KR102327509B1 - 남성 불임 또는 생식 능력 저하 진단용 바이오 마커 - Google Patents

남성 불임 또는 생식 능력 저하 진단용 바이오 마커 Download PDF

Info

Publication number
KR102327509B1
KR102327509B1 KR1020200058204A KR20200058204A KR102327509B1 KR 102327509 B1 KR102327509 B1 KR 102327509B1 KR 1020200058204 A KR1020200058204 A KR 1020200058204A KR 20200058204 A KR20200058204 A KR 20200058204A KR 102327509 B1 KR102327509 B1 KR 102327509B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
protein
male infertility
testis
antibody
expression level
Prior art date
Application number
KR1020200058204A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20200132750A (ko
Inventor
전현정
박호영
이은정
한태원
Original Assignee
한국식품연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국식품연구원 filed Critical 한국식품연구원
Publication of KR20200132750A publication Critical patent/KR20200132750A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102327509B1 publication Critical patent/KR102327509B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/689—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to pregnancy or the gonads
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/36—Gynecology or obstetrics
    • G01N2800/367—Infertility, e.g. sperm disorder, ovulatory dysfunction

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 남성 불임 진단용 바이오 마커에 관한 것으로, 구체적으로는 남성 불임 진단용 바이오 마커를 검출하는 단계를 포함하는 남성 불임 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법 및 남성 불임 진단용 바이오 마커를 검출하는 남성 불임 진단용 조성물에 관한 것으로, 본 발명은 남성 불임을 진단하는데 효과적으로 이용될 수 있다.

Description

남성 불임 또는 생식 능력 저하 진단용 바이오 마커 {Biomarker for Diagnosing Male Infertility or Decreased fertility}
본 발명은 남성 불임 진단용 바이오 마커에 관한 것으로, 구체적으로는 남성 불임 진단용 바이오 마커를 검출하는 단계를 포함하는 남성 불임 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법 및 남성 불임 진단용 바이오 마커를 검출하는 남성 불임 진단용 조성물에 관한 것이다.
남성 생식소 (male gonad)인 정소 (testis)는 체온보다 낮은 온도에서 정자 형성을 일으킨다. 사람을 비롯한 많은 포유류의 정소는 음낭 (scrotum)에 싸여 낮은 온도로 조절하여 유지된다. 음낭의 온도는 종에 따라 다소 차이가 있지만 일반적으로 체온에 비해 2 ℃에서 7 ℃가량 낮다. 생쥐의 정소 온도는 약 30 ℃에서 유지된다.
높은 온도에 노출된 정소는 정자 형성이 진행되지 않아 결국 불임이 된다. 남성 불임 환자에 관한 연구에서 불임 환자의 음낭 온도가 가임 환자에 비해 상대적으로 높다는 보고가 있다. 발생 과정 중 음낭으로 내려오지 못한 정소는 잠복 정소 (cryptorchidism)가 되며 이 경우 정상적인 정자 형성이 일어나지 않아 불임이 되는데 이로 인한 남성 불임은 정소가 높은 온도로 유지되었기 때문이라는 것이 입증되었다. 이 밖에도 열병이나 비만, 작업 환경 또는 생활 방식 등 음낭의 온도가 올라갈 수 있는 환경에 노출되어 불임 가능성이 높아질 수 있다.
본 발명자들은 남성 불임을 효과적으로 진단할 수 있는 바이오 마커를 개발하기 위해 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 열 손상에 의해 남성 불임이 유도된 동물모델에서 특정 유전자들의 발현 정도가 증가되는 것을 확인하고, 이들을 남성 불임에 대한 바이오 마커로 이용할 수 있음을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 남성 불임 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 남성 불임 진단용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명은 남성 불임 진단용 바이오 마커에 관한 것으로, 구체적으로는 남성 불임 진단용 바이오 마커를 검출하는 단계를 포함하는 남성 불임 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법 및 남성 불임 진단용 바이오 마커를 검출하는 남성 불임 진단용 조성물에 관한 것이다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는 하기의 단계를 포함하는 남성 불임 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다:
생물학적 시료로부터 α2M (alpha-2-Macroglobulin) 단백질 및 KCNE5 (Potassium Voltage-Gated Channel Subfamily E Regulatory Subunit 5) 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 발현 정도; 또는
상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 정도를 측정하는 단계.
본 발명에서 용어 '남성 불임'은 정자 형성이 정상적으로 진행되지 않아 발생하는 불임을 의미하며, 예를 들어, 무정자증 (azoospermia), 희소정자증 (oligospermia), 무력정자증 (astheno spermia) 또는 기형정자증 (tetrazoospermia) 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 생물학적 시료는 사람 또는 동물로부터 분리한 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 생물학적 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 또는 뇨일 수 있으며, 예를 들어, 혈액일 수 있다.
본 발명에 있어서, α2M (alpha-2-Macroglobulin) 단백질은 혈액에서 발견되는 큰 (720 kDa) 혈장 단백질이다. 주로 간에서 생산되며 대식세포, 섬유 아세포 및 부신피질 세포에 의해 국소적으로 합성된다. 인간에서는 α2M 유전자에 의해 암호화된다. α2M (alpha-2-Macroglobulin) 단백질은 항 단백질 분해 효소로서 작용하며, 다양한 단백질 분해 효소를 불활성화 시킬 수 있다. α2M (alpha-2-Macroglobulin) 단백질은 플라즈민 (Plasmin) 및 칼리크레인 (Kallikrein)을 억제함으로써 섬유소 분해의 억제제로서 기능을 한다. 또한, 트롬빈 (Thrombin)을 억제함으로써 응고의 억제제로의 기능을 한다. α2M (alpha-2-Macroglobulin) 단백질은 또한, 혈소판 유래 성장 인자, 염기성 섬유 아세포 성장 인자, TGF- β, 인슐린 및 IL-1 β와 같은 수많은 성장 인자 및 사이토카인에 결합하기 때문에 운반 단백질로 사용될 수 있다.
상기 α2M (alpha-2-Macroglobulin) 단백질은 혈액에서 분리한 혈청에서 유래된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 α2M (alpha-2-Macroglobulin) 단백질은 ELISA법을 이용하여 발현 정도를 측정할 수 있다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 보다 바람직하게는, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색 시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다. 남성 불임 마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, 불임 가능성 여부를 확인할 수 있다.
본 발명에 있어서, KCNE5 (Potassium Voltage-Gated Channel Subfamily E Regulatory Subunit 5) 단백질은 KCNE1L 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이다. 전압 게이트 칼륨(K) 채널의 다양한 기능에는 신경 전달 물질 방출, 심박수, 인슐린 분비, 신경 흥분성, 상피 전해질 수송, 평활근 수축 및 세포 부피 조절들이 포함되는데, KCNE5 (Potassium Voltage-Gated Channel Subfamily E Regulatory Subunit 5) 단백질은 전류 자체를 통과시키지 않고 칼륨 채널 세공 형성 알파 서브 유닛의 특성을 변경시키는 칼륨 채널 조절을 하는 역할을 한다. 인간의 KCNE5 (Potassium Voltage-Gated Channel Subfamily E Regulatory Subunit 5) 유전자은 심장 및 골격근, 척수 및 뇌에서 가장 많이 발현된다.
상기 KCNE5 (Potassium Voltage-Gated Channel Subfamily E Regulatory Subunit 5) 단백질은 조직으로부터 유래된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, KCNE5 (Potassium Voltage-Gated Channel Subfamily E Regulatory Subunit 5) 유전자의 발현 정도는 유전자 증폭 방식으로 측정할 수 있다. 유전자 증폭에 사용되는 프라이머는 짧은 자유 3말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트 (template) 와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응 (즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
상기 프라이머는 각 마커 유전자에 특이적인 프라이머로 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산이다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.
또한, 상기 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 상기 프라이머의 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비한정적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 상기 프라이머는 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질 (예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제 (예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제 (예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 상기 프라이머는 또한 검출 가능한 시그널을 직접 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 바이오틴 등이 있다.
본 발명에 있어서, 상기 방법은 TMEM184A (transmembrane protein 184A), CACNA1H (Calcium Voltage-Gated Channel Subunit Alpha1 H), ARHGEF16 (Rho Guanine Nucleotide Exchange Factor 16), ENPP7 (Ectonucleotide Pyrophosphatase/Phosphodiesterase 7), COL6A6 (Collagen Type VI Alpha 6 Chain), TMEM61 (transmembrane protein 61), MYBPC3 (Myosin Binding Protein C, Cardiac), ALDH3A1 (Aldehyde Dehydrogenase 3 Family Member A1), GXYLT2 (Glucoside Xylosyltransferase 2), AIF1L (Allograft Inflammatory Factor 1 Like) 및 MAGED4 (MAGE Family Member D) 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 발현 정도;
또는
상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 정도를 측정하는 단계;
를 추가적으로 포함하는 것이다.
본 발명에 있어서, 단백질의 발현 정도 측정은 생물학적 시료에서 상기 단백질의 발현 정도를 확인하는 과정으로, 예를 들어, 상기 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 항원-항체 반응으로 실시되는 것을 의미한다.
상기 항체란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.
상기한 바와 같이 새로운 남성 불임 마커 단백질이 규명되었으므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.
다클론 항체는 상기한 남성 불임 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.
단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법 또는 파지 항체 라이브러리 기술을 이용하여 제조될 수 있다.
상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
본 발명에 있어서, 효소의 활성형에 결합하는 앱타머는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자일 수 있다.
상기 항체는 미소입자(micro particle)와 접합된 항체(conjugated antibody)인 것일 수 있다. 상기 미소입자는 착색된 라텍스 (colored latex) 또는 콜로이드성 금 입자 (colloidal gold particle) 인 것이 바람직하다. 본 발명의 상기 항체는 상기 서술한 마커에 대한 공지의 mRNA 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 정도의 수준을 측정할 수 있는 어떠한 항체도 될 수 있다.
본 발명에 있어서, 단백질의 발현 정도의 측정은 면역효소분석법 (enzyme linked immunosorbent assay; ELISA), 웨스턴 블랏 (western blotting), 방사선면역분석 (Radioimmunoassay; RIA), 방사 면역확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트 (rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법 (Complement Fixation Assay), 유세포분석 (Fluorescence Activated Cell Sorter; FACS) 또는 단백질 칩 (protein chip)을 이용하여 수행하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 단백질의 발현 정도의 측정은 면역효소분석법을 이용하여 실시할 수 있다. 면역효소분석법은 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 면역효소분석법, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 면역효소분석법, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 면역효소분석법, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 면역효소분석법 등 다양한 면역효소면역효소분석 방법을 포함한다. 보다 바람직하게는, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 면역효소분석 방법에 의해서 검출한다. 남성 불임 마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, 불임 가능성 여부를 확인할 수 있다.
상기 단백질의 발현 정도 측정은 단백질에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 이용하여 실시할 수 있다. 구체적으로, 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현 정도에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여, 남성 불임 가능성 여부를 확인할 수 있다. 상기 검출 방법은 대조군에서 마커 유전자의 발현량과 남성 불임 세포에서 마커 단백질의 발현량을 조사하는 방법으로 이루어진다. 단백질의 발현 수준은 상기한 마커 단백질의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대 강도) 차이로 나타낼 수 있다.
상기 단백질의 발현 정도의 측정은 상기 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 면역조직 염색을 이용하여 실시할 수 있다. 구체적으로, 정상 조직 및 남성 불임이 의심되는 조직을 채취 및 고정한 후, 당업계에서 널리 공지된 방법으로 파라핀 포매 블록을 제조한다. 이들을 수 ㎛ 두께의 절편으로 만들어 유리 슬라이드에 붙인 후, 이와 상기의 항체 중 선택된 1개와 공지의 방법에 의하여 반응시킨다. 이후, 반응하지 못한 항체는 세척하고, 상기에 언급한 검출 라벨 중의 하나로 표지하여 현미경 상에서 항체의 표지 여부를 판독한다.
또한, 상기 단백질의 발현 측정은 상기 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용하여 실시할 수 있다. 구체적으로, 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 발현 정도를 확인하여 남성 불임 가능성 여부를 확인할 수 있다.
본 발명에 있어서, 유전자의 발현 측정은 유전자 증폭 방식으로 측정하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 남성 불임 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에서 유전자의 발현 정도 측정은 생물학적 시료에서 본 발명의 마커 유전자의 발현 정도를 확인하는 과정으로 해당 유전자의 폴리뉴클레오타이드 양을 측정하는 것을 의미한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응 (RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응 (Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응 (Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RPA; RNase protection assay), 노던 블럿팅 (Northern blotting) 또는 DNA 칩 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 남성 불임 마커의 유전자의 발현 정도는 유전자 증폭 방식으로 측정할 수 있다. 유전자 증폭에 사용되는 프라이머는 짧은 자유 3말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트 (template) 와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응 (즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
상기 프라이머는 각 마커 유전자에 특이적인 프라이머로 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산이다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.
또한, 상기 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 상기 프라이머의 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비한정적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 상기 프라이머는 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 상기 프라이머는 또한 검출 가능한 시그널을 직접 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 바이오틴 등이 있다.
상기 남성 불임 마커의 유전자의 발현 정도는 마이크로어레이 방식으로 측정할 수 있다. 마이크로어레이에 사용되는 프로브는 바람직하게는 단일쇄이며, 올리고디옥시리보뉴클레오타이드이다.
또한, 프로브는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄 (linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타깃 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화 할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다.
본 발명에 있어서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다.
상기 프로브는 혼성화 어레이 요소 (hybridizable array element)로서 이용되며, 기질 (substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기질은 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함한다. 상기한 혼성화 어레이 요소는 상기의 기질상에 배열되고 고정화 된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커 (예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기질에 결합될 수 있다.
프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5 (Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소 (P32 및 S35), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소 (알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속 (예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션 (nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법 및 카이네이션 방법을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.
혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널은 예컨대, 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있는 효소/기질의 조합은, 퍼옥시다아제 (예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR (p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB (tetramethylbenzidine), ABTS (2,2'-Azine-di[3-ethyl benzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민 (OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트 (BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트 (naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t-NBT (nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS (phenzaine methosulfate) 등이다. 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 나이트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태는 α2M (alpha-2-Macroglobulin) 단백질 및 KCNE5 (Potassium Voltage-Gated Channel Subfamily E Regulatory Subunit 5) 단백질과 결합할 수 있는 항체; 또는
상기 단백질을 암호화하는 유전자와 결합할 수 있는 프로브;
를 포함하는 남성 불임 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 TMEM184A (transmembrane protein 184A), CACNA1H (Calcium Voltage-Gated Channel Subunit Alpha1 H), ARHGEF16 (Rho Guanine Nucleotide Exchange Factor 16), ENPP7 (Ectonucleotide Pyrophosphatase/Phosphodiesterase 7), COL6A6 (Collagen Type VI Alpha 6 Chain), TMEM61 (transmembrane protein 61), MYBPC3 (Myosin Binding Protein C, Cardiac), ALDH3A1 (Aldehyde Dehydrogenase 3 Family Member A1), GXYLT2 (Glucoside Xylosyltransferase 2), AIF1L (Allograft Inflammatory Factor 1 Like) 및 MAGED4 (MAGE Family Member D)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질에 결합할 수 있는 항체;
또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자에 결합할 수 있는 프로브;
를 추가적으로 포함하는 것이다.
본 발명은 남성 불임 진단용 바이오 마커에 관한 것으로, 구체적으로는 남성 불임 진단용 바이오 마커를 검출하는 단계를 포함하는 남성 불임 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법, 남성 불임 진단용 바이오 마커를 검출하는 남성 불임 진단용 조성물에 관한 것으로, 본 발명은 남성 불임을 진단하는데 효과적으로 이용될 수 있다.
도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따라 대조군 (Con)인 음낭의 고환에 대하여 헤마톡실린 및 에오신 염색을 실시한 결과이다.
도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따라 잠복 정소 수술 후 7일 (D7)에 정소 조직에 대하여 헤마톡실린 및 에오신 염색을 실시한 결과이다.
도 1c는 본 발명의 일 실시예에 따라 잠복 정소 수술 후 14일 (D14)에 정소 조직에 대하여 헤마톡실린 및 에오신 염색을 실시한 결과이다.
도 1d는 본 발명의 일 실시예에 따라 잠복 정소 수술 후 21일 (D21)에 정소 조직에 대하여 헤마톡실린 및 에오신 염색을 실시한 결과이다.
도 1e는 본 발명의 일 실시예에 따라 잠복 정소 수술 후 30일 (D30)에 정소 조직에 대하여 헤마톡실린 및 에오신 염색을 실시한 결과이다.
도 1f는 본 발명의 일 실시예에 따라 대조군 및 잠복 정소 수술군의 정소 정세관 지름을 비교한 결과이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따라 수술 30일 후 잠복 정소 (좌측, C) 및 음낭 내 정소 (우측, S)의 정소 크기를 비교한 결과이다.
도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따라 잠복 정소의 부고환꼬리 부분에 대한 단면도이다.
도 2c는 본 발명의 일 실시예에 따라 음낭 내 정소의 부고환꼬리 부분에 대한 단면도이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따라 대조군 개 정원세포를 항-PGP9.5 항체를 이용하여 면역염색한 결과이다.
도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따라 수술 후 7일째 항-PGP9.5 항체를 이용하여 면역염색한 개 정원세포를 나타낸다.
도 3c는 본 발명의 일 실시예에 따라 수술 후 14일째 항-PGP9.5 항체를 이용하여 면역염색한 개 정원세포를 나타낸다.
도 3d는 본 발명의 일 실시예에 따라 수술 후 21일째 항-PGP9.5 항체를 이용하여 면역염색한 개 정원세포를 나타낸다.
도 3e는 본 발명의 일 실시예에 따라 수술 후 30일째 항-PGP9.5 항체를 이용하여 면역염색한 개 정원세포를 나타낸다.
도 3f는 본 발명의 일 실시예에 따라 대조군 및 잠복 정소 실험군에서 항-PGP9.5 항체에 대하여 염색된 양성 세포 수를 측정한 결과이다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따라 대조군 개 Sertoli 세포를 GATA4 항체를 이용하여 면역염색한 결과이다.
도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따라 수술 후 7일째 GATA4 항체를 이용하여 면역염색한 개 Sertoli 세포를 나타낸다.
도 4c는 본 발명의 일 실시예에 따라 수술 후 14일째 GATA4 항체를 이용하여 면역염색한 개 Sertoli 세포를 나타낸다.
도 4d는 본 발명의 일 실시예에 따라 수술 후 21일째 GATA4 항체를 이용하여 면역염색한 개 Sertoli 세포를 나타낸다.
도 4e는 본 발명의 일 실시예에 따라 수술 후 30일째 GATA4 항체를 이용하여 면역염색한 개 Sertoli 세포를 나타낸다.
도 4f는 본 발명의 일 실시예에 따라 대조군 (음낭 내 정소) 및 잠복 정소 실험군에서 GATA4 항체에 대하여 염색된 양성 세포 수를 측정한 결과이다.
도 5a는 본 발명의 일 실시예에 따라 정소 고정술을 실시하고 정소 조직을 H & E 염색한 결과이다.
도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따라 정소 고정술을 실시하고 부고환 조직을 H & E 염색한 결과이다.
도 5c는 본 발명의 일 실시예에 따라 정소 고정술을 실시하고 4주 후 정소 조직을 PGP9.5 항체를 이용하여 면역염색한 결과이다.
도 5d는 본 발명의 일 실시예에 따라 정소 고정술을 실시하고 4주 후 정소 조직을 SPC3 항체를 이용하여 면역염색한 결과이다.
도 5e는 본 발명의 일 실시예에 따라 정소 고정술을 실시하고 8주 후 사출된 정자를 촬영한 결과이다.
도 6a은 본 발명의 일 실시예에 따라 RNA 시퀀싱 결과에서 정상 대조군 및 잠복 정소 실험군 간 발현 수준 차이가 큰 것으로 확인된 α2M에 대하여 효소 면역기법 (ELISA)을 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6b는 본 발명의 일 실시예에 따라 테스토스테론에 대하여 효소 면역기법 (ELISA)을 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6c는 본 발명의 일 실시예에 따라 KCNE5에 대하여 효소 면역기법 (ELISA)을 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 동물 모델의 정립
1-1. 수술 방법
(1) 동물 준비
마취된 동물은 음낭 부위를 포함하여 복부 전체 제모를 실시하고, 제모된 부위는 알코올로 1차 소독하였다. 그 다음, 알코올-> 포비돈-> 알코올-> 포비돈 순으로 2차 소독을 실시하였다.
(2) 마취 유지
술자를 제외한 1인은 마취를 지속적으로 모니터링(심박수, 배출 이산화탄소 농도, 산소포화도) 하였다.
(3) 수술적 잠복 정소 유도
양쪽 음낭 사이의 공간에서 약 3 cm cranial쪽으로 절개하고, 절개한 곳으로 한쪽 정소를 노출시켰다. 이때 정소 및 막의 손상을 최소로 한다. Superficial ring 부위를 손으로 촉진한 후 inguinal region 피부를 절개하였고, 이 과정에서 정소는 생리 식염수를 적셔 놓은 거즈로 감싸서 마르지 않도록 하였다. 대퇴신경 및 동맥, 정맥을 유의하면서 internal inguinal ring을 노출시키고 그 부위로 정소가 들어갈 수 있도록 좀 더 절개하여 충분한 공간이 확보될 수 있도록 하였다. 정소는 정소 혈관이나 정관이 꼬이지 않도록 하면서 복부 공간 안으로 집어넣었다. 복막 및 근육은 흡수성 봉합사 2-0를 이용하여 단순단속 봉합법을 실시하였다. 피부 봉합은 비흡수성 봉합사 3-0를 이용하여 단순단속 봉합법으로 실시하였다. 반대편 음낭도 상기와 같은 방법으로 잠복 고환을 유도하였다. 동물은 마취에서 깨우고 수술 후 5일간 항생제 처치 후 8일후 봉합사는 제거하였다. 수술 한달 후 정소 고정술을 실시하였다.
(4) 정소 고정술(orchiopexy)
복강 내 위치한 정소를 다시 음낭 내로 환원시켜서 외래 주입 정원줄기세포의 생착을 위한 정상적인 정소 환경을 만들어 주었다.
피부를 소독한 후 inguinal region부분의 피부를 절개하고 절개한 피부 밑에 근육 및 복막을 꿰맨 부분을 확인한 후 봉합사를 잘라냈다. 복강 절개 부분을 확인하고 복강 안에 위치한 정소를 찾는다. 이때 정소 주위에 복막 및 지방 등이 유착될 수 있으므로 혈관이나 정관이 손상되지 않도록 주의하면서 정소를 분리하였다. 분리된 정소는 음낭 안으로 집어넣는데 이때 음낭 안의 공간이 좁아져 있으므로 집어넣기 전에 음낭 안의 공간을 확보하였다. 음낭 안으로 위치를 시킨 정소와 음낭 피부는 정소의 복강 이동을 방지하기 위해 결찰해 놓았다. 정소를 꺼낸 부위의 복막, 근육, 피부를 상기 기술 방법과 동일하게 봉합하였다.
1-2. 실험 결과
(1) 잠복 정소 시술에 따른 조직 분석 및 세정관 직경 분석
외과적 수술을 통해 잠복 정소를 유도하고 조직 분석을 시행하였다. 유도된 잠복 정소는 4주 후 정소 고정술을 이용해 원래의 자리인 음낭으로 복귀시켰다. 잠복 정소 유도에 의한 세정관 조직 분석을 1주일 간격으로 시행하였다. 잠복 정소 시술 후 1주 후부터 세정관 내 세포 감소가 관찰되었으며 30일 이후에는 세정관 내 세포가 거의 사라졌다.
잠복 정소 유도에 따른 세정관 지름 분석 결과, 도 1f에서 확인할 수 있듯이, 잠복 정소 유도에 의해 세정관 직경이 감소하였다.
(2) 잠복 정소 시술에 따른 정소 및 정소 상체관 조직 분석
도 2a에서 확인할 수 있듯이, 잠복 정소 유도 4주 후 정소 분석 결과, 정소의 크기가 현저히 줄어들었다. 정소 상체관 조직 분석 결과, 정상 정소에서는 정자가 관찰되었으나 잠복 정소 유도 4주 후 정소 상체관에서는 정자가 관찰되지 않았다.
(3) 잠복 정소 시술에 따른 세정관 내 미분화 정원세포 분석
잠복 정소 유도에 의한 세정관 내 미분화 정원세포를 PGP9.5 항체를 이용해 분석한 결과, 도 3f에서 확인할 수 있듯이, 잠복 정소 유도 후 시간 경과에 따라 지속적으로 감소하였고, 잠복 정소 시술 30일 후에는 세정관 내에 PGP9.5를 발현하는 세포가 거의 없었다.
(4) 잠복 정소 시술에 따른 세정관 내 Sertoli 세포 분석
잠복 정소 유도에 의한 세정관 내 Sertoli 세포를 GATA4 항체를 이용해 분석한 결과, 도 4f에서 확인할 수 있듯이, 잠복 정소 유도 후 시간 경과에 따라 변화하지 않았다. 따라서 잠복 정소 시술에 의한 정원세포의 감소는 있으나 지지세포인 Sertoli 세포의 변화는 관찰되지 않았다.
(5) 정소 고정술에 따른 개 정자세포 재생
정소 고정술을 이용해 복강 내에 존재하는 정소를 다시 음낭 안으로 복귀시키고 4주 후 정자 형성을 확인하였다. 정소에서는 일부 조직이 재생된 것을 확인하였으나 정소 상체관에서의 정자 생성을 관찰하지 못하였다. 정소 조직에서 미분화 정원세포와 정모세포를 확인하기 위해 PGP9.5와 SCP3 항체를 이용해 면역 염색을 시행한 결과, 도 5c 및 도 5d에서 확인할 수 있듯이, 두 가지 세포가 모두 확인되었다. 기간을 늘려 주면 충분히 정소 재생이 이루어질 것이라 사료된다.
실시예 2. RNA 시퀀싱
RNA 라이브러리 구축을 위해 정상 개 및 잠복고환 개 정소에서 총 RNA를 추출하였다. NanoDrop 1000 spectrophotometer (Thermo Scientific, DE, USA) 및 Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies, CA, USA)을 이용하여 총 RNA의 양 및 질을 분석하였다. 제조사의 지시에 따라 TruSeq RNA Library Preparation Kit (Illumina, CA, USA)를 이용하여 Illumina-compatible 라이브러리를 구축하였다. 간단히 설명하면, 먼저 총 RNA의 폴리 A를 선별하여 mRNA를 분리하였다. 랜덤 헥사머 프라이머를 이용하여 단일 가닥의 cDNA를 합성한 다음, 이중 가닥의 cDNA를 얻기 위해 상보적인 cDNA 가닥을 합성하였다. 시퀀싱 어댑터를 이용하여 짧은 이중가닥-cDNA 단편을 연결시키고, 아가로스 겔 전기영동을 통해 적절한 단편을 분리하였다. RNA 라이브러리는 PCR 증폭을 통해 구축하였다. RNA 라이브러리는 qPCR Quantification Protocol Guide (San Diego, CA, USA)에 따라 qPCR을 통해 정량하였고, Agilent Bioanalyzer 2100를 이용하여 확인하였다.
유전자 발현 정도의 수준을 분석하고, 선택적 스플라이싱 전사체를 확인하기 위해 TopHat를 이용하여 RNA-Seq 리드를 Canis lupus familiaris 지놈에 맵핑하였다. Canis lupus familiaris의 레퍼런스 지놈 서열 (GCF_000002285.3_CanFam3.1) 및 주석 데이터는 NCBI 웹사이트 (www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000002285.3/)에서 얻었다. 아이소폼(isoform) 수준에서의 전사 카운트를 계산하고, Cufflinks를 이용하여 FPKM (fragments per kilobase of exon per million fragments mapped)의 단위로 상대적인 전사체 양을 측정하였다. 또한, Cufflinks RABT (reference annotation based transcript assembly) 방법을 이용하여 각 샘플에서 새로운 전사체 및 선택적 스플라이싱 전사체를 확인하였다.
실시예 3. RNA 추출 및 RT-PCR
제조사 (Qiagen, Venlo, Netherlands)의 지시에 따라 Qiagen RNA extraction kit를 이용하여 정상 개 및 잠복고환 개 정소로부터 RNA를 추출하였다. RT-PCR premix kit (iNtRON, Seongnam, South Korea)를 사용하여 총 RNA 1 ug으로부터 cDNA를 합성하였다. 타겟 유전자는 95 ℃에서 30초, 55 ℃에서 30초, 및 72 ℃에서 30초를 30 사이클 반복하여 PCR 증폭시켰다. PCR에 사용된 프라이머 세트는 표 1과 같다.
서열번호 명칭 서열목록 (5'--> 3')
1 Canine GAPDH Forward Primer CTTCACCACCATGGAGAAGG
2 Canine GAPDH Reverse Primer CAGCTCAGGGATGACCTTGC
3 Canine GXYLT2 Forward Primer ACTCGCATACGAAGTGCTCA
4 Canine GXYLT2 Reverse Primer TGATCGGGACGGTAGTTCCA
실시예 4. 통계학적 분석
raw 데이터는 Cufflinks 소프트웨어를 통해 각 샘플의 각 전사체에 대하여 FPKM (Fragments Per Kilobase of exon model per Millon mapped fragments)으로 계산하였다. 두개 이상의 샘플에 대해 FPKM값이 0인 전사체는 제외시켰다. Log10 변환을 용이하게 하기 위해 필터링된 전사체의 FPKM 값에 1을 더했다. 필터링된 데이터는 대수 (logarithm)로 변환시키고, quantile 정규화 방법으로 정규화하였다. 각 전사체에 대하여 증례 (case)와 대조군 사이의 배수 변화를 계산하였고, |fold change| = 4 필터를 사용하여 유의미한 유전자를 결정하였다.
4-1. RNA 시퀀싱 결과 분석
RNA 시퀀싱 결과, 잠복정소에서 4폴드 이상 발현하는 유전자 리스트 중 기존에 정소와 관련된 것으로 알려지지 않은 유전자를 동정하였다. 아래 13개 유전자는 잠복정소에서 높게 발현하는 새로운 마커 유전자이다.
유전자
기호		 단백질_ID 설명 정상대조군 대비 잠복 정소 동물에서의 발현 비율
KCNE5 XP_853033.1 potassium channel, voltage gated subfamily E regulatory beta subunit 5 121.26
TMEM184A XP_003639133.1 transmembrane protein 184A 44.86
CACNA1H XP_013970195.1 calcium channel, voltage-dependent, T type, alpha 1H subunit 39.66
ARHGEF16 XP_005620490.1 rho guanine nucleotide exchange factor 16 37.24
ENPP7 XP_005624089.1 ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 7 35.69
COL6A6 XP_853279.3 collagen alpha-6(VI) chain 34.68
TMEM61 XP_005620309.1 transmembrane protein 61 33.75
MYBPC3 NP_001041571.1 myosin binding protein C, cardiac 32.17
α2M XP_534893.3 alpha-2-macroglobulin 31.48
ALDH3A1 NP_001075889.1 aldehyde dehydrogenase 3 family, member A1 30.80
GXYLT2 XP_853462.3 glucoside xylosyltransferase 2 29.73
AIF1L XP_005625285.1 allograft inflammatory factor 1-like 27.99
MAGED4 XP_005641423.1 melanoma-associated antigen D4 25.96
실시예 5. 혈액 샘플에서 다양한 유전자 발현의 검증
RNA sequencing 결과를 통해 잠복 정소에서 높게 발현되는 것으로 나타난 α2M를 효소 면역기법 (ELISA Kit, Bluegene biotech)를 이용하여 혈액 샘플 내 단백질의 발현양의 변화 (농도)를 확인하였다.
구체적으로, 동물모델의 혈액을 항응고제가 없는 튜브에 채혈한 후, 혈액을 2시간 정도 실온에 두어 혈청이 분리되도록 두었다. 3000 rpm에 15분가량 원심분리기를 통하여 혈청을 분리한 후, 혈청을 실험을 위하여 E-튜브 (Eppendorf-tube)에 나누어 담았다. 실험에 사용할 혈청을 제외한 남은 혈청은 E-튜브에 담아 -20 ℃ 내지 -80 ℃에 동결시켰다. 상기 과정을 통하여 분리된 혈청을 100 ul씩 사전 코팅된 웰에 적절하게 분주하였다. 블랭크 대조군 웰에는 혈청 대신 100 ul의 PBS(pH 7.0-7.2)를 분주하였다. 그 다음, 블랭크 대조군 웰을 제외한 나머지 웰에 50 ul의 콘쥬게이트를 분주한 후, 잘 섞어 준 뒤, 커버를 씌우고 37 ℃ 인큐베이터에서 1시간 동안 인큐베이션을 하였다. 인큐베이션이 끝난 플레이트(microtiter plate)를 각 웰에 200 ul의 1X 세척액을 완전히 채운 뒤, 플레이트의 내용물을 흡입하였다. 이러한 절차를 5번 반복한 후, 용액이 남지 않게 플레이트를 완전이 건조시켰다. 건조 후, 블랭크 대조군 웰을 포함하여 각각의 웰에 50 ul 기질(Substrate)A 및 기질(Substrate)B를 첨가한 뒤, 커버를 씌우고 빛이 없는 37 ℃에서 10 내지 15분 동안 배양하였다. 그 다음, 블랭크 컨트롤 웰을 포함하여 각 웰에 50 ul의 스탑 솔루션을 분주한 뒤, 잘 섞어 준 다음, 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 450 nm에서 광학 밀도(O.D.)를 바로 측정하였다.
5-1. α2M의 농도 확인
상기 방법을 통하여, α2M의 잠복 정소 유도 수술 전 혈청 샘플, 잠복 정소 유도 수술 후 8주차 혈청 샘플 및 복강에 위치한 정소를 다시 음낭으로 내리는 정소 고정 수술 후 8주차 혈청 샘플 내에서의 α2M의 평균 농도 변화를 관찰하여 표 3, 표 4 및 도 6a에 나타내었다.
α2M 평균 농도 (ng/mL)
0 week 2.692
8 weeks 5.708
Recovery 8 weeks 3.552
다중 비교검정 통계적 유의성 써머리
0 week VS 8 weeks Yes **
0 week VS Recovery 8 weeks No Ns
8 week VS Recovery 8 weeks Yes *
**: p<0.01 *: p<0.05, Ns: No Significance
도 6a에 나타낸 바와 같이, 잠복 정소 유도 수술 후 8주차 혈청 샘플에서는 α2M의 농도가 상승하였으며, 반면, 복강에 위치한 정소를 다시 음낭으로 내리는 정소 고정 수술 후 8주차 혈청 샘플에서의 α2M 농도는 감소하였다. 이를 통하여, 혈청 내 α2M 농도 측정을 통하여 남성 불임 진단용 바이오 마커로 사용이 가능할 수 있음을 확인하였다.
5-2. 테스토스테론의 농도 확인
상기 방법을 통하여, 동일 혈청 샘플을 가지고 정소에서 생성되고 분비되는대표적인 남성 호르몬인 테스토스테론 (Testosterone)의 농도를 측정하였다. 테스토스테론은 잠복 정소 수술 전 혈청 샘플, 잠복 정소 유도 수술 후 8주차 혈청 샘플 및 복강에 위치한 정소를 다시 음낭으로 내리는 정소고정수술 후 8주차 혈청 샘플 내에서의 테스토스테론의 평균 농도 변화를 관찰하여 표 5, 표 6 및 도 6b에 나타내었다.
테스토스테론 평균 농도 (ng/mL)
0 week 331.8
8 weeks 234.1
Recovery 8 weeks 287.6
통계적 유의성 써머리
0 week VS 8 weeks Yes *
0 week VS Recovery 8 weeks No Ns
8 week VS Recovery 8 weeks No Ns
*: p<0.05, Ns: No Significance
도 6b에 나타낸 바와 같이, 잠복 정소 유도 수술 후 8주차 혈청 샘플에서는 테스토스테론 농도가 감소하였다. 반면, 복강에 위치한 정소를 다시 음낭으로 내리는 정소고정수술 후 8주차 혈청 샘플에서의 테스토스테론 농도는 차이를 보이지 않았다. 이를 통해 테스토스테론은 손상 후 회복되는 정소 상태에 대한 감별능이 없음을 확인하였다.
α2M과 반대되는 테스토스테론의 농도 측정값의 비교를 통하여, α2M을 남성 불임 진단 및 불임 치료 확인용 바이오 마커로 사용할 수 있음을 확인하였다.
5-3. KCNE5의 농도 확인
RNA 시퀀싱 결과 정상대조군 대비 잠복정소 동물에서의 발현비율이 가장 높았던 KCNE5에 대한 잠복 정소 유도 수술 전 혈청 샘플, 잠복 정소 유도 수술 후 8주차 혈청 샘플 및 복강에 위치한 정소를 다시 음낭으로 내리는 정소고정수술 후 8주차 혈청 샘플 내에서의 KCNE5의 평균 농도 변화를 관찰하여 표 7, 표 8 및 도 6c에 나타내었다.
KCNE5 평균 농도 (ng/mL)
0 week 3.730
8 weeks 3.748
Recovery 8 weeks 2.835
통계적 유의성 Summary
0 week VS 8 weeks No Ns
0 week VS Recovery 8 weeks No Ns
8 week VS Recovery 8 weeks No Ns
Ns: No Significance
도 6c에 나타낸 바와 같이, 잠복 정소 유도 수술 전, 잠복 정소 수술 후 8주차 및 정소고정술 실시 후 8주차 혈청 샘플 모두 차이를 보이지 않았다. 이를 통하여, 혈청 내 남성 불임 진단용 바이오 마커로 사용이 가능한 것은 α2M임을 확인하였다.
<110> KOREA FOOD RESEARCH INSTITUTE <120> Biomarker for Diagnosing Male Infertility or Decreased fertility <130> PN170270P <150> KR 10-2019-0057449 <151> 2019-05-16 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH Forward Primer <400> 1 cttcaccacc atggagaagg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH Reverse Primer <400> 2 cagctcaggg atgaccttgc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GXYLT2 Forward Primer <400> 3 actcgcatac gaagtgctca 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GXYLT2 Reverse Primer <400> 4 tgatcgggac ggtagttcca 20

Claims (10)

  1. 하기의 단계를 포함하는 남성 불임 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법:
    혈액으로부터 α2M (alpha-2-Macroglobulin) 단백질의 발현 정도; 또는
    상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 정도를 측정하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 남성 불임은 무정자증 (azoospermia), 희소정자증 (oligospermia), 무력정자증 (astheno spermia) 또는 기형정자증 (tetrazoospermia)인 것인, 남성 불임 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 단백질의 발현 정도 측정은 항원-항체 반응 방식으로 실시되는 것인, 남성 불임 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 단백질의 발현 정도 측정은 면역효소분석법 (enzyme linked immunosorbent assay; ELISA), 웨스턴 블랏 (western blotting), 방사선면역분석 (Radioimmunoassay; RIA), 방사 면역확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트 (rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법 (Complement Fixation Assay), 유세포분석 (Fluorescence Activated Cell Sorter; FACS) 또는 단백질 칩 (protein chip)을 이용하여 수행하는 것인, 남성 불임 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 유전자의 발현 정도 측정은 유전자 증폭 방식으로 측정하는 것인, 남성 불임 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 유전자의 발현 정도 측정은 마이크로어레이, 역전사 중합효소반응 (RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응 (Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응 (Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RNase protection assay; RPA), 노던 블럿팅 (Northern blotting) 또는 DNA 칩을 이용하여 실시될 수 있는 것인, 남성 불임 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.

  9. 삭제
  10. 삭제
KR1020200058204A 2019-05-16 2020-05-15 남성 불임 또는 생식 능력 저하 진단용 바이오 마커 KR102327509B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20190057449 2019-05-16
KR1020190057449 2019-05-16

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20200132750A KR20200132750A (ko) 2020-11-25
KR102327509B1 true KR102327509B1 (ko) 2021-11-17

Family

ID=73645337

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020200058204A KR102327509B1 (ko) 2019-05-16 2020-05-15 남성 불임 또는 생식 능력 저하 진단용 바이오 마커

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102327509B1 (ko)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060199204A1 (en) 2001-10-05 2006-09-07 U.S. Epa Genetic testing for male factor infertility
US20170138963A1 (en) * 2010-08-16 2017-05-18 Sinai Health System Markers of the male urogenital tract
US20190112659A1 (en) * 2015-08-06 2019-04-18 The University Of Utah Research Foundation Methods of identifying male fertility status and embryo quality

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060199204A1 (en) 2001-10-05 2006-09-07 U.S. Epa Genetic testing for male factor infertility
US20170138963A1 (en) * 2010-08-16 2017-05-18 Sinai Health System Markers of the male urogenital tract
US20190112659A1 (en) * 2015-08-06 2019-04-18 The University Of Utah Research Foundation Methods of identifying male fertility status and embryo quality

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Asian Journal of Andrology (2009) 11:484-491*
Human Reproduction (1996) 11(11):2454-2460*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20200132750A (ko) 2020-11-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2010503385A (ja) 哺乳類卵母細胞発達適格性の顆粒膜マーカーおよびその使用
EP2576825B1 (en) Methods for assessing endometrium receptivity of a patient
WO2011057411A1 (en) Ovarian markers of oocyte competency and uses thereof
KR101945348B1 (ko) 혈액 내 chi3l1 발현 수준을 이용한 정상압 수두증 진단용 조성물과 진단 마커 검출 방법
KR101848064B1 (ko) 퇴행성관절염에 대한 바이오마커 및 상기 바이오마커를 포함하는 퇴행성관절염 진단 또는 예후분석용 키트
KR102562614B1 (ko) 비침습적 방법을 이용한 치주 질환 진단용 키트
CN112626207A (zh) 一种用于区分非侵袭性和侵袭性无功能垂体腺瘤的基因组合
KR102327509B1 (ko) 남성 불임 또는 생식 능력 저하 진단용 바이오 마커
US10415093B2 (en) Method for diagnosing and monitoring inflammatory disease progression
JP7150018B2 (ja) 新規なｃｉｐ２ａバリアント及びその使用
KR102505618B1 (ko) 신장이식 후 항체 매개성 거부반응의 진단을 위한 소변 엑소좀 유래 miRNA 유전자 바이오마커 및 이의 용도
KR101874632B1 (ko) 크론병에 대한 바이오마커 및 이를 이용한 크론병의 진단
KR102505617B1 (ko) 신장이식 후 T 세포 매개성 거부반응의 진단을 위한 소변 엑소좀 유래 miRNA 유전자 바이오마커 및 이의 용도
CN108753790B (zh) 与bavm相关的基因标志物及其突变
KR20100070776A (ko) 습관성 유산 진단용 바이오마커
CN118326058B (zh) iNK细胞中iPSC的标志物及其应用
KR102545543B1 (ko) BK 바이러스 신병증의 진단을 위한 소변 엑소좀 유래 miRNA 유전자 바이오마커 및 이의 용도
EP4332242A1 (en) Method for predicting prognosis of gastric cancer
KR102665392B1 (ko) 무증상 갑상선 저하증 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트
WO2020153759A2 (ko) 요로결석 진단을 위한 분석방법 및 키트
KR101727750B1 (ko) 단맛 수용체 유전자를 함유하는 허혈질환 진단용 조성물
KR20230136786A (ko) 췌장암의 진단용 조성물
KR20230144442A (ko) 급성기 만성골수성백혈병 진단용 신규 바이오마커 및 이의 용도
KR20230134925A (ko) 무혈성 골괴사증 진단용 조성물, 키트 및 이의 진단 정보제공 방법
KR20230020820A (ko) 유방암 진단용 바이오마커 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E90F Notification of reason for final refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right