KR102621064B1 - 외상성 뇌 손상 및 뇌진탕 증상의 분석 및 예측 - Google Patents

외상성 뇌 손상 및 뇌진탕 증상의 분석 및 예측 Download PDF

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Abstract

본 발명은 타액 중에서 TBI와 연관된 miRNA 농도 수준을 검출함으로써 외상성 뇌 손상 또는 TBI를 검출하거나 진단하기 위한 방법에 관한 것이다. 타액 miRNA 농도 수준의 제어된 그리고 정규화된 비교를 위한 방법을 추가로 제공한다. 타액 miRNA, 타액 miRNA를 검출하기 위한 프로브 및/또는 프라이머를 포함하는 어세이 키트가 또한 제공된다.

Description

외상성 뇌 손상 및 뇌진탕 증상의 분석 및 예측
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2017년 3월 23일자로 출원된 미국 가출원 제62/475,698호; 2017년 3월 31일자로 출원된 제62/480,079호; 2017년 5월 5일자로 출원된 제62/502,107호; 및 2018년 1월 29일자로 출원된 제62/623,145호를 우선권 주장하고, 이들의 내용은 본 명세서에 그들의 전문이 참고로 편입된다.
본 개시내용의 기술분야
본 발명은 지속된 외상성 뇌 손상(traumatic brain injury: TBI)을 갖는 성인 및 소아 대상체 및 TBI로부터 초래된 뇌진탕 후 증후군(post-concussion syndrome: PCS)이 발생할 가능성이 있는 해당 대상체를 진단하고 동정하는 분야에 관한 것이다. 본 발명은 타액 miRNA 수준에서 측두 변화, 예컨대 일주기 변동을 보상하는 타액 마이크로 RNA(micro RNA: miRNA) 수준의 값을 수정하거나 정규화할 뿐만 아니라 질환, 손상 또는 다른 장애와 또는 건강 상태와 상관관계가 있는 타액 miRNA 수준에서 비정상인 시간적 변화를 검출하기 위한 방법을 수반한다.
미국에서 매년 3백만건의 뇌진탕이 발생하며, 대략 2/3는 아동 및 청소년에서 일어나는데, 이는 2007년 이래로 거의 250%의 증가이다(McCarthy et al., 2015). 소아 뇌진탕의 80% 초과는 경증의 외상성 뇌 손상(mild traumatic brain injury: mTBI)으로부터 초래된다(Kirkwood, et al., 2006). mTBI는 초기 글라스고우 혼수 척도 스코어(Glasgow Coma Scale score)가 13 이상이고 초점 신경 결손이 결여된 변경된 정신상태, 의식의 상실(20분 미만) 또는 기억 상실증(24시간 미만)으로서 나타난 뇌 기능의 외상성 붕괴로서 정의된다(J. Head Trauma Rehabil., 1993). 대부분의 아동에 대해, 뇌진탕 증상은 2주 내에 해결될 것이지만, 일부 아동은 이 기간을 지나서 연장되는 인지, 신체, 감정 및 거동 증상을 경험할 것이다(Babcock et al., 2013; Barlow et al., 2011; Scorza et al., 2012). 28일보다 길게 지속되는 증상을 갖는 해당 개체는 아동에서 6% 내지 59% 범위의 발생률을 갖는 뇌진탕 후 증후군(PCS)을 갖는 것으로 분류될 수 있다(Ayr et al., 2009; Burton et al., 1997; Yeates et al., 1999; Barlow et al., 2010).
대부분의 소아과 의사는 뇌진탕을 진단할 수 있다고 느끼지만, PCS가 발생하는 아동의 소집단을 신뢰 가능하게 확인할 수 있는 확립된 임상 도구가 현재 없다(Zemek et al., 2013; Zonfrillo et al., 2012). 뇌진탕을 갖는 일부 아동이 PCS의 성향을 갖게 하는 인자에 관한 지식의 결여는 소아과 의사에게 어려운 예상 가이드라인을 개발하게 한다. 뇌진탕이 있는 아동을 평가함에 있어서 객관적 측정의 부재는 개인화된 치료 계획의 전문가 의뢰 및 실행을 지연시킬 수 있다(Bazarian et al., 2001).
이전의 소아 연구는 PCS 위험과 인자, 예컨대 여성 성별, 더 높은 연령, 초기 두통의 존재, 및 병원에 입원 사이의 상관관계를 발견하였다(Babcock et al., 2013; Zemek et al., 2013; Scopaz et al., 2013). 2012 스포츠에서 뇌진탕에 대한 공통 언급(Consensus Statement on Concussion in Sport)은 연령-적절 증상 체크리스트가 뇌진탕의 정확한 임상 평가를 위해 아동, 부모, 교사 및 돌보는 사람에게 투여되는 것을 권장하였다. 체크리스트 특징을 이용하는 임상 위험 점수는 두부 손상의 48시간 내에 제공되는 환자에서의 PCS 위험을 예측하는 보통의 능력을 입증하였다(Zemek et al., 2016). 그러나, 전형적인 임상적 맞닥뜨림의 시간 제약 내에서 다중 연령-특이적 질문을 투여하고 점수화하는 것의 실현 가능성은 의사가 공통 뇌진탕 평가 도구를 채택하는 것을 방지하였다(Zonfrillo et al., 2012). 대신에, 다수의 연구자들은 뇌진탕에 대한 대안의 진단적 접근을 연구하기 시작하였다.
뇌진탕 과정을 진단하고, 모니터링하며 예측하는 수단으로서 단백질 바이오마커의 사용에 대한 연구는 과거 십년에 걸쳐 현저하게 증가되었다(Papa et al., 2013). 가장 광범위하게 시험된 바이오마커 중 하나는 성상세포에서 발현되고 뇌척수액(cerebrospinal fluid: CSF) 및 혈청에서 저수준으로 발견되는 저분자량 단백질인 S100β였다(Papa et al., 2015; Berger et al., 2002). S100β 수준은 성인에서 mTBI 후에 두부 컴퓨터 단층촬영(computed tomography: CT) 소견과 상관관계가 있지만, 소아 두부 외상에서 그의 정확성에 관한 상충되는 보고가 있다(Jeter et al., 2013; Unden et al., 2009).
S100β에 대한 기준 범위가 존재하지만, 그들은 대체로 성인 데이터에 기반하며, 아동 발달 동안 연령 및 성별에 따른 변동을 설명하여야 한다(Gazzolo et al., 2003). S100β는 또한 중추 신경계(central nervous system: CNS) 밖에서 생산되며, 골절 및 복강내 손상을 비롯한 질환 상태에 의해 영향 받는다(Kovesdi et al., 2010). 이들 인자는 그것에 mTBI 진단 검사로서 불량한 특이성을 제공한다(Bazarian et al., 2006). 추가로, S100β는 운동에 의해 영향 받아서, 청소년에서 공통된 메커니즘인 스포츠 뇌진탕에서의 그의 효용을 제한한다(Otto et al., 2000). 연령과 상관없이, 현재 연구 중인 대부분의 단백질 바이오마커는 검출 가능한 두개내 병변을 갖지 않는 개체에서 mTBI를 검출하기에 낮은 민감도를 가진다(Bhomia et al., 2016). 또한 mTBI 후에 PCS를 신뢰 가능하게 예측할 수 있었던 단백질 바이오마커가 없었다(Ma et al., 2008; Begaz et al., 2006).
마이크로 리보핵산(miRNA)은 인간 신체 전체적으로 단백질 번역에 영향을 미치는 작은, 내인성의, 비암호화 분자이다(Nam et al., 2014). 그들은 보호적 엑소좀 및 마이크로 소수포에 의해 세포외 공간을 통해 수송되거나, 단백질에 결합되는데, 이는 그들이 혈청, CSF 또는 타액에서 용이하게 검출되게 한다(Bhomia et al., 2016; Valadi et al., 2007). 손상된 세포에 의해 방출되는 조직-특이적 mRNA 수준은 인간 질환의 바이오마커로서 작용할 것이다. 그들의 존재비, 변동하는 pH 수준의 안정성, 효소 분해에 대한 내성 및 전사 조절에서의 필수 역할에 기인하여, miRNA는 양호한 바이오마커 후보일 수 있다(Gilad et al., 2008).
7종의 이전의 연구는 인간 TBI에서 miRNA 바이오마커의 효용을 시험하였다. 파시네티(Pasinetti)와 동료들은 PTSD만을 갖는 9명의 대조군 재향 군인에 비해 동반이환 외상 후 스트레스 장애(post-traumatic stress disorder: PTSD) 및 mTBI를 갖는 9명의 재향 군인의 말초 혈액 단핵 세포에서 하나의 miRNA(miR-671-5p)가 감소된다는 것을 발견하였다(Pasinetti et al., 2012). 레델(Redell)와 동료들은 연령-, 성별- 및 인종-매칭된 대조군의 혈장에서 동정된 108종의 miRNA 중에서, 52종은 중증의 TBI(sTBI) 후에 10명의 대상체에서 "변경"되었다는 것을 발견하였다. 연구는 손상 후 처음 24시간 내에 sTBI(GCS < 6)과 mTBI(GCS >12)를 둘 다 동정하기 위한 miRNA의 효용을 추가로 시험하였다. 그들은 sTBI를 갖는 8명의 대상체에서 하나의 miRNA가 증가되고(miR-765) 2종의 miRNA(miR-16 및 miR-92a)가 감소될 뿐만 아니라; 건강한 지원자에 비해 mTBI를 갖는 11명의 대상체에서 2종의 miRNA(miR-92a 및 miR-16)가 증가되었다는 것을 발견하였다(Redell et al., 2010).
보미아(Bhomia)와 동료들은 경증 내지 중등증의 TBI(GCS ≥ 9)에 걸린 8명의 대상체의 혈청에 그리고 sTBI(GCS ≤ 8)에 걸린 8명의 대상체에서 존재하는 10종 miRNA의 그룹(miR-151-5p, miR-195, miR-20a, miR-30d, miR-328, miR-362-3p, miR-486, miR-505, miR-92a 및 mmu-miR-451)을 동정하였다. 혈청 중에서 발견된 miRNA의 존재를 입증하기 위해, 연구는 중증의 TBI를 갖는 8명의 대상체의 CSF를 시험하였고 10종 miRNA 중 4종(miR-328, miR-362-3p, miR-451 및 miR-486)에서 증가를 발견하였다(Bhomia et al., 2016). 디 피에로(Di Pietro)와 동료들에 의한 연구는 mTBI를 갖는 5명의 개체, sTBI를 갖는 5명의 개체, 및 5명의 건강한 대조군에서 혈청 miRNA 발현을 시험하였다. 저자는 2종의 miRNA(miR-425-5p 및 miR-502)가 mTBI 그룹에서 하향조절되고, 2종의 miRNA(miR-21 및 miR-335)가 sTBI 그룹에서 상향조절되었다는 것을 발견하였다(Di Pietro et al., 2017).
양(Yang)과 동료들은 건강한 대조군에 비교할 때 경증의 TBI(GCS ≥13)를 갖는 25명의 대상체, 중등증의 TBI(GCS 9-12)를 갖는 26명의 대상체, 및 중증의 TBI(GCS ≤8)를 갖는 25명의 대상체의 혈청에서 상향조절된 3종의 miRNA(mir-93, mir-191 및 mir-499)를 동정하였다. 그들은 또한 이들 miRNA 수준이 경증 및 중등증의 TBI 그룹과 비교할 때 중증의 TBI 그룹에서 더 높은 수준으로 증가되었다는 것을 인식하였다(Yang et al., 2016). 미트라(Mitra)와 동료들은 2명의 miRNA(mir-142-3p 및 mir-423-3p)가 TBI만을 갖는 12명의 대상체에 비교할 때 TBI와 기억 상실증의 조합을 갖는 12명의 대상체의 혈청에서 상승되었다는 것을 발견하였다(Mitra et al., 2017).
외상성 뇌 손상(TBI)은 미국 단독에서 매년 적어도 1백 7십만명의 개체에 영향을 미치는 중요한 공공의 건강 문제이며, WHO에 따르면 "2020년까지 주된 사망 원인 및 장애로서 다수의 질환을 능가하는 것"으로 예측된다. 상기 장애는 경증 내지 중증 범위의 범주로 분류되며, 경증의 TBI(mTBI)가 총 TBI 사례의 적어도 85%를 차지한다. 특히, mTBI의 발생률은 특히 스포츠 경쟁과 관련하여, 불충분하게 보고된 바가 통상적으로 간주되며, 여기서 운동선수는 종종 공식적인 의학적 평가의 완료 및 프로토콜로의 복귀까지 참여를 중단하고 스포츠 경쟁에서 빠질 것을 강요당하는 것을 피하기를 원한다. 그 결과, mTBI는 "침묵의 전염병"으로 지칭되었다.
mTBI에서 전형적인 두부 충격은 뇌에 대한 빠른 타격(일격/역타격) 및/또는 비틀림(회전) 손상을 유도하여, 직접적인 뇌 세포 상실을 갖는 실질 타박상 및 지주막하 출혈뿐만 아니라 축삭돌기의 신장, 및 수년간 지속될 수 있는 미만성 축삭 손상을 야기한다. 더 나아가, 반복 mTBI는 뇌진탕후 증후군 및 만성 외상성 뇌질환(chronic traumatic encephalopathy: CTE)을 비롯한 심각한 장기간 후유증과 연관되는데, 후자는 종종 인지 장애, 신경정신과적 증상, 치매 및 권투선수의 파킨슨병을 야기한다. 게다가, mTBI는 종종 경증의 뇌 손상을 검출함에 있어서, 불충분하게 보고된, 증상의 지연된 개시 및 통상적인 평가의 제한된 민감도에 기인하여 진단되지 않으며, 이에 의해 진단적, 예후적 및 치료적 접근을 방해한다.
이들 증상은 시간에 따라 발생되고 초기 손상은 종종 통상적인 신경촬영 기법에 의해 검출을 벗어나기 때문에, mTBI는 진단적 도전을 제시하는데, 이는 그의 병리생리학의 시간 과정을 시험하기 위한 노력을 나타내었다. 결과적으로, mTBI에 대한 진단적, 예후적 및 치료적 접근은 결여되어 있다. 이들 문제를 조합하여, mTBI가 처음에 일어난 것을 확인하는 것의 실패는 반복적 mTBI를 용이하게 야기하고, CTE의 위험을 증가시킬 수 있다. 따라서, mTBI의 조기 검출 및 진단을 돕는 정확하고 신뢰 가능한 진단적 마커를 확립하고, 그의 예후를 알리고, 궁극적으로 치료에 대한 반응을 모니터링하는 수단을 제공하는 것은 매우 중요하다.
마이크로RNA(miRNA)는 표적 mRNA 번역 및 전사체의 거대 분획에 대한 안정성을 억제하는 작은 비암호화 RNA(대략 22개의 뉴클레오타이드)이고, 암 및 당뇨병을 포함하는 몇몇 장애의 유용한 바이오마커로서 나타났다. 유전자 발현에 대한 miRNA의 영향은 그들을 합성하는 세포 내에서 뿐만 아니라 세포외 수송을 통해 멀리 있는 세포 내에서 일어난다. 일단 공여자 세포로부터 방출되면, miRNA는 다양한 세포외 유체를 통해 이동하고 수용자 세포에서의 유전자 발현에 대해 조절 효과를 발휘할 수 있다. 따라서, miRNA는 매우 다양한 세포와 조직 내의 그리고 세포와 조직 간의 세포 기능의 중요한 마스터 조절자이다. 순환 miRNA가 손상 후 혈장에서 상승된다는 것과, miRNA 발현 프로파일이 건강한 상태와 질환 상태 간에 상이하다는 것을 나타내는 최근의 데이터는 세포 및 조직 손상 또는 암의 말초 바이오마커로서 작용할 그들의 가능성에 상당한 관심을 생성하였다. 추가로, 특정 miRNA 네트워크의 조절장애는 알츠하이머병 및 파킨슨병뿐만 아니라 알코올 중독을 비롯한 중증의 신경퇴행성 장애와 연관되었다. 뇌 조직은 신경퇴행성 질환을 갖는 살아있는 대상체로부터 용이하게 입수 가능하지 않지만, 뇌-특이적 miRNA가 말초 생체유체에 방출된다는 사실은 miRNA 프로파일이 CNS에서 일어나는 병리학적 과정의 대용물 또는 간접적 판독으로서 작용할 수 있다는 것을 시사한다. 따라서, mTBI에 대한 특이적 바이오마커를 동정하는 것은 증상전 단계에 조기 검출을 용이하게 할 수 있었고, mTBI 후 후유증을 최소화하거나 심지어 예방하기 위한 신규한 표적에 대한 통찰을 제공할 것이다. mTBI 후 결과 측정을 예측하기 위해 말초 miRNA 바이오마커를 이용하는 것의 실현 가능성에 대한 근거는 최근에 소아 집단에서의 2종 연구로 제공되었다. 최초의 연구는 뇌척수액(CSF)과 타액(63%) 둘 다에 존재하는 miRNA에서 상당한 중복을 입증하였고, 또한 중증의 그리고 경증의 TBI를 갖는 아동에서 다수의 이들 miRNA에 대한 비슷한 변화를 나타내었다. 동일한 그룹으로부터의 후속 연구는 mTBI 후 며칠 내에 뇌진탕 클리닉에 내원한 아동에서의 타액 miRNA 패턴이 높은 정확도로 급성 뇌진탕 증후군(acute concussive syndrome: ACS) 또는 장기적인 뇌진탕 증후군(prolonged concussive syndrome: PCS)이 발생하는지의 여부를 예측할 수 있었다는 것을 나타내었다. 특히, 앞서 언급한 연구로부터 누락된 요소 중 하나는 후속적으로 mTBI 에피소드를 경험한 개체에서의 임의의 유형의 분자 또는 기능성 기준 평가이다.
이는 이제 타액 및 혈청 miRNA에서의 변화, 및 성인 운동선수가 아마추어 종합 격투기(MMA) 경쟁 동안 mTBI 사건을 경험할 가능성 후에 그들에서의 수많은 신경인지 기능성 측정의 변화 패턴을 직접적으로 비교하는 본 발명자들에 의해 구체적으로 처리되었다. 더 나아가, 본 발명자들은 miRNA의 변화와 기능성 측정 사이의 연관 강도를 정량화하였고, 그들의 잠재적 진단 효용을 평가하였다.
본 발명자들은 또한 mTBI의 민감한 그리고 특이적 말초 바이오마커로서 작용하는 마이크로RNA(miRNA)의 효용을 평가하였다. 상기 언급한 바와 같이, miRNA는 암, 당뇨병, 신경발달 및 신경퇴행성 장애에서 유용한 바이오마커 후보로서 나타난 단백질 발현을 억제하는 작은 비암호화 RNA이다. miRNA는 신체의 모든 조직 및 기관에서 만들어지지만, 그들 중 다수는 조직-특이성을 나타낸다. 게다가, miRNA는 그들을 합성하거나 세포외 공간(extracellular space: EC)으로 방출하고 다른 세포에 영향을 미치는 생체유체에서 이동하는 세포 내에서 작용할 수 있다. 수많은 연구는 miRNA 발현 프로파일이 건강한 상태와 질환 상태 간에 다르다는 것과 조직 손상 후에 miRNA의 EC로의 방출이 상승하는 것으로 나타난다는 것을 나타내었다. 본 명세서에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 miRNA의 말초 측정, 예컨대 그들의 타액 수준, 가능한 mTBI 중증도의 객관적 평가, 및 균형과 인지 기능의 민감 지표 사이의 관계를 확립시키고 있다. 다수의 연구가 성인 TBI에서 조절이상인 miRNA 표적을 동정하였지만, 어떤 것도 아동에서 PCS를 예측함에 있어서 그들의 효용을 시험하지 않았다.
본 발명자들은 mTBI를 갖는 60세 아동에서 타액 miRNA의 바이오마커 잠재력을 연구하였고 sTBI를 갖는 아동의 CSF와 mTBI를 갖는 아동의 타액 둘 다에서 조절이상인 6종 miRNA를 동정하였다. 본 발명자들은 또한 스포츠 뇌진탕 평가 도구(Sport Concussion Assessment Tool: SCAT-3)에 대한 PCS의 발생 및 중증도를 예측함에 있어서 타액 miRNA의 임상 정확도를 평가하였다. 본 발명자들은 뇌 손상 및 수선과 생리적으로 관련된 miRNA가 전형적인 뇌진탕 지속기간을 갖는 대조군에 비해 PCS를 갖는 아동에서 변경되는지의 여부, 및 타액 miRNA의 예측 값이 현재의 임상 도구, 예컨대 SCAT-3의 값을 초과하는지의 여부를 발견하는 것을 추구하였다. 본 명세서에 나타낸 바와 같이, 그들은 타액 miRNA 프로파일이 뇌진탕 증상의 지속기간을 예측할 수 있다는 것을 발견하였다. 예를 들어, 그들은 mTBI를 갖는 아동 및 청소년의 타액 miRNA 프로파일이 1) TBI를 갖는 아동 및 청소년의 CSF 프로파일을 반영하고; 2) mTBI의 존재를 정확하게 동정하고; 3) mTBI의 성인 miRNA 바이오마커와 상이하다는 것을 발견하였다. 붕괴된 miRNA는 뇌 손상 및 수선과 기능적으로 관련된다.
본 명세서에 기재된 시스템 및 방법은 스포츠 손상으로부터 초래된 것을 포함하는 TBI를 검출하고, 진단하며, 모니터링하는 기존의 방법에 의한 다수의 문제를 해결한다.
타액과 같은 생물학적 유체에서 그의 존재비 또는 몰농도와 같은 수준을 측정함으로써 뇌진탕 및 경증의 외상성 뇌 손상을 포함하는 외상성 뇌 손상을 검출하고, 진단하고, 예후하는 방법. 이들 방법은 소아와 성인 대상체 둘 다에 적용 가능하며, TBI로부터의 치료 및 회복을 모니터링하기 위해 적용될 수 있다. RNA 서열분석 절차에 의해 얻어지는 것과 같은 miRNA 수준에 대한 판독 데이터는, 예를 들어, 하나 이상의 비변이체 RNA 수준과의 비교에 의해 추가로 정규화될 수 있다. 일부 실시형태에서, miRNA 수준은 타액과 같은 생물학적 유체 중의 miRNA 수준의 일주기 변동에 기반하여 추가로 정규화된다. TBI와 관련된 것으로 본 명세서에 개시된 miRNA 수준을 검출하고 정량화하는 프로브 및/또는 프라이머를 함유하는 어세이 키트는 타액 및 다른 생물학적 유체 중의 TBI-연관 miRNA 수준을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 이들 및 다른 목적은 단독으로 또는 이들의 조합으로 바람직한 실시형태의 다음의 상세한 설명과 함께 더 명확하게 될 것이다.
본 개시내용의 목적 및 이들의 다수의 이점의 더 완전한 적용은 이하에 기재하는 수반하는 도면과 관련하여 고려할 때 다음의 상세한 설명을 참고로 하여 더 양호하게 이해되는 것으로 용이하게 얻어질 것이다.
도 1은 뇌진탕의 정확하고 생리적으로 적절한 miRNA 마커를 동정하기 위한 방법론적 파이프라인을 나타낸 도면이다. 약어: 골절(fx); 경증의 외상성 뇌 손상(mTBI); 중증의 외상성 뇌 손상(sTBI).
도 2A 내지 도 2L은 뇌진탕 및 대조군에 걸친 관심 대상의 6종의 miRNA에 대한 CSF 및 타액에서의 평균 농도를 도시하는 상자 수염 플롯(whisker box plot)을 도시한 도면이다. 윌콕슨 순위 합 검정(Wilcoxon rank sum testing)을 이용하여 miR-29c-3p(CSF p=0.032; 타액 p=0.008), miR-26b-5p(CSF p=0.003; 타액 p=0.016), miR-30e-5p(CSF p=0.045; 타액 p=0.009), miR-182-5p(CSF p=0.009; 타액 p=0.013), miR-320c(CSF p=0.037; 타액 p=0.016), 및 miR-221-3p(CSF p=0.014; 타액 p=0.005)에 대해 명목상의 유의한 변화를 검출하였다. 모두 6종의 miRNA에 대해 위검출률(False detection rate) 보정은 0.15 이하였다. 약어: 뇌척수액(CSF); 경증의 외상성 뇌 손상(mTBI); 중증의 외상성 뇌 손상(sTBI).
도 3a, 도 3b, 도 3c는 다변량 회귀 분석에서 mTBI 상태를 정확하기 동정하는 관심 대상의 6종의 miRNA를 도시한 도면이다. 6종 miRNA(miR-29c-3p, miR-26b-5p, miR-30e-5p, miR-182-5p, miR-320c 및 miR-221-3p)의 타액 농도를 이용하는 수용부 조작자 특징(receiver operator characteristic) 곡선은 mTBI 상태(A)의 랜덤 포레스트 검정(random forest testing)에 대해 0.852의 곡선하면적(AUC)을 입증하였다. 확립된 알고리즘은 2명의 대조군 대상체 및 15명의 mTBI 대상체(B)로 오분류되었다. 무작위로 대조군 및 mTBI 대상체의 1/4을 홀드아웃하는(hold out) 이 도구의 100배 교차 검증은 유사한 정확도(C)를 나타내었다.
도 4a, 도 4b, 도 4c는 계층적 클러스터링(hierarchical clustering: HC) 분석을 도시한 도면이다. 관심 대상의 6종 miRNA의 타액 농도 및 아동 SCAT-3 스코어(A), 부모 SCAT-3 스코어(B) 및 의학적/인구통계학적 특징(C)에 대해 스피어먼 순위 상관관계 검정(Spearman rank correlation testing)을 수행하였다. 색-척도 값은 관심 대상의 두 특징 사이의 스피어먼 순위 상관관계를 나타낸다.
도 5A 내지 도 5F는 뇌척수액 RNA의 품질 분석을 도시한 도면이다. 애질런트 바이오애널라이저(Agilent Bioanalyzer) RNA 나노칩을 이용하여 추출된 RNA의 시험은 뇌척수액 샘플에서 상대적으로 낮은 RNA 수율을 입증하였지만, 18 내지 25개의 뉴클레오타이드에서 피크가 일치된다(성공적인 miRNA 추출과 일치됨).
도 6은 MMA 시합 후에 평가한 기능성 측정의 변화에 대한 TBI 가능성 분류의 상당한 효과를 도시한 도면이다.
도 7A, 도 7B, 도 7C, 도 7D는 타액 또는 혈청 샘플을 제공하고 3개의 상이한 TBI 가능성 범주로 분류된 대상체에서 2종의 상이한 기능성 검사 동안 보인 시합 후 대 시합 전의 신체 동요(body sway)의 일관된 변화의 상자 수염 플롯을 도시한 도면이다(Low, Moderate, Very Likely). A 및 B - 상부 플롯, 좌측에서 우측으로; C 및 D - 하부 플롯, 좌측에서 우측으로. 동요 측정 중 하나는 인지 작업 수행(역순 숫자 세기(Digit Span Backwards), A-B) 동안 얻어지는 반면, 나머지는 시선 유도 없이 수행되는 균형 검사(눈을 감고 두 발로 서기, C-D) 동안 얻어졌다는 것을 주목한다. 동요의 증가는 낮은 TBI 가능성 그룹에 비해 중등증과 매우 가능성 있는 그룹에서의 측정의 세트 둘 다에 대해 명확하다.
도 8A, 도 8B, 도 8C, 도 8D는 TBI 가능성에 따라 그룹화한 대상체에서 두 상이한 기능성 검사에서 보이는 시합 후 대 시합 전의 신체 동요 또는 완료 시간 스코어의 덜 일치되는 변화를 도시한 도면이다. 도 7과 동일한 관례. 혈청(그러나 타액은 아님) 샘플을 취했을 때 TMB_Bal 작업의 매우 가능성 있는 그룹에서 스코어가 약간 상승되었고(A-B 상부 플롯, 좌측에서 우측으로), 중등증(그러나 매우 가능성 있는 그룹은 아님) 그룹에서 TMA_Cog 스코어(C-D, 하부 플롯, 좌측에서 우측으로)가 약간 상승되었다는 것을 주목한다.
도 9는 두부에 대한 가격(hits to the head: HTH)과 관련된 시합 후 혈청 UCHL1의 변화를 도시한 도면이다. 이 회귀는 30회 초과의 HTH를 받은 4명의 파이터에 의해 주로 유도되었다는 것을 주목한다. 그러나, 전반적으로, 시합 후 대 시합 전 파이터 그룹에서 유의한 차이는 없었다.
도 10A 내지 도 10I는 두부에 대한 가격(HTH)과 비교되는 혈청 단백질 변화를 도시한 도면이다. 9종 단백질 각각에 대해, 시합 전에 비해 시합후의 변화는 시합 전 수준의 백분율로서 표현하며, Y-축 상에 플롯팅한다. X-축은 각각의 MMA 시합의 비디오 기록의 독립적인 뷰어에 의해 계수된 HTH 값을 나타낸다. 이들 단백질 중 어떤 것도 HTH와 강한 연관을 나타내지 않았고, 최대 r2 값은 0.09 미만임을 주목한다.
도 11A, 도 11B는 통계학적 분석 전에 생체유체 유형 및 TBI 가능성에 따른 샘플 유형의 정규 및 매우 구형의 분포의 주성분 분석(Principal component analysis: PCA) 입증을 도시한 도면이다. 이미지(A)는 주요 데이터 클라우드로부터의 매우 가능성 있는 혈청 샘플(녹색/그레이 스케일 박스) 분리의 단지 약간의 제시와 함께, 샘플의 내부 혼합을 도시한 도면이다. 모든 데이터가 붕괴되었을 때, 변화 값은 고도로 정규의 방식으로 분포된다(B).
도 12는 시합 전 기준에 비해 혈청 또는 타액 샘플로부터의 miRNA 발현의 변화에 기반한 TBI 가능성을 예측하는 것의 정확도를 도시한 도면이다.
도 13A 내지 도 13F는 TBI 후 타액 및 혈청에서의 miRNA 발현 수준의 변화를 도시하는 상자 수염 플롯을 도시한 도면이다. 각각의 행은 상이한 miRNA 예(3종의 miRNA를 나타냄)를 나타내고, 각각의 점은 특정 샘플에서 해당 miRNA의 발현 수준을 나타낸다. 상부 플롯: A-B, 좌측에서 우측으로; 중간 플롯: C-D, 좌측에서 우측으로; 하부 플롯: E-F, 좌측에서 우측으로.
도 14는 KEGG 유비퀴틴-매개 단백질 분해 경로에서 표적 유전자에 대해 변화된 miRNA의 농축도를 도시한 도면이다.
도 15는 KEGG TGF-베타 신호전달 경로에서 표적 유전자에 대해 변화된 miRNA의 농축도를 도시한 도면이다.
도 16은 KEGG 축삭 인도(축삭 유도) 경로에서 표적 유전자에 대해 변화된 miRNA의 농축도를 도시한 도면이다.
도 17은 KEGG 글루탐산성 시냅스 경로에서 표적 유전자에 대해 변화된 miRNA의 농축도를 도시한 도면이다.
도 18은 분리에 수반된 상부 15종의 miRNA를 도시한 도면이다. 부분적 최소 제곱법 판별분석으로 장기간 뇌진탕 증상(PCS)을 갖는 아동을 급성 뇌진탕 증상(ACS)을 갖는 아동과 구별하는 데 가장 중요한 15종의 miRNA에 대한 VIP 스코어.
도 19는 총 miRNA 프로파일이 ACS 및 PCS 그룹의 부분적 분리를 달성한다는 것을 도시한 도면이다. PLSDA는 타액 miRNA 프로파일을 이용하는 ACS 및 PCS 그룹의 공간 분리를 도시한 도면이다.
도 20은 15종의 miRNA의 계층적 클러스터링 분석이 유전자 표적 기능에 기반한 miRNA의 3종의 별개의 클러스터(miR-629-3p 및 miR-133a-5p; let-7a-5p 및 let-7b-5p; miR-320c 및 miR-200b-3p)를 입증하였다는 것을 도시한 도면이다.
도 21은 초기 제시 시(손상의 2주 내에) 농도가 4주 후 특정 증상과 상관관계가 있는 개개 miRNA를 동정하는 상관관계 매트릭스를 도시한 도면이다.
도 22A 내지 도 22F는 로지스틱 회귀 분석(A)에 대해, 교차 검증 기법(B)으로, 20% 홀드 아웃(hold out) 기법(C)으로 PCS 와 ACS 그룹의 구별 시 5종의 miRNA(miR-320c-1, miR-133a-5p, miR-769-5p, let-7a-3p, miR-1307-3p)의 패널에 대한 수용부 조작자 특징을 도시한 도면이다. 기존의 임상 도구에 비해, 예컨대 아동 SCAT3(D), 부모 SCAT3(E), 및 소아 PCS 임상적 위험 스코어(F)는 훨씬 더 낮은 AUC를 가진다.
도 23A 내지 도 23H는 TBI 후 타액-CSF에서 miRNA 중복을 도시한 도면이다.
도 24A, 도 24B는 miRNA를 이용하는 로지스틱 회귀 분석(민감도: 75%; 특이성: 93%; 10배 CV: 0.87)을 도시한 도면이다.
도 25는 miRNA; 청색(상부): miRNA AUS = 0.898; 아동 SCAT3 AUC = 0.649를 이용하는 로지스틱 회귀 분석을 도시한 도면이다.
도 26은 miRNA; 청색(좌측 첫 번째): miRNA AUIS = 0.898; 적색(좌측 두 번째) 아동 SCAT3 AUS = 0.649; 녹색(좌측 세 번째) 부모 SCAT3 = 0.562를 이용하는 로지스틱 회귀 분석을 도시한 도면이다.
도 27A, 도 27B는 4주에 특정 증상과 관련된 miR-320c를 도시한 도면이다.
도 28은 변형된 임상 예측 도구를 이용하는 회귀 분석(Regression Analysis Using Modified Clinical Prediction Tool)을 도시한 도면이다(Zemek et al. 2016).
도 29a, 도 29b는 PCS 상태를 예측하기 위해 해당 miRNA의 서브세트를 이용하는 로지스틱 회귀 모델을 도시한 도면이다.
도 30은 고신뢰도 mRNA 표적에 대한 단백질 상호작용 네트워크를 도시한 도면이다. 이 네트워크는 String v10 소프트웨어에서 정보를 얻은 관심대상의 6종의 miRNA에 의해 표적화된 280개의 mRNA를 포함한다. 280개의 mRNA 중에서, 247개는 0.775의 클러스터링 계수치를 나타내고 우연히 단독으로 예상되는 상호작용의 수를 초과하는, 기능성 상호작용을 갖는 단백질 생성물을 가진다(p<0.0001). 적색의 mRNA는 신경계 발생과 기능적으로 관련된 것을 나타낸다(61개의 유전자; p=8.56E-09). 큰 결절은 3차원 구조로 알려져 있는 반면, 작은 결절 구조는 알려져 있지 않다. 에지폭은 상호작용의 의미를 정하는데, 두꺼운 에지는 실험적으로 결정된 공동 발현 또는 상동성을 나타낸다.
도 31은 아동 SCAT-3 스코어를 이용하는 비교(하회(under-performing)) 로지스틱 회귀 모델을 도시한 도면이다.
도 32는 수집물 1에서 24개의 샘플 및 수집물 2에서 48개의 샘플의 분석으로부터의 중복 miRNA의 벤다이어그램을 도시한 도면이다.
도 33은 2회/일(8 am, 8 pm)의 빈도로 3일의 샘플링(제1일, 제3일, 제7일)에 걸쳐 4명의 대상체로부터의 24개 샘플에서 수집 시간에 따라 변화된 19종의 miRNA에 대한 발현 데이터의 히트맵 클러스터링을 도시한 도면이다.
도 34는 4회/일(8 am, 12 pm, 4 pm, 8 pm)의 빈도로 4일의 샘플링(제1일, 제5일, 제10일, 제15일)에 걸쳐 3명의 대상체로부터의 48개 샘플에서 수집 시간에 따라 변화된 19종의 miRNA에 대한 발현 데이터의 히트맵 클러스터링을 도시한 도면이다.
도 35는 수집물 3(다양한 시점에 수집)에서 대상체 중 3명에 대해 나타난 상위 19종의 miRNA 중 1개에 대한 정규화된 데이터를 도시한 도면이다. 상부(검정색) 선: R2 = 0.8386; 중간(녹색/그레이스케일) 선: R2 = 0.9291; 하부(청색/그레이스케일): R2 = 0.949.
도 36은 하루주기리듬 신호전달(Circadian Rhythm Signaling)에 연루된 45개의 유전자가 circaMiR 중 14개의 표적으로서 동정되었다는 것을 도시한 도면이다. 이는 IPA에서 일주기 기능에 연루된 139개의 전체 주석달린 유전자의 거의 1/3이다. 도면에서, 1종의 miRNA에 의해 표적화된 유전자는 강조되어 있고 회색인 반면, 14종의 miRNA 중 1종 초과에 의해 표적화된 유전자는 강조되어 있고 적색이다. 비표적화된 유전자는 백색으로 나타난다.
도 37은 혈청 및 타액에서 시간, 유체 및 상호작용 효과에 기인하는 존재비의 변화를 갖는 miRNA를 도시한 도면이다.
도 38a 내지 도 38b는 비특이적 운동- 또는 사건-관련 시점(녹색/회색스케일 음영 영역)을 초과하는 타액 샘플(a-상부)에서 시합 후 1시간 시점(청색/회색 스케일 음영 영역)에 급속 시간적 효과(모두 증가)를 갖는 12종의 miRNA가 동정되었다는 것을 나타낸다. 대부분의 miRNA는 시합 후 2 내지 3일까지 기준 근처로 복귀된다는 것을 주목한다. 동일한 miRNA에 대한 패턴은 혈청(b-하부)와 별개로 상이하였다(몇몇은 변하지 않았고, 몇몇은 감소가 지연되었다).
도 39a 내지 도 39b는 비특이적 운동 또는 사건-관련 시점(녹색/회색스케일 음영 영역)을 초과하는 시합 후 1주(a-상부, 청색/회색스케일 음영 영역)에 혈청 중에서 우세하게 지연된 증가(실선) 및 감소(파선)로 동정된 miRNA를 도시한 도면이다. 이들 miRNA는 변화되지 않거나 타액 중의 비특이적 증가에 대한 일부 증거를 나타내었다는 것을 주목한다(b-하부).
도 40a 내지 도 40b는 KEGG 글루탐산성 시냅스 경로에서 표적 유전자에 대해 변화된 miRNA의 농축도를 도시한 도면이다. 도 10과 동일한 관례. 타액(a) miRNA와 혈청(b) miRNA는 둘 다 이 경로에서 다수의 동일한 유전자를 표적화한다는 것을 주목한다.
도 41a 내지 도 41b는 타액(장기 억압, a), 및 혈청(장기 증강, b)으로부터의 학습 및 기억에 수반된 경로에서 시간적으로-조절된 miRNA의 농축도를 도시한 도면이다. 도 10과 동일한 관례.
도 42는 급성 타액 반응 miRNA와 상관관계가 있는 기능성 측정을 도시한 도면이다. 실선은 인지 측정을 나타낸다(더 높은 값은 더 양호한 수행을 나타낸다). 파선은 정규화된 신체 동요 측정을 나타낸다(더 높은 값은 더 불량한 수행을 나타낸다).
도 43은 지연된 혈청 반응 miRNA와 상관관계가 있는 기능성 측정을 도시한 도면이다. 실선은 후속적으로 시합 후 2 내지 3일에 증가된 동요를 나타낸 분명한 학습 효과(HTH가 없는 대조군 및 시합 후 1시간 시점에서 감소된 동요)를 갖는 균형 측정(TSEO)을 나타낸다. 파선은 지연된 효과(TMB_Dual_Bal) 또는 급속 + 지연된 효과(DSB_Bal)를 갖는 2종의 균형 측정을 나타낸다.
도 44는 시합 전에 비해 시합 후에 혈청 및 타액에서 miRNA 발현 변화에 대한 TBI 가능성의 효과를 도시한 도면이다. 총 925종의 miRNA를 시험하였고, 21개는 TBI 가능성의 상당한 주된 효과를 나타내며, 이 중 둘은 또한 유체의 상당한 주된 효과를 나타내었고, 둘은 상당한 유체 x TBI 상호작용을 나타내었다.
본 명세서에 기재된 것과 유사한 또는 동일한 모든 방법 및 물질은 본 발명의 실행에서 사용될 수 있으며, 적합한 방법 및 물질은 본 명세서에 기재되어 있다. 본 명세서에 기재된 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시적이며, 달리 구체화되지 않는 한, 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
타액은 물, 뮤신, 단백질, 염 및 종종 침샘에 의해 입 안으로 분비되고 삼킨 음식을 윤활화하고, 종종 전분의 분해를 시작하는 전분-분해 효소(프티알린으로서)의 약간 알칼리성의 분비물이다. 타액은 턱밑샘, 귀밑샘 및/또는 혀밑샘에 의해 방출되고, 타액 방출은 교감신경계 및/또는 부교감신경계 활성에 의해 자극될 수 있다. 교감 또는 부교감성 유도에 의해 주로 방출되는 타액은 마이크로RNA를 단리시키기 위해 사용될 수 있다.
타액은 객담, 구강 면봉 채취, 수동적 침흘림에 의해, 또는 당업계에 공지된 다른 방법에 의해 수집될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이는 침샘으로부터 회수될 수 있다. 일부 실시형태에서, 타액 샘플은, 예를 들어, 원심분리 또는 여과에 의해 추가로 정제될 수 있다. 예를 들어, 이는 0.22 마이크론 또는 0.45 마이크론 막을 통해 여과될 수 있고, 그 사이의 모든 막 크기 및 분리된 성분은 마이크로RNA를 회수하기 위해 사용된다. 다른 실시형태에서, 마이크로RNA를 분해시키는 단백질 또는 효소는 타액 샘플에서 제거되거나, 비활성화되거나 중화될 수 있다.
일부 대표적인, 그러나, 제한되지 않는 타액 수집물 및 miRNA 정제 절차는, 예를 들어, TRI 시약 LS, TriZol 정제 방법 또는 유사한 방법을 이용하는 오라젠(Oragene) RNA 정제 프로토콜에 따라 타액 RNA를 정제하는 것을 포함한다. 오라겐 정제 프로토콜은 일반적으로 다중 부분을 포함한다. 제1 부분에서, 샘플은 격렬하게 8초 이상 동안 진탕시키고, 샘플은 수욕에서 50℃에서 1시간 동안 또는 에어 인큐베이터에서 2시간 동안 본래의 바이알 내에서 인큐베이션시킨다. 제2 부분에서, 타액의 250 내지 500㎕의 분취액은 마이크로원심분리관에 옮기고, 마이크로원심분리관은 90℃에서 15분 동안 인큐베이션시킨 다음, 실온으로 냉각시키고, 마이크로원심분리관은 10분 동안 얼음 상에서 인큐베이션시키고 나서, 타액 샘플은 3분 동안 최대 속도(13,000×g 초과)로 원심분리시키고, 맑은 상청액은 신선한 마이크로원심분리관에 옮기고 침전물은 폐기하고 나서, 차가운 95%의 EtOH 중 2용적을 맑은 상청액에 첨가하고 혼합한 후에, 상청액 혼합물을 -20℃에서 30분 동안 인큐베이션시키고, 마이크로원심분리관을 최대 속도로 원심분리시키고 나서, 침전물을 수집하는 한편, 상청액을 폐기하고, 침전물을 350㎕의 완충제 RLT 중에 용해시키고, 350㎕의 70% EtOH를 용해된 펠릿 혼합물에 첨가하고 나서, 교반에 의해 혼합하였다. 처음 2개의 부분 다음에 퀴아젠(Qiagen) RNeasy 세정 절차가 이어질 수 있다.
정제 공정은, 예를 들어, 퀴아젠에 의한 RNeasy 미니 스핀 칼럼을 이용하여 타액 샘플을 정제하는 단계의 제2 정제 단계를 추가로 포함할 수 있다. 생물학적 샘플의 정제는 임의의 적합한 순서로 임의의 적합한 수의 단계들을 포함할 수 있다. 정제 공정은 또한 대상체로부터 수집된 생물학적 샘플 유형에 기반하여 다를 수 있다. 정제된 생물학적 샘플의 수율 및 품질은, 예를 들어, RNA의 수율 및 품질이 사전결정된 역치 초과인지의 여부를 결정하기 위해 애질런트 바이오애널라이저와 같은 장치를 통해 평가될 수 있다.
마이크로RNA 또는 miRNA는 RNA 침묵 및 유전자의 전사후 조절에서 작용하는 식물, 동물 및 일부 바이러스에서 발견되는 약 22개의 뉴클레오타이드를 함유하는 작은 비-암호화 RNA 분자이다(문헌[Ambros et al., 2004; Bartel et al., 2004]). 마이크로RNA는 CLOCK, BMAL1, 및 다른 일주기 유전자를 포함하는 대다수의 인간 유전자의 발현에 영향을 미친다. 특히, miRNA는 모든 세포외 유체에서 신체 전체적으로 그들을 만들고 순환시키는 세포에 의해 방출되는데, 그들은 다른 조직 및 세포와 상호작용한다. 최근의 증거는 인간 miRNA는 심지어 장내세균으로 지칭되는 하부 위장관에 살고 있는 박테리아 세포 집단과 상호작용한다는 것을 나타내었다. 게다가, 장내세균의 일주기 변화가 최근에 확립되었다. 작은 비암호화 RNA(miRNA)는 단백질 발현을 억제하며 암, 당뇨병, 신경발달 및 신경퇴행성 장애에서 유용한 바이오마커로서 나타났다. miRNA는 신체의 모든 조직 및 기관에서 만들어지지만, 그들 중 다수는 조직-특이성을 나타낸다. 게다가, miRNA는 그들을 합성하거나 세포외 공간(extracellular space: EC)으로 방출하고 다른 세포에 영향을 미치는 생체유체에서 이동하는 세포 내에서 작용할 수 있다. 수많은 연구는 miRNA 발현 프로파일이 건강한 상태와 질환 상태 간에 다르다는 것과 조직 손상 후에 miRNA의 EC로의 방출이 상승하는 것으로 나타난다는 것을 나타내었다. 후생적 데이터는 miRNA에 관한 데이터를 포함한다. 본 발명자들의 목적 중에 miRNA의 말초 측정, 가능한 mTBI 중증도의 객관적 평가, 및 균형과 인지 기능의 민감 지표 사이의 관계를 확립한다.
miRNA 표준 명명 시스템은 접두사 "miR" 다음에 대시(dash) 및 숫자를 사용하며, 후자는 종종 명명 순서를 나타낸다. 예를 들어, miR-120을 명명하였고, 이는 miR-241 전에 발견되었을 가능성이 있다. 대문자 "miR-"은 miRNA의 성숙 형태를 지칭하는 한편, 대문자가 아닌 "mir-"은 프레(pre)-miRNA 및 프리(pri)-miRNA를 지칭하고, "MIR"은 그들을 암호화하는 유전자를 지칭한다. 접두사 "hsa-"는 인간 miRNA를 의미한다.
miRNA의 서열은 공지되어 있으며, MirBase, 하이퍼 텍스트 전송 규약(Hyper Text Transfer Protocol: HTTP)://WorldWideWeb.mirbase.org/blog/2018/03/mirbase-22-release/(2018년 3월 19일자로 마지막으로 액세스됨, 참고로 편입됨) 및/또는 하이퍼 텍스트 전송 규약(HTTP)://WorldWideWeb.mirbase.org/index.shtml(2018년 3월 19일자로 마지막으로 액세스됨, 참고로 편입됨)을 참고로 하여 얻을 수 있다.
miRNA 요소. 엑소좀 및 다른 미세소수포 및 친유성 담체를 통한 miRNA의 세포외 수송은 근처의 그리고 원거리의 세포에서 유전자 발현을 변경시키기 위한 세포에 대한 확립된 후생적 메커니즘이다. 미세소수포 및 담체는 세포외 공간으로 밀려 나가는데, 여기서 그들은 세포에 도킹하고 세포에 유입되며, mRNA의 단백질로의 번역을 차단한다(Hu et al., 2012). 추가로, 미세소수포 및 담체는 다양한 체액, 예컨대 혈액 및 타액에 존재하여(Gallo et al., 2012), 본 발명자들이 단순히 타액을 수집함으로써 중추 신경계(CNS)로부터 유래될 수 있는 후생적 물질을 측정하는 것을 가능하게 한다. 사실, 본 발명자들은 타액에서 다수의 다수의 검출된 miRNA가 혀 및 침샘에 분포하는 감각 신경 구심성 말단 및 운동 신경 원심성 말단을 통해 구강 내로 분비되고 이에 의해 개체의 CNS에서 이상조절될 수 있는 miRNA를 분석하기 위해 상대적으로 직접적인 창을 제공하는 것으로 여긴다. 따라서, 타액 중의 세포외 miRNA 정량화는 질환 또는 장애 또는 손상이 있는 아동에서 뇌-관련 바이오마커 동정을 위한 매력적이고 최소-침습적인 기법을 제공한다. 게다가, 본 방법은 이전에 사용된 사후 뇌 조직 또는 말초 백혈구의 분석과 관련된 다수의 제한(발현 변화, 통증있는 채혈의 적절성)을 최소화한다.
생물학적 샘플, 예컨대 타액으로부터의 miRNA 단리 및 그들의 분석은 문헌[Yoshizawa, et al., Salivary MicroRNAs and Oral Cancer Detection, Methods Mol. Biol., 2013; 936: 313-324]에 의해 기재된 방법을 포함하는 당업계에 공지된 방법에 의해 또는 상업적으로 입수 가능한 키트, 예컨대 mirVana(상표명) miRNA 단리 키트를 이용함으로써 수행될 수 있다.
수면-기상 주기 동안에, 수많은 분자, 세포 및 생리적 변화가 일어난다. 이들 변화 중 다수는 일주기 조절 유전자, 예컨대 CLOCK 및 BMAL1로서 지칭되는 것에 의해 유도된다. 이들은, 결국, 생리적으로 적절한 유전자, 단백질 및 호르몬 발현에서의 수많은 변화를 야기한다. 명암 주기 외에, 일주기 유전자의 발현에 영향을 미치는 인자는 완전히 이해되지 않는다. 종합하면, 본 발명자들의 데이터는 타액 miRNA와 미생물 함량 사이의 이전에 알려지지 않은 관계뿐만 아니라 miRNA(및/또는 미생물) 그 자체에 대한 시간적 영향(즉, 시간적 변화)을 뒷받침한다. 시간적 변화를 경험하는 후생적 데이터(서열분석 데이터 또는 다른 데이터)를 정규화하는 본 명세서에 기재된 시스템 및 방법은 임의의 적합한 적용에서 사용될 수 있으며, 여기서 시간적 변화는 데이터에 영향을 미칠 수 있다.
본 발명의 하나의 양상은 대상체가 프로브 세트의 2 이상의 miRNA 프로브를 포함하는 질환, 장애 또는 병태를 갖는지의 여부를 결정하는데 적합한 키트이다. 각각의 miRNA 프로브는 본 명세서에 기재된 특정 miRNA에 대응하는 리보핵산 서열을 포함할 수 있다. 실행에서, 상기 키트는 2 이상의 miRNA 프로브에 부착된 고체 지지체를 추가로 포함할 수 있다. 실행에서, 키트는 다음 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다: (a) 음성 대조군으로서 사용되기에 적합한 하나의 무작위로 생성된 miRNA 서열; (b) 총 RNA 분해에 대한 표준화된 대조군으로서 사용되는 하우스키핑 유전자로부터 유래된 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 서열; 또는 (c) 양성 대조군으로서 사용되는 하나 이상의 무작위로 생성된 서열. 대안적으로, 프로브 세트는 본 명세서에 기재된 특정 미생물로부터의 DNA 서열에 대응하는 리보뉴클레오타이드 서열을 갖는 miRNA 프로브를 포함할 수 있다.
단독으로 또는 이들의 조합으로 바람직한 실시형태의 다음의 상세한 설명과 함께 더 명확하게 될 본 발명의 이들 및 다른 목적은 상기 방법, 시스템, 키트에 의해 충족되고 본 발명자들에 의해 제공되었다.
본 발명자들의 한 가지 목적은 아동 TBI 후에 타액 miRNA 및 뇌척수액(CSF) miRNA의 변화를 비교하고 소아 뇌진탕의 정확한 그리고 생리적으로 적절한 마커로서 miRNA의 순환 농도 효용을 연구하기 위한 것이다.
본 발명자들의 다른 목적은 miRNA의 말초 측정, 가능한 mTBI 중증도의 객관적 평가, 및 균형과 인지 기능의 민감 지표 사이의 관계를 확립하는 것이다.
본 발명자들의 다른 목적은 최근의 경증의 두부 외상에 노출된 성인 대상체에서 균형 및 인지 기능의 객관적 측정으로 혈액 및 타액 중의 miRNA의 말초 측정 간의 관계를 결정하는 것; 임의의 동정된 miRNA가 뇌 기능 및 손상 반응에 적절한 특정 생물학적 경로에 연루되는지의 여부를 시험하는 것; 및 miRNA와 기능성 측정 사이의 관계 강도를 정량화하고 그들의 잠재적 진단 효용을 결정하는 것이었다.
본 발명자들의 한 가지 목적은 하기 단계들을 포함하는, 외상성 뇌 손상(TBI)이 의심되는 대상체에 대한 후생적 데이터를 한 명 이상의 건강한 대조군 대상체 또는 건강한 대조군 대상체의 개요에 비교하는 방법을 제공하는 것이되, 각각의 건강한 대조군 대상체는 TBI 또는 TBI 증상이 지속되지 않는 것으로 알려져 있다:
대상체로부터 취한 생물학적 샘플에서 하나 이상의 마이크로RNA(miRNA)의 계수치를 결정하는 단계;
샘플간 계수치 변화를 설명하기 위해 대상체의 후생적 데이터를 정규화하는 단계로서, 계수치 정규화는 하나 이상의 비변이체 miRNA를 사용하는 단계;
생물학적 샘플을 취하는 일자의 시각(time of day)을 결정하는 단계;
시각을 이용함으로써 계수치 정규화된 miRNA에 시각 정규화를 적용하여 시각에 대해 대상체의 miRNA 발현 수준을 추가로 정규화시키는 단계; 및
하나 이상의 miRNA의 계수치 및 시각 정규화된 발현 수준을 하나 이상의 건강한 대조군-대상체 또는 건강한 대조군 대상체의 개요로부터의 하나 이상의 대조군 miRNA의 계수치 및 시각 정규화된 발현 수준과 비교하는 단계로서, 하나 이상의 건강한 대조군-대상체 또는 건강한 대조군-대상체의 개요로부터의 동일한 하나 이상의 miRNA에 비교되는 대상체의 miRNA 중 하나 이상의 발현 수준의 증가 또는 감소는 대상체가 TBI를 지속시킬 수 있다는 것을 나타내는, 상기 비교하는 단계.
본 발명자들의 다른 목적은 하기 단계들을 포함하는, 외상성 뇌 손상(TBI)이 의심되는 대상체에 대한 후생적 데이터를 한 명 이상의 건강한 대조군 대상체 또는 건강한 대조군 대상체의 개요에 비교하는 방법을 제공하는 것이되, 각각의 건강한 대조군 대상체는 TBI 또는 TBI 증상이 지속되지 않는 것으로 알려져 있다:
대상체로부터 취한 생물학적 샘플에서 하나 이상의 마이크로RNA(miRNA)의 계수치를 결정하는 단계;
샘플간 계수치 변화를 설명하기 위해 대상체의 후생적 데이터를 정규화하는 단계로서, 계수치 정규화는 하나 이상의 비변이체 miRNA를 사용하는 단계;
생물학적 샘플을 취하는 일자의 시각을 결정하는 단계;
시각을 이용함으로써 계수치 정규화된 miRNA에 시각 정규화를 적용하여 시각에 대해 대상체의 miRNA 발현 수준을 추가로 정규화시키는 단계; 및
대상체의 miRNA 중 하나 이상의 계수치 및 시각 정규화된 발현 수준을 하나 이상의 건강한 대조군-대상체 또는 건강한 대조군 대상체의 개요로부터의 동일한 하나 이상의 miRNA의 계수치 및 시각 정규화된 발현 수준과 비교하는 단계로서, 하나 이상의 건강한 대조군-대상체 또는 건강한 대조군-대상체의 개요로부터의 동일한 하나 이상의 miRNA에 대한 대상체의 miRNA 중 하나 이상의 발현 수준의 증가 또는 감소는 대상체가 경험 중이거나 경험할 가능성이 있는 증상을 나타내는, 상기 비교하는 단계.
다른 목적은 하기 단계들을 포함하는, 외상성 뇌 손상(TBI)이 의심되는 대상체에 대한 후생적 데이터를 한 명 이상의 건강한 대조군 대상체 또는 건강한 대조군 대상체의 개요에 비교하는 방법을 제공하는 것이되, 각각의 건강한 대조군 대상체는 TBI 또는 TBI 증상이 지속되지 않는 것으로 알려져 있다:
대상체로부터 취한 생물학적 샘플에서 하나 이상의 마이크로RNA(miRNA)의 계수치를 결정하는 단계;
샘플간 계수치 변화를 설명하기 위해 대상체의 후생적 데이터를 정규화하는 단계로서, 계수치 정규화는 하나 이상의 비변이체 miRNA를 사용하는 단계;
생물학적 샘플을 취하는 일자의 시각을 결정하는 단계;
시각을 이용함으로써 계수치 정규화된 miRNA에 시각 정규화를 적용하여 시각에 대해 대상체의 miRNA 발현 수준을 추가로 정규화시키는 단계; 및
대상체의 miRNA 중 하나 이상의 계수치 및 시각 정규화된 발현 수준을 한 명 이상의 건강한 대조군-대상체 또는 건강한 대조군-대상체의 개요로부터의 동일한 하나 이상의 miRNA의 계수치 및 시각 정규화된 발현 수준에 비교하는 단계로서, 한 명 이상의 건강한 대조군-대상체 또는 건강한 대조군-대상체의 개요로부터의 동일한 하나 이상의 miRNA에 비교되는 대상체의 miRNA 중 하나 이상의 발현 수준의 양성 또는 음성 차이는 TBI의 중증도를 나타내고 경험 중인 또는 경험할 가능성이 있는 대상체의 증상의 잠재적 지속기간을 나타내는, 상기 비교하는 단계.
일 실시형태에서, miRNA는 hsa-let-7f-5p, hsa-let-7i, hsa-miR-10a-5p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-23a-3p, hsa-mir-23b, hsa-mir-25, hsa-miR-25-3p, hsa-mir-26a-1, hsa-mir-26a-2, hsa-miR-26a-5p, hsa-mir-26b, hsa-miR-26b-5p, hsa-mir-28, hsa-miR-28-3p, hsa-miR-28-5p, hsa-miR-29c-3p, hsa-mir-30b, hsa-miR-30e-3p, hsa-miR-30e-5p, hsa-mir-92a-1, hsa-mir-92a-2, hsa-mir-103a-1, hsa-mir-103a-2, hsa-miR-125b-1-3p, hsa-miR-125b-2-3p, hsa-miR-141-3p, hsa-miR-148b-3p, hsa-mir-151a, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-151a-5p, hsa-miR-155-5p, hsa-mir-181a-2, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-182-5p, hsa-miR-193a-3p, hsa-miR-203a-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-mir-218-2, hsa-miR-221-3p, hsa-miR-320c, hsa-miR-338-3p, hsa-miR-338-5p, hsa-miR-342-5p, hsa-miR-374a-5p, hsa-miR-378d, hsa-miR-378f, hsa-miR-378g, hsa-miR-378i, hsa-miR-454-3p, hsa-miR-501-3p, hsa-miR-532-5p, hsa-miR-577, hsa-miR-625-3p, hsa-miR-744-5p, hsa-miR-944, hsa-miR-1273g-5p, hsa-miR-1285-3p, hsa-miR-1303, hsa-miR-1307-3p, hsa-miR-3074-5p, hsa-mir-3160-1, hsa-mir-3613, hsa-miR-3613-5p, hsa-miR-3916, hsa-mir-4532, hsa-mir-5091, hsa-miR-6770-5p 및 상기 열거된 miRNA와 종자 서열(seed sequence)을 공유하는 해당 miRNA로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명자들의 다른 목적은
적어도 2개의 생물학적 샘플의 각각에서 하나 이상의 miRNA의 계수치 및 시각 정규화된 발현 수준을 결정하기 위해 상이한 시점에 취한 동일한 대상체로부터의 적어도 2개의 생물학적 샘플을 분석하는 단계; 및
하나 이상의 특이적 miRNA의 대상체의 계수치 및 시각 정규화된 발현 수준이 시간에 따라 변화하는지의 여부를 결정하기 위해 시간에 따른 하나 이상의 miRNA의 결정 수준을 비교하는 단계
를 포함하는, 대상체에서의 손상, 장애 또는 질환 상태의 진행을 모니터링하는 방법을 제공하는 것이되,
시간에 따른 하나 이상의 miRNA의 계수치 및 시각 정규화된 발현 수준의 증가 또는 감소는 대상체에서 TBI의 진행을 나타내고/내거나, 시간에 따른 하나 이상의 miRNA의 계수치 및 시각 정규화된 발현 수준의 양성 또는 음성 차이는 대상체에서 TBI의 진행을 나타낸다.
일 실시형태에서, 시각 정규화에 대한 miRNA 대상은 hsa-let-7f-5p, hsa-let-7i, hsa-miR-10a-5p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-23a-3p, hsa-mir-23b, hsa-mir-25, hsa-miR-25-3p, hsa-mir-26a-1, hsa-mir-26a-2, hsa-miR-26a-5p, hsa-mir-26b, hsa-miR-26b-5p, hsa-mir-28, hsa-miR-28-3p, hsa-miR-28-5p, hsa-miR-29c-3p, hsa-mir-30b, hsa-miR-30e-3p, hsa-miR-30e-5p, hsa-mir-92a-1, hsa-mir-92a-2, hsa-mir-103a-1, hsa-mir-103a-2, hsa-miR-125b-1-3p, hsa-miR-125b-2-3p, hsa-miR-141-3p, hsa-miR-148b-3p, hsa-mir-151a, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-151a-5p, hsa-miR-155-5p, hsa-mir-181a-2, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-182-5p, hsa-miR-193a-3p, hsa-miR-203a-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-mir-218-2, hsa-miR-221-3p, hsa-miR-320c, hsa-miR-338-3p, hsa-miR-338-5p, hsa-miR-342-5p, hsa-miR-374a-5p, hsa-miR-378d, hsa-miR-378f, hsa-miR-378g, hsa-miR-378i, hsa-miR-454-3p, hsa-miR-501-3p, hsa-miR-532-5p, hsa-miR-577, hsa-miR-625-3p, hsa-miR-744-5p, hsa-miR-944, hsa-miR-1273g-5p, hsa-miR-1285-3p, hsa-miR-1303, hsa-miR-1307-3p, hsa-miR-3074-5p, hsa-mir-3160-1, hsa-mir-3613, hsa-miR-3613-5p, hsa-miR-3916, hsa-mir-4532, hsa-mir-5091, hsa-miR-6770-5p 및 상기 열거된 miRNA와 종자 서열을 공유하는 해당 miRNA로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 실시형태에서, 시각 정규화에 대한 miRNA 대상은 hsa-let-7f-5p, hsa-let-7i, hsa-miR-10a-5p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-23a-3p, hsa-mir-23b, hsa-mir-25, hsa-miR-25-3p, hsa-mir-26a-1, hsa-mir-26a-2, hsa-miR-26a-5p, hsa-mir-26b, hsa-miR-26b-5p, hsa-mir-28, hsa-miR-28-3p, hsa-miR-28-5p, hsa-miR-29c-3p, hsa-mir-30b, hsa-miR-30e-3p, hsa-miR-30e-5p, hsa-mir-92a-1, hsa-mir-92a-2, hsa-mir-103a-1, hsa-mir-103a-2, hsa-miR-125b-1-3p, hsa-miR-125b-2-3p, hsa-miR-141-3p, hsa-miR-148b-3p, hsa-mir-151a, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-151a-5p, hsa-miR-155-5p, hsa-mir-181a-2, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-182-5p, hsa-miR-193a-3p, hsa-miR-203a-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-mir-218-2, hsa-miR-221-3p, hsa-miR-320c, hsa-miR-338-3p, hsa-miR-338-5p, hsa-miR-342-5p, hsa-miR-374a-5p, hsa-miR-378d, hsa-miR-378f, hsa-miR-378g, hsa-miR-378i, hsa-miR-454-3p, hsa-miR-501-3p, hsa-miR-532-5p, hsa-miR-577, hsa-miR-625-3p, hsa-miR-744-5p, hsa-miR-944, hsa-miR-1273g-5p, hsa-miR-1285-3p, hsa-miR-1303, hsa-miR-1307-3p, hsa-miR-3074-5p, hsa-mir-3160-1, hsa-mir-3613, hsa-miR-3613-5p, hsa-miR-3916, hsa-mir-4532, hsa-mir-5091, hsa-miR-6770-5p 및 상기 열거된 miRNA와 종자 서열을 공유하는 해당 miRNA로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명자들의 다른 목적은 하기 단계들을 포함하는, 생물학적 샘플에서 miRNA 서열 또는 복수의 miRNA 서열을 검출하는 방법을 제공하는 것이다:
대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
hsa-let-7f-5p, hsa-let-7i, hsa-miR-10a-5p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-23a-3p, hsa-mir-23b, hsa-mir-25, hsa-miR-25-3p, hsa-mir-26a-1, hsa-mir-26a-2, hsa-miR-26a-5p, hsa-mir-26b, hsa-miR-26b-5p, hsa-mir-28, hsa-miR-28-3p, hsa-miR-28-5p, hsa-miR-29c-3p, hsa-mir-30b, hsa-miR-30e-3p, hsa-miR-30e-5p, hsa-mir-92a-1, hsa-mir-92a-2, hsa-mir-103a-1, hsa-mir-103a-2, hsa-miR-125b-1-3p, hsa-miR-125b-2-3p, hsa-miR-141-3p, hsa-miR-148b-3p, hsa-mir-151a, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-151a-5p, hsa-miR-155-5p, hsa-mir-181a-2, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-182-5p, hsa-miR-193a-3p, hsa-miR-203a-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-mir-218-2, hsa-miR-221-3p, hsa-miR-320c, hsa-miR-338-3p, hsa-miR-338-5p, hsa-miR-342-5p, hsa-miR-374a-5p, hsa-miR-378d, hsa-miR-378f, hsa-miR-378g, hsa-miR-378i, hsa-miR-454-3p, hsa-miR-501-3p, hsa-miR-532-5p, hsa-miR-577, hsa-miR-625-3p, hsa-miR-744-5p, hsa-miR-944, hsa-miR-1273g-5p, hsa-miR-1285-3p, hsa-miR-1303, hsa-miR-1307-3p, hsa-miR-3074-5p, hsa-mir-3160-1, hsa-mir-3613, hsa-miR-3613-5p, hsa-miR-3916, hsa-mir-4532, hsa-mir-5091, hsa-miR-6770-5p 및 생물학적 샘플에서 발견되는 상기 열거된 miRNA와 종자 서열을 공유하는 해당 miRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 miRNA 서열의 각각에 대해 이중-가닥, 상보성 DNA 서열(cDNA)을 생성하는 단계; 및
노던 블롯, 실시간 PCR 또는 차세대 서열분석 및 cDNA의 존재, 부재 또는 상대적 양으로 cDNA를 검출하는 단계로서, cDNA의 존재, 부재 또는 상대적 양은 상보성 miRNA 서열의 존재, 부재 또는 상대적 양을 나타내는, 상기 검출하는 단계.
일 실시형태에서, 생물학적 샘플은 첫 번째 시점에 취한 제1 생물학적 샘플이고, cDNA는 제1 cDNA이며, 상기 방법은
두 번째 시점에 상기 대상체로부터 제2 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
hsa-let-7f-5p, hsa-let-7i, hsa-miR-10a-5p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-23a-3p, hsa-mir-23b, hsa-mir-25, hsa-miR-25-3p, hsa-mir-26a-1, hsa-mir-26a-2, hsa-miR-26a-5p, hsa-mir-26b, hsa-miR-26b-5p, hsa-mir-28, hsa-miR-28-3p, hsa-miR-28-5p, hsa-miR-29c-3p, hsa-mir-30b, hsa-miR-30e-3p, hsa-miR-30e-5p, hsa-mir-92a-1, hsa-mir-92a-2, hsa-mir-103a-1, hsa-mir-103a-2, hsa-miR-125b-1-3p, hsa-miR-125b-2-3p, hsa-miR-141-3p, hsa-miR-148b-3p, hsa-mir-151a, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-151a-5p, hsa-miR-155-5p, hsa-mir-181a-2, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-182-5p, hsa-miR-193a-3p, hsa-miR-203a-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-mir-218-2, hsa-miR-221-3p, hsa-miR-320c, hsa-miR-338-3p, hsa-miR-338-5p, hsa-miR-342-5p, hsa-miR-374a-5p, hsa-miR-378d, hsa-miR-378f, hsa-miR-378g, hsa-miR-378i, hsa-miR-454-3p, hsa-miR-501-3p, hsa-miR-532-5p, hsa-miR-577, hsa-miR-625-3p, hsa-miR-744-5p, hsa-miR-944, hsa-miR-1273g-5p, hsa-miR-1285-3p, hsa-miR-1303, hsa-miR-1307-3p, hsa-miR-3074-5p, hsa-mir-3160-1, hsa-mir-3613, hsa-miR-3613-5p, hsa-miR-3916, hsa-mir-4532, hsa-mir-5091, hsa-miR-6770-5p 및 제2 생물학적 샘플에서 발견되는 상기 열거된 miRNA와 종자 서열을 공유하는 해당 miRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 miRNA 서열의 각각에 대해 제2 cDNA를 생성하는 단계; 및
노던 블롯, 실시간 PCR, 또는 차세대 서열분석, 및 제2 cDNA의 존재, 부재 또는 상대적 양으로 제2 cDNA를 검출하는 단계로서,
상기 두 번째 시점으로부터의 상기 생물학적 샘플에서 제2 cDNA의 존재, 부재 또는 상대적 양은 두 번째 시점에 상보성 miRNA 서열의 존재, 부재 또는 상대적 양을 나타내는, 상기 검출하는 단계; 및 임의적으로 첫 번째 시점으로부터의 결과를 두 번째 시점으로부터의 결과에 비교함으로써 TBI의 진행을 추적하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명자들의 목적은 또한 하기를 포함하는, 대상체가 외상성 뇌 손상을 갖는지의 여부를 결정하기 위한 키트를 제공하는 것이다:
hsa-let-7f-5p, hsa-let-7i, hsa-miR-10a-5p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-23a-3p, hsa-mir-23b, hsa-mir-25, hsa-miR-25-3p, hsa-mir-26a-1, hsa-mir-26a-2, hsa-miR-26a-5p, hsa-mir-26b, hsa-miR-26b-5p, hsa-mir-28, hsa-miR-28-3p, hsa-miR-28-5p, hsa-miR-29c-3p, hsa-mir-30b, hsa-miR-30e-3p, hsa-miR-30e-5p, hsa-mir-92a-1, hsa-mir-92a-2, hsa-mir-103a-1, hsa-mir-103a-2, hsa-miR-125b-1-3p, hsa-miR-125b-2-3p, hsa-miR-141-3p, hsa-miR-148b-3p, hsa-mir-151a, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-151a-5p, hsa-miR-155-5p, hsa-mir-181a-2, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-182-5p, hsa-miR-193a-3p, hsa-miR-203a-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-mir-218-2, hsa-miR-221-3p, hsa-miR-320c, hsa-miR-338-3p, hsa-miR-338-5p, hsa-miR-342-5p, hsa-miR-374a-5p, hsa-miR-378d, hsa-miR-378f, hsa-miR-378g, hsa-miR-378i, hsa-miR-454-3p, hsa-miR-501-3p, hsa-miR-532-5p, hsa-miR-577, hsa-miR-625-3p, hsa-miR-744-5p, hsa-miR-944, hsa-miR-1273g-5p, hsa-miR-1285-3p, hsa-miR-1303, hsa-miR-1307-3p, hsa-miR-3074-5p, hsa-mir-3160-1, hsa-mir-3613, hsa-miR-3613-5p, hsa-miR-3916, hsa-mir-4532, hsa-mir-5091, hsa-miR-6770-5p 및 제2 생물학적 샘플에서 발견된 miRNA와 종자 서열을 공유하는 해당 miRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 miRNA의 리보뉴클레오타이드 서열에 대응하는 리보뉴클레오타이드 서열을 갖는 2 이상의 miRNA 프로브를 포함하는 프로브 세트.
일 실시형태에서, 키트는 상기 프로브 세트에 부착된 고체 지지체를 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서, 키트는 하기를 추가로 포함한다:
(a) 음성 대조군으로서 사용되는 하나의 무작위-생성된 리보뉴클레오타이드 서열; (b) 총 RNA 분해에 대한 표준화된 대조군으로서 사용된, 하우스키핑 유전자로부터 유래된 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 서열; 또는 (c) 양성 대조군으로서 사용되는 하나 이상의 무작위로 생성된 리보뉴클레오타이드 서열 중 하나 이상.
본 발명자들의 다른 목적은
대상체로부터의 타액 샘플로부터 마이크로 RNA(miRNA)의 어레이를 측정하는 단계 및 대상체 샘플에서 miRNA의 발현 수준의 증가 또는 감소가 대상체가 PCS를 발생할 가능성을 나타내도록, 건강한 대상체로부터 및/또는 급성 뇌진탕 증상(ACS)을 갖는 대상체로부터 miRNA의 대조군 어레이에 miRNA 어레이의 발현 프로파일을 비교하는 단계
를 포함하는 경증의 외상성 뇌 손상(mTBI)을 갖는 대상체에서 뇌진탕 후 증후군(PCS)을 평가하기 위한 방법을 제공하는 것이되,
miRNA의 어레이는 적어도 10, 바람직하게는 적어도 15, 더 바람직하게는 적어도 20종의 miRNA를 포함하고, 어레이에서 miRNA는 miR-769, miR-769-3p, miR-769-5p, miR-320c-1, miR-320c-1-3p, miR-320c-1-5p, miR-4792, miR-4792-3p, miR-4792-5p, miR-140, miR-140-3p, miR-140-5p, miR-629, miR-629-3p, miR-629-5p, miR-192, miR-192-3p, miR-192-5p, miR-145, miR-145-3p, miR-145-5p, let-7a, let-7a-3p, let-7s-5p, miR-133a, miR-133a-3p, miR-133a-5p, miR-1307, miR-1307-3p, miR-1307-5p, miR-200b, miR-200b-3p, miR-200b-5p, let-7a, let-7a-3p, let-7a-5p, miR-4508, miR-4508-3p, miR-4508-5p, miR-30e, miR-30e-3p, miR-30e-5p, let-7b, let-7b-3p, let-7b-5p, miR-194, miR-194-3p, miR-194-5p, miR-199a, miR-199a-3p, miR-199a-5p, let-7f, let-7f-3p, let-7f-5p, miR-128, miR-128-3p, miR-128-5p, miR-215, miR-215-3p, miR-215-5p, miR-149, miR-149-3p, miR-149-5p, miR-421, miR-421-3p 및 miR-421-5p로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 목적은 대상체의 타액 샘플에서 마이크로 RNA(miRNA)의 어레이를 검출하는 방법을 제공하는 것이며, 상기 방법은
상기 대상체로부터 타액 샘플을 수득하는 단계;
샘플에서 miRNA의 존재 또는 부재를 검출하는 단계로서, 상기 어레이는 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 miRNA, 바람직하게는 적어도 15종의 miRNA, 더 바람직하게는 적어도 20종의 miRNA를 포함하는, 상기 검출하는 단계를 포함하되,
상기 miRNA는 miR-769, miR-769-3p, miR-769-5p, miR-320c-1, miR-320c-1-3p, miR-320c-1-5p, miR-4792, miR-4792-3p, miR-4792-5p, miR-140, miR-140-3p, miR-140-5p, miR-629, miR-629-3p, miR-629-5p, miR-192, miR-192-3p, miR-192-5p, miR-145, miR-145-3p, miR-145-5p, let-7a, let-7a-3p, let-7s-5p, miR-133a, miR-133a-3p, miR-133a-5p, miR-1307, miR-1307-3p, miR-1307-5p, miR-200b, miR-200b-3p, miR-200b-5p, let-7a, let-7a-3p, let-7a-5p, miR-4508, miR-4508-3p, miR-4508-5p, miR-30e, miR-30e-3p, miR-30e-5p, let-7b, let-7b-3p, let-7b-5p, miR-194, miR-194-3p, miR-194-5p, miR-199a, miR-199a-3p, miR-199a-5p, let-7f, let-7f-3p, let-7f-5p, miR-128, miR-128-3p, miR-128-5p, miR-215, miR-215-3p, miR-215-5p, miR-149, miR-149-3p, miR-149-5p, miR-421, miR-421-3p 및 miR-421-5p로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 목적은 하기를 포함하는 뇌진탕을 갖는 경증의 외상성 뇌 손상(mTBI)으로 진단된 대상체에서 뇌진탕 후 증후군(PCS)을 평가하기 위한 키트를 제공하는 것이다:
miR-769, miR-769-3p, miR-769-5p, miR-320c-1, miR-320c-1-3p, miR-320c-1-5p, miR-4792, miR-4792-3p, miR-4792-5p, miR-140, miR-140-3p, miR-140-5p, miR-629, miR-629-3p, miR-629-5p, miR-192, miR-192-3p, miR-192-5p, miR-145, miR-145-3p, miR-145-5p, let-7a, let-7a-3p, let-7s-5p, miR-133a, miR-133a-3p, miR-133a-5p, miR-1307, miR-1307-3p, miR-1307-5p, miR-200b, miR-200b-3p, miR-200b-5p, let-7a, let-7a-3p, let-7a-5p, miR-4508, miR-4508-3p, miR-4508-5p, miR-30e, miR-30e-3p, miR-30e-5p, let-7b, let-7b-3p, let-7b-5p, miR-194, miR-194-3p, miR-194-5p, miR-199a, miR-199a-3p, miR-199a-5p, let-7f, let-7f-3p, let-7f-5p, miR-128, miR-128-3p, miR-128-5p, miR-215, miR-215-3p, miR-215-5p, miR-149, miR-149-3p, miR-149-5p, miR-421, miR-421-3p 및 miR-421-5p로 이루어진 군으로부터 선택되는 miRNA의 서열에 대응하거나, 서열에 대해 적어도 90% 상동성을 갖고 miRNA에 특이적으로 결합하는 핵산 프로브의 어레이로서, 상기 어레이는 적어도 10개, 바람직하게는 적어도 15개 및 더 바람직하게는 적어도 20개의 핵산 프로브를 포함하는, 상기 어레이.
본 발명자들의 다른 목적은 대상체에게 편두통 의약, 긴장성 두통 의약, 항우울제, 인지 요법, 정신요법, 불안증 의약 및 우울증 의약 중 하나 이상을 제공하는 단계를 포함하는 뇌진탕 후 증후군을 갖는 대상체를 치료하는 방법을 제공하는 것이되, 대상체는 본 발명의 방법에 의해 뇌진탕 후 증후군을 갖는 것으로 동정되었다.
일 실시형태에서, 대상체는 두통, 현기증, 피로, 이노성, 불안감, 불면, 집중력 상실, 기억상실, 소음에 민감함, 및 광 민감성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 증상 중 하나 이상을 가진다.
본 발명자들의 다른 목적은 하기 단계를 포함하는, 대상체에서 뇌 손상 상태 또는 예후를 모니터링하는 방법을 제공하는 것이다:
대상체의 타액에서 뇌 손상과 관련된 하나 이상의 마이크로RNA를 검출하는 단계 및 상기 마이크로RNA가 뇌 손상이 없는 대조군 대상체 양의 상당히 미만 또는 초과의 양으로 존재할 때 뇌 손상 상태를 평가하거나 예후하는 단계, 및 임의적으로 뇌 손상을 갖는 대상체를 치료하는 단계.
일 실시형태에서, 예후하는 단계는 균형 및/또는 인지와 관련된 하나 이상의 마이크로RNA의 비정상 수준을 검출하는 것을 포함한다.
다른 실시형태에서, 대상체는 신생아이거나 대상체는 적어도 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개월령, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25세이다.
다른 목적은 소아 TBI를 갖지 않는 아동으로부터의 값을 초과하는 let-7f 마이크로RNA 수준을 검출하는 단계를 포함하는 소아 TBI를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들의 한 가지 목적은 하기를 포함하는 외상성 뇌 손상("TBI")을 검출하거나, 진단하거나, 예후하거나 모니터링하는 방법을 제공하는 것이다:
대상체의 타액 또는 혈청에서 TBI와 관련된 하나 이상의 마이크로-RNA를 검출하는 단계;
상기 마이크로RNA가 대조군 대상체에서 검출된 양의 상당히 미만 또는 초과로 존재할 때 TBI를 검출하거나, 진단하거나, 예후하거나 모니터링하는 단계; 및 임의적으로, 비정상적인 더 낮은 또는 더 높은 수준이 검출될 때, TBI의 다른 증상에 대해 환자를 추가로 평가하는 단계 또는 TBI에 대한 대상체를 치료하는 단계.
일 실시형태에서, TBI는 경증의 TBI이다. 다른 실시형태에서, 검출하는 단계는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20 또는 50종의 miRNA를 검출한다. 또 다른 실시형태에서, 검출하는 단계는 타액에서 하나 이상의 miRNA를 검출하는 것을 포함한다. 상이한 실시형태에서, 검출하는 단계는 혈청에서 하나 이상의 miRNA를 검출하는 것을 포함한다. 다른 실시형태에서, 검출하는 단계는 클리어에지(ClearEdge)(상표명) 평가 시스템(Hyper Text Transfer Protocol Secure (HTTPS)://WorldWideWeb.clearedgetest.com/, 2018년 1월 22일자로 마지막으로 액세스됨)에 의해 기재된 인지 또는 증상 측정 또는 균형 및/또는 인자의 다른 기능성 측정과 관련된 하나 이상의 miRNA의 비정상 수준을 검출하는 것을 포함한다.
일 실시형태에서, 하나 이상의 miRNA는 프로테오글리칸 합성, 뮤신-O형-글리칸 생합성, 글리코사미노글리칸 생합성 또는 케라틴 황산염 생합성, FoxO 신호전달, 내포작용, 부정맥유발성 우심실 형성이상, ErbB 신호전달, GABAergic 시냅스, 줄기 세포 만능성의 조절, 몰핀 중독, 바이러스 발암 현상, cAMP 신호전달, 프로락틴 신호전달, 신경교종, 액틴 세포골격의 조절, 바이오틴 대사, 및 어드헤렌스 연접(소대 부착)과 연관된 경로 중 하나 이상을 표적화한다.
다른 실시형태에서, 검출하는 단계는 유비퀴틴-매개 단백질 분해 경로, 액손 가이드 경로 또는 TGF-베타 신호전달 경로에서 풍부한 하나 이상의 miRNA를 검출한다.
다른 실시형태에서, 상기 방법은 적어도 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 또는 95%의 정확도로 TBI 또는 mTBI를 갖는 대상체를 검출한다.
상이한 실시형태에서, 상기 방법은 TBI 또는 mTBI의 악화 또는 개선의 지표로서 하나 이상의 miRNA 수준을 모니터링하는 단계를 포함한다.
다른 실시형태에서, 상기 방법은 TBI 또는 mTBI에 대해 대상체를 치료하는 단계 및 치료 전에, 치료 동안에 또는 치료 후에 TBI 또는 mTBI의 악화 또는 개선의 지표로서 하나 이상의 miRNA 수준을 모니터링하는 단계를 포함한다.
본 발명자들의 다른 목적은 타액 또는 혈청에서 TBI 또는 mTBI와 연관된 하나 이상의 miRNA를 동정하는 프로브 및/또는 프라이머를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다. 일 실시형태에서, 프로브 및/또는 프라이머는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 50개 이상의 miRNA를 동정한다. 다른 실시형태에서, 조성물은 TBI 또는 mTBI를 갖는 대상체에서 유비퀴틴-매개 단백질 분해 경로, 축삭 유도 경로 또는 TGF-베타 신호전달 경로에서 풍부한 하나 이상의 miRNA를 검출하는 프로브 및/또는 프라이머를 포함한다. 다른 실시형태에서, 조성물은 마이크로어레이, 바이오칩 또는 칩이다.
본 발명자들의 다른 목적은 TBI 또는 mTBI와 연관된 다중 miRNA를 종합적으로 인식하는 프로브 또는 프라이머를 포함하는 마이크로어레이, 및 임의적으로 신호 전달, 정보 가공 및 데이터 디스플레이 또는 출력 요소를 포함하는, 타액에서 miRNA를 검출하기 위한 시스템을 제공하는 것이다.
일 실시형태에서, 상기 시스템은 miRNA를 수용하고 임의적으로 정제하거나 단리시키기 위한 하나 이상의 요소를 추가로 포함한다.
본 발명자들의 다른 목적은 TBI 또는 mTBI에 의해 영향받은 세포소기관, 세포 구획, 조직 또는 부위에 투여에 적합한 형태로 TBI 또는 mTBI를 가질 위험에 있는 대상체 또는 이들을 갖는 대상체에서 결핍된(건강한 대조군보다 더 낮은) 하나 이상의 miRNA를 포함하는 조성물; 또는 TBI 또는 mTBI에 의해 영향받은 세포소기관, 세포 구획, 조직 또는 부위에 대한 투여에 적합한 형태로 TBI 또는 mTBI를 가질 위험에 있는 대상체 또는 이들을 갖는 대상체에서, 건강한 대조군에 비해 상승된 하나 이상의 miRNA를 낮추거나 비활성화시키는 1종 이상의 제제를 포함하는 제공하는 조성물을 제공하는 것이었다.
일 실시형태에서, 조성물은 천연 또는 합성 리포좀, 미세소수포, 단백질 복합체, 지질단백질 복합체, 엑소좀 또는 다소포체; 또는 프로바이오틱 또는 프레바이오틱(prebiotic) 생성물의 형태이다.
본 발명자들의 한 가지 목적은 치료가 필요한 대상체에게 본 명세서에 개시된 조성물 44를 투여하는 단계를 포함하는, TBI의 위험에 있거나 TBI를 갖는 대상체를 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다수의 또는 대부분의 실시형태에서, 대상체는 인간이다.
생물학적 샘플은 타액, 뇌척수액, 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 분변물, 점막 배출물, 눈물 및 조직 중 하나 이상일 수 있었다. 유리하게는, 본 발명은 타액 샘플을 이용하여 실행된다.
본 발명의 일부 실시형태에서, miRNA의 발현 수준은 RNA 서열분석, 실시간 PCR, 차세대 서열분석에 의해 또는 다른 적절한 방법에 의해 결정될 수 있다.
최근의 연구에서, 본 발명자들은 일 변화에 대한 마이크로RNA(miRNA) 수준의 관계를 시험하였다. 본 발명자들은 일주기 유전자를 표적화하는 miRNA의 일부가 강한 일주기 리듬 그 자체를 나타낸다는 가설을 세웠다. miRNA는 모든 세포외 유체에서 신체 전체적으로 순환할 수 있기 때문에, 본 발명자들은 인간 타액에서 그들을 측정하였다. 타액 샘플을 사용하기 위한 추가적인 이유는 미생물로 지칭되는 인간 입에 존재하는 미생물의 수준 및 다양성에 대한 miRNA 관계의 분석을 가능하게 하는 것이었다. 하부 GI 관에서 이전의 연구는 숙주 miRNA와 존재하는 박테리아 사이의 강한 관계를 나타내었다. 게다가, 장내세균의 일주기 변화가 확립되었다. 결과적으로, 본 발명자들의 한 가지 목적은 일주기 진공 miRNA 및 미생물의 하위집단에서 상관관계가 있는 변화에 대한 증거를 얻기 위한 것이었다. 2017년 3월 23일자로 출원된 미국 가출원 제62/475,705호 및 2018년 3월 20일자로 출원된 PCT/US18/23336은 본 명세서에 전문이 참고로 편입된다.
11명의 인간 대상체 지원자가 초기 연구에 참여하였고, 반복된 날들 중 일자의 다양한 시점에 타액 샘플을 제공하였다. 타액 miRNA 및 미생물 함량의 동정 및 정량화는 차세대 서열분석(NGS), 실시간 PCR을 이용하여 수행되거나, 또 다르게는 통계학적 분석이 이어진다. 본 발명자들은 수집 시간(그러나 수집 일자는 아님)(일상에서 매일의 변화에 의해 강하게 영향받을 수 있었음)에 따라 상당히 변화된 miRNA 및 미생물을 동정하기 위한 두 독립적 샘플 세트에서 이원 분산 분석(ANOVA)을 처음 사용하였다. 이어서, 이들 miRNA 및 미생물의 서브세트는 다변량 회귀를 이용하는 수집 시간을 예측하기 위한 제3의 샘플 세트에서 사용되었다. 결과는 인간 타액이 신뢰 가능하게 정량화된 대략 400종의 miRNA 및 2000개의 미생물을 함유하였다는 것을 나타내었다. 이들 중에서, 수집 시간에 따른 강하고 예측 가능한 변화는 19종의 별종의 miRNA 및 다수의 미생물에 대해 분명하였다. 모델은 15%의 오차 범위 내에서 제3의 샘플 세트에서의 수집 시간을 예측할 수 있는 제1의 2개 샘플에서의 miRNA 데이터로부터 개발하였다. 미생물 데이터는 또한 제1의 2개의 샘플 세트에서 수집 시간과 강한 상관관계를 나타내었지만, 제3의 샘플 세트에서 수집 시간을 예측함에 있어서 정확하지 않았다. 또한 몇몇 miRNA와 미생물 사이의 고도로 유의한 상관관계가 관찰되었다. 흥미롭게도, 최적의 예측 변수 miRNA의 생물정보학적 분석은 뇌 및 면역 기능에 연루된 유전자에 추가로 대부분이 적어도 1회 이상의 일주기 유전자를 표적화한다는 것을 나타내었다. 종합하면, 본 발명자들의 데이터는 타액 miRNA와 미생물 함량 사이의 이전에 알려지지 않은 관계뿐만 아니라 miRNA(및/또는 미생물) 그 자체에 대한 시간적 영향(즉, 시간적 변화)을 뒷받침한다. 시간적 변화를 경험하는 후생적 데이터(서열분석 데이터 또는 다른 데이터)를 정규화하는 본 명세서에 기재된 시스템 및 방법은 임의의 적합한 적용에서 사용될 수 있으며, 여기서 시간적 변화는 데이터에 영향을 미칠 수 있다. 예로서, 본 명세서에 기재된 시스템 및 방법은 의학적 병태의 개시 및/또는 의학적 병태의 변화를 검출하기 위해- 더 구체적으로는, 신경학적 장애, 예컨대 자폐증, 수면 장애 및 외상성 뇌 손상(TBI)의 개시 및/또는 변화를 검출하기 위해 적용분야에서 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명자들의 목적은 하기 단계들을 포함하는, 마이크로RNA(miRNA) 발현에서 시간적 변화를 설명하기 위해 후생적 서열 데이터를 정규화하는 방법을 제공하는 것이었다:
대상체로부터 취한 생물학적 샘플에서 하나 이상의 miRNA의 판독 계수치를 결정하는 단계;
샘플간 판독-계수치 변화를 설명하기 위해 대상체의 후생적 데이터를 정규화하는 단계로서, 상기 판독-계수치 정규화는 하나 이상의 비변이체 miRNA를 사용하는 단계;
생물학적 샘플을 취하는 일자의 시각을 결정하는 단계; 및
판독-계수치 정규화된 miRNA에 알고리즘을 적용하는 단계로서, 알고리즘은 시각에 대한 대상체의 miRNA 발현 수준을 정규화하기 위해 시각을 사용하는, 상기 알고리즘을 적용하는 단계.
본 발명자들의 다른 목적은 하기를 포함하는, 장애, 질환 상태 또는 손상의 진행을 모니터링하는 방법을 제공하는 것이다:
적어도 2개의 생물학적 샘플의 각각에서 하나 이상의 특이적 miRNA의 판독-계수치 및 시각 정규화된 발현 수준을 결정하기 위해 상이한 시점에 취한 동일한 대상체로부터의 적어도 2개의 생물학적 샘플을 분석하는 단계; 및
대상체의 판독 계수치 및 하나 이상의 특이적 miRNA의 시각 정규화된 발현 수준이 시간에 따라 변하는지의 여부를 결정하기 위해 시간에 따른 하나 이상의 특이적 miRNA의 결정된 수준을 비교하는 단계로서, 시간에 따른 하나 이상의 특이적 miRNA의 판독 계수치 및 시각 정규화된 발현 수준의 증가 또는 감소는 대상체의 장애 또는 질환 상태 또는 손상이 개선되고 있거나 악화되고 있다는 것을 나타내는, 단계.
일 실시형태에서, 시각 정규화에 대한 miRNA 대상은 그룹 A circaMiR 및/또는 그룹 A circaMiR의 종자 서열을 공유하는 해당 miRNA로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 실시형태에서, 시각 정규화에 대한 miRNA 대상은 그룹 A circaMiR 및 그룹 B circaMiR 및/또는 그룹 A circaMiR 및 그룹 B circaMiR의 종자 서열을 공유하는 해당 miRNA로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 대상체는 뇌진탕 후 증후군(PCS)을 갖는 대상체이다. 다른 실시형태에서, 대상체는 TBI 또는 mTBI를 갖는 대상체이다.
본 발명자들의 다른 목적은 하기를 포함하는, 제1 생물학적 샘플에서 miRNA 또는 복수의 miRNA를 검출하는 방법을 제공하는 것이다:
대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
그룹 A circaMiR 및 그룹 B circaMiR로부터 선택되는 하나 이상의 miRNA의 각각에 대한 이중-가닥, 상보성 DNA 서열(cDNA)을 생성하는 단계; 및
cDNA의 존재, 부재 또는 상대적 양을 검출하는 단계로서, cDNA의 존재, 부재 또는 상대적 양은 상보성 miRNA의 존재, 부재 또는 상대적 양을 나타내는, 상기 검출하는 단계.
다른 목적은 하기 단계들을 포함하는, 제2 생물학적 샘플에서 miRNA 또는 복수의 miRNA를 검출하는 방법을 제공하는 것이다:
두 번째 시점에 상기 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
그룹 A circaMiR 및 그룹 B circaMiR로부터 선택되는 하나 이상의 miRNA의 각각에 대한 이중-가닥, 상보성 DNA 서열(cDNA)을 생성하는 단계; 및
cDNA의 존재, 부재 또는 상대적 양의 검출하는 단계로서, 상기 제2 시점으로부터의 상기 생물학적 샘플에서 cDNA의 존재, 부재 또는 상대적 양은 제2 시점에 상보성 miRNA의 존재, 부재 또는 상대적 양을 나타내고; 임의적으로 제1 시점으로부터의 결과를 제2 시점으로부터의 결과에 비교함으로써 장애, 질환 또는 손상의 진행을 추적하는 단계.
대상체는 TBI, mTBI 또는 뇌진탕 후 증후군(PCS)을 갖는 대상체일 수 있다.
본 발명자들의 다른 목적은 하기 단계들을 포함하는 시간적 리듬에서 변화를 검출하기 위한 방법을 제공하는 것이었다:
하나 이상의 정상 대상체로부터의 대조군 값과 비교되는 타액 또는 혈청 중의 miRNA 수준의 하나 이상의 비정상 또는 변경된 패턴을 검출하는 단계; 및
miRNA 양의 하나 이상의 비정상 또는 변경된 패턴을 갖는 대상체를 선택하는 단계; 및 임의적으로,
변경된 시간적 리듬과 연관된 TBI, mTBI 또는 PCS-관련된 리듬을 갖는 대상체를 선택하는 단계, 및 임의적으로,
miRNA 양의 하나 이상의 비정상 또는 변경된 패턴을 감소시키거나 재동기화하는(resynchronize) 치료를 투여하는 단계.
하나 이상의 miRNA 양에서 비정상 또는 변경된 패턴이 일 실시형태에서 검출된다.
본 발명의 다양한 실시형태에서, 생물학적 샘플은 타액, 뇌척수액, 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 분변물, 점막 배출물, 눈물 또는 조직일 수 있다.
본 기술의 비제한적 실시형태는 다음을 포함한다:
1. 뇌진탕, 경증의 외상성 뇌 손상("mTBI") 또는 기타 외상성 뇌 손상("TBI")을 검출하거나 진단하는 방법으로서,
(a) 인간 대상체로부터 취한 타액 샘플 중의 하나 이상의 마이크로 RNA("miRNA")의 농도 수준(들)을 결정하는 단계; 및
(b) 동일한 하나 이상의 miRNA의 정상 수준(들)에 대해 하나 이상의 miRNA의 결정된 농도 수준(들)을 비교하는 단계로서, 정상(또는 대조군) 수준은 대상체에서 발견된 것, 뇌진탕, 경증의 외상성 뇌 손상을 갖지 않는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10명 이상의 대상체로부터의 평균; 또는 뇌진탕, mTBI 또는 TBI를 일으킬 수 있었던 사건 전에 대상체에서 결정된 농도 수준(들)인, 상기 비교하는 단계; 및
(c) 뇌진탕, 경증의 외상성 뇌 손상("mTBI") 또는 기타 외상성 뇌 손상("TBI")을 갖거나 가질 더 높은 위험에 있는 상기 하나 이상의 miRNA의 비정상 수준을 갖는 대상체를 선택하는 단계를 포함하되,
하나 이상의 miRNA는 hsa-let-7f-5p, hsa-let-7i, hsa-miR-10a-5p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-23a-3p, hsa-mir-23b, hsa-mir-25, hsa-miR-25-3p, hsa-mir-26a-1, hsa-mir-26a-2, hsa-miR-26a-5p, hsa-mir-26b, hsa-miR-26b-5p, hsa-mir-28, hsa-miR-28-3p, hsa-miR-28-5p, hsa-miR-29c-3p, hsa-mir-30b, hsa-miR-30e-3p, hsa-miR-30e-5p, hsa-mir-92a-1, hsa-mir-92a-2, hsa-mir-103a-1, hsa-mir-103a-2, hsa-miR-125b-1-3p, hsa-miR-125b-2-3p, hsa-miR-141-3p, hsa-miR-148b-3p, hsa-mir-151a, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-151a-5p, hsa-miR-155-5p, hsa-mir-181a-2, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-182-5p, hsa-miR-193a-3p, hsa-miR-203a-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-mir-218-2, hsa-miR-221-3p, hsa-miR-320c, hsa-miR-338-3p, hsa-miR-338-5p, hsa-miR-342-5p, hsa-miR-374a-5p, hsa-miR-378d, hsa-miR-378f, hsa-miR-378g, hsa-miR-378i, hsa-miR-454-3p, hsa-miR-501-3p, hsa-miR-532-5p, hsa-miR-577, hsa-miR-625-3p, hsa-miR-744-5p, hsa-miR-944, hsa-miR-1273g-5p, hsa-miR-1285-3p, hsa-miR-1303, hsa-miR-1307-3p, hsa-miR-3074-5p, hsa-mir-3160-1, hsa-mir-3613, hsa-miR-3613-5p, hsa-miR-3916, hsa-mir-4532, hsa-mir-5091, hsa-miR-6770-5p 및 상기 열거된 miRNA와 종자 서열을 공유하는 해당 miRNA로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나; miR-769, miR-769-3p, miR-769-5p, miR-320c-1, miR-320c-1-3p, miR-320c-1-5p, miR-4792, miR-4792-3p, miR-4792-5p, miR-140, miR-140-3p, miR-140-5p, miR-629, miR-629-3p, miR-629-5p, miR-192, miR-192-3p, miR-192-5p, miR-145, miR-145-3p, miR-145-5p, let-7a, let-7a-3p, let-7s-5p, miR-133a, miR-133a-3p, miR-133a-5p, miR-1307, miR-1307-3p, miR-1307-5p, miR-200b, miR-200b-3p, miR-200b-5p, let-7a, let-7a-3p, let-7a-5p, miR-4508, miR-4508-3p, miR-4508-5p, miR-30e, miR-30e-3p, miR-30e-5p, let-7b, let-7b-3p, let-7b-5p, miR-194, miR-194-3p, miR-194-5p, miR-199a, miR-199a-3p, miR-199a-5p, let-7f, let-7f-3p, let-7f-5p, miR-128, miR-128-3p, miR-128-5p, miR-215, miR-215-3p, miR-215-5p, miR-149, miR-149-3p, miR-149-5p, miR-421, miR-421-3p, 및 miR-421-5p; 및 상기 열거된 miRNA와 종자 서열을 공유하는 해당 miRNA 중 1종 이상으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법. TBI에 선행할 수 있는 사건은 스포츠-관련 넘어짐 및 손상, 예컨대 풋볼, 플래그 풋볼, 축구, 럭비, 아이스하키, 라크로스, 농구 및 다른 접촉 스포츠, 테니스, 골프, 야구, 크리켓, 육상경기, 체조, 복싱, 유도, 가라데, 태권도 및 다른 무술, 말 관련 스포츠, 로데오 스포츠, 하이 다이빙 및 스킨 다이빙을 포함하는 다이빙, 스카이다이빙, 등반, 사이클링, 응원, 차량 관련 스포츠 및 다른 스포츠에서의 고속 충돌로부터 초래되는 것; 및 차량 사고, 및 작업-관련 충격, 넘어짐 및 손상을 포함한다. 다른 사건, 예컨대 충격, 예컨대 발포, 폭발 또는 폭파, 초음파 또는 음향 에너지에 대한 노출, 흔들림(예컨대 영아의 격한 흔들림) 또는 예컨대 주먹, 발차기 또는 무겁거나, 밀집하거나 뭉툭한 물체에 의한 물리적 포열은 TBI에 선행할 수 있다.
2. 실시형태 1에 있어서, 상기 miRNA 발현 수준은, RNA 발현 수준이 실질적으로 불변인, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 하우스키핑 유전자의 발현 수준 또는 평균 발현 수준에 대해 정규화되고/되거나; 상기 miRNA 수준은 하나 이상의 miRNA 수준의 발현에서 주행성(diurnal) 또는 일주기 변동(circadian fluctuation)을 보상하도록 정규화되거나, 식품 섭취, 또는 심박수를 상승시키는 운동에 기인하는 하나 이상의 miRNA 수준의 발현에서 변동을 보상하도록 정규화되거나; 연령, 성별 또는 유전적 배경의 차이를 보상하도록 조절된, 방법. 하우스키핑 유전자(Housekeeping gene)는 문헌[Eisenberg, et al., Trends in Genetics 29(10: 569-574, Cell Press(2013; 본 명세서에 참고로 편입됨)]에 의해 기재되는 것과 같은 RNA 서열분석 데이터의 교정에 유용한 것을 포함한다.
3. 실시형태 1 또는 2에 있어서, (a) 하나 이상의 miRNA의 농도를 결정하는 것은 RNA 서열분석("RNA-seq"), qPCR, miRNA 어레이 또는 멀티플렉스 miRNA 프로파일링에 의해 수행되는, 방법. 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있고, 또한 하이퍼텍스트 전송 규약(HTTP)://_WorldWideWeb.abcam.com/kits/review-of-mirna-assay-methods-qpcr-arrays-and-sequencing(2018년 3월 19일자에 마지막으로 액세스됨, 참고로 편입됨)에 기재되어 있다.
4. 실시형태 1, 2 또는 3에 있어서, 상기 타액 샘플은 mTBI를 갖는 것으로 의심되는 인간 대상체로부터 취해지고, 상기 miRNA는 miR-769, miR-769-3p, miR-769-5p, miR-320c-1, miR-320c-1-3p, miR-320c-1-5p, miR-4792, miR-4792-3p, miR-4792-5p, miR-140, miR-140-3p, miR-140-5p, miR-629, miR-629-3p, miR-629-5p, miR-192, miR-192-3p, miR-192-5p, miR-145, miR-145-3p, miR-145-5p, let-7a, let-7a-3p, let-7s-5p, miR-133a, miR-133a-3p, miR-133a-5p, miR-1307, miR-1307-3p, miR-1307-5p, miR-200b, miR-200b-3p, miR-200b-5p, let-7a, let-7a-3p, let-7a-5p, miR-4508, miR-4508-3p, miR-4508-5p, miR-30e, miR-30e-3p, miR-30e-5p, let-7b, let-7b-3p, let-7b-5p, miR-194, miR-194-3p, miR-194-5p, miR-199a, miR-199a-3p, miR-199a-5p, let-7f, let-7f-3p, let-7f-5p, miR-128, miR-128-3p, miR-128-5p, miR-215, miR-215-3p, miR-215-5p, miR-149, miR-149-3p, miR-149-5p, miR-421, miR-421-3p 및 miR-421-5p; 및 상기 열거된 miRNA와 종자 서열을 공유하는 해당 miRNA 중 1종 이상으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
5. 실시형태 1, 2, 3 또는 4에 있어서, 상기 타액 샘플은 뇌진탕을 갖는 것으로 의심되는 인간 대상체로부터 취해지고, 상기 miRNA는 miR-29c-3p, miR-26b-5p, miR-30e-5p, miR-182-5p, miR-320c 및 miR-221-3p; 및 상기 열거된 miRNA와 종자 서열을 공유하는 해당 miRNA 중 1종 이상으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
6. 실시형태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 타액 샘플은 특정 시각에 인간 대상체로부터 취해지고, 상기 샘플에서 miRNA의 농도 수준(들)은 그 밖의 동일한 조건 하에 동일한 시각에 취해진 타액 중의 정상 miRNA 값과 비교되는, 방법.
7. 실시형태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 타액 샘플이 miRNA의 정상 수준(들)이 결정된 시각과 상이한 시각에 인간 대상체로부터 취해지고, 상기 방법이 miRNA 수준(들)에서 주행성 또는 일주기 변동을 보상하기 위해 타액 샘플에서 결정된 miRNA 수준(들)의 값을 조절하거나 정규화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
8. 실시형태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 타액 샘플이 miRNA의 정상 수준(들)이 결정된 시각과 상이한 시각에 인간 대상체로부터 취해지고, 상기 방법이 회귀 모델 또는 다른 통계학적 분석을 이용하여 miRNA 수준(들)에서 주행성 또는 일주기 변동을 보상하기 위해; 또는 연령, 성별 또는 유전적 배경을 보상하기 위해 타액 샘플에서 결정된 miRNA 수준(들)의 값을 조절하거나 정규화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
9. 실시형태 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 타액 샘플은 걷기 1시간 내에, 양치질 또는 입을 헹구기 전에, 식사 또는 음용 전에 및/또는 심박수를 상승시키는 운동 전에 취해지는, 방법.
10. 실시형태 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 선택하는 단계는 상기 miRNA 중 4종 이상의 비정상 수준을 갖는 대상체를 선택하는 것, 및 임의적으로 상기 비정상 miRNA 수준과 뇌진탕, mTBI 또는 TBI의 하나 이상의 증상의 피어슨 상관계수(Pearson correlation coefficient)를 계산하는 것을 포함하는, 방법.
11. 실시형태 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 선택하는 단계는 상기 miRNA 중 10종 이상의 비정상 수준을 갖는 대상체를 선택하는 것, 및 임의적으로 상기 비정상 miRNA 수준과 뇌진탕, mTBI 또는 TBI의 하나 이상의 증상의 피어슨 상관계수를 계산하는 것을 포함하는, 방법.
12. 실시형태 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 팔코니드 헤르페스바이러스(Falconid herpesvirus), 프레보텔라 멜라니노게니카(Prevotella melaninogenica) ATCC 25845, 헤모필루스 파라인플루엔자(Haemophilus parainfluenzae) T3T1, 베일로넬라 파르불라(Veillonella parvula) DSM 2008, 마크로코커스 카세오리티쿠스(Macrococcus caseolyticus) JSCC5402, 푸조박테리움 뉴클레아툼(Fusobaterium nucleatum) 하위종 누클레아툼 25586, 헤모필루스, 푸조박테리움 누클레아툼 하위종 빈센티(vincentii), 메이슨-화이자(Mason-Pfizer) 원숭이 바이러스, 캄필로박터 호미니스(Camplyobacer hominis) ATCC 및 프레보텔라(Prevotella)로 이루어진 군으로부터 선택되는 타액 미생물로부터 RNA(들)의 발현 수준을 결정하는 단계; 또는 그에 대해 적어도 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5 또는 100% 유사하거나 동일한 RNA를 갖는 미생물; 및 미생물 RNA의 발현 수준(들)을 동일한 하나 이상의 미생물 RNA의 정상 수준(들)에 비교하는 단계를 추가로 포함하되, 상기 정상(또는 대조군) 발현 수준은 TBI를 갖지 않는 대상체, 2 이상의 대상체로부터의 평균; 또는 TBI의 하나 이상의 증상의 출현 전에 상기 대상체에서 결정된 농도 수준(들)에서 발견되는, 상기 비교하는 단계; 및 상기 TBI를 갖는 또는 갖는 것에 대해 더 높은 위험에 있는 상기 하나 이상의 미생물 RNA의 비정상 발현 수준을 갖는 대상체를 더 선택하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
BLASTN은 기준 폴리뉴클레오타이드 또는 공지된 게놈 서열에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 87.5%, 90%, 92.5%, 95%, 97.5%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열을 동정하기 위해 사용될 수 있다. 고도로 유사한 서열을 찾기 위해 최적화된 대표적인 BLASTN 세팅은 예상 역치 10 및 단어크기 28, 질의 범위에서의 최대 매치 0, 매치/미스매치 스코어 1/-2, 및 선형 갭 코스트를 사용한다. 낮은 복잡도 영역은 필터링/마스킹될 수 있다. 디폴트 세팅은 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_PROGRAMS=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK_LOC=blasthome(2018년 3월 19일자로 마지막으로 액세스 됨)(본 명세서에 참고로 편입됨)에 의해 기재되고, 이를 참고로 하여 편입된다.
13. 실시형태 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 타액 miRNA 수준을 결정하는 단계는 RNA 서열분석(RNA-seq)에 의해 수행되는, 방법.
14. 실시형태 13에 있어서, 상기 서열분석 데이터 원 판독 계수치(sequencing data raw read count)는 사분위수-정규화되고, 평균중심화되고(mean-centered), 각각의 변수의 표준 편차로 나뉘며; 데이터는 샘플간 계수치 변화를 설명하도록 정규화되고/되거나; 데이터는 상대적 및/또는 절대적 발현 수준을 기재하기 위해 하나 이상의 비변이체 miRNA의 발현에 대해 정규화되고; 임의적으로 정규화된 데이터가 추가로 통계학적으로 분석되는, 방법.
15. 실시형태 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, miRNA의 하나 이상의 비정상 수준 및/또는 비정상 미생물 발현 수준을 갖는 미생물을, 하나 이상의 miRNA의 하나 이상의 비정상 타액 수준을 감소시키는 요법으로 치료하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
16. 실시형태 15에 있어서, 상기 대상체로부터 2회 이상의 상이한 시점에 타액 샘플을 수득하는 단계 및 상기 제2 또는 후속 타액 샘플이 miRNA 수준(들)을 가질 때 치료 요법의 효능을 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
17. 실시형태 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 뇌진탕, 경증의 외상성 뇌 손상("mTBI")을 갖는 것으로 또는 갖는 것에 대해 더 높은 위험에 있는 대상체를, 하나 이상의 miRNA의 하나 이상의 비정상 타액 수준을 감소시키는 요법으로 치료하는 단계를 추가로 포함하되, 상기 요법은 수술 요법, 약물 요법, miRNA 또는 miRNA 길항제 요법, 식이 또는 영양 요법, 물리 치료, 광선 요법, 정신요법, 행동 치료 및 대안적인 의학적 요법 중 하나 이상을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
18. miRNA를 검출하기 위한 miRNA 키트로서, hsa-let-7f-5p, hsa-let-7i, hsa-miR-10a-5p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-23a-3p, hsa-mir-23b, hsa-mir-25, hsa-miR-25-3p, hsa-mir-26a-1, hsa-mir-26a-2, hsa-miR-26a-5p, hsa-mir-26b, hsa-miR-26b-5p, hsa-mir-28, hsa-miR-28-3p, hsa-miR-28-5p, hsa-miR-29c-3p, hsa-mir-30b, hsa-miR-30e-3p, hsa-miR-30e-5p, hsa-mir-92a-1, hsa-mir-92a-2, hsa-mir-103a-1, hsa-mir-103a-2, hsa-miR-125b-1-3p, hsa-miR-125b-2-3p, hsa-miR-141-3p, hsa-miR-148b-3p, hsa-mir-151a, hsa-miR-151a-3p, hsa-miR-151a-5p, hsa-miR-155-5p, hsa-mir-181a-2, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-182-5p, hsa-miR-193a-3p, hsa-miR-203a-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-mir-218-2, hsa-miR-221-3p, hsa-miR-320c, hsa-miR-338-3p, hsa-miR-338-5p, hsa-miR-342-5p, hsa-miR-374a-5p, hsa-miR-378d, hsa-miR-378f, hsa-miR-378g, hsa-miR-378i, hsa-miR-454-3p, hsa-miR-501-3p, hsa-miR-532-5p, hsa-miR-577, hsa-miR-625-3p, hsa-miR-744-5p, hsa-miR-944, hsa-miR-1273g-5p, hsa-miR-1285-3p, hsa-miR-1303, hsa-miR-1307-3p, hsa-miR-3074-5p, hsa-mir-3160-1, hsa-mir-3613, hsa-miR-3613-5p, hsa-miR-3916, hsa-mir-4532, hsa-mir-5091, hsa-miR-6770-5p 및 상기 열거된 miRNA와 종자 서열을 공유하는 해당 miRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 miRNA에 상보성이거나 그렇지 않으면 이의 증폭 및/또는 검출에 적합한 1 또는 2개 이상의 프로브 또는 프라이머;
상기 miRNA의 증폭 및/또는 검출을 위한 시약, 및 임의적으로 반응 기질, 플랫폼, 장치, 어레이, 패키징 물질 및/또는 사용을 위한 설명서를 포함하고/하거나;
상기 어세이 키트는 miR-769, miR-769-3p, miR-769-5p, miR-320c-1, miR-320c-1-3p, miR-320c-1-5p, miR-4792, miR-4792-3p, miR-4792-5p, miR-140, miR-140-3p, miR-140-5p, miR-629, miR-629-3p, miR-629-5p, miR-192, miR-192-3p, miR-192-5p, miR-145, miR-145-3p, miR-145-5p, let-7a, let-7a-3p, let-7s-5p, miR-133a, miR-133a-3p, miR-133a-5p, miR-1307, miR-1307-3p, miR-1307-5p, miR-200b, miR-200b-3p, miR-200b-5p, let-7a, let-7a-3p, let-7a-5p, miR-4508, miR-4508-3p, miR-4508-5p, miR-30e, miR-30e-3p, miR-30e-5p, let-7b, let-7b-3p, let-7b-5p, miR-194, miR-194-3p, miR-194-5p, miR-199a, miR-199a-3p, miR-199a-5p, let-7f, let-7f-3p, let-7f-5p, miR-128, miR-128-3p, miR-128-5p, miR-215, miR-215-3p, miR-215-5p, miR-149, miR-149-3p, miR-149-5p, miR-421, miR-421-3p, 및 miR-421-5p; 및 상기 열거된 miRNA와 종자 서열을 공유하는 해당 miRNA 중 1종 이상을 검출하는, miRNA 키트.
19. 실시형태 18에 있어서, 상기 어세이 키트는 miR-769, miR-769-3p, miR-769-5p, miR-320c-1, miR-320c-1-3p, miR-320c-1-5p, miR-4792, miR-4792-3p, miR-4792-5p, miR-140, miR-140-3p, miR-140-5p, miR-629, miR-629-3p, miR-629-5p, miR-192, miR-192-3p, miR-192-5p, miR-145, miR-145-3p, miR-145-5p, let-7a, let-7a-3p, let-7s-5p, miR-133a, miR-133a-3p, miR-133a-5p, miR-1307, miR-1307-3p, miR-1307-5p, miR-200b, miR-200b-3p, miR-200b-5p, let-7a, let-7a-3p, let-7a-5p, miR-4508, miR-4508-3p, miR-4508-5p, miR-30e, miR-30e-3p, miR-30e-5p, let-7b, let-7b-3p, let-7b-5p, miR-194, miR-194-3p, miR-194-5p, miR-199a, miR-199a-3p, miR-199a-5p, let-7f, let-7f-3p, let-7f-5p, miR-128, miR-128-3p, miR-128-5p, miR-215, miR-215-3p, miR-215-5p, miR-149, miR-149-3p, miR-149-5p, miR-421, miR-421-3p 및 miR-421-5p; 및 상기 열거된 miRNA와 종자 서열을 공유하는 해당 miRNA 중 1종 이상을 검출하는, mTBI의 진단 또는 검출을 위한 miRNA 키트.
20. 실시형태 18에 있어서, 상기 어세이 키트는 miR-29c-3p, miR-26b-5p, miR-30e-5p, miR-182-5p, miR-320c 및 miR-221-3p; 및 상기 열거된 miRNA와 종자 서열을 공유하는 해당 miRNA의 수준을 검출하는, 뇌진탕의 진단 또는 검출을 위한 어세이 키트.
21. miRNA를 동정하는 방법으로서, 인간 타액에서 농도가 주간 또는 일주기 리듬에 따라 변동하되, 하기 단계들을 포함하는, 방법:
(a) 24시간 기간 동안 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12회 이상 또는 간격으로 한 명 이상의 대상체로부터 타액 샘플을 수집하는 단계;
(b) 상기 샘플에서 miRNA를 서열분석하는 단계;
(c) miRNA 당 서열분석 판독을 계수함으로써 상이하게 발현된 miRNA를 동정하는 단계, 서열 판독 데이터를 정규화하는 단계 및 상이한 시간에 취한 타액 샘플 중에서 정규화된 서열 판독 계수치를 비교하는 단계;
(d) 하우스키핑 유전자 또는 miRNA(24시간 기간에 걸쳐 비변이체 발현을 나타냄)의 RNA 발현에 대해, 또는 2 이상의 하우스키핑 유전자로부터의 평균화된 RNA 발현에 대해 서열 판독 데이터를 정규화시키는 단계;
(e) 상이한 시점 또는 간격으로부터 정규화된 RNA 발현 데이터에 대해 다변량 회귀 분석 또는 다른 통계학적 분석을 수행하는 단계;
(f) 임의적으로, 얻어진 데이터에 대한 피어슨 상관계수를 계산하여 타액에서 발견되는 하나 이상의 miRNA의 농도 수준을 설명하는 단계;
(g) 주간 또는 일주기 리듬에 따라 동요하는 발현 수준을 갖는 하나 이상의 miRNA를 선택하는 단계; 및
(h) 임의적으로, DIANA miRpath 또는 다른 소프트웨어를 이용하여 miRNA에 대한 표적 유전자를 결정하는 단계.
본 발명에 일반적으로 기재되었지만, 추가적인 이해는 단지 예시의 목적을 위해 본 명세서에 제공되고 달리 구체화되지 않는 한 제한하는 것으로 의도되지 않는 소정의 특정 실시예를 참고로 하여 얻어질 수 있다.
실시예 1
소아 뇌진탕
소아 뇌진탕의 정확한 그리고 생리적으로 적절한 마커로서 miRNA의 순환 농도의 효용을 평가하기 위해, 본 발명자들은 아동 TBI 후에 타액 miRNA 및 뇌척수액(CSF) miRNA의 변화를 비교하였다. 약어: 곡선하면적(AUC); 중추 신경계(CNS); 뇌척수액(CSF); 뇌실외 배액술(EVD); 글라스코 코마 스코어(GCS); 마이크로-리보핵산(miRNA); 경증의 외상성 뇌 손상(mTBI); 수신부 작동 특징(receiver operating characteristic: ROC); 중증의 외상성 뇌 손상(sTBI).
연구 설계. 중증의 TBI가 있는 7명의 아동의 CSF 중의 종단적 miRNA 농도를 TBI가 없는 3명의 대조군과 비교하기 위해 사례-코호트 설계를 사용하였다. CSF에서 "변경된" miRNA는 경증의 TBI를 갖는 60명의 아동의 타액에서 정보를 얻었고, 18세- 및 성별-매칭 대조군을 비교하였다. CSF 및 타액에서 병행 변화(윌콕슨 순위 합계 검정)를 갖는 miRNA는 다변량 회귀 기법을 이용하여 TBI 상태의 예측 정확도에 대해 정보를 얻었다. 관심 대상의 miRNA와 임상 특징 사이의 상관관계는 스피어만 순위 상관관계(Spearman rank correlation)를 이용하여 연구하였다. DIANA mirPath 소프트웨어를 이용하는 기능성 분석은 관련된 mRNA 표적/경로를 동정하였다.
결과. 본 명세서에 나타낸 바와 같이 타액 miRNA는 용이하게 측정되고, 소아 TBI를 동정하기 위한 생리적으로 적절하고 정확한 바이오마커이다. CSF에서 검출된 214종의 miRNA가 있었고, 135종(63%)이 또한 타액 중에 존재하였다. 6종의 miRNA는 CSF와 타액 둘 다에서 병행 변화를 가졌다(miR-182-5p, miR-221-3p, mir-26b-5p, miR-320c, miR-29c-3p, miR-30e-5p). 이들 6종 miRNA는 소아 대상체에서 경증의 TBI 상태를 동정하기 위한 0.852의 곡선하면적을 입증하였다. miRNA 중 3종(miR-182-5p, miR-29c-3p, miR-320c)은 TBI 후 CSF 및/또는 타액에서의 종단적 경향을 나타내었고, 모두 3종의 mRNA는 신경 발생과 관련되었다. miR-320c의 농도는 스포츠 뇌진탕 평가 도구(Sports Concussion Assessment Tool)-3에 대한 집중 곤란의 아동(R=0.36, FDR=0.02) 및 모체(R=0.37, FDR=0.003) 보고 둘 다와 직접적인 상관관계가 있었다.
sTBI 보충 및 샘플 수집. sTBI를 갖는 아동 및 청소년에서 F2-아이소프로스탄 수준의 연구를 위해 이전에 수집한 CSF 샘플(Varma et al., 2003)을 CSF miRNA의 종단적 특성규명을 위해 이용하였다. 간략하게, sTBI를 갖는 8명의 아동으로부터 수집한 심실 CSF 샘플을 현재의 연구를 위해 무작위로 선택하였다. 샘플 선택 편향을 제거하기 위해, 연구자들은 샘플 선택 전에 참여자 특징에 대해 맹검이었다. 선택되는 코호트는 sTBI 후에 증가된 두개내압에 대해 임상적으로 나타낸 뇌실외 배액술(EVD)로 8 미만의 글라스코 코마 스코어(GCS)를 갖는 4 내지 17세의 아동 연령을 포함하였다. 손상 기전은 추락 및 모터 차량 충돌을 포함하였다. CSF는 손상 후 3회 멸균 방식으로 각각의 대상체의 EVD로부터 수동적으로 추출하였다: 제1일, 제4일 내지 제7일, 및 제8일 내지 제17일. 각각의 대상체에 대해 연령, 성별, 손상 기전 및 수집 시간을 기록하였다(표 1). 대조군 CSF는 뇌전증에 대한, 또는 패혈증 배제진단 프로토콜의 부분으로서 임상적으로 나타낸 척수 천자를 겪은 3명의 대상체(1 내지 8세)로부터의 12개의 샘플을 포함하였다.
mTBI 보충 및 샘플 수집
현재 연구의 부분으로서 얻은 타액 miRNA 프로파일을 mTBI의 임상 진단이 있는 또는 없는 대상체(5 내지 21세)에서 연구하였다. mTBI 코호트는 초기 손상의 14일 내에 mTBI의 평가를 위해 의학 센터에 소개된 61명의 아동 및 청소년을 포함하였다. 대부분의 임상 증상을 시사한 이전의 연구에 기반하여 14일 컷오프를 선택하였고, 바이오마커 프로파일은 뇌진탕의 2주 내에 기준으로 복귀된다(Yokobori et al., 2013). mTBI 그룹에 대한 제외 기준은 GCS < 12, 중증의 TBI의 임상 진단, 침투성 두부 손상, 두개골 골절, 두개강내 출혈 또는 근본적인 심리적 장애(예를 들어, 우울증 또는 불안감)에 기인하는 증상을 포함하였다. 대조군 코호트는 정기적으로 잘 계획된 아동 방문을 위한 소아 클리닉에 소개된 19명의 아동 및 청소년을 포함하였다. 이 그룹을 위한 배제 기준은 이전의 뇌진탕 이력, 진행 중인 류머티즘성 병태 또는 최근의 정형외과적 손상을 포함하였다. 치주 질환, 상기도 감염증, 경련장애, 지적 장애, 편두통의 이력, 또는 약물/알코올 사용 장애를 갖는 대상체는 그룹 둘 다로부터 제외하였다. 오라진(Oragene) RE-100 타액 수집 키트(DNA 게노텍(DNA Genotek); 캐나다 오타와에 소재)에 객담을 통한 수돗물 헹굼 후에 식후 상태로 등록 시 각각의 참여자로부터 타액 샘플을 수집하였다. 샘플을 손으로 5 내지 10회 진탕시키고 나서, 4℃ 냉장고에 전달 전에 10일까지 동안 실온에서 저장하였다. mTBI와 대조군 참가자 둘 다로부터 연령, 성별, 인종/민족, 신장, 체중, 식이 제한, 의학적 이력, 선택적 세로토닌 재흡수 저해제 사용, 알레르기, 의약 및 구강인두 상태를 포함하는 의학적 및 인구통계학적 정보를 수집하였다(표 2A 내지 표 2B). mTBI 코호트는 또한 이전의 뇌진탕 이력, 현재의 뇌진탕의 상술(손상 이후의 일수, 기전, 연관된 구토, 쇠약, 기억 상실증, 골절 또는 의식 상실), 및 마지막 진통제 사용 시간(비스테로이드성 항염증 또는 아세트아미노펜)을 보고하였다. 최종적으로, mTBI 대상체 및 그들의 부모/후견인은 아동 스포츠 뇌진탕 평가 도구(SCAT-3)를 이용하는 뇌진탕 증상의 목록 작성을 완료하였다.
[표 2A]
[표 2B]
RNA 가공 및 정량화
앞서 보고한 바와 같이 제조업자 설명서에 따라 노르겐 순환 및 엑소좀 RNA 정제 키트(Norgen Circulating and Exosomal RNA Purification Kit)(캐나다 온타리오주에 소재한 노르겐 바이오텍(Norgen Biotek))를 이용하여 타액 및 CSF 샘플로부터 RNA를 추출하였다(Xia et al., 2016). 나노드롭 분광광도계(Nanodrop Spectrophotmeter)로 최종 RNA 농도를 정량화하였고, 서열분석 전에 추출된 RNA를 -80℃에서 저장하였다. 라이브러리 구성 전에 애질런트(Agilent) 2100 바이오애널라이저로 RNA 수율 및 품질을 평가하였다. 넥스트플렉스(NEXTflex)(등록상표) 작은 RNA-Seq 키트 v3(바이오 사이언티픽(Bioo Scientific); 미국 텍사스주 오스틴에 소재), 일루미나(Illumina) HiSeq(등록상표) 2500 기기 및 샘플당 3백만 판독의 표적화된 깊이를 이용하여 타액 RNA의 서열분석을 하였다. CSF RNA 샘플을 일루미나 TruSeq 작은 RNA 샘플 분취 프로토콜(일루미나(Illumina); 미국 캘리포니아주 샌디에이고에 소재), 일루미나 MiSeq 기기, 및 샘플당 3백만 판독의 표적화된 깊이를 이용하여 업스테이트 메디컬 유니버시티(Upstate Medical University)의 써니 몰레큘러 분석 코어(SUNY Molecular Analysis Core)에서 서열분석하였다. SHRiMP2 얼라이너(aligner)를 이용하여 파테크 플로우(Partek Flow)(파테크; 미국 미주리주 세인트 루이스에 소재)에서 인간 게놈의 hg38 구성에 대해 판독을 정렬하였다. 각각의 샘플 내의 총 miRNA 계수치를 miRBase 성숙-마이크로RNA v21로 정렬하였다. 5x103개 미만의 총 계수치를 갖는 타액 샘플을 최종 분석으로부터 제외하여, 60개의 mTBI 및 18개의 대조군 타액 샘플을 생성하였다. 샘플의 적어도 25%에서 10개 초과의 원 판독 계수치를 갖는 miRNA만을 각각 CSF 및 타액에 대한 차별적 발현 분석에서 평가하였다. sTBI CSF 샘플의 25%에 존재하고 모든 대조군 CSF 샘플로부터 부재인 miRNA를 또한 "상향조절된" miRNA로서 연구하였다. 통계학적 분석 전에 판독 계수치를 합계 정규화시키고, 평균중심화시키고 나서, 각각의 변수의 표준편차로 나누었다. 용어 "판독" 또는 "판독-계수치"는 샘플 사이의 변수를 설명하기 위해 miRNA 또는 마이크로바이옴 발현 데이터를 조절하기 위한 임의의 방법에 적용하는 것, 예컨대 그들이 더 정확하게 비교될 수 있도록 샘플 내 모든 miRNA 수준을 정규화하기 위해 타액 중에서 예측 가능한 수준으로 항상 존재하는 소정의 대조군 miRNA 또는 대사물질을 발현 수준을 이용하는 것으로 이해되어야 한다.
대안의 실시형태에서, 형광 방법은 miRNA 및/또는 마이크로바이옴 수준을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 예에서, 리간드는 기질 상에서 그룹으로 고정될 수 있다. 표적 miRNA 및 마이크로바이옴 서열은 그것이 리간드에 결합하기 전에 또는 후에 형광 태그(또는 비형광 염료)로 표지될 수 있다. 본 출원에서, 각각의 리간드 그룹에서 상대적 강도는 존재하는 miRNA 및/또는 마이크로바이옴 양의 측정일 수 있다. 본 방법은 칩 유형 분석에 대해 실행될 수 있다. 당업자는 다른 적합한 칩-유형 분석이 miRNA 및/또는 마이크로바이옴 수준을 결정하기 위해 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 또 다른 실시형태에서, miRNA 수준을 검출하기 위해 등온 증폭이 사용될 수 있다.
도 5는 뇌척수액 RNA의 품질 분석을 나타낸다. 애질런트 바이오애널라이저(Agilent Bioanalyzer) RNA 나노칩을 이용하여 추출된 RNA의 시험은 뇌척수액 샘플에서 상대적으로 낮은 RNA 수율을 입증하였지만, 18 내지 25개의 뉴클레오타이드에서 피크가 일치된다(성공적인 miRNA 추출과 일치됨).
통계학적 분석. 3단계 절차를 이용하여 뇌진탕 바이오마커로서 가장 큰 생리적 적절도를 갖는 miRNA를 동정하였다: 1) sTBI CSF 샘플에만 존재하는 miRNA, 또는 sTBI CSF(백만개당 판독으로서 측정됨; RPM)에서 "변경된" 농도를 갖는 miRNA를 벤자민 호크버그(Benjamini Hochberg) 위검출률(FDR) 보정과 함께 비모수 윌콕슨 순위 합계 검정(Wilcoxon rank sum test)으로 동정하였고; 2) 이들 miRNA 표적의 농도(RPM)를 윌콕슨 순위 합계 검정을 이용하여 mTBI 타액 샘플(대조군 타액에 비교됨)에서 조사하고 나서; 3) CSF와 타액 TBI 샘플 둘 다에서 "변경된" miRNA는 대조군에 대한 병행 상향- 또는 하향-조절에 대해 시험하였다(도 1). 스피어먼 순위 상관관계 측정(miRNA 농도와 손상 이후의 일수의 상관관계)을 이용하는 CSF와 타액 뇌진탕 샘플 둘 다에서 종단적 경향에 대해 관심 대사의 miRNA를 연구하였다. 이들 바이오마커 예상의 진단 정확도를 다변량 로지스틱 회귀 분석으로 평가하였고, 결과를 수신부 작동 특징(ROC) 곡선으로 시각화하였다. 데이터세트의 "오버-모델링(over-modeling)"을 피하기 위해 그리고 miRNA 바이오마커가 대조군과 mTBI 대상체를 정확하게 구별하는 것을 보장하기 위해, 메타보애널라이트(Metaboanalyst) 소프트웨어(Xia et al., 2016)에서 1/4 샘플 홀드 아웃 절차와 동시에 100배 몬테-카를로 교차 검증(Monte-Carlo Cross Validation: MCCV)를 수반하는 2차 접근을 사용하였다. 관심 대상의 의학적/인구 통계학적 특징과 타액 miRNA 사이의 관계는 스피어먼 순위 상관관계로 시험하였다. mTBI 및 대조군에 걸친 의학적 및 인구통계학적 데이터의 분석을 양측 스튜던트 t-검정으로 달성하였다.
기능성 분석. 종-특이적 mRNA 표적(Vlachos et al., 2015) DIANA(등록상표) mirPath를 동정하기 위해 마이크로T-CDS 알고리즘을 이용하는 DIANA mirPath v3 온라인 소프트웨어(하이퍼텍스트 전송 규약(HTTP)://snf-515788.vm.okeanos.grnet.gr/)에서 기능성 주석 분석을 받은 mTBI의 miRNA 바이오마커는 피셔 정확 검정을 이용하는 유의한(FDR < 0.05) 표적 농축도로 유전자 온톨로지(gene ontology: GO) 범주를 동정하였다. 고신뢰도 mRNA 표적의 목록(마이크로T-CDS 스코어 ≥ 0.99)은 String v10 소프트웨어에서 중간 엄중 세팅(상호작용 스코어 > 0.40)을 이용하여 단백질-단백질 상호작용에 대해 정보를 얻었다(Hypertext Transfer Protocol (HTTP)://string-db.org)(Szklarczyk et al., 2015).
miRNA 바이오마커에서의 시간적 변화의 설명. 실시형태에서, 후생적 데이터(예를 들어, 후생적 서열분석 데이터)는 시간적 변화를 포함할 수 있기 때문에(예를 들어, 데이터는 사인곡선 또는 일주기에서 다를 수 있음), 후생적 데이터는 대상체가 외상성 뇌 손상을 경험하였는지 여부를 결정하기 위해, 손상의 중증도 또는 예후를 검출하기 위해, 또는 외상성 뇌 손상에 기인하는 질환 상태의 변화가 일어났는지의 여부를 검출하기 위해 분석을 수행하기 전의 시각을 기준으로 정규화될 수 있다. 예에서, miRNA 양/수준은 인간/대상체에서의 miRNA 양/수준의 천연 유래 변화를 설명하기 위해 시각을 기준으로 정규화될 수 있다. 시각 정규화된 miRNA 양은 인간/대상체가 그들의 질환 상태에서 외상성 뇌 손상 또는 변화를 갖는지의 여부를 결정하기 위해 대조군/건강한 기준 대상체 또는 대조군/건강한 대상체의 개요에 비교될 수 있다. 후생적 데이터를 정규화하기 위한 시스템 및 방법의 추가적인 논의는 본 명세서에 전문이 참고로 편입된 2017년 3월 23일자로 출원된 미국 가출원 제62/475,705호에서 찾을 수 있다.
의학적 및 인구통계학적 특징. mTBI와 대조군 사이의 참가자 연령(p=0.48), 성별(p=0.27) 또는 인종/민족(백인%; p=0.70)에서 유의한 차이가 없었다(표 2). 식품/의학 알레르기(p=0.63), 식이 제한(p=0.79) 또는 항우울 의약(p=0.88)을 갖는 참가자의 백분율에 차이가 없었다. mTBI 그룹은 유의하게 더 컸고(p=0.002) 타액 수집 전 6시간에 더 높은 빈도로 비-스테로이드성 항-염증 의약(p=0.001), 및 아세트아미노펜(p=0.003)을 이용하였다. mTBI 및 대조군에 대한 평균 수집 시간은 각각 13:00 및 13:30이었다(p=0.43). mTBI 참여자에 대한 타액 수집은 평균적으로 뇌진탕 후 6.5일에 일어났다. 이 그룹에 대한 가장 통상적인 손상 기전은 스포츠-관련 손상(59%), 자동차 사고(18%) 및 추락(16%)을 포함하였다. mTBI 그룹 내에서 뇌진탕 후 증상은 의식의 상실(25%), 구토(21%), 쇠약(31%) 및 기억상실(44%)을 포함하였다. mTBI 참여자에 대한 평균 SCAT3 스코어는 아동 보고에 대해 23.7 그리고 부모 보고에 대해 21.8이었고, 참여자당 평균 11개의 증상으로 이루어졌다. 증상은 mTBI 참여자의 66%에서 4주 이상 지속되었고, 43%는 이전의 뇌진탕 이력을 보고하였다.
중증의 TBI(sTBI)에서 CSF miRNA. 대조군 CSF(샘플당 22,885개의 정렬된 판독)에서보다 sTBI(샘플당 평균 정렬된 miRNA 판독 = 565,805) 후에 CSF에서 더 강한 miRNA 발현이 있었다. 정보를 얻은 2813개의 성숙 인간 miRNA 중에서, 214(7.6%)는 CSF 샘플에 존재하였다(표 3). 114개의 해당 miRNA는 발현에서 명목 차이가 있었고(p < 0.05), 86개는 sTBI와 대조군 사이의 유의한 변화가 있었다(FDR < 0.05). 72개는 하향조절되었고, 42개는 sTBI에서 상향조절되었다.
miled TBI(mTBI)에서의 타액. miRNA. 대조군과 mTBI 샘플 둘 다에 걸쳐 강한 발현을 갖는 214개의 타액 miRNA가 있었다(표 4). 타액 중에서 측정된 miRNA 중 40종은 정규화된 판독 계수치에서 명목 차이가 있었고, 10종은 대조군과 mTBI 그룹 사이에 상당한 차이가 있었다. miRNA 중 9종은 mTBI 타액에서 하향조절되었고, 31종은 상향조절되었다.
CSF 및 타액 miRNA의 조합된 분석. CSF에서 검출된 214종의 miRNA 중에서, 135종(63%)은 또한 타액 중에 존재하였다. sTBI 대상체의 CSF에서 명목 차이를 갖는 114종의 miRNA 중에서, 64종(56%)은 타액 중에 존재하였고, 10종(8.7%)은 mTBI 그룹에서 명목 차이를 입증하였다. 이들 10종의 miRNA 중 6종은 이전의 뇌진탕 연구에서 보고되었다(Redell et al., 2010; Bhoma et al., 2016); Mitra et al., 2017). miRNA 중 어떤 것도 중복 종자 서열을 갖지 않는다. 10종 중복 miRNA 중에서, 6종은 타액과 CSF TBI 샘플 둘 다에서 동일한 방향으로 변경되었다(표 5). 4종은 하향조절되었고(miR-182-5p, miR-221-3p, mir-26b-5p, miR-320c) 그리고 2종(miR-29c-3p, miR-30e-5p)은 상향조절되었다(도 2A 내지 도 2L).
화살표는 TBI 샘플에서의 변화 방향을 나타낸다.
miRNA 바이오마커 패널의 예측 정확도. mTBI와 대조군 타액 샘플을 구별하는 랜덤 포레스트 다변량 회귀 분석에서 사용할 때, 6종 miRNA는 0.852의 합쳐진 곡선하면적(AUC)을 가졌다(도 3a). 알고리즘은 2/18 대조군 대상체 및 15/60 mTBI 대상체를 오분류하여(도 3b), 78% 정확도로 75%의 민감도 및 89%의 특이도를 수득하였다. 무작위로 샘플의 25%를 홀드아웃한 100배 교차 검증 절차는 교차 검증 상황에서 0.800의 AUC 및 홀드아웃 상황에서 0.917의 AUC를 검증하였다(도 3c).
뇌진탕-관련 miRNA에서 종단적 변화. CSF 및 타액 샘플에서 병행 변화를 갖는 6종 miRNA는 뇌진탕 후 종단적 경향에 대해 정보를 얻었다. 손상(일수) 이후로 miRNA 농도와 시간 사이의 스피어먼 순위 상관관계는 CSF와 타액 샘플 둘 다에 대해 결정하였다(표 6).
6종 miRNA 중에서, 3종은 CSF와 타액 중의 병행 상관관계를 나타내었다. miR-29c-3p 및 miR-182-5p의 상대 농도(RPM)는 CSF와 타액 둘 다에서 시간에 따라 하향 경향이 있었다. miR-320c의 상대 농도는 생체 유체 둘 다에서 시간에 따라 상향조절 경향이 있었다. 이런 경향은 CSF와 타액 둘 다에서 miR-320c에 대해, 그리고 타액에서 miR-29c-3p에 대해 유의하였다(FDR < 0.05).
기능성 분석. mTBI 상태에 대한 예측 효용을 갖는 6종 miRNA는 700종의 예측된 고신뢰도 mRNA 표적을 가졌고, 이 중 354종은 실험적으로 입증되었다(표 7).
상기 표의 데이터는 당업자가 본 명세서에 개시된 방법에 적합한 특정 miRNA 또는 miRNA의 서브세트를 선택하도록 허용할 것이다.
하나 초과의 miRNA에 의해 표적화된 34종의 mRNA가 있었다. 700종의 mRNA 표적은 30종 GO 범주로 유의한 연관이 있었다(표 8). 특히, 신경계 발생과 관련된 mRNA 표적에 대해 유의한 농축이 있었고(p=2.67E-07), 37개의 유전자를 포함하는 경로는 4종 miRNA(miR-182-5p, miR-29c-3p, miR-30e-5p 및 miR-320c)에 의해 표적화되었다. 단백질-단백질 상호작용 네트워크는 String v10에서 가장 높은 신뢰도 mRNA 표적 중 280종에 대해 정하였다(마이크로T-CDS 스코어 ≥ 0.999). 본 분석은 0.775의 클러스터링 계수치를 갖는 269개의 노드 및 247개의 에지를 함유하는 유의한 단백질-단백질 상호작용 네트워크(p< 0.0001)를 동정하였다(도 30). 이 네트워크의 분석은 신경계 발생(61개의 유전자; p=8.56E-09), 뉴런 발생(29개의 유전자; p=8.45E-05) 및 축삭 발달(21개의 유전자; p=4.89E-04)을 포함하는 유의한 농축도(표 8B)를 갖는 67종 생물학적 과정을 동정하였다.
의학적 특징과 타액 miRNA 사이의 관계
관심 대상의 6종 타액 miRNA와 아동 SCAT3 스코어, 비경구 SCAT3 스코어와 의학적/인구통계학적 인자 사이의 상관관계를 연구하였다(도 4a 내지 도 4c). SCAT-3에 대한 아동-보고된 측정과 miR-26b-5p 및 miR-320c의 타액 농도 간에 유의한 상관관계가 있었다(표 10A). miR-26b-5p 수준은 "나는 많이 피곤하다" 및 "나는 쉽게 피곤해진다"의 보고와 역의 상관관계가 있었지만, miR-320c 수준은 "나는 몽상을 많이 한다" 및 "나는 혼란스럽다"의 보고와 직접적으로 상관관계가 있었다. 또한 miR-320c와 "집중을 계속하는 것이 곤란하다"와 "쉽게 집중이 안 된다"를 포함하는 부모에 의해 보고된 SCAT-3 측정 간에 유의한 직접적 상관관계가 있었다(표 10B). 여성과 miR-182-5p 및 miR-221-3p의 타액 농도 간의 명목 상관관계가 있었다(표 10C). 그러나, 관심 대상의 6종 miRNA와 다른 의학적/인구통계학적 특징(참가자 연령, 인종, 체중, 신장, 항-우울증 의약 사용 또는 식이 제한을 포함) 사이에 유의한 상관관계가 발견되지 않았다. 또한 6종 miRNA의 농도와 운동 동안에 부러진 뼈 또는 뇌진탕 간에 상관관계는 없었다.
[표 10A]
[표 10B]
[표 10C]
CSF 중에서 발견된 miRNA의 50% 초과가 또한 타액에서 발견되었고 거의 10%는 뇌진탕 두부 외상 후 병행 변화를 겪는다. 이들 miRNA 중 6종의 타액 농도는 뇌진탕 상태를 예측하였고, 5종은 성인 인간 혈청의 이전의 연구에 기재되어 있다. 중요하게는, 이들 6종 miRNA는 뼈 손상, 운동 참가 또는 참가자 인구통계학적 특징과 상관관계가 없었다. 그들은 또한 신경 발생과 관련된 mRNA 표적에 대해 두드러진 농축도를 나타내었다. 수집의 용이함 및 정량화와 결합된 이들 인자는 타액 miRNA를 뇌진탕 평가를 위한 이상적인 기질로 만든다.
뇌-관련 miRNA의 타액 전달을 위한 잠재적 기전. 혈액-기반 분석에 의해 지배되는 의학적 커뮤니티에서, 타액 샘플링이 뇌에 창을 제공한다는 생각은 가늠하는 것이 어려울 수 있다. 그러나 방대한 대부분의 의학적 검사가 구강의 효소 환경에서 용이하게 분해되는 단백질의 측정에 의존한다는 것을 상기한다. 비교 시, miRNA의 짧은 단일 가닥 구조는 그들을 효소 분해에 대해 상대적으로 내성으로 제공한다(Gilad et al., 20087). 그들은 또한 세포외 수송 동안 마이크로-소수포 또는 단백질-결합 기전에 의해 통상적으로 보호된다(Valadi et al., 2007). 이들 인자는 시간에 따른 건강한 대상체에서 타액 miRNA 서명의 안정성 및 재현성을 설명한다(Bahn et al., 2015). 그들은 또한 뇌-관련 miRNA가 타액으로 이동하는 방법을 설명하게 돕는다. miRNA의 엑소좀 수송은 구강인두 신경을 분포시키는 뇌신경(설인, 안면, 미주 및 삼차신경)으로부터 직접적으로(Majem et al., 2015) 또는 침샘 내 전문화된 세포에 의해 혈액으로부터의 추출을 통해 간접적으로 초래될 수 있다(Bahn et al., 2015). 이 후자의 기전은 부분적으로, 혈액에서 발견되는 다수의 펩타이드 및 지질이 또한 타액 중에 존재하는 이유(Yan et al., 2009), 및 현재의 연구가 뇌진탕의 혈청-기반 miRNA 바이오마커와 타액 중에서 검출되는 것 사이에 이러한 높은 중복을 발견하는 이유를 입증한다. 뇌신경 및 후구의 미엘린초 내에서 동맥주위 조직을 통해 CSF 전환을 조절하는 것을 돕는 글림프 시스템(glymphatic system)은 뇌-관련 분자가 말초 순환에 유입되는 1차적 경로를 나타낸다(Plog et al., 2015). 구강인두에 대한 이들 구조의 근접도를 고려하면, 글림프 시스템은 또한 타액에 대한 뇌-관련 miRNA의 전달에 어떤 역할을 하는 것처럼 보인다.
외상성 뇌 손상에 대한 생리적 반응에서 miRNA의 역할. 현재의 연구에서 동정된 6종 miRNA는 뇌진탕의 존재 또는 부재와 거의 상관관계가 없다. 그들은 또한 외상성 뇌 손상에 대한 생리적 반응에서 신경생물학적 연루를 가진다. 예를 들어, miR-320c는 sTBI 대상체의 CSF 및 mTBI 대상체의 타액에서 하향조절된다. 생체 유체 둘 다에서, miR-320c의 농도는 손상 이후 시간과 직접적으로 상관관계가 있다(즉, 그들은 시간에 따라 기준으로 복귀된다). MiR-320c는 가소성, 기분 및 일주기 리듬을 비롯한 신경계 기능에 중요한 몇몇 경로에 연루된다.
miR-320c의 1종의 mRNA 표적은 뉴런 흥분 동안 동적으로 발현되고 뉴런 가소성을 조절하는 가소성-관련 유전자 패밀리의 구성원인 인지질 포스파타제 관련 1(LPPR1)이다(Savaskan et al., 2004). 가소성-관련 유전자는 주의력 결핍에 연루되고, 현재의 연구에서 miR-320c의 농도는 증가된 몽상 및 아동 주의산만의 부모의 보고와 직접적으로 상관관계가 있었다. 기준에 대한 miR-320 수준의 종단적 복귀는 이들 증상을 완화시킬 수 있다. 반면에, miR-320c에서 규제가 없는 증가는 뇌진탕 후 증후군에서 흔히 보고되는 기분 조절장애를 야기할 수 있었다. 이 생각은 miR-320c의 상당한 증가에서 발견된 성공적인 자살 완료 후 성인 전뇌에서의 miRNA 발현 연구에 의해 뒷받침된다(Lopez et al., 2014).
뇌진탕 관리에 대한 연루. 본 연구에서 동정된 타액 miRNA는 소아 뇌진탕의 진단 및 관리에서 강력한 적용을 가진다. 이 패널은 MRI 영상화 접근보다 더 저렴하고, 혈청 샘플보다 더 용이하게 얻어지고, 주관적 뇌진탕 조사를 투여하고 스코어링하는 것보다 덜 시간 소모적인 뇌 손상의 객관적 측정을 제공한다. miRNA 서명은 손상 이후 거의 2주에 상승된 채로 남아있고 해당 시간 동안 기준으로 향하는 경향이 있기 때문에, 그들은 급성 임상 또는 응급 부서 상황에 대한 초기 제시 시뿐만 아니라 뇌진탕 전문가와의 후속적 만남 시 임상 적용을 가진다. miRNA 농도에서 종단적 경향은 중증도 분류(triaging) 전문가 의뢰, 개인화된 의학 요법의 개시 및 요법에 대한 임상 반응의 추적에 대한 강력한 효용을 가진다. 본 연구에서 동정된 miRNA의 패널은 78명의 대상체 중 17명만이 오분류되었다. 오분류된 대조군은 항-우울증 의약 및 비-스테로이드성 항-염증 의약을 취한 식품 알레르기를 갖는 한 명의 환자뿐만 아니라 동정 가능한 의학적 병태를 갖는 한 명의 대상체를 포함하였다. 15명의 오분류된 mTBI 대상체는 이전의 뇌진탕 이력(n=5), 쇠약(n=3), 구토(n=3), 근시(n=3) 및 항염증 의약 용도(n=6)를 특징으로 하였다. 따라서, 장래의 연구는 타액 miRNA에 대한 이들 인자의 관계를 시험하는 데 필요할 것이다.
miRNA의 표 11은 환자/대상체에서 외상성 뇌 손상을 동정하고/하거나 특성규명하는 데 사용될 수 있는 육십팔(68)종의 miRNA 목록이 있다. 표 1에서 임의의 miRNA와 동일한 종자 서열을 공유하는 miRNA는 환자/대상체에서 외상성 뇌 손상을 동정하고/하거나 특성규명하는 데 사용될 수 있다.
본 연구는 sTBI에서 CSF 패턴을 반영하고 mTBI 상태에 대해 진단 정확도를 입증하는 mTBI에서 변경된 6종 타액 miRNA(miR-182-5p, miR-221-3p, mir-26b-5p, miR-320c, miR-29c-3p 및 miR-30e-5p)를 동정하였다. 이들 6종 miRNA는 뉴런 발생과 기능적으로 관련되며 뇌진탕 증상 보고와의 아주 흥미로운 상관관계를 입증한다. 몇몇은 성인 뇌진탕의 이전의 혈청 연구에서 동정되었지만, 본 명세서에서 본 발명자들은 타액에서 용이하게 측정되며 손상 2주 후까지 동안 지속적 조절장애를 나타낸다는 것을 나타낸다.
실시예 2
성인 종합 격투기 파이터에서 mTBI 의 동정 및 특성규명을 위한 혈청과 타액 miRNA의 비교
본 연구에서 본 발명자들의 목적은 최근의 경증의 두부 외상에 노출된 성인 대상체에서 균형 및 인지 기능의 객관적 측정으로 혈액 및 타액 중의 miRNA의 말초 측정 간의 관계를 결정하는 것; 임의의 동정된 miRNA가 뇌 기능 및 손상 반응에 적절한 특정 생물학적 경로에 연루되는지의 여부를 시험하는 것; 및 miRNA와 기능성 측정 사이의 관계 강도를 정량화하고 그들의 잠재적 진단 효용을 결정하는 것이었다.
대상체. 인간 대상체의 사용에 관한 모든 프로토콜을 검토하였고, 써니 업스테이트 메디컬 유니버시티의 생명윤리위원회에 의해 승인받았다. 연구 등록 및 샘플 수집 전에 모든 인간 대상체로부터 서면동의서를 얻었다. 대상체는 그들의 참여에 대한 금전 배상을 받았다. 85개의 타액 및 131개의 혈청 샘플을 포함하는 총 216개의 샘플을 50명의 MMA 파이터(42명은 고유하고, 8명은 반복 파이터임)로부터 수집하였다. 시합 전 1주 또는 1시간 시점에 그리고 시합 후 4개 시점(시합 직후(15 내지 30분), 2 내지 3일, 1주 및 3+주) 중 하나 이상에 이들을 수집하였다(표 12). 각각의 MMA 시합은, 파이터가 넉아웃되거나 항복하지 않는 한, 각각 3분의 3회 라운드로 이루어졌다. 현장에서 훈련받은 채혈사에 의해 멸균 BD 진공채혈 SST 관(벡톤-딕킨슨(Becton-Dickenson)) 내로 채혈을 수행하고 나서 20분 동안 앉아있게 하고 제조업자의 설명서에 따라 원심분리시켰다. 오라진(Oragene) RNA 수집 바이알(RE-100, DNA게노텍(DNAGenotek), 미국 온타리오주 오타와에 소재) 내로 객담에 의해 또는 오라진 핵산 안정화 키트 면봉(P-157, DNA게노텍, 미국 온타리오주 오타와에 소재)을 이용하여 면봉 흡수에 의해 타액을 수집하였다.
MMA 대상체는 40명의 남성 및 2명의 여성을 포함하였고, 연령이 26.5세이고 평균 BMI는 24.6이었다. 대상체의 2/3(66%)는 백인으로 자기 보고되었고, 17%는 아프리카계 미국인 그리고 14%는 히스패닉계였다. 파이터의 총 29%는 또한 합병증 없는 뇌진탕의 이전의 이력을 보고하였다. 이들 파이터의 하위집단으로부터의 혈청 샘플을 사용하여 mTBI의 시합 전 및 시합 후 단백질 바이오마커에서의 잠재적 변화를 평가하였다. 이들 샘플은 24명의 파이터(23명의 남성)으로부터 유래되었고, 연령은 18 내지 42세(평균 24.9세)이며, 평균 BMI는 23.4였다. 대상체 중 한 명은 청력 상실의 잘 알려진 이력을 가졌고, 5명은 단일 뇌진탕(합병증 없음)의 이전의 이력을 가졌다. 대다수(57%)의 파이터는 백인이었고, 20%는 아프리카계 미국인이며, 20%는 히스패닉이었다.
miRNA 분석을 위해 사용한 타액 및 혈청 샘플
N 1주전 제0일
전		 0일 후 2 내지 3일 후 1주 후 3+주 후 기능성 데이터
타액 85 4 23 23 15 12 8 54 64%
혈청 131 7 52 52 17 3 0 49 37%
총계 216 11 75 75 32 15 8 103 48%
혈청 중의 단백질 바이오마커 . 파이터의 하위집단(n=24)에서, ELISA 또는 루미넥스(Luminex) 플랫폼을 이용하는 기존의 문헌(종종 중증의 TBI 사례 또는 동물 모델에 중점을 둠)에 기반한 TBI의 몇몇 후보 단백질 바이오마커의 발현을 시험하였다. 동일한 혈청 분취액을 분석 둘 다에 대해 사용하였는데, 이는 표 12에 나타낸 시점에 수집하였고, 후속적 가공을 위해 -80℃에서 저장하였다.
루미넥스 분석: 주문제작한 8-플렉스 마그네틱 루미넥스(8-plex Magnetic Luminex)(등록상표) 선별 패널(알앤디 시스템즈(R&D Systems), 미국 미네소타주 미네아폴리스에 소재; 카탈로그 번호 LXSAHM)를 이용하여, 제조업자의 프로토콜에 따라 BDNF, CCL2/MCP-1, CRP, ICAM1, IL-6, NSE2, S100B 및 VCAM의 발현 수준에 대해 혈청 샘플을 분석하였다. 각각의 분석물에 대한 민감도 한계는 각각 0.32, 9.9, 116, 140, 87.9, 1.7, 4.34 및 238pg/㎖였다. 샘플 형광을 바이오-라드 바이오플렉스(Bio-Rad Bioplex)(등록상표) 200 시스템에서 판독하였고, 바이오플렉스(Bioplex)(등록상표) 매니저 6.1 소프트웨어(미국 캘리포니아주 허큘리스에 소재한 바이오-라드)를 이용하여 분석하였다.
ELISA: 제조업자의 설명서에 따라 마이바이오소스(Mybiosource) ELISA 키트(미국 캘리포니아주 샌디에이고에 소재한 마이바이오소스 인코포레이티드(MyBiosource, Inc.)를 이용하여 UCHL1, MBP, GFAP의 혈청 수준을 검출하였다. 카탈로그 번호 및 검출 한계는 다음과 같았다: UCHL1(# MBS2512760), 78.125-5000pg/㎖; MBP(#MBS261463), 1000pg/㎖-15.6pg/㎖; 및 GFAP(#MBS262801), 20 ng/㎖-0.312ng/㎖. 450㎚의 파장에서 시너지 2(Synergy 2) 마이크로플레이트 판독기(미국 버몬트주 위누스키에 소재한 바이오테크(Biotek))를 이용하여 퍼옥시다제 산물의 광학 밀도를 분광광학적으로 측정하였다.
단백질 바이오마커 데이터의 통계학적 분석을 24명의 파이터에 대해 시합 후 수준을 시합 전 수준에 비교하는 쌍별 T 검정뿐만 아니라 각각의 대상체에 대한 시합 비디오로부터 관찰한 두부에 대한 가격(HTH)의 수에 비교되는 시합 후 수준의 변과 관계를 시험하기 위한 선형 회귀를 이용하여 수행하였다.
RNA 단리. RNA는 제조업자의 설명에 따라 miRNeasy 혈청/혈장 키트(퀴아젠 인코포레이티드(Qiagen Inc))를 이용하여 혈청 및 타액으로부터 단리하였다. 혈청: 냉동 혈청 샘플을 얼음 위에서 해동시키고, 200㎕의 혈청을 1㎖의 QIAzol 용해 시약에 첨가하였다. 격렬한 교반 후에, 200㎕의 클로로폼을 첨가하고 나서, 샘플을 실온(RT)에서 5분 동안 인큐베이션시키고, 이어서, RT에서 15분 동안 12,000×g에서 원심분리시켰다. 얻어진 수성상을 제거하고 나서, 1.5 용적의 100% 에탄올과 혼합하고, RNeasy MinElute 스핀 칼럼에 옮기고 나서, 15초 동안 원심분리시켰다. 칼럼을 제조업자의 표시 용적에서 완충제 RWT 및 RPE로 세척하였고, RNA를 30㎕의 무 RNase 워터로 용리시켰다. 타액: 본래 오리진 바이알 또는 면봉 수집 키트로 수집한 냉장시킨 타액 샘플을 50℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 250㎕ 분취액을 제거한 후에, 마이크로원심분리관에 전달하고 나서, 90℃에서 15분 동안 인큐베이션시키고, 실온으로 냉각시켰다. 750㎕의 QIAzol 용해 시약을 첨가하고 나서, 샘플을 격렬하게 1분 동안 교반시키고, 5분 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 클로로폼(200㎕)을 첨가하고 나서, 샘플을 1분 동안 교반시키고, 이어서, 최대 속도(>13,000×g)로 10분 동안 원심분리시켰다. 450㎕의 얻어진 수성상을 새로운 관에 옮기고 나서, 675㎕의 100% 에탄올과 혼합하고, RNeasy MinElute 스핀 칼럼에 옮기고 나서, 15초 동안 원심분리시켰다. 칼럼을 제조업자의 표시 용적에서 완충제 RWT 및 RPE로 순차적으로 세척하였고, RNA를 30㎕의 무 RNase 워터로 용리시켰다. RNA 나노칩 상에서 애질런트 테크놀로지즈 바이오애널라이저(Agilent Technologies Bioanalyzer)를 이용하여 RNA 품질을 평가하였다.
RNA 서열분석. 제조업자의 설명서에 따라 TruSeq 가닥 작은 RNA 키트(TruSeq Stranded Small RNA Kit)(일루미나(Illumina))를 이용하여 가닥 RNA-서열분석 라이브러리를 제조하였다. 샘플을 48개의 배취에서 색인을 달았고, 표적화된 서열분석 깊이는 샘플 당 1천만개의 판독이었다. 업스테이트 메디컬 유니버시티의 써니 분자 분석 코어(SUNY Molecular Analysis Core: SUNYMAC)에서 일루미나 NextSeq 500 기기 상의 36 bp 단일 단부 판독을 이용하여 서열분석을 수행하였다. FastQ 파일을 잘라내어 어댑서 서열을 제거하고, 파테크 플로우(Partek Flow)(미국 미주리주 세인트루이스에 소재한 파테크 인코포레이티드(Partek, Inc.))에서 쉬림프2(Shrimp2) 알고리즘을 이용하여 성숙 miRbase21 데이터베이스에 대해 정렬을 수행하였다.
RNA- Seq 분석. 정렬된 판독을 정량화하고 나서, 내부의 상대적으로 비변형 기준 miRNA(miR-24-3p)에 대해 정규화하고 나서 log2 스케일로 전환하였다. 이어서, 각각의 대상체의 정규화된 miRNA 시합 후 데이터는 그들의 각각의 시합 전/기준 값(시합 1주 전 또는 시합 직전에 얻음)과 상반되었고, 총 141개의 샘플 차이 값(n=62 타액, 79 혈청)을 수득하였다. 정규화된 miRNA 차이값을 통계학적 분석 전에 주성분 분석(principal component analysis: PCA)을 이용하여 구형성에 대해 선별하고 나서, 60% 초과의 상실을 갖는 것을 제거하도록 필터링하였다.
본 발명자들은 mTBI와 관련된 miRNA를 동정하기 위해 두 상이한 분석 작업 흐름을 사용하였다. 제1 방법에서, 파이터가 경험한 두부에 대한 가격(HTH) 수를 기준으로 수집 시 또는 수집 전에 일어난 mTBI의 확률에 기반하여 141개의 샘플을 3개의 그룹으로 분할하였다. 이들 HTH 값은 각각의 시합의 비디오 녹화로부터 얻었다. 정해진 그룹은 매우 가능성 있음(10+ HTH; 평균 = 24.2), 중간으로 가능성 있음(4-9 HTH; 평균 = 6.5) 및 가능성 없음(0-3 HTH; 평균 = 0.3)이었다(표 13):
유체 유형에 따라 분리된 분석에서 사용한 샘플 분류
TBI 위험(HTH)에 따른 비교 유형 N 유체 유형 평균 HTH
낮음 0-3 HTH 50 24 타액/26 혈청 0.3
중간 4-9 HTH 41 15 타액/26 혈청 6.5
매우 가능성 있음 10-65 HTH 50 23 타액/27 혈청 24.2
"HTH": 비디오로 관찰한 두부에 대한 가격.
대상체 변수 구간화 . 본 발명자들은 처음에 샘플 유형의 주요 효과를 시험하는 이원분산분석(ANOVA) 및 TBI 분류뿐만 아니라 HTH 스코어에 기반한 TBI 확률 비율의 상당한 효과와 miRNA에 대한 선별을 위한 그들의 상호작용을 사용하였다. 이는 0.15 미만의 위발견율(False Discovery Rate: FDR) 보정을 갖는 생체유체 둘 다로부터의 샘플 모두에서 수행하였다. 이어서, 이 필터를 통과한 miRNA를 실제 HTH 값을 가장 잘 예측한 miRNA를 확립하기 위해 단계적 선형 회귀를 사용하였다. 이어서, 매우 가능성 있는 그리고 가능성 없는 TBI 샘플을 모두 서로로부터 구별하는 능력(보통의 그룹을 홀드 아웃)을 평가하기 위해 로지스틱 회귀 분류 분석을 완료하였다. 100배 몬테-카를로 교차 검증(MCCV)을 수행하여 생체유체에 따른 경험적 정확도를 추정하였다. 가장 강한 예측 효용을 나타낸 miRNA에 다이아나 툴(Diana Tools) miRpathv3을 이용하는 기능성 분석을 실시하였다. 강한 판별력을 나타내는 miRNA에서 차이의 상관관계를 상관관계 분석을 이용하는 다양한 기능성 측정에 대해 평가하였다.
시간적 변수 구간화. 제1 분석은 시합 후 각각의 대상체로부터의 모든 초기 샘플을 동일한 TBI 확률 분류로 합쳤기 때문에, 그들이 단지 급속 또는 지연된 효과를 갖는다면, 일부 miRNA는 회피된 검출을 가질 수 있는 가능성이 있었다. 그럼에도 불구하고, 이러한 시간-의존적 반응은 대상체 변수 구간화로부터 유래된 것만큼 중요할 수 있었다. 잠재적인 급속 또는 지연된 효과를 나타내기 위해, 본 발명자들은 4개의 상이한 시간적 변수 구간화에 기반하여 상대적 miRNA 발현에 대해 시간 및 샘플 유형의 효과 및 그들의 상호작용을 시험하기 위해 일반적 선형 모델을 사용하였다. 앞에서와 같이, 본 분석에서 사용되는 122개의 샘플은 시합 전 발현 수준에 대해 정규화되었다(표 12). 따라서 시간 1은 MMA 매치까지 나타났지만 시합에 참여하지 않은 대상체로부터의 샘플을 함유하였고, 또한 생체유체 샘플(이들은 사건의 비특이적 효과에 대한 대조군으로서 작용함)뿐만 아니라 매치에 참여하였지만 두부에 대한 가격을 경험하지 않은 대상체(이들은 운동 대조군으로서 작용함)를 제공하였다. 종합적으로, 이들은 시간 1 대조군으로서 지칭한다. 남아있는 시간적 변수 구간화는 매치에 참여하고 두부에 대한 2회 이상의 가격(HTH)을 받은 파이터로부터 유래되었다. 이들은 수집 시점에 따라 시간 1 HTH(시합 후 1시간 이내), 시간 2 HTH(시합 후 2 내지 3일) 및 시간 3 HTH(시합 후 7일)로 그룹화하였다. 상대적 시간 효과를 갖는 모든 miRNA의 시간적 프로파일을 시각화하였고, 더 현저한 패턴을 동정하기 위해 감독 분류 분석을 실시하였다. 이어서, 관심 대상의 발현 프로파일로 miRNA에 Diana Tools miRpathv3을 이용하는 기능성 분석을 실시하였고 대상체 변수 구간화로부터의 miRNA와 비교하였다.
기능성 연구. 8회의 상이한 자세 동안 3차원으로 신체 동요뿐만 아니라 이중 운동 및 인지 작업의 수행 동안 신체 동요 및 완료 시간을 측정한 쿼드란트 바이오사이언시즈 인코포레이티드(Quadrant Biosciences Inc)(Syracuse NY)에 의해 개발된 ClearEdge(상표명) 평가 시스템 버전을 이용하여 MMA 파이터 균형 및 인지 기능의 평가를 수행하였다. 휴대용 태블릿 컴퓨터(도시바(Toshiba), 모델: WTB-B) 및 스타일러스를 이용하여 각각의 대상체에 의해 이중 작업 및 인지 작업을 완료하였다. 가공 후 각각의 정제로부터 다운로드한 얻어진 데이터를 이용하여 250 Hz의 빈도로 모두 3종 계획에서 움직임을 샘플링한 각각의 대상체가 허리에 두른 관성 센서의 사용을 통해 신체 동요(균형) 분석을 측정하였다. 바닥 상에서 또는 폼 패드 상에 서 있는 동안 30초 동안 각각의 대상체에 의해 신발을 벗은 채로 자세를 유지하였고 데이터를 눈을 뜬 채로 또는 감은 채로 얻었다. 스탠스 동안, 발을 발목 또는 발 터치의 의학적 양상과 함께 나란히 위치시켰거나, 그들은 주로 사용하는 발을 앞쪽의 직렬 위치에 두고 덜 지배적인 발을 뒤쪽으로 위치시키고 나서, 앞쪽 발의 뒤꿈치를 뒤쪽 발의 발가락과 접촉시켰다. 이중 작업의 인지 성분은 단지 태블릿을 안정되게 잡는 한편 그에 대한 고정을 유지하는 단순한 이중 작업에 추가로 시행 A 및 시행 B 작업의 디지털 형식 및 청각 작업 기억 작업(역순 숫자 세기)을 포함하였다. 시행 A에서, 선별 시 대상체는 스타일러스를 이용하여 증가되는 일련의 둘러싸는 숫자(1-2-3 등)를 빠르게 연결하였다. 시행 B에서, 대상체는 교번의 알파-숫자 순서로(1-A-2-B-3-C 등) 증가되는 일련의 둘러싸는 숫자 및 글자를 연결하였다. 역순 숫자 세기 작업은 헤드폰을 통해 각각의 대상체에 전달된 점점 증가하는 긴 숫자 순서의 역순 회상을 측정하는 것으로 이루어졌다. 종합하면, 14개의 작업을 파이터에 대해 측정하였다. 특히, 샘플 횟수의 대략 절반(48%)에서 동일한 대상체에 대해 동시 기능성 및 생체 유체 측정을 얻는 것만이 가능하였다.
miRNA 데이터를 이용하는 것과 같이, 기능성 데이터를 각각의 대상체 내에서 통상적인 시합 전 시점과 시합 후 시점의 비교에 의해 표준화된 차이 측정에 대해 전환시켰다. K-최근접 이웃 접근(K-nearest neighbor approach)을 이용하여 일부 역순 숫자 세기 작업에 대한 상실 데이터 지점을 채웠다. 주성분분석(PCA)를 이용하는 통계학적 분석 전에 구형성에 대해 기능성 데이터를 선별하였다. 이어서, 이원(샘플 유형 × TBI 분류) 분산분석(ANOVA)을 수행하여 위발견율(False Discovery Rate: FDR)이 0.05 미만인 수집 시간에 TBI 분류 배치의 유의한 효과를 갖는 기능성 측정을 선별하였다. 본 발명자들은 또한 피어슨 상관관계 측정 및 유의도의 R 내지 T 검정을 이용하여 서로 유의하게 변화된 기능성 매개변수의 관계를 시험하였다. 최종적으로, HTH의 가능성 또는 HTH 이후의 시간적 간격과 관련된 기능성 결과를 동정하기 위해 miRNA 측정과 유사한 방식으로 이원 ANOVA를 수행하였다.
기능성 및 miRNA 데이터에서 시간적 패턴의 조합된 분석. 관심 대상의 발현 프로파일로 miRNA를 동정한 후에, 본 발명자들은 시간에 따른 최고의 유사성을 나타내는 분자 및 기능성 특징을 검출하기 위해 주성분분석(PCA)을 이용하여 분자 데이터와 함께 균형 및 인지 스코어를 시험하였다. 이 분석을 위해, 모든 시합 후 샘플로부터의 기능성 데이터와 함께 ASR 또는 DSR miRNA만을 사용하였다(n=39 타액, n=31 혈청). 쿼티맥스 루트 곡선 추출(quartimax root curve extraction)을 이용하는 반복적 주축 PCA를 수행하였다. miRNA 변수와 가장 유사한 기능성 변수를 동정하기 위해 인자 가중치를 시험하였고, 시각화 목적을 위해 선 플롯을 생성하였다.
기능성 결과 측정
바닥에 서기
1) 눈을 뜬 채로 두 다리로 서기(Two Legs Eyes Open: TLEO) 동안의 동요
2) 눈을 감은 채로 두 다리로 서기(Two Legs Eyes Closed: TLEC) 동안의 동요
3) 눈을 뜬 채로 직렬 자세(Tandem Stance Eyes Open: TSEO) 동안의 동요
4) 눈을 감은 채로 직렬 자세(Tandem Stance Eyes Closed: TSEC) 동안의 동요
폼 패드 위에 서기
5) TLEO 폼 패드(TLEOFP) 동안의 동요
6) TLEC 폼 패드(TLECFP) 동안의 동요
7) TSEO 폼 패드(TSEOFP) 동안의 동요
8) TSEC 폼 패드(TSECFP) 동안의 동요
이중 작업
9) 태블릿 잡기(Holding Tablet: HT) 동안의 동요
10) 이중 작업 시행 B 작업(TMB_Dual_Bal) 동안의 동요
11) 이중 작업 역순 순서 세기(DSB_Bal) 동안의 동요
12) 시행 A 작업(TMA_Cog)에 대한 완료 시간
13) 시행 B 작업(TMB_Cog)에 대한 완료 시간
14) 이중 작업 역순 숫자 세기(DSB_Cog)에 대한 완료 시간
결과: MMA 파이터에서의 기능성 변화. 14회의 기능성 측정 중 4회는 TBI 가능성 분류에 기인하는 유의한 차이를 나타내었다. 예상한 바와 같이, 14회의 기능성 측정 중 어떤 것도 수집 시 샘플링 된 생체유체 유형에 의해 영향받지 않았고, 어떤 것도 임의의 상호작용을 나타내지 않았다; 표 15 및 도 6 참조. 이들 작업은 신체 동요의 3회 측정(TLEC, DSB_Bal, TMB_Bal) 및 인지 기능의 1회 측정(TMA_Cog)을 포함하였다. 도 6은 MMA 시합 후에 평가한 기능성 측정의 변화에 대한 TBI 가능성 분류의 상당한 효과를 나타낸다.
생체유체 샘플링 동안 얻은 기능성 데이터에 대한 유의한 효과
기능성 작업 TBI 유체 상호작용
역순 숫자 세기(동요) 0.00004 0.84799 0.23975
눈을 감은 채로 두 다리로 서기(동요) 0.00049 0.84799 0.71747
기호 잇기 B 이중 작업(동요) 0.02047 0.84799 0.83046
기호 잇기 A(인지) 0.04340 0.84799 0.83046
생체유체 유형의 효과는 없었지만, 본 발명자들은 타액 및 혈청을 별개로 제공하는 대상체의 세트에 대한 기능성 변화 패턴을 시험하여, 게이지 재현성을 도왔다. 신체 동요에서 변화 패턴의 예는 DSB 동안 측정하며, TLEC 작업은 도 7A 내지 도 7D에 제공한다. 전반적으로, 이들 기능성 측정은 둘 다 낮은 가능성 그룹에 비해 중간 및 매우 가능성이 있는 TBI 그룹에서 증가되었다. 특히, 패턴은 대상체 샘플 둘 다에서 동일하지 않았는데, 대상체의 상이한 그룹을 평가하였기 때문이다(타액과 혈청을 둘 다 제공한 소수의 대상체에 대해 단지 부분적 중복을 가짐). 도 7A 내지 도 7D는 타액 또는 혈청 샘플을 제공하고 3개의 상이한 TBI 가능성 범주(낮음, 중간, 매우 가능성 있음)로 분류된 대상체에서 2종의 상이한 기능성 검사 동안 보인 시합 후 대 시합 전의 신체 동요(body sway)의 일관된 변화의 상자 수염 플롯을 도시한 도면. 동요 측정 중 하나는 인지 작업 수행(역순으로 숫자 외우기(Digit Span Backwards), 상부) 동안 얻어지는 반면, 나머지는 시선 유도 없이 수행되는 균형 검사(눈을 감고 두 발로 서기, 하부) 동안 얻어졌다는 것을 주목한다. 동요의 증가는 낮은 TBI 가능성 그룹에 비해 중등증과 매우 가능성 있는 그룹에서의 측정의 세트 둘 다에 대해 명확하다.
TBI의 확률에 따른 MMA 파이터에서 장애의 분명한 단계적 구배를 나타낸 두 기능성 특정에 추가로, TBI 가능성에 따른 분명한 패턴으로서 나타내지 않은 2종의 다른 유의하게 변화된 기능성 측정이 있었다, 도 8. 이들은 기호 잇기 B 작업(TMB_Bal) 동안의 동요 및 기호잇기 A 작업(TMA_Cog)에 대한 완료 시간의 차이 스코어를 포함하였다. TMB_Bal 작업에 대해, 매우 가능성 있는 그룹에서, 특히 혈청 샘플을 제공하는 대상체에서 상승된 스코어의 제시가 있었지만, 타액 샘플을 제공한 대상체에서 분명하지 않았다, 도 8(A 내지 B, 상부). TMA_Cog 작업에 대해, 패턴을 혼합하였고, 중간 그룹에서 완료 시간에 잠재적 상승이 보였지만, 매우 가능성 있는 그룹에서 변화 없음 또는 약간의 감소가 보였다, 도 8(C 내지 D, 하부). 도 8은 TBI 가능성에 따라 그룹화한 대상체에서 두 상이한 기능성 검사에서 보이는 시합 후 대 시합 전의 신체 동요 또는 완료 시간 스코어의 덜 일치되는 변화를 나타낸다(도 7A 내지 도 7D와 동일한 관례). 혈청(그러나 타액은 아님) 샘플을 취했을 때 TMB_Bal 작업의 매우 가능성 있는 그룹에서 스코어가 약간 상승되었고(상부), 중등증(그러나 매우 가능성 있는 그룹은 아님) 그룹에서 TMA_Cog 스코어(하부)가 약간 상승되었다는 것을 주목한다.
기능성 변화의 연구는 TLEC 작업 및 DSB_Bal 작업 동안 신체 동요의 차이 스코어 측정이 TBI 가능성의 가장 민감한 예측자였다는 것을 나타내었다. 이들 두 변수 간의 상관관계를 시험하였다. 51개 쌍의 측정을 이용하여(K-최근접 이웃 알고리즘으로 대체한 상실 값을 제외), 본 발명자들은 2회의 측정에서 상관관계의 완전한 부재를 관찰하였다(피어슨의 R = 0.00, p = 0.99). 따라서, 작업은 둘 다 TBI의 가능성(즉, 두부에 대한 가격)의 함수로서 균형의 차이에 대해 민감하지만, 그들은 상이한 정보를 분명하게 제공한다. 그러나, 헤드폰을 착용할 필요 때문에 모든 대상체에서 숫자 세기 스코어를 얻는 데 증가된 어려움을 고려하면, TLEC 작업은 실행적 이점을 가진다.
혈청 단백질 바이오마커. 시합 전에 비교되는 시합 직후 24명의 파이터에서 11종 혈청 단백질 수준의 잠재적 변화를 시험하였다. 이들 단백질은 UCHL1, MBP, GFAP(ELISA에 의해 분석) 및 BDNF, CCL2/MCP-1, CRP, ICAM1, IL-6, NSE2, S100B 및 VCAM(맞춤형 루미넥스(Luminex) 분석에 의해 분석)을 포함하였다. 모두 IL-6 샘플 값은 해당 분석에 대해 가장 낮은 표준 농도 미만이었고, 따라서 이 분석물에 대해 이용 가능한 결과는 없었다. 시합 전 샘플에 대한 대다수(21/24)의 S100B 값은 가장 낮은 표준 농도 미만이었다. 그러나, 동일한 파이터로부터의 샘플 중 16개는 S100B 시합 후의 측정 가능한 수준을 가졌다. 이들 16개의 샘플에 대한 변화 규모를 측정하기 위해 그리고 통계학적 비교를 수행하기 위해, 시합 전 농도는 가장 낮은 시합 후 농도 값(22.7pg/㎖)의 절반과 동일하게 설정하였다. 10종 단백질 중에서, 본 발명자들은 시합 후 대 시합 전 4종에 대해 혈청 샘플에서 유의한 쌍별 변화(모두 증가)에 대한 농도를 얻었다. 이들은 GFAP(p = 1.4e-7, 중위 변화% = 33.1%), MBP(p = 0.003, 중위 변화% =65.4), NSE2(p =0.037, 중위 변화% = 50.4), 및 S100B(p = 0.006, 중위 변화% = 747%)를 포함하였다.
각각의 파이터가 받은 두부에 대한 가격 수에 대해 이들 10종 단백질에서 변화의 잠재적 관계를 시험하였다. 바이오마커 중 1종(UCHL1)만이 유의한 회귀를 입증하였다; r2 = 0.7339, 도 9. 그러나, 특히, UCHL1은 유의한 전반적인 후-효과 대 전-효과를 입증하지 못하였다(p = 0.934, 중위 변화% = 1.2). 남아있는 단백질은 0.005 내지 0.09 범위의 r2 상관계수를 입증하였다, 도 10A 내지 도 10I.
miRNA 바이오마커. 총 925종의 miRNA는 합한 타액 및 혈청 샘플에서 RNA-Seq에 의해 신뢰 가능하게 정량화하였고, 하류 분석을 실시하였다. 정량화 후에, 주성분분석(PCA)을 이용하여 통계학적 분석 전에 miRNA 값의 변화를 구형성 및 정규성에 대해 시각적으로 선별하였다, 도 11A 내지 도 11B. 결과는 생체유체 유형과 상관 없이 일반적으로 비편향 데이터 세트를 입증하였고, PCA 축의 클러스터링 및 크기에 기반하여 분명한 이상점이 없었다. 도 11A 내지 도 11B에 나타낸 바와 같이, 통계학적 분석 전에 생체유체 유형 및 TBI 가능성에 따른 샘플 유형의 정규 및 매우 구형의 분포의 주성분 분석(PCA) 입증을 나타낸다. 상부의 이미지(도 11A)는 주요 데이터 클라우드로부터의 매우 가능성 있는 혈청 샘플(녹색/그레이 스케일 박스) 분리의 단지 약간의 제시와 함께, 샘플의 내부 혼합을 도시한 도면. 모든 데이터가 붕괴되었을 때, 변화 값은 고도로 정규의 방식으로 분포된다(도 11B-하부).
다중 검정에 대한 보정 후에(FDR < 0.15), 총 21종의 miRNA는 도 44 및 표 16에 의해 나타낸 바와 같이 TBI 가능성 분류에 따라 유의한 변화를 입증하였다. 이 중에서, 둘은 또한 유체 유형의 상당한 효과를 나타내었고, 둘은 유체 유형 x TBI 가능성의 상호작용 효과를 나타내었다. 도 44는 시합 전에 비해 시합 후에 혈청 및 타액에서 miRNA 발현 변화에 대한 TBI 가능성의 효과를 나타낸다. 총 925종의 miRNA를 시험하였고, 21개는 TBI 가능성의 상당한 주된 효과를 나타내며, 이 중 둘은 또한 유체의 상당한 주된 효과를 나타내었고, 둘은 상당한 유체 x TBI 상호작용을 나타내었다.
특징 선택에 따른 수신부 작동 곡선(ROC) 이원 분류 검정 및 100배 몬테 카를로 교차 검증을 이용하여, TBI 가능성을 예측하는 최고의 능력을 갖는 것을 동정하기 위한 시도에서 miRNA의 추가적인 시험을 수행하였다. 이 경우에, 낮은과 매우 가능성 있는 TBI 그룹을 비교하였다. 추가로, TBI 예측자의 선택은 그들의 발현 변화와 샘플의 총 합계에서 두부에 대한 가격 수 사이의 상관관계(단계적 선형 회귀에 의해 결정한 바와 같음)를 특이적으로 나타내는 해당 miRNA로 제한된다. 이 분석으로부터의 결과는 13종만큼 적은 miRNA를 이용하여, 유체 유형과 상관없이 주어진 샘플에서 TBI 가능성을 예측하기 위한 거의 90% 정확도(AUC = 0.89)를 갖는 다변량 예측 모델을 수득하였다; 도 12 참조. 도 12는 시합 전 기준에 비해 혈청 또는 타액 샘플로부터의 miRNA 발현의 변화에 기반한 TBI 가능성을 예측하는 것의 정확도를 나타낸다. 이들 분석에 대해, 단계적 선형 회귀를 사용하여 두부에 대한 가격(HTH) 값의 예측을 위한 miRNA의 최적 수를 사전 선택하였고, 13종의 이들 세트에 매우 가능성 있음을 낮은 가능성 TBI 샘플과 구별하기 위한 분류 정확도를 추정하기 위해, 랜덤 포레스트를 이용하는 100배 몬테 카를로 교차 검증(MCCV)을 실시하였다.
동정한 miRNA 바이오마커의 타당성을 추가로 확인하기 위해, ROC 분석을 두 상이한 샘플 유형을 합하거나 분리한 로지스틱 회귀 분석으로 실행하였다. 결과는 별개의 로지스틱 회귀 모델(각각의 생체유체에 대해 상이한 베타 상관계수)을 이용할 때 동일한 13종 miRNA가 완전한 분류를 달성하였다는 것을 나타내었다(표 17). 따라서, 혈청과 타액은 둘 다 TBI 가능성에 따라 샘플을 정확하게 분류할 수 있는 miRNA의 하위집단을 함유하지만, 각각에 의해 제공되는 정보는 다소 별개라는 결론을 내렸다.
시합 후 발현의 변화에 의한 혈청 및 타액 중의 21종 miRNA의 일부 예를 도 13A 내지 도 13F에 나타낸다. 흥미롭게도, 이들 miRNA 중 일부는 TBI 후에 생체유체 둘 다에서 증가된 발현 패턴을 나타내었지만(도 13A 내지 도 13B, miR-30b-5p, 상부), 나머지는 단일 생체유체 유형에서 가장 분명한 변화를 나타내었다. 예를 들어, miR-92a-3p(도 13C 내지 도 13D, 중간)는 TBI 후 타액에서 크게 감소된 반면, miR-122-5p(도 13E 내지 도 13F, 하부)는 TBI 후 혈청에서 크게 증가되었다. 도 13A 내지 도 13F는 TBI 후 타액 및 혈청에서의 miRNA 발현 수준의 변화를 도시하는 상자 수염 플롯을 도시한다. 각각의 행은 상이한 miRNA 예(3종의 miRNA를 나타냄)를 나타내고, 각각의 점은 특정 샘플에서 해당 miRNA의 발현 수준을 나타낸다. 일부 miRNA는 TBI 후에 생체유체 둘 다에서 발현 패턴의 증가를 나타내었지만(30b-5p, 상부), 나머지는 단일 생체유체 유형에서 가장 분명한 변화를 나타내었다(예를 들어, 92a-3p 및 122-5p).
변화된 miRNA의 생물학적 맵핑. 다이아나 툴스(DIANA Tools) miRpath v.3(0.05 미만의 FDR 보정 세트)을 이용하는 21종의 유의하게 변화된 miRNA에 대한 변화의 생물학적 적절성을 추가로 연구하였다. 이 분석은 예측된 표적에 기반하였고, 생물학적 경로의 별개의 세트가 상부 miRNA의 표적 유전자에서 과다하게 나타났다는 것을 표시하였다. 유전자와 게놈의 교토 백과사전(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes: KEGG) 데이터베이스 내에 정의된 상위 10개의 경로는 각각의 생체유체에 대해 나타낸 매우 가능성 있는 TBI 대 낮은 TBI의 비교에서 각각의 연관된 miRNA의 순 발현 변화와 함께 나타내었다(표 18). 특히, 모든 풍부한 경로에 걸쳐, 연관된 miRNA는 혼합된 효과를 나타내었는데, 몇몇은 증가되고 몇몇은 감소되었다. miRNA의 절반 초과(n=13)는 2개의 생체유체에서 변화의 혼합된 방향성을 나타내었는데, 하나의 생체유체에서 증가 또는 감소는 다른 생체유체에서 반대의 방향에서의 변화 없음 또는 변화를 수반하였다. 그러나, 7종의 miRNA는 증가된 2종(miR-10b-5p, miR-30b-5p) 및 감소된 5종(miR-3678-3p, miR-455-5p, miR-5694, miR-6809-3p 및 miR-92a-3p)을 포함하는, 2종 생체유체에서 동일한 방향에서의 변화를 나타내었다.
특히, 상위 10개의 순위 KEGG 경로 중에서, 4종은 TBI에 대한 그들의 잠재적 적절함에 대해 특정 관심이 있었다. 이들 경로는 유비퀴틴-매개 단백질 분해, 형질전환 성장 인자-베타(TGF-베타), 축삭 유도 및 글루타메이트 시냅스를 포함하였다. 이들 경로의 각각 내에서, 총 46 내지 80개의 유전자는 miRNA 중 총 20종에 의해 표적화하였다. 이들 발견은 표시된 1종 이상의 miRNA에 의해 표적화된 유전자에 의한 각각의 경로의 맵을 나타내기 위해 DIANA 도구를 추가로 이용하여 시험하였다; 도 14, 도 15, 도 16 및 도 17 참조.
도 14는 KEGG 유비퀴틴-매개 단백질 분해 경로에서 표적 유전자에 대해 변화된 miRNA의 농축도를 나타낸다. 이 경로에서, 80종 유전자는 총 19종 miRNA에 의해 표적화하였다. 1종 miRNA에 의해 표적화된 유전자를 황색으로 나타내고, 유전자 표적화된 1종 초과의 miRNA는 오렌지색으로 나타낸다. 녹색의 유전자는 그들을 표적화하도록 예측된 miRNA를 갖지만, 이들 중 어떤 것도 21종의 변화된 miRNA의 목록에 함유되지 않았다. 백색 유전자는 그들을 표적화하는 예측된 miRNA를 갖지 않는다. 도 15는 KEGG TGF-베타 신호전달 경로에서 표적 유전자에 대해 변화된 miRNA의 농축도를 도시한다(도 10과 동일한 관례). 이 경로는 20종의 miRNA에 의해 표적화되는 것으로 예측된 46개의 유전자를 함유하였다. 도 16은 KEGG 축삭 인도(축삭 유도) 경로에서 표적 유전자에 대해 변화된 miRNA의 농축도를 도시한다(도 10과 동일한 관례). 이 경로는 17종의 miRNA에 의해 표적화되는 것으로 예측된 70개의 유전자를 함유하였다. 도 17은 KEGG 글루타메이트 시냅스 경로에서 표적 유전자에 대해 변화된 miRNA의 농축도를 도시한다(도 10과 동일한 관례). 이 경로는 20종의 miRNA에 의해 표적화되는 것으로 예측된 61개의 유전자를 함유하였다.
miRNA 변화 및 기능성 변화의 상관관계. 최종적으로, 이원 ANOVA로부터의 21종의 가장 유의하게 변화된 miRNA의 관계 및 상부 변화된 기능성 측정뿐만 아니라 실제 두부에 대한 가격 값을 시험하였다. 이 분석은 혈청 miR-4766-5p 수준의 변화와 TLEC 기능성 측정 사이의 단일 명목상의 유의한 음의 상관관계를 나타내었다(표 19). 특히, 이 동일한 miRNA는 또한 혈청에서 그의 변화와 DSB_Bal 검정에서 균형 스코어 차이 간에 약한 양의 상관관계가 있었다. 기능성 결과와 이들 명목상의 유의한 상관관계와 대조적으로, 본페로니(Bonferroni) 보정(타액 miRNA에서 n=7, 혈청 miRNA에서 n=3, 및 합한 샘플에서 n=8)에서 잔존한 실제 HTH 값에 의한 몇몇 고도로 유의한 상관관계를 관찰하였다.
miRNA 변화의 시간적 분석. TBI 가능성에 유일하게 기반한 발현의 변화에 대한 프로빙에 추가로, 본 발명자들은 발현에서의 더 복잡한 그리고 잠재적으로 더 생물학적으로 적절한 변화로 miRNA를 동정하는 것을 추구하였다. 이는 샘플의 시간적 변수 구간화 및 시간 및 샘플 유형을 포함하는 일반적 선형 모델을 통해 달성하였다. 이 접근을 이용하여, 1197종의 검정된 miRNA 중에서, 본 발명자들은 상당한 시간 효과를 갖는 47종의 miRNA, 샘플 유형(유체)의 상당한 효과를 갖는 226종 및 44종은 시간과 유체 사이의 상호작용의 상당한 효과를 발견하였다. 도 37은 혈청 및 타액에서 시간, 유체 및 상호작용 효과에 기인하는 존재비의 변화를 갖는 miRNA를 나타낸다. 목표는 생체유체 중에서 mTBI 사건의 발생을 반영하는 시간적 효과를 동정하는 것이었기 때문에, 본 발명자들은 상당한 시간 효과를 갖는 47종의 miRNA에 대해 배타적으로 중점을 두었다(표 20). 이 중에서, 21종은 유체의 상당한 효과를 가졌고, 20종은 상당한 상호작용 효과를 가졌는데, 이는 그들의 변화가 2종 생체유체에서 상이한 시간적 효과를 나타내었다는 것을 나타낸다. 47종으로부터, 상당히 별개의 패턴을 갖는 25종(표 21)을 동정하였다.
사건 및 가능하게는 분투와 관련된 시합일에 보인 비특이적 변화(그러나 두부에 대한 가격(HTH)은 아님)의 규모를 초과한 시합 후 시점에 급속, 지연된 또는 지속적 효과의 침전 패턴을 갖는 잠재적 바이오마커를 동정하기 위해 상당한 변화된 miRNA의 시간적 패턴의 육안 검사를 사용하였다. 이 절차를 위해 두 가지 기준을 사용하였다: 시합 후 시점 중 하나 이상에서 변화 규모는 1.3배(+/- 0.28의 log2 변화)를 초과하였을 뿐만 아니라 HTH가 없는 그룹에서의 변화 규모를 적어도 2배까지 초과하였다. 이들 두 단순한 기준은 생체유체 샘플에서 매우 별개의 패턴을 갖는 miRNA의 2개 세트를 나타내었다. miRNA의 제1 세트는 시합 직후 타액에서 급속 증가를 나타내었고, 이어서, 시합 후 제2일 내지 제3일 및 1주에 정상 수준으로 복귀되었다. 이 패턴은 주로 타액 샘플에서 분명하였고, 유의한 ANOVA 효과로 47종의 miRNA 중 12종을 정확하게 기재하였다(도 38a). 이들은 급속 타액 반응(ASR) miRNA로 지칭하였다. 현저하게는, 이들 동일한 miRNA는 혈청 샘플에서 별개로 상이한 변화 패턴을 입증하였다. 구체적으로, 시합 후 2 내지 3일에 시작해서, 어떤 것도 증가되지 않았고, 소수는 변화를 나타내지 않았고, 몇몇은 지연된 감소를 나타낸다(도 38b).
두 번째 패턴은 보통은 시합 후 1주에 최대에 도달되는 제2일 내지 제3일에 발현의 등급화된 증가 또는 감소인 지연된 효과였고, 초기 시합 후 시점에 존재하지 않았다. 이 패턴은 혈청 샘플에서 매우 분명하였고, 47종의 miRNA 중 13종에서 정확하게 기재하였다(도 39a). 이들은 지연된 혈청 반응(DSR) miRNA로 지칭하였다. 특히, 이들 동일한 miRNA는 타액 샘플에서 유사한 패턴을 나타내지 않았다. 오히려, 대부분은 잠재적으로 비특이적인 또는 운동-관련 변화를 포함하는 더 조기의 시점에 변화되지 않거나 보통으로 증가된 발현 경향을 나타내었다(도 39b).
중추 신경계 공급원으로부터의 방출을 반영하도록 타액 및 혈청 miRNA에 대한 잠재력을 확인하기 위해, miRGator3.0 도구를 사용하였다. 다중 CNS 공급원에 걸쳐 그의 중위 표현이 miRGator 3.0 데이터베이스에서 31종 비신경 기관 및 51종 비신경 조직 중 어떤 것에서 중위 표현을 초과한다면, miRNA는 "뇌에서 농축됨"으로 고려하였다. 이용 가능한 맵핑 정보로 11종의 ASR miRNA 중에서, 뇌에서 농축되었기 때문에 4종을 동정하였는데, 이는 시합 후 1시간 내에 증가된 타액 miRNA에 대해 가능한 CNS 기점을 시사한다(표 20). 이 발견은 DSR miRNA와 대조적으로 나타나는데, 이용 가능한 맵핑 정보로 11종의 혈청 miRNA 증상 중에서, 1종만이 뇌에서 농축되는 것을 발견하였다(표 20).
도 38a 내지 도 38b는 비특이적 운동- 또는 사건-관련 시점(녹색 음영 영역)을 초과하는 타액 샘플(상부)에서 시합 후 1시간 시점(청색 음영 영역)에 급속 시간적 효과(모두 증가)를 갖는 12종의 miRNA가 동정되었다는 것을 나타낸다. 대부분의 miRNA는 시합 후 2 내지 3일까지 기준 근처로 복귀된다는 것을 주목한다. 동일한 miRNA에 대한 패턴은 혈청과 별개로 상이하였다(몇몇은 변하지 않았고, 몇몇은 감소가 지연되었다). 도 39a 내지 도 39b는 비특이적 운동 또는 사건-관련 시점(녹색 음영 영역)을 초과하는 시합 후 1주(상부, 청색 음영 영역)에 혈청 중에서 우세하게 지연된 증가(실선) 및 감소(파선)로 동정된 miRNA를 도시한다. 이들 miRNA는 변화되지 않거나 타액 중의 비특이적 증가에 대한 일부 증거를 나타내었다는 것을 주목한다(하부).
TBI -관련 급성 또는 지연된 변화로 miRNA의 생물학적 맵핑. 타액에서의 주목할 만한 증가를 갖는 12종 miRNA에 대한 발견의 생물학적 적절성은 시합 후 결정적인 1시간 시점에 추가로 연구하였고, 13종 miRNA는 시합 후 1주에 최대인 지연된 변화(증가와 감소 둘 다)를 갖는 혈청에서 동정하였다. 이 분석은 DIANA Tools miRpath 3.0을 이용하여 수행하였고, 상부 15종의 KEGG 경로 농축도를 miRNA의 각각의 세트에 대해 동정하였다. 급속 타액 반응의 예측된 표적에서 농축된 경로 중에서, miRNA는 프라이온병, 장기간 우울증, 글루타메이트 시냅스, 축삭 유도, 암페타민 중독 및 코카인 중독을 비롯한, 뇌 기능과 관련된 몇몇이 있다(표 22). 이들 miRNA는 모두 증가되었기 때문에(적색의 상향 화살표로 나타냄), 연루는 이들 뇌-관련 경로의 각각(및 열거된 다른 것)은 잠재적으로 억제되는 것이다.
뇌 기능과 관련된 몇몇 KEGG 경로는 축삭 유도, 장기간 강화작용 및 글루타메이트 시냅스를 비롯한 지연된 혈청 반응 miRNA의 예측된 표적에서 농축된 것 중에 있었다(표 23). 이들 miRNA 중 일부는 증가되었고 나머지는 감소되었기 때문에(각각 적색 화살표 및 녹색 화살표), 이들 발견의 결과를 해석하는 것은 더 어렵다.
특히, 표 22 및 표 23에서 miRNA 표적이 농축된 경로 중 몇몇은 서로 동일하거나 고도로 관련되었다(예를 들어, 장기간 우울증 및 장기간 강화작용). 이들 유사한 농축 발견은 선택되는 경로 내의 유전자 수준으로 시험하였다.
직접 비교한 제1 경로는 글루타메이트 시냅스 경로였다, 도 40. 다수의 동일한 유전자는 타액 또는 혈청에서 발견된 miRNA에 의해 표적화되었다는 것을 주목하였다. 중복 표적에 대한 일부 제외는 SLC1A2/EAAT2(유일하게 급성 반응 타액 miRNA에 의해 표적화됨) 및 글루타미나제/GLS2 및 소포 글루타메이트 수송체/SLC17A7(유일하게 지연된 반응 혈청 miRNA에 의해 표적화됨)을 포함하였다.
글루타메이트 시냅스 경로 발견과 관련하여 가능하게는, 또한 학습 및 기억에 연루된 2종의 뇌-관련 경로(장기간 우울증(Long-term depression: LTD; 급속 반응 타액 miRNA에 의해 표적화됨) 및 장기간 강화작용(Long-term potentiation: LTP; 지연된 반응 혈청 miRNA에 의해 표적화됨) 상에서 타액 및 혈청 유래 miRNA의 잠재적으로 모순적인 작용의 증거를 발견하였다, 도 41a 내지 도 41b. 이들 두 생물학적 과정은 시냅스 가소성 과정에 중요한데, LTP는 시냅스 후 글루타메이트(AMPA) 수용체의 삽입을 촉진시키고 시냅스 성장을 향상시키는 한편, LTD는 AMPA 수용체를 내재화하고 시냅스 후 반응을 감소시키는 작용을 한다. 도 40a 내지 도 40b는 KEGG 글루타메이트 시냅스 경로에서 표적 유전자에 대해 변화된 miRNA의 농축도를 도시한다(도 10과 동일한 관례). 타액 miRNA와 혈청 miRNA는 둘 다 이 경로에서 다수의 동일한 유전자를 표적화한다는 것을 주목한다. 도 41a 내지 도 41b는 타액(장기 억압, 상부), 및 혈청(장기 증강, 하부)으로부터의 학습 및 기억에 수반된 경로에서 시간적으로-조절된 miRNA의 농축도를 나타낸다(도 10과 동일한 관례).
기능성 및 miRNA 데이터에서 시간적 패턴의 조합된 분석
타액. 본 발명자들은 타액 및 혈청 miRNA 데이터에서 시간적 변화를 동정할 수 있었기 때문에, 특정 시점에 가장 큰 변화를 나타내고 ASR 또는 DSR miRNA와 상관관계가 있는 것을 검출하기 위한 균형 및 인지 스코어 데이터를 또한 시험하였다. 기능성 데이터를 갖는 39종의 시합 후 타액 샘플에서 총 12종의 ASR miRNA 및 14종의 기능성 측정에 대해 PCA를 이용하여 이를 처음 수행하였다. 본 발명자들의 결과는 3종 인자가 합한 데이터에서의 변량의 대략 절반을 설명하였다는 것을 나타내었다. 일부 miRNA 및 기능성 측정을 다중 성분에 대해 강하게 부하하였지만, 인자 1은 9/12 miRNA 및 4회의 기능성 측정의 최대 부하 성분이었다(표 24). 특히, 대부분의 인자 1 부하 타액 miRNA는 증가된 신체 동요를 나타내는 몇몇 기능성 측정과 함께 큰 양의 가중치를 나타내었다. 대조적으로, 1 타액 miRNA만이 감소된 인지 수행을 나타내는 다수의 기능성 측정(TMA_COG, TMB_Dual_COG, 및 TMB_COG)과 함께 인자 1에 대해 큰 음의 가중치를 나타내었다. 이들 데이터의 그래프 디스플레이는 시합 직후 시점 이외의 시간에 걸쳐 감소된 신체 동요 증거와 함께 균형 측정 중 하나에서의 가능성 있는 학습 효과(TLEOFP)를 나타내었다(도 42).
도 42는 급성 타액 반응 miRNA와 상관관계가 있는 기능성 측정을 도시한다. 실선은 인지 측정을 나타낸다(더 높은 값은 더 양호한 수행을 나타낸다). 파선은 정규화된 신체 동요 측정을 나타낸다(더 높은 값은 더 불량한 수행을 나타낸다). 인지 측정이 시합 후 1시간 시점에 수행의 하락에 대한 경향을 나타낸 반면, 신체 동요는 동일한 시점에 증가를 나타낸다는 것을 주목한다. 또한 인지 측정 중 둘(TMB_COG 및 TMB_Dual_COG)은 분명한 학습 효과를 나타낸다는 것을 주목한다(시합 직후 시점 이외에 시간에 따라 개선된 수행). 학습 효과는 또한 시합 직후 시점 이외에, 시간에 따른 감소된 신체 동요와 함께 균형 측정(TLEOFP) 1로 보였다.
혈청. 시간적 효과를 확인한 혈청 miRNA는 시합 후 2 내지 3일 및 1주에 보이는 증가 및 감소와 함께 지연된 변화를 나타내는 경향이 있었다. 따라서, 이들은 31개의 총 샘플로부터의 조합된 데이터에 대한 PCA를 이용하여 타액 miRNA와 별개로 시험하였다. 이는 발현의 지연된 감소를 나타낸 3종 miRNA(miR-139-5p, miR-30c-1-3p, miR-421) 및 6종 miRNA(miR-6809-3p, miR-5588-5p, miR-3678-3p, miR-4529-3p, miR3664-3p 및 miR-4727-3p) 및 지연된 증가를 나타낸 4종의 기능성 측정(TSEO, DSB_Bal, TMB_DualBal)에 대한 강한 상호 부하를 나타내었다(표 25; 도 43). 특히, 이들 기능성 측정 중 하나는 분명한 학습 효과(TSEO)를 나타내었고, 하나는 또한 급속 반응 타액 miRNA(DSB_Bal)와 고도로 관련되는 것으로 확인하였다.
도 43은 지연된 혈청 반응 miRNA와 상관관계가 있는 기능성 측정을 나타낸다. 실선은 후속적으로 시합 후 2 내지 3일에 증가된 동요를 나타낸 분명한 학습 효과(HTH가 없는 대조군 및 시합 후 1시간 시점에서 감소된 동요)를 갖는 균형 측정(TSEO)을 나타낸다. 파선은 지연된 효과(TMB_Dual_Bal) 또는 급속 + 지연된 효과(DSB_Bal)를 갖는 2종의 균형 측정을 나타낸다.
본 발명의 연구에서, 본 발명자들은 mTBI 또는 스포츠-관련 뇌진탕 또는 두부 충격 가능성을 정확하게 예측할 수 있는 진단적 측정을 확립하는 목표와 함께, 기준 그리고 MMA 사건 후 다양한 시점 둘 다에서 젊은 성인 운동선수에서 타액과 혈청 분자 측정 및 신경인지와 균형 측정을 연구하였다. 이는 4종 상보적 접근을 이용하여 수행하였다. 첫째로, 본 발명자들은 한차례 MMA를 받은 두부에 대한 가격 수에 기반하여 mTBI 확률에 대한 대상체를 변수 구간화하였고, 기존 문헌의 주장에 기반하여, 대상체의 하위집단에서 잠재적 혈청 단백질 바이오마커의 세트를 분석하였다. 단백질 데이터는 잠재적 바이오마커 중 하나(UCHL1)만이 두부에 대한 가격 수와 정량적으로 관련된 변화를 나타낸 반면, 다른 바이오마커는 잠재적으로 운동 효과에 기인하여 비특이적 증가를 나타낼 수 있다는 것을 나타내었다. 이어서, 본 발명자들은 저확률 뇌진탕 샘플을 고확률 뇌진탕 샘플과 구별할 수 있는 다른 잠재적 측정을 동정하기 위해 혈청 및 타액 miRNA 데이터뿐만 아니라 이원 ANOVA 및 ROC 곡선 분석을 이용하는 신경인지 및 균형 측정을 시험하였다. 다음에, 본 발명자들은 반복 측정 ANOVA를 이용하여 miRNA 데이터를 시험하였고 한 차례 MMA에 대해 급속 또는 지연된 시간적 효과를 갖는 분자 바이오마커를 나타내었다. 이는 패턴이 두 생체유체에서 상이한 경향을 나타내었지만, 타액과 혈청 miRNA 둘 다에 대해 참이었다. 가장 정보성의 바이오마커는 정량 가능한 기능성 측정에서의 변화와 관련된 것이라는 것을 느꼈기 때문에, 이어서, 본 발명자들은 급속-반응성 타액 miRNA 및 지연-반응성 혈청 miRNA와 관련된 기능성 측정에서 시간적 패턴을 묘사하기 위해 조합 데이터의 PCA 분석을 사용하였다. 이는 실행-관련 개선의 존재에도 불구하고, 또한 급속 또는 지연된 효과를 나타내는 경향이 있는 선택되는 타액 또는 혈청 바이오마커와 기능성 측정의 별개의 세트 간의 강한 관계를 확인하였다. 전반적으로, 이들 결과는 mTBI에서 분자 및 기능성 마커의 연구가 엄격히 수행되고 데이터에서 잠재적 학습효과를 확습하기에 충분한 빈도로 샘플링된 민감한 측정을 편입하여야 한다는 것을 나타낸다. 게다가, 이들 데이터는 또한 mTBI에 가장 민감한 바이오마커가 강한 생물학적 연루를 가질 수 있다는 것을 나타낸다.
기능성 결과 측정. 기준에서 또는 스포츠 관련 뇌진탕 후 대상체를 평가하기 위해 수많은 균형 측정을 사용하였다. 시험은 몇몇 상이한 유형의 균형, 컴퓨터화된 가속도계 및 태블릿 장치를 이용하는 측정을 포함하였다. 본 발명자들은 또한 균형의 이중 작업 평가를 추가한 한편, 대상체는 인지 작업 및 순수하게 인지 요구를 갖는 작업을 완료하기 위한 요구에 집중하지 못하였다. 평가 시간에 관련 없이 14종 상이한 측정의 본 발명자들의 초기 분석은 눈을 감은 채로 두 다리로 서기(TLEO) 작업 및 역순으로 숫자 세기 균형 검사(DSB_Bal) 및 기호잇기 B 이중 작업 균형 검사(TMB_Dual_Bal)를 포함하는 2종의 이중 작업을 비롯한 3종 측정이 mTBI 가능성에 잠재적으로 민감하다는 것을 나타내었다. 본 발명자들은 또한 기호잇기 A 인지 검사(TMA_Cog)가 mTBI 가능성에 대해 잠재적으로 민감하다는 것을 발견하였다.
mTBI를 갖는 대상체에서 균형 또는 신경인지 기능 변경의 다수의 문헌 보고가 있었지만, 기준 및 시간-과정 데이터의 편입이 유리한 것은 매우 소수였다. 본 연구에서, 기능성 측정에 대한 시간적 효과는 상이한 시점에 대상체의 주로 상이한 세트의 사용 및 그들의 본질상 대상체-의존적인 잠재적 학습 효과의 존재에 기인하여 형식적 반복 측정 ANOVA 처리하지 않았다. 그럼에도 불구하고, 시간에 따른 기능성 데이터의 본 발명자들의 PCA 분석은 일부 측정에서 상당한 학습 효과의 존재뿐만 아니라 가장 큰 변화를 입증한 시점의 차이를 확인하였다. 이들 관찰은 일부 균형 측정, 특히 높은 이중 작업 인자 요구를 수반하는 것, 예컨대 TMB_Dual_Bal 및 DSB_Bal이 급속보다는 다소 지연된 시점에 그들의 최대 효과를 나타낼 수 있다는 것을 시사한다(도 43). 대조적으로, MMA 시합의 1시간 내에 수행한 급속 시점 평가는 가장 민감하고 신뢰 가능한 측정이 몇몇 단순한 균형 측정(예를 들어, TSECFP)뿐만 아니라 인지 측정(TMA_Cog, TMB_Dual_Cog)을 포함한다는 것을 나타내었다(도 42). 다른 균형 검사는 시합 직전에 비해 시합 후 신체 동요의 증가를 나타내었지만, 그들은 또한 시간에 따른 전반적인 감소된 동요의 변화하는 정도, 특히 학습 효과를 나타내는 것으로 나타난 TLEOFP를 보여주었다. 이 작업 성능의 개선은 자세 안정성을 조절하도록 돕는 시각적 피드백 신호를 사용하는 대상체의 능력을 고려하면 놀랍지 않을 수도 있다. 대조적으로, TSECFP 작업은 대부분의 어려운 작업을 나타낼 가능성이 있으며, 대상체는 자기 수용 신호만을 사용할 수 있지만, 시각적 정보는 사용하지 않으며, 이는 시간에 따른 임의의 명백한 개선을 입증하지 않았다.
기호잇기 A 및 B 검사는 인지 수행을 평가하기 위해 널리 사용되었고, 최근의 연구는 mTBI를 갖는 대상체에서 수행을 시험하기 위한 이들 검사의 컴퓨터화된 형태를 실행하였다. 시험 둘 다 TBI에 대해 민감하였지만, 이러한 작업은 기호잇기 B 검사(그러나 A 검사는 아님)에서 상당한 학습 효과를 관찰하였다. 본 발명자들의 데이터는 그들이 또한 검사에 사전 노출된 대상체에서 기호잇기 수행의 시험을 위한 최적의 시점일 수 있다는 것을 나타내는 이들 발견과 일치한다.
분자 결과 측정:
단백질 바이오마커. 인간 대상체와 설치류 모델 둘 다에서 수많은 연구는 mTBI 및 더 흔하게는 중증의 TBI와 관련하여 상이한 혈청 단백질의 잠재적 효용을 시험하였다. 본 발명자들은 시합 직전 및 시합 후에 얻은 본 발명자들의 MMA 파이터 샘플의 하위집단에서 11종 잠재적 바이오마커의 세트를 시험하였다. 이들 단백질 중 일부는 시합 전에 비해 시합 후에 상승을 나타내었지만, 이는 대상체가 다수의(또는 임의의) 두부에 대한 가격을 경험하였는지의 여부와 상관없이 대체로 ㅊ 참이었다. 이에 대한 유일한 예외는 UCHL1이었는데, 이는 두부에 대한 가격 수와 상관관계가 있는 시합 후 증가를 나타내었다. 흥미롭게도, UCHL1에 대한 문헌은 상이한 연구에서 다수의 변화 보고를 함유하지만, 이는 균일한 발견이 아니며 다수의 연구는 또한 발현의 감소 또는 mTBI 후 변화의 결여를 주장하였다. 본 발명자들의 데이터는 혈청에서 UCHL1의 증가된 발현이 mTBI의 가장 중증의 사례(즉, 30회 이상의 두부에 대한 가격이 있는 MMA 파이터)에서만 관찰될 수 있다는 것을 나타낸다. 특히, 뇌진탕에 대한 혈액 검사는 UCHL1 및 GFAP의 측정을 수반하는 미국식품의약국에 의해 최근에 승인되었다[https://_www.fda.gov/newsevents/newsroom/pressannouncements/ucm596531.htm].
miRNA 바이오마커 . 10대 아동에서 TBI에 대한 최근의 작업을 비롯한, miRNA를 이용하는 mTBI의 잠재적 혈액 또는 다른 생체유체 측정에 대해 공개된 몇몇 인간 연구가 있었다. 이들 연구는 일반적으로 mTBI 및 대조군 대상체의 횡단 비교에서 단일 시점의 시험에 중점을 두거나, 다중 시점에 걸쳐 소수의 miRNA의 시험에 중점을 두었다. 매우 소수의 연구는 운동- 또는 비-두부 손상(예를 들어, mTBI에서 근골격 손상 대조군)을 이용하였다. 실험실 동물에서 다른 연구는 일반적으로 설치류를 수반하였고, 종종 다중 시점 또는 중증의 TBI에 더 유사한 개방 TBI 절차를 사용하였다. 개방 절차는 정상 환경에서 경증의 TBI에서 생기는 것의 범주 이상인 조건을 분명하게 도입한다. 본 발명자들의 연구는 miRNA 데이터에 대한 mTBI 중증도 및 시간의 문제를 연구하고 당해 분야에서 기능성 데이터 및 이전의 발견의 내용 내에 변화를 두기 위한 시도를 하였다.
대다수의 본 발명자들의 후보 miRNA 바이오마커는 이전의 문헌에서 보고되지 않았다. 각각의 miRNA 및 기능성 결과 측정을 정규화하기 위한 기준 시점의 본 발명자들의 사용은 검출을 위한 더 큰 민감도를 생산할 가능성이 있다. 그러나, 본 발명자들의 후보 mTBI 바이오마커 중 몇몇은 앞서 보고되었다. 이들 miRNA 바이오마커는 동일한 miRNA 유전자로부터 유래된 정확한 매치 또는 고도로-관련된 매치로서 구체화될 수 있다. 본 발명자들이 두부에 대한 가격과 관련된 변화로 검출한 miRNA 중에서, 12종은 신규하였고, 9종은 TBI의 이전의 연구에서 동정한 것에 대해 정확한 매치이거나 고도로 관련된다. 본 발명자들의 데이터에서 확정적인 시간-과정 변화를 갖는 miRNA 중에서, 17종은 신규하고, 7종은 TBI의 이전의 연구에서 보고된 것과 정확한 매치이거나 고도로 관련된다(표 26). 특히, 본 발명자들이 동정한 현재의 miRNA 중 3종은 동일하였고, 3종은 경증의 TBI를 갖는 아동으로부터의 타액에서 변화된 바와 같이 이전에 보고된 것에 고도로 관련되었다(표 26). 게다가, 몇몇의 정확한 그리고 고도로-관련된 매치는 또한 인간 또는 설치류뿐만 아니라 인간 CSF 또는 설치류 뇌 조직에서 말초 혈액을 샘플링한 TBI의 연구에서 발견되었다.
본 발명자들은 중추 신경계(CNS)와 주변 위치 사이의 miRNA 수송에 고도로 흥미를 가진다. 혈액 뇌 장벽(blood brain barrier: BBB) 붕괴는 TBI 중증도의 모든 수준에서 일어나기 때문에, 이는 일반적으로 혈청 바이오마커가 영향받은 개체의 CNS에서 생기는 병리학적 과정의 간접적 판독으로서 작용할 수 있다는 것으로 이해된다. 그러나 덜 명확한 것은 뇌 기능의 변화가 타액에서 반영될 수 있는 방법이다. 두 잠재적 경로는 가치있는 특징이다. 처음에, 뇌 줄기는 침샘 및 혀의 신경을 분포시키는 감각(V, VII, IX) 및 운동(XII, X, XII) 뇌신경을 통해 잠재적 CNS-대-구강 경로를 제공한다. CNS로부터 타액까지의 유사한 전달 기전이 광견병 바이러스 감염에서 일어나되, 바이러스는 근육으로부터 뇌까지 그리고 종국적으로 침샘의 신경을 분포시키는 뇌신경까지 이동한다. 이는 완전히 특성 규명된 채로 남아있지만, 입에 대한 miRNA 전달에 대한 제2 경로는 글림프 시스템을 통한 느린 수송을 수반한다.
실시예 3
TBI에 대한 타액 miRNA의 예측 효용 및 TBI로부터의 회복
연구 집단. 연구는 mTBI의 임상 진단으로 연령 7 내지 21세의 대상체를 포함하였다. mTBI 그룹은 초기 두부 손상의 14일 내에 mTBI의 평가를 위해 펜실베이니아 주립대학교 허시 의료 센터(Penn State Hershey Medical Center)에 있는 61명의 아동 및 청소년으로 구성하였다. 이 14일 컷오프 기간은 대부분의 임상 증상 및 바이오마커 프로파일이 뇌진탕의 2주 내에 기준으로 복귀된다는 것을 나타내는 이전의 연구에 기반하여 선택하였다(McCarthy et al., 2015). 손상 시 12 이하의 GCS, TBI의 임상 진단, 침투성 두부 손상, 두개골 골절, 두개강 내 출혈 또는 우울증 또는 불안감에 기인하는 증상으로 고통받는 것을 갖는 대상체를 배제하였다. 추가적인 배제 기준은 영어 이외의 주 언어, 병동 상태, 치주 질환, 상기도 감염증, 중심 신경 결손, 편두통 이력 및 약물/알코올 남용이었다.
데이터 수집. 연령, 체중, 신장, 성별, 민족, 의학/식품 알레르기, 정신의학적 이력, 자각 신경 결핍, 의약 이력 및 현재의 구강인두 상태(예를 들어, 계절성 알레르기, 치과용 충전제)를 포함하는 각각의 대상체에 대한 의학적 및 인구통계학적 특징을 기록하였다. 뇌진탕 이력을 또한 기록하였다: 손상 이후의 시간, 손상 기전, 즉각적인 증상(기억 상실증, 의식 상실, 구토, 발작, 골절 또는 쇠약), 마지막 진통제 사용 시간(비스테로이드성 항-염증 또는 아세트아미노펜), 및 이전의 뇌진탕 이력. 인지 및 신체 뇌진탕 증상을 평가하기 위해, 아동 SCAT-3의 증상 평가 부분을 등록 시 각각의 대상체 및 그들의 부모에 투여하였다(Kirkwood et al., 2006). 아동 SCAT-3에 의한 증상의 재평가를 위해 처음 손상일의 4주 후에 전화를 통해 대상체와 부모에 접촉하였다. 4주에 자기- 또는 부모-보고 중 하나에서 SCAT-3 스코어가 5 이상인 30명의 대상체는 PCS를 갖는 것으로 분류하였다. 가능하다면, 후속 임상 방문 시 전자 의학적 보고의 검토를 통해 PCS의 존재를 확인하였다. 남아있는 대상체는 급성 뇌진탕 증상(ACS)을 갖는 것으로 분류하였다. 4주에 PCS를 갖는 해당 대상체는 추가적인 SCAT-3 전화 평가를 위해 8주에 다시 접촉하였다. 4주에 후속 SCAT-3 인터뷰를 완료하지 못하고 후속 임상 방문이 결여된 7명의 대상체를 연구로부터 배제하였다.
RNA 수집, 가공 및 정량화. 입을 수돗물로 헹군 후에 식후 상태에서 등록 시 객담을 통해 각각의 대상체로부터 타액을 수집하였다. 각각의 대상체는 오라진 RE-100 타액 수집 키트(DNA 게노텍; 캐나다 오타와에 소재)에 객담을 뱉었다. 샘플을 손으로 5 내지 10회 진탕시키고 나서, 4℃ 냉장고에 전달 전에 10일까지 동안 실온에서 저장하였다. 본 발명자들이 앞서 보고한 바와 같이 제조업자 설명서에 따라 노르겐 순환 및 엑소좀 RNA 정제 키트(캐나다 온타리오주에 소재한 노르겐 바이오텍)로 RNA를 추출하였다(J. Head Trauma Rehabil., 1993). 나노드롭 분광광도계(Nanodrop Spectrophotmeter)로 RNA 농도를 정량화하였고, 서열분석 전에 -80℃에서 저장하였다. 라이브러리 구성 전에 애질런트(Agilent) 2100 바이오애널라이저로 RNA 수율 및 품질을 평가하였다. 넥스트플렉스(등록상표) 작은 RNA-Seq 키트 v3(바이오 사이언티픽(Bioo Scientific); 미국 텍사스주 오스틴에 소재), 일루미나 HiSeq(등록상표) 2500 기기 및 샘플당 3백만 판독의 표적화된 깊이를 이용하여 미국 펜실베이니아주 게놈학 핵심 연구지원 시설(Penn State Genomics Core Facility)에서 타액 RNA의 서열분석을 하였다. SHRiMP2 얼라이너를 이용하여 파테크 플로우(Partek Flow) 소프트웨어(파테크; 미국 미주리주 세인트 루이스에 소재)를 이용하여 인간 게놈의 hg38 구성에 대해 판독을 정렬하였다. 각각의 샘플 내의 총 miRNA 계수치를 miRBase 마이크로RNA v21로 정렬하였다. 2.5×104개 미만의 총 miRNA 계수치를 갖는 3개의 타액 샘플을 최종 분석으로부터 제외하여, 52개의 최종 mTBI 샘플을 생성하였다. 샘플의 적어도 22/52(42%)에서 10개 초과의 원 판독 계수치를 갖는 miRNA만을 차별적 발현 분석에서 평가하였다. 이 기준은 PCS를 갖는 대상체의 비 및 PCS 또는 ACS 그룹에서만 존재할 수 있는 확률에 기반하였다. 통계학적 분석 전에, 원 판독 계수치를 사분위수 정규화시키고, 평균중심화시키고 나서, 각각의 변수의 표준편차로 나누었다.
통계학적 분석. 보고된 메타보애널라이트(Metaboanalyst) 온라인 소프트웨어를 이용하여 통계학적 분석을 수행하였다(J. Head Trauma Rehabil., 1993). PCS와 ACS 그룹 간에 차별적 발현을 갖는 타액 miRNA는 위검출률(FDR) 보정과 함께 비모수 맨휘트니 검정을 이용하여 동정하였다. 2차원 부분적 최소 제곱 판별분석(PLSDA)을 사용하여 소아 PCS에서 타액의 miRNA 프로파일의 예후 잠재력을 연구하였다. 각각의 차원의 설명된 변량을 고려하는 PLSDA 가중치 제곱의 가중치 부여된 합계인 변수 중요도 척도(variable importance in projection: VIP)를 각각의 miRNA에 대해 결정하였다. 가장 큰 VIP 스코어를 갖는 15종의 miRNA를 보고하였다. 다변량 로지스틱 회귀 분석을 사용하여 PLSDA로부터의 15종 miRNA의 PCS 예측 정확도를 평가하였다. 회귀에서 miRNA의 농도를 비로서 이용하여, 샘플에 따른 총 miRNA에서의 변량에 대한 대조군의 제2 수준을 제공하였다. 수신부 작동 특징 플롯에 대해 곡선하면적(AUC)을 측정함으로써 정확도를 결정하였고, 100배 몬테 카를로 교차 검증 기법으로 검증하였다. miRNA 그룹을 수행하는 상부에 대한 AUC를 3종 임상 측정에 대한 AUC에 비교하였다: 1) SCAT-3의 아동-반응 부분에 대한 총 증상 스코어; 2) SCAT-3의 부모-반응 부분에 대한 총 증상 스코어; 및 3) 제멕(Zemek)과 동료들에 의해 앞서 기재된 바와 같은 성별, 연령, 사전 뇌진탕 이력, 두통, 피로, 처리의 어려움 및 편두통 이력을 이용하는 변형된 PCS 위험 스코어(Babcock et al., 2013). 이 마지막 도구는 균형 오차 스코어의 부재 및 소음에 민감함의 평가에 의해 부분적으로 제한된다는 것을 주목하여야 한다. 15종 타액 miRNA(손상 시 측정)와 PCS 특징(손상 후 4주에 측정) 사이의 관계를 피어슨 상관 시험으로 평가하였다. 타액 miRNA와 의학/인구통계학적 변수 사이의 잠재적 혼재 관계를 시험하기 위해 피어슨 상관관계를 또한 사용하였다. PCS 및 ACS에 걸친 의학적 및 인구통계학적 데이터의 분석을 양측 스튜던트t-검정으로 달성하였고, p-값 <0.05은 그룹 간에 유의하게 상이한 것으로 고려하였다. DIANA mirPath v3 온라인 소프트웨어(하이퍼 텍스트 전송 규약 시큐어(HTTPS)://snf-515788.vm.okeanos.grnet.gr/)를 이용하여 뇌 손상 및 수선에 대한 기능적 적절성에 대해 상위 15종 miRNA를 연구하였다. 각각의 miRNA에 대한 인간-특이적, 고 신뢰도 유전자 표적을 DIANA의 마이크로T-CDS 알고리즘(0.90의 표적 컷오프 스코어를 사용)으로 동정하였다(Barlow et al., 2011). miRNA 유전자 표적(FDR < 0.05; 피셔의 정확성 검정)에 의해 과다하게 나타난 유전자 온톨로지(GO) 및 KEGG 경로 범주를 보고하였다.
참여자. 52명의 참여자(평균 연령 14세; 42% 여성)를 분석에 포함시켰다. 인구통계학적, 의학적 또는 뇌진탕 특징에서 ACS(n=22)와 PCS 그룹(n=30) 간의 차이는 없었다(표 27). 대다수의 참여자는 백인이었고, 25% 초과는 타액 수집의 6시간 내에 비스테로이드성 항염증 약물 또는 아세트아미노펜을 사용하였다. 15%의 대상체는 등록 시 자극제 또는 선택적 세로토닌 재흡수 저해제를 취하였다. 대다수의 참여자는 그들의 뇌진탕의 1주 내에 등록하였고, 대부분의 통상적인 손상 기전은 스포츠(42%) 및 자동차 충돌(15%)이었다. 거의 절반은 이전의 뇌진탕(46%)으로 고통받았다. 손상 시 가장 통상적으로 보고된 증상은 기억 상실증(48%) 및 의식 상실(27%)이었다.
증상 보고
아동 SCAT-3의 증상 평가 부분은 추가 평가 시(손상의 2주 내에) 그리고 손상 후 4주에 다시 모든 참여자 및 그들의 부모에 투여하였다(표 28).
뇌진탕 증상
집단 평가 ACS PCS P-값
등록 시(손상 후 0 내지 14일)
아동 증상 중증도 스코어 23 19 26 0.044
보고된 아동 총 증상(#) 12 11 13 0.105
나는 집중하는 시간이 힘들다 1.6 1.2 1.9 0.030
나는 사람들이 나에게 말한 것을 기억하는 데 문제가 있다 1.3 0.9 1.6 0.027
나는 몽상을 너무 많이 한다 1.2 0.8 1.4 0.047
나는 두통을 가진다 2.2 1.7 2.5 0.005
나는 매우 피곤하다 1.7 1.1 2.1 0.001
부모 증상 중증도 스코어 22 20 23 0.297
보고된 부모 총 증상(#) 12 11 13 0.216
아동이 집중하는 데 어려움이 있다 1.5 1.1 1.8 0.018
아동이 어지러움을 느낀다 1.3 1.0 1.6 0.045
4-주 후속(손상 후 28 내지 34일)
아동 증상 중증도 스코어 11 0.8 18 7.0E-15
보고된 아동 총 증상(#) 6.9 0.8 11 1.6E-7
나는 매우 피곤하다(양성%) 0.9 0 (0) 1.6 (90) 5.9E-6
나는 쉽게 피곤해 진다(양성%) 1.0 0.2 (18) 1.6 (85) 5.9E-6
부모 증상 중증도 스코어 8.8 0.5 13 0.005
보고된 부모 총 증상(#) 4.6 0.3 7.1 3.8E-4
8주 후속(손상 후 56 내지 62일)
아동 증상 중증도 스코어 11
보고된 아동 총 증상(#) 10
부모 증상 중증도 스코어 16
나는 사람들이 나에게 말한 것을 기억하는 데 문제가 있다(양성%) 1.3 (92)
보고된 부모 총 증상(#) 8.4
아동 스포츠 뇌진탕 평가 도구(SCAT-3) 상의 평균 증상 스코어를 나타낸다. 부모 및 아동 증상 보고를 등록 시(손상 후 0 내지 14일), 손상 후 4주 및 손상 후 8주(PCS 그룹 단독)를 수집하였다. 각각의 평가 시, 아동과 부모 둘 다에 의해 20종의 뇌진탕 증상을 0 내지 4의 라이셔(Leicher) 척도로 등급화하여, 80의 최대 가능한 중증도 스코어 및 최대 총 20종의 보고된 증상을 얻었다. 서로 만났을 때 평가한 20종의 증상 중에서, ACS와 PCS 그룹 간에 유의한 차이를 갖는 것(손상 후 0 내지 14일), 또는 가장 통상적으로 보고된 것(4주 및 8주)만을 나타낸다.
초기 평가 시, PCS가 발생하도록 진행된 아동은 더 높은 증상 중증도 스코어(p=0.044)를 보고하였지만, 증상 수의 차이는 없었다. PCS가 발생하도록 진행된 아동의 부모는 아동 증상 중증도 또는 증상의 총 수에서 초기 차이를 보고하지 않았다. 질문한 20종의 증상 중에서, 5종은 아동 조사에 대해 ACS와 PCS 그룹 간에 상이하였다. PCS가 발생하도록 진행된 아동은 더 높은 증상 스코어를 기입하였다: "나는 집중하는 시간이 힘들다"(p=0.030); "나는 사람들이 나에게 말한 것을 기억하는 데 문제가 있다"(p=0.027); "나는 몽상을 너무 많이 한다"(p=0.048); "나는 두통을 가진다"(p=0.005); 및 "나는 매우 피곤하다"(p=0.002). 초기 부모 조사 시, 20종 증상 중에서 2종은 PCS 그룹에서 더 중증이었다: "아동이 집중하는 데 어려움이 있다"(p=0.018); 및 "아동이 어지러움을 느낀다"(p=0.045). 손상 후 4주에, PCS 그룹은 평균 중증도 스코어가 18이었고, 평균 11/20의 뇌진탕 증상을 기입하였다. "나는 매우 피곤하다" 및 "나는 쉽게 피곤해진다"는 손상 후 4주에 참여자에 의해 가장 통상적으로 기입되었고, 참여자의 90% 및 85%에서 각각 발생하였다. 15명의 참여자는 손상 후 8주에 계속해서 뇌진탕 증상(SCAT-3 스코어 > 5 및/또는 임상적으로 관련된 방문)을 가졌다. 해당 시간에 가장 통상적으로 보고된 증상은 "나는 사람들이 나에게 말한 것을 기억하는 데 문제가 있다"(92%)였다. 5명의 PCS 참여자는 손상 후 8주에 증상이 해결되었고, 10명의 참여자는 후속 연구에 참여하지 않았다.
마이크로RNA 발현
분석한 52개의 타액 샘플 중에서, 평균 판독 계수치는 샘플 당 2.1x105개의 판독이었고, 적어도 22/30 샘플에서 437종의 miRNA를 검출하였다. 이들 437종의 miRNA 중에서, 14종은 맨 휘트니 검정에 대해 ACS와 PCS 그룹 간에 명목 차이를 입증하였지만(표 4B), 어떤 것도 다중 검정 보정에서 생존하지 않았다. 이들 14종의 miRNA 중에서, 3종은 ACS 대상체에서 하향조절되었고, 11종은 상향조절되었다. ACS와 PCS 그룹 간에 가장 유의한 변화를 갖는 5종의 miRNA는 miR-769-5p(1.8 FC; p=0.002), miR-215-5p(2.4 FC; p=0.024), miR-769(2.5 FC; p=0.025), miR-320c-1(0.44 FC; p=0.028) 및 miR-194-2(1.4 FC; p=0.028)를 포함하였다. 모두 437종의 miRNA에 대한 miRNA 발현 수준을 사용하는 PLSDA는 ACS와 PCS 그룹의 부분적 공간 분리를 달성한 한편, 데이터세트에서 변량의 21.5%를 차지하였다(표 29A 내지 도 29b). ACS와 PCS 대상체의 분리에 가장 중요한 15종 miRNA를 VIP 스코어에 의해 동정하였다(도 18). 이들 miRNA 중 둘(miR-30e 및 miR-320c)은 소아 mTBI 후 타액에서 유의하게 변화되기 때문에(건강한 대조군에 비해) 6종 타액 miRNA의 세트에서 이전에 동정되었다. 이전의 TBI 연구에서 소정의 15종 miRNA가 동정되었다.
[표 29A]
[표 29B]
총 miRNA 프로파일은 ACS 및 PCS 그룹의 부분적 분리를 달성한다. PLSDA는 타액 miRNA 프로파일을 이용하는 ACS 및 PCS 그룹의 공간 분리를 나타낸다(도 19).
마이크로RNA 기능. PLSDA에 대해 ACS와 PCS 그룹을 가장 정확하게 구별하는 15종 miRNA를 DIANA miRPATH 소프트웨어에서 기능성 표적에 대해 정보를 얻었다. 15종 miRNA는 고신뢰도로 2429개의 유전자를 표적화하였다(마이크로-c-tds 스코어 >0.90). 이들 유전자는 62개의 GO 경로 및 22개의 KEGG 경로에 연루되었다(표 30). 가장 유의하게 과다하게 나타난 GO 경로는 세포소기관이었고(p=2.77E-61; 1009개의 유전자; 14종의 miRNA), 가장 과다하게 나타난 KEGG 경로는 세포외 기질-수용체 상호작용이었다(p=2.31E-13; 16개의 유전자, 7종 miRNA). 표적화된 GO 및 KEGG 경로 중에 시냅스 발생, 신경 이동 및 손상과 관련된 다수의 신호전달 캐스케이드가 있었다(표 31). 표적화된 GO 경로는 뉴로트로핀 TRK 신호전달(34개의 유전자), 축삭 인도(61개의 유전자) 및 신경계 발생(56개의 유전자)을 포함하였다. 관심 대상의 KEGG 경로 중에 신경교종(14개의 유전자), FOXO 신호전달(29개의 유전자) 및 Wnt 신호전달(22개의 유전자)이 있다. 15종의 miRNA의 계층적 클러스터링 분석은 유전자 표적 기능에 기반한 miRNA의 3종의 별개의 클러스터(miR-629-3p 및 miR-133a-5p; let-7a-5p 및 let-7b-5p; miR-320c 및 miR-200b-3p)를 입증하였다(도 20).
증상 및 miRNA 상관관계
피어슨 상관관계는 증상 특징(손상 후 4주) 및 15종 타액 miRNA의 농도에 대해 결정하였다(초기 평가 시). 12종의 miRNA-증상 쌍 사이의 명목 상관관계(p<0.05)를 확인하였다(도 21). 이들 상관관계 중 셋은 다회 시험 보정에 존재하였다: miR-320c-1은 "나는 사람들이 나에게 말한 것을 기억하는 데 문제가 있다"와 양의 상관관계가 있고(R=0.55; FDR=0.02); miR-629는 "나는 두통이 있다"와 양의 상관관계가 있으며(R=0.47; FDR=0.04); let-7b-5p는 "나는 매우 피곤하다"와 양의 상관관계가 있었다(R=0.45; FDR=0.04). 개개 miRNA는 서로 양의 상관관계와 음의 상관관계를 둘 다 나타내었고, 대다수의 개개 SCAT-3 항목은 서로 양의 상관관계가 있었다. 그러나, 개개 SCAT-3 항목과 총 SCAT-3 스코어 간에 상관관계가 없었다. 아동과 부모 총 SCAT-3 증상 스코어는 서로 양의 상관관계가 있었지만, 개개 miRNA 또는 개개 아동 증상 항목과는 그렇지 않았다.
예측 효용. 다변량 로지스틱 회귀 분석을 사용하여 PLSDA로부터의 15종 miRNA의 PCS 예측 정확도를 평가하였다. 대부분의 예측 miRNA에 대한 분류 정확도 검사를 수신부 작동 특징(ROC) 곡선으로 시각화하였다. 5종 miRNA(miR-320c-1, miR-133a-5p, miR-769-5p, let-7a-3p, miR-1307-3p)를 사용하는 모델은 PCS 상태에 대해 80%의 민감도 및 75%의 특이도로 가장 높은 분류 정확도(AUC=0.856; 95% CI: 0.822 내지 0.890)를 입증하였다(도 22A). 데이터의 과잉-모델링을 방지하기 위해, 두 가지 검증 기법을 시험하였다: 10배 교차 검증 기법은 0.812의 AUC를 입증하였고; 추가로, 각각의 그룹에서 샘플의 처음 20%를 홀드 아웃시키고, 홀드 아웃 세트에서 0.933의 AUC와 함께 0.792의 초기 AUC를 생성하였다(도 22B 내지 도 22C). 비교 시, 총 아동 SCAT-3 중증도 스코어 또는 총 부모 SCAT-3 중증도 스코어를 이용하는 로지스틱 회귀 모델은 각각 0.649 및 0.562의 AUC를 입증하였다(도 22D 내지 도 22E). 몇몇 연구는 총 SCAT-3 스코어가 PCS 위험에 대한 가장 정확한 임상 평가를 제공하지 않는다는 것을 나타내었기 때문에, 본 발명자들은 miRNA 패널을 PCS 위험의 제2 임상 측정에 비교하는 것을 추구하였다. 52명의 대상체 중에서 PCS 상태는 제멕(Zemek)과 동료들에 의해 개발된 PCS 예측 도구의 변형된 형태로 계획하였다. 위험 인자는 (9종 중) 7종의 이용 가능한 위험 인자(균형 및 소음 민감도를 제외)를 각각의 대상체에 대해 소급적으로 계산하였다. 본 발명자들의 대상체에서, 이 위험 계산기는 PCS 상태를 예측하기 위한 0.625의 AUC(도 22F), 즉, 그들의 본래의 보고서에서 동료와 함께 제멕에 의해 기재되는 것과 유사한 수행을 입증하였다. 도 23A 내지 도 23H는 TBI 후 타액-CSF에서 miRNA 중복을 나타낸다.
추가로, 손상 후 4주에 증상 보고에 기반하여 두 그룹을 시험하였는데, 하나의 그룹은 PSC 그룹이었고, 제2 그룹은 급성 뇌진탕 증상(ACS) 그룹이었다. 타액을 손상의 2주 내에 수집하였고, miRNA를 RNA 서열분석으로 정량화하고 나서, 손상 후 제0일, 제4일 및 제8주에 스포츠 뇌진탕 평가 도구(SCAT-3)를 수행하였다.
본 개시내용은 또한 프로브 세트의 2개 이상의 miRNA 프로브를 포함하는, 대상체가 질환, 장애 또는 병태(예컨대 외상성 뇌 손상)를 갖는지의 여부를 결정하기 위한 적합한 키트를 동정한다. 각각의 miRNA 프로브는 본 명세서에 기재된 특정 miRNA에 대응하는 리보핵산 서열을 포함할 수 있다. 실행에서, 상기 키트는 2 이상의 miRNA 프로브에 부착된 고체 지지체를 추가로 포함할 수 있다. 실행에서, 키트는 다음 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다: (a) 음성 대조군으로서 사용되기에 적합한 하나의 무작위로 생성된 miRNA 서열; (b) 총 RNA 분해에 대한 표준화된 대조군으로서 사용되는 하우스키핑 유전자로부터 유래된 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 서열; 또는 (c) 양성 대조군으로서 사용되는 하나 이상의 무작위로 생성된 서열.
miRNA를 이용하는 로지스틱 회귀 분석을 도 24 내지 도 26에 나타낸다.
생물학적 개연성
miRNA에 의해 표적화된 KEGG 경로:
-FoxO 신호전달(p=0.001; 29개의 유전자),
-축삭 유도(p=0.003; 23개의 유전자),
-신경교종(p=0.0004; 14개의 유전자),
-PI3K-Akt 신호전달(p=0.0004; 57개의 유전자).
miRNA-320c는 4주에 특정 증상과 관련된다(도 27).
본 명세서에 나타낸 바와 같이, 타액 마이크로RNA는 높은 예후 잠재력을 나타내고, 타액에서 용이하게 측정되며, mTBI 후에 변경되고, 뇌에서 발현되는 유전자와 기능적으로 관련되거나 상호작용하며, TBI 증상 지속기간을 예측하고, TBI의 임상적 또는 다른 신체 증상의 특징과 연관된다.
도 28은 변형된 임상 예측 도구를 이용하는 회귀 분석을 나타낸다(Zemek et al., 2016). 임상 위험 스코어는 7일 초과의 증상(두통, 피로, 처리의 어려움)과 함께 성별, 연령, 이전의 뇌진탕을 포함하는 인자를 고려한다. 도 29a 내지 도 29b는 PCS 상태를 예측하기 위해 해당 miRNA의 서브세트를 이용하는 로지스틱 회귀 모델을 제시한다.　
[표 32A]
PCS 및 ACS 그룹에 대해 비교되는 모든 타액 miRNA에 대한 배수 변화 및 p-값
이 표의 데이터에 기반하여, 당업자는 본 명세서에 개시된 방법에 대한 miRNA의 적절한 세트 또는 세트들을 선택할 수 있다.
[표 32B]
이 표의 데이터에 기반하여, 당업자는 본 명세서에 개시된 방법에 대한 miRNA의 적절한 세트 또는 세트들을 선택할 수 있다.
도 31은 아동 SCAT-3 스코어를 이용하는 비교(하회(under-performing)) 로지스틱 회귀 모델을 나타낸다.
PCS의 검출 및 예측에 유용한 MiRNA: miR-769, miR-769-3p, miR-769-5p, miR-320c-1, miR-320c-1-3p, miR-320c-1-5p, miR-4792, miR-4792-3p, miR-4792-5p, miR-140, miR-140-3p, miR-140-5p, miR-629, miR-629-3p, miR-629-5p, miR-192, miR-192-3p, miR-192-5p, miR-145, miR-145-3p, miR-145-5p, let-7a, let-7a-3p, let-7s-5p, miR-133a, miR-133a-3p, miR-133a-5p, miR-1307, miR-1307-3p, miR-1307-5p, miR-200b, miR-200b-3p, miR-200b-5p, let-7a, let-7a-3p, let-7a-5p, miR-4508, miR-4508-3p, miR-4508-5p, miR-30e, miR-30e-3p, miR-30e-5p, let-7b, let-7b-3p, let-7b-5p, miR-194, miR-194-3p, miR-194-5p, miR-199a, miR-199a-3p, miR-199a-5p, let-7f, let-7f-3p, let-7f-5p, miR-128, miR-128-3p, miR-128-5p, miR-215, miR-215-3p, miR-215-5p, miR-149, miR-149-3p, miR-149-5p,miR-421, miR-421-3p 및 miR-421-5p.
실시예 4
타액 miRNA의 종단적 질문
급성(손상 후 0 내지 3일), 아급성(손상 후 7 내지 17일) 및 만성(손상 후 28일 이상) 시점에 의사-진단 경증의 외상성 뇌 손상으로 3차 치료 센터에 있는 50명의 아동(7 내지 21세)으로부터 타액 microRNA를 수집하였다. 손상 기전 및 인구통계학적 특징을 기록하였다. SCAT-5 연구를 이용하여 객관적 증상을 평가하였고, 균형 및 인지의 기능적 증상(예를 들어, 처리 속도, 분산된 주의력 수행)을 클리어에지(ClearEdge)(저작권) 뇌진탕 도구 키트로 측정하였다. 타액 마이크로RNA 수준을 고속대량 RNA 서열분석으로 정량화하였다. 마이크로RNA 수준과 4개의 연속 변수 사이의 잠재적 관계를 확인하기 위해 스피어만 순위 상관관계를 사용하였다: 1) 손상 이후 일수; 2) 클리어에지(ClearEdge)(상표명) 균형 스코어; 3) 클리어에지(상표명) 인지 스코어; 및 4) 참여자 연령.
초기 분석(n=35)은 수준이 손상 후 일수와 관련된 6종 마이크로RNA(R≥0.40; p< 0.05)를 확인하였다. 이들 miRNA 중 셋(50%)은 본 발명자들의 이전의 연구에서 잠재적 바이오마커(miR-574-5p, let-7b-5p, let-7f-5p)로서 동정하였다. 이들 마이크로RNA(let-7f) 중 하나는 참여자 연령과 음으로 연관되며(R=-0.48; p=0.009), 소아 뇌 손상에 대한 독특한 바이오마커를 나타낼 수 있다.
7종 타액 miRNA가 클리어에지 인지 스코어와 관련된다는 것을 발견하였고, 이 중 둘(miR-30e-5p, R=-0.48, p=0.015; miR-320c, R=-0.43, p=0.034)은 이전의 연구에서 확인하였다. 3종의 이전에 동정한 마이크로RNA(miR-182-5p, miR-744-5p, miR-769-5p)는 또한 클리어에지 균형 스코어와 연관되었다.
이 작업은 시간 기간에 걸쳐 중증 뇌 손상 증상에 대한 통찰을 제공하기 위해 그리고 회복 정도뿐만 아니라 손상의 지속기간을 추정하기 위해 타액 중의 miRNA 프로파일을 평가하는 값을 나타낸다. 이전에 본 발명자들은 타액 마이크로RNA 프로파일이 외상성 뇌 손상 후에 뇌척수액 중의 마이크로RNA 프로파일과 중복된다는 것을 나타내었다. 이들 프로파일은 뇌 손상 상태를 확인함에 있어서 그리고 환자가 장기간 증상을 경험하는 것을 예측함에 있어서 효용을 입증한다. 이러한 정보는 환자 및 가족에 대해 예상 가이드를 제공하는 것을 또는 개인화된 환자 관리 계획을 생성하는 것을 추구하는 의사에 대해 가치 있을 것이다. 이 도구의 추가적인 개발은 뇌 손상 관련 마이크로RNA가 시간에 따라 변하는 방법 및 마이크로RNA 수준이 기능성 증상 측정에 관련되는 방법의 더 양호한 이해를 필요로 할 것이다.
균형 및 인지의 측정과 함께 타액 miRNA 바이오마커의 종단적 질문은 miRNA가 시간에 따라 발현 경향을 나타내고 뇌 손상 후 객관적 증상과 관련된다는 것을 입증한다. 마이크로RNA의 하위집단은 환자 연령과 상관관계가 있으며, 소아 뇌 손상에 대한 독특한 서명을 나타낼 수 있다. 이들 결과는 뇌 손상의 비침습적, 객관적 측정 및 손상의 종단적 평가뿐만 아니라 회복 동안 균형 및 인지 측정의 평가를 위한 그들의 효용으로서 진단적 또는 예후적 방법에 기반한 miRNA의 효용을 입증한다.
실시예 5
발현 및 존재비에서 일주기 리듬을 나타내는 타액 miRNA
본 명세서에 참고로 편입된 2018년 3월 20일자로 출원된 PCT/US 2018/023336에 기재된 바와 같이, 타액 miRNA의 일부는 강한 일주기 리듬("circamiRNA")을 나타내는 데, 이 중 다수는 일주기 리듬과 연관된 공지된 유전자를 표적화한다. 이들 miRNA 중 일부는 또한 특정 미생물 수준과 관련하여 변동되거나 동요된다.
1일 이상의 간격으로 타액 수집. 11명의 인간 대상체 지원자가 초기 연구에 참여하였고, 3회의 상이한 라운드의 샘플 수집에서 반복된 날들 중 일자의 다양한 시점에 타액 샘플을 제공하였다. 면봉을 통해 타액을 수집하고 나서, 타액 제조 키트를 이용하여 제조하였다.
수집물 1: 제1일, 제3일 및 제7일에 수집한 8 am 및 8 pm 샘플.
수집물 2: 제1일, 제5일, 제10일 및 제15일에 8 am, 12 pm, 4 pm 및 8 pm 샘플.
수집물 3: 제1일 및 제2일에 12회의 비-반복 횟수.
TruSeq(등록상표) 작은 RNA 라이브러리 제조 키트 프로토콜(미국 캘리포니아주 샌디에이고에 소재한 일루미나) 후에 업스테이트 메디컬 유니버시티의 써니 분자 분석 코어(SUNYMAC)에서 NextSeq 500 기기 상의 차세대 서열분석(NGS)을 이용하여 타액 miRNA 및 미생물 함량의 동정 및 정량화를 수행하였다. 성숙 miRNA를 동정하기 위해 파테크 플로우 소프트웨어에서 SHRRiMP2(등록상표) 알고리즘을 이용하여 miRbase21 데이터베이스에 NGS 판독의 정렬을 수행하였다. 둘 다에서 일관되게 발견된 미생물만을 확인하기 위해 크라켄(Kraken) 소프트웨어 및 원코덱스(OneCodex)(등록상표) 소프트웨어를 이용하여 마이크로바이옴 판독의 맵핑을 수행하였다. 용어 "판독" 또는 "판독-계수치"는- 샘플 사이의 변수를 설명하기 위해 miRNA 또는 마이크로바이옴 발현 데이터를 조절하기 위한 임의의 방법에 적용하는 것, 예컨대 그들이 더 정확하게 비교될 수 있도록 샘플 내 모든 miRNA 수준을 정규화하기 위해 타액 중에서 예측 가능한 수준으로 항상 존재하는 소정의 대조군 miRNA 또는 대사물질을 발현 수준을 이용하는 것으로 이해되어야 한다.
대안의 실시형태에서, miRNA 및/또는 마이크로바이옴 수준을 결정하기 위해 형광 방법을 사용한다. 실시예에서, 본 명세서에 기재된 표적 miRNA 중 일부 또는 모두를 표적화하는 리간드의 별개의 그룹을 기질 상에서 그룹으로 고정시킨다. 표적 miRNA 및 마이크로바이옴 서열은 그것이 리간드에 결합하기 전에 또는 후에 형광 태그(또는 비형광 염료)로 표시된다. 각각의 리간드 그룹에서 상대적 강도는 존재하는 miRNA 및/또는 마이크로바이옴 양의 측정일 수 있다. 본 방법은 칩 유형 분석에 대해 실행될 수 있다. 다른 적합한 칩-유형 분석은 miRNA 및/또는 마이크로바이옴 수준을 결정하기 위해 사용될 수 있다.
통계학적 분석. 본 발명자들은 수집 시간(그러나 수집 일자는 아님)(일상에서 매일의 변화에 의해 강하게 영향받을 수 있었음)에 따라 상당히 변화된 miRNA 및 미생물을 동정하기 위한 샘플 1 및 2 샘플 세트에서 이원 분산 분석(ANOVA)을 처음 사용하였다. 이어서, 이들 miRNA 및 미생물의 서브세트는 다변량 회귀를 이용하는 수집 시간을 예측의 정확도를 평가하기 위해 제3의 샘플 세트에서 사용되었다. 가장 강한 일주기 변동을 나타낸 miRNA를 circaMiR로 지칭하였고, 독창성 경로 분석(Ingenuity Pathway Analysis: IPA) 소프트웨어를 이용하여 총 139개의 주석이 달린 일주기 유전자의 예측 조절자가 된 것에 대해 시험하였다. 이어서, 일주기 유전자를 표적화하는 CircaMiR를 피어슨 상관관계 분석을 이용하는 가장 강한 일주기-변동 미생물과의 연관 증거에 대해 시험하였다. 이어서, circaMiR에 의해 표적화된 유전자의 기능은 IPA 및 miRpath 소프트웨어를 이용하여 그들의 특정 생물학적 기능에 대해 시험하였다.
24개의 샘플 데이터 세트: 총 35종의 miRNA는 수집 시간의 고도로-유의한 효과(FDR < 0.001)를 나타내었고, 수집일의 효과는 없었다;
48개의 샘플 데이터 세트: 총 41종의 miRNA는 수집 시간의 고도로-유의한 효과(FDR < 0.001)를 나타내었고, 수집일의 효과는 없었다;
19종의 miRNA를 둘 다에서 통상적으로 변하였고, 도 32에 나타낸 제3 데이터 세트에서 수집 시간을 예측하는 능력에 대해 시험하였다.
circamiRNA 시간 예측
수집 시간을 예측하기 위한 19종 circaMiR의 정확도
　 다중 R P 값 오차 범위
수집 1 0.990 0.003929 12.9%
수집 2 0.878 0.000031 18.1%
수집 3 0.875 0.000040 26.0%
(4 am 없음) 0.938 2.28e-10 15.7%
그룹 A 및 그룹 B circa MiR를 표 34에 기재한다.
표 34는 본 명세서에 기재된 방법을 이용하여 건강한 대상체를 질환 또는 장애를 갖는 대상체와 구별하기 위해 사용될 수 있거나 농도 또는 존재비에서 일주기 변동에 대해 조절하도록 정규화될 수 있는 circaMiR을 열거한다. 상기 표에서 miRNA 중 어떤 것과 동일한 종자 서열을 공유하는 다른 miRNA는 이들 목적을 위해 사용될 수 있다.
2회/일(8 am, 8 pm)의 빈도로 3일의 샘플링(제1일, 제3일, 제7일)에 걸쳐 4명의 대상체로부터의 24개 샘플에서 수집 시간에 따라 변화된 19종의 miRNA에 대한 발현 데이터의 히트맵 클러스터링을 도 33에 나타낸다. 4회/일(8 am, 12 pm, 4 pm, 8 pm)의 빈도로 4일의 샘플링(제1일, 제5일, 제10일, 제15일)에 걸쳐 3명의 대상체로부터의 48개 샘플에서 수집 시간에 따라 변화된 19종의 miRNA에 대한 발현 데이터의 히트맵 클러스터링을 도 34에 나타낸다. 수집물 3(다양한 시점에 수집)에서 대상체 중 3명에 대해 나타난 상위 19종의 miRNA 중 1개에 대한 정규화된 데이터를 도 35에 나타낸다. 하루주기리듬 신호전달(Circadian Rhythm Signaling)에 연루된 45개의 유전자가 circaMiR 중 14개의 표적으로서 동정되었다(도 36). 이는 -IPA에서 일주기 기능에 연루된 139개의 전체 주석달린 유전자의 거의 1/3이다. 도 36에서, 1종의 miRNA에 의해 표적화된 유전자는 강조되어 있고 회색인 반면, 14종의 miRNA 중 1개 초과에 의해 표적화된 유전자는 강조되어 있고 적색이다. 비표적화된 유전자는 백색으로 나타난다.
타액 miRNA 수준의 일부는 강한 일주기 패턴을 나타낸다. 이 관찰은 앞서 기재하지 않았다. 대부분의 타액 circaMiR은 뇌, 대사 및 암 기능에 연루된 유전자, 예를 들어, 표 34에 기재한 것에 추가로 적어도 하나 이상의 일주기 유전자를 표적화한다.
circaMiR에 의해 표적화된 유전자를 함유하는 생물학적 경로
유전자 및 게놈의 교토 백과사전(KEGG) 경로 p-값 #유전자 #miRNA
지방산 생합성 4.6e-11 5 6
암에서의 프로테오글리칸 3.1e-08 94 17
프라이온병 4.8e-07 10 9
Hippo 신호전달 경로 2.0e-06 71 17
FoxO 신호전달 경로 8.0e-06 70 16
만능 줄기 세포를 조절하는 신호전달 경로 8.0e-06 68 17
신세포 암종 1.1e-05 39 17
글루타메이트 시냅스 7.9e-05 52 17
전립선 암 7.9e-05 47 17
암에서의 경로 8.0e-05 159 17
신경교종 8.7e-05 33 15
심장 근육 세포에서 아드레날린 신호전달 8.7e-05 61 17
에스트로겐 신호전달 경로 0.00013 46 16
갑상선 호르몬 신호전달 경로 0.00014 57 16
Rap1 신호전달 경로 0.00016 91 17
액틴 세포골격의 조절 0.00027 94 17
PI3K-Akt 신호전달 경로 0.00044 136 17
국소 접착 0.00044 91 17
mTOR 신호전달 경로 0.00055 34 15
특정 병태, 장애 또는 질환, 예컨대 TBI 또는 뇌진탕 손상과 상관관계가 있거나 연관되고 또한 시간적 또는 일주기 변동을 나타내는 MiRNA를 이용하는 진단적 및 예후적 방법은 circa-MiR에서 공지된 일주기 변동에 기반하여 정규화될 수 있다. 대안적으로, 진단적 및 예후적 방법은 변동을 피하기 위해 고정된 시간(일)에 샘플을 얻음으로써 이들 일주기 변동에 대해 제어할 수 있다. 다른 실시형태에서, 진단적 또는 예후적 방법은 miRNA 존재비 또는 농도에서 일주기 또는 다른 시간적 변동에 의해 도입된 노이즈 또는 오류를 피하기 위해 일정한 또는 상대적으로 비변형의 발현을 나타내는 miRNA를 사용할 수 있다.
본 발명에 대한 수많은 변형 및 변화는 상기 교시에 비추어 가능하다. 따라서, 첨부한 청구범위의 범주 내에서, 본 발명은 본 명세서에 구체적으로 기재된 것과 다르게 실행될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 단지 특정 실시형태를 기재하는 목적을 위한 것이며, 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 표제(예컨대 "배경기술" 및 "발명의 내용") 및 본 명세서에서 사용되는 하위 표제는 본 발명 내에서 주제의 일반적 조직화를 위해서만 의도되고, 본 발명의 개시내용 또는 이의 임의의 양상을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 특히, "배경"에 개시된 대상은 신규한 기술을 포함할 수 있고, 선행 기술의 설명을 구성하지 않을 수도 있다. "발명의 내용"에 개시된 대상은 기술의 전체 범주 또는 이의 임의의 실시형태의 철저한 또는 완전한 개시내용은 아니다. 특정 효용을 갖는 본 명세서의 부문 내의 물질의 분류 또는 논의는 편리함을 위한 것이며, 어떠한 추론도 물질이 임의의 주어진 조성물에 사용될 때 본 명세서에서 그의 분류에 따라 필수적으로 또는 유일하게 작용하여야 한다는 것을 도출하여서는 안 된다.
본 명세서에서 사용되는 단수 형태는 달리 분명하게 나타내지 않는다면, 복수의 형태도 포함하는 것으로 의도된다.
용어 "포함하다" 및/또는 "포함하는"은 본 명세서에서 사용될 때, 언급된 특징, 단계, 작업, 요소 및/또는 성분의 존재를 구체화하지만, 하나 이상의 다른 특징, 단계, 작업, 요소, 성분 및/또는 이들의 그룹의 존재 또는 첨가를 불가능하게 하지는 않는다는 것이 추가로 이해될 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "및/또는"은 연관된 열거 목록 중 하나 이상의 임의의 및 모든 조합을 포함하고, "/"로서 약칭될 수 있다.
링크는 http:의 삭제에 의해 또는 www. 앞의 스페이스 또는 밑줄친 스페이스의 삽입에 의해 이용 불가능하게 된다. 일부 예에서, "마지막으로 액세스된" 일자에 링크를 통해 이용 가능한 텍스트는 참고로 편입될 수 있다.
실시예에 사용되는 바와 같은 것을 포함하고 달리 분명하게 구체화되지 않는 한, 본 명세서 및 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 모든 숫자는 상기 용어가 분명하게 나타나지 않는다고 해도, 단어 "실질적으로", "약" 또는 "대략"으로 서두를 쓴 것과 같이 읽혀질 수 있다. 어구 "약" 또는 "대략"은 본 명세서에 기재된 값 및/또는 위치가 값 및/또는 위치의 합리적인 예상된 범위 내라는 것을 나타내기 위해 규모 및/또는 위치를 기재할 때 사용될 수 있다. 예를 들어, 수치적 값은 언급된 값(또는 값의 범위)의 +/- 0.1%, 언급된 값(또는 값의 범위)의 +/- 1%, 언급된 값(또는 값의 범위)의 +/- 2%, 언급된 값(또는 값의 범위)의 +/- 5%, 언급된 값(또는 값의 범위)의 +/- 10%, 언급된 값(또는 값의 범위)의 +/- 15%, 언급된 값(또는 값의 범위)의 +/- 20% 등인 값을 가질 수 있다. 본 명세서에 열거된 임의의 수치적 범위는 그 안에 포함된 모든 하위 범위를 포함하는 것으로 의도된다.
구체적 매개변수(예컨대 온도, 분자량, 체중% 등)에 대한 값 및 값의 범위의 개시내용은 본 명세서에서 유용한 다른 값 및 값의 범위를 제외하지 않는다. 주어진 매개변수에 대한 2 이상의 구체적인 예시된 값은 매개변수에 대해 청구될 수 있는 다양한 값에 대한 종점을 정할 수 있다는 것을 생각한다. 예를 들어, 매개변수 X가 값 A를 갖도록 예시되고 또한 값 Z를 갖도록 예시된다면, 매개변수 X는 약 A로부터 약 Z까지의 다양한 값을 가질 수 있는 것으로 여겨진다. 유사하게, 매개변수에 대한 값의 2 이상의 범위의 개시내용은 (이러한 범위가 포개지든, 중복되든 또는 별개이든) 개시된 범위의 종점을 이용하여 청구될 수 있는 값에 대한 범위의 모든 가능한 범위의 조합을 포괄하는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 매개변수 X가 1 내지 10 범위 내의 값을 갖도록 본 명세서에서 예시된다면, 이는 또한 단지 예로서 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 2 내지 9, 2 내지 8, 2 내지 7, 3 내지 9, 3 내지 8, 3 내지 7, 2 내지 8, 3 내지 7, 4 내지 6 또는 7 내지 10, 8 내지 10 또는 9 내지 10을 포함하는 매개변수 X에 대한 하위범위를 기재한다. 범위는 그의 종점뿐만 아니라 종점 내의 값을 포함하고, 예를 들어, 범위 0 내지 5는 0, 0 초과, 1, 2, 3, 4, 5 미만 및 5를 포함한다.
본 명세서에서 사용하는 단어 "바람직한" 및 "바람직하게는"은 소정의 상황 하에 소정의 이점을 얻는 기술의 실시형태를 지칭한다. 그러나, 동일한 또는 다른 상황 하에서 다른 실시형태가 또한 바람직할 수 있다. 더 나아가, 하나 이상의 바람직한 실시형태의 인용은 다른 실시형태가 유용하지 않다는 것을 나타내지 않으며, 기술의 범주로부터 다른 실시형태를 제외하는 것으로 의도되지 않는다.
본 명세서에서 언급되는 바와 같은 모든 조성 백분율은 달리 구체화되지 않는 한 전체 조성물의 중량 기준이다. 본 명세서에서 사용되는 단어 "포함한다" 및 그의 변형은, 목록에서 항목의 열거가 또한 이 기술의 물질, 조성물, 장치 및 방법에서 유용할 수 있는 다른 유사한 항목을 제외하지 않도록, 비제한적인 것으로 의도된다. 유사하게, 용어 "일 수 있다" 및 "일 수도 있다" 및 그들의 변형은 실시형태가 소정의 요소 또는 특징을 포함할 수 있거나 포함할 수도 있다는 열거가 해당 요소 또는 특징을 함유하지 않는 본 발명의 다른 실시형태를 제외하지 않도록, 비제한적인 것으로 의도된다.
용어 "제1" 및 "제2"는 다양한 특징/요소(단계들을 포함)를 기재하기 위해 본 명세서에서 사용될 수 있지만, 이들 특징/요소는 문맥에서 달리 표시되지 않는 한, 이들 용어에 의해 제한되어서는 안 된다. 이들 용어는 하나의 특징/요소를 다른 특징/요소와 구별하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 이하에 논의하는 제1 특징/요소는 제2 특징/요소로 지칭될 수 있고, 유사하게, 이하에 논의하는 제2 특징/요소는 본 발명의 교시를 벗어나지 않고 제1 특징/요소로 지칭될 수 있다.
기술의 실시형태를 나타내는 동안 설명 및 특정 실시예는 단지 예시의 목적을 위한 것으로 의도되며, 기술의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 게다가, 언급된 특징을 갖는 다수의 실시형태의 열거는 추가적인 특징을 갖는 다른 실시형태, 또는 언급된 특징의 상이한 조합을 편입하는 다른 실시형태를 제외하는 것으로 의도되지 않는다. 특정 실시예는 본 기술의 조성물 및 방법을 제조하고 사용하는 방법을 예시하는 목적으로 제공되고, 달리 분명하게 언급되지 않는 한, 본 기술의 주어진 실시형태가 생성되거나 시험되거나 그렇지 않다는 표현인 것으로 의도되지 않는다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은 각각의 개개 간행물 또는 특허 출원이 참고로 편입되는 것으로 구체적이고 개별적으로 나타난 것과 동일한 정도로 그들의 전문이 본 명세서에 참고로 편입되고, 특히 참고에 의한 편입이 나타나는 명세서의 동일한 문장, 어구, 페이지 또는 부문에서 나타나는 개시내용을 참고로 한다.
본 명세서의 참고문헌의 인용은 해당 참고문헌이 선행기술이거나 본 명세서에 개시된 기술의 특허 가능성에 대한 임의의 적절함을 갖는다는 용인을 구성하지는 않는다. 인용되는 참고문헌의 내용의 임의의 논의는 단지 참고문헌의 저자에 의해 만들어진 주장의 일반적 요약을 제한하는 것으로 의도되며, 이러한 참고문헌의 내용의 정확성에 관한 용인을 구성하지는 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> QUADRANT BIOSCIENCES INC. THE RESEARCH FOUNDATION FOR THE STATE UNIVERSITY OF NEW YORK PENN STATE RESEARCH FOUNDATION <120> ANALYSIS AND PREDICTION OF TRAUMATIC BRAIN INJURY AND CONCUSION SYMPTOMS <130> 503572WO <140> PCT/US2018/024111 <141> 2018-03-23 <150> US62/475,698 <151> 2017-03-23 <150> US62/480,079 <151> 2017-03-31 <150> US62/502,107 <151> 2017-05-05 <150> US62/623,145 <151> 2018-01-29 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 7 <212> RNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> hsa-let-7f-5p <400> 1 gagguag 7 <210> 2 <211> 7 <212> RNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> hsa-miR-151a-5p <400> 2 cgaggag 7 <210> 3 <211> 7 <212> RNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> hsa-miR-182-5p <400> 3 uuggcaa 7 <210> 4 <211> 7 <212> RNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> hsa-miR-221-3p <400> 4 gcuacau 7 <210> 5 <211> 7 <212> RNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> hsa-miR-26b-5p <400> 5 ucaagua 7 <210> 6 <211> 7 <212> RNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> hsa-miR-29c-3p <400> 6 agcacca 7 <210> 7 <211> 7 <212> RNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> hsa-miR-30e-5p <400> 7 guaaaca 7 <210> 8 <211> 7 <212> RNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> hsa-miR-320c <400> 8 aaagcug 7 <210> 9 <211> 7 <212> RNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> hsa-miR-532-5p <400> 9 augccuu 7 <210> 10 <211> 7 <212> RNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(7) <223> hsa-miR-744-5p <400> 10 gcggggc 7

Claims (20)

  1. 뇌진탕, 경증의 외상성 뇌 손상(mild traumatic brain injury: mTBI) 또는 기타 외상성 뇌 손상(traumatic brain injury: TBI)의 검출 또는 진단을 위한 데이터 제공 방법으로서,
    (a) 인간 대상체의 단리된 타액 샘플 중의 하나 이상의 마이크로 RNA(micro RNA: miRNA)의 존재비 또는 농도 수준을 결정하는 단계;
    (b) 상기 하나 이상의 miRNA의 상기 결정된 존재비 또는 농도 수준을 동일한 하나 이상의 miRNA의 정상 수준과 비교하는 단계로서, 상기 정상 수준이 대상체에서 발견된 것, 또는 뇌진탕 또는 mTBI를 갖지 않는 2명 이상의 대상체로부터의 평균, 또는 뇌진탕, mTBI 또는 기타 TBI를 일으키는 사건 전에 상기 대상체에서 결정된 존재비 또는 농도 수준인, 단계; 및
    (c) 뇌진탕, mTBI 또는 기타 TBI를 갖는 상기 하나 이상의 miRNA의 비정상 수준을 갖는 대상체를 선택하는 단계
    를 포함하되,
    상기 하나 이상의 miRNA 및 상기 하나 이상의 miRNA의 비정상 수준이, 정상 수준과 비교할 때 인간 대상체에서 상향조절된 miR-29c-3p, 정상 수준과 비교할 때 인간 대상체에서 하향조절된 miR-26b-5p, 정상 수준과 비교할 때 인간 대상체에서 하향조절된 miR-182-5p, 정상 수준과 비교할 때 인간 대상체에서 하향조절된 miR-320c, 또는 정상 수준과 비교할 때 인간 대상체에서 하향조절된 miR-221-3p 중 1종 이상인, 뇌진탕, mTBI 또는 기타 TBI의 검출 또는 진단을 위한 데이터 제공 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    miRNA 발현 수준이, RNA 발현 수준이 실질적으로 불변인 하나 이상의 하우스키핑 유전자의 발현 수준 또는 평균 발현 수준에 대해 정규화되고/되거나; 연령, 성별 또는 유전적 배경의 차이를 보상하도록 조절되는, 뇌진탕, mTBI 또는 기타 TBI의 검출 또는 진단을 위한 데이터 제공 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    하나 이상의 miRNA의 존재비 또는 농도를 결정하는 단계 (a)가 RNA 서열분석(RNA-seq), qPCR, miRNA 어레이 또는 멀티플렉스 miRNA 프로파일링에 의해 수행되는, 뇌진탕, mTBI 또는 기타 TBI의 검출 또는 진단을 위한 데이터 제공 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 인간 대상체가 mTBI를 갖는 것으로 의심되고, 상기 방법이 miR-29c-3p, miR-26b-5p, miR-182-5p, miR-320c, 및 miR-221-3p의 존재비 또는 농도 수준을 결정하는 것을 포함하는, 뇌진탕, mTBI 또는 기타 TBI의 검출 또는 진단을 위한 데이터 제공 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 인간 대상체가 뇌진탕을 갖는 것으로 의심되고, 상기 방법이 miR-29c-3p, miR-26b-5p, miR-182-5p, miR-320c, 및 miR-221-3p의 존재비 또는 농도 수준을 결정하는 것을 포함하는, 뇌진탕, mTBI 또는 기타 TBI의 검출 또는 진단을 위한 데이터 제공 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    회귀 모델 또는 다른 통계학적 분석을 이용하여 연령, 성별 또는 유전적 배경을 보상하기 위해 상기 타액 샘플에서 결정된 miRNA 수준의 값을 조절하거나 정규화하는 단계를 추가로 포함하는, 뇌진탕, mTBI 또는 기타 TBI의 검출 또는 진단을 위한 데이터 제공 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    선택하는 단계가 miRNA 중 4종 이상의 비정상 수준을 갖는 대상체를 선택하는 것, 및 뇌진탕, mTBI 또는 기타 TBI의 하나 이상의 증상과 상기 비정상 miRNA 수준의 피어슨 상관계수(Pearson correlation coefficient)를 계산하는 것을 포함하는, 뇌진탕, mTBI 또는 기타 TBI의 검출 또는 진단을 위한 데이터 제공 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    타액 miRNA 수준을 결정하는 단계가 RNA 서열분석(RNA-seq)에 의해 수행되는, 뇌진탕, mTBI 또는 기타 TBI의 검출 또는 진단을 위한 데이터 제공 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    서열분석 데이터 원 판독 계수치(sequencing data raw read count)가 사분위수-정규화되고, 평균중심화되고(mean-centered), 각각의 변수의 표준 편차로 나뉘고, 데이터가 샘플간 계수치 변화를 설명하도록 정규화되고/되거나; 데이터가 상대적 및/또는 절대적 발현 수준을 기재하기 위해 하나 이상의 비변이체 miRNA의 발현에 대해 정규화되고, 정규화된 데이터가 임의적으로 추가로 통계학적으로 분석되는, 뇌진탕, mTBI 또는 기타 TBI의 검출 또는 진단을 위한 데이터 제공 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 방법이 miR-29c-3p의 존재비 또는 농도 수준을 결정하는 것을 포함하는, 뇌진탕, mTBI 또는 기타 TBI의 검출 또는 진단을 위한 데이터 제공 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 방법이 miR-26b-5p의 존재비 또는 농도 수준을 결정하는 것을 포함하는, 뇌진탕, mTBI 또는 기타 TBI의 검출 또는 진단을 위한 데이터 제공 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 방법이 miR-182-5p의 존재비 또는 농도 수준을 결정하는 것을 포함하는, 뇌진탕, mTBI 또는 기타 TBI의 검출 또는 진단을 위한 데이터 제공 방법.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 방법이 miR-320c의 존재비 또는 농도 수준을 결정하는 것을 포함하는, 뇌진탕, mTBI 또는 기타 TBI의 검출 또는 진단을 위한 데이터 제공 방법.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 방법이 miR-221-3p의 존재비 또는 농도 수준을 결정하는 것을 포함하는, 뇌진탕, mTBI 또는 기타 TBI의 검출 또는 진단을 위한 데이터 제공 방법.
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