WO2020179887A1 - 慢性腸炎と消化管リンパ腫との鑑別方法並びに鑑別マーカーおよびキット - Google Patents

慢性腸炎と消化管リンパ腫との鑑別方法並びに鑑別マーカーおよびキット Download PDF

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WO2020179887A1
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真吾 前田
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Definitions

  • the present invention relates to a method for distinguishing between chronic enteritis and gastrointestinal lymphoma, and a marker and kit for distinguishing between chronic enteritis and gastrointestinal lymphoma.
  • the diagnosis of chronic enteritis and gastrointestinal lymphoma is made by histopathological examination by endoscopic biopsy, but chronic enteritis and small cell gastrointestinal lymphoma (hereinafter, may be simply referred to as "small cell lymphoma"). Histopathological images are often similar and may be difficult to distinguish (Washabau et al., Journal of veterinary internal medicine, 24: 10-26 (2010)).
  • An object of the present invention is to provide a method for differentiating chronic enteritis (IBD) from small cell gastrointestinal lymphoma in carnivorous animals, and a marker and a kit for using this discrimination.
  • IBD chronic enteritis
  • the present inventor has identified chronic enteritis, small-cell gastrointestinal lymphoma, and large-cell gastrointestinal lymphoma by diagnosis from a population of dogs with clinical signs of chronic gastrointestinal disease that has undergone endoscopy. It was found that there were significant differences in clinical scores and overall survival between the groups.
  • the present inventor also quantified the expression levels of various antibacterial peptides in the duodenal mucosa using real-time PCR for 4 groups including healthy, and in chronic enteritis, the mRNA expression levels of 5 antibacterial peptides were found to be healthy or gastrointestinal lymphoma. It was found to be significantly higher in comparison.
  • the inventor has also found that expression levels of bactericidal/permeability-increasing protein (BPI) are specifically increased in chronic enteritis and not in gastrointestinal lymphoma and healthy.
  • BPI bactericidal/permeability-increasing protein
  • the present inventor also examined the diagnostic accuracy of BPI by the ROC curve method. When the cutoff value of the BPI gene expression level was set to 1.875, the sensitivity was 86.3%, the specificity was 100%, and the area under the curve was 0. It was found that with high sensitivity and specificity of .948, it is possible to distinguish between chronic enteritis and gastrointestinal lymphoma and normal.
  • the present invention is based on these findings.
  • Expression level of an antimicrobial peptide selected from the group consisting of bactericidal/permeability-increasing protein (BPI), lactoferrin, secretory leukocyte peptidase inhibitor (SLPI), lysozyme, and dog beta defensin (CBD103) in test animals A method of differentiating between chronic enteritis (IBD) and small cell gastrointestinal lymphoma in carnivorous animals, comprising the step of measuring.
  • IBD chronic enteritis
  • small cell gastrointestinal lymphoma in carnivorous animals
  • a marker for differentiating IBD from small cell gastrointestinal lymphoma which comprises an antibacterial peptide selected from the group consisting of BPI, lactoferrin, SLPI, lysozyme and CBD103, and these genes or a gene thereof.
  • a kit for discriminating IBD from small cell gastrointestinal lymphoma which comprises an antibacterial peptide selected from the group consisting of BPI, lactoferrin, SLPI, lysozyme and CBD103, and a gene thereof, or Diagnostic agent for IBD or small cell gastrointestinal lymphoma.
  • a method for treating IBD or small cell gastrointestinal lymphoma in carnivorous animals wherein the method according to any one of the above [1] to [7] is carried out and the test animal suffers from IBD.
  • the method comprising identifying an animal suffering from small cell gastrointestinal lymphoma and performing treatment on the animal for IBD or small cell gastrointestinal lymphoma.
  • the relative amount of antimicrobial peptide mRNA is represented by the n-fold difference relative to the reference gene mRNA. Bars indicate the median value of each group.
  • FIG. 2 shows BPI receiver operating characteristics for (A) identification from healthy dogs, (B) identification from gastrointestinal lymphoma, and (C) identification from both healthy dogs and gastrointestinal lymphoma for chronic enteritis. It is a figure which shows the characteristic (ROC) curve.
  • FIG. 3 is a diagram showing an example of diagnosis of chronic enteritis and small cell gastrointestinal lymphoma (small cell lymphoma) by immunoassay (immunohistological staining) (Example 4).
  • the method for differentiating the present invention can be carried out on carnivorous animals.
  • Carnivora also known as Carnivora
  • Caniformia is classified into Caniformia and Feliformia.
  • animals belonging to the suborder Caniformia include canines (for example, domestic dogs), and examples of animals belonging to the suborder Feliformia include felines (for example, domestic cats).
  • felines for example, domestic cats
  • "ye dog” and "dog” are synonymous.
  • the antibacterial peptides tested in the present invention are bactericidal / permeability increating protein (BPI), lactoferrin, secretory leukocyte peptidase inhibitor (leukocyte peptidase inhibitor; SLPI), lysozyme and lysozyme.
  • BPI bactericidal / permeability increating protein
  • lactoferrin lactoferrin
  • secretory leukocyte peptidase inhibitor leukocyte peptidase inhibitor
  • SLPI secretory leukocyte peptidase inhibitor
  • lysozyme lysozyme
  • Canine beta defensin CBD103
  • BPI can be preferably used as an inspection target from the viewpoint of high sensitivity and specificity in ROC curve analysis.
  • the antibacterial peptide gene to be detected in the present invention can be an antibacterial peptide gene of a carnivorous animal to be tested.
  • the antibacterial peptide can be derived from the domestic dog.
  • nucleotide sequences of the antibacterial peptide genes are known in the art.
  • nucleotide sequences of the genes of BPI, lactoferrin, SLPI, lysozyme and CBD103 of domestic dogs are registered in GenBank as XM_022409167, XM_541903, EU315072, KJ700878, NM_001129980, respectively. And these can be used.
  • amino acid sequences of the peptides of BPI, lactoferrin, SLPI, lysozyme and CBD103 of domestic dogs are registered in GenBank as XP_02264875.1, XP_541903.2., ABY59249.1, AIE13825.1 and NP_00112345.21, respectively. Can be used.
  • the expression level of the antibacterial peptide in the differential method of the present invention can be measured in vitro by a known method. Therefore, the identification method of the present invention can be an in vitro identification method.
  • the expression level of the antibacterial peptide in the biological sample in the discrimination method of the present invention can be measured, for example, based on the expression level of the antibacterial peptide gene.
  • the expression level of the antibacterial peptide gene should be measured by, for example, a gene amplification method such as PCR method (particularly RT-PCR, quantitative RT-PCR), DNA microarray analysis, or a known method such as Northern blotting.
  • PCR method particularly RT-PCR, quantitative RT-PCR
  • DNA microarray analysis or a known method such as Northern blotting.
  • the probe and primer set used for measuring the expression level of the antibacterial peptide gene can be prepared based on the sequence information of the antibacterial peptide gene described below, and it is also possible to refer to the Examples described later.
  • the expression level of the antibacterial peptide in the biological sample can also be measured based on the expression level of the antibacterial peptide.
  • the expression level of the antibacterial peptide can be measured by a known detection means using a specific binding substance for the antibacterial peptide, for example, ELISA (for example, direct method, indirect method, sandwich method, competitive method). ), Western blot, immunohistochemical staining and other immunoassays.
  • ELISA for example, direct method, indirect method, sandwich method, competitive method.
  • Western blot immunohistochemical staining and other immunoassays.
  • the specific binding substance to the antibacterial peptide include an antibody, and a commercially available antibody can be used.
  • a rabbit polyclonal anti-BPI antibody (Rabbit polyclonal anti-BPI antibody; manufactured by GeneTex) can be mentioned.
  • Antibodies against antimicrobial peptides means antibodies that specifically bind to the antimicrobial peptides.
  • antibodies monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, chimeric antibodies, canine antibodies, cat antibodies, humanized antibodies, human antibodies, mouse antibodies, rat antibodies, camel antibodies, antibody fragments (eg, Fab, Fv, Fab', Any of F (ab') 2, scFv) and the like may be used, and these can be prepared according to a method known to those skilled in the art.
  • An antibody against an antibacterial peptide can be produced, for example, using an antibacterial peptide protein or a part thereof as an antigen according to a known antibody or antiserum production method.
  • the antimicrobial peptide protein or a part thereof can be prepared by known protein expression methods and purification methods. Examples of the antibacterial peptide protein include, but are not limited to, the domestic dog antibacterial peptide defined by the sequence information of the antibacterial peptide described above. Antimicrobial peptide proteins from various organisms may be used as the immunogen.
  • Antibodies against the antibacterial peptide that can be used in the present invention can also be produced via the phage display method (see, for example, FEBS Letter, 441:20-24 (1998)).
  • the expression level of the antibacterial peptide in the test animal meets the predetermined criteria, it is highly likely that the patient has IBD, or the patient has small cell gastrointestinal lymphoma. Can be determined to be high.
  • the criteria for judgment can be determined for each method of measuring the antimicrobial peptide used.
  • the determination includes not only the determination based on a specific numerical value but also the determination based on a standard other than the numerical value that can be visually recognized such as color shading and color difference. For example, if the cutoff value is set as described later and the measured value is above or above the predetermined value, or below or below the predetermined value, there is a possibility of suffering from IBD.
  • the expression level of the antibacterial peptide of the test animal when the expression level of the antibacterial peptide of the test animal is equal to or higher than the predetermined cutoff value or exceeds the predetermined cutoff value, or when the expression level is equal to or lower than the predetermined cutoff value or is lower than the predetermined cutoff value, IBD. It can be determined that there is a high possibility of having a small cell gastrointestinal lymphoma or a high possibility of having a small cell gastrointestinal lymphoma.
  • the cut-off value used for the determination and the criteria for the determination can be set for each antimicrobial peptide.
  • the expression levels of BPI, lactoferrin, lysozyme and CBD103 in carnivorous animals suffering from IBD are the levels of BPI, lactoferrin, lysozyme and CBD103 in carnivorous animals suffering from small cell gastrointestinal lymphoma.
  • the cutoff value can be the average value of the expression level of the antibacterial peptide of the carnivorous animal suffering from IBD, or can be the value calculated by the following formula.
  • the expression level of one or more of the above four antibacterial peptides measured in a test animal exceeds the cutoff value (1) or (2) (preferably the cutoff value (1)). It is shown that the test animals are likely to have IBD. In the present invention, the expression level of one or two or more of the above four antibacterial peptides measured in a test animal also has a cutoff value (1) or (2) (preferably a cutoff value (2)). Below, it indicates that the test animal is likely to have small cell gastrointestinal lymphoma. That is, in the method of the present invention, after measuring the expression level of one or more of the above four antibacterial peptides in a test animal, the expression level is a cutoff value (1) or (2) (preferably cut).
  • a step of determining that the test animal has IBD or is likely to have IBD may be included.
  • the method of the present invention also determines the expression level after measuring the expression level of one or more of the above four antibacterial peptides in the test animal, separately from or in combination with the determination step.
  • the cutoff value (1) or (2) preferably the cutoff value (2)
  • the test animal has small cell gastrointestinal lymphoma or suffers from small cell gastrointestinal lymphoma. It may include a step of determining that the possibility is high.
  • the test animal is IBD or Determining whether or not you have small cell gastrointestinal lymphoma may be combined with examination results and other laboratory findings (eg, histopathological examination, immunohistochemistry (IHC) examination, clonality examination). Finally, a veterinarian can do it.
  • IHC immunohistochemistry
  • the cutoff value can be the average value of the expression level of the antibacterial peptide of the carnivorous animal suffering from IBD, or can be the value calculated by the following formula.
  • the test animal suffers from IBD when the expression level of SLPI measured in the test animal is lower than the cutoff value (3) or (4) (preferably the cutoff value (3)). It is highly probable.
  • the test animal also has a small cell gastrointestinal tract when the expression level of SLPI measured in the test animal exceeds the cutoff value (3) or (4) (preferably the cutoff value (4)). It is shown that there is a high probability of having lymphoma. That is, the method of the present invention is a test when the expression level is lower than the cutoff value (3) or (4) (preferably the cutoff value (3)) after measuring the expression level of SLPI in the test animal. It may include a step of determining that the animal has or is likely to have IBD.
  • the method of the present invention also has a cut-off value (3) or (4) (preferably) after the measurement of the expression level of SLPI in the test animal, separately from the determination step or in combination with the determination step. Is greater than the cutoff value (4)), it is determined that the test animal has a small cell gastrointestinal lymphoma, or is likely to have a small cell gastrointestinal lymphoma. May be included. Whether or not the test animal has IBD or small cell gastrointestinal lymphoma, including the case where the SLPI expression level of the test animal exceeds the cutoff value (3) and falls below the cutoff value (4). In some cases, the judgment may be made by a veterinarian in combination with examination results and other laboratory findings (eg, histopathological examination, immunohistochemistry (IHC) examination, clonality examination). it can.
  • IHC immunohistochemistry
  • the setting of the cutoff value in the method of the present invention may be performed by statistical analysis.
  • the cutoff value may be set using ROC curve analysis, as shown in Examples below.
  • ROC curve analysis a cutoff value having a desired sensitivity and specificity can be selected, and the accuracy can be evaluated by the area under the ROC curve (AUC: Area Under the Curve).
  • AUC Area Under the Curve
  • the cutoff value in the method of the present invention is not particularly limited as long as it correlates with the expression level of the antimicrobial peptide, and the result of the immunoassay described below is imaged and quantified using analysis software or the like. May be used.
  • the expression level of the antibacterial peptide of the carnivorous animal suffering from IBD and the expression level of the antibacterial peptide of the carnivorous animal suffering from small cell gastrointestinal lymphoma were measured in advance.
  • the determination step can be performed after preparing the cutoff value based on the result. That is, the method of the present invention is either the expression level of the antibacterial peptide of the carnivorous animal suffering from IBD or the expression level of the antibacterial peptide of the carnivorous animal suffering from small cell gastrointestinal lymphoma prior to the determination step. It may further include the step of measuring both and preparing the cutoff value.
  • a method for distinguishing IBD from small cell gastrointestinal lymphoma in carnivorous animals which comprises a step of measuring the expression level of BPI in a test animal.
  • the measurement step of this discrimination method may be a step of measuring the presence or absence of BPI expression in a biological sample.
  • the presence of BPI expression indicates that the test animal is or is likely to be affected by IBD, and further, the test Indicates that the animal does not have small cell gastrointestinal lymphoma or is unlikely to have small cell gastrointestinal lymphoma. That is, even if the above-mentioned discrimination method includes a step of determining that the test animal has IBD or is likely to have IBD when the presence of BPI expression is confirmed. Good. The above differential method is also unlikely that the test animal has small cell gastrointestinal lymphoma or has small cell gastrointestinal lymphoma when the presence of BPI expression is observed. It may include a step of determining that.
  • the absence of BPI expression also indicates that the test animal has small cell gastrointestinal lymphoma or small cell gastrointestinal lymphoma. It indicates that it is likely, and further indicates that the test animal is not suffering from IBD or is unlikely to be suffering from IBD. That is, in the above differentiation method, when the presence of BPI expression is not observed, the test animal may have small cell gastrointestinal lymphoma or may have small cell gastrointestinal lymphoma. It may include a step of determining that it is high. The discrimination method may also include a step of determining that the test animal is not suffering from IBD or is unlikely to be suffering from IBD when the presence of BPI expression is not observed. ..
  • the presence or absence of BPI expression can be measured using an immunoassay.
  • an immunoassay using an antibody against BPI is performed on an intestinal tissue sample obtained from a test animal, and if color development indicating the presence of BPI is observed, is the test animal suffering from IBD? Or, if it can be determined that there is a high possibility of having IBD and no color development indicating the presence of BPI is observed, or if color development indicating the presence of BPI is hardly observed, the said. It can be determined that the test animal has a small cell gastrointestinal lymphoma or is likely to have a small cell gastrointestinal lymphoma. Such an embodiment is advantageous because IBD and small cell gastrointestinal lymphoma can be easily and quickly differentiated in the examination room.
  • the expression level of the antimicrobial peptide can be measured by measuring the expression level of the antimicrobial peptide in the intestinal tract tissue (preferably duodenal tissue) of the test animal.
  • the intestinal tissue is preferably intestinal mucosal tissue.
  • Intestinal tissue samples can be taken endoscopically from the test animal, for example, prior to measurement.
  • the collected sample biological sample may be cryopreserved after undergoing pretreatment suitable for the measurement method to be carried out thereafter.
  • IBD and small cell gastrointestinal lymphoma can be distinguished in a test animal. Therefore, the methods of the present invention can be used as an adjunct to the diagnosis of IBD and / or small cell gastrointestinal lymphoma. Determining whether a subject has IBD or small cell gastrointestinal lymphoma cancer may be determined by examination results and other laboratory findings (eg, histopathological examination, immunohistochemistry (IHC) examination, etc. Finally, it can be done by a veterinarian.
  • IHC immunohistochemistry
  • the method of the present invention is useful in that it can provide an index in deciding the therapeutic course of carnivorous animals (in particular, carnivorous animals having clinical signs of chronic gastrointestinal disease).
  • a marker for distinguishing IBD from small cell gastrointestinal lymphoma which comprises an antibacterial peptide selected from the group consisting of BPI, lactoferrin, SLPI, lysozyme and CBD103 and genes thereof, or a gene thereof.
  • the differential marker of the present invention can be used to distinguish IBD from small cell gastrointestinal lymphoma in carnivorous animals (particularly domestic dogs). Therefore, the differentiation marker of the present invention is useful as an index when determining a treatment policy in a carnivorous animal (particularly, a carnivorous animal having clinical signs of chronic gastrointestinal disease).
  • the differentiation marker of the present invention When the differentiation marker of the present invention is used for diagnosing a certain species of carnivorous animals, it is preferable that the antibacterial peptide and its gene constituting the marker are derived from that species.
  • the differential marker of the present invention when used for the diagnosis of domestic dogs, it is preferable to use the antibacterial peptide derived from domestic dogs and its gene as the differential marker.
  • the antimicrobial peptide gene may be DNA comprising the genomic sequence of the antimicrobial peptide gene, or is obtained by reverse transcription of the antimicrobial peptide gene mRNA or the antimicrobial peptide gene mRNA. It may be cDNA.
  • the identification marker of the present invention can be carried out according to the above-mentioned identification method of the present invention.
  • kits for distinguishing chronic enteritis from small cell gastrointestinal lymphoma such as a kit for distinguishing chronic enteritis from small cell gastrointestinal lymphoma, an antibacterial peptide selected from the group consisting of BPI, lactoferrin, SLPI, lysozyme and CBD103, and genes thereof
  • a kit for distinguishing IBD from small cell gastrointestinal lymphoma which comprises means for detecting a gene
  • a diagnosis of IBD or small cell gastrointestinal lymphoma comprising an antimicrobial peptide selected from the group consisting of BPI, lactoferrin, SLPI, lysozyme and CBD103 and genes thereof or a means for detecting said gene.
  • the agent is provided.
  • Examples of means for detecting the antibacterial peptide constituting the discrimination kit and the diagnostic agent of the present invention include specific binding substances (eg, antibodies, aptamers) to the antibacterial peptide, and preferably antibodies.
  • Antibodies to antibacterial peptides (particularly BPI) can be carried out according to the description of the differentiation method of the present invention.
  • Examples of means for detecting the gene of the antibacterial peptide include a probe for the antibacterial peptide gene, a primer and a primer set. The probe, primer and primer set for the gene of the antibacterial peptide (particularly BPI) can be carried out according to the description of the differentiation method of the present invention.
  • the identification kit of the present invention may include, in addition to the detection means, reagents, devices, instruction manuals, etc. for carrying out the identification method of the present invention. Therefore, the detection means can be selected depending on the measurement method carried out by the discrimination method of the present invention, and the reagents and devices suitable for the detection means can be selected.
  • the members required for the discrimination kit are known for each measurement method and detection means, and those skilled in the art can appropriately select and determine them.
  • the differential method according to the present invention is carried out, or using the differential marker of the present invention or the differential kit of the present invention, an animal suffering from IBD or small cell digestion from a test animal is performed. Identify animals with ductal lymphoma. Differentiation of IBD from small cell gastrointestinal lymphoma in a test animal can be performed according to the differentiation method of the present invention. The test animal can also be an animal with clinical signs of chronic gastrointestinal disease.
  • treatment method of the present invention treatment for IBD is performed on animals determined to have IBD, and small cells are administered to animals determined to have small cell gastrointestinal lymphoma. Treatment for primary gastrointestinal lymphoma. Treatment of IBD and treatment of small cell gastrointestinal lymphoma are known, and appropriate treatment (for example, IBD therapeutic agent administration, anticancer agent administration, surgical treatment, radiation therapy) is selected and implemented at the discretion of the veterinarian. can do.
  • Example 1 Diagnosis of chronic enteritis and gastrointestinal lymphoma (1) Method a Subject This study showed clinical signs of chronic gastrointestinal disease that underwent endoscopy at the University of Tokyo Veterinary Medical Center between 2009 and 2012. Based on 88 dogs having. In addition, 20 healthy beagle dogs were used as a control group. Nine of the 20 are female (1 intact, 8 castrated), 11 male (all intact), with a median age of 67 months (range 49-110 months). The median body weight was 11 kg (range 8.6 to 13.3 kg). All dogs had no clinical signs of gastrointestinal disease and were not receiving any medication.
  • Non-Patent Document 1 The diagnosis of gastrointestinal lymphoma was also reported by histopathological examination, the presence of clonal IgH or TCR ⁇ gene rearrangements in the clonality test, and Carrasco et al., Veterinary Pathology, 52:668-675 (2015). Immunohistochemistry (IHC) for CD3 and CD20. Gastrointestinal lymphomas were classified into two categories, small cell lymphomas and large cell lymphomas, according to the morphological characteristics of proliferating lymphocytes (Maeda et al., Veterinary Pathology, 53:102-112 (2016)).
  • CCECAI Canine chronic enteropathy clinical activity index
  • Example 2 Expression of antimicrobial peptide in duodenal mucosa (1) Method a Preparation of duodenal mucosa sample
  • 44 mice were diagnosed with chronic enteritis, 25 were diagnosed with small cell gastrointestinal lymphoma, and large cell gastrointestinal tract
  • Duodenal mucosal samples from 19 dogs diagnosed with lymphoma and 20 healthy dogs were used.
  • the duodenal mucosa sample was obtained by performing endoscopy according to the method described in Example 2 (1) a.
  • the duodenal sample was then immediately immersed in RNAlater (manufactured by Qiagen) and stored at ⁇ 20 ° C. for use in RNA extraction.
  • RNAspin Mini RNA Isolation Kit manufactured by GE Healthcare
  • Genomic DNA was then removed from the sample using a TURBO DNA-free Kit (manufactured by Applied Biosystems) and stored at -80 ° C.
  • the expression levels of 6 antimicrobial peptides (BPI, lactoferrin, secretory leukocyte peptidase inhibitor (SLPI), lysozyme, CBD103 and cathelicidin) were analyzed.
  • the expression level of mRNA is determined by using PrimeScript RT Reagent Kit and SYBR PrimeScript RT-PCR Kit II (manufactured by Takara Bio) according to the manufacturer's instructions, and using two-step real-time RT-PCR (manufactured by StepOnePlus, Applied Biosystems).
  • Reference genes include TATA box binding protein (TBP), Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and subunit based on Peters et al., Veterinary immunology and immunopathology, 117: 55-66 (2007). SDHA) was used.
  • TTP TATA box binding protein
  • GPDH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
  • subunit based on Peters et al., Veterinary immunology and immunopathology, 117: 55-66 (2007). SDHA was used.
  • the primer pair sequences used in this study are shown in Table 2.
  • amplification efficiency of PCR was determined for each primer set using a 10-fold dilution series of representative cDNA samples. All primer sets showed efficiencies greater than 95% according to the Comparative Cycle Threshold (CT) method (Livak KJ & Schmittgen TD, Methods, 25 (4): 402-8 (2001)). All samples were double-examined and mean ⁇ Ct values were calculated based on the description of Maeda et al., Veterinary Pathology, 53: 102-112 (2016).
  • CT Comparative Cycle Threshold
  • Example 3 Antibacterial peptide markers for the diagnosis of chronic enteritis and gastrointestinal lymphoma
  • ROC Receiver Operating Characteristic curve
  • Example 4 Diagnosis of chronic enteritis and small cell gastrointestinal lymphoma by immunoassay
  • an example in which chronic enteritis and small cell gastrointestinal lymphoma are differentiated by immunohistochemistry is shown.
  • the section sample was treated with an anti-BPI antibody (rabbit polyclonal antibody, manufactured by GeneTex) as the primary antibody, washed, and then treated with Envision for rabbit (manufactured by Dako) as the secondary antibody.
  • a peroxidase-labeled secondary antibody was developed using DAB (3,3'-diaminobenzidine) as a color-developing substrate.

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Abstract

本発明は、食肉目動物において慢性腸炎（ＩＢＤ）と小細胞性消化管リンパ腫とを鑑別する方法の提供を目的とする。本発明によれば、被験動物において、殺菌性／透過性増加タンパク質（ＢＰＩ）、ラクトフェリン、分泌型白血球ペプチダーゼ阻害物質（ＳＬＰＩ）、リゾチームおよびイヌベータデフェンシン（ＣＢＤ１０３）からなる群から選択される抗菌ペプチドの発現量を測定する工程を含んでなる、食肉目動物においてＩＢＤと小細胞性消化管リンパ腫とを鑑別する方法が提供される。

Description

慢性腸炎と消化管リンパ腫との鑑別方法並びに鑑別マーカーおよびキット 関連出願の参照
　本願は、先行する日本国出願である特願２０１９－３９５１２（出願日：２０１９年３月５日）の優先権の利益を享受するものであり、その開示内容全体は引用することにより本明細書の一部とされる。
　本発明は、慢性腸炎と消化管リンパ腫との鑑別方法と、慢性腸炎と消化管リンパ腫との鑑別用マーカーおよびキットに関する。
　犬および猫における慢性腸炎および消化管リンパ腫は、類似した慢性消化器症状を呈するがその予後は大きく異なり、一般的に慢性腸炎と比べて消化管リンパ腫では予後が不良である。慢性腸炎と消化管リンパ腫の診断は、内視鏡生検による病理組織学的検査により行われるが、慢性腸炎と小細胞性消化管リンパ腫（以下、単に「小細胞性リンパ腫」ということがある）の病理組織像はしばしば類似しているため鑑別が困難な場合がある（Washabau et al., Journal of veterinary internal medicine, 24:10-26 (2010)）。このため補助診断として、生検組織を用いた免疫組織化学（ＩＨＣ）およびクローナリティ検査による段階的診断アプローチが推奨されているが、どちらの検査も感度および特異度が低く、これらの検査を用いても慢性腸炎と小細胞性消化管リンパ腫との鑑別は依然として困難な場合が多い。
　東京大学獣医医療センターにおいて２０１７年１月から１３か月間に診断した症例について調査したところ、病理組織学的検査により慢性腸炎と診断された犬の２４％（猫では３９％）がクローナリティ検査では小細胞性消化管リンパ腫陽性であり、同様に小細胞性消化管リンパ腫と診断された犬の４１％（猫では４２％）がクローナリティ検査では慢性腸炎陽性であり、病理組織学的検査とクローナリティ検査の結果が一致しない症例が４割近く存在した。
　本発明は、食肉目動物において慢性腸炎（ＩＢＤ）と小細胞性消化管リンパ腫とを鑑別する方法と、この鑑別に用いるためのマーカーおよびキットを提供することを目的とする。
　本発明者は、内視鏡検査を受けた慢性胃腸疾患の臨床徴候を有する犬母集団から診断により、慢性腸炎、小細胞性消化管リンパ腫および大細胞性消化管リンパ腫を特定し、これらの３群の間には、臨床スコアおよび全生存期間について有意差があることを見出した。本発明者はまた、健常を含めた４群についてリアルタイムＰＣＲを用いて十二指腸粘膜内における各種抗菌ペプチド発現量を定量し、慢性腸炎では５種の抗菌ペプチドのｍＲＮＡ発現レベルが健常または消化管リンパ腫と比較して有意に高いことを見出した。本発明者はまた、殺菌性／透過性増加タンパク質（ＢＰＩ）の発現レベルは、慢性腸炎で特異的に増加し、消化管リンパ腫および健常では増加しないことを見出した。本発明者はまた、ＲＯＣカーブ法によりＢＰＩの診断精度を検討したところ、ＢＰＩ遺伝子発現量のカットオフ値を１．８７５に設定すると、感度８６．３％、特異度１００％、曲線下面積０．９４８と高い感度および特異度で慢性腸炎と消化管リンパ腫および正常とを区別することができることを見出した。本発明は、これらの知見に基づくものである。
　本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］被験動物において、殺菌性／透過性増加タンパク質（ＢＰＩ）、ラクトフェリン、分泌型白血球ペプチダーゼ阻害物質（ＳＬＰＩ）、リゾチームおよびイヌベータデフェンシン（ＣＢＤ１０３）からなる群から選択される抗菌ペプチドの発現量を測定する工程を含んでなる、食肉目動物において慢性腸炎（ＩＢＤ）と小細胞性消化管リンパ腫とを鑑別する方法。
［２］腸管組織における抗菌ペプチドの発現量を測定する、上記［１］に記載の方法。
［３］遺伝子増幅法またはイムノアッセイにより抗菌ペプチドの発現量を測定する、上記［１］または［２］に記載の方法。
［４］抗菌ペプチドがＢＰＩである、上記［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］被験動物が慢性胃腸疾患の臨床徴候を有する動物である、上記［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］ＩＢＤまたは小細胞性消化管リンパ腫の診断を補助する方法である、上記［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］食肉目動物が、イヌ科動物またはネコ科動物である、上記［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］ＢＰＩ、ラクトフェリン、ＳＬＰＩ、リゾチームおよびＣＢＤ１０３並びにこれらの遺伝子からなる群から選択される抗菌ペプチドまたはその遺伝子からなる、ＩＢＤと小細胞性消化管リンパ腫との鑑別用マーカー。
［９］ＢＰＩ、ラクトフェリン、ＳＬＰＩ、リゾチームおよびＣＢＤ１０３並びにこれらの遺伝子からなる群から選択される抗菌ペプチドまたはその遺伝子の検出手段を含んでなる、ＩＢＤと小細胞性消化管リンパ腫との鑑別用キットまたはＩＢＤもしくは小細胞性消化管リンパ腫の診断剤。
［１０］食肉目動物におけるＩＢＤまたは小細胞性消化管リンパ腫の治療方法であって、上記［１］～［７］のいずれかに記載の方法を実施して被験動物からＩＢＤに罹患した動物または小細胞性消化管リンパ腫に罹患した動物を特定する工程と、前記動物にＩＢＤに対する治療または小細胞性消化管リンパ腫に対する治療を実施する工程とを含む前記方法。
図１は、健常犬（ｎ＝２０）、慢性腸炎（ｎ＝４４）、小細胞性消化管リンパ腫（ｎ＝２５）および大細胞性消化管リンパ腫（ｎ＝１９）の十二指腸粘膜における（Ａ）ＢＰＩ、（Ｂ）ラクトフェリン、（Ｃ）分泌型白血球ペプチダーゼ阻害物質（ＳＬＰＩ）、（Ｄ）リゾチーム、（Ｅ）イヌベータデフェンシン（ＣＢＤ１０３）および（Ｆ）カテリシジンのｍＲＮＡ発現量を示す図である。抗菌ペプチドｍＲＮＡの相対量は、参照遺伝子のｍＲＮＡに対するｎ倍の差によって表される。バーは各グループの中央値を示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 図２は、慢性腸炎について、（Ａ）健常犬からの識別、（Ｂ）消化管リンパ腫からの識別、（Ｃ）健常犬と消化管リンパ腫の両方からの識別のための、ＢＰＩの受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す図である。 図３は、イムノアッセイ（免疫組織染色）による慢性腸炎および小細胞性消化管リンパ腫（小細胞性リンパ腫）の診断例を示す図である（例４）。
発明の具体的説明
慢性腸炎と小細胞性消化管リンパ腫との鑑別方法
　本発明の鑑別方法は食肉目動物に対して実施することができる。食肉目は、別名：ネコ目とも呼ばれ、イヌ亜目とネコ亜目に分類される。イヌ亜目に属する動物としてはイヌ科動物（例えば、イエイヌ）が挙げられ、ネコ亜目に属する動物としてはネコ科動物（例えば、イエネコ）が挙げられる。なお、本明細書において、「イエイヌ」と「犬」は同義である。
　本発明において検査対象である抗菌ペプチドは、殺菌性／透過性増加タンパク質（ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ／ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ　ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ；ＢＰＩ）、ラクトフェリン、分泌型白血球ペプチダーゼ阻害物質（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　ｐｅｐｔｉｄａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ；ＳＬＰＩ）、リゾチームおよびイヌベータデフェンシン（ｃａｎｉｎｅ　ｂｅｔａ　ｄｅｆｅｎｓｉｎ；ＣＢＤ１０３）が挙げられ、ＲＯＣ曲線分析における高い感度および特異度の観点から好ましくはＢＰＩを検査対象として用いることができる。
　本発明において検出対象である抗菌ペプチド遺伝子は、検査対象の食肉目動物の抗菌ペプチド遺伝子とすることができる。例えば、本発明の鑑別方法をイエイヌに対して実施する場合には、抗菌ペプチドはイエイヌ由来のものとすることができる。
　抗菌ペプチド遺伝子の塩基配列は本技術分野において公知であり、例えば、イエイヌのＢＰＩ、ラクトフェリン、ＳＬＰＩ、リゾチームおよびＣＢＤ１０３の遺伝子の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋにそれぞれＸＭ＿０２２４０９１６７、ＸＭ＿５４１９０３、ＥＵ３１５０７２、ＫＪ７００８７８、ＮＭ＿００１１２９９８０として登録されており、これらを利用することができる。また、イエイヌのＢＰＩ、ラクトフェリン、ＳＬＰＩ、リゾチームおよびＣＢＤ１０３のペプチドのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋにそれぞれＸＰ＿０２２２６４８７５．１、ＸＰ＿５４１９０３．２、ＡＢＹ５９２４９．１、ＡＩＥ１３８２５．１、ＮＰ＿００１１２３４５２．１として登録されており、これらを利用することができる。
　本発明の鑑別方法における抗菌ペプチドの発現量の測定は、公知の方法によりイン・ビトロにおいて実施することができる。従って、本発明の鑑別方法はイン・ビトロの鑑別方法とすることができる。
　本発明の鑑別方法における生体試料中の抗菌ペプチドの発現量は、例えば、抗菌ペプチド遺伝子の発現量に基づいて測定することができる。この場合、抗菌ペプチド遺伝子の発現量の測定は、例えば、ＰＣＲ法（特にＲＴ－ＰＣＲ、定量的ＲＴ－ＰＣＲ）等の遺伝子増幅法、ＤＮＡマイクロアレイ解析、ノーザンブロッティング等の公知の方法により実施することができる。抗菌ペプチド遺伝子の発現量の測定に使用するプローブおよびプライマーセットは、後述の抗菌ペプチド遺伝子の配列情報に基づいて作製することができ、後記実施例を参照することもできる。
　生体試料中の抗菌ペプチドの発現量はまた、抗菌ペプチドの発現量に基づいて測定することができる。この場合、抗菌ペプチドの発現量の測定は、抗菌ペプチドに対する特異的結合物質を用いた公知の検出手段により実施することができ、例えば、ＥＬＩＳＡ（例えば、直接法、間接法、サンドイッチ法、競合法）、ウエスタンブロット、免疫組織化学染色等のイムノアッセイにより実施することができる。抗菌ペプチドに対する特異的結合物質としては抗体が挙げられ、市販の抗体を使用することができる。例えば、ＢＰＩに対する抗体としては、ウサギポリクローナル抗ＢＰＩ抗体（Rabbit polyclonal anti-BPI antibody；GeneTex社製）が挙げられる。
　抗菌ペプチドに対する抗体は、抗菌ペプチドに特異的に結合する抗体を意味する。本発明では、抗体として、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、イヌ抗体、ネコ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、マウス抗体、ラット抗体、ラクダ抗体、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ）等のいずれを使用してもよく、これらは当業者であれば公知の手法に従って調製することができる。
　抗菌ペプチドに対する抗体は、例えば、抗菌ペプチドタンパク質またはその一部を抗原として、公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。抗菌ペプチドタンパク質またはその一部は、公知のタンパク質発現法および精製法によって調製することができる。抗菌ペプチドタンパク質としては、例えば前述の抗菌ペプチドの配列情報によって規定されるイエイヌ抗菌ペプチド等が挙げられるが、これに限定されるものではない。種々の生物由来の抗菌ペプチドタンパク質を免疫原として用いてもよい。本発明に用いることができる抗菌ペプチドに対する抗体はまた、ファージ・ディスプレー法（例えば、FEBS Letter, 441:20-24(1998)を参照）を介して作製することもできる。
　本発明の方法においては、被験動物における抗菌ペプチドの発現量が所定の基準を満たす場合に、ＩＢＤに罹患している可能性が高いと、あるいは小細胞性消化管リンパ腫に罹患している可能性が高いと判定することができる。判定の基準は、採用する抗菌ペプチドの測定方法ごとに定めることができる。上記判定は、具体的な数値を基準にして判定することのみならず、色の濃淡や色彩の違い等、視覚通じて把握できる数値以外の基準に基づいて判定することを含む。例えば、後述するようにカットオフ値を定め、測定値が所定値以上である場合またはそれを上回る場合に、あるいは所定値以下である場合またはそれを下回る場合に、ＩＢＤに罹患している可能性が高いと、あるいは小細胞性消化管リンパ腫に罹患している可能性が高いと判定することができる。あるいは、後述するように発色の有無を基準として定め、発色があった場合に、あるいは発色がなかった場合に、ＩＢＤに罹患している可能性が高いと、あるいは小細胞性消化管リンパ腫に罹患している可能性が高いと判定することができる。
　本発明の方法においては、被験動物の抗菌ペプチドの発現量が所定のカットオフ値以上である場合またはそれを上回る場合に、あるいは所定のカットオフ値以下である場合またはそれを下回る場合に、ＩＢＤに罹患している可能性が高いと、あるいは小細胞性消化管リンパ腫に罹患している可能性が高いと判定することができる。判定に使用するカットオフ値や判定の基準は、抗菌ペプチドごとに定めることができる。
　後記実施例に示される通り、ＩＢＤに罹患した食肉目動物におけるＢＰＩ、ラクトフェリン、リゾチームおよびＣＢＤ１０３のそれぞれの発現量は、小細胞性消化管リンパ腫に罹患した食肉目動物におけるＢＰＩ、ラクトフェリン、リゾチームおよびＣＢＤ１０３のそれぞれの発現量を有意に上回るものであった。従って、本発明の方法においてカットオフ値は、ＩＢＤに罹患した食肉目動物の抗菌ペプチドの発現量の平均値とすることができ、あるいは、下記式により算出される値とすることができる。
カットオフ値（１）＝（ＩＢＤに罹患した食肉目動物の抗菌ペプチドの発現量の平均値）－ｋ×（ＩＢＤに罹患した食肉目動物の抗菌ペプチドの発現量の標準偏差）
（上記式中、ｋは０～３の定数であり、好ましくはｋ＝１～３であり、特に２とすることができる。）
　本発明の方法においてカットオフ値はまた、小細胞性消化管リンパ腫に罹患した食肉目動物の抗菌ペプチドの発現量の平均値とすることができ、あるいは、下記式により算出される値とすることができる。
カットオフ値（２）＝（小細胞性消化管リンパ腫に罹患した食肉目動物の抗菌ペプチドの発現量の平均値）＋ｋ×（小細胞性消化管リンパ腫に罹患した食肉目動物の抗菌ペプチドの発現量の標準偏差）
（上記式中、ｋは０～３の定数であり、好ましくはｋ＝１～３であり、特に２とすることができる。）
　本発明においては、被験動物において測定した上記４種の抗菌ペプチドの１種または２種以上の発現量がカットオフ値（１）または（２）（好ましくはカットオフ値（１））を上回る場合に、被験動物がＩＢＤに罹患している可能性が高いことが示される。本発明においてはまた、被験動物において測定した上記４種の抗菌ペプチドの１種または２種以上の発現量が、カットオフ値（１）または（２）（好ましくはカットオフ値（２））を下回る場合に、被験動物が小細胞性消化管リンパ腫に罹患している可能性が高いことが示される。すなわち、本発明の方法は、被験動物の上記４種の抗菌ペプチドの１種または２種以上の発現量の測定の後に、該発現量がカットオフ値（１）または（２）（好ましくはカットオフ値（１））を上回る場合に、被験動物がＩＢＤに罹患していると、あるいはＩＢＤに罹患している可能性が高いと判定する工程を含んでいてもよい。本発明の方法はまた、上記判定工程とは別に、あるいは上記判定工程と組み合わせて、被験動物の上記４種の抗菌ペプチドの１種または２種以上の発現量の測定の後に、該発現量がカットオフ値（１）または（２）（好ましくはカットオフ値（２））を下回る場合に、被験動物が小細胞性消化管リンパ腫に罹患していると、あるいは小細胞性消化管リンパ腫に罹患している可能性が高いと判定する工程を含んでいてもよい。なお、被験動物の上記４種の抗菌ペプチドの１種または２種以上の発現量がカットオフ値（１）を下回り、かつ、カットオフ値（２）を上回る場合を含め、被験動物がＩＢＤあるいは小細胞性消化管リンパ腫に罹っているか否かの判断は、場合によっては診察結果や、他の検査所見（例えば、病理組織学的検査、免疫組織化学（ＩＨＣ）検査、クローナリティ検査）と組み合わせて、最終的には獣医師が行うことができる。
　後記実施例に示される通り、ＩＢＤに罹患した食肉目動物におけるＳＬＰＩの発現量は、小細胞性消化管リンパ腫に罹患した食肉目動物におけるＳＬＰＩの発現量を有意な傾向で下回るものであった。従って、本発明の方法においてカットオフ値は、ＩＢＤに罹患した食肉目動物の抗菌ペプチドの発現量の平均値とすることができ、あるいは、下記式により算出される値とすることができる。
カットオフ値（３）＝（ＩＢＤに罹患した食肉目動物の抗菌ペプチドの発現量の平均値）＋ｋ×（ＩＢＤに罹患した食肉目動物の抗菌ペプチドの発現量の標準偏差）
（上記式中、ｋは０～３の定数であり、好ましくはｋ＝１～３であり、特に２とすることができる。）
　本発明の方法においてカットオフ値はまた、小細胞性消化管リンパ腫に罹患した食肉目動物の抗菌ペプチドの発現量の平均値とすることができ、あるいは、下記式により算出される値とすることができる。
カットオフ値（４）＝（小細胞性消化管リンパ腫に罹患した食肉目動物の抗菌ペプチドの発現量の平均値）－ｋ×（小細胞性消化管リンパ腫に罹患した食肉目動物の抗菌ペプチドの発現量の標準偏差）
（上記式中、ｋは０～３の定数であり、好ましくはｋ＝１～３であり、特に２とすることができる。）
　本発明においては、被験動物において測定したＳＬＰＩの発現量が、カットオフ値（３）または（４）（好ましくはカットオフ値（３））を下回る場合に、被験動物がＩＢＤに罹患している可能性が高いことが示される。本発明においてはまた、被験動物において測定したＳＬＰＩの発現量が、カットオフ値（３）または（４）（好ましくはカットオフ値（４））を上回る場合に、被験動物が小細胞性消化管リンパ腫に罹患している可能性が高いことが示される。すなわち、本発明の方法は、被験動物のＳＬＰＩの発現量の測定の後に、該発現量がカットオフ値（３）または（４）（好ましくはカットオフ値（３））を下回る場合に、被験動物がＩＢＤに罹患していると、あるいはＩＢＤに罹患している可能性が高いと判定する工程を含んでいてもよい。本発明の方法はまた、上記判定工程とは別に、あるいは上記判定工程と組み合わせて、被験動物のＳＬＰＩの発現量の測定の後に、該発現量がカットオフ値（３）または（４）（好ましくはカットオフ値（４））を上回る場合に、被験動物が小細胞性消化管リンパ腫に罹患していると、あるいは小細胞性消化管リンパ腫に罹患している可能性が高いと判定する工程を含んでいてもよい。なお、被験動物のＳＬＰＩの発現量がカットオフ値（３）を上回り、かつ、カットオフ値（４）を下回る場合を含め、被験動物がＩＢＤあるいは小細胞性消化管リンパ腫に罹っているか否かの判断は、場合によっては診察結果や、他の検査所見（例えば、病理組織学的検査、免疫組織化学（ＩＨＣ）検査、クローナリティ検査）と組み合わせて、最終的には獣医師が行うことができる。
　本発明の方法におけるカットオフ値の設定は統計学的解析により実施してもよい。例えば、後記実施例に示される通り、ＲＯＣ曲線分析を使用してカットオフ値を設定してもよい。ＲＯＣ曲線分析では、所望の感度および特異度となるカットオフ値を選択することができ、精度はＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ：Ａｒｅａ　Ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　Ｃｕｒｖｅ）により評価することができる。また本発明の方法におけるカットオフ値は、抗菌ペプチドの発現量と相関している限り、特に限定されるものではなく、後述のイムノアッセイの結果を撮像し、解析ソフト等を用いて定量化したものを用いてもよい。
　本発明の方法の実施に当たっては、予めＩＢＤに罹患した食肉目動物の抗菌ペプチドの発現量と、小細胞性消化管リンパ腫に罹患した食肉目動物の抗菌ペプチドの発現量を測定しておき、その結果に基づいてカットオフ値を準備した上で前記判定工程を実施することができる。すなわち本発明の方法は、前記判定工程に先立って、ＩＢＤに罹患した食肉目動物の抗菌ペプチドの発現量および小細胞性消化管リンパ腫に罹患した食肉目動物の抗菌ペプチドの発現量のいずれかまたは両方を測定し、カットオフ値を準備する工程をさらに含んでいてもよい。
　後記実施例に示される通り、抗菌ペプチドとしてＢＰＩを選択した場合に、慢性胃腸疾患の臨床徴候を有する被験動物においてＢＰＩの発現が認められたときは、該被験動物がＩＢＤに罹患している可能性が高い。このため、本発明の好ましい態様においては、被験動物において、ＢＰＩの発現量を測定する工程を含んでなる、食肉目動物においてＩＢＤと小細胞性消化管リンパ腫とを鑑別する方法が提供される。この鑑別方法の測定工程は、生体試料におけるＢＰＩの発現の有無を測定する工程であってもよい。
　抗菌ペプチドとしてＢＰＩを選択した本発明の鑑別方法では、ＢＰＩの発現の存在は被験動物がＩＢＤに罹患していること、あるいはＩＢＤに罹患している可能性が高いことを示し、さらには、被験動物が小細胞性消化管リンパ腫に罹患していないこと、あるいは小細胞性消化管リンパ腫に罹患している可能性が低いことを示す。すなわち、上記鑑別方法は、ＢＰＩの発現の存在が認められたときに、被験動物がＩＢＤに罹患していると、あるいはＩＢＤに罹患している可能性が高いと判定する工程を含んでいてもよい。上記鑑別方法はまた、ＢＰＩの発現の存在が認められたときに、被験動物が小細胞性消化管リンパ腫に罹患していないと、あるいは小細胞性消化管リンパ腫に罹患している可能性が低いと判定する工程を含んでいてもよい。
　抗菌ペプチドとしてＢＰＩを選択した本発明の鑑別方法ではまた、ＢＰＩの発現の不存在は被験動物が小細胞性消化管リンパ腫に罹患していること、あるいは小細胞性消化管リンパ腫に罹患している可能性が高いことを示し、さらには、被験動物がＩＢＤに罹患していないこと、あるいはＩＢＤに罹患している可能性が低いことを示す。すなわち、上記鑑別方法は、ＢＰＩの発現の存在が認められないときに、被験動物が小細胞性消化管リンパ腫に罹患していると、あるいは小細胞性消化管リンパ腫に罹患している可能性が高いと判定する工程を含んでいてもよい。上記鑑別方法はまた、ＢＰＩの発現の存在が認められないときに、被験動物がＩＢＤに罹患していないと、あるいはＩＢＤに罹患している可能性が低いと判定する工程を含んでいてもよい。
　抗菌ペプチドとしてＢＰＩを選択した本発明の鑑別方法ではイムノアッセイを用いてＢＰＩの発現の有無を測定することができる。例えば、被験動物から得られた腸管組織サンプルに対して、ＢＰＩに対する抗体を用いたイムノアッセイを実施し、ＢＰＩの存在を示す発色が認められた場合には、該被験動物がＩＢＤに罹患しているか、あるいはＩＢＤに罹患している可能性が高いと判定することができ、ＢＰＩの存在を示す発色が認められなかった場合や、ＢＰＩの存在を示す発色がほとんど認められなかった場合には、該被験動物が小細胞性消化管リンパ腫に罹患しているか、あるいは小細胞性消化管リンパ腫に罹患している可能性が高いと判定することができる。このような態様は、ＩＢＤと小細胞性消化管リンパ腫とを診察室で簡便かつ迅速に鑑別できるため有利である。
　本発明において抗菌ペプチドの発現量の測定は、被験動物の腸管組織（好ましくは十二指腸組織）における抗菌ペプチドの発現量を測定することにより実施することができる。腸管組織は好ましくは腸管粘膜組織である。腸管組織サンプルは、例えば、測定に先立って、内視鏡により被験動物から採取することができる。採取したサンプル（生体試料）はその後実施する測定方法に適した前処理を行った上で凍結保存してもよい。
　本発明の方法によれば、被験動物においてＩＢＤと小細胞性消化管リンパ腫とを鑑別することができる。従って、本発明の方法は、ＩＢＤおよび／または小細胞性消化管リンパ腫の診断に補助的に用いることができる。被験動物がＩＢＤまたは小細胞性消化管リンパ腫癌に罹っているか否かの判断は、場合によっては診察結果や、他の検査所見（例えば、病理組織学的検査、免疫組織化学（ＩＨＣ）検査、クローナリティ検査）と組み合わせて、最終的には獣医師が行うことができる。
　前記の通り従来の検査技術では、慢性胃腸疾患の臨床徴候を有する食肉目動物においてＩＢＤと小細胞性消化管リンパ腫との区別が困難であり、治療方針が定まらないという問題があった。本発明の方法によれば、食肉目動物（特にイエイヌ）においてＩＢＤと小細胞性消化管リンパ腫とを正確に鑑別することができる。従って、本発明の方法は食肉目動物（特に慢性胃腸疾患の臨床徴候を有する食肉目動物）の治療方針を決定する際の指標を提供できる点で有用である。
慢性腸炎と小細胞性消化管リンパ腫との鑑別用マーカー
　後記実施例に記載される通り、食肉目動物における特定の抗菌ペプチドの発現量がＩＢＤおよび小細胞性消化管リンパ腫の罹患状態と相関することが示された。従って、本発明によれば、ＢＰＩ、ラクトフェリン、ＳＬＰＩ、リゾチームおよびＣＢＤ１０３並びにこれらの遺伝子からなる群から選択される抗菌ペプチドまたはその遺伝子からなる、ＩＢＤと小細胞性消化管リンパ腫との鑑別用マーカーが提供される。
　本発明の鑑別用マーカーは、食肉目動物（特にイエイヌ）におけるＩＢＤと小細胞性消化管リンパ腫との鑑別に用いることができる。従って、本発明の鑑別用マーカーは食肉目動物（特に慢性胃腸疾患の臨床徴候を有する食肉目動物）における治療方針を決定する際の指標として有用である。
　本発明の鑑別用マーカーを食肉目動物のある特定の種の診断に用いる場合には、該マーカーを構成する抗菌ペプチドおよびその遺伝子はその種由来のものであることが好ましい。例えば、本発明の鑑別用マーカーをイエイヌの診断に用いる場合には、イエイヌ由来の抗菌ペプチドおよびその遺伝子を鑑別用マーカーに使用することが好ましい。
　また、本発明の鑑別用マーカーにおいて、抗菌ペプチド遺伝子は、抗菌ペプチド遺伝子のゲノム配列からなるＤＮＡであってもよく、あるいは抗菌ペプチド遺伝子のｍＲＮＡや、抗菌ペプチド遺伝子のｍＲＮＡを逆転写して得られたｃＤＮＡであってもよい。本発明の鑑別用マーカーは、前述の本発明の鑑別方法に従って実施することができる。
慢性腸炎と小細胞性消化管リンパ腫との鑑別用キット等
　本発明のさらに別の側面によれば、ＢＰＩ、ラクトフェリン、ＳＬＰＩ、リゾチームおよびＣＢＤ１０３並びにこれらの遺伝子からなる群から選択される抗菌ペプチドまたはその遺伝子の検出手段を含んでなる、ＩＢＤと小細胞性消化管リンパ腫との鑑別用キットが提供される。本発明によればまた、ＢＰＩ、ラクトフェリン、ＳＬＰＩ、リゾチームおよびＣＢＤ１０３並びにこれらの遺伝子からなる群から選択される抗菌ペプチドまたはその遺伝子の検出手段を含んでなる、ＩＢＤまたは小細胞性消化管リンパ腫の診断剤が提供される。
　本発明の鑑別用キットおよび診断剤を構成する抗菌ペプチドの検出手段としては、抗菌ペプチドに対する特異的結合物質（例えば、抗体、アプタマー）が挙げられ、好ましくは抗体である。抗菌ペプチド（特にＢＰＩ）に対する抗体については、本発明の鑑別方法の記載に従って実施することができる。また、抗菌ペプチドの遺伝子の検出手段としては、例えば、抗菌ペプチド遺伝子に対するプローブや、プライマーおよびプライマーセットが挙げられる。抗菌ペプチド（特にＢＰＩ）の遺伝子に対するプローブ、プライマーおよびプライマーセットについては、本発明の鑑別方法の記載に従って実施することができる。
　本発明の鑑別用キットは、検出手段に加えて、本発明の鑑別方法を実施するための試薬、装置、使用説明書等を含むことができる。従って、本発明の鑑別方法で実施する測定方法に依存して検出手段を選択し、さらには該検出手段に適した試薬や装置を選択することができる。鑑別用キットに必要な部材は測定方法や検出手段ごとに公知であり、当業者であれば適宜選択し、決定することができる。
慢性腸炎および小細胞性消化管リンパ腫の治療
　本発明の別の面によれば、肉目動物におけるＩＢＤまたは小細胞性消化管リンパ腫の治療方法が提供される。本発明の治療方法ではまず、本発明による鑑別方法を実施して、あるいは、本発明の鑑別用マーカーまたは本発明の鑑別用キットを用いて、被験動物からＩＢＤに罹患した動物または小細胞性消化管リンパ腫に罹患した動物を特定する。被験動物におけるＩＢＤと小細胞性消化管リンパ腫の鑑別は本発明の鑑別方法に従って実施することができる。また被験動物は慢性胃腸疾患の臨床徴候を有する動物とすることができる。次に、本発明の治療方法では、ＩＢＤに罹患していると判定された動物についてはＩＢＤに対する治療を実施し、小細胞性消化管リンパ腫に罹患していると判定された動物については小細胞性消化管リンパ腫に対する治療を実施する。ＩＢＤの治療や小細胞性消化管リンパ腫の治療は公知であり、獣医師の判断により適切な治療（例えば、ＩＢＤ治療剤投与、抗がん剤投与、外科療法、放射線療法）を選択して実施することができる。
　以下の例に基づき本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
例１：慢性腸炎と消化管リンパ腫の診断
（１）方法
ア　被験対象
　本研究は、２００９年から２０１２年の間に東京大学獣医医療センターで内視鏡検査を受けた慢性胃腸疾患の臨床徴候を有する８８匹の犬に基づいて行った。また、対照群として健常な２０匹のビーグル犬を用いた。２０匹のうち９匹は雌（１匹は無傷、８匹は去勢）、１１匹は雄（全て無傷）であり、年齢の中央値は６７か月（４９～１１０か月の範囲）であり、体重の中央値は１１ｋｇ（範囲は８．６～１３．３ｋｇ）であった。全ての犬は、胃腸疾患の臨床徴候はなく、いかなる薬物も投与されていなかった。全血球計算、血中尿素窒素、クレアチニン濃度、アラニンアミノトランスフェラーゼ活性およびアルカリホスファターゼ活性を含む、尿検査または血液検査において異常は検出されなかった。また、糞便分析において異常は検出されなかった。本試験における犬の使用は、東京大学の動物管理委員会によって承認された（承認番号Ｐ１１－５３０；承認日２０１１年６月１日）。
イ　慢性腸炎および消化管リンパ腫症例の特定
　慢性腸炎および消化管リンパ腫の症例選択基準は、Maeda et al., Veterinary Pathology, 53:102-112 (2016)に基づいた。具体的には、慢性腸炎の診断は、腸の炎症の病理組織学的エビデンス、クローナリティ検査（polymerase chain reaction for antigen receptor gene rearrangement、ＰＡＲＲ、Goto-Koshino et al., Veterinary immunology and immunopathology, 165: 81-87 (2015)およびHiyoshi et al., Veterinary immunology and immunopathology, 165: 138-144 (2015)）におけるクローナルな免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）およびＴ細胞受容体ガンマ（ＴＣＲγ）遺伝子の再配列の欠如ならびに食物および抗生物質応答性腸炎の排除（非特許文献１）に基づいて実施した。また、消化管リンパ腫の診断は、病理組織学的検査、クローナリティ検査におけるクローナルなＩｇＨまたはＴＣＲγ遺伝子再配列の存在、ならびにCarrasco et al., Veterinary Pathology, 52:668-675 (2015)に報告されたＣＤ３およびＣＤ２０についての免疫組織化学（ＩＨＣ）に基づいて実施した。消化管リンパ腫を、増殖リンパ球の形態学的特徴（Maeda et al., Veterinary Pathology, 53:102-112 (2016)）に従って、小細胞性リンパ腫と大細胞性リンパ腫の２つのカテゴリーに分類した。なお、研究の２週間前にコルチコステロイド治療を受けた症例および病理組織学検査結果とクローナリティ検査結果とに矛盾がある症例は除外した。全症例について、犬慢性腸症臨床活動性指標（Ｃａｎｉｎｅ　ｃｈｒｏｎｉｃ　ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｙ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｎｄｅｘ：ＣＣＥＣＡＩ、本明細書において単に「臨床スコア」ということがある）（Allenspach et al., Journal of Veterinary Internal Medicine, 21:700-708 (2007)）に従って、重症度を採
点した。
ウ　内視鏡検査
　内視鏡検査の前に、犬を１２～１８時間絶食させた。胃十二指腸鏡検査および／または回腸結腸鏡検査は、フレキシブルビデオ内視鏡（ＶＱ－８１４３Ｂ、Ｏｌｙｍｐｕｓ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて全身麻酔下で実施した。組織病理学的検査のために、粘膜生検標本を胃、十二指腸、結腸および回腸から各６個ずつ得た。試料を１０％ホルマリン中で４８時間保存した後、パラフィンに包埋した。Goto-Koshino et al., Veterinary immunology and immunopathology, 165: 81-87 (2015)およびHiyoshi et al., Veterinary immunology and immunopathology, 165: 138-144 (2015)の記載に基づいて、各部位からの少なくとも１つの生検標本をＰＡＲＲ分析に使用した。
エ　統計学的解析
　例１～３において、統計解析は下記の通り行った。統計解析はＪＭＰバージョン９（ＳＡＳ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社製）を用いて行った。フィッシャーの直接確率検定を使用して、慢性腸炎患犬と消化管リンパ腫患犬との間の性分布を比較した。クラスカル・ウォリス検定を使用して全体的な差を検定した。Ｓｔｅｅｌ－Ｄｗａｓｓ検定を用いて群間の差異を分析した。全生存期間はログランク検定を用いて比較した。
（２）結果
ア　慢性腸炎の診断結果と治療
　慢性腸炎と診断された犬は４４匹であった。全ての犬が腸粘膜内の炎症およびリンパ球－形質細胞性腸炎の組織学的診断の証拠を有していた。内視鏡検査後、全ての犬にプレドニゾロン（０．５～２ｍｇ／ｋｇ）を投与した。
　慢性腸炎患犬４４匹のうち、１８匹は雌（７匹は無傷、１１匹は去勢）、２６匹は雄（１８匹は無傷、８匹は去勢）であり、年齢の中央値は８７．５ヶ月（２２～１６０ヶ月の範囲）であり、平均体重の中央値は５．５５ｋｇ（２．２～３２．４ｋｇの範囲）であり、ＣＣＥＣＡＩスコアの中央値は６（１～１８の範囲）であった。また、犬の品種としては、２匹以上の個体を含む品種は、ミニチュアダックスフント（ｎ＝５）、ヨークシャーテリア（ｎ＝５）およびペンブロークウェールズコーギー（ｎ＝３）、チワワ（ｎ＝３）、パグ（ｎ＝３）、キャバリエキングチャールズスパニエル（ｎ＝３）、フレンチブルドッグ（ｎ＝３）、ボストンテリア（ｎ＝３）、柴犬（ｎ＝２）、ジャックラッセルテリア（ｎ＝２）、トイプードル（ｎ＝２）、マルチーズ（ｎ＝２）であり、他に８品種（各ｎ＝１）が含まれていた。
イ　小細胞性消化管リンパ腫の診断結果と治療
　小細胞性消化管リンパ腫と診断された犬は２５匹であった。ＩＨＣおよびＰＡＲＲに基づいて２１個の新生物がＴ細胞リンパ腫と分類され、３個の新生物がＢ細胞リンパ腫と分類された。１個の新生物はＴ細胞とＢ細胞の両方の特徴を持っていた。全ての犬にプレドニゾロン（１～２ｍｇ／ｋｇ）を投与し、１７匹にはプレドニゾロンと併用してクロラムブシル（２ｍｇ／ｍ２）を投与した。
　小細胞性消化管リンパ腫患犬２５匹のうち、１０匹は雌（３匹は無傷、７匹は去勢）、１５匹は雄（６匹は無傷、９匹は去勢）であり、年齢の中央値は１０５か月（５４～１７０か月の範囲）であり、体重の中央値は６．４ｋｇ（２．２５～２８．９ｋｇの範囲）であり、ＣＣＥＣＡＩスコアの中央値は７（１～１２の範囲）であった。また、犬の品種としては、２匹以上の個体を含む品種は、柴犬（ｎ＝５）、ミニチュアダックスフント（ｎ＝３）、マルチーズ（ｎ＝２）、ラブラドールレトリーバー（ｎ＝２）、フレンチブルドッグ（ｎ＝２）、ケアンテリア（ｎ＝２）であり、他に９品種（各ｎ＝１）が含まれていた。
ウ　大細胞性消化管リンパ腫の診断結果と治療
　大細胞性リンパ腫と診断された犬は１９匹であった。ＩＨＣおよびＰＡＲＲに基づいて１５個の新生物がＴ細胞リンパ腫と分類され、３個の新生物がＢ細胞リンパ腫と分類された。１個の新生物はＴ細胞とＢ細胞の両方の特徴を持っていた。６匹の犬にプレドニゾロン（１～２ｍｇ／ｋｇ）を投与し、１３匹にウィスコンシン－マディソンの化学療法プロトコル（ＵＷ－２５）の６ヶ月修正版（Garrett et al., Journal of veterinary internal medicine, 16: 704-709 (2002)）を実施した。
　大細胞性消化管リンパ腫患犬１９匹のうち、１１匹は雌（７匹は無傷、４匹は去勢）、８匹は雄（６匹は無傷、２人は去勢）であり、平均年齢は１０２ヶ月（５２～１６２か月の範囲）であり、体重の中央値は５．０５ｋｇ（２．７～２６．２ｋｇの範囲）であり、ＣＣＥＣＡＩスコアの中央値は１３（６～１８の範囲）であった。また、犬の品種としては、２匹以上の個体を含む品種は、ミニチュアダックスフント（ｎ＝４）、パグ（ｎ＝３）、柴犬（ｎ＝３）、マルチーズ（ｎ＝２）およびシーズー（ｎ＝２）であり、他に５品種（各ｎ＝１）が含まれていた。
エ　慢性腸炎および消化管リンパ腫の臨床所見の比較
　慢性腸炎および消化管リンパ腫と診断された犬の特徴は、表１に示した通りであった。慢性腸炎、小細胞性消化管リンパ腫および大細胞性消化管リンパ腫の３群の間には、性、体重、年齢および血清アルブミン濃度について差異は確認されなかった。しかしながら、３群の間には、臨床スコアおよび全生存期間について有意差があった。大細胞性リンパ腫患犬の臨床スコア（ＣＣＥＣＡＩスコア）は、慢性腸炎患犬（Ｐ＜０．００１）および小細胞性リンパ腫患犬（Ｐ＜０．０５）よりも有意に高いことが確認された。全生存期間は、消化管リンパ腫患犬では慢性腸炎患犬と比較して、有意に短いことが確認された（慢性腸炎　対　小細胞性リンパ腫　Ｐ＜０．０１、慢性腸炎　対　大細胞リンパ腫　Ｐ＜０．０００１、小細胞性リンパ腫　対　大細胞性リンパ腫　Ｐ＜０．０１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
例２：十二指腸粘膜における抗菌ペプチドの発現
（１）方法
ア　十二指腸粘膜サンプルの調製
　例１において慢性腸炎と診断された４４匹、小細胞性消化管リンパ腫と診断された２５匹、大細胞性消化管リンパ腫と診断された１９匹および健常犬２０匹の犬から得た十二指腸粘膜サンプルを用いた。十二指腸粘膜サンプルは、例２（１）イに記載の方法に従って内視鏡検査を実施して得た。次いで、ＲＮＡ抽出に用いるために、十二指腸サンプルを直ちにＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ社製）に浸し、－２０℃で保存した。
イ　定量的リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ
　全ＲＮＡの抽出は、ＲＮＡｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉ　ＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて製造業者の説明書に従って十二指腸サンプルについて行った。次いで、ＴＵＲＢＯ　ＤＮＡ－ｆｒｅｅ　Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、サンプルからゲノムＤＮＡを除去し、－８０℃で保存した。６種の抗菌ペプチド（ＢＰＩ、ラクトフェリン、分泌型白血球ペプチダーゼ阻害物質（ＳＬＰＩ）、リゾチーム、ＣＢＤ１０３およびカテリシジン）の発現レベルを解析した。具体的には、ｍＲＮＡの発現レベルは、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＲＴ　Ｒｅａｇｅｎｔ　ＫｉｔおよびＳＹＢＲ　ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＲＴ－ＰＣＲ　Ｋｉｔ　ＩＩ（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ社製）を製造元の指示に従って用いて、２段階リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ（ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）によって定量した。参照遺伝子としては、Peters et al., Veterinary immunology and immunopathology, 117: 55-66 (2007)に基づいてＴＡＴＡ　ｂｏｘ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＢＰ）、Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）およびＳｕｃｃｉｎａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｓｕｂｕｎｉｔ　Ａ（ＳＤＨＡ）を用いた。この研究で使用したプライマーペア配列を表２に示す。ＰＣＲの増幅効率は、代表的なｃＤＮＡサンプルの１０倍希釈系列を使用して、各プライマーセットについて決定した。全てのプライマーセットは、比較サイクル閾値（ＣＴ）法（Livak KJ & Schmittgen TD, Methods, 25(4):402-8 (2001)）によれば９５％より高い効率を示した。全てのサンプルについて二重に調べ、Maeda et al., Veterinary Pathology, 53:102-112 (2016)の記載に基づいて、平均ΔＣｔ値を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（２）結果
　結果は、図１に示した通りであった。図１Ａの結果から、ＢＰＩの発現レベルは、慢性腸炎患犬では、健常犬、小細胞性リンパ腫患犬および大細胞性リンパ腫患犬と比較して、有意に高いことが確認された。図１Ｂおよび図１Ｃの結果から、ラクトフェリンおよびＳＬＰＩの発現レベルは、慢性腸炎患犬、小細胞性リンパ腫患犬および大細胞リンパ腫患犬では、健常犬と比較して、有意に高いことが確認された。図１Ｄおよび図１Ｅの結果から、リゾチームおよびＣＢＤ１０３の発現レベルは、慢性腸炎患犬では、消化管リンパ腫患犬と比較して有意に高かったが、健常犬と患犬との間には有意差はないことが確認された。図１Ｆの結果から、４群の間でカテリシジンの発現レベルに有意差は確認されなかった。
例３：慢性腸炎および消化管リンパ腫の診断のための抗菌ペプチドマーカー
（１）方法
ア　統計学的解析
　受信者動作特性（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ　Ｏｐｅｒａｔｏｒａｔｉｎｇ　Ｃｈａｒａｓｔｅｒｉｓｔｉｃ　ｃｕｒｖｅ、ＲＯＣ）曲線分析（Akobeng AK, Acta Paediatr, 96(5):644-7(2007)およびAggarwal R & Ranganathan P, Perspect Clin Res., 9(3):145-148(2018)）を使用して、慢性腸炎の診断のためのＢＰＩ、ラクトフェリンおよびＳＬＰＩのカットオフ値を決定した。統計学的有意性は、Ｐ＜０．０５と定義した。
（２）結果
　結果は、図２および表３に示した通りであった。ＢＰＩは、慢性腸炎を健常および消化管リンパ腫と区別するための最良の能力を有することが確認された。ＢＰＩのカットオフ値１．８７５では、感度８６．７％、特異度１００％、曲線下面積（ＡＵＣ）０．９４７であり、慢性腸炎と健常とを最もよく区別することができることが確認された。また、ＢＰＩのカットオフ値０．６７６では、感度９７．７％、特異度９０．９％、曲線下面積（ＡＵＣ）０．９４８であり、慢性腸炎と消化管リンパ腫とを区別することができた。全体として、慢性腸炎を健常および消化管リンパ腫から区別するための最良のカットオフ値は１．８７５であり、感度８６．３％、特異度１００％、曲線下面積（ＡＵＣ）０．９４８であった。以上の結果から、抗菌ペプチドは慢性腸炎の診断のための有用なバイオマーカーとなることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
例４：イムノアッセイによる慢性腸炎および小細胞性消化管リンパ腫の診断
　本例では免疫組織染色により慢性腸炎と小細胞性消化管リンパ腫とを鑑別した例を示す。
　慢性胃腸疾患の臨床徴候を有さない正常犬と、慢性腸炎と診断された犬と、小細胞性消化管リンパ腫と診断された犬のそれぞれから、例１（１）ウの手順に従って十二指腸組織を採取し、パラフィン切片サンプルを調製した。次いで、脱パラフィン処理を行った後、１０ｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ６．０）に浸漬し、オートクレーブで１２１℃１０分間インキュベートし、抗原賦活化させた。それぞれの切片サンプルについて、REAL Peroxidase-Blocking Solution（Dako社製）を用いて内因性ペルオキシダーゼ活性を不活化させ、さらに５％スキムミルクでブロッキングを行った。一次抗体として抗ＢＰＩ抗体（ウサギポリクローナル抗体、GeneTex社製）を用いて切片サンプルを処置し、洗浄後、二次抗体としてEnvision for rabbit（Dako社製）を用いて切片サンプルを処置した。発色基質としてＤＡＢ（３，３’－ジアミノベンジジン）を用いてペルオキシダーゼ標識二次抗体を発色させた。
　結果は図３に示される通りであった。慢性腸炎と診断された犬の切片では茶色に染色された細胞の存在が組織全体に認められたが、正常犬の切片や小細胞性消化管リンパ腫と診断された犬の切片ではこのような細胞の存在は認められなかった。以上の結果から、抗菌ペプチドのうちＢＰＩに対する抗体を用いて慢性腸炎と小細胞性消化管リンパ腫とを正確に鑑別できることが示された。

Claims (10)

  1. 　被験動物において、殺菌性／透過性増加タンパク質（ＢＰＩ）、ラクトフェリン、分泌型白血球ペプチダーゼ阻害物質（ＳＬＰＩ）、リゾチームおよびイヌベータデフェンシン（ＣＢＤ１０３）からなる群から選択される抗菌ペプチドの発現量を測定する工程を含んでなる、食肉目動物において慢性腸炎（ＩＢＤ）と小細胞性消化管リンパ腫とを鑑別する方法。
  2. 　腸管組織における抗菌ペプチドの発現量を測定する、請求項１に記載の方法。
  3. 　遺伝子増幅法またはイムノアッセイにより抗菌ペプチドの発現量を測定する、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　抗菌ペプチドがＢＰＩである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　被験動物が慢性胃腸疾患の臨床徴候を有する動物である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　ＩＢＤまたは小細胞性消化管リンパ腫の診断を補助する方法である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　食肉目動物が、イヌ科動物またはネコ科動物である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　ＢＰＩ、ラクトフェリン、ＳＬＰＩ、リゾチームおよびＣＢＤ１０３並びにこれらの遺伝子からなる群から選択される抗菌ペプチドまたはその遺伝子からなる、ＩＢＤと小細胞性消化管リンパ腫との鑑別用マーカー。
  9. 　ＢＰＩ、ラクトフェリン、ＳＬＰＩ、リゾチームおよびＣＢＤ１０３並びにこれらの遺伝子からなる群から選択される抗菌ペプチドまたはその遺伝子の検出手段を含んでなる、ＩＢＤと小細胞性消化管リンパ腫との鑑別用キットまたはＩＢＤもしくは小細胞性消化管リンパ腫の診断剤。
  10. 　食肉目動物におけるＩＢＤまたは小細胞性消化管リンパ腫の治療方法であって、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法を実施して被験動物からＩＢＤに罹患した動物または小細胞性消化管リンパ腫に罹患した動物を特定する工程と、前記動物にＩＢＤに対する治療または小細胞性消化管リンパ腫に対する治療を実施する工程とを含む前記方法。
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