WO2020179858A1 - インフルエンザウイルス検出のための方法及びキット、並びにインフルエンザウイルス感染の診断方法 - Google Patents

インフルエンザウイルス検出のための方法及びキット、並びにインフルエンザウイルス感染の診断方法 Download PDF

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influenza virus
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carbon atoms
neuraminidase
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和仁 田端
博行 野地
泰照 浦野
真子 神谷
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    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/924—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)

Definitions

  • the present invention relates to a method and kit for detecting influenza virus, and a method for diagnosing influenza virus infection. More specifically, the present invention relates to a method for detecting influenza virus using a substrate showing different reactivity with neuraminidase derived from influenza and neuraminidase derived from bacteria.
  • Patent Document 1 a simple influenza virus test kit using immunochromatography has been developed (see Patent Document 1). Since the method using immunochromatography can detect influenza virus within a few minutes to several tens of minutes, it is utilized for diagnosis and treatment of infection.
  • Neuraminidase is an exo-type glycolytic enzyme that releases sialic acid from the non-reducing end of the sugar chain. Neuraminidase is present on the surface of influenza virus and is involved in the growth of the virus.
  • the color-developing substrate include 4-methylumbelliferyl- ⁇ -D-neuraminic acid (4-Methyllumbelliferyl-N-acetyl- ⁇ -D-neuraminic acid: 4MU-NANA, see Patent Document 2) and 4-alkoxy.
  • a chemiluminescent derivative of -N-acetylneuraminic acid or 4,7-dialkoxy-N-acetylneuraminic acid (see Patent Document 3) is used.
  • 4-methylumbelliferone which is a fluorescent substance, is produced by decomposition of 4MU-NANA by neuraminidase.
  • the enzyme activity value of neuraminidase can be calculated based on the fluorescence intensity of 4-methylumbelliferone produced, and the number of influenza virus particles can be quantified based on the enzyme activity value.
  • Patent Document 4 discloses a kit for detecting whether influenza is human influenza or human pathogenic avian influenza in humans (see Example 7).
  • the kit comprises a substrate containing N-glycolylneuraminic acid (NeuGc ⁇ 2-3Gal) bound to galactose and a substrate containing N-acetylneuraminic acid (NeuAc ⁇ 2-3Gal) bound to galactose. If these two types of substrates are contacted with a clinical sample and only the substrate based on NeuAc ⁇ 2-3Gal is cleaved, it is determined to be positive for human influenza virus. Based on the substrate based on NeuAc ⁇ 2-3Gal and NeuGc ⁇ 2-3Gal. If both substrates are cleaved, the human pathogenic avian influenza virus is considered positive.
  • Patent Document 5 describes a method for detecting an influenza virus by a digital method.
  • an object to be detected is introduced so that one molecule at a maximum exists in a large number of extremely small spaces (for example, microdroplets). Then, the detection target object in each minimum space is detected, and its existence is digitized by 0 or 1. As a result, in the digital method, the detection target can be detected with high sensitivity and quantitatively.
  • Patent Documents 6 and 7 describe a technique for enclosing a substance in an extremely small space and a technique applicable to a digital method.
  • neuraminidase Some bacteria resident in the upper respiratory tract mucosa have neuraminidase. Therefore, in a method for detecting an influenza virus based on a reaction between ilaminidase and a substrate, which uses a nasal swab or the like as a sample, a signal derived from neuraminidase derived from bacteria may be detected as a false positive.
  • the present invention has a main object to provide a technique for detecting influenza virus with improved accuracy by using substrates showing different reactivities to influenza-derived neuraminidase and bacterial-derived neuraminidase. ..
  • a method for detecting influenza virus or neuraminidase derived from influenza virus in a biological sample comprising: (1) Procedure 1 of mixing the biological sample with a first probe and a second probe,
  • the first probe is decomposed by both influenza virus-derived neuraminidase and bacterial-derived neuraminidase to generate an optically detectable signal.
  • the second probe is degraded by bacterial neuraminidase to produce an optically detectable signal and is not degraded by influenza-derived neuraminidase.
  • the signal generated from the first probe and the signal generated from the second probe are optically distinguishable and detectable, (2) a step 2 of detecting a signal generated from the first probe and the second probe, (A) When the ratio of the intensity of the signal generated from the first probe to the intensity of the signal generated from the second probe is equal to or more than a predetermined value, the influenza virus or influenza virus-derived neuraminidase in the biological sample Detect presence, When the ratio is less than the predetermined value, the absence of influenza virus or influenza virus-derived neuraminidase in the biological sample is detected, or (B) When the signal generated from the first probe is detected and the signal generated from the second probe is not detected, the presence of influenza virus or influenza virus-derived neuraminidase in the biological sample is detected.
  • R 1 when present, represents the same or different monovalent substituents present on the benzene ring
  • R 2 and R 3 each independently represent a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or a halogen atom
  • R 4 and R 5 each independently represent a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or a halogen atom
  • R 6 represents a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, or a fluorinated alkyl group having 1 to 5 carbon atoms
  • R 7 and R 8 when present, each independently represent an alkyl group or aryl group having 1 to 6 carbon atoms,
  • R 9 is independently selected from a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, an alkoxy group, a hydroxyl group, a carboxyl group, a halogen atom, a
  • a kit for detecting influenza virus or neuraminidase derived from influenza virus in a biological sample isolated from a subject infected with or suspected of being infected with influenza virus A first probe that is decomposed by both an influenza virus-derived neuraminidase and a bacterial-derived neuraminidase to produce an optically detectable signal, Includes a second probe that is degraded by bacterial neuraminidase to produce an optically detectable signal and is not degraded by influenza-derived neuraminidase.
  • the kit wherein the second probe is a compound represented by the following formula (1) or a salt thereof.
  • R 1 indicates the same or different monovalent substituents present on the benzene ring, if present;
  • R 2 and R 3 independently represent a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or a halogen atom;
  • R 4 and R 5 independently represent a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or a halogen atom;
  • R 6 represents a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, or a fluorinated alkyl group having 1 to 5 carbon atoms;
  • R 7 and R 8 if present, independently represent alkyl or aryl groups with 1 to 6 carbon atoms, respectively.
  • R 7 and R 8 do not exist;
  • R 9 is independently selected from a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, an alkoxy group, a hydroxyl group, a carboxyl group, a halogen atom, a sulfo group, an amino group, an alkoxycarbonyl group, and an oxo group at each appearance;
  • R 10 if present, represents the same or different monovalent substituents present on the benzene ring;
  • X represents an oxygen atom, a silicon atom or a carbon atom;
  • m is an integer from 0 to 4;
  • n is an integer of 1 to 3;
  • s is an integer of 1;
  • t is an integer from 0 to 4.
  • R 1 indicates the same or different monovalent substituents present on the benzene ring, if present;
  • R 2 and R 3 each independently represent a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or a halogen atom;
  • R 4 and R 5 independently represent a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or a halogen atom;
  • R 6 indicates a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, or an alkyl fluoride group having 1 to 5 carbon atoms;
  • R 7 and R 8 when present, each independently represent an alkyl group or aryl group having 1 to 6 carbon atoms,
  • R 9 is independently represent an alkyl group or aryl group having 1 to 6 carbon atoms
  • R 1 indicates the same or different monovalent substituents present on the benzene ring, if present
  • R 2 and R 3 independently represent a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or a halogen atom
  • R 4 and R 5 each independently represent a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or a halogen atom
  • R 6 indicates a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, or an alkyl fluoride group having 1 to 5 carbon atoms
  • R 7 and R 8 if present, independently represent alkyl or aryl groups with 1 to 6 carbon atoms, respectively.
  • R 7 and R 8 do not exist;
  • R 9 is independently selected from a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, an alkoxy group, a hydroxyl group, a carboxyl group, a halogen atom, a sulfo group, an amino group, an alkoxycarbonyl group, and an oxo group at each appearance;
  • R 10 if present, represents the same or different monovalent substituents present on the benzene ring;
  • X represents an oxygen atom, a silicon atom or a carbon atom;
  • m is an integer from 0 to 4;
  • n is an integer from 1 to 3;
  • s is an integer of 1;
  • t is an integer from 0 to 4.
  • Procedure 1 in which a biological sample isolated from a subject infected with or suspected of being infected with influenza virus is mixed with a first probe and a second probe.
  • the first probe is one which is decomposed by both neuraminidase derived from influenza virus and neuraminidase derived from bacteria to produce an optically detectable signal
  • the second probe is degraded by bacterial neuraminidase to produce an optically detectable signal and is not degraded by influenza-derived neuraminidase.
  • the signal generated from the first probe and the signal generated from the second probe can be optically distinguished and detected.
  • the procedure 2 for detecting the signal generated from the first probe and the second probe is included. (A) determining the infection of the target influenza virus when the ratio of the intensity of the signal generated from the first probe to the intensity of the signal generated from the second probe is a predetermined value or more, If the ratio is less than the predetermined value, determine non-infection of the target influenza virus, or, (B) When the signal generated from the first probe is detected and the signal generated from the second probe is not detected, the infection of the target influenza virus is determined. When a signal generated from the first probe and a signal generated from the second probe are detected, non-infection of the target influenza virus is determined. Diagnostic method. [15] The diagnostic method of [14], wherein in the formula (1), R 6 is —CH 2 —CF 3 .
  • the alkyl part of an “alkyl group” or a substituent containing an alkyl part has, for example, 1 to 6 carbon atoms, preferably 1 to 4 carbon atoms, unless otherwise specified. More preferably, it means an alkyl group having about 1 to 3 carbon atoms, which is linear, branched, cyclic, or a combination thereof.
  • examples of the alkyl group include, for example, methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, cyclopropyl group, n-butyl group, sec-butyl group, isobutyl group, tert-butyl group, cyclopropyl group.
  • examples thereof include a methyl group, an n-pentyl group, an n-hexyl group and the like.
  • halogen atom may be any of a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, or an iodine atom, preferably a fluorine atom, a chlorine atom, or a bromine atom.
  • the present invention provides a technique for detecting an influenza virus with improved accuracy.
  • HMRef-S-Neu5Ac which is an example of the compound represented by the formula (1), and 4MU-NANA influenza virus or bacterial neuraminidase. It is a figure for demonstrating one Embodiment of the procedure 2 of the influenza virus detection method which concerns on this invention. It is a figure for demonstrating other embodiment of the procedure 2 of the influenza virus detection method which concerns on this invention. It is a figure for demonstrating other embodiment of the procedure 2 of the influenza virus detection method which concerns on this invention. It is a figure for demonstrating other embodiment of the procedure 2 of the influenza virus detection method which concerns on this invention. It is a figure for demonstrating other embodiment of the procedure 2 of the influenza virus detection method which concerns on this invention.
  • FIG. 2 is a graph showing the time-dependent change in the fluorescence intensity of HMRef-S-Neu5Ac accompanying the enzymatic reaction with neuraminidase derived from Arthrobacter ureafaciens (Test Example 1).
  • 3 is a graph showing the time-dependent changes in the fluorescence intensity of HMRef-S-Neu5Ac and 4MU-NANA due to the enzymatic reaction with the neuraminidase derived from influenza eurus (Test Example 2).
  • influenza virus detection method and influenza infection diagnosis method detects influenza virus based on the presence or absence of hydrolysis of a probe by neuraminidase derived from influenza virus. Therefore, in the present invention, "influenza virus detection” and “influenza virus-derived neuraminidase” are used interchangeably.
  • the influenza virus detection method includes the following procedures (steps) 1 and 2.
  • Step 1 The procedure of mixing the biological sample with the first probe and the second probe.
  • Step 2 A procedure for detecting signals generated from the first probe and the second probe.
  • the biological sample is not particularly limited as long as it is a biological material that can contain influenza virus.
  • biological samples include nasal aspirate, nasal swab, pharyngeal swab, tracheal swab, saliva, sputum, blood (including whole blood, serum and plasma), urine, cell/tissue, organ extract, etc. Can be mentioned.
  • a biological sample is separated from a subject infected with or suspected of being infected with influenza virus.
  • the target is not limited to humans, but may be mammals including monkeys and pigs, and birds including ducks and chickens.
  • the first probe (hereinafter referred to as "probe 1") is hydrolyzed by both influenza virus-derived neuraminidase and bacterial-derived neuraminidase to generate an optically detectable signal.
  • bacteria is used in the broadest sense to refer to all prokaryotes, including archaea, but in particular to eubacteria that can be resident in biological samples.
  • bacteria for nasal cavity, pharynx, oral cavity and urinary organs, Actinomyces, Bacteroides, Clostridium, Corynebacterium, Enterobacteriaceae, Eubacterium, Fusobacterium, Haemophilus, Lactobacillus, Micrococcus, Mycobacterium, Mycoplasma, Neisseria, Peptostreptococcus, Porphyromonas, Prevotella
  • Various bacteria belonging to each genus such as Streptococcus, Spirohaetaceae and Veillonella are resident, and these bacteria may have neurominidase.
  • the probe 1 is a compound containing sialic acid, and the glycoside bond of sialic acid is hydrolyzed by both the influenza virus-derived neuraminidase and the bacterial-derived neuraminidase to produce a reaction product having optical characteristics different from those of the compound before the degradation. Anything that does.
  • the change from the optical characteristic of the probe 1 before hydrolysis to the optical characteristic of the reaction product generated after hydrolysis is detected as an “optically detectable signal”.
  • the change to the optical characteristics means a change in absorbance, optical rotation and refractive index, a change in the presence or absence of fluorescence, a change in intensity, and the like.
  • the probe 1 a compound in which a chromophore is bound to neuraminic acid or a derivative thereof is preferably used.
  • the chromophore may be a fluorescent substance or a chemiluminescent substance, but is preferably a fluorescent substance.
  • known substances such as 4-methylumbelliferone, 4-fluorescein, resorufin, and rhodamine can be used.
  • 4MU-NANA 2'-(4-methylumbelliferyl) - ⁇ -DN-acetylneuraminic acid
  • 4MU-NANA releases the fluorescent substance 4-methylumbelliferone when it reacts in contact with neuraminidase derived from influenza virus and bacteria.
  • the second probe (hereinafter referred to as "probe 2") is not degraded by influenza-derived neuraminidase, but is degraded only by bacterial-derived neuraminidase to produce an optically detectable signal.
  • the probe 2 is a compound containing sialic acid, which is not decomposed by influenza-derived neuraminidase, and a glycoside bond of sialic acid is hydrolyzed by bacterial-derived neuraminidase to produce a reaction product having optical characteristics different from those of the compound before decomposition. Anything can be generated.
  • the change from the optical characteristic of the probe 2 before hydrolysis to the optical characteristic of the reaction product generated after hydrolysis is detected as an “optically detectable signal”.
  • the “optically detectable signal” generated by the probe 2 is different from the “optically detectable signal” generated by the probe 1. That is, the signal generated by the probe 2 and the signal generated by the probe 1 can be optically distinguished and detected. Specifically, for example, when the signal generated by the probe 1 is a change in absorbance, optical rotation and refractive index, the signal generated by the probe 2 may be a change in the presence or absence of fluorescence or a change in intensity. Alternatively, in this case, the signal generated by the probe 2 may be a change in the absorbance optical rotation and the refractive index in a wavelength range different from the signal generated by the probe 1.
  • the signal generated by the probe 1 when the signal generated by the probe 1 is the presence or absence of fluorescence or a change in intensity, the signal generated by the probe 2 may be a change in absorbance, optical rotation and refractive index. Alternatively, in this case, the signal generated by the probe 2 may be the presence or absence of fluorescence or a change in intensity in a wavelength region different from the signal generated by the probe 1.
  • a compound represented by the following formula (1) or a salt thereof (hereinafter, also simply referred to as “compound (1)”) is preferably used.
  • R 1 if present, represents the same or different monovalent substituent present on the benzene ring.
  • the monovalent substituent include halogen, an optionally substituted alkyl group and the like.
  • n is an integer from 0 to 4. In one preferred aspect of the present invention, m is 0 and R 1 is an unsubstituted benzene ring.
  • R 2 and R 3 independently represent a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or a halogen atom.
  • the alkyl group may contain one or more halogen atoms, carboxy groups, sulfonyl groups, hydroxyl groups, amino groups, alkoxy groups, and the like.
  • the alkyl group indicated by R 2 or R 3 may be an alkyl halide group, a hydroxyalkyl group, a carboxyalkyl group, or the like.
  • R 2 and R 3 are each independently hydrogen atom or a halogen atom, R 2 and R 3 are both fluorine atoms, when a chlorine atom is more preferable.
  • R 4 and R 5 each independently represent a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or a halogen atom, and are the same as those described for R 2 and R 3 . Both R 4 and R 5 are preferably hydrogen atoms.
  • R 6 represents a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, or an alkyl fluoride group having 1 to 5 carbon atoms.
  • the alkyl group of R 6 a methyl group and an ethyl group are preferable.
  • the alkyl fluoride group of R 6 -CH 2- CF 3 and -CH 2- CH 2- CF 3 are preferable.
  • R 6 is —CH 2 —CF 3 .
  • R 7 and R 8 each independently represent an alkyl group or an aryl group having 1 to 6 carbon atoms when present, whereas R 7 and R 8 independently represent carbons, respectively.
  • the number of alkyl groups is preferably 1 to 3, and it is more preferable that both R 7 and R 8 are methyl groups.
  • the alkyl group indicated by R 7 and R 8 may contain one or more halogen atoms, carboxy groups, sulfonyl groups, hydroxyl groups, amino groups, alkoxy groups, etc., for example, indicated by R 7 or R 8.
  • the alkyl group may be an alkyl halide group, a hydroxyalkyl group, a carboxyalkyl group or the like.
  • the aryl group may be either a monocyclic aromatic group or a condensed aromatic group, and the aryl ring has one or more ring-constituting heteroatoms. It may contain (for example, a nitrogen atom, an oxygen atom, or a sulfur atom).
  • a phenyl group is preferred as the aryl group.
  • One or more substituents may be present on the aryl ring. As the substituent, for example, one or two or more halogen atoms, carboxy groups, sulfonyl groups, hydroxyl groups, amino groups, alkoxy groups and the like may be present.
  • R 7 and R 8 do not exist.
  • R 9 is independently selected from hydrogen atom, alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, alkoxy group, hydroxyl group, carboxyl group, halogen atom, sulfo group, amino group, alkoxycarbonyl group, and oxo group at each appearance. Preferably, it is a hydrogen atom.
  • S is an integer of 1.
  • R 10 indicates the same or different monovalent substituents present on the benzene ring, if present.
  • the monovalent substituent include halogen and an optionally substituted alkyl group.
  • t is an integer from 0 to 4. In one preferred aspect of the present invention, t is 0 and R 10 is absent and an unsubstituted benzene ring.
  • X represents an oxygen atom, a silicon atom or a carbon atom. In one preferred aspect of the invention, X is an oxygen atom.
  • N is an integer of 1 to 3, and preferably n is 1.
  • the compound represented by the formula (1) can exist as an acid addition salt or a base addition salt.
  • the acid addition salt include mineral salts such as hydrochlorides, sulfates and nitrates, or organic acid salts such as methanesulfonates, p-toluenesulfonates, oxalates, citrates and tartrates.
  • the base addition salt include metal salts such as sodium salt, potassium salt, calcium salt and magnesium salt, ammonium salt, and organic amine salt such as triethylamine salt.
  • the compound represented by the formula (1) may form a salt with an amino acid such as glycine.
  • Compound (1) may also exist as a hydrate or solvate.
  • the compound (1) may have one or two or more asymmetric carbons depending on the type of the substituent, but is an optically active substance based on one or two or more asymmetric carbons or two or more asymmetric carbons.
  • stereoisomers such as diastereoisomers based on the same carbon, any mixture of stereoisomers, racemates and the like are all included in the scope of the present invention.
  • a method for producing a representative compound of compound (1) is specifically shown in the examples of the present specification. Therefore, those skilled in the art will appropriately select reaction raw materials, reaction conditions, reaction reagents, etc. based on these explanations, and modify or modify these methods as necessary to modify the compound (1). ) Can be manufactured.
  • compound (1) is not degraded by influenza-derived neuraminidase, but is degraded only by bacterial-derived neuraminidase to exhibit fluorescence enhancement (see Test Example 1 and Test Example 2).
  • the scheme of enzymatic hydrolysis by neuraminidase of "HMRef-S-Neu5Ac" (see Synthesis Example 1), which is an example of compound (1), is shown in FIG. Therefore, compound (1) can be used as a fluorescent probe for distinguishing and detecting influenza virus or influenza-derived neuraminidase from bacteria or bacterial-derived neuraminidase.
  • the present invention also provides a reagent containing compound (1) for distinguishing and detecting influenza virus or influenza-derived neuraminidase from bacteria or bacterial-derived neuraminidase.
  • This reagent may be a dried compound (1) or a compound (1) dissolved in a suitable buffer.
  • the buffer solution described below can be appropriately used.
  • the hydrophilic solvent is not particularly limited as long as it is conventionally used as a reaction solution for an enzyme, and for example, a buffer substance is added to water or water at a concentration necessary for optimizing the enzyme reaction. A buffer solution is used.
  • the buffer substance is not particularly limited, but is MES (2-Morpholinoethanesulfonic acid), ADA (N- (2-Acetamido) iminodiacetic acid), PIPES (Piperazine-1,4-bis (2-ethanesulfonic acid)), ACES ( N-(2-Acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid), BES (N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid), TES (N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid) HEPES ( So-called Good's Buffer such as 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid), Tris (Tris(hydroxymethyl)aminomethane), DEA (Diethanolamine) and the like can be used.
  • MES Methyl
  • ADA N- (2-Acetamido) iminodiacetic
  • the mixture of the biological sample, probe 1 and probe 2 is incubated as necessary for the enzymatic reaction. Incubation is, for example, at room temperature-37° C. for several minutes to several tens of minutes.
  • Step 2 (Signal detection procedure)
  • the signals generated from the probe 1 and the probe 2 can be detected and quantified by using a conventionally known device such as an image sensor, a spectrophotometer, a polarimeter, a spectrofluorometer, and a fluorescence microscope.
  • the biological sample, the mixed solution of the probe 1 and the probe 2 (hereinafter, also referred to as “sample solution”) may be loaded into the device, and the measurement may be performed according to the operation procedure manual of the device.
  • the probe 1 is degraded by both influenza virus-derived neuraminidase and bacterial-derived neuraminidase to generate an optically detectable signal.
  • the signal intensity from the probe 1 is S1.
  • probe 2 is hydrolyzed only by bacterial neuraminidase to produce an optically detectable signal.
  • the signal intensity from the probe 2 is S2.
  • neuraminidase present in the sample solution is derived from bacteria (when the subject is not infected)
  • signals are generated from both probe 1 and probe 2.
  • the neuraminidase present in the sample solution is derived from influenza virus (when the subject is infected)
  • a signal is generated from the probe 1
  • the signal generated from the probe 2 is theoretically 0, and the probe. It is sufficiently small even when the signal generated by the natural decomposition of 2 (decomposition not due to the enzymatic activity of neuraminidase) is taken into consideration.
  • the ratio of S1 to S2 (S1/S2) is higher when the influenza virus-derived neuraminidase is present in the sample solution than when the bacterial-derived neuraminidase is present in the sample solution (when the subject is not infected) ( If the subject is infected), it will be larger. That is, if the ratio (S1 / S2) of the signal intensity S2 generated from the probe 2 to the signal intensity S1 generated from the probe 1 is equal to or higher than a predetermined value (threshold value), the influenza virus is present in the sample solution (target). Is infected with the influenza virus).
  • the ratio (S1 / S2) is less than the threshold value, it can be detected that the influenza virus is not present in the sample solution (the subject is not infected with the influenza virus).
  • the neuraminidase present in the biological sample is clearly distinguished whether it is derived from influenza virus or bacterial origin, without detecting the signal caused by the bacterial neuraminidase as a false positive, the influenza virus is detected. It can be detected with high accuracy.
  • the threshold value can be appropriately set according to the compounds used as the probe 1 and the probe 2, the optical properties thereof, the type of bacteria that can be present in the biological sample, and the like.
  • the threshold is 1.1 times, 1.5 times, 2 times, 3 times, 4 times, 5 times, 6 times, 7 times, 8 times the ratio (S1/S2) when bacterial neuraminidase is present in the sample solution.
  • 9 times, 10 times, 20 times, 30 times, 40 times, 50 times or more can be set.
  • the spontaneous degradation of the probe 2 (degradation not due to the enzymatic activity of neuraminidase) does not occur or is negligible
  • the neuraminidase present in the sample solution is derived from influenza virus (when the subject is infected)
  • the signal generated from the probe 2 is 0.
  • the influenza virus can be detected regardless of the ratio (S1/S2) of the signal intensity S2 generated by the probe 2 to the signal intensity S1 generated by the probe 1.
  • the signal generated from the probe 1 when the signal generated from the probe 1 is detected and the signal generated from the probe 2 is not detected, the presence of influenza virus (target influenza infection) in the sample solution is detected, and the signal generated from the probe 1 and the probe When the signal generated from 2 is detected, the absence of influenza virus in the sample solution (non-infected target influenza virus) can be detected.
  • influenza virus target influenza infection
  • the detection target is introduced so that a maximum of one molecule is present in a large number of extremely small spaces (for example, minute droplets). Then, the detection target in each extremely small space is detected, and its existence is quantified by 0 or 1. As a result, in the digital method, the detection target can be detected with high sensitivity and quantitatively.
  • the procedure 2 includes the following procedures 2A1 to 2A3.
  • Step 2A1 A lower layer portion in which a plurality of accommodating portions capable of accommodating influenza virus and bacteria are separated from each other by a partition wall having a hydrophobic upper surface, and a surface in which the accommodating portion is formed in the lower layer portion.
  • Step 2A2 A procedure for introducing a hydrophobic solvent into the space to form droplets of a sample solution in the container, which is coated with the hydrophobic solvent and contains influenza virus and / or bacteria.
  • Step 2A3 A step of detecting signals generated from the probe 1 and the probe 2 in the droplet.
  • the array 101 has a flow cell structure in which the lower layer portion 111 and the upper layer portion 121 are arranged so as to face each other with the space 131 as a fluid flow path.
  • a plurality of accommodating portions 114 capable of accommodating influenza virus and / or bacteria are formed in the lower layer portion 111.
  • the accommodating portions 114 are separated from each other by a partition wall 113 having a hydrophobic upper surface.
  • the upper layer portion 121 faces the surface of the lower layer portion 111 on which the accommodating portion 114 is formed, with the space 131 separated from the space 131.
  • the sample liquid 4 is introduced into the space 131.
  • the sample liquid 4 contains the probe 1 and the probe 2.
  • the sample solution 4 may contain influenza virus or bacteria 3.
  • the sample liquid 4 can be introduced into the space 131 from a through hole (not shown) formed in at least one of the upper layer portion 121 and the lower layer portion 111, for example.
  • the sample liquid 4 introduced into the space 131 flows through the space 131 according to the capillary phenomenon and is filled in the space 131.
  • a surfactant may be added to the sample liquid 4. By adding the surfactant, the sample liquid 4 tends to be easily introduced into the space 131 and the accommodation portion 114.
  • the surfactant is not particularly limited, for example, TWEEN 20 (CAS number: 9005-64-5, polyoxyethylene sorbitan monolaurate) and Triton X-100 (CAS number: 9002-93-1, general name polyethylene glycol mono) -4-octylphenyl ether (n ⁇ 10)) and the like.
  • the concentration of the surfactant added to the sample liquid 4 is not particularly limited, but is preferably 0.01 to 1%.
  • anionic surfactants anionic surfactants, cationic surfactants, nonionic surfactants, zwitterionic surfactants, naturally-occurring surfactants, etc. can be widely used.
  • Anionic surfactants are classified into, for example, carboxylic acid type, sulfuric acid ester type, sulfonic acid type, and phosphoric acid ester type.
  • carboxylic acid type sulfuric acid ester type, sulfonic acid type, and phosphoric acid ester type.
  • Cations are classified into, for example, quaternary ammonium salt type, alkylamine type, and heterocyclic amine type. Specific examples include stearyl trimethyl ammonium chloride, distearyl dimethyl ammonium chloride, didecyl dimethyl ammonium chloride, cetyl tripyridinium chloride, dodecyl dimethyl benzyl ammonium chloride, and the like.
  • nonionic surfactant examples include polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, polyoxyethylene monofatty acid ester, polyoxyethylene sorbitan monofatty acid ester, sucrose fatty acid ester, polyglycerin fatty acid ester, alkyl polyglycoside. , N-methylalkyl glycamide and the like.
  • Triton X such as Triton X-100
  • Pluronic registered trademark
  • Tween Tween 20, 40
  • Brij® Brij®
  • Brij® Brij®
  • Span Span 20, 40, 60, 80, 83, 85.
  • amphoteric surfactant examples include betayl lauryldimethylaminoacetate, dodecylaminomethyldimethylsulfopropylbetaine, 3-(tetradecyldimethylaminio)propane-1-sulfonate, and 3-[(3-colamide It is preferable to use propyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate (CHAPS), 3-[(3-colamidopropyl)dimethylammonio]-2-hydroxy-1-propanesulfonate (CHAPSO), or the like.
  • lecithin and saponin are preferable, and among the compounds referred to as lecithin, specifically, phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol, phosphatidylserine, phosphatidyl acid, phosphatidylglycerol and the like are used. preferable.
  • saponin Kiraya saponin is preferable.
  • the probe 1, the probe 2, and the influenza virus or bacteria 3 are introduced into the container 114. If the influenza virus or bacterium is diluted to a sufficiently low concentration in the sample solution 4, the number of the influenza virus or bacterium 3 in one container 114 can be 0 or at most 1. When the concentration of influenza virus or bacterium is higher in the sample liquid 4, two or more viruses 2 can be introduced into one container 114.
  • Encapsulation procedure 2A2 The encapsulation procedure 2A2 will be described with reference to FIG. 2B. In this procedure, the hydrophobic solvent 5 is introduced into the space 131 between the lower layer portion 111 and the upper layer portion 121.
  • the hydrophobic solvent 5 may be any solvent (immiscible solvent) that does not easily mix with the sample liquid 4, and a hydrophobic solvent is preferably used for the sample liquid 4 which is a hydrophilic solvent.
  • a hydrophobic solvent for example, at least one selected from the group consisting of saturated hydrocarbons, unsaturated hydrocarbons, aromatic hydrocarbons, silicone oils, perfluorocarbons, halogen-based solvents, and hydrophobic ionic liquids, or a mixture thereof. A mixture etc. can be used conveniently.
  • saturated hydrocarbons include alkanes and cycloalkanes.
  • alkanes include decane and hexadecane.
  • unsaturated hydrocarbons include squalene and the like.
  • the hydrophobic ionic liquid refers to an ionic liquid that does not dissociate at least in water, and examples thereof include 1-Butyl-3-methylimidazolium Hexafluorophosphate.
  • An ionic liquid refers to a salt that exists as a liquid at room temperature.
  • the hydrophobic solvent 5 may also be introduced into the space 131 from a through hole (not shown) formed in at least one of the upper layer portion 121 and the lower layer portion 111, similarly to the sample liquid 4.
  • the hydrophobic solvent 5 introduced into the space 131 flows through the space 131 according to a capillary phenomenon and replaces the sample liquid 4 in the space 131.
  • the replaced sample liquid 4 is discharged out of the space 131.
  • a droplet of the sample solution 4 which is coated with the hydrophobic solvent 5 and contains the probe 1, the probe 2, and the influenza virus or the bacterium 3 is formed in the housing portion 114.
  • the volume of the droplet (approximately equal to the volume of the accommodating portion 114) may be extremely small, for example, 10 aL to 100 nL, preferably 1 fL to 1 pL.
  • the reaction between the influenza virus or bacterial neuraminidase and the probe 1 and probe 2 proceeds in a very small volume of the droplet of the sample solution 4.
  • the space 131 may be degassed between the introduction procedure 2A1 and the encapsulation procedure 2A2.
  • the degassing method for example, a method of leaving the array 101 in a reduced pressure environment, a method of cooling the array 101, or the like can be preferably used.
  • the array 101 is left in a decompression desiccator at about 0.1 atm for about 30 seconds.
  • the degassing procedure is not essential, but by performing the degassing, the air in the container 114 is removed, and the probe 1, the probe 2, and the influenza virus or bacteria 3 are efficiently stored in the container 114. Can be introduced.
  • Detection procedure 2A3 In this procedure, the signals from the probe 1 and the probe 2 generated in the droplet of the sample liquid 4 are detected.
  • the number of influenza viruses or bacteria 3 that can be contained in one storage portion 114 is 0 or 1 at the maximum.
  • Droplets containing either influenza virus or bacteria are formed in part 114.
  • Fluorescence of 4-methylumbelliferone (4MU) generated from a droplet encapsulating influenza virus in a digital method using 4MU-NANA as probe 1 and HMRef-S-Neu5Ac as probe (2) as compound (1) 2D shows an example of the image detected by the CCD camera. Two signal-positive droplets can be confirmed in the detection area. Blue fluorescence (wavelength 443 nm) emitted by 4 MU has been detected from droplets in which influenza virus is present. When a baccriteria is present in the droplet, blue fluorescence (wavelength 443 nm) emitted by 4MU and green fluorescence (wavelength: 518 nm) emitted by HMRef are detected.
  • the right diagram of FIG. 2D is an example of an image obtained by capturing an area in which no signal-positive droplet is present.
  • the amount of influenza virus can also be determined quantitatively (digital quantification). It should be noted that if at least one accommodation unit 114 in which the influenza virus is detected exists, the test sample may be determined to be positive for influenza. Such a determination method is useful for determining the presence or absence of influenza in the early stage of infection when the number of influenza viruses in the sample is extremely small.
  • Procedure 2 includes the following procedures 2B1 to 2B3.
  • Step 2B1 A step of introducing the sample liquid onto a substrate in which a plurality of storage units capable of storing influenza viruses and bacteria are separated from each other by a partition having a hydrophobic upper surface.
  • Step 2B2 A hydrophobic solvent having a specific gravity higher than that of the sample liquid is introduced so as to be laminated on the sample liquid layer, and layer substitution between the sample liquid layer and the hydrophobic solvent layer is caused, thereby causing the layer to be replaced in the container.
  • Procedure 2B3 Detection procedure for detecting signals generated from the probe 1 and the probe 2 in the droplet.
  • the figure is a cross-sectional side view of the array 201.
  • the array 201 includes a lower layer portion 211.
  • the array 201 has a region 21 that is partitioned downward and both sides by a lower layer 211 and side walls 221,221, and the upper side is open. That is, the lower layer portion 211 and the side walls 221,221 form an opening well having an opening at the upper side.
  • the space in the opening well is shown as region 21 in the figure.
  • a plurality of accommodating portions 214 capable of accommodating influenza virus and / or bacteria are formed in the lower layer portion 211.
  • the accommodating portions 214 are separated from each other by a partition wall 213 having a hydrophobic upper surface.
  • the lower layer portion 211 does not have a surface facing it.
  • the sample liquid 4 is introduced onto the lower layer 211.
  • the sample liquid 4 contains the probe 1 and the probe 2.
  • the sample solution 4 may contain influenza virus or bacteria 3.
  • the sample liquid can be introduced into the region 21 from the opening of the opening well, for example.
  • a surfactant may be added to the sample liquid 4.
  • the addition of the surfactant can accelerate the replacement of the sample liquid 4 with the hydrophobic solvent in the encapsulation procedure described below.
  • the surfactant the above-mentioned ones can be used.
  • the hydrophobic solvent 5 is introduced so as to be laminated on the layer of the sample liquid 4.
  • the method for introducing the hydrophobic solvent 5 is not particularly limited, but for example, it can be introduced into the region 21 from the opening of the opening well.
  • the hydrophobic solvent 5 is preferably introduced so that the layer of the hydrophobic solvent 5 is laminated on the layer of the sample solution 4.
  • the hydrophobic solvent 5 a solvent having a specific gravity larger than that of the sample solution 4 is used. Further, it is preferable that the hydrophobic solvent 5 has amphipathic properties with each other to the extent that it can be layer-replaced with the sample solution 4, but it is necessary that the solvent is incompatible with each other. If the amphipathicity between the sample solution 4 and the hydrophobic solvent 5 is too low, layer substitution between the sample solution 4 and the hydrophobic solvent 5 does not occur. Further, when the sample liquid 4 and the hydrophobic solvent 5 are compatible with each other, the sample liquid 4 and the hydrophobic solvent 5 are not layer-separated, and a laminated state does not occur. As such a hydrophobic solvent, the above-mentioned one can be used. “Table 1” lists the specific gravities of the exemplary hydrophobic solvent 5. The hydrophobic solvent 5 may contain a surfactant in order to promote layer substitution, as in the sample solution 4.
  • the hydrophobic solvent 5 introduced and laminated on the sample liquid 4 has a specific gravity larger than that of the sample liquid 4, and therefore moves below the sample liquid 4. That is, when the layer of the sample liquid 4 and the layer of the hydrophobic solvent 5 are replaced with each other, the upper layer is the hydrophobic solvent 5 and the lower layer is the sample liquid 4 (see FIG. 3-1B). The lower layer is in the state of the hydrophobic solvent 5 (see FIG. 3-3H).
  • the manner in which layer replacement occurs is schematically shown in FIGS. 3-1C to 3-3G.
  • the probe 1, the probe 2, and the influenza virus or bacterium 3 are accommodated in each of the accommodating portions 214 so as to be pushed by the hydrophobic solvent 5 that moves downward in the sample liquid 4 ( See FIGS. 3-2D to F).
  • a droplet of the sample solution 4 which is coated with the hydrophobic solvent 5 and contains the probe 1, the probe 2 and the influenza virus or the bacterium 3 is formed in the housing portion 214.
  • the volume of the droplet (approximately equal to the volume of the accommodating portion 214) may be extremely small, for example, 10 aL to 100 nL, preferably 1 fL to 1 pL.
  • the reaction between the influenza virus or bacterial neuraminidase and the probe 1 and probe 2 proceeds in a very small volume of the droplet of the sample solution 4.
  • Detection procedure 2B3 In this procedure, the signals from the probe 1 and the probe 2 generated in the droplet of the sample liquid 4 are detected.
  • the number of influenza viruses or bacteria 3 that can be contained in one storage unit 214 is 0 or 1 at the maximum. Droplets containing either influenza virus or bacteria are formed in part 214.
  • the signal generated from the probe 1 is detected in each droplet and the signal generated from the probe 2 is not detected, the influenza virus can be detected in the droplet.
  • the signal generated from the probe 1 and the signal generated from the probe 2 are detected, the presence of bacteria (absence of influenza virus) can be detected in the droplet.
  • the amount of influenza virus can also be determined quantitatively (digital quantification).
  • influenza virus detection kit and influenza infection diagnostic kit The influenza virus detection kit according to the present invention is for detecting influenza virus in a biological sample isolated from a subject infected with or suspected of being infected with influenza virus. It is a kit.
  • the influenza virus detection kit according to the present invention is used for diagnosing the presence or absence of influenza infection in a subject.
  • the influenza virus detection kit according to the present invention comprises the above-mentioned probe 1 and probe 2, and may optionally include the above-mentioned hydrophobic solvent and array 101 or array 201. .. These kit components may be sold as a group, or may be sold individually.
  • the probe 1, probe 2 and hydrophobic solvent are as described above. More detailed structures of the array 101 and the array 201 will be described below. As a technique such as photolithography, etching, and substrate stacking for manufacturing the arrays 101 and 201, a technique for manufacturing a general-purpose microchip or array can be applied.
  • the material of the upper layer portion 121 may be, for example, glass, silicon, a polymer resin, or the like.
  • the thickness of the upper layer portion 121 is not particularly limited.
  • the lower surface of the upper layer 121 (the surface facing the space 131) is preferably hydrophobic. “Hydrophobic” is used here in the same meaning as “lipophilic” and means that the affinity with a hydrophobic solvent is higher than the affinity with a hydrophilic solvent.
  • the accommodating portion 114 is separated from each other by a partition wall 113 formed on the plate-shaped member 112.
  • the bottom surface of the accommodating portion 114 may be the surface of the plate-shaped member 112.
  • the material of the plate-shaped member 112 can be, for example, glass, silicon, polymer resin, or the like.
  • the thickness of the plate-shaped member 112 is not particularly limited.
  • the partition wall 113 can be formed by a resin layer formed on the surface of the plate-shaped member 112, and can be formed by etching, for example, a water-repellent resin or a fluoropolymer resin.
  • the fluoropolymer resin include amorphous fluororesins. Amorphous fluororesins are preferably used because they have high hydrophobicity and low toxicity to biological samples.
  • As the amorphous fluororesin for example, at least one selected from CYTOP (registered trademark), TEFLON (registered trademark) AF2400, and TEFLON (registered trademark) AF1600 can be preferably used.
  • CYTOP registered trademark
  • CYTOP registered trademark
  • CYTOP registered trademark
  • CYTOP registered trademark
  • the shape of the accommodating portion 114 is not particularly limited, and may be, for example, a cylindrical shape, a prismatic shape, or the like.
  • the size of the accommodating portion 114 is not particularly limited as long as it can accommodate influenza virus and / or bacteria, but the horizontal width and the vertical height (height of the partition wall 113) are, for example, 100 nm-100 ⁇ m, respectively.
  • one million or more accommodating portions 114 may be arranged at high density. Even with such an ultra-high density array, according to the encapsulation procedure described above, the sample solution 4 coated with the hydrophobic solvent 5 and containing the probe 1, the probe 2, and the influenza virus or bacteria 3 is The droplets can be efficiently formed in each containing portion 114.
  • the upper surface of the partition 113 (the surface facing the upper layer portion 121) is preferably hydrophobic. Further, it is preferable that the surface of the plate-shaped member 112 forming the bottom surface of the accommodating portion 114 is hydrophilic. "Hydrophilic" refers to a surface that has a higher affinity for a hydrophilic solvent than that for a hydrophobic solvent. Since the bottom surface of the accommodating portion 114 is hydrophilic and the upper surface of the partition wall 113 and the lower surface of the upper layer portion 121 are hydrophobic, the sample liquid 4 can be smoothly introduced into the accommodating portion 114 in the introduction procedure 2A1. it can.
  • the bottom surface of the container 114 is hydrophilic and the top surface of the partition wall 113 is hydrophobic, it is possible to prevent the hydrophobic solvent 5 from entering the container 114 in the encapsulation procedure 2A2.
  • the upper surface of the partition wall 113 may be hydrophobic, and the side surface (the surface facing the accommodating portion 114) may be hydrophobic or hydrophilic.
  • the distance (height of the space 131) between the lower surface of the upper layer portion 121 (the surface facing the space 131) and the upper surface of the partition wall 113 (the surface facing the upper layer portion 121) is such that the liquid passes through the space 131 in accordance with the capillary phenomenon. It is made small enough to be washed away.
  • the height of the space 131 is, for example, 0.1 ⁇ m-5 mm, 0.5 ⁇ m-4 mm, 1 ⁇ m-3 mm, 2 ⁇ m-2 mm, 5 ⁇ m-1 mm, 10 ⁇ m-500 ⁇ m, 20 ⁇ m-400 ⁇ m, 30 ⁇ m-300 ⁇ m, 40 ⁇ m-200 ⁇ m, 50 ⁇ m-. It is in the range of 100 ⁇ m. If the height is less than 0.1 ⁇ m, the liquid sending pressure required to flow the liquid into the space 131 may be too high.
  • the lower layer portion 211 of the array 201 may have the same configuration as the lower layer portion 111 of the array 101, and the plate-shaped member 212 and the partition wall 213 constituting the lower layer portion 211 are also the same as the plate-shaped member 112 and the partition wall 113 of the array 101. It may be the configuration of. Further, the accommodating portion 214 may have the same configuration as the accommodating portion 114 of the array 101.
  • the side wall 221 is made of the same material as the plate-shaped member 212, and may be the surface of a member made of, for example, glass, silicon, or a polymer resin.
  • the height of the side wall 221 is arbitrary, but needs to exceed the total thickness of the sample liquid 4 layer and the hydrophobic solvent 5 layer in a laminated state.
  • the bottom surface of the accommodating portion 214 is hydrophilic and the upper surface of the partition wall 213 is hydrophobic, it is possible to prevent the hydrophobic solvent 5 from entering the accommodating portion 214 in the encapsulation procedure 2B2.
  • the NMR spectrum was obtained by a Bruker NMR AVANCE III 400 spectrometer [1H (400 MHz), 13C (101 MHz)] using deuterated solvent.
  • High resolution ESI mass spectra were obtained with microOTOF II (Bruker).
  • HPLC purification was performed on JASCO PU-2087 Plus pumps (GL Science Co., Ltd.) and UVIDEC-100 equipped with Inerttil-ODS-3 columns ( ⁇ 10 ⁇ 250 mm (semi-preparation) and ⁇ 20 ⁇ 250 mm (preparation)).
  • -V detector JASCO
  • Silica gel column chromatography was performed using silica gel 60N (spherical, neutral, 63 to 210 ⁇ m; manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.). TLC was performed on silica gel plate F254 (0.25 mm (analysis); Merck, AKG). The UV-vis spectrum was obtained with a Shimadzu UV-2450 spectrophotometer.
  • HMRef-S-Neu5Ac was synthesized according to the procedure of the following reaction scheme.
  • HMRef (79 mg, 0.2 mmol) and NaH (6 mg, 0.26 mmol) were added dry THF (3 mL) and dry DMF (1 mL) and the mixture was stirred under argon at 0 °C.
  • EtOAc (20 mL) was added and the mixture was washed with saturated NH 4 Cl solution (x2) and saturated saline (x1).
  • the organic layer was dried over sodium sulfate and distilled off under reduced pressure. The residue was dissolved in MeOH (6 mL) and 1 M NaOH (aqueous solution) was added (3 mL).
  • a probe (HMRef-S-Neu5Ac) was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO, fluorescence measurement grade, Dojin Chemical Laboratory) to obtain a stock solution. Further, the stock solution was diluted with a buffer solution (100 mM NaOAc, 2 mM CaCl 2 , pH 7.4) so that the final concentration of the probe was 1 ⁇ M to obtain a measurement solution.
  • the fluorescence spectrum of the measurement solution was measured every second using Hitachi F-7000 (excitation wavelength 490 nm, emission wavelength 520 nm). 60 seconds after the start of the measurement, 0.01 U of neuraminidase derived from Arthrobacter ureafaciens was added alone or in combination with an enzyme inhibitor. The measurement temperature was 37° C., and the enzyme inhibitor (DANA) concentration was 100 ⁇ M.
  • HMRef-S-Neu5Ac showed a 130-fold increased fluorescence in reaction with bacterial neuraminidase. Similar results were obtained when neuraminidase derived from Clostridium perfringens was used. Clostridium perfringens is a bacterium that is resident in humans and is also resident in the upper respiratory tract mucosa including the oral cavity.
  • HMRef-S-Neu5Ac Reactivity of HMRef-S-Neu5Ac with influenza-derived neuraminidase
  • HMRef-S-Neu5Ac was examined in the same manner as in Test Example 1 with respect to the time-dependent change in fluorescence intensity associated with the enzyme reaction with the neuraminidase derived from influenza eurus.
  • the probe was used for 4MU-NANA (positive control) in addition to HMRef-S-Neu5Ac.
  • the final concentration of the probe in the measurement solution was HMRef-S-Neu5Ac 100 ⁇ M, 4MU-NANA 1 mM.
  • Influenza virus A / PR8 Institute of Medical Science II was added to the measurement solution at 5 ⁇ 10 7 PFU / mL, and fluorescence spectrum measurement was started (excitation wavelength 360 nm, emission wavelength 448 nm).
  • the temperature at the time of measurement was 25°C.
  • HMRef-S-Neu5Ac has reactivity to a bacterial neuraminidase but does not have a reactivity to influenza-derived neuraminidase. It was
  • probe 1 probe 1, 2: probe 2, 3: influenza virus or bacterium, 4: sample solution, 5: hydrophobic solvent, 101, 201: array, 111, 211: lower layer part, 112, 212: plate-like member, 113 , 213: partition wall, 114, 214: accommodating portion, 121: upper layer portion, 131: space, 21: region, 221: side wall

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Abstract

インフルエンザウイルスを改善された確度で検出するための技術として、インフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼ及びバクテリア由来のノイラミニダーゼの双方により分解されて光学的に検出可能な信号を生成する第一のプローブと、バクテリア由来のノイラミニダーゼにより分解されて光学的に検出可能な信号を生成しかつインフルエンザ由来のノイラミニダーゼにより分解されない第二のプローブとを用いた、生物試料中のインフルエンザウイルス検出方法を提供する。

Description

[規則26に基づく補充 07.04.2020]　インフルエンザウイルス検出のための方法及びキット、並びにインフルエンザウイルス感染の診断方法
　本発明は、インフルエンザウイルス検出のための方法及びキット、並びにインフルエンザイウイルス感染の診断方法に関する。より詳しくは、インフルエンザ由来のノイラミニダーゼとバクテリア由来のノイラミニダーゼとに対して異なる反応性を示す基質を用いた、インフルエンザウイルスの検出方法等に関する。
　近年、イムノクロマトグラフィを用いた簡易なインフルエンザウイルス検査キットが開発されている（特許文献１参照）。イムノクロマトグラフィを用いる方法は、数分から数十分の間にインフルエンザウイルスを検出できるので、感染の診断や治療等に活用されている。
　また、従来、インフルエンザウイルスが有する酵素であるノイラミニダーゼ（シアリダーゼ）と発色基質との反応に基づいて光学的にインフルエンザウイルスを検出する技術が知られている（特許文献２、３参照）。ノイラミニダーゼは、糖鎖の非還元末端からシアル酸を遊離するエキソ型糖分解酵素である。ノイラミニダーゼは、インフルエンザウイルスの表面に存在し、ウイルスの増殖に関与している。発色基質としては、例えば、４－メチルウンベリフェリル－α－Ｄ－ノイラミン酸（４－Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ－Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－α－Ｄ－ｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ　ａｃｉｄ：４ＭＵ－ＮＡＮＡ、特許文献２参照）や、４－アルコキシ－Ｎ－アセチルノイラミン酸又は４，７－ジアルコキシ－Ｎ－アセチルノイラミン酸の化学発光誘導体（特許文献３参照）などが用いられている。例えば、発色基質として４ＭＵ－ＮＡＮＡを用いた方法では、ノイラミニダーゼによる４ＭＵ－ＮＡＮＡの分解によって蛍光物質である４－メチルウンベリフェロンが生成する。生成した４－メチルウンベリフェロンの蛍光強度に基づいてノイラミニダーゼの酵素活性値を算出することができ、さらに酵素活性値に基づいてインフルエンザウイルスの粒子数を定量することができる。
　特許文献４には、ヒトにおいてインフルエンザがヒトインフルエンザであるかヒト病原性トリインフルエンザであるかを検出するためのキットが開示されている（実施例７参照）。このキットは、ガラクトースに結合したN-グリコリルノイラミン（NeuGcα2-3Gal）酸を含む基質と、ガラクトースに結合したN-アセチルノイラミン酸（NeuAcα2-3Gal）を含む基質とを含んでなる。これら２種類の基質と臨床検体とを接触させ、NeuAcα 2-3Galに基づいた基質のみが切断されればヒトインフルエンザウイルス陽性と判定され、NeuAcα 2-3Galに基づいた基質及びNeuGcα 2-3Galに基づいた基質の双方が切断されればヒト病原性トリインフルエンザウイルス陽性と判断される。
　特許文献５には、デジタル法によるインフルエンザウイルスの検出方法が記載されている。デジタル法では、多数の極小空間（例えば微小液滴）中に検出対象物を最大で１分子ずつ存在するように導入する。そして、各極小空間内の検出対象物を検出し、その存在を０又は１で数値化する。これによって、デジタル法では、検出対象物を高感度かつ定量的に検出することが可能である。特許文献６，７には、物質を極小空間中に封入（Enclose）するための方法であって、デジタル法に適用可能な技術が記載されている。
特開２００８－２７５５１１号 特開２０１１－１３９６５６号 特表２００２－５４１８５８号 特表２００９－５１６５０２号 特開２０１８－０３８３８４号 再表２０１２－１２１３１０号 再表２０１６－００６２０８号
　上部気道粘膜に常在するバクテリアには、ノイラミニダーゼを有するものがある。このため、鼻腔ぬぐい液等を試料に用いた、イラミニダーゼと基質との反応に基づくインフルエンザウイルスの検出方法では、バクテリア由来のノイラミニダーゼに起因する信号が擬陽性として検出される可能性がある。
　そこで、本発明は、インフルエンザ由来のノイラミニダーゼとバクテリア由来のノイラミニダーゼに対して異なる反応性を示す基質を用い、インフルエンザウイルスを改善された確度で検出するための技術を提供することを主な目的とする。
　上記の課題を解決するために、本発明は、以下の［１］～［１８］を提供する。
［１］　生物試料中のインフルエンザウイルスあるいはインフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼを検出する方法であって、
（１）前記生物試料を、第一のプローブと第二のプローブと混合する手順１、
　ここで、前記第一のプローブは、インフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼ及びバクテリア由来のノイラミニダーゼの双方により分解されて光学的に検出可能な信号を生成するものであり、
　前記第二のプローブは、バクテリア由来のノイラミニダーゼにより分解されて光学的に検出可能な信号を生成しかつインフルエンザ由来のノイラミニダーゼにより分解されないものであり、
　前記第一のプローブから生成する信号と前記第二のプローブから生成する信号は光学的に区別して検出可能である、と、
（２）前記第一のプローブ及び前記第二のプローブから生成する信号を検出する手順２と、を含み、
（Ａ）前記第二のプローブから生成する信号の強度に対する前記第一のプローブから生成する信号の強度の比が所定値以上である場合に、前記生物試料中のインフルエンザウイルスあるいはインフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼの存在を検出し、
前記比が前記所定値未満である場合に、前記生物試料中のインフルエンザウイルスあるいはインフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼの不存在を検出する、又は、
（Ｂ）前記第一のプローブから生成する信号が検出され、前記第二のプローブから生成する信号が検出されない場合に、前記生物試料中のインフルエンザウイルスあるいはインフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼの存在を検出し、
前記第一のプローブから生成する信号及び前記第二のプローブから生成する信号が検出された場合に、前記生物試料中のインフルエンザウイルスあるいはインフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼの不存在を検出する、
検出方法。
［２］　前記第二のプローブが以下の式（１）で表わされる化合物又はその塩である、［１］の検出方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 （式中、
Ｒ1は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；
Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ6は、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、又は炭素数１～５個のフッ化アルキル基を示し；
Ｒ7及びＲ8は、存在する場合は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基を示し、
ここで、Ｘが酸素原子の場合は、Ｒ7及びＲ8は存在せず；
Ｒ9は、各出現において独立に、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基から選択され；
Ｒ10は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；Ｘは、酸素原子、珪素原子又は炭素原子を示し；
ｍは、０～４の整数であり；
ｎは、１～３の整数であり；
ｓは、１の整数であり；
ｔは、０～４の整数である。）
［３］　式（１）中、Ｒ6が－ＣＨ2－ＣＦ3である、［２］の検出方法。
［４］　前記第一のプローブが、２´－（４－メチルウンベリフェリル）－α－Ｄ－Ｎ－アセチルノイラミン酸（4MU-NANA）である、［１］－［３］のいずれかの検出方法。
［５］　前記第一のプローブから生成する信号が検出され、前記第二のプローブから生成する信号が検出されない場合に、前記生物試料中のインフルエンザウイルスあるいはインフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼの存在を検出し、
前記第一のプローブから生成する信号及び前記第二のプローブから生成する信号が検出された場合に、前記生物試料中のインフルエンザウイルスあるいはインフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼの不存在を検出する、［１］－［４］のいずれかの検出方法。
［６］　デジタル法に基づく、［１］－［５］のいずれかの検出方法。
［７］　インフルエンザウイルスに感染した対象又は感染した疑いがある対象から分離された生物試料中のインフルエンザウイルスあるいはインフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼを検出するためのキットであって、
　インフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼ及びバクテリア由来のノイラミニダーゼの双方により分解されて光学的に検出可能な信号を生成する第一のプローブと、
　バクテリア由来のノイラミニダーゼにより分解されて光学的に検出可能な信号を生成しかつインフルエンザ由来のノイラミニダーゼにより分解されない第二のプローブと、を含み、
　前記第二のプローブが以下の式（１）で表わされる化合物又はその塩である、キット。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 （式中、
Ｒ1は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；
Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ6は、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、又は炭素数１～５個のフッ化アルキル基を示し；
Ｒ7及びＲ8は、存在する場合は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基を示し、
ここで、Ｘが酸素原子の場合は、Ｒ7及びＲ8は存在せず；
Ｒ9は、各出現において独立に、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基から選択され；
Ｒ10は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；Ｘは、酸素原子、珪素原子又は炭素原子を示し；
ｍは、０～４の整数であり；
ｎは、１～３の整数であり；
ｓは、１の整数であり；
ｔは、０～４の整数である。）
［８］　式（１）中、Ｒ6が－ＣＨ2－ＣＦ3である、［７］のキット。
［９］　前記第一のプローブが、２´－（４－メチルウンベリフェリル）－α－Ｄ－Ｎ－アセチルノイラミン酸（4MU-NANA）である、［７］又は［８］のキット。
［１０］　以下の式（１）で表わされる化合物又はその塩の、インフルエンザウイルスあるいはインフルエンザ由来ノイラミニダーゼをバクテリアあるいはバクテリア由来ノイラミニダーゼと識別検出するための使用。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 （式中、
Ｒ1は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；
Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ6は、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、又は炭素数１～５個のフッ化アルキル基を示し；
Ｒ7及びＲ8は、存在する場合は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基を示し、
ここで、Ｘが酸素原子の場合は、Ｒ7及びＲ8は存在せず；
Ｒ9は、各出現において独立に、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基から選択され；
Ｒ10は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；Ｘは、酸素原子、珪素原子又は炭素原子を示し；
ｍは、０～４の整数であり；
ｎは、１～３の整数であり；
ｓは、１の整数であり；
ｔは、０～４の整数である。）
［１１］　式（１）中、Ｒ6が－ＣＨ2－ＣＦ3である、［１０］の使用。
［１２］　インフルエンザウイルスあるいはインフルエンザ由来ノイラミニダーゼをバクテリアあるいはバクテリア由来ノイラミニダーゼと識別検出するための試薬であって、以下の式（１）で表わされる化合物又はその塩を含む試薬。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 （式中、
Ｒ1は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；
Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ6は、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、又は炭素数１～５個のフッ化アルキル基を示し；
Ｒ7及びＲ8は、存在する場合は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基を示し、
ここで、Ｘが酸素原子の場合は、Ｒ7及びＲ8は存在せず；
Ｒ9は、各出現において独立に、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基から選択され；
Ｒ10は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；Ｘは、酸素原子、珪素原子又は炭素原子を示し；
ｍは、０～４の整数であり；
ｎは、１～３の整数であり；
ｓは、１の整数であり；
ｔは、０～４の整数である。）
［１３］　式（１）中、Ｒ6が－ＣＨ2－ＣＦ3である、［１２］の試薬。
［１４］　対象のインフルエンザウイルスへの感染の有無を診断する方法であって、
（１）インフルエンザウイルスに感染した対象又は感染した疑いがある対象から分離された生物試料を、第一のプローブと第二のプローブと混合する手順１、
　ここで、前記第一のプローブは、インフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼ及びバクテリア由来のノイラミニダーゼの双方により分解されて光学的に検出可能な信号を生成するものであり、
　前記第二のプローブは、バクテリア由来のノイラミニダーゼにより分解されて光学的に検出可能な信号を生成しかつインフルエンザ由来のノイラミニダーゼにより分解されないものであり、
　前記第一のプローブから生成する信号と前記第二のプローブから生成する信号は光学的に区別して検出可能である、と、
（２）前記第一のプローブ及び前記第二のプローブから生成する信号を検出する手順２と、を含み、
（Ａ）前記第二のプローブから生成する信号の強度に対する前記第一のプローブから生成する信号の強度の比が所定値以上である場合に、前記対象のインフルエンザウイルスの感染を決定すし、
　前記比が前記所定値未満である場合に、前記対象のインフルエンザウイルスの非感染を決定する、又は、
（Ｂ）前記第一のプローブから生成する信号が検出され、前記第二のプローブから生成する信号が検出されない場合に、前記対象のインフルエンザウイルスの感染を決定し、
前記第一のプローブから生成する信号及び前記第二のプローブから生成する信号が検出された場合に、前記対象のインフルエンザウイルスの非感染を決定する、
診断方法。
［１５］　式（１）中、Ｒ6が－ＣＨ2－ＣＦ3である、［１４］の診断方法。
［１６］　前記第一のプローブが、２´－（４－メチルウンベリフェリル）－α－Ｄ－Ｎ－アセチルノイラミン酸（4MU-NANA）である、［１４］又は［１５］の診断方法。
［１７］　前記第一のプローブから生成する信号が検出され、前記第二のプローブから生成する信号が検出されない場合に、前記対象のインフルエンザウイルスの感染を決定し、前記第一のプローブから生成する信号及び前記第二のプローブから生成する信号が検出された場合に、前記対象のインフルエンザウイルスの非感染を決定する、［１４］－［１６］のいずれかの診断方法。
［１８］　デジタル法に基づく、［１４］－［１７］のいずれかの診断方法。
　本明細書において、「アルキル基」又はアルキル部分を含む置換基（例えばアルコキシ基など）のアルキル部分は、特に言及しない場合には例えば炭素数１～６個、好ましくは炭素数１～４個、更に好ましくは炭素数１～３個程度の直鎖、分枝鎖、環状、又はそれらの組み合わせからなるアルキル基を意味している。より具体的には、アルキル基として、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、シクロプロピルメチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基などを挙げることができる。
　本明細書において「ハロゲン原子」という場合には、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよく、好ましくはフッ素原子、塩素原子、又は臭素原子である。
　本発明により、インフルエンザウイルスを改善された確度で検出するための技術が提供される。
式（１）で表される化合物の一例である「ＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃ」と、４ＭＵ－ＮＡＮＡのインフルエンザウイルス又はバクテリアのノイラミニダーゼによる酵素加水分解のスキームを示す。 本発明に係るインフルエンザウイルス検出方法の手順２の一実施形態を説明するための図である。 本発明に係るインフルエンザウイルス検出方法の手順２の他の実施形態を説明するための図である。 本発明に係るインフルエンザウイルス検出方法の手順２の他の実施形態を説明するための図である。 本発明に係るインフルエンザウイルス検出方法の手順２の他の実施形態を説明するための図である。 アルスロバクター・ウレアファシエンス由来のノイラミニダーゼとの酵素反応に伴うＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃの蛍光強度の経時変化を示すグラフである（試験例１）。 インフルエンザイウルス由来のノイラミニダーゼとの酵素反応に伴うＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃ及び４ＭＵ－ＮＡＮＡの蛍光強度の経時変化を示すグラフである（試験例２）。
　以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
１．インフルエンザウイルスの検出方法及びインフルエンザ感染の診断方法
　本発明に係るインフルエンザウイルス検出方法は、インフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼによるプローブの加水分解の有無に基づいてインフルエンザウイルスを検出するものである。したがって、本発明において、「インフルエンザウイルスの検出」と「インフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼ」の検出とは同義に用いられる。
　本発明に係るインフルエンザウイルス検出方法は、以下の手順（ステップ）１，２を含む。
　手順１：生物試料を、第一のプローブと第二のプローブと混合する手順。
　手順２：第一のプローブ及び第二のプローブから生成する信号を検出する手順。
１－１．手順１（生物試料とプローブとの混合手順）
［生物試料］
　本発明において、生物試料は、インフルエンザウイルスが含まれ得る、生体由来の材料であれば特に限定されない。
　生物試料としては、例えば、鼻腔吸引液、鼻腔ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、気管ぬぐい液、唾液、喀痰、血液（全血、血清及び血漿を含む）、尿、細胞や組織、臓器の抽出液等が挙げられる。
　本発明に係るインフルエンザ感染の診断方法においては、生物試料は、インフルエンザウイルスに感染した対象又は感染した疑いがある対象から分離される。
　対象は、ヒトに限定されず、サル及びブタを含む哺乳類や、アヒル及びニワトリを含む鳥類であってよい。
［プローブ１］
　第一のプローブ（以下「プローブ１」と称する）は、インフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼ及びバクテリア由来のノイラミニダーゼの双方により加水分解されて光学的に検出可能な信号を生成する。
　本発明において、「バクテリア」（細菌）との用語は、古細菌を含む原核生物全般を指す最も広義な意味で使用されるが、特には生物試料中に常在しえる真性細菌を意味する。
　鼻腔、咽喉頭、口腔及び泌尿器等には、Actinomyces, Bacteroides, Clostridium, Corynebacterium, Enterobacteriaceae, Eubacterium, Fusobacterium, Haemophilus, Lactobacillus, Micrococcus, Mycobacterium, Mycoplasma, Neisseria, Peptostreptococcus, Porphyromonas, Prevotella, Propinibacterium, Salmonella, Staphylococcus, Streptococcus, Spirohaetaceae及びVeillonella等の各属に属する多種のバクテリアが常在しており、これらのバクテリアはノイラミニダーゼを有する場合がある。
　プローブ１は、シアル酸を含む化合物であって、インフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼ及びバクテリア由来ノイラミニダーゼの双方によりシアル酸のグリコシド結合が加水分解されて分解前の化合物とは異なる光学特性を示す反応生成物を生成するものであればよい。加水分解前のプローブ１の光学特性から、加水分解後に生成する反応生成物の光学特性への変化が、「光学的に検出可能な信号」として検出される。
　ここで、光学特性への変化とは、吸光度、旋光度及び屈折率の変化や、蛍光の有無あるいは強度の変化などを意味する。
　プローブ１として、ノイラミン酸又はその誘導体に発色団を結合した化合物が好適に用いられる。
　発色団は、蛍光物質又は化学発光物質であってよいが、蛍光物質とされること好ましい。蛍光物質には、例えば４－メチルウンベリフェロン（４－Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ）、フルオレセイン（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、レゾルフィン（Ｒｅｓｏｒｕｆｉｎ）及びローダミン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）などの公知の物質を用いることができる。
　このようなプローブ１としては、例えば、２´－（４－メチルウンベリフェリル）－α－Ｄ－Ｎ－アセチルノイラミン酸（４ＭＵ－ＮＡＮＡ）が汎用されている。４ＭＵ－ＮＡＮＡは、インフルエンザウイルス及びバクテリアに由来するノイラミニダーゼと接触して反応すると、蛍光物質である４－メチルウンベリフェロンを遊離させる。
［プローブ２］
　第二のプローブ（以下「プローブ２」と称する）は、インフルエンザ由来のノイラミニダーゼにより分解されず、バクテリア由来のノイラミニダーゼによってのみ分解されて光学的に検出可能な信号を生成する。
　プローブ２は、シアル酸を含む化合物であって、インフルエンザ由来ノイラミニダーゼにより分解されず、バクテリア由来ノイラミニダーゼによってシアル酸のグリコシド結合が加水分解されて分解前の化合物とは異なる光学特性を示す反応生成物を生成するものであればよい。加水分解前のプローブ２の光学特性から、加水分解後に生成する反応生成物の光学特性への変化が、「光学的に検出可能な信号」として検出される。
　プローブ２が生成する「光学的に検出可能な信号」は、プローブ１が生成する「光学的に検出可能な信号」とは異なるものとされる。すなわち、プローブ２が生成する信号と、プローブ１が生成する信号とは、光学的に区別して検出可能なものとされる。
　具体的には、例えばプローブ１が生成する信号が、吸光度、旋光度及び屈折率の変化である場合、プローブ２が生成する信号は、蛍光の有無あるいは強度の変化であってよい。あるいは、この場合、プローブ２が生成する信号は、プローブ１が生成する信号とは異なる波長域での吸光度旋光度及び屈折率の変化であってよい。
　また、例えばプローブ１が生成する信号が、蛍光の有無あるいは強度の変化である場合、プローブ２が生成する信号は、吸光度、旋光度及び屈折率の変化であってよい。あるいは、この場合、プローブ２が生成する信号は、プローブ１が生成する信号とは異なる波長域での蛍光の有無あるいは強度の変化であってよい。
　プローブ２としては、以下の式（１）で表わされる化合物又はその塩（以下、単に「化合物（１）」とも称する）が好適に用いられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　式（１）において、Ｒ1は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示す。一価の置換基としては、ハロゲン、置換されていてもよいアルキル基等が挙げられる。
　ｍは、０～４の整数である。
　本発明の１つの好ましい側面においては、ｍが０であり、Ｒ1存在せずに無置換のベンゼン環である。
　式（１）において、Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示す。
　Ｒ2及びＲ3がアルキル基を示す場合には、該アルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ2又はＲ3が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。Ｒ2及びＲ3がそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子であることが好ましく、Ｒ2及びＲ3がともにフッ素原子であるか、塩素原子である場合がより好ましい。
　Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基、又はハロゲン原子を示し、Ｒ2及びＲ3について説明したものと同様である。Ｒ4及びＲ5が共に水素原子であることが好ましい。
　Ｒ6は、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、又は炭素数１～５個のフッ化アルキル基を示す。Ｒ6のアルキル基としては、メチル基、エチル基が好ましい。Ｒ6のフッ化アルキル基としては、－ＣＨ2－ＣＦ3、－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＦ3が好ましい。
　本発明の１つの好ましい側面においては、Ｒ6は、－ＣＨ2－ＣＦ3である。
　式（１）において、Ｒ7及びＲ8は、存在する場合は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基を示すが、Ｒ7及びＲ8は、それぞれ独立に、炭素数１～３個のアルキル基であることが好ましく、Ｒ7及びＲ8がともにメチル基であることがより好ましい。Ｒ7及びＲ8が示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ7又はＲ8が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。
　Ｒ7又はＲ8がアリール基を示す場合には、アリール基は単環の芳香族基又は縮合芳香族基のいずれであってもよく、アリール環は１個又は２個以上の環構成ヘテロ原子（例えば窒素原子、酸素原子、又は硫黄原子など）を含んでいてもよい。アリール基としてはフェニル基が好ましい。アリール環上には１個又は２個以上の置換基が存在していてもよい。置換基としては、例えばハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよい。
　また、後述するＸが酸素原子の場合は、Ｒ7及びＲ8は存在しない。
　Ｒ9は、各出現において独立に、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基から選択され、好ましくは、水素原子である。
　ｓは、１の整数である。
　Ｒ10は、存在する場合、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示す。
　一価の置換基としては、ハロゲン、置換されていてもよいアルキル基等が挙げられる。
　ｔは、０～４の整数である。
　本発明の１つの好ましい側面においては、ｔが０であり、Ｒ10は存在せずに無置換のベンゼン環である。
　Ｘは、酸素原子、珪素原子又は炭素原子を示す。
　本発明の１つの好ましい側面においては、Ｘは酸素原子である。
　ｎは、１～３の整数であり、好ましくは、ｎは１である。
　式（１）で表される化合物は、酸付加塩又は塩基付加塩として存在することができる。
　酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、又はメタンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩などの有機酸塩などを挙げることができる。
　塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩などの有機アミン塩などを挙げることができる。
　式（１）で表される化合物は、グリシンなどのアミノ酸との塩を形成する場合もある。
　化合物（１）は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もある。
　化合物（１）は、置換基の種類により、１個又は２個以上の不斉炭素を有する場合があるが、１個又は２個以上の不斉炭素に基づく光学活性体や２個以上の不斉炭素に基づくジアステレオ異性体などの立体異性体のほか、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などは、いずれも本発明の範囲に包含される。
　化合物（１）の代表的化合物の製造方法を本明細書の実施例に具体的に示した。従って、当業者は、これらの説明をもとにして、反応原料、反応条件、及び反応試薬などを適宜選択して、必要に応じてこれらの方法に修飾や改変を加えることにより、化合物（１）を製造することができる。
　化合物（１）は、インフルエンザ由来ノイラミニダーゼにより分解されず、バクテリア由来ノイラミニダーゼによってのみ分解されて蛍光増強を示すことが明らかとなっている（試験例１、試験例２参照）。化合物（１）の一例である「ＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃ」（合成例１参照）のノイラミニダーゼによる酵素加水分解のスキームを図１に示す。
　したがって、化合物（１）は、インフルエンザウイルスあるいはインフルエンザ由来ノイラミニダーゼを、バクテリアあるいはバクテリア由来ノイラミニダーゼと識別検出するための蛍光プローブとして利用できる。
　本発明は、化合物（１）を含む、インフルエンザウイルスあるいはインフルエンザ由来ノイラミニダーゼをバクテリアあるいはバクテリア由来ノイラミニダーゼと識別検出するための試薬をも提供するものである。この試薬は、乾燥された化合物（１）あるいは適当な緩衝液に溶解された化合物（１）であってよい。なお、緩衝液には後述のものを適宜用いることができる。
　生物試料、プローブ１及びプローブ２の混合は、同一又は異なる水溶性溶媒に溶解され生物試料、プローブ１及びプローブ２のそれぞれの溶液を混合することによって行うことができる。あるいは、同一の水溶性溶媒に生物試料、プローブ１及びプローブ２を溶解することにより混合してもよい。
［親水性溶媒］
　親水性溶媒には、酵素の反応溶液として従来用いられているものであれば特に限定されず、例えば、水、あるいは、水に酵素反応の最適化のために必要な濃度で緩衝物質を添加したバッファー溶液が用いられる。
　緩衝物質としては、特に限定されないが、ＭＥＳ（2-Morpholinoethanesulfonic acid）、ＡＤＡ（N-(2-Acetamido)iminodiacetic acid）、ＰＩＰＥＳ（Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid)）、ＡＣＥＳ（N-(2-Acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid）、ＢＥＳ（N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid）、ＴＥＳ（N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid）ＨＥＰＥＳ（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid）等のいわゆるグッドバッファー（Good's Buffer）や、Ｔｒｉｓ（Tris(hydroxymethyl)aminomethane）、ＤＥＡ（Diethanolamine）等が用いられ得る。
　生物試料、プローブ１及びプローブ２の混合液は、酵素反応のために必要に応じてインキュベートされる。インキュベーションは、例えば、室温－３７℃で、数分－数十分程度である。
１－２．手順２（信号の検出手順）
　プローブ１及びプローブ２から生成する信号は、イメージセンサ、分光光度計、旋光計、分光蛍光光度計及び蛍光顕微鏡等の従来公知の機器を用いて検出し、数値化することができる。生物試料、プローブ１及びプローブ２の混合液（以下、「サンプル液」とも称する）を機器にロードし、機器の操作手順書に従って測定を行えばよい。
　プローブ１は、インフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼ及びバクテリア由来ノイラミニダーゼの双方により分解されて光学的に検出可能な信号を生成する。プローブ１からの信号強度をＳ１とする。
　一方、プローブ２は、バクテリア由来ノイラミニダーゼによってのみ加水分解されて光学的に検出可能な信号を生成する。プローブ２からの信号強度をＳ２とする。
　サンプル液中に存在するノイラミニダーゼがバクテリア由来である場合（対象が非感染の場合）、プローブ１及びプローブ２の双方から信号が生成する。
　一方、サンプル液中に存在するノイラミニダーゼがインフルエンザウイルス由来である場合（対象が感染の場合）、プローブ１からは信号が生成するが、プローブ２から生成する信号は理論的には０であり、プローブ２の自然分解（ノイラミニダーゼの酵素活性によらない分解）により生成する信号を考慮しても十分に小さい。
　したがって、Ｓ２に対するＳ１の比（Ｓ１／Ｓ２）は、サンプル液中にバクテリア由来ノイラミニダーゼが存在する場合（対象が非感染の場合）に比べて、サンプル液中にインフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼが存在する場合（対象が感染の場合）では、より大きくなる。
　すなわち、プローブ１から生成する信号の強度Ｓ１に対するプローブ２から生成する信号の強度Ｓ２の比（Ｓ１／Ｓ２）が所定値（閾値）以上であれば、サンプル液中にインフルエンザウイルスが存在する（対象がインフルエンザウイルスに感染している）と検出できる。
　一方、比（Ｓ１／Ｓ２）が閾値未満であれば、サンプル液中にインフルエンザウイルスが存在しない（対象がインフルエンザウイルスに感染していない）と検出できる。
　これにより、生物試料中に存在するノイラミニダーゼがインフルエンザウイルス由来のものであるかバクテリア由来のものであるかを明確に区別して、バクテリア由来ノイラミニダーゼに起因する信号を擬陽性として検出することなく、インフルエンザウイルスを高確度に検出することができる。
　閾値は、プローブ１及びプローブ２として用いられる化合物、それらの光学特性、及び生物試料中に存在しえるバクテリアの種類などに応じて適宜設定されえる。例えば、閾値は、サンプル液中にバクテリア由来ノイラミニダーゼが存在する場合の比（Ｓ１／Ｓ２）の1.1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍以上に設定できる。
　プローブ２の自然分解（ノイラミニダーゼの酵素活性によらない分解）が生じないあるいは無視可能な程度である場合、サンプル液中に存在するノイラミニダーゼがインフルエンザウイルス由来である場合（対象が感染の場合）に、プローブ２から生成する信号は０である。この場合には、プローブ１から生成する信号の強度Ｓ１に対するプローブ２から生成する信号の強度Ｓ２の比（Ｓ１／Ｓ２）によらずに、インフルエンザウイルスの検出を行うこともできる。
　すなわち、プローブ１から生成する信号が検出され、プローブ２から生成する信号が検出されない場合に、サンプル液中のインフルエンザウイルスの存在（対象のインフルエンザ感染）を検出し、プローブ１から生成する信号及びプローブ２から生成する信号が検出された場合には、サンプル液中のインフルエンザウイルスの不存在（対象のインフルエンザウイルス非感染）を検出することができる。
１－２－１．デジタル法に基づく検出１
　手順２にデジタル法を適用した実施形態を説明する。
　デジタル法では、多数の極小空間（例えば微小液滴）中に検出対象物を最大で１分子ずつ存在するように導入する。そして、各極小空間内の検出対象物を検出し、その存在を０又は１で数値化する。これによって、デジタル法では、検出対象物を高感度かつ定量的に検出することが可能である。
　本実施形態に係る手順２は、以下の手順２Ａ１～２Ａ３を含む。
　手順２Ａ１：インフルエンザウイルス及びバクテリアを収容可能な複数の収容部が、疎水性の上面を有する隔壁によって互いに隔てられて形成されている下層部と、当該下層部における当該収容部が形成されている面に対向している上層部との間の空間に、サンプル液を導入する手順。
　手順２Ａ２：前記空間に疎水性溶媒を導入して、前記収容部内に、疎水性溶媒で被覆されかつインフルエンザウイルス及び／又はバクテリアを包含する、サンプル液の液滴を形成する手順と、
　手順２Ａ３：前記液滴中でプローブ１及びプローブ２から生成する信号を検出する手順。
１－２－１－１．導入手順２Ａ１
　図２Ａを参照して導入手順２Ａ１を説明する。
　アレイ１０１は、下層部１１１と上層部１２１が空間１３１を隔てて対向して配置されており、空間１３１を流体流路とするフローセル構造を有している。
　下層部１１１には、インフルエンザウイルス及び／又はバクテリアを収容可能な収容部１１４が複数形成されている。収容部１１４は、疎水性の上面を有する隔壁１１３によって互いに隔てられている。
　また、上層部１２１は、空間１３１を隔てて、下層部１１１における収容部１１４が形成されている面に対向している。
　本手順では、空間１３１にサンプル液４を導入する。サンプル液４には、プローブ１とプローブ２が含まれる。また、サンプル液４には、インフルエンザウイルス又はバクテリア３が含まれえる。サンプル液４は、例えば上層部１２１及び下層部１１１の少なくとも一方に形成されている貫通孔（図示せず）から空間１３１内に導入することができる。空間１３１内に導入されたサンプル液４は、毛細管現象に従って空間１３１を通流し、空間１３１内に充填される。
［界面活性剤］
　サンプル液４には、界面活性剤を添加してもよい。界面活性剤を添加することで、サンプル液４が、空間１３１内及び収容部１１４内へ導入され易くなる傾向がある。
　界面活性剤としては、特に限定されないが、例えばＴＷＥＥＮ２０（ＣＡＳ番号：9005-64-5、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン）及びＴｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００（ＣＡＳ番号：9002-93-1、一般名ポリエチレングリコールモノ－４－オクチルフェニルエーテル（n≒10））などが挙げられる。サンプル液４への界面活性剤の添加濃度は、特に限定されないが、好ましくは０．０１～１％である。
　さらに、界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性イオン界面活性剤、天然由来の界面活性剤などを広く用いることができる。
　陰イオン性界面活性剤としては、例えば、カルボン酸型、硫酸エステル型、スルホン酸型、リン酸エステル型に分類される。このうち、具体的には、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリン酸ナトリウム、α-スルホ脂肪酸メチルエステルナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ドデシルエトキシレート硫酸ナトリウムなどが挙げられ、中でも、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムを用いることが好ましい。
　陽イオン性界面活性剤としては、例えば、第四級アンモニウム塩型、アルキルアミン型、複素環アミン型に分類される。具体的には、例えば、ステアリルトリメチルアンモニウムクロライド、ジステアリルジメチルアンモニウムクロライド、ジデシルジメチルアンモニウムクロライド、セチルトリピリジニウムクロライド、ドデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライドなどが挙げられる。
　非イオン界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン硬化ひまし油、ポリオキシエチレンモノ脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、アルキルポリグリコシド、N-メチルアルキルグルカミドなどが挙げられる。中でも、ドデシルアルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、ラウロイルジエタノールアマイドの他、Triton X（Triton X-100など）、Pluronic（登録商標）（Pluronic F-123、F-68など）、Tween (Tween 20、40、60、65、80、85など)、Brij（登録商標）（Brij 35、58、98など）、Span (Span 20、40、60、80、83、85)の名前で市販されてい
るものが好ましい。
　両性界面活性剤としては、例えば、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン、ドデシルアミノメチルジメチルスルホプロピルベタイン、3-(テトラデシルジメチルアミニオ)プロパン-1-スルホナートなどがあるが、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホナート（CHAPS）、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ヒドロキシ-1-プロパンスルホナート（CHAPSO）などを用いることが好ましい。
　天然由来の界面活性剤としては、例えば、レシチン、サポニンが好ましく、レシチンとして称される化合物のうち、具体的には、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロールなどが好ましい。また、サポニンとしてはキラヤサポニンが好ましい。
　本手順により、プローブ１、プローブ２、及びインフルエンザウイルス又はバクテリア３が収容部１１４に導入される。サンプル液４においてインフルエンザウイルス又はバクテリアが十分に低い濃度に希釈されている場合、１つの収容部１１４に入るインフルエンザウイルス又はバクテリア３の数は０又は最大で１となり得る。サンプル液４においてインフルエンザウイルス又はバクテリアの濃度がより高い場合には、１つの収容部１１４には２以上のウイルス２が導入されえる。
１－２－１－２．封入手順２Ａ２
　図２Ｂを参照して封入手順２Ａ２を説明する。本手順では、下層部１１１と上層部１２１との間の空間１３１に疎水性溶媒５を導入する。
　疎水性溶媒５は、サンプル液４と混ざり合いにくい溶媒（非混和性の溶媒）であればよく、親水性溶媒であるサンプル液４に対して疎水性溶媒が好適に用いられる。
　疎水性溶媒５として、例えば飽和炭化水素、不飽和炭化水素、芳香族炭化水素、シリコーンオイル、パーフルオロカーボン、ハロゲン系溶媒、及び疎水性イオン液体からなる群より選択される少なくとも１つ又はこれを含む混合物等を好適に用いることができる。飽和炭化水素としては、例えばアルカン、シクロアルカンなどが挙げられる。アルカンとしては、例えばデカン、ヘキサデカン等が挙げられる。不飽和炭化水素としては、例えばスクアレン等が挙げられる。芳香族炭化水素としては、例えばベンゼン、トルエン等が挙げられる。パーフルオロカーボンとしては、例えばフロリナート（登録商標）ＦＣ４０（SIGMA社製）等が挙げられる。ハロゲン系溶媒としては、例えばクロロホルム、塩化メチレン、クロロベンゼン等が挙げられる。疎水性イオン液体とは少なくとも水中では解離しないイオン液体をさし、例えば１―Ｂｕｔｙｌ―３―ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ　Ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ等が挙げられる。イオン液体とは、室温において液体で存在する塩をさす。
　疎水性溶媒５も、サンプル液４と同様に、上層部１２１及び下層部１１１の少なくとも一方に形成されている貫通孔（図示せず）から空間１３１内に導入すればよい。空間１３１内に導入された疎水性溶媒５は、毛細管現象に従って空間１３１を通流し、空間１３１内のサンプル液４と置換する。置換されたサンプル液４は、空間１３１外に排出される。これにより、収容部１１４内に、疎水性溶媒５で被覆されかつプローブ１、プローブ２、及びインフルエンザウイルス又はバクテリア３を包含する、サンプル液４の液滴が形成される。
　この液滴の容積（収容部１１４の容積にほぼ等しい）は、極小であってよく、例えば１０ａＬ～１００ｎＬ、好ましくは１ｆＬ～１ｐＬとされる。
　サンプル液４の液滴の極小容積中で、インフルエンザウイルス又はバクテリアのノイラミニダーゼとプローブ１及びプローブ２との反応が進行する。
［脱気］
　導入手順２Ａ１と封入手順２Ａ２との間に、空間１３１内の脱気を行ってもよい。脱気方法としては、例えば、アレイ１０１を減圧環境下において放置する方法、あるいはアレイ１０１を冷却する方法等を好適に用いることができる。具体的には、約０．１気圧の減圧デシケータ内にアレイ１０１を約３０秒放置する方法などである。
　本発明において、脱気手順は必須ではないが、脱気を行なうことにより、収容部１１４内の空気が除去され、プローブ１、プローブ２、及びインフルエンザウイルス又はバクテリア３を収容部１１４内に効率よく導入できる。
１－２－１－３．検出手順２Ａ３
　本手順では、サンプル液４の液滴中で生成したプローブ１及びプローブ２からの信号が検出される。
　上述の通り、サンプル液４において、インフルエンザウイルス又はバクテリアが十分に低い濃度に希釈されている場合、１つの収容部１１４に入るインフルエンザウイルス又はバクテリア３の数は０又は最大で１となるので、収容部１１４にはインフルエンザウイルス及びバクテリアのどちらか一方が封入された液滴が形成される。
　各液滴においてプローブ１から生成する信号が検出され、プローブ２から生成する信号が検出されない場合（図２Ｃ左図参照）に、当該液滴中にインフルエンザウイルスを検出できる。一方、プローブ１から生成する信号及びプローブ２から生成する信号が検出された場合（図２Ｃ右図参照）には、当該液滴中にバクテリアの存在（インフルエンザウイルスの不存在）を検出できる。
　プローブ１に４ＭＵ－ＮＡＮＡを、プローブ２に化合物（１）としてＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃを用いたデジタル法において、インフルエンザウイルスが封入された液滴から生じた４－メチルウンベリフェロン（４ＭＵ）の蛍光をCCDカメラにより検出したイメージの一例を図２Ｄ左図に示す。検出領域に信号陽性の液滴が２つ確認できる。インフルエンザウイルスが存在する液滴から４ＭＵが発する青色蛍光（波長443 nm）が検出されている。液滴にバクリテリアが存在する場合には、４ＭＵが発する青色蛍光（波長443 nm）とＨＭＲｅｆが発する緑色蛍光（波長：518ｎｍ）が検出される。図２Ｄ右図は、信号陽性の液滴が存在しない領域を撮像したイメージの一例である。
　インフルエンザウイルスが検出された収容部１１４の数と、インフルエンザウイルスが検出されない収容部１１４の数との比率を用いて、予め作成した当該比率とウイルス粒子数との関係を規定した標準曲線に基づいて、インフルエンザウイルス量を定量的に決定することもできる（デジタル定量）。
　なお、インフルエンザウイルスが検出された収容部１１４が１つでも存在すれば、被検試料についてインフルエンザ陽性と判定してよい。このような判定方法は、検体中のインフルエンザウイルスの数が極めて少ない感染初期の場合にインフルエンザの罹患の有無を判定するため有用である。
１－２－２．デジタル法に基づく検出２
　手順２にデジタル法を適用した他の実施形態を説明する。
　本実施形態に係る手順２は、以下の手順２Ｂ１～２Ｂ３を含む。
　手順２Ｂ１：インフルエンザウイルス及びバクテリアを収容可能な複数の収容部が、疎水性の上面を有する隔壁によって互いに隔てられて形成されている基板上に、サンプル液を導入する手順。
　手順２Ｂ２：サンプル液よりも比重が大きい疎水性溶媒をサンプル液層の上に積層するようにして導入し、サンプル液層と疎水性溶媒層との層置換を生じさせることにより、前記収容部内に、疎水性溶媒で被覆されかつインフルエンザウイルス及び／又はバクテリアを包含する、サンプル液の液滴を形成する手順。
　手順２Ｂ３：前記液滴中でプローブ１及びプローブ２から生成する信号を検出する検出手順。
１－２－２－１．導入手順２Ｂ１
　図３－１～図３－３を参照して導入手順２Ｂ１を説明する。図は、アレイ２０１の側方断面図である。
　アレイ２０１は、下層部２１１を含んでなる。アレイ２０１は、下層部２１１と側壁２２１，２２１によって下方及び両側方を区画されておりかつ上方が開放されている領域２１を有する。すなわち、下層部２１１と側壁２２１，２２１は、上方に開口を有する開口ウェルを形成している。当該開口ウェル内の空間を、図中、領域２１として示す。
　下層部２１１には、インフルエンザウイルス及び／又はバクテリアを収容可能な収容部２１４が複数形成されている。収容部２１４は、疎水性の上面を有する隔壁２１３によって互いに隔てられている。下層部２１１は、それに対向する面を有さない。
　本手順では、下層部２１１上にサンプル液４を導入する。サンプル液４には、プローブ１とプローブ２が含まれる。また、サンプル液４には、インフルエンザウイルス又はバクテリア３が含まれえる。サンプル液は、例えば、開口ウェルの開口から領域２１内に導入することができる。
　サンプル液４には、界面活性剤を添加してもよい。界面活性剤を添加することで、次に説明する封入手順における、サンプル液４と疎水性溶媒との置換を促進できる。界面活性剤には、上述のものを用いることができる。
１－２－２－２．封入手順２Ｂ２
　図３－１～図３－３Ｂ－Ｈを参照して封入手順２Ｂ２を説明する。本手順では、疎水性溶媒５をサンプル液４の層の上に積層するようにして導入する。
　疎水性溶媒５の導入方法としては、特に限定されないが、例えば、開口ウェルの開口から領域２１内に導入することができる。この際、疎水性溶媒５は、図３－１Ｂに示すように、サンプル液４の層上に疎水性溶媒５の層が積層されるようにして導入することが好ましい。
　疎水性溶媒５には、サンプル液４よりも比重が大きい溶媒が用いられる。また、疎水性溶媒５には、サンプル液４と層置換をしえる程度に相互に親媒性を有するものであることが好ましいが、互いに相溶しないことが必要である。サンプル液４と疎水性溶媒５との間の親媒性が低すぎると、サンプル液４と疎水性溶媒５との層置換が生じない。また、サンプル液４と疎水性溶媒５とが互いに相溶する場合には、サンプル液４と疎水性溶媒５とが層分離せず、積層状態が生じない。このような疎水性溶媒として、上述のものを用いることができる。「表１」に例示的な疎水性溶媒５の比重を挙げる。
　疎水性溶媒５は、サンプル液４と同様に、層置換を促進するために界面活性剤を含んでいてもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　サンプル液４上に導入され積層された疎水性溶媒５は、サンプル液４よりも比重が大きいため、サンプル液４の下方に移動する。すなわち、サンプル液４の層と疎水性溶媒５の層とが置換されて、上層が疎水性溶媒５で下層がサンプル液４となった状態（図３－１Ｂ参照）から上層がサンプル液４で下層が疎水性溶媒５となった状態（図３－３Ｈ参照）となる。層置換を生じる様子を図３－１Ｃ～図３－３Ｇに模式的に示す。この層置換において、プローブ１、プローブ２、及びインフルエンザウイルス又はバクテリア３が、サンプル液４の下方へ移動していく疎水性溶媒５によって押し込まれるようにして収容部２１４の各々に収容されていく（図３－２Ｄ～Ｆ参照）。その結果、収容部２１４内に、疎水性溶媒５で被覆されかつプローブ１、プローブ２及びインフルエンザウイルス又はバクテリア３を包含する、サンプル液４の液滴が形成される。
　この液滴の容積（収容部２１４の容積にほぼ等しい）は、極小であってよく、例えば１０ａＬ～１００ｎＬ、好ましくは１ｆＬ～１ｐＬとされる。
　サンプル液４の液滴の極小容積中で、インフルエンザウイルス又はバクテリアのノイラミニダーゼとプローブ１及びプローブ２との反応が進行する。
１－２－２－３．検出手順２Ｂ３
　本手順では、サンプル液４の液滴中で生成したプローブ１及びプローブ２からの信号が検出される。
　上述の通り、サンプル液４において、インフルエンザウイルス又はバクテリアが十分に低い濃度に希釈されている場合、１つの収容部２１４に入るインフルエンザウイルス又はバクテリア３の数は０又は最大で１となるので、収容部２１４にはインフルエンザウイルス及びバクテリアのどちらか一方が封入された液滴が形成される。
　各液滴においてプローブ１から生成する信号が検出され、プローブ２から生成する信号が検出されない場合に、当該液滴中にインフルエンザウイルスを検出できる。一方、プローブ１から生成する信号及びプローブ２から生成する信号が検出された場合には、当該液滴中にバクテリアの存在（インフルエンザウイルスの不存在）を検出できる。
　インフルエンザウイルスが検出された収容部２１４の数と、インフルエンザウイルスが検出されない収容部２１４の数との比率を用いて、予め作成した当該比率とウイルス粒子数との関係を規定した標準曲線に基づいて、インフルエンザウイルス量を定量的に決定することもできる（デジタル定量）。
２．インフルエンザウイルスの検出キット及びインフルエンザ感染の診断キット
　本発明に係るインフルエンザウイルスの検出キットは、インフルエンザウイルスに感染した対象又は感染した疑いがある対象から分離された生物試料中のインフルエンザウイルスを検出するためのキットである。本発明に係るインフルエンザウイルスの検出キットは、対象におけるインフルエンザ感染の有無の診断に用いられる。本発明に係るインフルエンザウイルスの検出キットは、上述のプローブ１及びプローブ２を含んでなるものであり、これらに加えて任意に上述した疎水性溶媒、及び、アレイ１０１又はアレイ２０１を含んでいてよい。これらのキット構成要素（コンポーネント）は、ひとまとまりで販売されるものであってよく、それぞれ単独で販売されるものであってもよい。
　プローブ１、プローブ２及び疎水性溶媒については上述のとおりである。アレイ１０１及びアレイ２０１について、以下により詳しい構造を説明する。
　アレイ１０１及びアレイ２０１の作製のためのフォトリソグラフィー、エッチング、基板積層などの技術は、汎用のマイクロチップやアレイを作成するための技術を適用できる。
［アレイ１０１］
　上層部１２１の材質は、例えばガラス、シリコン、高分子樹脂等とできる。
　上層部１２１の厚みは、特に限定されない。
　上層部１２１の下面（空間１３１に臨む面）は、疎水性であることが好ましい。「疎水性」とは、ここでは「親油性」と同じ意味で用いられ、疎水性溶媒との親和性が親水性溶媒との親和性よりも高いことをいう。
　下層部１１１において、収容部１１４は、板状部材１１２上に形成された隔壁１１３によって互いに隔てられている。収容部１１４の底面は、板状部材１１２の表面であってよい。
　板状部材１１２の材質は、例えばガラス、シリコン、高分子樹脂等とできる。
　板状部材１１２の厚みは、特に限定されない。
　隔壁１１３は、板状部材１１２の表面に形成した樹脂層により形成でき、例えば撥水性の樹脂又はフッ素系高分子樹脂等のエッチングにより形成できる。フッ素系高分子樹脂としては、例えばアモルファスフッ素樹脂等が挙げられる。アモルファスフッ素樹脂は、高い疎水性を有し、かつ、生体試料に対する毒性が低いという理由で、好ましく用いられる。
　上記アモルファスフッ素樹脂としては、例えば、ＣＹＴＯＰ（登録商標）、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ＡＦ２４００、およびＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ＡＦ１６００から選択した少なくとも１つを好適に用いることができる。中でも、微細加工が容易であるという理由で、ＣＹＴＯＰ（登録商標）が最も好ましい。
　収容部１１４の形状は、特に限定されず、例えば円柱形状及び角柱形状等であってよい。
　収容部１１４の大きさは、インフルエンザウイルス及び／又はバクテリアを収容可能であれば特に限定されないが、水平方向の幅及び垂直方向の高さ（隔壁１１３の高さ）は、それぞれ、例えば１００ｎｍ－１００μｍ、２００ｎｍ－９０μｍ、３００ｎｍ－８０μｍ、４００ｎｍ－７０μｍ、５００ｎｍ－６０μｍ、６００ｎｍ－５０μｍ、７００ｎｍ－４０μｍ、８００ｎｍ－３０μｍ、９００ｎｍ－２０μｍ、１０００ｎｍ－１０μｍ、２μｍ－９μｍ、３μｍ－８μｍの範囲である。
　収容部１１４は、例えば１００万個以上が高密度に配置されていてよい。このような超高密度アレイであっても、先に説明した封入手順によれば、疎水性溶媒５で被覆されかつプローブ１、プローブ２、及びインフルエンザウイルス又はバクテリア３を包含する、サンプル液４の液滴を各収容部１１４に効率よく形成できる。
　隔壁１１３の上面（上層部１２１と対向する面）は、疎水性とされることが好ましい。また、収容部１１４の底面を形成する板状部材１１２の表面は親水性であることが好ましい。「親水性」とは、親水性溶媒との親和性が疎水性溶媒との親和性よりも高い表面を指す。
　収容部１１４の底面が親水性であり、かつ隔壁１１３の上面及び上層部１２１の下面が疎水性であることにより、導入手順２Ａ１において、サンプル液４を円滑に収容部１１４内に導入することができる。また、収容部１１４の底面が親水性であり、かつ隔壁１１３の上面が疎水性であることにより、封入手順２Ａ２において疎水性溶媒５が収容部１１４内に入り込むことを防止できる。
　なお、隔壁１１３は、その上面が疎水性であればよく、その側面（収容部１１４に臨む面）は、疎水性であっても親水性であってもよい。
　上層部１２１の下面（空間１３１に臨む面）と隔壁１１３の上面（上層部１２１と対向する面）との間の距離（空間１３１の高さ）は、毛細管現象に従って液体を空間１３１内に通流させえる程度に小さくされる。空間１３１の高さは、例えば０．１μｍ－５ｍｍ、０．５μｍ－４ｍｍ、１μｍ－３ｍｍ、２μｍ－２ｍｍ、５μｍ－１ｍｍ、１０μｍ－５００μｍ、２０μｍ－４００μｍ、３０μｍ－３００μｍ、４０μｍ－２００μｍ、５０μｍ－１００μｍの範囲である。高さが０．１μｍ未満では、空間１３１内に液体を通流させるのに要する送液圧が高くなりすぎる可能性がある。
［アレイ２０１］
　アレイ２０１の下層部２１１は、アレイ１０１の下層部１１１と同様の構成であってよく、下層部２１１を構成する板状部材２１２及び隔壁２１３も、アレイ１０１の板状部材１１２及び隔壁１１３と同様の構成であってよい。
　また、収容部２１４も、アレイ１０１の収容部１１４と同様の構成であってよい。
　側壁２２１は、板状部材２１２と同様の材質であって、例えばガラス、シリコン、高分子樹脂等からなる部材の表面であってよい。
　側壁２２１の高さは、任意であるが、サンプル液４の層と疎水性溶媒５の層とが積層された状態での合計の厚みを上回る必要がある。
　収容部２１４の底面が親水性であり、かつ隔壁２１３の上面が疎水性であることにより、封入手順２Ｂ２において疎水性溶媒５が収容部２１４内に入り込むことを防止できる。
　以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
［合成例１：ＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃの合成］
　以下の反応スキームの手順に従って化合物３を合成した。次に、化合物３を用いてＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
［原料］
　合成に使用した全ての化学物質は、東京化成工業（株）、和光純薬工業（株）、シグマアルドリッチ（株）から購入し、追加的な精製を行うことなく使用した。
［測定機器］
　ＮＭＲスペクトルは、重水素化溶媒中を用い、Ｂｒｕｋｅｒ　ＮＭＲ　ＡＶＡＮＣＥ　ＩＩＩ　４００分光計［１Ｈ（４００ＭＨｚ）、１３Ｃ（１０１ＭＨｚ）］で得た。
　高分解能ＥＳＩ質量スペクトルは、ｍｉｃｒｏＯＴＯＦ　ＩＩ（Ｂｒｕｋｅｒ）で得た。
　ＨＰＬＣ精製は、Ｉｎｅｒｔｓｔｉｌ－ＯＤＳ－３カラム（Φ１０×２５０ｍｍ（セミ分取）およびΦ２０×２５０ｍｍ（分取））を備えたＪＡＳＣＯ　ＰＵ－２０８７　Ｐｌｕｓポンプ（ＧＬ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｃｏ．、Ｌｔｄ．）およびＵＶＩＤＥＣ－１００－Ｖ検出器（ＪＡＳＣＯ）で行った。
　ＨＰＬＣに使用した溶媒は、和光（株）より入手した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーは、シリカゲル６０Ｎ（球状、中性、６３～２１０μｍ；関東化学株式会社製）を用いて行った。
　ＴＬＣは、シリカゲルプレートＦ２５４（０．２５ｍｍ（分析）；Ｍｅｒｃｋ、ＡＫＧ）で行った。
　ＵＶ－ｖｉｓスペクトルは、Ｓｈｉｍａｄｚｕ　ＵＶ－２４５０分光光度計で得た。
（１）化合物１の合成
　４－ヒドロキシベンズアルデヒド（Ｓ、４７９ｍｇ、３．９ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（５ｍＬ）の溶液に、Ｎ－アセチル－２－クロロ－２－デオイズノイラミン酸メチルエステル４，７，８，９－テトラアセテート３（０．５ｍＬ、３．１ｍｍｏｌ）のＭｅＣＮ溶液に加え、反応混合物を室温で３時間撹拌した。この後、すべての溶媒を除去し、トルエン（×３）で希釈した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ：ＤＣＭ、１：１～ＥｔＯＡｃ）を用いて精製して、化合物１を白色泡状物として得た（１４５ｍｇ、６２％）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3):δ1.93 (s, 3H, NHOAc), 2.05 (s, 3H, OAc), 2.06 (s, 3H, OAc), 2.12 (s, 3H, OAc), 2.19 (s, 3H, OAc), 2.30 (t, 1H, 3JHH = 12.5 Hz, H3ax), 2.74 (dd, 1H, 3JHH = 13, 4.7 Hz, H3eq), 3.65 (s, 3H, COOMe), 4.11 (m, 1H, H9), 4.13 (m, 1H, H5), 4.25 (dd, 1H, 3JHH = 12.4, 2.4 Hz, H9'), 4.60 (dd, 1H, 3JHH = 10.8, 1.6 Hz, H6), 4.98 (td, 1H, 3JHH = 10.4, 4.6, 1.8 HZ, H4), 5.23 (d, 1H, 3JHH = 10 Hz, H7), 5.35 (m, 1H, NH), 5.37 (m, 1H, H8), 7.18 (d, 2H, 3JHH = 8.7 Hz, Ar), 7.83 (d, 2H, 3JHH = 8.8 Hz, Ar), 9.93 (s, 1H, CHO). 13C NMR (101 MHz, CDCl3):δ 20.7, 20.7, 20.8, 21.0, 23.2, 38.7, 49.5, 53.2, 62.0, 67.1, 68.4, 68.7, 73.6, 99.5, 118.9, 131.7, 132.0, 158.9, 168.2, 169.9, 170.1, 170.2, 170.6, 170.9, 190.9. HRMS (ESI+): calcd for [M+Na+] 618.17933, found 618.18094 (-1.6 mDa) for C27H34NaNO14.
（２）化合物２の合成
　化合物１（２４７ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（５ｍＬ）に溶解し、０℃でＬｉＡｌＨ（ＯｔＢｕ）3（０．８３ｍＬの１．０Ｍ　ＴＨＦ溶液）を加えた。０℃で１時間撹拌した後、飽和ＮＨ4Ｃｌ（ａｑ）（５ｍＬ）およびＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）を混合物に加え、室温でさらに１時間撹拌した。これにロッシェル塩（水性）（１０ｍＬ）の飽和溶液を加え、粗生成物をＣＨＣｌ3（×３）で抽出したのち、有機層を減圧残去した。次いで残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ：ＤＣＭ　１：９９から５：９５）を用いて精製して、化合物２を白色泡状物として得た（１５６ｍｇ、６３％）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ1.90 (s, 3H, NHOAc), 2.04 (s, 3H, OAc), 2.04 (s, 3H, OAc), 2.12 (s, 3H, OAc), 2.13 (s, 3H, OAc), 2.21 (t, 1H, 3JHH = 12.6 Hz, H3ax), 2.72 (dd, 1H, 3JHH = 12.9, 4.6 Hz, H3eq), 3.68 (s, 3H, COOMe), 4.10 (m, 1H, H5), 4.14 (d, 1H, 3JHH = 5 Hz, H9), 4.28 (dd, 1H, 3JHH = 12.6, 2.6 Hz, H9'), 4.38 (dd, 1H, 3JHH = 10.8, 1.6 Hz, H6), 4.63 (s, 2H, CH2OH), 4.95 (td, 1H, 3JHH = 10.4, 4.6, 1.8 HZ, H4), 5.27 (m, 1H, NH), 5.35 (m, 2H, H7, H8), 7.03 (d, 2H, 3JHH = 8.6 Hz, Ar), 7.27 (d, 2H, 3JHH = 8.6 Hz, Ar). 13C NMR (101 MHz, CDCl3): δ 20.7, 20.8, 20.8, 21.0, 23.2, 38.2, 49.5, 52.9, 62.1, 64.9, 67.4, 68.8, 69.4, 73.4, 99.9, 120.3, 128.3, 136.7, 153.1, 168.1, 170.0, 170.1, 170.3, 170.7, 170.9. HRMS (ESI+): calcd for [M+Na+] 620.19498, found 620.19672 (-1.7 mDa) C27H36NaNO14.
（３）化合物３の合成
　化合物２（１５０ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（３ｍＬ）に溶解し、三臭化リン（１２μＬ、０．１３ｍｍｏｌ）を０℃で溶液に添加した。０℃で２時間撹拌後、溶液を飽和ＮａＨＣＯ3水溶液（×３）および飽和食塩水（×１）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧残去して化合物３を白色泡状物（１３６ｍｇ、８２％）として得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 1.84 (s, 3H, NHOAc), 1.97 (s, 3H, OAc), 1.98 (s, 3H, OAc), 2.05 (s, 3H, OAc), 2.09 (s, 3H, OAc), 2.15 (t, 1H, 3JHH = 12.6 Hz, H3ax), 2.63 (dd, 1H, 3JHH = 13, 4.7 Hz, H3eq), 3.58 (s, 3H, COOMe), 4.03 (m, 1H, H9), 4.10 (m, 1H, H5), 4.23 (m, 1H, H9'), 4.37 (m, 1H, H6), 4.40 (s, 2H, CH2Br), 4.89 (td, 1H, 3JHH = 10.4, 4.6, 1.8 Hz, H4), 5.29 (m, 3H, H7, H8, NH), 6.95 (d, 2H, 3JHH = 8.7 Hz, Ar), 7.23 (d, 2H, 3JHH = 8.7 Hz, Ar). 13C NMR (101 MHz, CDCl3): δ 19.7, 19.8, 19.8, 20, 22.2, 32.3, 37.2, 48.4, 52.0, 70.0, 66.3, 67.7, 68.1, 72.4, 98.8, 118.7, 129.2, 132.1, 152.8, 167.1, 169.0, 169.1, 169.2, 169.6, 169.9. HRMS (ESI+): calcd for [M+Na+] 682.11057, found 682.10666 (3.9 mDa) C27H34BrNNaO13.
（４）ＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃの合成
　以下の反応スキームの手順に従って、ＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　ＨＭＲｅｆ（７９ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）およびＮａＨ（６ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）に乾燥ＴＨＦ（３ｍＬ）および乾燥ＤＭＦ（１ｍＬ）を添加し、この混合物をアルゴン気下で０℃で撹拌した。化合物３（１３０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）の乾燥ＴＨＦ（３ｍＬ）溶液を加え、反応混合物を室温で１６時間撹拌した。この後、ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）を加え、この混合物を飽和ＮＨ4Ｃｌ溶液（×２）および飽和食塩水（×１）で洗浄した。
有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧留去した。残渣をＭｅＯＨ（６ｍＬ）に溶解し、１Ｍ　ＮａＯＨ（水溶液）を加えた（３ｍＬ）。混合物を室温で５時間撹拌し、その後、有機溶媒を蒸発させた。残留水溶液を２ＭのＨＣｌで中和し、次いで凍結乾燥させた。次いで、残留物をＭｅＯＨ：ＤＣＭ、１：４溶液に溶解し、濾過して不溶性塩を除去した。この溶液を減圧留去させ、残渣をＨＰＬＣ（Ａ液：１００ｍＭ　ＴＥＡＡ緩衝液、Ｂ液：ＣＨ3ＣＮ　９９％、Ｈ2Ｏ　１％。Ａ／Ｂ＝９０／１０で５分間、その後１５分で１０／９０に勾配をかけ、次いで１０／９０で１５分間）で精製し、凍結乾燥後に橙色の粉末（２ステップで３６％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ1.04 (t, 26H, TEAA), 1.84 (1H, t, 3JHH = 11.9 Hz, H3ax), 1.90 (s, 3H, TEAA), 2.02 (s, 3H, NHCOCH3), 2.55 (q, 17 H, TEAA), 2.94 (dd, 1H, 3JHH = 12.2, 4.0 Hz, H3eq), 3.54 (dd, 1H, 3JHH = 9.0, 1.6 Hz, H7), 3.66 (dd, 1H, 3JHH = 11.3, 5.4 Hz, H9), 3.74 (m, 1H, H5), 3.77 (m, 1H, H4), 3.81 (m, 1H, H9'), 3.85 (m, 2H, NHCH2CF3), 3.86 (m, 1H, H8), 3.91 (m, 1H, H6), 5.01 (s, 2H, ArCH2O), 5.23 (s, 2H, ArCH2O), 6.45 (dd, 1H, 3JHH = 8.6, 4JHH = 2.4 Hz, Ar), 6.50 (d, 1H, 4JHH = 2.3 Hz, Ar), 6.65 (dd, 1H, 3JHH = 8.7, 4JHH = 2.6 Hz, Ar), 6.67 (d, 1H, 3JHH = 8.6, Ar), 6.78 (m, 1H, Ar), 6.79 (m, 1H, Ar), 6.82 (m, 1H, Ar), 7.24 (d, 2H, 3JHH = 8.7 Hz, Ar), 7.30 (m, 1H, Ar), 7.31 (d, 2H, 3JHH = 8.7 Hz, Ar), 7.39 (m, 1H, Ar), 7.43 (m, 1H, Ar). 13C NMR (101 MHz, CD3OD): δ 11.2 (TEAA) 22.9, 24.4 (TEAA), 43.1, 45.8, 46.9 (TEAA), 54.3, 64.0, 69.3, 70.2, 72.6, 72.7, 73.1, 75.3, 85.5, 99.3, 104.0, 104.1, 109.7, 110.8, 114.7, 117.8, 118.1, 120.8, 121.9, 124.7, 124.8, 126.9 (q, CF3), 129.3, 129.4, 130.2, 130.2, 130.9, 140.3, 146.0, 150.3, 152.1, 153.0, 157.0, 173.6, 175.6, 180.7 (TEAA). HRMS (ESI+) L calcd for [M+Na]+ 797.75163; found 797.75043 (-1.2 mDa).
直線勾配（０ｍｉｎ、２０％ＣＨ3ＣＮ／０．１％ＴＦＡａｑ．　Ｔｏ　１５ｍｉｎ，１００％ＣＨ3ＣＮ　０．１％ＴＦＡ　ａｑ；ｆｌｏｗ　ｒａｔｅ＝１．０ｍＬ／ｍｉｎ）を用いてＨＰＬＣ分析を行った。５２０ｎｍでの蛍光を調べた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
［試験例１：ＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃのバクテリア由来ノイラミニダーゼとの反応性］
　合成例１で得られたＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃについて、アルスロバクター・ウレアファシエンス（Arthrobacter ureafaciens）由来のノイラミニダーゼとの酵素反応に伴う蛍光強度の経時変化を調べた。
　プローブ（ＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃ）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、蛍光測定グレード、同仁化学研究所）に溶解してストック溶液を得た。さらに、ストック溶液を、プローブの最終濃度が１μＭになるように緩衝液（１００ｍＭ　ＮａＯＡｃ、２ｍＭ　ＣａＣｌ2、ｐＨ７．４）で希釈して測定溶液を得た。
　測定溶液の蛍光スペクトルを、日立Ｆ－７０００を用いて１秒ごとに測定した（励起波長４９０ｎｍ、発光波長５２０ｎｍ）。測定開始後６０秒後にアルスロバクター・ウレアファシエンス由来のノイラミニダーゼ０．０１Ｕを、単独であるいは酵素阻害剤との組み合わせで添加した。測定時の温度は３７℃、酵素阻害剤（ＤＡＮＡ）の濃度は１００μＭとした。
　結果を図４に示す。ＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃは、バクテリア由来のノイラミニダーゼとの反応で１３０倍の蛍光増強を示した。
　ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）由来のノイラミニダーゼを用いた場合にも同様の結果を得た。ウェルシュ菌は、ヒトに常在する菌であり、口腔を含む上部気道粘膜にも常在している。
［試験例２：ＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃのインフルエンザ由来ノイラミニダーゼとの反応性］
　ＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃについて、試験例１と同様にしてインフルエンザイウルス由来のノイラミニダーゼとの酵素反応に伴う蛍光強度の経時変化を調べた。
　本試験例ではプローブにＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃに加えて４ＭＵ－ＮＡＮＡ（陽性コントロール）に用いた。プローブの測定溶液中の終濃度はＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃ　１００μＭ、４ＭＵ－ＮＡＮＡ　１ｍＭとした。
　測定溶液にインフルエンザウイルス（A/PR8 医科研II株）を５×１０7ＰＦＵ／ｍＬを添加し、蛍光スペクトルの測定を開始した（励起波長３６０ｎｍ、発光波長４４８ｎｍ）。測定時の温度は２５℃とした。
　結果を図５に示す。陽性コントロールの４ＭＵ－ＮＡＮＡは経時的な蛍光増強を示したが、ＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃでは蛍光強度の変化は全くみられなかった。本試験例及び試験例１の結果から、ＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃは、バクテリア由来のノイラミニダーゼに対しては反応性を有するが、インフルエンザ由来ノイラミニダーゼに対しては反応性を有さないことが明らかとなった。
１：プローブ１、２：プローブ２、３：インフルエンザウイルス又はバクテリア、４：サンプル液、５：疎水性溶媒、１０１，２０１：アレイ、１１１，２１１：下層部、１１２，２１２：板状部材、１１３，２１３：隔壁、１１４，２１４：収容部、１２１：上層部、１３１：空間、２１：領域、２２１：側壁

Claims (9)

  1. 　生物試料中のインフルエンザウイルスを検出する方法であって、
    （１）前記生物試料を、第一のプローブと第二のプローブと混合する手順１、
    　ここで、前記第一のプローブは、インフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼ及びバクテリア由来のノイラミニダーゼの双方により分解されて光学的に検出可能な信号を生成するものであり、
    　前記第二のプローブは、バクテリア由来のノイラミニダーゼにより分解されて光学的に検出可能な信号を生成しかつインフルエンザ由来のノイラミニダーゼにより分解されないものであり、
    　前記第一のプローブから生成する信号と前記第二のプローブから生成する信号は光学的に区別して検出可能である、と、
    （２）前記第一のプローブ及び前記第二のプローブから生成する信号を検出する手順２と、を含み、
    　前記第二のプローブから生成する信号の強度に対する前記第一のプローブから生成する信号の強度の比が所定値以上である場合に、前記生物試料中のインフルエンザウイルスの存在を検出し、
    前記比が前記所定値未満である場合に、前記生物試料中のインフルエンザウイルスの不存在を検出する、検出方法。
  2. 　前記第二のプローブが以下の式（１）で表わされる化合物又はその塩である、請求項１記載の検出方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
    （式中、
    Ｒ1は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；
    Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
    Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
    Ｒ6は、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、又は炭素数１～５個のフッ化アルキル基を示し；
    Ｒ7及びＲ8は、存在する場合は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基を示し、
    ここで、Ｘが酸素原子の場合は、Ｒ7及びＲ8は存在せず；
    Ｒ9は、各出現において独立に、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基から選択され；
    Ｒ10は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；Ｘは、酸素原子、珪素原子又は炭素原子を示し；
    ｍは、０～４の整数であり；
    ｎは、１～３の整数であり；
    ｓは、１の整数であり；
    ｔは、０～４の整数である。）
  3. 　前記第一のプローブが、２´－（４－メチルウンベリフェリル）－α－Ｄ－Ｎ－アセチルノイラミン酸（4MU-NANA）である、請求項１又は２記載の検出方法。
  4. 　前記第一のプローブから生成する信号が検出され、前記第二のプローブから生成する信号が検出されない場合に、前記生物試料中のインフルエンザウイルスの存在を検出し、
    前記第一のプローブから生成する信号及び前記第二のプローブから生成する信号が検出された場合に、前記生物試料中のインフルエンザウイルスの不存在を検出する、請求項１－３のいずれか一項に記載の検出方法。
  5. 　デジタル法に基づく、請求項１－４のいずれか一項に記載の検出方法。
  6. 　インフルエンザウイルスに感染した対象又は感染した疑いがある対象から分離された生物試料中のインフルエンザウイルスを検出するためのキットであって、
    　インフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼ及びバクテリア由来のノイラミニダーゼの双方により分解されて光学的に検出可能な信号を生成する第一のプローブと、
    　バクテリア由来のノイラミニダーゼにより分解されて光学的に検出可能な信号を生成しかつインフルエンザ由来のノイラミニダーゼにより分解されない第二のプローブと、を含み、
    　前記第二のプローブが以下の式（１）で表わされる化合物又はその塩である、キット。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
    （式中、
    Ｒ1は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；
    Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
    Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
    Ｒ6は、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、又は炭素数１～５個のフッ化アルキル基を示し；
    Ｒ7及びＲ8は、存在する場合は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基を示し、
    ここで、Ｘが酸素原子の場合は、Ｒ7及びＲ8は存在せず；
    Ｒ9は、各出現において独立に、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基から選択され；
    Ｒ10は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；Ｘは、酸素原子、珪素原子又は炭素原子を示し；
    ｍは、０～４の整数であり；
    ｎは、１～３の整数であり；
    ｓは、１の整数であり；
    ｔは、０～４の整数である。）
  7. 　前記第一のプローブが、２´－（４－メチルウンベリフェリル）－α－Ｄ－Ｎ－アセチルノイラミン酸（4MU-NANA）である、請求項６記載のキット。
  8. 　以下の式（１）で表わされる化合物又はその塩の、インフルエンザウイルスをバクテリアと識別検出するための使用。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
    （式中、
    Ｒ1は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；
    Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
    Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
    Ｒ6は、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、又は炭素数１～５個のフッ化アルキル基を示し；
    Ｒ7及びＲ8は、存在する場合は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基を示し、
    ここで、Ｘが酸素原子の場合は、Ｒ7及びＲ8は存在せず；
    Ｒ9は、各出現において独立に、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基から選択され；
    Ｒ10は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；Ｘは、酸素原子、珪素原子又は炭素原子を示し；
    ｍは、０～４の整数であり；
    ｎは、１～３の整数であり；
    ｓは、１の整数であり；
    ｔは、０～４の整数である。）
  9. 　対象のインフルエンザウイルスへの感染の有無を診断する方法であって、
    （１）インフルエンザウイルスに感染した対象又は感染した疑いがある対象から分離された生物試料を、第一のプローブと第二のプローブと混合する手順１、
    　ここで、前記第一のプローブは、インフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼ及びバクテリア由来のノイラミニダーゼの双方により分解されて光学的に検出可能な信号を生成するものであり、
    　前記第二のプローブは、バクテリア由来のノイラミニダーゼにより分解されて光学的に検出可能な信号を生成しかつインフルエンザ由来のノイラミニダーゼにより分解されないものであり、
    　前記第一のプローブから生成する信号と前記第二のプローブから生成する信号は光学的に区別して検出可能である、と、
    （２）前記第一のプローブ及び前記第二のプローブから生成する信号を検出する手順２と、を含み、
    　前記第二のプローブから生成する信号の強度に対する前記第一のプローブから生成する信号の強度の比が所定値以上である場合に、前記対象のインフルエンザウイルスの感染を決定し、
    　前記比が前記所定値未満である場合に、前記対象のインフルエンザウイルスの非感染を決定する、診断方法。
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