WO2020183051A1 - Procedimiento para obtención y conservación de factores de crecimiento de alta pureza y sus usos - Google Patents

Procedimiento para obtención y conservación de factores de crecimiento de alta pureza y sus usos Download PDF

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Definitions

  • PROCEDURE FOR OBTAINING AND CONSERVING HIGH PURITY GROWTH FACTORS AND THEIR USES
  • the present invention relates to a process for obtaining and conserving high purity growth factors (greater than 90%) applicable in clinical bioregeneration treatments, particularly in stomatology, dentistry, aesthetics, traumatology, dermatology and rheumatology.
  • Platelets are cells that do not have a nucleus and therefore lack cell division properties. These cytoplasmic fragments from the megakaryocyte division contain three types of granules inside: dense granules, lysosomal and alpha granules. Alpha granules are of great interest since inside they house the so-called growth factors (FC) that have various tissue repair functions and marked angiogenic activity. Thus, there is the beta transforming FC, the epidermal or epithelial growth FC, the vascular endothelial FC (angiogenic), the acid-base fibroblast FC and the IGF I insulin type, among others.
  • FC growth factors
  • FCs released by alpha granules have been shown to be effective in inducing tissue and functional regeneration in tissues with affected or underactive cells. For example, if a fibroblast in the skin has stopped producing collagen, an injection of autologous FC in the area to be treated provides an inducing factor on the fibroblast (or target cell), resulting in the 'new' production of collagen from the fibroblast. affected.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) They do not have regenerative action, but must be activated in order for the alpha granules to release the FC.
  • Procedures for obtaining PRP are widely described in the state of the art.
  • document ES2567603T3 discloses a method that makes it possible to generate a PRP concentrate, and that comprises the separation from a sample of whole blood mixed with anticoagulants of a fraction of plasma poor in platelets and of another one rich in platelets by means of centrifugation.
  • the method further includes platelet count determination of platelet concentration after separation, and a procedure comprising mixing platelet-rich volumes with platelet-poor volumes so that a desired minimum concentration of 800,000 to 2,000,000 is achieved. platelets / pl in all fractions.
  • document WO2014126931A describes the obtaining of PRP for cosmetic (aesthetic) or therapeutic uses in the field of traumatology and rheumatology.
  • the production process comprises the use of calcium chloride as an activator and inducer of gel formation from PRP.
  • reference is made to the possibility of cryo-preserving the material obtained at temperatures below -20 ° C by known procedures for the preservation of cells.
  • a publication entitled "Platelet-rich plasma” ⁇ describes a procedure for obtaining PRP and its activation for application in dentistry.
  • the steps of extraction of the blood sample and deposit in containers are described.
  • addition of 3.2% sodium citrate as anticoagulant, centrifugation and addition of 10% calcium chloride or calcium gluconate as platelet activator to obtain growth factors to be used in dentistry.
  • the present invention refers to a process for obtaining and conserving growth factors of high purity (above 90%) that can be used in cellular bioregeneration processes.
  • the method of the present invention consists in that, once a platelet-rich plasma is available, the following steps are carried out: a) adding a platelet membrane breaking agent to a platelet-rich plasma to obtain a factor-rich plasma growth;
  • step b) incubating the plasma rich in growth factors of step a) for 30 to 40 minutes at a temperature between 37 and 40 ° C;
  • step b) cooling the plasma rich in growth factors of step b) for 5 to 7 minutes to obtain a gel and a supernatant, said supernatant containing growth factors at a concentration greater than% 90;
  • step d) freeze the supernatant with growth factors from step d) at a temperature between -40 ° C and -18 ° C.
  • the supernatant obtained in step c) does not contain platelet remains.
  • the process of the present invention is preferably carried out in a sterile environment, optionally in a laminar flow hood.
  • the platelet membrane breaking agent is in charge of releasing the growth factors, optionally the platelet membrane breaking agent is sodium gluconate in solution, preferably with a concentration between 100 mg / ml_.
  • the solution is added to the platelet-rich plasma at 20% v / v.
  • the growth factors (without platelet residues) obtained by the process of the present invention have been shown to be more effective when used in bioregeneration processes compared to the performance of other forms of plasma derivatives such as platelet-rich plastics, PRGF and PRGF activated.
  • a greater effect is achieved with lower doses of product and fewer applications, which demonstrates better assimilation by the patient.
  • the product is stored for up to 18 months and shows to maintain its effectiveness in terms of growth factor content.
  • the product does not show loss of effectiveness when defrosted up to three times.
  • Example 1 Obtaining and preserving pure growth factors
  • the tube was incubated for 30 minutes at 40 ° C. Then it was fan cooled for 5 minutes. This process was carried out in an ISM Equipment)
  • a gel and a supernatant were obtained with the growth factors.
  • the tube was inverted and with the help of a syringe the supernatant was extracted until the gel was very
  • the material Since the supernatant containing the pure growth factors loses its activity very quickly at room temperature, the material is deposited quickly (in a time significantly less than 5 minutes) in sterile vials.
  • the vials Prior to use, the vials are subjected to a bacteriological control to guarantee their sterility.
  • the sterile vials are then frozen at -18 ° C and, in some cases, at -40 ° C using dry ice.

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Abstract

La presente invención se refiere a un procedimiento para la obtención y conservación de factores de crecimiento de alta pureza(con una concentración mayor de 90%).El procedimiento comprende las etapas de activación un plasma rico en factores de crecimiento, incubación, enfriamiento, extracción de factores de crecimiento con una concentración mayor de 90% y ultracongelación. Los factores de crecimiento obtenidos mediante el procedimiento de la presente invención se utilizan en tratamientos de bioregeneración de tejidos.

Description

PROCEDIMIENTO PARA OBTENCIÓN Y CONSERVACIÓN DE FACTORES DE CRECIMIENTO DE ALTA PUREZA Y SUS USOS
SECTOR TÉCNICO
La presente invención se refiere a procedimiento para obtención y conservación de factores de crecimiento de alta pureza (mayores al 90%) aplicable en tratamientos clínicos de bioregeneración, particularmente en estomatología, odontología, estética, traumatología, dermatología y reumatología.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las plaquetas (PLT), comúnmente conocidas por su papel en el proceso de coagulación, son células que no poseen núcleo por lo que carecen de propiedades de división celular. Estos fragmentos citoplasmáticos procedentes de la división del megacariocito contienen tres tipos de gránulos en su interior: gránulos densos, lisosomales y gránulos alfa. Los gránulos alfa son de gran interés ya que en su interior albergan los llamados factores de crecimiento (FC) que poseen diversas funciones reparadoras de tejidos y marcada actividad angiogénica. De esta forma, existe el FC transformante beta, el FC de crecimiento epidérmico o epitelial, el FC endotelial vascular (angiogénico), el FC fibroblástico ácido-básico y el insulínico tipo IGF I, entre otros.
Los FC liberados por los gránulos alfa han demostrado ser efectivos para inducir la regeneración tisular y funcional en tejidos con células afectadas o hipofuncionantes. Por ejemplo, si un fibroblasto de la piel ha dejado de producir colágeno, una inyección de FC autólogos en la zona a tratar, proporciona un factor inductor sobre el fibroplasto (o célula diana), resultando en la ‘nueva’ producción de colágeno del fibroblasto afectado.
Por lo anterior, el plasma rico en factores de crecimiento activado (PRGF, de sus siglas en inglés Plasma Rich Growth Factor) tiene un gran interés científico. Su procedimiento de obtención va más allá de efectuar una extracción de sangre y centrifugarla para separar la fracción más rica en plaquetas. Las plaquetas por sí solas 1
HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) no tienen acción regenerativa, sino que deben ser activadas a fin de que los gránulos alfa liberen los FC.
En el estado de la técnica se describen ampliamente procedimientos para obtención de PRP. Por ejemplo, el documento ES2567603T3 divulga un método que permite generar un concentrado de PRP, y que comprende la separación a partir de una muestra de sangre entera mezclada con anticoagulantes de una fracción de plasma pobre en plaquetas y de otra rica en plaquetas mediante centrifugación. El método incluye además la determinación por recuento de plaquetas de la concentración de estas después de la separación, y un procedimiento que comprende mezclar volúmenes ricos en plaquetas con volúmenes pobres en plaquetas de forma que se alcance una concentración mínima deseada de 800.000 a 2.000.000 de plaquetas/pl en todas las fracciones.
También, el documento WO2014126931A describe la obtención de PRP para usos cosméticos (estética) o terapéuticos en el ámbito de la traumatología y la reumatología. El procedimiento de obtención comprende el uso de cloruro de calcio como agente activador e inductor de la formación de gel a partir del PRP. Además, se hace referencia a la posibilidad de crio-preservar el material obtenido a temperaturas inferiores a -20°C por procedimientos conocidos para la preservación de células.
Por otra parte, también se describen algunos procedimientos para activación de PRP y las utilidades biológicas y médicas del producto. Ejemplos de esto puede encontrarse en el documento ES2527967A2, que indica el uso de gluconato de sodio como activador del plasma rico en plaquetas.
De manera particular, además, una publicación titulada“Plasma rico en plaquetas"\ describe un procedimiento para obtención de PRP y su activación para aplicación en odontología. En dicho documento se describen las etapas de extracción de la muestra de sangre y depósito en recipientes, adición de citrato sódico al 3,2% como anticoagulante, centrifugación y adición de cloruro de calcio al 10% o gluconato de calcio como activador plaquetario para obtener factores de crecimiento a ser utilizado en odontología.
1 https://issuij.com/robertohdzvides/docs/piasma rico en plaquetas. pptx
2
HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) Aunque se describen varios procedimientos para la obtención del plasma con factores de crecimiento, la gran mayoría de estos procedimientos llegan a un plasma con contenido medio de factores de crecimiento que tienen que ser utilizados de forma inmediata ya que, de otra forma, disminuye la calidad del plasma en cuanto al contenido de factores de crecimiento activado.
Es así como los inventores de la presente invención, tras extensos y exhaustivos experimentos, han desarrollado un procedimiento de obtención de factores de crecimiento puros y conservación de estos de tal forma que puedan ser utilizados posteriormente de manera efectiva.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Por tanto, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para obtención y conservación de factores de crecimiento de alta pureza (por encima del 90%) que puedan ser utilizados en procesos de bioregeneración celular.
El procedimiento de la presente invención consiste en que, una vez se cuenta con un plasma rico en plaquetas, se realizan las etapas de: a) adicionar un agente rompedor de membrana de plaquetas a un plasma rico en plaquetas para obtener un plasma rico en factores de crecimiento;
b) incubar el plasma rico en factores de crecimiento de la etapa a) durante 30 a 40 minutos a una temperatura entre 37 y 40 °C;
c) enfriar el plasma rico en factores de crecimiento de la etapa b) durante 5 a 7 minutos para obtener un gel y un sobrenadante, dicho sobrenadante que contiene factores de crecimiento a una concentración mayor del % 90;
d) extraer el sobrenadante con factores de crecimiento de la etapa c);
e) ultracongelar el sobrenadante con factores de crecimiento de la etapa d) a una temperatura entre -40°C y -18°C.
El sobrenadante obtenido en la etapa c) no contiene restos de plaquetas.
El procedimiento de la presente invención se realiza preferiblemente en un ambiente estéril, opcionalmente en una campana de flujo laminar.
-3-
HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) En la etapa a), el agente rompedor de membrana de plaquetas es el encargado de liberar los factores de crecimiento, opcionalmente el agente rompedor de membrana de plaquetas es gluconato sódico en solución, preferiblemente con una concentración entre 100 mg/ml_. Preferiblemente, la solución se adiciona al plasma rico en plaquetas al 20% v/v.
Los factores de crecimiento (sin restos de plaquetas) obtenidos mediante el procedimiento de la presente invención han demostrado tener una mayor efectividad cuando se utiliza en procesos de bioregeneración en comparación con el desempeño de otras formas de derivados plasmáticos como plasta rico en plaquetas, PRGF y PRGF activado. Al utilizar los factores de crecimiento de la presente invención se consigue un mayor efecto con menores dosis de producto y menor número de aplicaciones, lo que demuestra una mejor asimilación por parte del paciente.
Adicionalmente, el producto es almacenado hasta 18 meses y demuestra mantener su efectividad en cuanto a contenido de factores de crecimiento. El producto no presenta pérdida de efectividad al descongelarlo hasta tres veces.
EJEMPLOS
Para una mejor comprensión y con carácter no limitativo, la presente invención se describe en más detalle en los ejemplos de realización y ensayos descritos a continuación.
Ejemplo 1. Obtención y conservación de factores de crecimiento puros
Dentro de una campana de flujo laminar, en un tubo Vacutainer de 6 mililitros de depositó 1 mililitros de PRP con 0,2 mililitros de gluconato sódico en solución (con una concentración de 100 mg/ml).
El tubo se incubó durante 30 minutos a 40°C. Seguidamente, se enfrió con ventilador durante 5 minutos. Este proceso se llevó a cabo en un ISM Equipment)
Se obtuvo un gel y un sobrenadante con los factores de crecimiento. Se invirtió el tubo y con la ayuda de una jeringa se extrajo el sobrenadante hasta que el gel quedara muy
-4-
HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) reducido.
Debido a que el sobrenadante que contiene los factores de crecimiento puros pierde muy rápidamente su actividad a temperatura ambiente, se procede rápidamente (en un tiempo significativamente inferior a 5 minutos) a depositar el material en viales estériles.
Previa utilización, los viales se someten a un control bacteriológico para garantizar su esterilidad.
Seguidamente, se congelan los viales estériles a -18 °C y, en algunos casos, a -40°C utilizando nieve carbónica.
-5-
HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26)

Claims

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento para obtención de factores de crecimiento puros, caracterizado por que comprende las etapas de:
a. adicionar un agente rompedor de membrana de plaquetas a un plasma rico en plaquetas, para obtener un plasma rico en factores de crecimiento;
b. incubar dicho plasma rico en factores de crecimiento de la etapa a) durante 30 a 40 minutos a una temperatura entre 37 y 40 °C;
c. enfriar el plasma rico en factores de crecimiento de la etapa b) durante 5 a 7 minutos para obtener un gel y un sobrenadante, en que dicho sobrenadante contiene factores de crecimiento a una concentración mayor de 90%;
d. extraer el sobrenadante con factores de crecimiento de la etapa c);
e. ultracongelar el sobrenadante con factores de crecimiento de la etapa d) a una temperatura entre -40°C y -18°C.
2. El procedimiento de la reivindicación 1 , caracterizado porque el agente rompedor de membrana de plaquetas es gluconato sódico en solución.
3. El procedimiento de la reivindicación 2, caracterizado porque el gluconato sódico en solución tiene una concentración de 100 mg/ml_ y es adicionado al plasma rico en plaquetas al 20% v/v.
4. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se realiza en un ambiente estéril.
6
HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26)
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