JP7132224B2 - 外傷性脳傷害のバイオマーカー - Google Patents
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Description
(i) miR-425-5p及びmiR-502から選択される第1のmiRNA;及び
(ii) miR-21及びmiR-335から選択される第2のmiRNA
のレベルを決定するステップを含む。
対象由来のサンプル中の少なくとも1種のmiRNAのレベルを決定するステップ;及び
該少なくとも1種のmiRNAのレベルに基づいて、TBIを軽減させるための療法を施すことが適切か否かを決定するステップ
を含む、TBIを軽減させるための療法を対象に施すことが適切か否かを決定するための方法が提供される。
対象由来のサンプル中の少なくとも1種のmiRNAのレベルを決定するステップ;及び
該少なくとも1種のmiRNAのレベルがmTBIを示すものである場合に、mTBIに対して適切な処置を施すステップ;又は
該少なくとも1種のmiRNAのレベルがm-sTBIを示すものである場合に、m-sTBIに対して適切な処置を施すステップ
を含む、TBIを処置する方法を提供する。
(i)miR-27b-3p、let-7i-5p、miR-142-3p、miR-107及びmiR-135b-5pからなる群より選択される少なくとも1種のmiRNAの上方調節レベルが対象から取得された唾液サンプルにおいて検出可能であるかどうかを決定するステップ、
(ii)少なくとも1種のmiRNAの上方調節レベルが検出された場合に対象に対してmTBIのための処置を施すステップ
を含む。
-mTBIと診断された運動家(アスリート)は、典型的には、(Berlin Consensus Conference on Concussion及び個々のスポーツ当局、例えばRFUによって定義されているように)プレープロトコールへの段階的な復帰で開始されるだろう。これには、休息期間とそれに続く勤労及び接触暴露の段階的増加が含まれ得る。mTBIを有するアスリートは通常、医療監督のレベルと年齢に応じて、6日から23日の間で変動する期間にわたりプレーすることができない。逆に、mTBIが除外された場合、アスリートは制限を受けず、翌日には通常どおりトレーニングを行うことができる。
本発明は、例えば以下の実施形態を包含する。
[実施形態1]対象において軽度外傷性脳傷害(mTBI)を診断及び/又はモニターする方法であって、対象から取得された唾液サンプル中の少なくとも1種のmiRNAのレベルを決定するステップを含み、該少なくとも1種のmiRNAがmiR-27b-3p、let-7i-5p、miR-142-3p、miR-107及びmiR-135b-5p、又はそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、上記方法。
[実施形態2]前記少なくとも1種のmiRNAの上方調節レベルがmTBIを示す、実施形態1に記載の方法。
[実施形態3]前記少なくとも1種のmiRNAのレベルが所定の閾値を超える又は対照と比較して増大している場合に、対象がmTBIを有すると診断される、実施形態1に記載の方法。
[実施形態4]前記所定の閾値が、2-デルタデルタCT(2-ΔΔCT)法において2倍以上の倍率変化と同等である、実施形態3に記載の方法。
[実施形態5]前記少なくとも1種のmiRNAがmiR-27b-3pである、実施形態1~4のいずれかに記載の方法。
[実施形態6]前記少なくとも1種のmiRNAがlet-7i-5pである、実施形態1~4のいずれかに記載の方法。
[実施形態7]前記少なくとも1種のmiRNAがmiR-142-3pである、実施形態1~4のいずれかに記載の方法。
[実施形態8]前記少なくとも1種のmiRNAがmiR-107である、実施形態1~4のいずれかに記載の方法。
[実施形態9]前記少なくとも1種のmiRNAがmiR-135b-5pである、実施形態1~4のいずれかに記載の方法。
[実施形態10]前記対象から取得された唾液サンプル中の少なくとも2種のmiRNAのレベルを決定するステップを含む、実施形態1~9のいずれかに記載の方法。
[実施形態11]前記少なくとも2種のmiRNAが、miR-27b-3p、let-7i-5p、miR-142-3p、miR-107又はmiR-135b-5pから選択される、実施形態10に記載の方法。
[実施形態12]前記少なくとも2種のmiRNAの上方調節レベルがmTBIを示す、実施形態10又は11に記載の方法。
[実施形態13]前記少なくとも2種のmiRNAのレベルが所定の閾値を超える又は対照と比較して増大している場合に、対象がmTBIを有すると診断される、実施形態10又は11に記載の方法。
[実施形態14]前記所定の閾値が、2-デルタデルタCT(2-ΔΔCT)法において1.5倍以上の倍率変化と同等である、実施形態13に記載の方法。
[実施形態15]前記唾液サンプルが傷害の24時間~15日後に取得される、実施形態1~14のいずれかに記載の方法。
[実施形態16]前記唾液サンプルが傷害の24時間~7日後に取得される、実施形態15に記載の方法。
[実施形態17]前記唾液サンプルが傷害の2~5日後に取得される、実施形態16に記載の方法。
[実施形態18]miR-27b-3p、let-7i-5p、miR-142-3p、miR-107及びmiR-135b-5pのmiRNAのレベルを決定するステップを含む、実施形態1~17のいずれかに記載の方法。
[実施形態19]let-7c-5p、let-7i-5p、miR-142-3p、miR-148a-3p、miR-15b-5p、miR-16-5p、miR-181a-5p、miR-20a-5p、miR-20b-5p、miR-221-3p、 miR-24-3p、miR-27b-3p、miR-29a-3p、miR-29c-3p、及びmiR-424-5p、miR-30a-5p、miR-107、miR-135b-5p、miR-199b-5p、miR-324-5p、又はmiR-652-3pから選択される1種以上の追加のmiRNAのレベルを決定するステップをさらに含む、実施形態1~18のいずれかに記載の方法。
[実施形態20]miR-27b-3p、let-7i-5p、miR-142-3p、miR-107又はmiR-135b-5pの少なくとも1種に対して特異的なプローブを用いて官能化されている基板を含む、mTBIを診断及び/又はモニターするための検出系用センサー素子。
[実施形態21]前記プローブが少なくとも1種のmiRNAに結合可能な核酸を含む、実施形態20に記載のセンサー素子。
[実施形態22]前記プローブが、標的miRNAの配列の相補体である配列に対して少なくとも70%の同一性を有する核酸を含む、実施形態20又は21に記載のセンサー素子。
[実施形態23]前記プローブが、配列番号25、26、35、39又は40の相補体である配列に対して少なくとも70%の同一性を有する核酸を含む、実施形態20又は21に記載のセンサー素子。
[実施形態24]以下の構成要素:
・実施形態20~23のいずれかに記載のセンサー素子;及び
・前記プローブに対する標的miRNAの結合を検出することが可能である検出デバイスを備えた、mTBIを診断及び/又はモニターするための検出系。
[実施形態25]前記標的miRNAが上方調節されているかどうかを決定するための手段をさらに含む、実施形態24に記載の検出系。
[実施形態26]mTBIを有することが疑われる対象のための行動方針を決定する方法であって、対象から取得された唾液サンプルを実施形態24又は25に記載の検出系に適用するステップ、及び少なくとも1種のmiRNAの上方調節レベルが検出された場合には、mTBIのための処置を施すステップを含む、上記方法。
[実施形態27]mTBIが疑われる対象を処置する方法であって、
(i)miR-27b-3p、let-7i-5p、miR-142-3p、miR-107及びmiR-135b-5pからなる群より選択される少なくとも1種のmiRNAの上方調節レベルが対象から取得された唾液サンプルにおいて検出可能であるかどうかを決定するステップ、
(ii)少なくとも1種のmiRNAの上方調節レベルが検出された場合に対象に対してmTBIのための処置を施すステップ
を含む、上記方法。
材料及び方法
患者及びサンプル採取
研究への参加者は、バーミンガムのクイーン・エリザベス病院(UK)の外科的再建・微生物学研究センター(Surgical Reconstruction and Microbiology Research Centre(SRMRC))から、外傷後脳バイオマーカー(ゴールデンアワー研究)研究(Ethics Ref. 13/WA/0399)の一部分として募集された。
末梢血サンプルは、各患者で、傷害から1日間及び15日間で取得された。血液サンプルは、採血後2時間以内に血清単離のために処理された。全血を、室温で30分間静置し、続いて4℃で10分間、3000rpmで遠心分離した。血清をアリコートに分け、分析まで-80℃で保存した。
初期スクリーニング(発見セット)を、5名のmTBI+EC患者及び5名のsTBI+EC患者に対して行ない、これを2つの異なる時点で(傷害から1日間及び15日間)、HVと比較した。これらの患者の血清を用いて、754種類のmiRNAのトランスクリプトームのプロフィールを作成した。血清サンプルを、2000rpmで10分間遠心分離してペレットにし、循環細胞又は残渣を取り出した。miRNAを、Qiagen miRNeasy miniキット(Qiagen社、GmbH、Hilden、Germany)を血清及び血漿からの小分子RNAの精製のためのQiagenの補足プロトコールに従って用いることにより、400μLの血清サンプルから抽出し、30μL体積のRNase不含水中に最終的に溶出させた。得られたRNAの濃度及び純度は、ND-1000 UV-Vis分光光度計(NanoDrop)を用いて決定した。20ngの血清RNAを、製造業者の取扱説明書に従って、レトロ転写(retrotranscribed)及び予備増幅した。予備増幅産物を、TLDAにロードした(TaqMan Human MicroRNAアレイv3.0 A及びB(Applied Biosystems LifeTechnologiesTM))。TLDAでのPCRは、7900HT Fast RealTime PCRシステム(Applied Biosystem、LifeTechnologiesTM)を用いて行なった。
正確なmiRNAプロフィールを得るために、本発明者らは、包括的中央値標準化法(global median normalization method)を用いた。マイクロアレイ分析と同様に、各サンプル由来のCt値を、アレイの中央値Ctに対して標準化した。さらに、各アレイのCt中央値及び平均並びに各miRNAのCt間でのピアソン補正を計算することにより、本発明者らは、TLDAの中央値及び平均に近似した発現プロフィールを示した2種類のmiRNA、すなわち、miR-331及びmiR-223*を特定した。これらのmiRNAは、2種類の異なる方法:DataAssistv.3software(AppliedBiosystem Life TechnologiesTM)及びgeNormアルゴリズムを適用することにより、TLDAでは最も安定なものに入ることも確認された。したがって、miR-331及びmiR-223*が、単一TaqManアッセイによる検証のための参照遺伝子として用いられた。発現変化倍率は、2-ΔΔCT法により算出された。示差的に発現されるmiRNA(DE miRNA)を、Multi実験ビューワーv4.8.1により、ΔCt間の対応のない二項分類検定(two-class unpaired test)を適用し、かつ100順列に基づくp値を用いて、マイクロアレイ分析の有意性(Significance of Microarrays Analysis(SAM))により特定し;補完エンジン:K-最近傍(10近傍);誤発見率<0.15を、多重比較のための補正として用いた。本発明者らは、すべての内因性対照を用いることによるのと一致して、DE miRNAのみが信頼性が高いと認めた。
軽度TBIと重度TBIとを鑑別し、かつ軽度TBIの回復をモニターする目的で、10種類の示差的に発現されるmiRNAを、考えられる候補バイオマーカーとしてアレイから選択した。これらの候補を用いて、単一TaqManアッセイ(AppliedBiosystems、Life TechnologiesTM)により、2種類の異なる時点(傷害から1日間及び15日間)での3種類の異なる分類(mTBI+EC、sTBI+EC及びECのみ)に分けられる30名の患者(検証セット)及び10名の対照(HV)の拡大コホートでのデータを検証した。上記の通りに、サンプルを抽出及びレトロ転写し、Bio-Rad iQ5 Real-time PCR Detectionシステム(Bio-Rad社、CA、USA)でRT-qPCR分析を行なった。発現変化倍率は、2-ΔΔCT法により算出した。
データを、正規分布に関してチェックし、パラメトリック検定を行なうために変換した。各時点での群間及び経時的な群内での比較を、一元配置分散分析及びテューキーの事後検定により、変換されたデータに対して行なった。受信者動作特性分析を用いて、曲線下面積(AUC)として表わした、mTBI又はsTBIのいずれかの診断での各バイオマーカーの感度及び特異度を算出した。すべての解析は、SPSS v.20(IBM社)を用いて行なった。p値が0.05未満である場合に差異が統計学的に有意であると見なされた。
TaqMan Low Densityアレイ(TLDA)による発現プロフィール
TLDAの754種類のスクリーニング可能なmiRNAから、本発明者らは、10種類の循環型miRNA(1日間)及び13種類(15日間)をmTBI+ECで、19種類(1日間)及び22種類(15日間)をsTBI+ECで、示差的に発現されていると特定した(表2)。このリストから、hsa-miR-126*、miR-193a-5p、miR-144*、miR-190、miR-194、miR-365、miR-590-3p、miR-624、miR-625*及びmiR-671-3pは、それらが患者のうちの大多数で発現されていたため、軽度又は重度外傷のみに関する好適な候補バイオマーカーではないので、さらなる解析からは除外された。しかしながら、上記のマイクロRNAは、いずれの重症度のTBIでも特定することができ、したがって、有用なTBIバイオマーカーである。一方で、miR-184、miR-301b、miR-502及びmiR-505は、mTBI+EC(1日間)で特有にかつ示差的に発現され、mTBIの初期候補バイオマーカーとして選択された。加えて、mTBI+EC後15日間で示差的に発現されるmiR-203、miR-425-5p、miR-654-3p及びmiR-655は、mTBIの回復を追跡することができる候補バイオマーカーとして選択された。
これらの知見を検証するために、本発明者らは、続いて、単一TaqManアッセイを用いて、2つの選択された時点(傷害から1日間及び15日間)での、3種類の別個の独立した群(10名のmTBI+EC、10名のsTBI+EC、10名のEC)での選択されたmiRNAの発現を調べた。結果を、10名のHVと比較した。変化倍率は、miR-331及びmiR-223*を参照遺伝子として用いて、2-ΔΔCT法により算出した。
それらの両方が、初期スクリーニングでのsTBI+ECの両方の時点でアップレギュレーションされていたことが明らかになったので、miR-21及びmiR-335を、sTBIの考えられるバイオマーカーとして分析した。これらは、第2の患者のデータセットでも同様に、強力な候補であることが示された(図2)。miR-21は、ECを有するsTBIでの両方の時点で、HV(p、0.001)、EC(p<0.001)及びmTBI(p<0.001)に対して、有意にアップレギュレーションされた(7.106±4.192及び4.012±1.577)。HVと比較して、残余の分類では有意差が見出されなかった。miR-335は、sTBI+ECで、かつ両方の時点でのアップレギュレーションを示した(それぞれ、16.824±14.195及び12.324±8.931)。1日目には、これらの群は対照(p=0.001)及びmTBI+EC(p=0.031)とは有意に異なったが、ECとは有意に異ならなかった。興味深いことに、EC患者での有意なアップレギュレーションは、1日目では見られたが(7.951±4.870)、傷害から15日間では見られなかった(1.260±0.531)。この理由のために、15日目では、miR335は、HV(p=0.002)、EC(p=0.007)及びmTBI+EC(p=0.001)に対して、sTBI+EC群で有意に高かった。miR-335は、HVと比較して、両方の時点で、mTBI+ECではいかなる有意差も示さなかった。これらのバイオマーカーについてのAUCもまた、表3に示す。
本研究では、miRNAレベルの変化が、TBIの診断、及びその重症度の評価に適用できるか否かを調べた。4種類のmiRNAが、TBIで示差的に発現されるものと特定された:miR-425-5p、miR 502、miR-21及びmiR-335。
患者及びサンプル採取
研究の参加者は、バーミンガムのクイーン・エリザベス病院(UK)の外科的再建・微生物学研究センター(Surgical Reconstruction and Microbiology Research Centre(SRMRC))から、SIR(リハビリテーションを通した傷害からのステロイド及び免疫;Steroids and Immunity from injury through to Rehabilitation)研究(Ethics Ref. 11/SW/0177)、ReCoS(スポーツでの反復される脳震盪;REpetitive COncussion in Sport)研究(Ethics Ref. 11-0429AP28)及びゴールデンアワー研究(Ethics Ref. 13/WA/0399)の一部分として募集された。書面によるインフォームドコンセントを参加者から、又は法的に有効な委任状(家族又は研究に直接関与しない専門家)を、研究へと組み入れる前に受領した。
血液サンプルは、採血後2時間以内に血清単離のために処理された。全血を、室温で約30分間静置し、続いて4℃で10分間、3000rpmで遠心分離した。血清をアリコートに分け、分析まで-80℃で保存した。
mTBIの候補バイオマーカーに関する単一TaqManアッセイ
実施例1での知見を検証するために、3種類の別個の独立した群(30名のmTBI+EC、30名のsTBI+EC、30名のEC)での選択されたmiRNAの発現を、種々の時点(傷害からT0、T4~12h、T48~72h及び15日間)で、単一TaqManアッセイを用いて測定した。結果を、10名のHVと比較した。変化倍率は、miR-331及びmiR-223*を参照として用いて、2-ΔΔCT法により算出した。
miR-21及びmiR-335は、それらの両方が、初期スクリーニングでのsTBI+ECの両方の時点でアップレギュレーションされたことが明らかになったので、sTBIの考えられるバイオマーカーとして分析された。これらは、第2の患者のデータセットでも、強力な候補であることが示された(図4)。miR-21は、HV、EC及びmTBI+ECに対して、傷害から4時間後のすべての時点で、ECを有するsTBIで有意にアップレギュレーションされた(p=0.00306(T4~12h)、p=0.00844(T48~72h)及びp=0.00077(15日間))。残余の分類では、HVと比較して有意差は見られなかった。miR-335は、HVと比較して、sTBI+ECではすべての時点でアップレギュレーションを示し(p=0.00109(T0~1h)、p=0.00284(T4~12h)、p=0.00012(T48~72h)及びp=0.01284(15日間))、mTBI+ECでアップレギュレーションを示したが、ECと比較して有意なアップレギュレーションは見出されなかった。これらのバイオマーカーについてのAUCもまた、表4に示される。
本研究では、miRNAレベルの変化が、TBIの診断及びその重症度の評価に適用できるという以前の知見を検証した。本研究は、以下の4種類のmiRNAがTBIで示差的に発現されることを確認した:miR-425-5p、miR 502、miR-21及びmiR-335。
唾液サンプルを、脳震盪を起こしたプロスポーツ選手(アスリート)から、傷害から2~3日後に採取し、唾液中に存在するマイクロRNAを分析した。アスリートは、臨床的にmTBIを有すると診断された。
マイクロRNAは、nCounter技術(nanoString Technologies(登録商標))を用いて分析され、この技術は、1回のハイブリダイゼーション反応で、最大で数百種類の固有の転写産物を検出及び計数するために、分子「バーコード」及び顕微鏡イメージングを用いる。各カラーコード化バーコードは、対象となるマイクロRNAに対応する単一の標的特異的プローブに連結されている。
精製及び固定化:ハイブリダイゼーション後、過剰なプローブを除去し、プローブ/標的複合体が、アライメントされ、nCounterカートリッジ中に固定化される。
データ収集:サンプルカートリッジは、データ収集のために、デジタルアナライザー装置に配置される。カートリッジの表面上のカラーコードが計数され、各標的分子について作表される。
以下の表4は、健常ボランティアと比較して、脳震盪を起こしたアスリートで有意かつ示差的に発現されていることが見出されたマイクロRNAのリストである。本表は、対照群と比較した、患者でのマイクロRNAの発現の変化倍率を示す。変化倍率は、miR-23a-3p及びmiR-148b-3pを参照遺伝子として用いて算出した。健常ボランティアと比較して、脳震盪を起こしたアスリートで示差的に発現される。本表は、対照群と比較した、患者でのマイクロRNAの発現の変化倍率を示す。変化倍率は、miR-23a-3p及びmiR-148b-3pを参照遺伝子として用いて算出した。
本研究は、唾液中に存在するマイクロRNAが、脳震盪/mTBIの指標であることを示す。唾液は血液よりも容易に取得されるので、このことは重要であり、つまり、唾液中マイクロRNAの検出が、特に競技場脇での、TBIを診断するための迅速かつ簡便な手段を提供する。
材料及び方法
研究承認
研究参加者は、ReCoS(The REpetitive COncussion in Sport)研究(倫理参照番号11-0429AP28)の一環として、英国バーミンガムのクイーンエリザベス病院にある外科的再建・微生物学研究センター(Surgical Reconstruction and Microbiology Research Centre:SRMRC)を通じて募集された。研究に含める前に、参加者から書面によるインフォームドコンセントを得た。
氷上に保った50mlの滅菌プラスチック製万能容器チューブに、30分以内に5mlの唾液を集めた。次にサンプルを4℃で15分間、2600×gで遠心した。次いで、唾液をアリコートに分け、各mlの唾液に、miRNAの分析のためにRNase阻害剤(500ユニット/mL)を加えた。
血清又は血漿からのRNA(小型RNAを含む)の精製のためのQiagen補足プロトコルに従って、Qiagen miRNeasy Mini Kit(Qiagen, GmbH, Hilden,ドイツ)を使用することによって400μlの唾液から総RNAを単離した。最後に、RNAを200μlのRNAse不含水中に溶出し、続いて20μgのグリコーゲン、0.1容量の3M酢酸ナトリウム及び2.5容量の氷冷100%エタノールを添加することによって沈殿させた。-80℃で一晩インキュベートした後、RNAを遠心分離し、氷冷75%エタノール中で2回洗浄し、7μlのRNAse不含水に再懸濁した。RNAをNanodropにより定量した。
nCounter FLEX(Prep Station and Digital Analyzer(調製ステーション及びデジタルアナライザー))(NanoString Technologies)においてnCounter Human v3 miRNA発現アッセイキット(NanoString Technologies)を製造業者の指示に従って使用することによって、唾液からのmiRNAの発現プロファイルを、NanoString技術によって実施した。プロファイリングは、6名の脳震盪を起こしたアスリートと6名の脳震盪を起こしていないアスリートについて行った。3μl(約150ng)の総RNAをサンプル調製に使用した。データ解析は、nSolver 2.6ソフトウェアによって行った。内因性対照として使用されるmiRNAは、グローバル中央値正規化(GMN)法によって選択した。我々は、各レーンのカウント平均と各miRNAのカウントとの間のピアソン相関を計算し、発現がカートリッジのカウント平均に近いmiRNAを同定した(miR-23a-3p、miR-29b-3p、miR-148b-3p)。統計的解析は、100個の順列に基づくp値を使用して、有意性マイクロアレイ分析(SAM)(http://www.tm4.org)により行った。代入エンジン:K最近傍(10人)。誤発見率(FDR)< 0.05。
アレイから脳震盪の潜在的なバイオマーカー候補として21の示差的に発現されたmiRNAを選択した。これらの候補を使用して、22名の脳震盪を起こしたアスリートと10名の脳震盪を起こしていないアスリート(検証群)の拡大コホートでデータを検証した。傷害から2~5日後に唾液を採取し、単一TaqManアッセイ(AppliedBiosystems, Life Technologies(商標))によって分析した。サンプルを上記のように抽出し、逆転写し(AppliedBiosystems, Life Technologies(商標))、RT-qPCR分析をBio-Rad iQ5リアルタイムPCR検出系(Bio-Rad, CA, USA)で行った。参照遺伝子としてmiR-23a-3p及びmiR-148b-3pを使用することにより、2-ΔΔCT法によって発現倍率変化を計算した。
ノンパラメトリック検定(Mann-Whitney U検定)を用いて、2つの独立した群におけるmiRNAのレベルを比較した。0.05未満のp値が有意であると認められた。
Nanostringプロファイリング
脳震盪を起こした及び脳震盪を起こしていないアスリートの唾液中でnCounter NanoStringにより分析した800のマイクロRNAのうち、2つの集団において示差的に発現されたものとして21のmiRNAを選択した:hsa-let-7c-5p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-20a-5p+ hsa-miR-20b-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-27b-3p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-29c-3p、hsa-miR-30a-5p、hsa-miR-107、hsa-miR-135b-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-148a-3p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-324-5p、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-652-3p。結果は、上述したmiRNAの全てについて有意な上方調節を示した。
これらの知見を検証するために、続いて、22名の脳震盪を起こしたアスリート及び10名の脳震盪を起こしていないアスリートから構成される別個のかつ独立した群において21の選択したmiRNAの発現を試験した。単一TaqManアッセイを使用することにより傷害の2~5日後に唾液を採取した。miR-23a-3p及びmiR-148b-3pを参照マーカーとして使用して、2-ΔΔCT法(2-デルタデルタCT法)により倍率変化を計算した。
この研究では、頭部傷害及び脳震盪(mTBI)の関連でバイオマーカーの検査のための潜在的に新規な液体である唾液を調べた。
Claims (16)
- 対象において軽度外傷性脳傷害(mTBI)を診断するために唾液サンプル中の少なくとも1種の標的miRNAの量を決定する方法であって、
(a)対象から取得された唾液サンプルを準備するステップ、
(b)前記唾液サンプルを、miR-27b-3p、let-7i-5p、miR-107及びmiR-135b-5pからなる群より選択される少なくとも1種のmiRNAに結合可能な核酸を含むプローブと接触させるステップ、
(c)前記唾液サンプル中の少なくとも1種の標的miRNAの量を決定するステップであって、該少なくとも1種の標的miRNAが、
(i)miR-107、
(ii)miR-135b-5p、又は
(iii)まとめてmiR-27b-3p、let-7i-5p、miR-107及びmiR-135b-5p
を含む、前記ステップ
を含み、少なくとも1種の標的miRNAの量が所定の閾値と比較して又は健常対象から採取された対照唾液サンプル中の少なくとも1種の標的miRNAの量と比較して増大している場合に、対象がmTBIを有すると同定され、該所定の閾値は、2-デルタデルタCT(2-ΔΔCT)法において参照miRNAの量に対する1.5倍以上の倍率変化と同等である、上記方法。 - 前記少なくとも1種の標的miRNAがmiR-107である、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1種の標的miRNAがmiR-135b-5pである、請求項1に記載の方法。
- 前記唾液サンプルが、傷害の24時間~15日後に取得されたサンプルである、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記唾液サンプルが、傷害の24時間~7日後に取得されたサンプルである、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記唾液サンプルが、傷害の2~5日後に取得されたサンプルである、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
- 傷害の後の1以上の追加の時点で対象から取得された1以上の追加の唾液サンプルを準備すること、各追加のサンプルについて前記接触ステップ及び決定ステップを反復することをさらに含む、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記1以上の追加の唾液サンプルが、傷害から2日後、3日後、5日後、7日後、10日後、14日後、又は15日後に取得されたサンプルである、請求項7に記載の方法。
- 前記少なくとも1種の標的miRNAの量の決定ステップが、PCRに基づくアッセイを用いて行われる、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記所定の閾値が、2-デルタデルタCT(2-ΔΔCT)法において参照miRNAの量に対する2倍以上の倍率変化と同等である、請求項1~9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記参照miRNAが、miR-331、miR-223 * 、miR-23a-3p、及びmiR148b-3pから選択される少なくとも1つのmiRNAを含む、請求項1~10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記唾液サンプル中の少なくとも2種の標的miRNAの量を決定するステップを含む、請求項1~11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記少なくとも2種の標的miRNAが、miR-27b-3p、let-7i-5p、miR-107又はmiR-135b-5pから選択される、請求項12に記載の方法。
- 前記少なくとも1種の標的miRNAが、miR-27b-3p、let-7i-5p、miR-107及びmiR-135b-5pをまとめて含む、請求項1~13のいずれか1項に記載の方法。
- let-7c-5p、let-7i-5p、miR-142-3p、miR-148a-3p、miR-15b-5p、miR-16-5p、miR-181a-5p、miR-20a-5p、miR-20b-5p、miR-221-3p、 miR-24-3p、miR-27b-3p、miR-29a-3p、miR-29c-3p、miR-424-5p、miR-30a-5p、miR-107、miR-135b-5p、miR-199b-5p、miR-324-5p、及びmiR-652-3pから選択される1種以上の追加のmiRNAの量を決定するステップをさらに含む、請求項1~14のいずれか1項に記載の方法。
- 対象における軽度外傷性脳傷害(mTBI)の診断方法において使用するための、miR-27b-3p、let-7i-5p、miR-107及びmiR-135b-5pからなる群より選択される少なくとも1種のmiRNAに結合可能な核酸を含むプローブを含むキットであって、前記方法が、
(a)対象から取得された唾液サンプルを準備するステップ、
(b)前記唾液サンプルを、miR-27b-3p、let-7i-5p、miR-107及びmiR-135b-5pからなる群より選択される少なくとも1種のmiRNAに結合可能な核酸を含むプローブと接触させるステップ、
(c)前記唾液サンプル中の少なくとも1種の標的miRNAの量を決定するステップであって、該少なくとも1種の標的miRNAが、
(i)miR-107、
(ii)miR-135b-5p、又は
(iii)まとめてmiR-27b-3p、let-7i-5p、miR-107及びmiR-135b-5p
を含む、前記ステップ、
(d)少なくとも1種の標的miRNAの量が所定の閾値と比較して又は健常対象から採取された対照唾液サンプル中の少なくとも1種の標的miRNAの量と比較して増大している場合に、対象がmTBIを有すると同定するステップ
を含むものであり、該所定の閾値は、2-デルタデルタCT(2-ΔΔCT)法において参照miRNAの量に対する1.5倍以上の倍率変化と同等である、上記キット。
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Emergency Medicine International (2012) Vol.2012, Article ID 637171, pp.1-11 |
Netherlands Journal of Critical Care (2016) Vol.24, No.1, pp.6-11 |
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