TW202313097A - 用於獲得和保存高純度生長因數的方法 - Google Patents
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Abstract
本發明涉及用於獲得和保存高純度生長因數(濃度大於90%)的方法。所述方法包括以下階段:活化富含生長因數的血漿、孵育、冷卻、提取濃度大於90%的生長因數以及超冷凍。使用本發明的方法獲得的生長因數用於組織生物再生治療。
Description
本發明涉及用於獲得和保存可應用于臨床生物再生治療,特別是口腔醫學、牙科學、美學、創傷學、皮膚病學和風濕病學的高純度生長因數(大於90%)的方法。
血小板(通常已知其在凝血過程中的作用)是不具有細胞核並且因此缺乏細胞分裂特性的細胞。來自巨核細胞分裂的這些胞質片段在其內部包含三種類型的顆粒:緻密顆粒、溶酶體和α顆粒。α顆粒是非常令人感興趣的,因為在其內部,其包含所謂的生長因數(GF),所述生長因數具有數種組織修復功能和顯著的血管生成活性。存在不同類型的GF,例如β轉化GF、表皮或上皮GF、血管內皮GF(血管生成)、酸性和鹼性成纖維細胞GF和胰島素樣IGF-I等。
由α顆粒釋放的GF已被證明在具有受影響或低活性的細胞的組織中在誘導組織再生和功能再生方面是有效的。例如,如果皮膚中的成纖維細胞已停止產生膠原蛋白,則在待處理區域中注射自體GF會在成纖維細胞(或靶細胞)上提供誘導因數,從而導致從受影響的成纖維細胞中“新”產生膠原蛋白。
基於以上所述,富含生長因數的活化血漿(PRGF)具有重大的科學意義。其獲得方法不僅僅是對其進行血液提取和離心以分離最富含血小板的級分。單獨的血小板不具有再生作用,而必須被活化以使α顆粒釋放GF。
現有技術中廣泛描述了用於獲得富血小板血漿(PRP)的方法。例如,ES2567603T3公開了允許產生富血小板血漿濃縮物的方法,並且所述方法包括通過離心手段從與抗凝血劑混合的全血樣品中分離貧血小板血漿的級分和富血小板血漿級分的另一級分。所述方法還包括在分離之後對血小板濃度進行血小板計數測定,以及包括以下的方法:將富血小板體積與貧血小板體積混合以使得在所有級分中實現800,000至2,000,000個血小板/μL的期望最小濃度。
另外,WO2014126931A描述了用於獲得在創傷學和風濕病學領域中用於美容(美學)或治療用途的PRP的方法。這樣的方法包括使用氯化鈣作為活化劑和從PRP形成凝膠物的誘導劑。此外,提及了通過已知的細胞保存方法在低於-20℃的溫度下冷凍保存所獲得的材料的可能性。
在另一方面,還描述了一些PRP活化方法以及所述產物的生物學和醫學效用。其一些實例可見於ES2527967A2中,其表明使用葡萄糖酸鈉作為富血小板血漿的活化劑。
此外,特別是題為“
”1的出版物(可從 https://issuu.com/robertohdzvides/docs/plasma_rico_en_plaquetas.pptx獲得)描述了用於獲得PRP的方法以及其活化以應用於牙科學。該檔描述了以下步驟以獲得待用於牙科學的生長因數:提取血液樣品並使其在容器中沉積、添加3.2%檸檬酸鈉作為抗凝血劑、離心並添加10%氯化鈣或葡萄糖酸鈣作為血小板活化劑。
儘管描述了用於獲得具有生長因數的血漿的數種方法,但這些方法中的絕大多數獲得了必須立即使用的具有中等含量生長因數的血漿,因為,否則血漿的品質在經活化的生長因數的含量方面降低。
這就是本發明的發明人在進行廣泛和詳盡的實驗之後,如何開發了用於獲得純的生長因數並以其可在之後以有效方式使用的方式保存所述生長因數的方法。
因此,在第一方面中,本發明涉及用於獲得和保存可用于細胞生物再生過程的高純度生長因數(大於90%)的方法。
本發明的方法在於,一旦可獲得富血小板血漿,則進行以下步驟:
a)向富血小板血漿添加血小板膜破裂劑以獲得富含生長因數的血漿;
b)將來自步驟a)的富含生長因數的血漿在37℃至40℃的溫度下孵育30至40分鐘;
c)將來自步驟b)的富含生長因數的血漿冷卻5至7分鐘以獲得凝膠物和上清液,所述上清液包含濃度大於90%的生長因數;
d)對來自步驟c)的具有生長因數的上清液進行提取;
e)在-40℃至-18℃的溫度下深度冷凍來自步驟d)的具有生長因數的上清液。
在步驟c)中獲得的上清液不包含血小板殘餘物。
本發明的方法優選地在無菌環境中進行,任選地在層流罩中進行。
在步驟a)中,血小板膜破裂劑負責釋放生長因數,任選地,血小板膜破裂劑是葡萄糖酸鈉溶液,優選地濃度為100 mg/mL。優選地,溶液以20% v/v添加至富血小板血漿。
與其他形式的血漿衍生物例如富血小板血漿、PRGF和活化的PRGF的性能相比,通過本發明的方法獲得的生長因數(不含血小板殘餘物)在用於生物再生過程時顯示出更有效。通過使用本發明的生長因數,以更低劑量的產物和更少的施加獲得了更大的作用,這表明被患者更好的吸收。
此外,該產物儲存長達18個月並且在生長因數含量方面顯示出維持其有效性。在解凍多至三次時該產物未顯示出有效性的損失。
為了更好地理解並且以非限制性的方式,在下述實施方案和測試中更詳細地描述本發明。
實施例:獲得和保存純的生長因數
在層流罩內,在6毫升真空采血管中,將1毫升PRP用0.2毫升葡萄糖酸鈉溶液(濃度為100 mg/mL)沉積。
將管在40℃下孵育30分鐘。然後,將其風扇冷卻5分鐘。該過程在ISM設備中進行。
獲得凝膠物和具有生長因數的上清液。將管倒置,並在注射器的幫助下抽取上清液,直至凝膠物顯著減少。
由於包含純的生長因數的上清液在室溫下非常快地失去其活性,因此將材料快速沉積(在顯著少於5分鐘的時間內)在無菌小瓶中。
在使用之前,對小瓶進行細菌學控制以保證其無菌性。
然後將無菌小瓶冷凍在-18℃下,並且在一些情況下,使用乾冰冷凍在-40℃下。
Claims (4)
- 一種用於獲得和保存高純度生長因數的方法,其特徵在於包括以下步驟: a.向富血小板血漿添加血小板膜破裂劑,以獲得富含生長因數的血漿; b.將步驟a)的所述富含生長因數的血漿在37℃至40℃的溫度下孵育30至40分鐘; c.將步驟b)的所述富含生長因數的血漿冷卻5至7分鐘以獲得凝膠物和上清液,所述上清液包含濃度大於90%的生長因數; d.對來自步驟c)的具有生長因數的上清液進行提取; e.在-40℃至-18℃的溫度下深度冷凍來自步驟d)的具有生長因數的上清液。
- 如請求項1所述用於獲得和保存高純度生長因數的方法,其中,所述血小板膜破裂劑是葡萄糖酸鈉溶液。
- 如請求項1所述用於獲得和保存高純度生長因數的方法,其中,所述葡萄糖酸鈉溶液的濃度為100 mg/mL並且以20% v/v添加至所述富血小板血漿。
- 如請求項1至3其中一項所述用於獲得和保存高純度生長因數的方法,其中,所述用於獲得和保存高純度生長因數的方法在無菌環境中進行。
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