JP2020143951A - 慢性腸炎と消化管リンパ腫との鑑別方法並びに鑑別マーカーおよびキット - Google Patents
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Abstract
【課題】食肉目動物において慢性腸炎（ＩＢＤ）と小細胞性消化管リンパ腫とを鑑別する方法の提供。【解決手段】本発明によれば、被験動物において、殺菌性／透過性増加タンパク質（ＢＰＩ）、ラクトフェリン、分泌型白血球ペプチダーゼ阻害物質（ＳＬＰＩ）、リゾチームおよびイヌベータデフェンシン（ＣＢＤ１０３）からなる群から選択される抗菌ペプチドの発現量を測定する工程を含んでなる、食肉目動物においてＩＢＤと小細胞性消化管リンパ腫とを鑑別する方法が提供される。【選択図】なし
Description
本発明は、慢性腸炎と消化管リンパ腫との鑑別方法と、慢性腸炎と消化管リンパ腫との鑑別用マーカーおよびキットに関する。
犬および猫における慢性腸炎および消化管リンパ腫は、類似した慢性消化器症状を呈するがその予後は大きく異なり、一般的に慢性腸炎と比べて消化管リンパ腫では予後が不良である。慢性腸炎と消化管リンパ腫の診断は、内視鏡生検による病理組織学的検査により行われるが、慢性腸炎と小細胞性消化管リンパ腫（以下、単に「小細胞性リンパ腫」ということがある）の病理組織像はしばしば類似しているため鑑別が困難な場合がある（非特許文献１）。このため補助診断として、生検組織を用いた免疫組織化学（ＩＨＣ）およびクローナリティ検査による段階的診断アプローチが推奨されているが、どちらの検査も感度および特異度が低く、これらの検査を用いても慢性腸炎と小細胞性消化管リンパ腫との鑑別は依然として困難な場合が多い。
Washabau et al., Journal of veterinary internal medicine, 24:10-26 (2010)
東京大学獣医医療センターにおいて２０１７年１月から１３か月間に診断した症例について調査したところ、病理組織学的検査により慢性腸炎と診断された犬の２４％（猫では３９％）がクローナリティ検査では小細胞性消化管リンパ腫陽性であり、同様に小細胞性消化管リンパ腫と診断された犬の４１％（猫では４２％）がクローナリティ検査では慢性腸炎陽性であり、病理組織学的検査とクローナリティ検査の結果が一致しない症例が４割近く存在した。
本発明は、食肉目動物において慢性腸炎（ＩＢＤ）と小細胞性消化管リンパ腫とを鑑別する方法と、この鑑別に用いるためのマーカーおよびキットを提供することを目的とする。
本発明者は、内視鏡検査を受けた慢性胃腸疾患の臨床徴候を有する犬母集団から診断により、慢性腸炎、小細胞性消化管リンパ腫および大細胞性消化管リンパ腫を特定し、これらの３群の間には、臨床スコアおよび全生存期間について有意差があることを見出した。本発明者はまた、健常を含めた４群についてリアルタイムＰＣＲを用いて十二指腸粘膜内における各種抗菌ペプチド発現量を定量し、慢性腸炎では５種の抗菌ペプチドのｍＲＮＡ発現レベルが健常または消化管リンパ腫と比較して有意に高いことを見出した。本発明者はまた、殺菌性／透過性増加タンパク質（ＢＰＩ）の発現レベルは、慢性腸炎で特異的に増加し、消化管リンパ腫および健常では増加しないことを見出した。本発明者はまた、ＲＯＣカーブ法によりＢＰＩの診断精度を検討したところ、ＢＰＩ遺伝子発現量のカットオフ値を１．８７５に設定すると、感度８６．３％、特異度１００％、曲線下面積０．９４８と高い感度および特異度で慢性腸炎と消化管リンパ腫および正常とを区別することができることを見出した。本発明は、これらの知見に基づくものである。
本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］被験動物において、殺菌性／透過性増加タンパク質（ＢＰＩ）、ラクトフェリン、分泌型白血球ペプチダーゼ阻害物質（ＳＬＰＩ）、リゾチームおよびイヌベータデフェンシン（ＣＢＤ１０３）からなる群から選択される抗菌ペプチドの発現量を測定する工程を含んでなる、食肉目動物において慢性腸炎（ＩＢＤ）と小細胞性消化管リンパ腫とを鑑別する方法。
［２］腸管組織における抗菌ペプチドの発現量を測定する、上記［１］に記載の方法。
［３］遺伝子増幅法またはイムノアッセイにより抗菌ペプチドの発現量を測定する、上記［１］または［２］に記載の方法。
［４］抗菌ペプチドがＢＰＩである、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］被験動物が慢性胃腸疾患の臨床徴候を有する動物である、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］ＩＢＤまたは小細胞性消化管リンパ腫の診断を補助する方法である、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］食肉目動物が、イヌ科動物またはネコ科動物である、上記［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］ＢＰＩ、ラクトフェリン、ＳＬＰＩ、リゾチームおよびＣＢＤ１０３並びにこれらの遺伝子からなる群から選択される抗菌ペプチドまたはその遺伝子からなる、ＩＢＤと小細胞性消化管リンパ腫との鑑別用マーカー。
［９］ＢＰＩ、ラクトフェリン、ＳＬＰＩ、リゾチームおよびＣＢＤ１０３並びにこれらの遺伝子からなる群から選択される抗菌ペプチドまたはその遺伝子の検出手段を含んでなる、ＩＢＤと小細胞性消化管リンパ腫との鑑別用キットまたはＩＢＤもしくは小細胞性消化管リンパ腫の診断剤。
［１］被験動物において、殺菌性／透過性増加タンパク質（ＢＰＩ）、ラクトフェリン、分泌型白血球ペプチダーゼ阻害物質（ＳＬＰＩ）、リゾチームおよびイヌベータデフェンシン（ＣＢＤ１０３）からなる群から選択される抗菌ペプチドの発現量を測定する工程を含んでなる、食肉目動物において慢性腸炎（ＩＢＤ）と小細胞性消化管リンパ腫とを鑑別する方法。
［２］腸管組織における抗菌ペプチドの発現量を測定する、上記［１］に記載の方法。
［３］遺伝子増幅法またはイムノアッセイにより抗菌ペプチドの発現量を測定する、上記［１］または［２］に記載の方法。
［４］抗菌ペプチドがＢＰＩである、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］被験動物が慢性胃腸疾患の臨床徴候を有する動物である、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］ＩＢＤまたは小細胞性消化管リンパ腫の診断を補助する方法である、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］食肉目動物が、イヌ科動物またはネコ科動物である、上記［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］ＢＰＩ、ラクトフェリン、ＳＬＰＩ、リゾチームおよびＣＢＤ１０３並びにこれらの遺伝子からなる群から選択される抗菌ペプチドまたはその遺伝子からなる、ＩＢＤと小細胞性消化管リンパ腫との鑑別用マーカー。
［９］ＢＰＩ、ラクトフェリン、ＳＬＰＩ、リゾチームおよびＣＢＤ１０３並びにこれらの遺伝子からなる群から選択される抗菌ペプチドまたはその遺伝子の検出手段を含んでなる、ＩＢＤと小細胞性消化管リンパ腫との鑑別用キットまたはＩＢＤもしくは小細胞性消化管リンパ腫の診断剤。
慢性腸炎と小細胞性消化管リンパ腫との鑑別方法
本発明の鑑別方法は食肉目動物に対して実施することができる。食肉目は、別名：ネコ目とも呼ばれ、イヌ亜目とネコ亜目に分類される。イヌ亜目に属する動物としてはイヌ科動物（例えば、イエイヌ）が挙げられ、ネコ亜目に属する動物としてはネコ科動物（例えば、イエネコ）が挙げられる。なお、本明細書において、「イエイヌ」と「犬」は同義である。
本発明の鑑別方法は食肉目動物に対して実施することができる。食肉目は、別名：ネコ目とも呼ばれ、イヌ亜目とネコ亜目に分類される。イヌ亜目に属する動物としてはイヌ科動物（例えば、イエイヌ）が挙げられ、ネコ亜目に属する動物としてはネコ科動物（例えば、イエネコ）が挙げられる。なお、本明細書において、「イエイヌ」と「犬」は同義である。
本発明において検査対象である抗菌ペプチドは、殺菌性／透過性増加タンパク質（ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ／ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＢＰＩ）、ラクトフェリン、分泌型白血球ペプチダーゼ阻害物質（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ；ＳＬＰＩ）、リゾチームおよびイヌベータデフェンシン（ｃａｎｉｎｅ ｂｅｔａ ｄｅｆｅｎｓｉｎ；ＣＢＤ１０３）が挙げられ、ＲＯＣ曲線分析における高い感度および特異度の観点から好ましくはＢＰＩを検査対象として用いることができる。
本発明において検出対象である抗菌ペプチド遺伝子は、検査対象の食肉目動物の抗菌ペプチド遺伝子とすることができる。例えば、本発明の鑑別方法をイエイヌに対して実施する場合には、抗菌ペプチドはイエイヌ由来のものとすることができる。
抗菌ペプチド遺伝子の塩基配列は本技術分野において公知であり、例えば、イエイヌのＢＰＩ、ラクトフェリン、ＳＬＰＩ、リゾチームおよびＣＢＤ１０３の遺伝子の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋにそれぞれＸＭ＿０２２４０９１６７、ＸＭ＿５４１９０３、ＥＵ３１５０７２、ＫＪ７００８７８、ＮＭ＿００１１２９９８０として登録されており、これらを利用することができる。また、イエイヌのＢＰＩ、ラクトフェリン、ＳＬＰＩ、リゾチームおよびＣＢＤ１０３のペプチドのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋにそれぞれＸＰ＿０２２２６４８７５．１、ＸＰ＿５４１９０３．２、ＡＢＹ５９２４９．１、ＡＩＥ１３８２５．１、ＮＰ＿００１１２３４５２．１として登録されており、これらを利用することができる。
本発明の鑑別方法における抗菌ペプチドの発現量の測定は、公知の方法によりイン・ビトロにおいて実施することができる。従って、本発明の鑑別方法はイン・ビトロの鑑別方法とすることができる。
本発明の鑑別方法における生体試料中の抗菌ペプチドの発現量は、例えば、抗菌ペプチド遺伝子の発現量に基づいて測定することができる。この場合、抗菌ペプチド遺伝子の発現量の測定は、例えば、ＰＣＲ法（特にＲＴ−ＰＣＲ、定量的ＲＴ−ＰＣＲ）等の遺伝子増幅法、ＤＮＡマイクロアレイ解析、ノーザンブロッティング等の公知の方法により実施することができる。抗菌ペプチド遺伝子の発現量の測定に使用するプローブおよびプライマーセットは、後述の抗菌ペプチド遺伝子の配列情報に基づいて作製することができ、後記実施例を参照することもできる。
生体試料中の抗菌ペプチドの発現量はまた、抗菌ペプチドの発現量に基づいて測定することができる。この場合、抗菌ペプチドの発現量の測定は、抗菌ペプチドに対する特異的結合物質を用いた公知の検出手段により実施することができ、例えば、ＥＬＩＳＡ（例えば、直接法、間接法、サンドイッチ法、競合法）、ウエスタンブロット、免疫組織化学染色等のイムノアッセイにより実施することができる。抗菌ペプチドに対する特異的結合物質としては抗体が挙げられ、市販の抗体を使用することができる。例えば、ＢＰＩに対する抗体としては、ウサギポリクローナル抗ＢＰＩ抗体（Rabbit polyclonal anti-BPI antibody；GeneTex社製）が挙げられる。
抗菌ペプチドに対する抗体は、抗菌ペプチドに特異的に結合する抗体を意味する。本発明では、抗体として、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、イヌ抗体、ネコ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、マウス抗体、ラット抗体、ラクダ抗体、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ）等のいずれを使用してもよく、これらは当業者であれば公知の手法に従って調製することができる。
抗菌ペプチドに対する抗体は、例えば、抗菌ペプチドタンパク質またはその一部を抗原として、公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。抗菌ペプチドタンパク質またはその一部は、公知のタンパク質発現法および精製法によって調製することができる。抗菌ペプチドタンパク質としては、例えば前述の抗菌ペプチドの配列情報によって規定されるイエイヌ抗菌ペプチド等が挙げられるが、これに限定されるものではない。種々の生物由来の抗菌ペプチドタンパク質を免疫原として用いてもよい。本発明に用いることができる抗菌ペプチドに対する抗体はまた、ファージ・ディスプレー法（例えば、FEBS Letter, 441:20-24(1998)を参照）を介して作製することもできる。
本発明の方法においては、被験動物における抗菌ペプチドの発現量が所定の基準を満たす場合に、ＩＢＤに罹患している可能性が高いと、あるいは小細胞性消化管リンパ腫に罹患している可能性が高いと判定することができる。判定の基準は、採用する抗菌ペプチドの測定方法ごとに定めることができる。上記判定は、具体的な数値を基準にして判定することのみならず、色の濃淡や色彩の違い等、視覚通じて把握できる数値以外の基準に基づいて判定することを含む。例えば、後述するようにカットオフ値を定め、測定値が所定値以上である場合またはそれを上回る場合に、あるいは所定値以下である場合またはそれを下回る場合に、ＩＢＤに罹患している可能性が高いと、あるいは小細胞性消化管リンパ腫に罹患している可能性が高いと判定することができる。あるいは、後述するように発色の有無を基準として定め、発色があった場合に、あるいは発色がなかった場合に、ＩＢＤに罹患している可能性が高いと、あるいは小細胞性消化管リンパ腫に罹患している可能性が高いと判定することができる。
本発明の方法においては、被験動物の抗菌ペプチドの発現量が所定のカットオフ値以上である場合またはそれを上回る場合に、あるいは所定のカットオフ値以下である場合またはそれを下回る場合に、ＩＢＤに罹患している可能性が高いと、あるいは小細胞性消化管リンパ腫に罹患している可能性が高いと判定することができる。判定に使用するカットオフ値や判定の基準は、抗菌ペプチドごとに定めることができる。
後記実施例に示される通り、ＩＢＤに罹患した食肉目動物におけるＢＰＩ、ラクトフェリン、リゾチームおよびＣＢＤ１０３のそれぞれの発現量は、小細胞性消化管リンパ腫に罹患した食肉目動物におけるＢＰＩ、ラクトフェリン、リゾチームおよびＣＢＤ１０３のそれぞれの発現量を有意に上回るものであった。従って、本発明の方法においてカットオフ値は、ＩＢＤに罹患した食肉目動物の抗菌ペプチドの発現量の平均値とすることができ、あるいは、下記式により算出される値とすることができる。
カットオフ値（１）＝（ＩＢＤに罹患した食肉目動物の抗菌ペプチドの発現量の平均値）−ｋ×（ＩＢＤに罹患した食肉目動物の抗菌ペプチドの発現量の標準偏差）
（上記式中、ｋは０〜３の定数であり、好ましくはｋ＝１〜３であり、特に２とすることができる。）
カットオフ値（１）＝（ＩＢＤに罹患した食肉目動物の抗菌ペプチドの発現量の平均値）−ｋ×（ＩＢＤに罹患した食肉目動物の抗菌ペプチドの発現量の標準偏差）
（上記式中、ｋは０〜３の定数であり、好ましくはｋ＝１〜３であり、特に２とすることができる。）
本発明の方法においてカットオフ値はまた、小細胞性消化管リンパ腫に罹患した食肉目動物の抗菌ペプチドの発現量の平均値とすることができ、あるいは、下記式により算出される値とすることができる。
カットオフ値（２）＝（小細胞性消化管リンパ腫に罹患した食肉目動物の抗菌ペプチドの発現量の平均値）＋ｋ×（小細胞性消化管リンパ腫に罹患した食肉目動物の抗菌ペプチドの発現量の標準偏差）
（上記式中、ｋは０〜３の定数であり、好ましくはｋ＝１〜３であり、特に２とすることができる。）
カットオフ値（２）＝（小細胞性消化管リンパ腫に罹患した食肉目動物の抗菌ペプチドの発現量の平均値）＋ｋ×（小細胞性消化管リンパ腫に罹患した食肉目動物の抗菌ペプチドの発現量の標準偏差）
（上記式中、ｋは０〜３の定数であり、好ましくはｋ＝１〜３であり、特に２とすることができる。）
本発明においては、被験動物において測定した上記４種の抗菌ペプチドの１種または２種以上の発現量がカットオフ値（１）または（２）（好ましくはカットオフ値（１））を上回る場合に、被験動物がＩＢＤに罹患している可能性が高いことが示される。本発明においてはまた、被験動物において測定した上記４種の抗菌ペプチドの１種または２種以上の発現量が、カットオフ値（１）または（２）（好ましくはカットオフ値（２））を下回る場合に、被験動物が小細胞性消化管リンパ腫に罹患している可能性が高いことが示される。すなわち、本発明の方法は、被験動物の上記４種の抗菌ペプチドの１種または２種以上の発現量の測定の後に、該発現量がカットオフ値（１）または（２）（好ましくはカットオフ値（１））を上回る場合に、被験動物がＩＢＤに罹患していると、あるいはＩＢＤに罹患している可能性が高いと判定する工程を含んでいてもよい。本発明の方法はまた、上記判定工程とは別に、あるいは上記判定工程と組み合わせて、被験動物の上記４種の抗菌ペプチドの１種または２種以上の発現量の測定の後に、該発現量がカットオフ値（１）または（２）（好ましくはカットオフ値（２））を下回る場合に、被験動物が小細胞性消化管リンパ腫に罹患していると、あるいは小細胞性消化管リンパ腫に罹患している可能性が高いと判定する工程を含んでいてもよい。なお、被験動物の上記４種の抗菌ペプチドの１種または２種以上の発現量がカットオフ値（１）を下回り、かつ、カットオフ値（２）を上回る場合を含め、被験動物がＩＢＤあるいは小細胞性消化管リンパ腫に罹っているか否かの判断は、場合によっては診察結果や、他の検査所見（例えば、病理組織学的検査、免疫組織化学（ＩＨＣ）検査、クローナリティ検査）と組み合わせて、最終的には獣医師が行うことができる。
後記実施例に示される通り、ＩＢＤに罹患した食肉目動物におけるＳＬＰＩの発現量は、小細胞性消化管リンパ腫に罹患した食肉目動物におけるＳＬＰＩの発現量を有意な傾向で下回るものであった。従って、本発明の方法においてカットオフ値は、ＩＢＤに罹患した食肉目動物の抗菌ペプチドの発現量の平均値とすることができ、あるいは、下記式により算出される値とすることができる。
カットオフ値（３）＝（ＩＢＤに罹患した食肉目動物の抗菌ペプチドの発現量の平均値）＋ｋ×（ＩＢＤに罹患した食肉目動物の抗菌ペプチドの発現量の標準偏差）
（上記式中、ｋは０〜３の定数であり、好ましくはｋ＝１〜３であり、特に２とすることができる。）
カットオフ値（３）＝（ＩＢＤに罹患した食肉目動物の抗菌ペプチドの発現量の平均値）＋ｋ×（ＩＢＤに罹患した食肉目動物の抗菌ペプチドの発現量の標準偏差）
（上記式中、ｋは０〜３の定数であり、好ましくはｋ＝１〜３であり、特に２とすることができる。）
本発明の方法においてカットオフ値はまた、小細胞性消化管リンパ腫に罹患した食肉目動物の抗菌ペプチドの発現量の平均値とすることができ、あるいは、下記式により算出される値とすることができる。
カットオフ値（４）＝（小細胞性消化管リンパ腫に罹患した食肉目動物の抗菌ペプチドの発現量の平均値）−ｋ×（小細胞性消化管リンパ腫に罹患した食肉目動物の抗菌ペプチドの発現量の標準偏差）
（上記式中、ｋは０〜３の定数であり、好ましくはｋ＝１〜３であり、特に２とすることができる。）
カットオフ値（４）＝（小細胞性消化管リンパ腫に罹患した食肉目動物の抗菌ペプチドの発現量の平均値）−ｋ×（小細胞性消化管リンパ腫に罹患した食肉目動物の抗菌ペプチドの発現量の標準偏差）
（上記式中、ｋは０〜３の定数であり、好ましくはｋ＝１〜３であり、特に２とすることができる。）
本発明においては、被験動物において測定したＳＬＰＩの発現量が、カットオフ値（３）または（４）（好ましくはカットオフ値（３））を下回る場合に、被験動物がＩＢＤに罹患している可能性が高いことが示される。本発明においてはまた、被験動物において測定したＳＬＰＩの発現量が、カットオフ値（３）または（４）（好ましくはカットオフ値（４））を上回る場合に、被験動物が小細胞性消化管リンパ腫に罹患している可能性が高いことが示される。すなわち、本発明の方法は、被験動物のＳＬＰＩの発現量の測定の後に、該発現量がカットオフ値（３）または（４）（好ましくはカットオフ値（３））を下回る場合に、被験動物がＩＢＤに罹患していると、あるいはＩＢＤに罹患している可能性が高いと判定する工程を含んでいてもよい。本発明の方法はまた、上記判定工程とは別に、あるいは上記判定工程と組み合わせて、被験動物のＳＬＰＩの発現量の測定の後に、該発現量がカットオフ値（３）または（４）（好ましくはカットオフ値（４））を上回る場合に、被験動物が小細胞性消化管リンパ腫に罹患していると、あるいは小細胞性消化管リンパ腫に罹患している可能性が高いと判定する工程を含んでいてもよい。なお、被験動物のＳＬＰＩの発現量がカットオフ値（３）を上回り、かつ、カットオフ値（４）を下回る場合を含め、被験動物がＩＢＤあるいは小細胞性消化管リンパ腫に罹っているか否かの判断は、場合によっては診察結果や、他の検査所見（例えば、病理組織学的検査、免疫組織化学（ＩＨＣ）検査、クローナリティ検査）と組み合わせて、最終的には獣医師が行うことができる。
本発明の方法におけるカットオフ値の設定は統計学的解析により実施してもよい。例えば、後記実施例に示される通り、ＲＯＣ曲線分析を使用してカットオフ値を設定してもよい。ＲＯＣ曲線分析では、所望の感度および特異度となるカットオフ値を選択することができ、精度はＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ：Ａｒｅａ Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ Ｃｕｒｖｅ）により評価することができる。また本発明の方法におけるカットオフ値は、抗菌ペプチドの発現量と相関している限り、特に限定されるものではなく、後述のイムノアッセイの結果を撮像し、解析ソフト等を用いて定量化したものを用いてもよい。
本発明の方法の実施に当たっては、予めＩＢＤに罹患した食肉目動物の抗菌ペプチドの発現量と、小細胞性消化管リンパ腫に罹患した食肉目動物の抗菌ペプチドの発現量を測定しておき、その結果に基づいてカットオフ値を準備した上で前記判定工程を実施することができる。すなわち本発明の方法は、前記判定工程に先立って、ＩＢＤに罹患した食肉目動物の抗菌ペプチドの発現量および小細胞性消化管リンパ腫に罹患した食肉目動物の抗菌ペプチドの発現量のいずれかまたは両方を測定し、カットオフ値を準備する工程をさらに含んでいてもよい。
後記実施例に示される通り、抗菌ペプチドとしてＢＰＩを選択した場合に、慢性胃腸疾患の臨床徴候を有する被験動物においてＢＰＩの発現が認められたときは、該被験動物がＩＢＤに罹患している可能性が高い。このため、本発明の好ましい態様においては、被験動物において、ＢＰＩの発現量を測定する工程を含んでなる、食肉目動物においてＩＢＤと小細胞性消化管リンパ腫とを鑑別する方法が提供される。この鑑別方法の測定工程は、生体試料におけるＢＰＩの発現の有無を測定する工程であってもよい。
抗菌ペプチドとしてＢＰＩを選択した本発明の鑑別方法では、ＢＰＩの発現の存在は被験動物がＩＢＤに罹患していること、あるいはＩＢＤに罹患している可能性が高いことを示し、さらには、被験動物が小細胞性消化管リンパ腫に罹患していないこと、あるいは小細胞性消化管リンパ腫に罹患している可能性が低いことを示す。すなわち、上記鑑別方法は、ＢＰＩの発現の存在が認められたときに、被験動物がＩＢＤに罹患していると、あるいはＩＢＤに罹患している可能性が高いと判定する工程を含んでいてもよい。上記鑑別方法はまた、ＢＰＩの発現の存在が認められたときに、被験動物が小細胞性消化管リンパ腫に罹患していないと、あるいは小細胞性消化管リンパ腫に罹患している可能性が低いと判定する工程を含んでいてもよい。
抗菌ペプチドとしてＢＰＩを選択した本発明の鑑別方法ではまた、ＢＰＩの発現の不存在は被験動物が小細胞性消化管リンパ腫に罹患していること、あるいは小細胞性消化管リンパ腫に罹患している可能性が高いことを示し、さらには、被験動物がＩＢＤに罹患していないこと、あるいはＩＢＤに罹患している可能性が低いことを示す。すなわち、上記鑑別方法は、ＢＰＩの発現の存在が認められないときに、被験動物が小細胞性消化管リンパ腫に罹患していると、あるいは小細胞性消化管リンパ腫に罹患している可能性が高いと判定する工程を含んでいてもよい。上記鑑別方法はまた、ＢＰＩの発現の存在が認められないときに、被験動物がＩＢＤに罹患していないと、あるいはＩＢＤに罹患している可能性が低いと判定する工程を含んでいてもよい。
抗菌ペプチドとしてＢＰＩを選択した本発明の鑑別方法ではイムノアッセイを用いてＢＰＩの発現の有無を測定することができる。例えば、被験動物から得られた腸管組織サンプルに対して、ＢＰＩに対する抗体を用いたイムノアッセイを実施し、ＢＰＩの存在を示す発色が認められた場合には、該被験動物がＩＢＤに罹患しているか、あるいはＩＢＤに罹患している可能性が高いと判定することができ、ＢＰＩの存在を示す発色が認められなかった場合や、ＢＰＩの存在を示す発色がほとんど認められなかった場合には、該被験動物が小細胞性消化管リンパ腫に罹患しているか、あるいは小細胞性消化管リンパ腫に罹患している可能性が高いと判定することができる。このような態様は、ＩＢＤと小細胞性消化管リンパ腫とを診察室で簡便かつ迅速に鑑別できるため有利である。
本発明において抗菌ペプチドの発現量の測定は、被験動物の腸管組織（好ましくは十二指腸組織）における抗菌ペプチドの発現量を測定することにより実施することができる。腸管組織は好ましくは腸管粘膜組織である。腸管組織サンプルは、例えば、測定に先立って、内視鏡により被験動物から採取することができる。採取したサンプル（生体試料）はその後実施する測定方法に適した前処理を行った上で凍結保存してもよい。
本発明の方法によれば、被験動物においてＩＢＤと小細胞性消化管リンパ腫とを鑑別することができる。従って、本発明の方法は、ＩＢＤおよび／または小細胞性消化管リンパ腫の診断に補助的に用いることができる。被験動物がＩＢＤまたは小細胞性消化管リンパ腫癌に罹っているか否かの判断は、場合によっては診察結果や、他の検査所見（例えば、病理組織学的検査、免疫組織化学（ＩＨＣ）検査、クローナリティ検査）と組み合わせて、最終的には獣医師が行うことができる。
前記の通り従来の検査技術では、慢性胃腸疾患の臨床徴候を有する食肉目動物においてＩＢＤと小細胞性消化管リンパ腫との区別が困難であり、治療方針が定まらないという問題があった。本発明の方法によれば、食肉目動物（特にイエイヌ）においてＩＢＤと小細胞性消化管リンパ腫とを正確に鑑別することができる。従って、本発明の方法は食肉目動物（特に慢性胃腸疾患の臨床徴候を有する食肉目動物）の治療方針を決定する際の指標を提供できる点で有用である。
慢性腸炎と小細胞性消化管リンパ腫との鑑別用マーカー
後記実施例に記載される通り、食肉目動物における特定の抗菌ペプチドの発現量がＩＢＤおよび小細胞性消化管リンパ腫の罹患状態と相関することが示された。従って、本発明によれば、ＢＰＩ、ラクトフェリン、ＳＬＰＩ、リゾチームおよびＣＢＤ１０３並びにこれらの遺伝子からなる群から選択される抗菌ペプチドまたはその遺伝子からなる、ＩＢＤと小細胞性消化管リンパ腫との鑑別用マーカーが提供される。
後記実施例に記載される通り、食肉目動物における特定の抗菌ペプチドの発現量がＩＢＤおよび小細胞性消化管リンパ腫の罹患状態と相関することが示された。従って、本発明によれば、ＢＰＩ、ラクトフェリン、ＳＬＰＩ、リゾチームおよびＣＢＤ１０３並びにこれらの遺伝子からなる群から選択される抗菌ペプチドまたはその遺伝子からなる、ＩＢＤと小細胞性消化管リンパ腫との鑑別用マーカーが提供される。
本発明の鑑別用マーカーは、食肉目動物（特にイエイヌ）におけるＩＢＤと小細胞性消化管リンパ腫との鑑別に用いることができる。従って、本発明の鑑別用マーカーは食肉目動物（特に慢性胃腸疾患の臨床徴候を有する食肉目動物）における治療方針を決定する際の指標として有用である。
本発明の鑑別用マーカーを食肉目動物のある特定の種の診断に用いる場合には、該マーカーを構成する抗菌ペプチドおよびその遺伝子はその種由来のものであることが好ましい。例えば、本発明の鑑別用マーカーをイエイヌの診断に用いる場合には、イエイヌ由来の抗菌ペプチドおよびその遺伝子を鑑別用マーカーに使用することが好ましい。
また、本発明の鑑別用マーカーにおいて、抗菌ペプチド遺伝子は、抗菌ペプチド遺伝子のゲノム配列からなるＤＮＡであってもよく、あるいは抗菌ペプチド遺伝子のｍＲＮＡや、抗菌ペプチド遺伝子のｍＲＮＡを逆転写して得られたｃＤＮＡであってもよい。本発明の鑑別用マーカーは、前述の本発明の鑑別方法に従って実施することができる。
慢性腸炎と小細胞性消化管リンパ腫との鑑別用キット等
本発明のさらに別の側面によれば、ＢＰＩ、ラクトフェリン、ＳＬＰＩ、リゾチームおよびＣＢＤ１０３並びにこれらの遺伝子からなる群から選択される抗菌ペプチドまたはその遺伝子の検出手段を含んでなる、ＩＢＤと小細胞性消化管リンパ腫との鑑別用キットが提供される。本発明によればまた、ＢＰＩ、ラクトフェリン、ＳＬＰＩ、リゾチームおよびＣＢＤ１０３並びにこれらの遺伝子からなる群から選択される抗菌ペプチドまたはその遺伝子の検出手段を含んでなる、ＩＢＤまたは小細胞性消化管リンパ腫の診断剤が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、ＢＰＩ、ラクトフェリン、ＳＬＰＩ、リゾチームおよびＣＢＤ１０３並びにこれらの遺伝子からなる群から選択される抗菌ペプチドまたはその遺伝子の検出手段を含んでなる、ＩＢＤと小細胞性消化管リンパ腫との鑑別用キットが提供される。本発明によればまた、ＢＰＩ、ラクトフェリン、ＳＬＰＩ、リゾチームおよびＣＢＤ１０３並びにこれらの遺伝子からなる群から選択される抗菌ペプチドまたはその遺伝子の検出手段を含んでなる、ＩＢＤまたは小細胞性消化管リンパ腫の診断剤が提供される。
本発明の鑑別用キットおよび診断剤を構成する抗菌ペプチドの検出手段としては、抗菌ペプチドに対する特異的結合物質（例えば、抗体、アプタマー）が挙げられ、好ましくは抗体である。抗菌ペプチド（特にＢＰＩ）に対する抗体については、本発明の鑑別方法の記載に従って実施することができる。また、抗菌ペプチドの遺伝子の検出手段としては、例えば、抗菌ペプチド遺伝子に対するプローブや、プライマーおよびプライマーセットが挙げられる。抗菌ペプチド（特にＢＰＩ）の遺伝子に対するプローブ、プライマーおよびプライマーセットについては、本発明の鑑別方法の記載に従って実施することができる。
本発明の鑑別用キットは、検出手段に加えて、本発明の鑑別方法を実施するための試薬、装置、使用説明書等を含むことができる。従って、本発明の鑑別方法で実施する測定方法に依存して検出手段を選択し、さらには該検出手段に適した試薬や装置を選択することができる。鑑別用キットに必要な部材は測定方法や検出手段ごとに公知であり、当業者であれば適宜選択し、決定することができる。
以下の例に基づき本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
例１：慢性腸炎と消化管リンパ腫の診断
（１）方法
ア 被験対象
本研究は、２００９年から２０１２年の間に東京大学獣医医療センターで内視鏡検査を受けた慢性胃腸疾患の臨床徴候を有する８８匹の犬に基づいて行った。また、対照群として健常な２０匹のビーグル犬を用いた。２０匹のうち９匹は雌（１匹は無傷、８匹は去勢）、１１匹は雄（全て無傷）であり、年齢の中央値は６７か月（４９〜１１０か月の範囲）であり、体重の中央値は１１ｋｇ（範囲は８．６〜１３．３ｋｇ）であった。全ての犬は、胃腸疾患の臨床徴候はなく、いかなる薬物も投与されていなかった。全血球計算、血中尿素窒素、クレアチニン濃度、アラニンアミノトランスフェラーゼ活性およびアルカリホスファターゼ活性を含む、尿検査または血液検査において異常は検出されなかった。また、糞便分析において異常は検出されなかった。本試験における犬の使用は、東京大学の動物管理委員会によって承認された（承認番号Ｐ１１−５３０；承認日２０１１年６月１日）。
（１）方法
ア 被験対象
本研究は、２００９年から２０１２年の間に東京大学獣医医療センターで内視鏡検査を受けた慢性胃腸疾患の臨床徴候を有する８８匹の犬に基づいて行った。また、対照群として健常な２０匹のビーグル犬を用いた。２０匹のうち９匹は雌（１匹は無傷、８匹は去勢）、１１匹は雄（全て無傷）であり、年齢の中央値は６７か月（４９〜１１０か月の範囲）であり、体重の中央値は１１ｋｇ（範囲は８．６〜１３．３ｋｇ）であった。全ての犬は、胃腸疾患の臨床徴候はなく、いかなる薬物も投与されていなかった。全血球計算、血中尿素窒素、クレアチニン濃度、アラニンアミノトランスフェラーゼ活性およびアルカリホスファターゼ活性を含む、尿検査または血液検査において異常は検出されなかった。また、糞便分析において異常は検出されなかった。本試験における犬の使用は、東京大学の動物管理委員会によって承認された（承認番号Ｐ１１−５３０；承認日２０１１年６月１日）。
イ 慢性腸炎および消化管リンパ腫症例の特定
慢性腸炎および消化管リンパ腫の症例選択基準は、Maeda et al., Veterinary Pathology, 53:102-112 (2016)に基づいた。具体的には、慢性腸炎の診断は、腸の炎症の病理組織学的エビデンス、クローナリティ検査（polymerase chain reaction for antigen receptor gene rearrangement、ＰＡＲＲ、Goto-Koshino et al., Veterinary immunology and immunopathology, 165: 81-87 (2015)およびHiyoshi et al., Veterinary immunology and immunopathology, 165: 138-144 (2015)）におけるクローナルな免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）およびＴ細胞受容体ガンマ（ＴＣＲγ）遺伝子の再配列の欠如ならびに食物および抗生物質応答性腸炎の排除（非特許文献１）に基づいて実施した。また、消化管リンパ腫の診断は、病理組織学的検査、クローナリティ検査におけるクローナルなＩｇＨまたはＴＣＲγ遺伝子再配列の存在、ならびにCarrasco et al., Veterinary Pathology, 52:668-675 (2015)に報告されたＣＤ３およびＣＤ２０についての免疫組織化学（ＩＨＣ）に基づいて実施した。消化管リンパ腫を、増殖リンパ球の形態学的特徴（Maeda et al., Veterinary Pathology, 53:102-112 (2016)）に従って、小細胞性リンパ腫と大細胞性リンパ腫の２つのカテゴリーに分類した。なお、研究の２週間前にコルチコステロイド治療を受けた症例および病理組織学検査結果とクローナリティ検査結果とに矛盾がある症例は除外した。全症例について、犬慢性腸症臨床活動性指標（Ｃａｎｉｎｅ ｃｈｒｏｎｉｃ ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｙ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎｄｅｘ：ＣＣＥＣＡＩ、本明細書において単に「臨床スコア」ということがある）（Allenspach et al., Journal of Veterinary Internal Medicine, 21:700-708 (2007)）に従って、重症度を採点した。
慢性腸炎および消化管リンパ腫の症例選択基準は、Maeda et al., Veterinary Pathology, 53:102-112 (2016)に基づいた。具体的には、慢性腸炎の診断は、腸の炎症の病理組織学的エビデンス、クローナリティ検査（polymerase chain reaction for antigen receptor gene rearrangement、ＰＡＲＲ、Goto-Koshino et al., Veterinary immunology and immunopathology, 165: 81-87 (2015)およびHiyoshi et al., Veterinary immunology and immunopathology, 165: 138-144 (2015)）におけるクローナルな免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）およびＴ細胞受容体ガンマ（ＴＣＲγ）遺伝子の再配列の欠如ならびに食物および抗生物質応答性腸炎の排除（非特許文献１）に基づいて実施した。また、消化管リンパ腫の診断は、病理組織学的検査、クローナリティ検査におけるクローナルなＩｇＨまたはＴＣＲγ遺伝子再配列の存在、ならびにCarrasco et al., Veterinary Pathology, 52:668-675 (2015)に報告されたＣＤ３およびＣＤ２０についての免疫組織化学（ＩＨＣ）に基づいて実施した。消化管リンパ腫を、増殖リンパ球の形態学的特徴（Maeda et al., Veterinary Pathology, 53:102-112 (2016)）に従って、小細胞性リンパ腫と大細胞性リンパ腫の２つのカテゴリーに分類した。なお、研究の２週間前にコルチコステロイド治療を受けた症例および病理組織学検査結果とクローナリティ検査結果とに矛盾がある症例は除外した。全症例について、犬慢性腸症臨床活動性指標（Ｃａｎｉｎｅ ｃｈｒｏｎｉｃ ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｙ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎｄｅｘ：ＣＣＥＣＡＩ、本明細書において単に「臨床スコア」ということがある）（Allenspach et al., Journal of Veterinary Internal Medicine, 21:700-708 (2007)）に従って、重症度を採点した。
ウ 内視鏡検査
内視鏡検査の前に、犬を１２〜１８時間絶食させた。胃十二指腸鏡検査および／または回腸結腸鏡検査は、フレキシブルビデオ内視鏡（ＶＱ−８１４３Ｂ、Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて全身麻酔下で実施した。組織病理学的検査のために、粘膜生検標本を胃、十二指腸、結腸および回腸から各６個ずつ得た。試料を１０％ホルマリン中で４８時間保存した後、パラフィンに包埋した。Goto-Koshino et al., Veterinary immunology and immunopathology, 165: 81-87 (2015)およびHiyoshi et al., Veterinary immunology and immunopathology, 165: 138-144 (2015)の記載に基づいて、各部位からの少なくとも１つの生検標本をＰＡＲＲ分析に使用した。
内視鏡検査の前に、犬を１２〜１８時間絶食させた。胃十二指腸鏡検査および／または回腸結腸鏡検査は、フレキシブルビデオ内視鏡（ＶＱ−８１４３Ｂ、Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて全身麻酔下で実施した。組織病理学的検査のために、粘膜生検標本を胃、十二指腸、結腸および回腸から各６個ずつ得た。試料を１０％ホルマリン中で４８時間保存した後、パラフィンに包埋した。Goto-Koshino et al., Veterinary immunology and immunopathology, 165: 81-87 (2015)およびHiyoshi et al., Veterinary immunology and immunopathology, 165: 138-144 (2015)の記載に基づいて、各部位からの少なくとも１つの生検標本をＰＡＲＲ分析に使用した。
エ 統計学的解析
例１〜３において、統計解析は下記の通り行った。統計解析はＪＭＰバージョン９（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社製）を用いて行った。フィッシャーの直接確率検定を使用して、慢性腸炎患犬と消化管リンパ腫患犬との間の性分布を比較した。クラスカル・ウォリス検定を使用して全体的な差を検定した。Ｓｔｅｅｌ−Ｄｗａｓｓ検定を用いて群間の差異を分析した。全生存期間はログランク検定を用いて比較した。
例１〜３において、統計解析は下記の通り行った。統計解析はＪＭＰバージョン９（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社製）を用いて行った。フィッシャーの直接確率検定を使用して、慢性腸炎患犬と消化管リンパ腫患犬との間の性分布を比較した。クラスカル・ウォリス検定を使用して全体的な差を検定した。Ｓｔｅｅｌ−Ｄｗａｓｓ検定を用いて群間の差異を分析した。全生存期間はログランク検定を用いて比較した。
（２）結果
ア 慢性腸炎の診断結果と治療
慢性腸炎と診断された犬は４４匹であった。全ての犬が腸粘膜内の炎症およびリンパ球−形質細胞性腸炎の組織学的診断の証拠を有していた。内視鏡検査後、全ての犬にプレドニゾロン（０．５〜２ｍｇ／ｋｇ）を投与した。
ア 慢性腸炎の診断結果と治療
慢性腸炎と診断された犬は４４匹であった。全ての犬が腸粘膜内の炎症およびリンパ球−形質細胞性腸炎の組織学的診断の証拠を有していた。内視鏡検査後、全ての犬にプレドニゾロン（０．５〜２ｍｇ／ｋｇ）を投与した。
慢性腸炎患犬４４匹のうち、１８匹は雌（７匹は無傷、１１匹は去勢）、２６匹は雄（１８匹は無傷、８匹は去勢）であり、年齢の中央値は８７．５ヶ月（２２〜１６０ヶ月の範囲）であり、平均体重の中央値は５．５５ｋｇ（２．２〜３２．４ｋｇの範囲）であり、ＣＣＥＣＡＩスコアの中央値は６（１〜１８の範囲）であった。また、犬の品種としては、２匹以上の個体を含む品種は、ミニチュアダックスフント（ｎ＝５）、ヨークシャーテリア（ｎ＝５）およびペンブロークウェールズコーギー（ｎ＝３）、チワワ（ｎ＝３）、パグ（ｎ＝３）、キャバリエキングチャールズスパニエル（ｎ＝３）、フレンチブルドッグ（ｎ＝３）、ボストンテリア（ｎ＝３）、柴犬（ｎ＝２）、ジャックラッセルテリア（ｎ＝２）、トイプードル（ｎ＝２）、マルチーズ（ｎ＝２）であり、他に８品種（各ｎ＝１）が含まれていた。
イ 小細胞性消化管リンパ腫の診断結果と治療
小細胞性消化管リンパ腫と診断された犬は２５匹であった。ＩＨＣおよびＰＡＲＲに基づいて２１個の新生物がＴ細胞リンパ腫と分類され、３個の新生物がＢ細胞リンパ腫と分類された。１個の新生物はＴ細胞とＢ細胞の両方の特徴を持っていた。全ての犬にプレドニゾロン（１〜２ｍｇ／ｋｇ）を投与し、１７匹にはプレドニゾロンと併用してクロラムブシル（２ｍｇ／ｍ２）を投与した。
小細胞性消化管リンパ腫と診断された犬は２５匹であった。ＩＨＣおよびＰＡＲＲに基づいて２１個の新生物がＴ細胞リンパ腫と分類され、３個の新生物がＢ細胞リンパ腫と分類された。１個の新生物はＴ細胞とＢ細胞の両方の特徴を持っていた。全ての犬にプレドニゾロン（１〜２ｍｇ／ｋｇ）を投与し、１７匹にはプレドニゾロンと併用してクロラムブシル（２ｍｇ／ｍ２）を投与した。
小細胞性消化管リンパ腫患犬２５匹のうち、１０匹は雌（３匹は無傷、７匹は去勢）、１５匹は雄（６匹は無傷、９匹は去勢）であり、年齢の中央値は１０５か月（５４〜１７０か月の範囲）であり、体重の中央値は６．４ｋｇ（２．２５〜２８．９ｋｇの範囲）であり、ＣＣＥＣＡＩスコアの中央値は７（１〜１２の範囲）であった。また、犬の品種としては、２匹以上の個体を含む品種は、柴犬（ｎ＝５）、ミニチュアダックスフント（ｎ＝３）、マルチーズ（ｎ＝２）、ラブラドールレトリーバー（ｎ＝２）、フレンチブルドッグ（ｎ＝２）、ケアンテリア（ｎ＝２）であり、他に９品種（各ｎ＝１）が含まれていた。
ウ 大細胞性消化管リンパ腫の診断結果と治療
大細胞性リンパ腫と診断された犬は１９匹であった。ＩＨＣおよびＰＡＲＲに基づいて１５個の新生物がＴ細胞リンパ腫と分類され、３個の新生物がＢ細胞リンパ腫と分類された。１個の新生物はＴ細胞とＢ細胞の両方の特徴を持っていた。６匹の犬にプレドニゾロン（１〜２ｍｇ／ｋｇ）を投与し、１３匹にウィスコンシン−マディソンの化学療法プロトコル（ＵＷ−２５）の６ヶ月修正版（Garrett et al., Journal of veterinary internal medicine, 16: 704-709 (2002)）を実施した。
大細胞性リンパ腫と診断された犬は１９匹であった。ＩＨＣおよびＰＡＲＲに基づいて１５個の新生物がＴ細胞リンパ腫と分類され、３個の新生物がＢ細胞リンパ腫と分類された。１個の新生物はＴ細胞とＢ細胞の両方の特徴を持っていた。６匹の犬にプレドニゾロン（１〜２ｍｇ／ｋｇ）を投与し、１３匹にウィスコンシン−マディソンの化学療法プロトコル（ＵＷ−２５）の６ヶ月修正版（Garrett et al., Journal of veterinary internal medicine, 16: 704-709 (2002)）を実施した。
大細胞性消化管リンパ腫患犬１９匹のうち、１１匹は雌（７匹は無傷、４匹は去勢）、８匹は雄（６匹は無傷、２人は去勢）であり、平均年齢は１０２ヶ月（５２〜１６２か月の範囲）であり、体重の中央値は５．０５ｋｇ（２．７〜２６．２ｋｇの範囲）であり、ＣＣＥＣＡＩスコアの中央値は１３（６〜１８の範囲）であった。また、犬の品種としては、２匹以上の個体を含む品種は、ミニチュアダックスフント（ｎ＝４）、パグ（ｎ＝３）、柴犬（ｎ＝３）、マルチーズ（ｎ＝２）およびシーズー（ｎ＝２）であり、他に５品種（各ｎ＝１）が含まれていた。
エ 慢性腸炎および消化管リンパ腫の臨床所見の比較
慢性腸炎および消化管リンパ腫と診断された犬の特徴は、表１に示した通りであった。慢性腸炎、小細胞性消化管リンパ腫および大細胞性消化管リンパ腫の３群の間には、性、体重、年齢および血清アルブミン濃度について差異は確認されなかった。しかしながら、３群の間には、臨床スコアおよび全生存期間について有意差があった。大細胞性リンパ腫患犬の臨床スコア（ＣＣＥＣＡＩスコア）は、慢性腸炎患犬（Ｐ＜０．００１）および小細胞性リンパ腫患犬（Ｐ＜０．０５）よりも有意に高いことが確認された。全生存期間は、消化管リンパ腫患犬では慢性腸炎患犬と比較して、有意に短いことが確認された（慢性腸炎 対 小細胞性リンパ腫 Ｐ＜０．０１、慢性腸炎 対 大細胞リンパ腫 Ｐ＜０．０００１、小細胞性リンパ腫 対 大細胞性リンパ腫 Ｐ＜０．０１）。
慢性腸炎および消化管リンパ腫と診断された犬の特徴は、表１に示した通りであった。慢性腸炎、小細胞性消化管リンパ腫および大細胞性消化管リンパ腫の３群の間には、性、体重、年齢および血清アルブミン濃度について差異は確認されなかった。しかしながら、３群の間には、臨床スコアおよび全生存期間について有意差があった。大細胞性リンパ腫患犬の臨床スコア（ＣＣＥＣＡＩスコア）は、慢性腸炎患犬（Ｐ＜０．００１）および小細胞性リンパ腫患犬（Ｐ＜０．０５）よりも有意に高いことが確認された。全生存期間は、消化管リンパ腫患犬では慢性腸炎患犬と比較して、有意に短いことが確認された（慢性腸炎 対 小細胞性リンパ腫 Ｐ＜０．０１、慢性腸炎 対 大細胞リンパ腫 Ｐ＜０．０００１、小細胞性リンパ腫 対 大細胞性リンパ腫 Ｐ＜０．０１）。
例２：十二指腸粘膜における抗菌ペプチドの発現
（１）方法
ア 十二指腸粘膜サンプルの調製
例１において慢性腸炎と診断された４４匹、小細胞性消化管リンパ腫と診断された２５匹、大細胞性消化管リンパ腫と診断された１９匹および健常犬２０匹の犬から得た十二指腸粘膜サンプルを用いた。十二指腸粘膜サンプルは、例２（１）イに記載の方法に従って内視鏡検査を実施して得た。次いで、ＲＮＡ抽出に用いるために、十二指腸サンプルを直ちにＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ社製）に浸し、−２０℃で保存した。
（１）方法
ア 十二指腸粘膜サンプルの調製
例１において慢性腸炎と診断された４４匹、小細胞性消化管リンパ腫と診断された２５匹、大細胞性消化管リンパ腫と診断された１９匹および健常犬２０匹の犬から得た十二指腸粘膜サンプルを用いた。十二指腸粘膜サンプルは、例２（１）イに記載の方法に従って内視鏡検査を実施して得た。次いで、ＲＮＡ抽出に用いるために、十二指腸サンプルを直ちにＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ社製）に浸し、−２０℃で保存した。
イ 定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡの抽出は、ＲＮＡｓｐｉｎ Ｍｉｎｉ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて製造業者の説明書に従って十二指腸サンプルについて行った。次いで、ＴＵＲＢＯ ＤＮＡ−ｆｒｅｅ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、サンプルからゲノムＤＮＡを除去し、−８０℃で保存した。６種の抗菌ペプチド（ＢＰＩ、ラクトフェリン、分泌型白血球ペプチダーゼ阻害物質（ＳＬＰＩ）、リゾチーム、ＣＢＤ１０３およびカテリシジン）の発現レベルを解析した。具体的には、ｍＲＮＡの発現レベルは、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｒｅａｇｅｎｔ ＫｉｔおよびＳＹＢＲ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ ＩＩ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社製）を製造元の指示に従って用いて、２段階リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）によって定量した。参照遺伝子としては、Peters et al., Veterinary immunology and immunopathology, 117: 55-66 (2007)に基づいてＴＡＴＡ ｂｏｘ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＢＰ）、Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）およびＳｕｃｃｉｎａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｓｕｂｕｎｉｔ Ａ（ＳＤＨＡ）を用いた。この研究で使用したプライマーペア配列を表２に示す。ＰＣＲの増幅効率は、代表的なｃＤＮＡサンプルの１０倍希釈系列を使用して、各プライマーセットについて決定した。全てのプライマーセットは、比較サイクル閾値（ＣＴ）法（Livak KJ & Schmittgen TD, Methods, 25(4):402-8 (2001)）によれば９５％より高い効率を示した。全てのサンプルについて二重に調べ、Maeda et al., Veterinary Pathology, 53:102-112 (2016)の記載に基づいて、平均ΔＣｔ値を算出した。
全ＲＮＡの抽出は、ＲＮＡｓｐｉｎ Ｍｉｎｉ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて製造業者の説明書に従って十二指腸サンプルについて行った。次いで、ＴＵＲＢＯ ＤＮＡ−ｆｒｅｅ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、サンプルからゲノムＤＮＡを除去し、−８０℃で保存した。６種の抗菌ペプチド（ＢＰＩ、ラクトフェリン、分泌型白血球ペプチダーゼ阻害物質（ＳＬＰＩ）、リゾチーム、ＣＢＤ１０３およびカテリシジン）の発現レベルを解析した。具体的には、ｍＲＮＡの発現レベルは、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｒｅａｇｅｎｔ ＫｉｔおよびＳＹＢＲ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ ＩＩ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社製）を製造元の指示に従って用いて、２段階リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）によって定量した。参照遺伝子としては、Peters et al., Veterinary immunology and immunopathology, 117: 55-66 (2007)に基づいてＴＡＴＡ ｂｏｘ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＢＰ）、Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）およびＳｕｃｃｉｎａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｓｕｂｕｎｉｔ Ａ（ＳＤＨＡ）を用いた。この研究で使用したプライマーペア配列を表２に示す。ＰＣＲの増幅効率は、代表的なｃＤＮＡサンプルの１０倍希釈系列を使用して、各プライマーセットについて決定した。全てのプライマーセットは、比較サイクル閾値（ＣＴ）法（Livak KJ & Schmittgen TD, Methods, 25(4):402-8 (2001)）によれば９５％より高い効率を示した。全てのサンプルについて二重に調べ、Maeda et al., Veterinary Pathology, 53:102-112 (2016)の記載に基づいて、平均ΔＣｔ値を算出した。
（２）結果
結果は、図１に示した通りであった。図１Ａの結果から、ＢＰＩの発現レベルは、慢性腸炎患犬では、健常犬、小細胞性リンパ腫患犬および大細胞性リンパ腫患犬と比較して、有意に高いことが確認された。図１Ｂおよび図１Ｃの結果から、ラクトフェリンおよびＳＬＰＩの発現レベルは、慢性腸炎患犬、小細胞性リンパ腫患犬および大細胞リンパ腫患犬では、健常犬と比較して、有意に高いことが確認された。図１Ｄおよび図１Ｅの結果から、リゾチームおよびＣＢＤ１０３の発現レベルは、慢性腸炎患犬では、消化管リンパ腫患犬と比較して有意に高かったが、健常犬と患犬との間には有意差はないことが確認された。図１Ｆの結果から、４群の間でカテリシジンの発現レベルに有意差は確認されなかった。
結果は、図１に示した通りであった。図１Ａの結果から、ＢＰＩの発現レベルは、慢性腸炎患犬では、健常犬、小細胞性リンパ腫患犬および大細胞性リンパ腫患犬と比較して、有意に高いことが確認された。図１Ｂおよび図１Ｃの結果から、ラクトフェリンおよびＳＬＰＩの発現レベルは、慢性腸炎患犬、小細胞性リンパ腫患犬および大細胞リンパ腫患犬では、健常犬と比較して、有意に高いことが確認された。図１Ｄおよび図１Ｅの結果から、リゾチームおよびＣＢＤ１０３の発現レベルは、慢性腸炎患犬では、消化管リンパ腫患犬と比較して有意に高かったが、健常犬と患犬との間には有意差はないことが確認された。図１Ｆの結果から、４群の間でカテリシジンの発現レベルに有意差は確認されなかった。
例３：慢性腸炎および消化管リンパ腫の診断のための抗菌ペプチドマーカー
（１）方法
ア 統計学的解析
受信者動作特性（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｏｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｓｔｅｒｉｓｔｉｃ ｃｕｒｖｅ、ＲＯＣ）曲線分析（Akobeng AK, Acta Paediatr, 96(5):644-7(2007)およびAggarwal R & Ranganathan P, Perspect Clin Res., 9(3):145-148(2018)）を使用して、慢性腸炎の診断のためのＢＰＩ、ラクトフェリンおよびＳＬＰＩのカットオフ値を決定した。統計学的有意性は、Ｐ＜０．０５と定義した。
（１）方法
ア 統計学的解析
受信者動作特性（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｏｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｓｔｅｒｉｓｔｉｃ ｃｕｒｖｅ、ＲＯＣ）曲線分析（Akobeng AK, Acta Paediatr, 96(5):644-7(2007)およびAggarwal R & Ranganathan P, Perspect Clin Res., 9(3):145-148(2018)）を使用して、慢性腸炎の診断のためのＢＰＩ、ラクトフェリンおよびＳＬＰＩのカットオフ値を決定した。統計学的有意性は、Ｐ＜０．０５と定義した。
（２）結果
結果は、図２および表３に示した通りであった。ＢＰＩは、慢性腸炎を健常および消化管リンパ腫と区別するための最良の能力を有することが確認された。ＢＰＩのカットオフ値１．８７５では、感度８６．７％、特異度１００％、曲線下面積（ＡＵＣ）０．９４７であり、慢性腸炎と健常とを最もよく区別することができることが確認された。また、ＢＰＩのカットオフ値０．６７６では、感度９７．７％、特異度９０．９％、曲線下面積（ＡＵＣ）０．９４８であり、慢性腸炎と消化管リンパ腫とを区別することができた。全体として、慢性腸炎を健常および消化管リンパ腫から区別するための最良のカットオフ値は１．８７５であり、感度８６．３％、特異度１００％、曲線下面積（ＡＵＣ）０．９４８であった。以上の結果から、抗菌ペプチドは慢性腸炎の診断のための有用なバイオマーカーとなることが確認された。
結果は、図２および表３に示した通りであった。ＢＰＩは、慢性腸炎を健常および消化管リンパ腫と区別するための最良の能力を有することが確認された。ＢＰＩのカットオフ値１．８７５では、感度８６．７％、特異度１００％、曲線下面積（ＡＵＣ）０．９４７であり、慢性腸炎と健常とを最もよく区別することができることが確認された。また、ＢＰＩのカットオフ値０．６７６では、感度９７．７％、特異度９０．９％、曲線下面積（ＡＵＣ）０．９４８であり、慢性腸炎と消化管リンパ腫とを区別することができた。全体として、慢性腸炎を健常および消化管リンパ腫から区別するための最良のカットオフ値は１．８７５であり、感度８６．３％、特異度１００％、曲線下面積（ＡＵＣ）０．９４８であった。以上の結果から、抗菌ペプチドは慢性腸炎の診断のための有用なバイオマーカーとなることが確認された。
例４：イムノアッセイによる慢性腸炎および小細胞性消化管リンパ腫の診断
本例では免疫組織染色により慢性腸炎と小細胞性消化管リンパ腫とを鑑別した例を示す。
本例では免疫組織染色により慢性腸炎と小細胞性消化管リンパ腫とを鑑別した例を示す。
慢性胃腸疾患の臨床徴候を有さない正常犬と、慢性腸炎と診断された犬と、小細胞性消化管リンパ腫と診断された犬のそれぞれから、例１（１）ウの手順に従って十二指腸組織を採取し、パラフィン切片サンプルを調製した。次いで、脱パラフィン処理を行った後、１０ｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ６．０）に浸漬し、オートクレーブで１２１℃１０分間インキュベートし、抗原賦活化させた。それぞれの切片サンプルについて、REAL Peroxidase-Blocking Solution（Dako社製）を用いて内因性ペルオキシダーゼ活性を不活化させ、さらに５％スキムミルクでブロッキングを行った。一次抗体として抗ＢＰＩ抗体（ウサギポリクローナル抗体、GeneTex社製）を用いて切片サンプルを処置し、洗浄後、二次抗体としてEnvision for rabbit（Dako社製）を用いて切片サンプルを処置した。発色基質としてＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジン）を用いてペルオキシダーゼ標識二次抗体を発色させた。
結果は図３に示される通りであった。慢性腸炎と診断された犬の切片では茶色に染色された細胞の存在が組織全体に認められたが、正常犬の切片や小細胞性消化管リンパ腫と診断された犬の切片ではこのような細胞の存在は認められなかった。以上の結果から、抗菌ペプチドのうちＢＰＩに対する抗体を用いて慢性腸炎と小細胞性消化管リンパ腫とを正確に鑑別できることが示された。
Claims (9)
- 被験動物において、殺菌性／透過性増加タンパク質（ＢＰＩ）、ラクトフェリン、分泌型白血球ペプチダーゼ阻害物質（ＳＬＰＩ）、リゾチームおよびイヌベータデフェンシン（ＣＢＤ１０３）からなる群から選択される抗菌ペプチドの発現量を測定する工程を含んでなる、食肉目動物において慢性腸炎（ＩＢＤ）と小細胞性消化管リンパ腫とを鑑別する方法。
- 腸管組織における抗菌ペプチドの発現量を測定する、請求項１に記載の方法。
- 遺伝子増幅法またはイムノアッセイにより抗菌ペプチドの発現量を測定する、請求項１または２に記載の方法。
- 抗菌ペプチドがＢＰＩである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
- 被験動物が慢性胃腸疾患の臨床徴候を有する動物である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
- ＩＢＤまたは小細胞性消化管リンパ腫の診断を補助する方法である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
- 食肉目動物が、イヌ科動物またはネコ科動物である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
- ＢＰＩ、ラクトフェリン、ＳＬＰＩ、リゾチームおよびＣＢＤ１０３並びにこれらの遺伝子からなる群から選択される抗菌ペプチドまたはその遺伝子からなる、ＩＢＤと小細胞性消化管リンパ腫との鑑別用マーカー。
- ＢＰＩ、ラクトフェリン、ＳＬＰＩ、リゾチームおよびＣＢＤ１０３並びにこれらの遺伝子からなる群から選択される抗菌ペプチドまたはその遺伝子の検出手段を含んでなる、ＩＢＤと小細胞性消化管リンパ腫との鑑別用キットまたはＩＢＤもしくは小細胞性消化管リンパ腫の診断剤。
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| JP2019039512A JP2020143951A (ja) | 2019-03-05 | 2019-03-05 | 慢性腸炎と消化管リンパ腫との鑑別方法並びに鑑別マーカーおよびキット |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2019193577A (ja) * | 2016-09-01 | 2019-11-07 | 国立研究開発法人国立成育医療研究センター | 好酸球性消化管疾患または食物蛋白誘発腸症の検査方法および検査キット |
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