WO2020185056A2 - 타가면역세포배양방법, 그 방법으로 얻어진 면역세포배양액 및 이를 포함하는 면역세포치료제 - Google Patents

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    • C12N2506/11—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from blood or immune system cells

Definitions

  • the present invention relates to a method of culturing natural killer cells (NK cells) applied to immunotherapy, and more specifically, by culturing lymphocytes derived from the blood of a healthy donor rather than a patient to be administered an immune cell therapy.
  • the present invention relates to another immune cell culture method that efficiently amplifies and activates NK cells, which are excellent in tumor treatment, and an immune cell culture solution obtained by the method, and an immune cell therapy product comprising the same.
  • NK cells are large granular lymphocytes (LGL), which are a type of lymphocyte, and have excellent ability to kill infected viruses and tumor cells, and do not kill most normal cells. Necrosis, apoptosis, or both of these mechanisms occur simultaneously. NK cells respond to cytokines such as IL-2, IL-12, and interferon, thereby increasing their cytotoxicity, secretory, and proliferative functions.
  • the phenotype of NK cells is CD16 (Fc ⁇ RIII) and CD56 in humans, and CD16 and CD56 do not have a T-cell receptor complex (TRC) on the cell surface, so they are used as markers for NK cells.
  • TRC T-cell receptor complex
  • NK cells are known to play an important role in the early biological defense mechanisms and tumor immunity of the human body.
  • NK cells can kill specific magnetic cells, allogeneic cells, and even xenogeneic cancer cells without the process of obtaining immunity through the expression of the Major Histocompatibility Complex (MHC), and in particular, express or do not express Class 1 MHC less. It can better kill target cells that don't.
  • MHC Major Histocompatibility Complex
  • NK cells can effectively kill most cancer cells that do not express MHC, and in addition, they can kill some virus-infected cells and bacteria such as salmonella typhi.
  • NK cells which have an excellent effect on cancer cell killing, occupy only 5 to 15% of peripheral blood lymphocytes even in normal humans, and especially in the case of cancer patients, the proportion or cytotoxicity is greatly reduced. There is a limit to effectively attacking cancer cells without a separate amplification process.
  • NK cells natural killer cells
  • DC dendritic cells
  • B cells B cells
  • T cells etc.
  • autoimmune cell therapy which is treated by separating and culturing immune cells from their own blood, is also meaningful, but in the case of severe terminal cancer patients, the number of cells is small and its activity is very small, and cell culture is sometimes difficult. There are many difficulties, such as having to wait for a period. However, if it can be treated by culturing the immune cells of other healthy people, it can be effectively used for patients with severe terminal cancer, where cell culture is not easy.
  • NK cells In other words, if such other immune cell therapy is developed, a large amount of healthy human immune cells can be cultured in advance and stored frozen, and the effect can be enhanced by immediately administering to the patient as soon as the patient desires.
  • pure NK cells In order to use other people's immune cells, pure NK cells must be used because other people's Tc cells attack the patient's body. In the conventional method of making pure NK cells, the process of culturing such as using feeder cells such as cancerous cell lines or gamma-ray treatment is very complicated and expensive.
  • the present inventors have completed the present invention by developing an immune cell culture method that causes immune tolerance to a patient to be administered T cells from a healthy donor and changes into cells that do not attack.
  • Another object of the present invention is to stimulate immune cells from lymphocyte peripheral blood mononuclear cells (PBMC) isolated from the blood of a healthy donor when culturing immune cells without the use of anti-CD3 antibodies. It is to provide a method for culturing other immune cells that can be used for immunotherapy with the mixed immune cells of another person, an immune cell culture solution obtained by the method, and an immune cell therapy product comprising the same.
  • PBMC lymphocyte peripheral blood mononuclear cells
  • the object of the present invention is not limited to the above-mentioned object, and even if not explicitly mentioned, the object of the invention that one of ordinary skill in the art can recognize from the description of the detailed description of the invention to be described later may naturally be included. .
  • the present invention is to obtain a first donor cell culture solution by culturing peripheral blood mononuclear cells (PBMC) isolated from the blood of a healthy donor for 9 to 12 days; Preparing a patient-derived PBMC from the blood of a patient to be administered an immune cell therapy agent; Obtaining a first mixed culture solution by adding the patient-derived PBMC to the first donor cell culture solution; And a mixed culture step of culturing the first mixed culture solution.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • the present invention provides a step of culturing peripheral blood mononuclear cells (PBMC) isolated from the blood of a healthy donor for 1-2 days to obtain a second donor cell culture solution; Preparing a patient-derived PBMC from the blood of a patient to be administered an immune cell therapy agent; Obtaining a second mixed culture solution by adding the patient-derived PBMC to the second donor cell culture solution; And culturing the second mixed culture solution.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • the patient-derived PBMC is a PBMC isolated from the patient's blood and not cultured, a patient cell culture solution obtained by culturing the PBMC isolated from the patient's blood for 1-2 days, or isolated from the patient's blood. It is any one of patient cell culture solutions obtained by culturing the PBMC for 7 to 14 days.
  • the number of immune cells contained in the patient-derived PBMC per 100 immune cells contained in the first donor cell culture solution or the second donor cell culture solution is 30 to 200 in the first mixed culture solution or the second mixed culture solution. Included to be a dog.
  • the mixed culture step is performed for 30 days or more while performing a plurality of medium composition replacement and medium composition harvesting steps.
  • the plurality of medium composition replacement and medium composition harvesting steps are performed while changing the concentration of Cytokine at intervals of 3 to 4 days.
  • the present invention provides another immune cell culture comprising a medium composition obtained by culturing by any one of the above-described culture methods and proliferated immune cells.
  • the present invention provides a culture medium composition in which the proliferated immune cells are removed from the above-described other immune cell culture.
  • the present invention provides an immune cell therapeutic agent comprising as an active ingredient the immune cells obtained after removing the medium composition from the above-described other immune cell culture.
  • the immune cells include NK cells and T cells in which immune tolerance to a specific patient to be administered the immune cell therapy has occurred.
  • the T cells in which immune tolerance has occurred include NKT cells, helper T cells (Th), cytotoxic T cells (Tc) and gamma delta T cells.
  • the immune tolerance is obtained by culturing the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) isolated from the blood of a healthy donor and culturing the specific patient-derived PBMC at a certain time.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • the present invention provides a medium composition obtained in the step of replacing a plurality of medium compositions and harvesting a medium composition by culturing by the above-described other immune cell culture method.
  • the present invention provides a cosmetic composition comprising the above-described medium composition as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating wounds or skin diseases, including burns and wounds, comprising the above-described medium composition as an active ingredient.
  • the immune cell culture solution obtained by the method, and the immune cell therapy product comprising the same the T cells of a healthy human cause immune tolerance to the patient to be administered, and the cells change into cells that do not attack. Not only does it proliferate better, it also has the effect of prolonging cell life.
  • the other immune cell culture method of the present invention the immune cell culture solution obtained by the method, and the immune cell therapeutic agent comprising the same are used to obtain anti-CD3 antibodies when culturing immune cells from lymphocyte peripheral blood mononuclear cells (PBMC) isolated from the blood of a healthy donor. Even if it is not used, it stimulates immune cells and cultures well, and by inducing immune tolerance, other people's immune cells mixed with T cells can be used for immunotherapy.
  • PBMC lymphocyte peripheral blood mononuclear cells
  • 1 is a graph showing FACS data of effector cells used in an experiment to confirm the decreased cell killing power after inducing immune tolerance of T cells.
  • FIG. 2 is a graph showing results of a titer test of immune cells performed by a conventional method in order to confirm the decreased cell killing power after inducing immune tolerance of T cells.
  • Figure 3 is a graph showing the change in the number of cells over time in the other immune cell culture method according to an embodiment of the present invention.
  • 4A to 4C are graphs showing FACS data measured on the 20th, 31st and 54th days, respectively, in the other immune cell culture method according to another embodiment of the present invention.
  • 5 is a graph showing the change in the number of cells over time in the other immune cell culture method according to another embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 is a graph showing FACS data measured on the 14th day of culture in FIG. 5.
  • first and second may be used to describe various elements, but the elements should not be limited by the terms. These terms are only used for the purpose of distinguishing one component from another component. For example, without departing from the scope of the present invention, a first component may be referred to as a second component, and similarly, a second component may be referred to as a first component.
  • NK cell is used to mean both NK cells and NKT cells, but may be interpreted as meaning only NK cells in some cases.
  • the technical feature of the present invention is that even if two types of immune cells with different origins, that is, immune cells derived from the blood of a healthy donor and immune cells derived from the blood of a patient, are mixed and cultured, they do not attack the cultured T cells by causing immune tolerance. It is found in other immune cell culture methods, which have the effect of increasing cell lifespan as well as improving cell proliferation, and immune cell culture solution obtained by the method, and immune cell therapy products containing the same.
  • the other immune cell culture method of the present invention can be classified into two types as follows depending on the time point of mixing two types of immune cells of different origins and whether or not anti-CD3 antibodies are used.
  • the first other immune cell culture method of the present invention comprises the steps of culturing peripheral blood mononuclear cells (PBMC) isolated from the blood of a healthy donor for 9 to 12 days to obtain a first donor cell culture solution; Preparing a patient-derived PBMC from the blood of a patient to be administered an immune cell therapy agent; Obtaining a first mixed culture solution by adding the patient-derived PBMC to the first donor cell culture solution; And a mixed culture step of culturing the first mixed culture solution. Therefore, in the first other immune cell culture method of the present invention, the immune cells of a healthy donor among the two types of immune cells of different origins are cultured for at least 7 days using an anti-CD3 antibody, and then PBMCs derived from patients are mixed.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • NK cells are not well cultured, but T cells are relatively well cultured, so the number of cells can be increased.When mixing cells of different origins, it is sufficient to have only T cells that are necessary for stimulation. Because.
  • the second other immune cell culture method of the present invention comprises the steps of culturing peripheral blood mononuclear cells (PBMC) isolated from the blood of a healthy donor for 1 to 2 days to obtain a second donor cell culture solution; Preparing a patient-derived PBMC from the blood of a patient to be administered an immune cell therapy agent; Obtaining a second mixed culture solution by adding the patient-derived PBMC to the second donor cell culture solution; And culturing the second mixed culture solution. Therefore, the second other immune cell culture method of the present invention does not use anti-CD3 antibodies by mixing patient-derived PBMCs at least 3 days before the start of culture at the initial stage of culture of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) isolated from the blood of healthy donors.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • the culture step is simpler, and the immune cells are well cultured, and since the culture is in the early stage, the number of immune cells of the donor is small, so the number of immune cells of the patient required to induce immune tolerance is required. .
  • both the first mixed culture solution and the second mixed culture solution are prepared to contain 30 to 200 immune cells contained in patient-derived PBMC per 100 immune cells contained in the donor cell culture solution, and this mixing ratio is determined experimentally. This is because at least 30% of the patient-derived immune cells must be at least 30% of the number of donor immune cells to induce immune tolerance and at the same time effectively stimulate immune cells to facilitate culture. On the other hand, the more patient-derived immune cells relative to the number of donor immune cells, the easier it is to induce complete immune tolerance, but the ratio exceeding 1:2 may be a burden on the patient in the case of critically ill patients.
  • the step of preparing a patient-derived PBMC is a patient cell culture solution obtained by culturing the isolated PBMC for 1 to 2 days or a patient cell culture solution obtained by culturing the isolated PBMC for 7 to 14 days. It can be carried out by preparing any one of them.
  • the patient is a critically ill patient
  • the patient cell culture solution obtained by culturing with patient-derived PBMC for 7 to 14 days is used, the number of cells is proliferated even when a small amount of blood is collected, so it can be used several times.
  • patient-derived PBMCs may contain other monocytes such as B cells in addition to immune cells when they are not isolated from blood and cultured, but only immune cells survive in the subsequent culture process, so the patient cell culture solution contains substantially only immune cells. May be in the state.
  • the first and second other immune cell culture methods of the present invention have the effect of prolonging the lifespan of immune cells because two types of immune cells of different origins are mixed and cultured, so that a number of medium compositions are replaced and medium compositions are harvested.
  • the mixed culture step may be performed for 30 days or more.
  • a plurality of medium composition replacement and medium composition harvesting steps may be performed while changing the concentration of Cytokine at intervals of 3 to 4 days.
  • a medium composition from which immune cells containing a large amount of useful ingredients such as cytokines have been removed a medium composition from which immune cells containing a large amount of useful ingredients such as cytokines have been removed.
  • a medium composition containing a large amount of useful ingredients is a raw material for cosmetics or pharmaceuticals. Can be. Therefore, according to the other immune cell culture method of the present invention, it is possible to obtain a medium composition that contains not only a large amount of useful ingredients, but also serum, very economically.
  • the other immune cell culture method of the present invention to obtain a medium composition that is a raw material for cosmetics or pharmaceuticals
  • two kinds of immune cells with different origins are derived, one from a healthy donor, and one from a patient. If the cultivation is performed using PBMCs derived from the blood of healthy donors, but not of all healthy donors, it may be useful to obtain a larger amount of medium composition.
  • the medium composition thus obtained can be used as an active ingredient in cosmetic compositions and pharmaceutical compositions.
  • the medium composition of the present inventor is effective for one or more of skin whitening, pigmentation removal, and wrinkle improvement, as described in Patent Publication No. 10-2018-0057359, which is a prior patent of the present inventor, and allergic rhinitis, allergic dermatitis, Inflammation improvement effect was good for atopic dermatitis, acne, and inflammation caused by insect bites. In particular, it has the effect of quickly removing itchiness, and it has a very good effect on skin regeneration effect and removal of deposit pigments through treatment of burns and wounds. It was confirmed that it is also effective in whitening.
  • the other immune cell culture of the present invention includes a medium composition obtained by performing the first and second other immune cell culture methods and proliferated immune cells, and the other immune cell culture is used as a medium composition and the grown immune cells.
  • the culture medium composition from which the proliferated immune cells are removed is used as an active ingredient in a cosmetic composition or pharmaceutical composition, and the isolated immune cells can be used as an active ingredient in an immune cell therapy.
  • the immune cell therapy agent of the present invention contains immune cells isolated from other immune cell cultures as an active ingredient, and the immune cells include NK cells and T cells in which immune tolerance has occurred for a specific patient to be administered the immune cell therapy agent. do.
  • the T cells in which immune tolerance has occurred include NKT cells, helper T cells (Th), cytotoxic T cells (Tc), and gamma delta T cells.
  • immune tolerance is a peripheral isolated from the blood of a healthy donor. It is obtained by culturing blood mononuclear cells (PBMC) and culturing PBMCs derived from a specific patient at a certain time.
  • PBMC blood mononuclear cells
  • the immune cell therapy agent of the present invention can be administered to the patient's body in the form of Ringer by including immune cells in a carrier such as physiological saline, but may further contain known ingredients that do not affect immune cells but are effective in treating patients. Yes, of course.
  • the above-described immune cell culture medium addition kit (NKTM) used in the first and second other immune cell culture methods of the present invention is individually packaged so that it can be added to the medium at each stage of lymphocyte culture, and the contents, that is, components
  • NKTM culture process A detailed description of the specific conditions for the process (NKTM culture process) is disclosed in Patent Publication No. 10-2018-0057359 (hereinafter referred to as "prior patent"), which is a prior patent, so in the following examples, the parts described in the prior patent and We will focus on the other parts.
  • the first other immune cell culture method was performed as follows.
  • PBMCs containing lymphocytes were obtained by separating the red blood cells and granulocyte layers with specific gravity greater than 1.077 down and the mononuclear cell layers and platelets less than 1.077 up.
  • lymphocytes can be extracted from PBMCs and used, but even if PBMCs are cultured as they are, the remaining cells except immune cells (NK cells and T cells) disappear from the culture conditions, so that the same results can be obtained. Can be used.
  • the PBMC isolated from the blood of a healthy donor was performed from Day 0 to Day 10 according to the method described in the example of the prior patent, that is, the NKTM culture method, thereby obtaining a first donor cell culture solution.
  • PBMCs isolated by performing the above-described method from the blood of the patient to be administered the immune cell therapy were also cultured from Day 0 to Day 10 according to the NKTM culture method to obtain a patient cell culture solution.
  • the prepared first donor cell culture solution And patient cell culture solution were mixed at a volume ratio of 1:1 to obtain a first mixed culture solution.
  • the first mixed culture solution was obtained in the same manner as in Example 1, and then cultured for 60 days while replacing the medium composition and harvesting the medium composition in the same manner as in Table 1 below. A medium composition was obtained.
  • the concentration of Cytokine in the culture medium was changed at intervals of 3 to 4 days, the stimulation was changed, and the culture was carried out by changing the medium.
  • the change in the concentration of Cytokine can be implemented by repeating the process from day 8 to day 14 of the NKTM culture process. have. That is, after culturing under a high concentration of C1 solution, the concentration of cytokines can be changed by gradually culturing using a culture bag without cytokines, and gradually releasing the culture bag. When cultured in this way, a large amount of cytokine-rich immune cell culture medium can be obtained using a small amount of immune cells.
  • the second other immune cell culture method was performed as follows.
  • PBMCs isolated from blood from other donors in the same manner as in Example 1 were subjected to Day 0 and Day 1 according to the NKTM culture method to obtain a second donor cell culture solution. At this time, the number of immune cells was 1.2 ⁇ 10 7 cells.
  • PBMCs isolated from the blood of the patient to be administered the immune cell therapy were cultured from Day 0 to Day 14 according to the NKTM culture method to obtain patient cell culture fluid.
  • the patient cell culture solution was added so that the number of immune cells became 0.8 ⁇ 10 7 instead of the D unit that should be added to the second donor cell culture solution on Day 2 to obtain a second mixed culture solution.
  • the second mixed culture solution was subjected to Day 2 to Day 14 according to the NKTM culture method to obtain another immune cell culture 2 containing a medium composition and proliferated immune cells.
  • the target cell was stained with fluorescence, reacted with the effector cell, and the intensity of fluorescence emitted from the target cell destroyed by attack by the effector cell was measured to evaluate the killing ability of the effector cell.
  • Calcein AM a fluorescent reagent
  • Calcein AM is a lipid-soluble diester fluorogenic esterase substrate and can pass through cell membranes. In living cells, it is hydrolyzed by an intracellular esterase of an intact cell membrane, and Calcein AM (non-fluorescence) is converted to Calcein (fluorescence), resulting in fluorescence. Esterase activity is maintained by the intact membrane of living cells, resulting in fluorescence. However, in the case of damaged cell membranes of dead cells, esterase activity is lost, and fluorescence is emitted to prevent fluorescence (in case of dead cells, it is impossible to maintain fluorescence).
  • the target cell When the target cell is fluorescently dyed with Calcein AM and reacted with the effector cell, the target cell attacked by the effector cell is destroyed to emit fluorescence, and only the living target cell becomes fluorescent. The more damage is caused by the effector cell, the higher the fluorescence intensity emitted from the destroyed target cell. It is a device that can measure the fluorescence intensity and can measure the fluorescence intensity emitted from the target cell.
  • the experiment was performed in the following order.
  • Figure 1 shows the FACS data of the Effector cell used in the experiment.
  • Natural glass Well 100 ⁇ l of culture medium (RPMI1640+10% FBS) + 50 ⁇ l of target cell
  • Culture medium Well culture medium (RPMI1640+10% FBS) 150 ⁇ l
  • Cytotoxicity (%) of effector cell (fluorescence value of sample-natural glass fluorescence value)/(maximum glass fluorescence value-natural glass fluorescence value) X100
  • Control(not co-cultured) 1 day Co-cultured
  • Control(not co-cultured) 1 day Co-cultured
  • Effector/target cell 10:1) (10:1) (5:1) (5:1) Cytotoxicity 49.7% 33.8% 35.5% 24.3%
  • Example 1 while performing culture from Day 0 to Day 18, the number of immune cells according to the culture day was observed, and the results are shown in Table 3 and FIG. 3.
  • Example 2 while culturing from Day 0 to Day 60, the number of immune cells according to the culture day was observed, and the results are shown in Table 4 and FIGS. 4A to 4C.
  • the number of cells rapidly decreased after about 17 to 20 days, but the cells of other people were mixed and the concentration of Cytokine in the culture medium was changed at intervals of 3 to 4 days, the stimulation was changed, and the medium was changed. If so, it was confirmed that a large number of immune cells can survive even if the lifespan is more than 60 days.
  • Example 3 while performing culture from Day 0 to Day 14, the number of immune cells according to the culture day was observed, and the results are shown in Table 5, FIGS. 5 and 6.
  • Tc cells initially attack each other and the number of cells slightly decreases, but they cause immune tolerance to each other, so that they no longer attack, and the second other immune cells of the present invention
  • the stimulation caused by the different patient's immune cells i.e., the stimulation caused by the difference, activates the immune cells and proliferates more than expected. have.

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Abstract

본 발명은 면역요법에 적용되는 자연살해세포(Natural Killer cell; NK 세포) 배양방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 면역세포치료제가 투여될 환자가 아니라 건강한 공여자의 혈액에서 유래된 림프구를 배양하여 악성종양 치료에 효과가 뛰어난 NK세포를 효율적으로 증폭 및 활성화시키는 타가면역세포배양방법, 그 방법으로 얻어진 면역세포배양액 및 이를 포함하는 면역세포치료제에 대한 것이다.

Description

타가면역세포배양방법, 그 방법으로 얻어진 면역세포배양액 및 이를 포함하는 면역세포치료제
본 발명은 면역요법에 적용되는 자연살해세포(Natural Killer cell; NK 세포) 배양방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 면역세포치료제가 투여될 환자가 아니라 건강한 공여자의 혈액에서 유래된 림프구를 배양하여 악성종양 치료에 효과가 뛰어난 NK세포를 효율적으로 증폭 및 활성화시키는 타가면역세포배양방법, 그 방법으로 얻어진 면역세포배양액 및 이를 포함하는 면역세포치료제에 대한 것이다.
NK 세포는 림프구의 일종인 특징적인 형태인 거대과립형 림프구(LGL, Large granular lymphocytes)로서, 감염된 바이러스, 종양세포를 죽이는 능력이 뛰어나고 대부분의 정상 세포는 죽이지 않는 특성을 가지고 있는데, 그 항종양 작용은 괴사(necrosis)나 세포예정사(apoptosis), 또는 이들 두 가지 작용기전이 동시에 발생하여 이루어진다. NK 세포는 IL-2, IL-12, 인터페론(Interferon) 등의 사이토카인(cytokine)에 반응하며 이에 의해 역가(cytotoxicity), 분비성(secretory), 증식성(proliferative) 기능이 상승한다. NK 세포의 표현형(phenotype)은 사람에 있어서 CD16(FcγRIII), CD56이며, CD16과 CD56은 세포표면에 TRC(T-cell receptor complex)가 없어 NK세포에 대한 마커(marker)로 활용된다.
이와 같은 NK 세포는 초기 생체방어 기구와 인체의 종양면역에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 즉, NK 세포는 주요조직적합유전자 복합체(Major Histocompatibility Complex : MHC)의 발현에 따른 면역 획득 과정 없이도 특정자기세포, 동종세포, 심지어 이종 암세포도 살상할 수 있으며, 특히 Class1 MHC를 적게 발현하거나 발현하지 않는 표적 세포들을 더 잘 죽일 수 있다. 따라서, NK 세포는 MHC가 발현되지 않는 대부분의 암세포를 효과적으로 죽일 수 있으며, 그 외에도 몇몇 바이러스에 감염된 세포와 장티프스균(salmonella typhi)과 같은 세균들을 죽일 수 있다. 그러나, 이와 같이 암세포 살상에 탁월한 작용을 하는 NK 세포는 정상적인 사람인 경우에도 말초혈액 림프구의 5 ~ 15 % 만을 차지하고 있으며, 특히 암환자의 경우에는 그 비율이나 Cytotoxicity가 많이 저하되기 때문에, 면역요법을 통한 별도의 증폭 과정 없이는 암세포를 효과적으로 공격하는 데에 한계가 있다.
이러한 면역요법은 자연살해세포(Natural Killer cell; NK 세포), 수지상세포(DC), B 세포, T 세포 등 암 치료에 가장 중요한 면역세포를 환자의 혈액에서 추출한 후 여러 종류의 자극제를 이용하여 암에 강하게 작용하는 면역세포로 키운 뒤 다시 환자에게 주입하는 방법으로서, 환자 자신의 혈액을 사용하기 때문에 종래의 화학요법 등에 비해 부작용도 적고 투여법도 간편하여 최근 들어 활발하게 연구되고 있다.
하지만, 항암 면역세포치료제의 경우 자기 혈액에서 면역세포를 분리 배양하여 치료를 받는 자가 면역세포 치료제도 의미가 있으나 중증 말기 암환자의 경우 세포수가 적고 그 활성도가 매우 작아 세포배양이 어려운 경우가 있고 배양기간 동안 기다려야 하는 등 어려움이 많다. 그러나 건강한 다른 사람의 면역세포를 배양하여 치료를 할 수 있다면 세포 배양이 쉽지 않은 중증 말기 암환자에게도 효과적으로 사용할 수 있다.
즉, 이러한 타가 면역세포치료제가 개발될 경우 건강한 사람의 면역세포를 다량으로 미리 배양하여 동결보관하고 있다가 환자가 원할 때 빠른 시간 안에 환자에게 바로 투여하여 효과를 높일 수도 있기 때문이다. 다른 사람의 면역세포를 사용하기 위해서는 순수한 NK세포를 사용하여야만 하는데 그 이유는 다른 사람의 Tc 세포가 환자의 몸을 공격하기 때문이다. 기존의 순수한 NK세포를 만드는 방법은 암세포화된 세포주 등 feeder cell을 사용하고 또는 감마선 처리를 하는 등의 배양하는 과정이 매우 복잡하고 비용이 많이 들어간다.
따라서, 이러한 단점들이 제거된 타가 면역세포치료제 개발기술에 대한 필요성이 존재한다.
본 발명자는 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 연구 노력한 결과, 건강한 공여자의 T세포를 투여 받을 환자에 대해 면역관용을 일으켜 공격하지 않는 세포로 변화시키는 면역세포배양방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 건강한 사람의 T 세포가 투여 받을 환자에 대해 면역 관용을 일으켜서 공격하지 않는 세포로 변하고 세포 증식도 더 잘 될 뿐만 아니라 세포 수명도 길어지는 타가면역세포배양방법, 그 방법으로 얻어진 면역세포배양액 및 이를 포함하는 면역세포치료제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 건강한 공여자의 혈액에서 분리된 림프구말초혈액단핵세포(PBMC)로부터 면역세포 배양시 항CD3 항체를 사용하지 않아도 면역세포를 자극하여 배양이 잘되고 또한 면역관용을 유도하여 T세포가 혼합되어 있는 타인의 면역세포를 면역요법에 사용할 수 있는 타가면역세포배양방법, 그 방법으로 얻어진 면역세포배양액 및 이를 포함하는 면역세포치료제를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않으며, 명시적으로 언급되지 않았더라도 후술되는 발명의 상세한 설명의 기재로부터 통상의 지식을 가진 자가 인식할 수 있는 발명의 목적 역시 당연히 포함될 수 있을 것이다.
상술된 본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 건강한 공여자의 혈액에서 분리된 말초혈액단핵세포(PBMC)를 9일 내지 12일 동안 배양하여 제1공여자세포배양액을 얻는 단계; 면역세포치료제가 투여될 환자의 혈액으로부터 환자유래 PBMC를 준비하는 단계; 상기 제1공여자세포배양액에 상기 환자유래 PBMC를 첨가하여 제1혼합배양액을 얻는 단계; 및 상기 제1혼합배양액을 배양하는 혼합배양단계;를 포함하는 타가면역세포배양방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 건강한 공여자의 혈액에서 분리된 말초혈액단핵세포(PBMC)를 1~2일 동안 배양하여 제2공여자세포배양액을 얻는 단계; 면역세포치료제가 투여될 환자의 혈액으로부터 환자유래 PBMC를 준비하는 단계; 상기 제2공여자세포배양액에 상기 환자유래 PBMC를 첨가하여 제2혼합배양액을 얻는 단계; 및 상기 제2혼합배양액을 배양하는 단계;를 포함하는 타가면역세포배양방법을 제공한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 환자유래 PBMC는 상기 환자의 혈액에서 분리되어 배양되지 않은 PBMC, 상기 환자의 혈액에서 분리된 PBMC를 1 ~ 2일 동안 배양하여 얻어지는 환자세포배양액 또는 상기 환자의 혈액에서 분리된 PBMC를 7일 내지 14일 동안 배양하여 얻어지는 환자세포배양액 중 어느 하나이다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 제1혼합배양액 또는 제2혼합배양액은 상기 제1공여자세포배양액 또는 제2공여자세포배양액에 포함된 면역세포 100개당 상기 환자유래 PBMC에 포함된 면역세포 수가 30개 내지 200개가 되도록 포함된다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 혼합배양단계는 다수의 배지조성물교체 및 배지조성물수확단계를 수행하면서 30일 이상 수행된다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 다수의 배지조성물교체 및 배지조성물수확단계는 3 내지 4일 간격으로 Cytokine의 농도를 변화시키면서 수행된다.
또한, 본 발명은 상술된 어느 하나의 배양방법으로 배양되어 얻어진 배지조성물과 증식된 면역세포를 포함하는 타가면역세포배양물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상술된 타가면역세포배양물로부터 증식된 면역세포가 제거된 배양배지조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상술된 타가면역세포배양물에서 배지조성물을 제거한 후 얻어진 면역세포를 유효성분으로 포함하는 면역세포치료제를 제공한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 면역세포는 NK세포 및 상기 면역세포치료제가 투여될 특정 환자에 대한 면역관용이 일어난 T세포를 포함한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 면역관용이 일어난 T세포는 NKT세포, 도움 T세포(Th), 세포독성 T세포(Tc) 및 감마델타 T세포를 포함한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 면역관용은 건강한 공여자의 혈액에서 분리된 말초혈액단핵세포(PBMC)를 배양하면서 일정 시기에 상기 특정 환자유래 PBMC를 함께 배양하여 얻어진다.
또한, 본 발명은 상술된 타가면역세포배양방법으로 배양되어 다수의 배지조성물교체 및 배지조성물수확단계에서 얻어진 배지조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상술된 배지조성물을 유효성분으로 포함하는 화장료조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상술된 배지조성물을 유효성분으로 포함하는 화상 및 창상을 포함하는 상처 또는 피부질환 치료용 약학조성물을 제공한다.
상술된 본 발명의 타가면역세포배양방법, 그 방법으로 얻어진 면역세포배양액 및 이를 포함하는 면역세포치료제에 의하면, 건강한 사람의 T 세포가 투여 받을 환자에 대해 면역 관용을 일으켜서 공격하지 않는 세포로 변하고 세포 증식도 더 잘 될 뿐만 아니라 세포 수명도 길어지는 효과가 있다.
또한, 본 발명의 타가면역세포배양방법, 그 방법으로 얻어진 면역세포배양액 및 이를 포함하는 면역세포치료제는 건강한 공여자의 혈액에서 분리된 림프구말초혈액단핵세포(PBMC)로부터 면역세포 배양시 항CD3 항체를 사용하지 않아도 면역세포를 자극하여 배양이 잘되고 또한 면역관용을 유도하여 T세포가 혼합되어 있는 타인의 면역세포를 면역요법에 사용할 수 있다.
본 발명의 이러한 기술적 효과들은 이상에서 언급한 범위만으로 제한되지 않으며, 명시적으로 언급되지 않았더라도 후술되는 발명의 실시를 위한 구체적 내용의 기재로부터 통상의 지식을 가진 자가 인식할 수 있는 발명의 효과 역시 당연히 포함된다.
도 1은 T 세포의 면역관용을 유도한 후 저하된 세포 살상력을 확인하는 실험에 사용된 effector 세포의 FACS data를 나타낸 그래프이다.
도 2는 T 세포의 면역관용을 유도한 후 저하된 세포 살상력을 확인하기 위해 통상적인 방법으로 수행된 면역세포의 역가시험 결과 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 타가면역세포배양방법에서 시간에 따른 세포 수 변화를 나타내는 그래프이다.
도 4a 내지 도 4c는 본 발명의 다른 실시예에 따른 타가면역세포배양방법에서 각각 20일, 31일 및 54일에 측정된 FACS data를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 타가면역세포배양방법에서 시간에 따른 세포 수 변화를 나타내는 그래프이다.
도 6은 도 5에서 배양 14일에 측정된 FACS data를 나타낸 그래프이다.
본 발명에서 사용하는 용어는 단지 특정한 실시예들을 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성 요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성 요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안된다. 상기 용어들은 하나의 구성 요소를 다른 구성 요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성 요소는 제2 구성 요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성 요소도 제1 구성 요소로 명명될 수 있다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하며, 본 발명에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
본 발명에서 "면역세포"는 NK세포 및 T세포만을 포함하는 의미로 사용되었다. 또한,"NK세포"는 NK cell과 NKT cell을 모두 포함하는 의미로 사용되지만, 경우에 따라서는 NK cell만을 의미하는 것으로 해석될 수도 있다.
시간 관계에 대한 설명일 경우, 예를 들어, '~후에', '~에 이어서', '~다음에', '~전에' 등으로 시간 적 선후관계가 설명되는 경우, '바로' 또는 '직접'이 사용되지 않는 이상 연속적이지 않은 경우도 포함한다.
이하, 첨부한 도면 및 바람직한 실시예들을 참조하여 본 발명의 기술적 구성을 상세하게 설명한다.
그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화 될 수도 있다. 명세서 전체에 걸쳐 본 발명을 설명하기 위해 사용되는 동일한 참조번호는 동일한 구성요소를 나타낸다.
본 발명의 기술적 특징은 유래가 다른 2종의 면역세포 즉 건강한 공여자의 혈액에서 유래한 면역세포와 환자의 혈액에서 유래한 면역세포를 혼합하여 배양하더라도 배양된 T 세포에 대해 면역 관용을 일으켜서 공격하지 않는 세포로 변화시키고 세포 증식도 더 잘 될 뿐만 아니라 세포 수명까지도 길어지는 효과가 있는 타가면역세포배양방법, 그 방법으로 얻어진 면역세포배양액 및 이를 포함하는 면역세포치료제에 있다.
따라서, 본 발명의 타가면역세포배양방법은 유래가 다른 2종의 면역세포를 혼합하는시점 및 항CD3항체 사용여부에 따라 다음과 같이 두 가지로 분류할 수 있다.
먼저, 본 발명의 제1 타가면역세포배양방법은 건강한 공여자의 혈액에서 분리된 말초혈액단핵세포(PBMC)를 9일 내지 12일 동안 배양하여 제1공여자세포배양액을 얻는 단계; 면역세포치료제가 투여될 환자의 혈액으로부터 환자유래 PBMC를 준비하는 단계; 상기 제1공여자세포배양액에 상기 환자유래 PBMC를 첨가하여 제1혼합배양액을 얻는 단계; 및 상기 제1혼합배양액을 배양하는 혼합배양단계;를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 제1타가면역세포배양방법은 유래가 다른 2종의 면역세포 중 건강한 공여자의 면역세포를 항CD3항체를 사용하여 어느 정도 적어도 7일 이상 배양한 다음 환자유래 PBMC를 혼합하게 되므로 2중으로 자극이 가해져 면역세포의 증식속도 및 수명이 약은 길어지는 장점이 있을 뿐만 아니라, 공여자 중 암 병기가 깊어서 NK 세포가 매우 부족하거나 환자 특이적으로 NK 세포의 배양 증식이 잘 안 되는 환자이거나 환자가 다수일 때 유효한 방법이다. 이러한 환자들의 경우 NK 세포는 배양이 잘 안 되나 T세포는 비교적 배양이 잘 되어 세포수를 많이 늘릴 수 있는데, 유래가 다른 세포를 혼합할 때 자극을 주기 위해 필요한 세포는 T 세포로만 이루어져 있어도 충분하기 때문이다.
다음으로, 본 발명의 제2 타가면역세포배양방법은 건강한 공여자의 혈액에서 분리된 말초혈액단핵세포(PBMC)를 1~2일 동안 배양하여 제2공여자세포배양액을 얻는 단계; 면역세포치료제가 투여될 환자의 혈액으로부터 환자유래 PBMC를 준비하는 단계; 상기 제2공여자세포배양액에 상기 환자유래 PBMC를 첨가하여 제2혼합배양액을 얻는 단계; 및 상기 제2혼합배양액을 배양하는 단계;를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 제2타가면역세포배양방법은 건강한 공여자의 혈액에서 분리된 말초혈액단핵세포(PBMC) 배양 초기에 적어도 배양시작일로부터 3일 이전에 환자유래 PBMC를 혼합함으로써 항CD3 항체를 사용하지 않아도 공여자의 면역세포를 자극하여 배양단계가 더 간단하면서도 면역세포의 배양이 잘 이루어질 뿐만 아니라, 배양초기 이므로 공여자의 면역세포 수가 적어 면역관용을 유도하기 위해 필요한 환자의 면역세포수도 적게 필요한 장점이 있다.
여기서, 제1혼합배양액 및 제2혼합배양액은 모두 공여자세포배양액에 포함된 면역세포 100개당 환자유래 PBMC에 포함된 면역세포가 30 내지 200개 비율로 포함되도록 준비되는데, 이러한 혼합비율은 실험적으로 결정된 것으로 적어도 환자유래 면역세포가 공여자 면역세포 수 대비 30% 이상이어야 면역관용을 유도하는 동시에 면역세포를 효과적으로 자극하여 배양이 잘되기 때문이다. 한편, 공여자 면역세포 수 대비 환자유래 면역세포가 많을수록 완벽한 면역관용을 유도하기 용이하지만 그 비율이 1:2를 초과하는 것은 중환자의 경우 환자에게 부담이 될 수 있어 1:2를 최대치로 설정하였다.
또한, 환자유래 PBMC를 준비하는 단계는 환자의 혈액에서 분리되어 배양되지 않은 PBMC 또는 분리한 PBMC를 1~2일 동안 배양한 환자세포배양액 또는 분리한 PBMC를 7 내지 14일 동안 배양한 환자세포배양액 중 어느 하나를 준비하여 수행될 수 있다. 특히, 환자가 중환자인 경우 환자유래 PBMC로 7 ~ 14일 배양하여 얻어진 환자세포배양액을 사용하면 적은 양을 채혈하여도 세포수가 많이 증식되어 있으므로 여러 번 사용할 수 있어 보다 유리하다. 한편, 환자유래 PBMC는 혈액에서 분리되어 배양되지 않은 상태에서는 면역세포 외에 B세포 같은 다른 단핵구가 포함되어 있을 수 있으나 이후 배양과정에서 면역세포만 생존하게 되므로, 환자세포배양액에는 실질적으로 면연세포만 포함된 상태일 수 있다.
한편, 본 발명의 제1 및 제2 타가면역세포배양방법은 모두 유래가 다른 2종의 면역세포가 혼합되어 배양되므로 면역세포의 수명이 연장되는 효과가 있어, 다수의 배지조성물교체 및 배지조성물수확단계를 수행하면서 30일 이상 혼합배양단계가 수행될 수 있다. 이 때, 다수의 배지조성물교체 및 배지조성물수확단계는 3 내지 4일 간격으로 Cytokine의 농도를 변화시키면서 수행될 수 있다. 한편, 이와 같이 세포의 수명이 연장되면 사이토카인 등 유용성분이 다량 포함된 면역세포가 제거된 배양액 즉 배지조성물 다량 확보할 수 있는데, 주지된 바와 같이 유용성분이 다량 포함된 배지조성물은 화장품이나 의약품의 원료가 될 수 있다. 따라서, 본 발명의 타가면역세포배양방법에 의하면 매우 경제적으로 유용성분이 다량 함유될 뿐만 아니라 혈청이 포함되지 않은 배지조성물을 얻을 수 있게 된다. 특히, 화장품이나 의약품의 원료가 되는 배지조성물을 얻기 위해 본 발명의 타가면역세포배양방법을 실행하는 경우에는 유래가 다른 2종의 면역세포를 1종은 건강한 공여자 유래의 것이고, 1종은 환자유래의 것이 아니라 모두 건강한 공여자들의 혈액으로부터 유래된 PBMC를 사용하여 배양을 수행하게 되면 보다 다량의 배지조성물을 얻는데 유용할 수 있다.
이와 같이 얻어진 배지조성물은 화장료조성물 및 약학조성물의 유효성분으로 사용할 수 있다. 특히, 본 발명자의 배지조성물은 본 발명자의 선행특허인 특허공개번호 제10-2018-0057359호에 기재된 바와 같이 피부 미백, 색소 침착 제거, 주름 개선 중 하나 이상에 유효하며, 알러지 비염, 알러지 피부염, 아토피 피부염, 여드름, 벌레 물려 생긴 염증 등에 염증 개선 효과가 좋았으며 특히 가려움을 신속히 없애 주는 효과가 있고, 화상, 창상 등의 치료를 통한 피부재생효과와 침착 색소의 제거에 효과가 매우 좋았으며 또한 피부미백에도 효과가 있음을 확인하였다.
다음으로, 본 발명의 타가면역세포배양물은 제1 및 제2 타가면역세포배양방법이 수행되어 얻어진 배지조성물과 증식된 면역세포를 포함하는데, 타가면역세포배양물을 배지조성물과 증식된 면역세포로 분리하여, 증식된 면역세포가 제거된 배양배지조성물은 화장료조성물이나 약학조성물의 유효성분으로 사용하여 분리된 면역세포는 면역세포치료제의 유효성분으로 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 면역세포치료제는 타가면역세포배양물에서 분리된 면역세포를 유효성분으로 포함하는데, 면역세포는 NK세포 및 면역세포치료제가 투여될 특정 환자에 대한 면역관용이 일어난 T세포를 포함한다. 여기서, 면역관용이 일어난 T세포는 NKT세포, 도움 T세포(Th), 세포독성 T세포(Tc) 및 감마델타 T세포를 포함하는데, 상술된 바와 같이 면역관용은 건강한 공여자의 혈액에서 분리된 말초혈액단핵세포(PBMC)를 배양하면서 일정 시기에 특정 환자유래 PBMC를 함께 배양하여 얻어지는 것이다. 본 발명의 면역세포치료제는 대체로 면역세포를 생리식염수 등 담체에 포함시켜 링거형식으로 환자의 몸속에 투여될 수 있는데, 면역세포에 영향을 주지 않지만 환자의 치료에 유효한 공지된 성분을 더 포함할 수 있음은 물론이다.
상술된 본 발명의 제1 및 제2 타가면역세포배양방법에서 사용되는 면역세포배양용 배지첨가키트(NKTM)는 림프구배양의 각 단계에서 배지에 첨가될 수 있도록 각각 개별적으로 포장되고 내용물 즉 구성성분이 다른 B유닛, C1-1유닛, C1-2유닛, C2유닛, A1유닛, A2유닛 및 D유닛을 포함하여 구성되는데, 각 유닛에 대한 상세한 설명 및 상기 유닛을 이용하여 면역세포를 배양하는 배양과정(NKTM 배양과정)에 대한 구체적인 조건에 대한 상세한 설명은 선행특허인 특허공개번호 제10-2018-0057359호(이하 "선행특허")에 개시된 바 있으므로, 하기 실시예에서는 선행특허에 기재된 부분과 다른 부분만을 중점적으로 설명하기로 한다.
실시예 1
제1 타가면역세포배양방법을 하기와 같이 수행하였다.
1.제1공여자세포배양액을 얻는 단계
먼저, 인간의 림프구 또는 단핵구 등의 단핵세포가 1.077보다 낮은 비중을 가지는 성질을 이용하여 건강한 공여자의 혈액을 1.077 비중의 Ficoll-Paque Plus용액에 중첩시켜 일정한 원심력으로 원심 침전시킴으로써, 비중의 차이에 따라 비중이 1.077보다 큰 적혈구와 과립구층은 아래로, 1.077 이하인 단핵세포층과 혈소판 등은 위로 분리되게 하여 림프구가 포함된 PBMC를 얻었다. 필요한 경우 PBMC로부터 림프구만을 추출하여 사용할 수 있으나, PBMC 그대로 배양하더라도 이후 배양조건에서 면역세포(NK세포 및 T세포)를 제외한 나머지 세포가 사라지게 되므로 동일한 결과를 얻을 수 있으므로, PBMC와 림프구를 동일하게 해석하여 사용할 수 있다.
그 후, 건강한 공여자의 혈액으로부터 분리된 PBMC를 선행특허의 실시예에 기재된 방법 즉 NKTM배양방법에 따라 Day 0부터 Day 10까지 수행함으로써 제1공여자세포배양액을 얻었다.
2. 환자유래 PBMC를 준비하는 단계
면역세포치료제가 투여될 환자의 혈액으로부터 상술된 방법을 그대로 수행하여 분리된 PBMC를 또한 NKTM배양방법에 따라 Day 0부터 Day 10까지 배양하여 환자세포배양액을 얻었다.
3. 제1혼합배양액을 얻는 단계
선행특허에서 Day11에 세포를 포함한 1차 배양액을 원심분리(400xg)를 통해 면역세포와 무혈청1차배양액으로 분리하여 무혈청1차배양액을 수거하는 것과는 달리, 본 발명에서는 준비된 제1공여자세포배양액과 환자세포배양액을 1:1의 부피비로 혼합하여 제1혼합배양액을 얻었다.
4. 혼합배양단계
제1혼합배양액을 대상으로 NKTM배양방법에 따라 Day 12 내지 Day 18을 수행함으로써 배지조성물과 증식된 면역세포가 포함된 타가면역세포배양물1을 얻었다.
실시예 2
공여자의 혈액과 환자의 혈액을 달리한 것을 제외하면 실시예1과 동일한 방법으로 제1혼합배양액을 얻은 후 하기 표 1과 같은 방법으로 배지조성물교체 및 배지조성물수확을 수행하면서 60일 동안 배양하여 다량의 배지조성물을 얻었다.
이 때, day11에 2개의 bag에 들어있는 세포를 서로 혼합 후 다시 2개의 bag으로 나누어 배양하였다. 또한, 3~4일 간격으로 배양액 중 Cytokine의 농도를 변화시키며 자극의 변화를 주고 배지를 교체해 주며 배양하였는데, Cytokine의 농도 변화는 NKTM 배양과정 중 day8 ~ day14의 과정을 반복해 주는 방식으로 구현할 수 있다. 즉, 고농도의 C1용액 하에서 배양 후 점차 Cytokine이 없는 culture bag을 사용하여 배양하며 culture bag을 조금씩 풀어주는 방법으로 Cytokine의 농도를 변화시켜줄 수 있다. 이러한 방법으로 배양을 하면 적은 양의 면역세포를 이용하여 Cytokine이 풍부한 면역세포 배양액을 많이 얻을 수 있다.
배양일(day) 배양방법 배양일(day) 배양방법
11 배지조성물교체, 세포 혼합 32 배지조성물교체 (배지조성물수확)
13 34
15 배지조성물교체 (배지조성물수확) 37 배지조성물교체 (배지조성물수확)
18 배지조성물교체 (배지조성물수확) 39
20 배지조성물교체 (배지조성물수확) 42 배지조성물교체 (배지조성물수확)
22 배지조성물교체 (배지조성물수확) 44
24 49 배지조성물교체 (배지조성물수확)
24 배지조성물교체 (배지조성물수확) 53 배지조성물교체 (배지조성물수확)
29 54
31 60
실시예 3
제2 타가면역세포배양방법을 하기와 같이 수행하였다.
1. 제2공여자세포배양액을 얻는 단계
다른 공여자의 혈액으로부터 실시예1과 동일한 방법으로 분리된 PBMC를 NKTM배양방법에 따라 Day 0 및 Day 1을 수행함으로써 제2공여자세포배양액을 얻었다. 이 때 면역세포수는 1.2×10 7개였다.
2. 환자유래 PBMC를 준비하는 단계
면역세포치료제가 투여될 환자의 혈액으로부터 분리된 PBMC를 NKTM배양방법에 따라 Day 0부터 Day 14까지 배양하여 환자세포배양액을 얻었다.
3. 제2혼합배양액을 얻는 단계
NKTM배양방법에 따라 Day2에 제2공여자세포배양액에 첨가되어야 하는 D유닛 대신에 환자세포배양액을 면역세포수가 0.8×10 7개가 되도록 첨가하여 제2혼합배양액을 얻었다.
4. 혼합배양단계
제2혼합배양액을 대상으로 NKTM배양방법에 따라 Day 2 내지 Day 14를 수행함으로써 배지조성물과 증식된 면역세포가 포함된 타가면역세포배양물2를 얻었다.
실험예 1
다음과 같이 기저 줄기세포를 사용하여 T 세포의 면역관용을 유도한 후 저하된 세포 살상력을 확인하는 실험을 수행하였는데 즉 어느 특정인의 줄기세포를 이용하여 T 세포의 면역관용을 유도하고 이 줄기세포에 대한 T 세포의 살상력을 비교함으로써 면역관용을 확인하였다. 줄기세포는 세포 표면에 MHC class I 분자를 다른 세포들보다 적게 발현하는 것으로 알려져 있다. 실험에 사용된 줄기세포는 제대에서 얻은 passage8 줄기세포를 사용하였다. 세포배양 day14에 수확한 면역세포(NK 세포 순도 : 69%)를 사용하였고 이 면역세포에 줄기세포가 약 30%되게 섞어서 하루 배양한 후 면역세포의 역가실험을 하였다. 즉 effector cell로서 면역세포를 사용하였고 target cell로서 전날 함께 배양했던 줄기세포와 같은 사람의 줄기세포를 사용하여 시험하였으며 다음의 통상적인 방법으로 면역세포의 역가시험을 하였다.
[역가시험]
In vitro상에서 Target cell을 형광염색하여 Effector cell과 함께 반응시켜 Effector cell에 의해 공격 받아 파괴된 Target cell로부터 방출된 형광강도를 측정하여 Effector cell의 살해능력을 평가하였다. 세포상해활성이 높을수록 형광 강도의 측정치는 높아진다.
형광발색시약인 Calcein AM은 lipid-soluble diester fluorogenic esterase substrate이며 세포막을 통과할 수 있다. 살아있는 세포에서 손상되지 않은 세포막의 세포내 esterase에 의하여 가수분해되어 Calcein AM(non-fluorescence)이 Calcein (fluorescence)으로 전환되어 형광을 띠게 된다. 살아있는 세포의 손상되지 않은 막에 의하여 esterase activity가 유지되어 형광을 띤다. 그러나 죽은 세포의 손상된 세포막의 경우 esterase activity가 상실되어 형광을 방출하여 형광을 띠지 못하게 된다(죽은 세포의 경우 형광유지가 불가능하다).
Target cell에 Calcein AM으로 형광염색하여 Effector cell과 반응시키면 Effector cell에 의해 공격을 받은 Target cell은 파괴되어 형광을 방출시키고 살아있는 Target Cell에만 형광을 띠게 된다. Effector cell에 의하여 손상을 많이 받을수록 파괴된 Target cell로부터 방출된 형광 강도는 높아진다. 형광강도를 측정할 수 있는 기기로 Target cell로부터 방출된 형광강도를 측정할 수 있다.
다음의 순서로 실험을 수행하였다.
1) Target Cell을 15㎖ tube에 모아 1500rpm에서 5분 동안 원심분리한다. 상층액을 버리고 1㎖의 배양액(RPMI1640 + 10% FBS)으로 pellet을 풀어준 후 Cell counting 한다.
2) 1.5㎖ tube에 세포수가 1×10 6/㎖이 되도록 한 후 Calcein AM(1㎎/DMSO 1㎖)염색액을 10㎕을 첨가하고 5% CO2, 37℃에서 30분 동안 Incubation한다.
3) Incubation 후 상층액을 제거하고 1㎖ 의 배양액(RPMI1640 + 10% FBS)로 Cell을 Washing한다. (2번 반복한다.)
4) Effector cell을 1500rpm에서 5분 동안 원심분리 후 배양액 (RPMI1640 + 10% FBS)으로 1번 Washing하여 준다. 도 1에 실험에 사용된 Effector cell의 FACS데이터를 나타내었다.
5) 상층액을 버린 후 1㎖의 배양액을 첨가한 후 Hemocytometer로 cell counting하여 세포농도를 Target cell의 10배와 5배의 농도로 준비한다.
6) 96 well plate에 control 과 Target cell / Effector cell을 제작하여 well에 분주한다.
7) 자연유리 Well(Negative control) : 배양액(RPMI1640+10%FBS) 100㎕ + Target cell 50㎕
8) 최대유리 Well(Positive control) : 배양액(RPMI1640+10%FBS) 70㎕ + Target cell 50㎕ +1% Triton X-100 30㎕
9) 배양액 Well : 배양액(RPMI1640+10%FBS) 150㎕
10) 검체 Well : Target cell 50㎕ + Effector cell 100㎕
11) 반응이 잘되도록 배양액과 시료를 섞어준다.
12) 5% CO2, 37℃에서 4시간 Incubation한다.
13) 반응 후 1500 rpm에서 5분 동안 원심분리한다.
14) 원심분리 후 120㎕를 black plate로 옮겨 Fluoroskan ascent plate reader로 형광값을 측정한다.
15) 다음의 계산식을 이용하여 Cytotoxicity를 계산한다.
Effector cell의 Cytotoxicity(%) = (검체의 형광값-자연유리 형광값)/(최대유리형광값-자연유리형광값)X100
상기와 같은 실험을 통해 얻어진 공 배양된 면역 세포(effector : 표적 세포)의 세포 독성을 비교하고 그 결과를 표 2 및 도 2에 나타내었다.
Control(not co-cultured) 1 dayCo-cultured Control(not co-cultured) 1 dayCo-cultured
Effector/target cell (10:1) (10:1) (5:1) (5:1)
Cytotoxicity 49.7% 33.8% 35.5% 24.3%
표 2 및 도 2의 결과로부터 면역관용이 일어나는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 줄기세포의 경우 그 표면에 MHC class I 분자가 많이 표현되지 않는 것으로 알려져 있으며 이 경우 NK세포의 공격을 받기가 쉬워지고 MHC class I 분자가 많이 표현된 줄기세포는 서로 다름으로 인한 다른 사람의 Tc(CD8+T세포)에 의해 공격을 받아 죽게 되는데, 표 2 및 도 2에서 보는 바와 같이 줄기세포를 혼합 배양하여 면역관용을 유도한 면역세포의 활성도는 그렇지 않은 면역세포보다 활성이 많이 떨어져 있음을 확인할 수 있었기 때문이다. 다만, 여전히 어느 정도 활성이 있는 것은 NK세포에 의한 것으로 생각되며 이렇듯 동종의 세포를 함께 배양하여 대상 세포에 대한 면역관용이 유도되는 것을 확인하였고 이를 이용하여 T 세포를 제거하지 않고도 보다 쉽게 동종 면역세포치료제를 만들 수가 있음을 알 수 있다.
실험예 2
실시예1에서 Day 0부터 Day 18까지 배양을 수행하면서 배양일에 따른 면역세포수를 관찰하고 그 결과를 표 3 및 도 3에 나타내었다.
배양일 0 4 6 8 12 13 14 15 17 19
제1공여자세포배양액세포수(×10 7) 0.5 0.6 2.3 8.5 71.5 　 　 　 　 　
환자세포배양액세포수(×10 7) 0.55 0.5 2.1 8.1 68.3 　 　 　 　 　
세포수합계(×10 7) 1.05 1.1 4.4 16.6 139.8 135 235 360 420 450
표 3 및 도 3의 결과는 두 사람의 세포를 섞었을 때 처음에는 Tc 세포가 서로 공격하여 세포수가 약간 줄지만 서로 면역관용을 일으켜 더 이상 공격하지 않게 되고 또한 서로 다름으로 인한 자극으로 면역세포는 더 활성화 되어 예상했던 것보다 더 많이 증식되게 된다. 또한, 세포 수명도 길어져 day14 ~ day 21 사이에 cell harvest가 가능함을 알 수 있다.
실험예 3
실시예 2에서 Day 0부터 Day 60까지 배양을 수행하면서 배양일에 따른 면역세포수를 관찰하고 그 결과를 표 4 및 도 4a 내지 도 4c에 나타내었다.
배양일(Day) 세포 수 (x10 7) 기타
제2공여자세포배양액 환자세포배양액
0 1.1 0.9
4 0.7 0.5
6 3.96 2.1
8 14.1 8.5
11 51.2 40.5
13
15
18
20 305.2 NK : 35.16, NKT:29.3, gdT:35.12
22 303.5
24 350
24
29
31 389 NK : 29.13, NKT:50.7, gdT:34
32
34 420
37
39 363
42
44 303
49
53
54 215 NK : 35.88, NKT : 16.2, gdT : 18.52역가(10:1) : 41.2%
60 120
표 4 및 도 4a 내지 도 4c로부터 알 수 있듯이, 실험예 2와 동일하게 두 사람의 세포를 섞었을 때 처음에는 Tc 세포가 서로 공격하여 세포수가 약간 줄지만 서로 면역관용을 일으켜 더 이상 공격하지 않게 되고 또한 서로 다름으로 인한 자극으로 면역세포는 더 활성화 되어 예상했던 것보다 더 많이 증식되게 된다. NK세포 또한 K562 cell line에 대한 세포독성이 매우 크게 나타나는 것으로 보아 면역관용과 상관없이 NK면역세포는 그 활성을 유지하는 것으로 밝혀졌다. 또한 세포 수명이 매우 길어짐을 확인할 수 있었다. 기존의 배양방법으로는 약 17일에서 20일 정도 지나면 세포수가 급격히 줄어들었으나 다른 사람의 세포를 혼합하고 3~4일 간격으로 배양액 중 Cytokine의 농도를 변화시키며 자극의 변화를 주고 배지를 교체해 주며 배양하였을 경우 그 수명이 60일 이상이 되어도 많은 수의 면역세포가 생존할 수 있음을 확인하였다.
실험예 4
실시예 3에서 Day 0부터 Day 14까지 배양을 수행하면서 배양일에 따른 면역세포수를 관찰하고 그 결과를 표 5, 도 5 및 도 6에 나타내었다.
배양일 0 4 6 8 11 14
세포수(X10 7) 1.2 1.0 3.6 13.1 115 325
표 5, 도 5 및 도 6의 또한 두 사람의 세포를 섞었을 때 처음에는 Tc 세포가 서로 공격하여 세포수가 약간 줄지만 서로 면역관용을 일으켜 더 이상 공격하지 않게 되고 본 발명의 제2타가면역세포배양방법에 따라 배양 초기에 항CD3항체를 사용하여 자극을 하지 않더라도 유래가 다른 환자의 면역세포로 인한 즉 서로 다름으로 인한 자극으로 면역세포가 더 활성화 되어 예상했던 것보다 더 많이 증식되는 것을 알 수 있다.
본 발명은 이상에서 살펴본 바와 같이 바람직한 실시 예를 들어 도시하고 설명하였으나, 상기한 실시 예에 한정되지 아니하며 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변경과 수정이 가능할 것이다.

Claims (15)

  1. 건강한 공여자의 혈액에서 분리된 말초혈액단핵세포(PBMC)를 9일 내지 12일 동안 배양하여 제1공여자세포배양액을 얻는 단계;
    면역세포치료제가 투여될 환자의 혈액으로부터 환자유래 PBMC를 준비하는 단계;
    상기 제1공여자세포배양액에 상기 환자유래 PBMC를 첨가하여 제1혼합배양액을 얻는 단계; 및
    상기 제1혼합배양액을 배양하는 혼합배양단계;를 포함하는 타가면역세포배양방법.
  2. 건강한 공여자의 혈액에서 분리된 말초혈액단핵세포(PBMC)를 1~2일 동안 배양하여 제2공여자세포배양액을 얻는 단계;
    면역세포치료제가 투여될 환자의 혈액으로부터 환자유래 PBMC를 준비하는 단계;
    상기 제2공여자세포배양액에 상기 환자유래 PBMC를 첨가하여 제2혼합배양액을 얻는 단계; 및
    상기 제2혼합배양액을 배양하는 단계;를 포함하는 타가면역세포배양방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 환자유래 PBMC는 상기 환자의 혈액에서 분리되어 배양되지 않은 PBMC 또는 상기 환자의 혈액에서 분리된 PBMC를 7일 내지 14일 동안 배양하여 얻어지는 환자세포배양액 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 타가면역세포배양방법.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 제1혼합배양액 또는 제2혼합배양액은 상기 제1공여자세포배양액 또는 제2공여자세포배양액에 포함된 면역세포 100개당 상기 환자유래 PBMC에 포함된 면역세포 수가 30개 내지 200개가 되도록 포함하는 것을 특징으로 하는 타가면역세포배양방법.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 혼합배양단계는 다수의 배지조성물교체 및 배지조성물수확단계를 수행하면서 30일 이상 수행되는 것을 특징으로 하는 타가면역세포배양방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 다수의 배지조성물교체 및 배지조성물수확단계는 3 내지 4일 간격으로 Cytokine의 농도를 변화시키면서 수행되는 것을 특징으로 하는 타가면역세포배양방법.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항의 배양방법으로 배양되어 얻어진 배지조성물과 증식된 면역세포를 포함하는 타가면역세포배양물.
  8. 제 7 항의 타가면역세포배양물로부터 증식된 면역세포가 제거된 배양배지조성물.
  9. 제 7 항의 타가면역세포배양물에서 배지조성물을 제거한 후 얻어진 면역세포를 유효성분으로 포함하는 면역세포치료제.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 면역세포는 NK세포 및 상기 면역세포치료제가 투여될 특정 환자에 대한 면역관용이 일어난 T세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역세포치료제.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 면역관용이 일어난 T세포는 NKT세포, 도움 T세포(Th), 세포독성 T세포(Tc) 및 감마델타 T세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역세포치료제.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 면역관용은 건강한 공여자의 혈액에서 분리된 말초혈액단핵세포(PBMC)를 배양하면서 일정 시기에 상기 특정 환자유래 PBMC를 함께 배양하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 면역세포치료제.
  13. 제 5 항의 타가면역세포배양방법으로 배양되어 다수의 배지조성물교체 및 배지조성물수확단계에서 얻어진 배지조성물.
  14. 제 13 항의 배지조성물을 유효성분으로 포함하는 화장료조성물.
  15. 제 13 항의 배지조성물을 유효성분으로 포함하는 화상 및 창상을 포함하는 상처 또는 피부질환 치료용 약학조성물.
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