elemento sensor de acuerdo con la reivindicación 8 o 9; y - un dispositivo de detección que es capaz de detectar la unión de un miARN objetivo a la sonda.
- 11. Un uso de un kit en el método para diagnosticar y/o monitorear lesiones cerebrales traumáticas leves (mTBI) en una muestra de fluido de un sujeto de acuerdo a la reivindicación 1, en donde el kit comprende al menos una sonda específica para miR-502, en donde la muestra de fluido comprende suero, y en donde la sonda comprende un ácido nucleico, en donde el ácido nucleico comprende una secuencia que es al menos 80 % idéntica a una secuencia que es el complemento de la secuencia de SEQ ID NO: 3.
- 12. Un fármaco neuroprotector o un sedante para su uso en un método de tratamiento de mTBI en un sujeto que lo necesite, en donde, mediante el método de acuerdo con la reivindicación 1, se ha identificado que dicho sujeto tiene una mTBI mediante la determinación de un nivel de al menos un miARN en una muestra de fluido del sujeto obtenida del sujeto hasta 48 horas después de la lesión, en donde la muestra de fluido comprende suero, y en donde al menos un miARN comprende miR-502.
- 13. Un uso de una composición en el método para diagnosticar y/o monitorear una lesión cerebral traumática leve (mTBI) en un sujeto de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la composición comprende al menos una sonda específica para miR-502, en donde la sonda comprende un ácido nucleico, y en donde el ácido nucleico comprende una secuencia que es al menos 80 % idéntica a una secuencia que es el complemento de la secuencia SEQ ID NO: 3.
- 14. Un uso del elemento sensor, sistema de detección, kit o composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 o 13, en donde el elemento sensor, sistema de detección, kit o composición comprende además al menos una sonda adicional específica para un miARN objetivo, en donde el miARN se selecciona del grupo que consiste en: (a) miR-425-5p; (b) miR-425-5p, miR-21 y miR-335, o cualquier combinación de los mismos; y (c) miR-505, miR-203, miR-654-3p, miR-655, miR-184, miR-301b, miR-425-5p, miR-21, miR-let-7g, miR-335, miR-126*, miR-193a-5p, miR-144*, miR-190, miR-194, miR-365, miR-590-3p, miR-624, miR-625*, miR-671-3p, hsa-let-7c-5p, hsalet-7i-5p, miR-142-3p, miR-148a-3p, miR-15b-5p, miR-16-5p, miR-181a-5p, miR-20a-5p, miR-20b-5p, miR-221-3p, miR-24-3p, miR-27b-3p, miR-29a-3p, miR-29c-3p, miR-30a-5p; miR-107; miR-135b-5p; miR-199b-5p; miR-324-5p; miR-652-3p, miR-424-5p, miR-10a, miR-132, miR-223, miR-143, miR-148b, miR-18a, miR-192, miR-429, miR-618, miR-95, miR-130a, miR-152, miR-27b, miR-301, miR-326, miR-345, miR-361, miR-422a, miR-579, miR-642, miR-99a, miR-520D-3p y miR-629, o cualquier combinación de los mismos.Figura 2 AValor atípico máximo Figura 3Ad s -s g ^ -y ju i e p BA|}B|ai u o js e jd x g Figura 3BFigura 4Al^-yiw sp ba|ib |0J uojsejdxg Figura 4BS££-id!W 9P<ba>|1B|0J uoisejdxg
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