JP7037807B2 - 食肉目動物の癌検出方法 - Google Patents
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Description
[1]被験動物の尿試料から得られた細胞におけるHER2遺伝子のコピー数を測定する工程を含んでなる、食肉目動物において癌を検出する方法。
[2]前記癌が、尿路上皮癌または前立腺癌である、上記[1]に記載の方法。
[3]前記尿路上皮癌が、膀胱癌、尿管癌、尿道癌または腎盂癌である、上記[2]に記載の方法。
[4]前記尿試料から得られた細胞が、尿沈渣細胞である、上記[1]~[3]のいずれかに記載の方法。
[5]HER2遺伝子のコピー数の測定をPCR法により実施する、上記[1]~[4]のいずれかに記載の方法。
[6]被験動物のHER2遺伝子のコピー数の対照遺伝子のコピー数に対する比率(コピー数比率)が、健常食肉目動物のコピー数比率(カットオフ値)を上回る場合に、被験動物に癌が存在することが示される、上記[1]~[5]のいずれかに記載の方法。
[7]前記カットオフ値が、下記式:
カットオフ値=(健常食肉目動物のコピー数比率の平均値)+2×(健常食肉目動物のコピー数比率の標準偏差)
により算出される、上記[6]に記載の方法。
[8]前記食肉目動物が、イヌ科動物またはネコ科動物である、上記[1]~[7]のいずれかに記載の方法。
[9]他の遺伝子変異検査と組み合わせて実施される、上記[1]~[8]のいずれかに記載の方法。
[10]前記他の遺伝子変異検査が、BRAF遺伝子変異を検出する検査である、上記[9]に記載の方法。
[11]食肉目動物の癌の診断方法である、上記[1]~[10]のいずれかに記載の方法。
カットオフ値=(健常食肉目動物のコピー数比率の平均値)+k×(健常食肉目動物のコピー数比率の標準偏差)
(上記式中、kは0~3の定数であり、好ましくはk=1~3であり、特に2とすることができる。)
により算出される値とすることができる。上記のいずれの場合も、複数の健常食肉目動物から得られたコピー数比率を算出に用いることができる。また、標準偏差は公知の方法に従って算出することができる。被験動物がイヌ科動物(特に、イエイヌ)であり、対照遺伝子がCFA8(イエイヌの染色体8)の一領域である場合には、上記式により算出されるカットオフ値は1.1とすることができる。
(1)膀胱癌組織サンプルの調製
膀胱癌患犬(n=23)から膀胱癌組織を採取した。膀胱癌組織をホルマリンで固定し、パラフィン包埋後、常温で保存した。
上記(1)で調製したパラフィン包埋した膀胱癌組織から4μmの薄切スライド標本を作製した。各スライドを脱パラフィン処理後、10mMのクエン酸バッファー(pH6.0)に浸漬し、121℃で5分間オートクレーブ処理することで抗原賦活した。続いて、REAL Peroxidase-Blocking Solution(Dako社製)を用いて室温で10分間処理して内因性ペルオキシダーゼを不活化した後、5%スキムミルクを含むTris-buffered saline with 0.1% Tween 20(TBST)により室温で60分間ブロッキング処理を行った。次いで、一次抗体としてrabbit polyclonal anti-HER2 antibody(100倍希釈、Dako社製)を添加し37℃で40分間静置した。スライドをTBSTで3回洗浄し、EnVision polymer reagent for rabbit(Dako社製)と37℃で40分間反応させた。TBSで3回洗浄後、四塩酸3,3’-ジアミノベンジジン(DAB)を用いて反応産物を可視化した。以下の染色強度スコアの判定基準に従って、HER2タンパク量を評価した。
スコア0:細胞膜に陽性染色なし(細胞質に限局する陽性染色は判定対象外)
スコア1:弱い不完全な細胞膜の陽性染色がある癌細胞>5%
スコア2:強いが不完全な細胞膜の陽性染色がある癌細胞>10%
スコア3:強い完全な細胞膜の陽性染色がある癌細胞>10%
スコア2およびスコア3に該当する膀胱癌患犬数は14匹であり、HER2タンパクを過剰発現する膀胱癌患犬の比率は61%であったことから、膀胱癌であってもHER2タンパクを過剰に発現しない症例が半数近く存在することが確認された。
(1)組織サンプルの調製
膀胱癌患犬(n=36)、膀胱ポリープ患犬(n=8)および健常犬(n=39)から膀胱組織を採取した以外は例1(1)の記載に従って実施した。なお、膀胱ポリープは対照疾患として扱った。
QIAmp DNA FFPE Tissue Kit(キアゲン社製)を用いて、上記(1)で調製した膀胱組織サンプルからDNAを抽出した。抽出したDNAは-20℃で冷凍保存した。
HER2遺伝子およびコントロール遺伝子であるCFA8のプライマー配列およびTaqMan MGBプローブをPrimer Express Software(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)を用いて作製した。HER2遺伝子のプライマー配列およびプローブ配列は、Primer Express Software v3.0.1のアルゴリズムに基づいて設計した。具体的には、上記ソフトウェアの設計結果の中から、極端に各遺伝子の5’寄りまたは3’寄りの配列は避け、かつUCSC Blatサーチで相同性の高い配列を増幅しないような領域に設計した。CFA8のプライマー配列およびプローブ配列は、癌の存在によってもコピー数が変動しない領域が増幅されるように、Shapiro SG et al., Chromosome Res. 2015 Jun;23(2):311-331を参考にして設計した。各プライマーおよびプローブの配列は以下の通りである。
フォワードプライマー:GTGGTGAGGCTGGTTTTCAGA(配列番号1)
リバースプライマー:CCTGTCCTCCCACCTCTTCAT(配列番号2)
プローブ(FAM標識):TAACCGCTAAGCAGTATGT(配列番号3)
フォワードプライマー:TGCAGAGTTTGATTTGTTGTTTGAA(配列番号4)
リバースプライマー:TGGAAGAAGGTGCATTTTTCTGA(配列番号5)
プローブ(VIC標識):AATGCCTTTGACCAGTGGGTAGCC(配列番号6)
結果を図1に示す。
(1)尿沈渣細胞サンプルの調製
膀胱癌患犬(n=57)、膀胱炎患犬(n=16)、膀胱結石患犬(n=4)、膀胱ポリープ患犬(n=10)および健常犬(n=10)から尿を採取した。なお、膀胱炎患犬、膀胱結石患犬および膀胱ポリープ患犬を「対照疾患」とした。採取した尿は1500rpmで5分間遠心し、癌細胞を含む尿沈渣細胞を分離した。分離した尿沈渣細胞サンプルは-20℃で冷凍保存した。
上記(1)で調製した尿沈渣細胞サンプルからのDNA抽出は、例2(2)の記載に従って実施した。
上記(2)で調製したDNAについてHER2遺伝子コピー数の定量は、例2(3)の記載に従って実施した。
結果を図2に示す。
(1)尿沈渣細胞サンプルの調製
尿沈渣細胞サンプルの調製は、膀胱癌患犬(n=12)から尿を採取した以外は例3(1)の記載に従って実施した。
上記(1)の膀胱癌患犬(n=12)から膀胱癌組織を採取した以外は例1(1)の記載に従って実施した。
上記(1)で調製した尿沈渣細胞サンプルおよび上記(2)で調製した膀胱癌組織サンプルからのDNA抽出は、例2(2)の記載に従って実施した。
上記(3)で調製した各DNAについてHER2遺伝子コピー数の定量は、例2(3)の記載に従って実施した。
結果を図3に示す。
(1)尿沈渣細胞サンプルの調製
尿沈渣細胞サンプルの調製は、膀胱癌患犬(n=16)から尿を採取した以外は例3(1)の記載に従って実施した。
上記(1)で調製した尿沈渣細胞サンプルからのDNA抽出は、例2(2)の記載に従って実施した。
上記(2)で調製したDNAについてHER2遺伝子コピー数の定量は、例2(3)の記載に従って実施した。
膀胱癌組織サンプルの調製は、上記(1)の膀胱癌患犬(n=16)から膀胱癌組織を採取した以外は、例1(1)の記載に従って実施した。
上記(4)で調製した膀胱癌組織サンプルのHER2免疫組織化学は、例1(2)の記載に従って実施した。HER2タンパク発現量がスコア0および1に該当する症例をHER2タンパク過剰発現が陰性であると判断し、スコア2および3に該当する症例をHER2タンパク過剰発現が陽性であると判断した。
結果を図4に示す。
(1)尿沈渣細胞サンプルの調製
例3(1)に記載の膀胱癌患犬(n=57)から採取した尿沈渣細胞サンプルを用いた。
例3(2)に記載の上記(1)の尿沈渣細胞サンプルから抽出したDNAを用いた。
例3(3)に記載の上記(2)で調製したDNAを用いて定量したHER2遺伝子コピー数の値を用いた。
デジタルPCRによるBRAF遺伝子変異を持つ腫瘍細胞の検出は、Mochizuki et al., PLoS ONE, 10(12):e0144170に記載の手順に従って実施した。
結果を図5に示す。
Claims (9)
- 被験動物の尿試料から得られた細胞におけるHER2遺伝子のコピー数を測定する工程を含んでなる、イヌ科動物において尿路上皮癌または前立腺癌を検出する方法。
- 前記尿路上皮癌が、膀胱癌、尿管癌、尿道癌または腎盂癌である、請求項1に記載の方法。
- 前記尿試料から得られた細胞が、尿沈渣細胞である、請求項1または2に記載の方法。
- HER2遺伝子のコピー数の測定をPCR法により実施する、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 被験動物のHER2遺伝子のコピー数の対照遺伝子のコピー数に対する比率(コピー数比率)が、健常イヌ科動物のコピー数比率(カットオフ値)を上回る場合に、被験動物に尿路上皮癌または前立腺癌が存在することが示される、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記カットオフ値が、下記式:
カットオフ値=(健常イヌ科動物のコピー数比率の平均値)+k×(健常イヌ科動物のコピー数比率の標準偏差)
(上記式中、kは0~3の定数である。)
により算出される、請求項5に記載の方法。 - 他の遺伝子変異検査と組み合わせて実施される、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記他の遺伝子変異検査が、BRAF遺伝子変異を検出する検査である、請求項7に記載の方法。
- イヌ科動物の尿路上皮癌または前立腺癌の診断方法である、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。
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JP2018009612A JP7037807B2 (ja) | 2018-01-24 | 2018-01-24 | 食肉目動物の癌検出方法 |
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JP (1) | JP7037807B2 (ja) |
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2018
- 2018-01-24 JP JP2018009612A patent/JP7037807B2/ja active Active
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
Akita J Med,vol.31,2004年,p.63-69 |
PLOS ONE,2015年,10(12):e0144170 |
Vet Comp Oncol,2017年,vol.16,p.297-300 |
Also Published As
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