WO2020090563A1 - 培養容器、培養方法、及び輸送方法 - Google Patents

培養容器、培養方法、及び輸送方法 Download PDF

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WO2020090563A1
WO2020090563A1 PCT/JP2019/041436 JP2019041436W WO2020090563A1 WO 2020090563 A1 WO2020090563 A1 WO 2020090563A1 JP 2019041436 W JP2019041436 W JP 2019041436W WO 2020090563 A1 WO2020090563 A1 WO 2020090563A1
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WO
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culture
top plate
container
flow path
main body
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PCT/JP2019/041436
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French (fr)
Inventor
小関　修
郷史 田中
Original Assignee
東洋製罐グループホールディングス株式会社
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    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/12—Well or multiwell plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
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    • C12M25/06—Plates; Walls; Drawers; Multilayer plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
    • C12M41/32—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of substances in solution

Definitions

  • the present invention relates to a cell culture-related technique, and more particularly to a technique for improving the efficiency of sphere creation and the like.
  • This culture container includes a container body having a bottom portion having a compartment formed therein and a peripheral wall portion rising from a peripheral portion of the bottom portion, and a partition member arranged at a position facing the bottom portion, and at least a part of the partition member. Is immersed in the culture solution in the container body. This prevents the spheres from moving when moving the culture vessel or changing the medium.
  • a problem that it is difficult to align the peripheral wall portion of the compartment with the partition member and to adjust the gap between the compartment and the partition member. Further, when there is a warp in the bottom portion or the partition member, these become more difficult, and thus it was difficult to apply this culture container to a culture bag made of a soft packaging material.
  • This cell culture container is provided with a container body and a lid body that can be freely taken in and out from an inner cavity of the container body, and a plurality of recesses for accommodating cells are arranged on a bottom surface of the inner cavity. Is made of a flexible liquid-permeable material. While the lid is immersed in the medium, the lower surface of the lid is shaped and held so as to follow the bottom surface, which allows the sphere to be enclosed in the compartment.
  • a gap may be formed between the concave portion and the lid body, so that it is particularly difficult to apply it to a culture bag made of a soft packaging material. .. Further, in this cell culture container, it was difficult to completely discharge the medium in the recess, and it was not suitable for rapid medium exchange.
  • a culture container provided with a container body having a first surface on which a concave portion is formed and a top plate having a second surface facing the first surface
  • the first surface and / or the second surface is provided with a protrusion and / or a flow path, and the container body and a part of the top plate are brought into contact with each other, and the culture object such as a sphere is placed between the container body and the top plate.
  • a channel with a width smaller than the small diameter is formed to allow passage of liquids such as culture medium and passage of cells and debris smaller than the minimum diameter of the target culture object among a large number of recesses formed in the culture container.
  • a culture container that can suppress the movement between recesses such as spheres. Further, according to this culture container, it is not necessary to align the concave portion with the top plate, and the culture container can be easily realized as a closed culture bag made of a soft packaging material. Furthermore, since spheres and the like do not move between the recesses even when the medium is exchanged, it can be suitably used for long-term culture.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, in a culture container formed with a plurality of recesses for culturing an object to be cultured such as spheres, it is possible to pass the liquid substance between the recesses.
  • the culture container of the present invention is a culture container having a plurality of recesses for accommodating a culture object, and a container body having a first surface in which the recesses are formed,
  • the container main body is provided with a top plate having a second surface facing the first surface, and the first surface side and / or the second surface side is provided with a protrusion and / or a flow path portion.
  • a part of the top plate are in contact with each other to form a flow path between the container body and the top plate, and the width of the flow path is smaller than the minimum diameter of the culture object.
  • a top plate protrusion is provided on the second surface side, the width of the top plate protrusion is smaller than the width of the opening of the recess, and the top plate protrusion.
  • the height of the part is smaller than the minimum diameter of the culture object, the top plate protrusion contacts a part of the first surface, and a gap is formed between the first surface and the second surface. It is also preferable to have a formed structure.
  • the culturing method of the present invention is a method of using the above-mentioned culture container to take a medium or a washing solution in and out through the flow path formed between the container body and the top plate.
  • the transportation method of the present invention by using the above-mentioned culture container, to house the culture object in the recess, the recess, and the flow path formed between the container body and the top plate, a culture medium, This is a method of storing or transporting the culture object while being filled with a washing solution or a cell preservation solution.
  • a culture container having a plurality of recesses for culturing a culture object such as a sphere, it is possible to pass a liquid substance between the recesses, and the culture object between the recesses. It is possible to provide a culture container, a culture method, and a transportation method capable of suppressing the movement of bacteria.
  • FIG. 1 It is a schematic diagram which shows the top plate and container body in the culture container which concerns on 1st embodiment of this invention. It is a figure which shows the schematic plan view which expanded a part of culture container which concerns on 1st embodiment of this invention, and sectional drawing. It is a figure showing the photograph of the whole culture container created as a culture container concerning a first embodiment of the present invention. It is a figure which shows the one part photograph of the culture container created as the culture container which concerns on 1st embodiment of this invention. It is a figure which shows the schematic plan view which expanded a part of culture container which concerns on 2nd embodiment of this invention, and sectional drawing.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a top plate and a container body in a culture container according to the present embodiment
  • FIG. 2 is a schematic plan view and a cross-sectional view showing an enlarged part of the culture container according to the present embodiment.
  • the culture container of the present embodiment is a culture container provided with a plurality of recesses for accommodating an object to be cultured, and by bonding the container body 10 and the top plate 20 as shown in FIG. 1 by heat sealing or the like. It is formed.
  • the container body 10 has a first surface 10-1 in which the opening 12 in the recess 11 is formed, and the surface forming the side wall of the first surface 10-1 and the recess 11 is used as a culture surface, and a culture container is provided. Constitutes the bottom of.
  • the number of recesses 11 is not particularly limited.
  • the top plate 20 has a second surface 20-1 facing the first surface 10-1 of the container body 10.
  • the second surface 20-1 of the top plate 20 faces the first surface 10-1 of the container body 10 to form a culture container, and the container body 10 and a part of the top plate 20 are brought into contact with each other.
  • a flow path is formed between the container body 10 and the top plate 20, and the width of the flow path is smaller than the minimum diameter of the culture object 30.
  • the flow path is formed by the protrusion in the first and second embodiments, and is formed by the flow path in the third and fourth embodiments.
  • the culture container of the present embodiment is provided with a top plate protrusion 21 on the second surface 20-1 side of the top plate 20.
  • the width of the top plate protrusion 21 is smaller than the width of the opening 12 in the recess 11 of the container body 10, and the height of the top plate protrusion 21 is smaller than the minimum diameter of the culture object 30. Then, the tip portion of the top plate projection 21 comes into contact with a part of the first surface 10-1 of the container body 10 (other than the region corresponding to the opening 12), so that the first surface of the container body 10 A gap is formed between 10-1 and the second surface 20-1 of the top plate 20.
  • FIG. 2 shows a schematic plan view, an AA ′ cross-sectional view, and an A ′′ A ′′ ′ cross-sectional view showing a state in which a sphere is accommodated as a culture object 30 in a part of such a culture container. ..
  • the top plate protrusions 21 are elongated triangular columns protruding from the second surface 20-1 and are arranged at equal intervals on all the recesses.
  • the arrangement is not limited to this, and various shapes and arrangements can be made as long as a gap can be formed between the first surface 10-1 and the second surface 20-1. That is, the top plate protrusions 21 may be, for example, semicylindrical protrusions protruding from the second surface 20-1, and may be randomly arranged on the second surface 20-1.
  • the gap between the first surface 10-1 of the container body 10 and the second surface 20-1 of the top plate 20 is the same as the height of the top plate protrusion 21. It is smaller than the diameter of the object. Therefore, the culture object cannot pass through the gap between the first surface 10-1 and the second surface 20-1 and can be retained in the recess 11.
  • the culture object such as the sphere cannot move from the recess and may enter the next recess. Can not. Therefore, according to the culture container of the present embodiment, it is possible to solve the conventional problem that it is difficult to obtain a sphere having a desired size and shape. Further, since the sphere does not jump out of the concave portion and move to another concave portion even if the flow velocity of the medium is increased, the medium can be easily taken in and out, and the medium can be easily replaced. It is also easy to move the culture vessel during the culture of the spheres.
  • the culture container of the present embodiment even when the culture container is tilted or inverted, the state in which the sphere is held in the recess can be maintained, so that the medium can be easily replaced.
  • the culture container of the present embodiment can also be used for washing an object to be cultured. That is, a culture solution is easily washed by injecting a washing solution such as a phosphate buffer solution, physiological saline, or a cell preservation solution into the culture container, tilting or reversing the culture container, and discharging the washing solution from the culture container. can do.
  • a washing solution such as a phosphate buffer solution, physiological saline, or a cell preservation solution
  • the spheres were once collected together, suspended in a container such as a centrifuge tube containing the washing solution, and after the sphere settled, the supernatant during washing was repeatedly extracted several times. .. Since spheres have a property of aggregating when the spheres come into contact with each other, the cleaning operation needs to be performed in a short time. In the conventional method, there was a risk that the spheres would aggregate with each other in the worst case, but the culture container of the present embodiment can easily solve this problem.
  • the culture container of the present embodiment it is possible to obtain the culture object in a state of being arranged in each section composed of a plurality of recesses, and to obtain these in a uniform size according to the recesses. is there. Then, since the culture object can be obtained in a state of being arranged in each section, it is possible to easily count the culture object.
  • the culture object is accommodated in the recess, and the recess and the flow path formed between the container body and the top plate are filled with a medium, a washing solution, or a cell preservation solution.
  • the culture container of the present embodiment is a container in which the concave portion and the flow path formed between the container body and the top plate are filled with a medium, a cleaning solution or the like to perform medium replacement, cleaning, transportation, etc. It goes without saying that the main body and the top plate do not have through holes.
  • the culture object 30 in the present embodiment not only spheres but also cells, biological tissues, etc. can be used.
  • the culture object 30 also includes a cleaning object. That is, by setting the width of the flow path formed between the container body 10 and the top plate 20 to a value suitable for the size of the culture object 30, it can be applied to the culture of various culture objects 30, It is also possible to wash these.
  • the container body 10 and / or the top plate 20 can be made of a soft packaging material, and can be configured as a culture bag. That is, in the culture container of the present embodiment, by pressing the top plate 20 against the container body 10, the tip of the top plate protrusion 21 can be easily brought into contact with a part of the first surface of the container body 10. Yes, it is possible to maintain that state. At this time, the container body 10 can be pressed by the top plate 20 by using, for example, a spring, a magnet, or suction, and the width of the flow path formed between the container body 10 and the top plate 20 can be appropriately adjusted. It is possible to control.
  • the width of the flow path formed between the container body 10 and the top plate 20 can be easily controlled. Further, since the width of the top plate protrusion 21 is smaller than the width of the opening 12 in the recess 11, the top plate protrusion 21 may be arranged anywhere with respect to the recess 11, and the container body 10 and the top plate 20 may be arranged. It is possible to eliminate the need for strict alignment with.
  • the size of a single cell is about 6 ⁇ m to 15 ⁇ m, and often about 10 ⁇ m.
  • One sphere can be formed by aggregating about 300 to several thousand single cells. The size of the sphere thus formed is about 50 ⁇ m to 100 ⁇ m for a small one, and about 200 ⁇ m to 300 ⁇ m for a large one.
  • the width of the flow path (gap) formed between the container body 10 and the top plate 20 (the height of the top plate protrusion 21) is set to , It is desirable to set according to the size of the target sphere. For example, when making a small sphere, it is preferable to set the thickness to about 10 ⁇ m, 20 ⁇ m, 30 ⁇ m, 40 ⁇ m. Moreover, when making a large sphere, it is preferable that the size is about 50 ⁇ m, 60 ⁇ m, 70 ⁇ m, 80 ⁇ m, 90 ⁇ m, 100 ⁇ m.
  • the width of the flow path formed between the container body 10 and the top plate 20 is, for example, about 2 ⁇ m, 3 ⁇ m, 4 ⁇ m, 5 ⁇ m. Preferably.
  • the width of the flow path formed between the container body 10 and the top plate 20 is set according to the size of the target biological tissue. It is desirable to set.
  • the shape of the recessed portion 11 of the container body 10 is a hemispherical shape in the examples of FIGS. 1 and 2, but the shape is not limited to this, and it may be a conical shape, a truncated cone shape, or a polygonal prism shape. It is also possible to have a polygonal pyramid shape, a polygonal pyramid shape, or the like.
  • a polyolefin resin such as polyethylene or polypropylene can be preferably used.
  • examples thereof include polyethylene, ethylene- ⁇ -olefin copolymers, ethylene-vinyl acetate copolymers, ethylene-acrylic acid or methacrylic acid copolymers, and ionomers using metal ions.
  • polyolefin, styrene-based elastomer, polyester-based thermoplastic elastomer, silicone-based thermoplastic elastomer, silicone resin and the like can also be used.
  • silicone rubber soft vinyl chloride resin, polybutadiene resin, ethylene-vinyl acetate copolymer, chlorinated polyethylene resin, polyurethane-based thermoplastic elastomer, polyester-based thermoplastic elastomer, silicone-based thermoplastic elastomer, styrene-based elastomer, for example, SBS (styrene / butadiene / styrene), SIS (styrene / isoprene / styrene), SEBS (styrene / ethylene / butylene / styrene), SEPS (styrene / ethylene / propylene / styrene), polyolefin resin, fluorine resin, etc. Good.
  • SBS styrene / butadiene / styrene
  • SIS styrene / isoprene / styrene
  • the culture object 30 is a sphere
  • the sphere or the single cell does not adhere to the first surface 10-1 of the container body 10 and the surface forming the sidewall of the recess 11.
  • a low-adhesion surface treatment coating it is preferable to apply a cell adhesion inhibitor (cell low adhesion treatment agent) in advance.
  • a cell adhesion inhibitor cell low adhesion treatment agent
  • phospholipid polymer, polyvinyl alcohol derivative, phospholipid / polymer complex, polyhydroxyethyl methacrylate, polyvinyl alcohol, agarose, chitosan, polyethylene glycol, albumin and the like can be used. Also, these may be used in combination.
  • the culture container of the present embodiment may be used in a step of forming a sphere, a step of culturing and proliferating while maintaining a sphere state, a step of inducing differentiation in a sphere state, and the like. it can.
  • a method of forming spheres using differentiated cells obtained from iPS cells, ES cells, and other stem cells that have already undergone a differentiation-inducing step, or a method in which differentiation-induced cells are cryopreserved once and thawed again to form spheres It can also be used in methods and the like.
  • the spheres formed to contain the target differentiation-inducing cells are washed with a phosphate buffer, physiological saline, or the like, or used in an adjusting step in which they are suspended in water for injection or the like. It is also possible.
  • the washing liquid is directly passed through the culture container to be washed, and after being formed in another culture container such as a bioreactor. It is conceivable to transfer the spheres to the culture container of the present embodiment and wash them without overlapping the spheres.
  • the differentiation-induced cells are once cryopreserved and then thawed again to form spheres. That is, cells that have been induced to differentiate in the adherent culture or sphere state are not necessarily immediately administered to the living body, but may be once frozen and stored and then thawed before use. Due to the nature of cells, it is difficult to freeze in a sphere state, and even if differentiation is induced by spheres, it is necessary to loosen the cells into single cells before freezing.
  • the culture container of the present embodiment When the culture container of the present embodiment is used, not only the medium can be exchanged but also the spheres can be easily washed during the culture of the spheres, which is very advantageous in the culture of the spheres. Further, for example, when a large amount of spheres are cultured in a bioreactor or the like and then returned to a single cell and frozen, the sphere is formed and washed and then water for injection is used for each administration by using the culture container of the present embodiment. It is also easy to carry out suspension.
  • the culture container of the present embodiment can be particularly preferably used for a culture bag made of a soft packaging material, thereby eliminating the problem in the conventional culture bag having a large number of recesses on the culture surface.
  • the culture bag when the medium is fed into the bag in order to exchange the medium, the sphere easily jumps out of the well and moves to another well.
  • the outer diameter is 100 mm ⁇ 50 mm
  • the medium could be sent only at a flow rate of about 0.2 ml / min.
  • the culture container of the present embodiment the medium can be sent without considering the flow rate, so that the spheres can be efficiently cultured.
  • the culture container of the present embodiment it is possible to feed the medium at a rate of 5 ml / min.
  • the culture container of the present embodiment is not limited to the culture bag made of the soft packaging material, and may be a dish-shaped rigid culture container.
  • FIG. 3 and 4 show photographs of the culture container prepared as the culture container according to the present embodiment.
  • This culture container is made by bonding a container body 10 made of polyethylene and having a size of 12 cm ⁇ 7 cm and a top plate 20 by heat sealing. Ports are provided at both ends, and the recess has a diameter of 2 mm.
  • the height of the plate projection is 50 ⁇ m, and the width of the top projection is 100 ⁇ m.
  • the top plate protrusions are arranged so as to cover the entire culture surface at intervals of 2 mm.
  • beads with a diameter of 200 ⁇ m are placed in the recess of this culture container, and the medium is passed through while the top plate is pressed against the container body, and the beads do not jump out of the recess and move to the adjacent recess. It was confirmed. Also, even if the culture vessel was turned over and all the medium was discharged from the recess, the beads were still retained in the recess.
  • FIG. 5 is a diagram showing a schematic plan view and a sectional view in which a part of the culture container according to the present embodiment is enlarged.
  • the culture container of the present embodiment is a culture container having a plurality of recesses for accommodating a culture object, and as shown in FIG. 5, includes a container body 10b and a top plate 20b.
  • the container body 10b has a first surface 10b-1 in which the opening 12b in the recess 11b is formed, and the surface forming the side wall of the first surface 10b-1 and the recess 11b is used as a culture surface, and a culture container is provided. Constitutes the bottom of.
  • the top plate 20b has a second surface 20b-1 facing the first surface 10b-1 of the container body 10b.
  • the culture vessel is formed by facing the second surface 20b-1 of the top plate 20b to the first surface 10b-1 of the container body 10b, and by bringing the container body 10b and a part of the top plate 20b into contact with each other.
  • a flow path is formed between the container body 10b and the top plate 20b, and the width of the flow path is smaller than the minimum diameter of the culture object 30.
  • the culture container of the present embodiment is provided with a main body protrusion 13b on the first surface 10b-1 side of the main container body 10b.
  • the height of the main body protrusion 13b is smaller than the minimum diameter of the culture object 30. Then, the tip portion of the main body protrusion 13b comes into contact with a part of the second surface 20b-1 of the top plate 20, whereby the first surface 10b-1 of the container main body 10b and the second surface 20b-1 of the top plate 20b. A gap is formed on the surface 20b-1.
  • FIG. 5 shows a schematic plan view and a BB ′ cross-sectional view showing a state in which a sphere as a culture object 30 is housed in a part of such a culture container.
  • the main body protrusions 13b project in a triangular prism shape from the first surface 10-1 and are evenly arranged among all the recesses, but the shape and arrangement of the main body protrusions 13b are not limited to this. However, various shapes and arrangements can be made within a range in which a gap can be formed between the first surface 10b-1 and the second surface 20b-1. That is, the main body protrusions 13b may be, for example, semi-cylindrical protrusions from the first surface 10b-1, and may be randomly arranged on the first surface 10b-1.
  • the gap between the first surface 10b-1 of the container body 10b and the second surface 20b-1 of the top plate 20b is the same as the height of the main body protrusion 13b, and the height of the main body protrusion 13b is the culture object. Smaller than the diameter of. Therefore, the culture object cannot pass through the gap between the first surface 10b-1 and the second surface 20b-1 and can be retained in the recess 11b.
  • Other configurations and effects of the culture container of this embodiment are the same as those of the first embodiment.
  • FIG. 6 is a diagram showing an enlarged schematic plan view and a sectional view of a part of the culture container according to the present embodiment.
  • the culture container of the present embodiment is a culture container provided with a plurality of recesses for accommodating an object to be cultured, and includes a container body 10c and a top plate 20c as shown in FIG.
  • the container body 10c has a first surface 10c-1 in which the opening 12c in the recess 11c is formed, and the surface forming the side wall of the first surface 10c-1 and the recess 11c is the culture surface, and the culture container Constitutes the bottom of.
  • the top plate 20c has a second surface 20c-1 facing the first surface 10c-1 of the container body 10c. In FIG. 4, some of these surfaces are in contact.
  • the culture container by forming the culture container by facing the second surface 20c-1 of the top plate 20c to the first surface 10c-1 of the container body 10c, and bringing the container body 10c and a part of the top plate 20c into contact with each other.
  • a channel is formed between the container body 10c and the top plate 20c, and the width of the channel is smaller than the minimum diameter of the culture object 30.
  • the culture container of the present embodiment is provided with a main body flow path portion 14c on the first surface 10c-1 side of the container main body 10c.
  • the main body flow path portion 14c is provided between the concave portions 11c so as to connect all the concave portions 11c to one space.
  • the width of the main body channel portion 14c is smaller than the minimum diameter of the culture object 30.
  • the first surface 10c-1 and a part of the second surface 20c-1 (other than the area corresponding to the opening 12c and the main body flow path portion 14c) contact each other, and the container body 10c and the top plate 20c.
  • the main body channel portion 14c is formed between the two.
  • FIG. 6 shows a schematic plan view showing a state in which a sphere as the culture object 30 is housed in a part of such a culture container, and a CC ′ sectional view.
  • the main body flow passage portion 14c is formed in a substantially columnar shape evenly among all the recesses, but the shape and arrangement of the main body flow passage portion 14c are not limited to this, and the main body flow passage portion 14c is not limited to this.
  • Various shapes and arrangements can be made as long as a flow path can be formed between the top plates 20c. That is, the main body flow path portion 14c may be, for example, a prismatic shape and randomly arranged so that all the concave portions 11c are connected to one space.
  • the first surface 10c-1 and the second surface 20c-1 are in contact with each other, and the width of the main body flow path portion 14c is , Smaller than the diameter of the culture object. Therefore, the culture object cannot pass through the main body flow path portion 14c and can be held in the recess 11c.
  • Other configurations and effects of the culture container of this embodiment are the same as those of the first embodiment.
  • FIG. 7 is a diagram showing a schematic plan view and a sectional view in which a part of the culture container according to the present embodiment is enlarged.
  • the culture container of the present embodiment is a culture container having a plurality of recesses for accommodating a culture object, and as shown in FIG. 7, includes a container body 10d and a top plate 20d.
  • the container body 10d has a first surface 10d-1 in which the opening 12d in the recess 11d is formed, and the surface forming the side wall of the first surface 10d-1 and the recess 11d is used as a culture surface, and a culture container is provided. Constitutes the bottom of.
  • the top plate 20d has a second surface 20d-1 that faces the first surface 10d-1 of the container body 10d. In FIG. 7, some of these surfaces are in contact.
  • the second surface 20d-1 of the top plate 20d faces the first surface 10d-1 of the container body 10d to form a culture container, and the container body 10d and a part of the top plate 20d are brought into contact with each other.
  • a flow path is formed between the container body 10d and the top plate 20d, and the width of the flow path is smaller than the minimum diameter of the culture object 30.
  • the culture container of the present embodiment is provided with a top plate flow path portion 22d on the second surface 10d-1 side of the top plate 20d.
  • the top plate channel portion 22d is provided in the top plate 20 so as to connect all the recesses 11d to one space.
  • the width of the top plate channel portion 22d is smaller than the minimum diameter of the culture object 30.
  • the first surface 10d-1 and a part of the second surface 20d-1 are in contact with each other, and the container body 10d and the top plate 10d-1.
  • a top plate channel portion 22d is formed between 20d.
  • FIG. 7 shows a schematic plan view and a DD ′ cross-sectional view showing a state in which a sphere as a culture object 30 is housed in a part of such a culture container.
  • the top plate channel portion 22d has a substantially columnar shape and is evenly formed so as to connect all the recesses, but the shape and arrangement of the top panel channel portion 22d are not limited to this. Instead, various shapes and arrangements can be made as long as a flow path can be formed between the container body 10d and the top plate 20d. That is, the top plate flow path portion 22d may be, for example, a prismatic shape and randomly arranged so that all the recesses 11d are connected to one space.
  • a part of the first surface 10d-1 and the second surface 20d-1 are in contact with each other, and the top plate flow path
  • the width of the portion 22d is smaller than the diameter of the culture object. Therefore, the culture object cannot pass through the top plate channel portion 22d and can be retained in the recess 11d.
  • Other configurations and effects of the culture container of this embodiment are the same as those of the first embodiment.
  • the configurations of the culture vessels of the first embodiment to the fourth embodiment. Specifically, by combining the configuration of the culture container of the first embodiment and the second embodiment, with the top plate protrusion on the second surface, the main body protrusion between the plurality of recesses on the first surface. It is also possible to have a configuration provided. In this case, the height of the top plate protrusion and the height of the main body protrusion are made the same, and a gap smaller than the minimum diameter of the culture object is the same between these heights and the first surface and the second surface. Formed in.
  • the configuration of the culture container of the first embodiment and / or the second embodiment and the third embodiment at least one of the top plate protrusion and the main body protrusion is provided, and the first surface is provided. It is also possible to adopt a configuration including a main body flow path portion. In this case, a gap is formed without contact between the first surface and the second surface, and the sum of the width of the main body channel portion and the width of the gap between the first surface and the second surface is It is smaller than the minimum diameter.
  • first embodiment and / or the second embodiment and the configuration of the culture container of the fourth embodiment are combined to include at least one of the top plate protrusion and the main body protrusion, and to the second surface. It is also possible to adopt a configuration including a top plate flow path portion. In this case, a gap is formed without contact between the first surface and the second surface, and the total width of the width of the top plate channel and the width of the gap between the first surface and the second surface is the culture object. Is smaller than the minimum diameter of.
  • the configurations of the culture vessels of the third embodiment and the fourth embodiment can be combined to obtain a configuration including a main body flow path portion and a top plate flow path portion.
  • the first surface and a part of the second surface are in contact with each other, and the total width of the main body flow path portion and the top plate flow path portion is smaller than the minimum diameter of the culture object.
  • the height of the top plate protrusion and the height of the main body protrusion are the same, a gap is formed without contact between the first surface and the second surface, and the first surface and the second surface are The total of the width of the gap, the width of the main body flow path portion and the width of the top plate flow path portion is smaller than the minimum diameter of the culture object.
  • the culture container in which a plurality of recesses for culturing a culture object such as a sphere are formed, It is possible to pass a liquid material such as a culture medium or to pass cells or debris smaller than the minimum diameter of the target culture object, and to suppress the movement of the culture object between the recesses.
  • the present invention is not limited to the above embodiments and examples, and various modifications can be made within the scope of the present invention.
  • the size of the culture vessel is not limited to the size shown in the embodiment, and can be appropriately changed, for example, to a size capable of forming 500,000 to 1 million spheres.
  • the present invention can be suitably used when efficiently creating a large number of uniformly-sized spheres arranged at equal intervals.

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Abstract

スフェアなどの培養対象物を培養するための複数の凹部が形成された培養容器において、凹部間での液状物の通液が可能であり、かつ凹部間での培養対象物の移動を抑制することを可能とする。培養対象物を収容するための複数の凹部（１１）を備えた培養容器であって、凹部が形成された第一の面（１０－１）を有する容器本体（１０）と、第一の面に対面する第二の面（２０－１）を有する天板（２０）を備え、第一の面側及び／又は第二の面側に突起部及び／又は流路部が備えられ、容器本体と天板の一部（２１）が接触して、容器本体と天板の間に流路が形成され、流路の幅が、培養対象物の最小径より小さい培養容器とする。

Description

培養容器、培養方法、及び輸送方法
　本発明は、細胞培養関連技術に関し、特にスフェアの作成などを効率化する技術に関する。
　近年、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの幹細胞等の接着細胞を大量に培養する場合には、細胞を培養容器に接着させて増殖させるだけではなく、細胞に対して接着性の低い材料を塗工したマイクロウェルプレートなどを備えた培養容器を使用して、スフェア（スフェロイド，凝集塊）やオルガノイドを形成させることによって、細胞をより生体内に近い三次元的な状態で培養する方法が用いられている。
　このような培養容器を使用したスフェアの大量培養においては、スフェアがウェル（凹部）から飛び出して他のウェルに移動してしまい、所望の大きさや形状のスフェアを得ることが難しいという問題があった。
　例えば、培地交換を行うために、多数のウェルを培養面に備えた培養バッグ（袋状の培養容器）内に培地を送液すると、スフェアは簡単にウェルから飛び出して他のウェルに移動するため、培地の流速を極めて遅くする必要があり、迅速な培地交換が非常に困難であった。このため、このような培養容器は、頻繁に培地交換が必要な長期間培養には不向きであった。
　また、このような培養容器では、振動を与えただけでもスフェアが簡単にウェルから飛び出してしまうため、スフェアの培養中に培養容器を安全に移動させることは、容易にはできなかった。
特開２０１８－１０８０３２号公報 特開２０１８－５０号公報
　このような問題の解消に関連する技術として、特許文献１に記載の培養容器を挙げることができる。この培養容器は、隔室が形成された底部と底部の周縁部分から立ち上がった周壁部とを備える容器本体と、底部と対向する位置に配置される仕切り部材とを備え、仕切り部材が少なくとも一部が容器本体内の培養液中に浸漬されている。そして、これにより、培養容器の移動や培地交換の際にスフェアが移動することを抑制している。
　しかしながら、隔室の周壁部と仕切り部材の位置合わせや、隔室と仕切り部材間のギャップの調整が難しいという問題があった。また、底部や仕切り部材の反りがある場合には、これらは更に難しくなるため、この培養容器を軟包材からなる培養バッグに適用することは困難であった。
　また、特許文献２に記載の細胞培養容器を挙げることもできる。この細胞培養容器は、容器本体と、容器本体の内腔に対して出し入れ自在な蓋体とを備え、内腔の底面には細胞を収容するための複数の凹部が配置されており、蓋体は可撓性を有する透液性素材からなる。蓋体が培地に浸漬されている状態で、蓋体の下面が底面に追随するように賦形されて保持され、これによってスフェアを隔室に閉じ込めることが可能になっている。
　しかしながら、この細胞培養容器でも、容器本体に反りがある場合には、凹部と蓋体の間に隙間が生じることがあるため、特に軟包材からなる培養バッグに適用することは困難であった。また、この細胞培養容器では、凹部内の培地を全て排出することは難しく、迅速な培地交換には不向きであった。
　そこで、本発明者らは鋭意研究して、凹部が形成された第一の面を有する容器本体と、第一の面に対面する第二の面を有する天板を備えた培養容器において、第一の面及び／又は第二の面に突起部及び／又は流路部を備え、容器本体と天板の一部を接触させて、容器本体と天板の間に、スフェアなどの培養対象物の最小径より小さい幅を有する流路を形成し、培養容器に形成された多数の凹部間で培地などの液状物の通液や目的の培養対象物の最小径より小さい細胞やデブリの通過を可能とし、かつスフェアなどの凹部間での移動を抑制可能な培養容器を開発することに成功した。
　また、この培養容器によれば、凹部と天板の位置合せが不要であり、軟包材からなる閉鎖系の培養バッグとしても容易に実現することが可能である。さらに、培地交換を行っても凹部間でスフェアなどが移動しないため、長時間の培養に好適に用いることが可能である。
　本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、スフェアなどの培養対象物を培養するための複数の凹部が形成された培養容器において、凹部間での液状物の通液が可能であり、かつ凹部間での培養対象物の移動を抑制可能な培養容器、培養方法、及び輸送方法の提供を目的とする。
　上記目的を達成するため、本発明の培養容器は、培養対象物を収容するための複数の凹部を備えた培養容器であって、前記凹部が形成された第一の面を有する容器本体と、前記第一の面に対面する第二の面を有する天板を備え、前記第一の面側及び／又は前記第二の面側に突起部及び／又は流路部が備えられ、前記容器本体と前記天板の一部が接触して、前記容器本体と前記天板の間に流路が形成され、前記流路の幅が、前記培養対象物の最小径より小さい構成としてある。
　また、本発明の培養容器を、前記第二の面側に天板突起部が備えられ、前記天板突起部の幅が、前記凹部の開口部の幅よりも小さく、かつ、前記天板突起部の高さが、前記培養対象物の最小径より小さく、前記天板突起部が、前記第一の面の一部に接触して、前記第一の面と前記第二の面に間隙が形成された構成とすることも好ましい。
　また、本発明の培養方法は、上記の培養容器を用いて、前記容器本体と前記天板の間に形成された前記流路を通じて、培地又は洗浄液を出し入れする方法としてある。
　また、本発明の輸送方法は、上記の培養容器を用いて、前記凹部に前記培養対象物を収容し、前記凹部、及び前記容器本体と前記天板の間に形成された前記流路に、培地、洗浄液、又は細胞保存液を満たした状態で、前記培養対象物を保管又は輸送する方法としてある。
　本発明によれば、スフェアなどの培養対象物を培養するための複数の凹部が形成された培養容器において、凹部間での液状物の通液が可能であり、かつ凹部間での培養対象物の移動を抑制可能な培養容器、培養方法、及び輸送方法の提供が可能となる。
本発明の第一実施形態に係る培養容器における天板と容器本体を示す模式図である。 本発明の第一実施形態に係る培養容器の一部を拡大した模式平面図と断面図を示す図である。 本発明の第一実施形態に係る培養容器として作成された培養容器の全体の写真を示す図である。 本発明の第一実施形態に係る培養容器として作成された培養容器の一部の写真を示す図である。 本発明の第二実施形態に係る培養容器の一部を拡大した模式平面図と断面図を示す図である。 本発明の第三実施形態に係る培養容器の一部を拡大した模式平面図と断面図を示す図である。 本発明の第四実施形態に係る培養容器の一部を拡大した模式平面図と断面図を示す図である。
　以下、本発明の培養容器、培養方法、及び輸送方法の実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の実施形態の具体的な内容に限定されるものではない。
［第一実施形態］
　本発明の第一実施形態に係る培養容器、培養方法、及び輸送方法について、図１及び図２を参照して説明する。図１は、本実施形態に係る培養容器における天板と容器本体を示す模式図であり、図２は、本実施形態に係る培養容器の一部を拡大した模式平面図と断面図を示す図である。
　本実施形態の培養容器は、培養対象物を収容するための複数の凹部を備えた培養容器であり、図１に示すような容器本体１０と天板２０をヒートシール等により貼り合わせることなどによって形成される。
　容器本体１０は、凹部１１における開口部１２が形成された第一の面１０－１を有し、この第一の面１０－１と凹部１１の側壁を形成する面を培養面として、培養容器の底部を構成する。凹部１１の個数は特に限定されない。
　天板２０は、容器本体１０の第一の面１０－１に対面する第二の面２０－１を有する。
　そして、容器本体１０の第一の面１０－１に天板２０の第二の面２０－１を向かい合わせて培養容器を形成し、容器本体１０と天板２０の一部を接触させることによって、容器本体１０と天板２０の間に流路が形成され、この流路の幅が、培養対象物３０の最小径より小さくなっている。流路は、第一実施形態と第二実施形態では突起部によって形成され、第三実施形態と第四実施形態では流路部によって形成される構成となっている。
　具体的には、本実施形態の培養容器は、天板２０の第二の面２０－１側に天板突起部２１が備えられている。
　天板突起部２１の幅は、容器本体１０の凹部１１における開口部１２の幅よりも小さく、かつ、天板突起部２１の高さは、培養対象物３０の最小径より小さい。
　そして、天板突起部２１の先端部が、容器本体１０の第一の面１０－１の一部（開口部１２に対応する領域以外）に接触することによって、容器本体１０の第一の面１０－１と天板２０の第二の面２０－１に間隙が形成されている。
　図２には、このような培養容器の一部に、培養対象物３０としてスフェアを収容した様子を示す模式平面図、ＡＡ’断面図、及びＡ’’Ａ’’’断面図を示している。
　ＡＡ’断面図において、天板突起部２１は、細長の三角柱状に第二の面２０－１から突出し、全ての凹部上に等間隔に配置されているが、天板突起部２１の形状及び配置はこれに限定されず、第一の面１０－１と第二の面２０－１に間隙を形成できる範囲で、様々な形状及び配置にすることができる。
　すなわち、天板突起部２１を、例えば半円柱状に第二の面２０－１から突出したものとし、第二の面２０－１においてランダムに配置させたものすることもできる。
　容器本体１０の第一の面１０－１と天板２０の第二の面２０－１の間隙は、天板突起部２１の高さと同一であり、天板突起部２１の高さは、培養対象物の直径より小さい。
　したがって、第一の面１０－１と第二の面２０－１の間隙を、培養対象物は通過することができず、凹部１１内に保持することが可能となっている。
　すなわち、第一の面と第二の面の間隙を通じて、培地などの液状物を通液したとしても、スフェアなどの培養対象物は凹部から移動することができず、隣の凹部に入り込むことができない。
　したがって、本実施形態の培養容器によれば、所望の大きさや形状のスフェアを得ることが難しいという従来の問題を解消することが可能となっている。
　また、培地の流速を速くしてもスフェアが凹部から飛び出して他の凹部に移動することがないため、培地の出し入れを簡単に行うことができ、容易に培地交換を行うことが可能である。また、スフェアの培養中に培養容器を移動させることも容易である。
　さらに、全ての培地を交換する場合には、培養容器を傾斜させたり、あるいは反転させることによって、培養容器内における培地を第一の面と第二の面の間隙を通じて、容易に出し入れすることが可能となっている。すなわち、培地を入れるときには容易に均一化することができ、また容易に排出することも可能である。また、このようにして、洗浄液を出し入れすることも容易である。
　このように、本実施形態の培養容器は、培養容器を傾斜又は反転させても、スフェアを凹部に保持した状態を維持できるため、培地交換などを容易に行うことが可能である。
　また、本実施形態の培養容器は、培養対象物の洗浄に用いることも可能である。
　すなわち、リン酸緩衝液や生理食塩水、細胞保存液などの洗浄液を培養容器に注入して、培養容器を傾斜又は反転させ、培養容器から洗浄液を排出することによって、培養対象物を容易に洗浄することができる。一般的なスフェアの洗浄では、一旦スフェアをまとめて回収し、洗浄液を入れた遠沈管などの容器に浮遊させ、スフェアが沈降した後に、洗浄時の上清を抜き取ることを数回繰り返し行っていた。スフェアは、スフェア同士が接触すると凝集する性質があるため、洗浄操作は短時間で処理する必要がある。従来の方法では、最悪の場合スフェア同士が凝集してしまう危険性があったが、本実施形態の培養容器によれば、この課題も容易に解決することが可能である。
　また、本実施形態の培養容器によれば、複数の凹部からなる各区画に配列させた状態で培養対象物を得ることができると共に、これらを凹部に応じた均一なサイズで得ることが可能である。
　そして、各区画に配列させた状態で培養対象物を得ることができるため、培養対象物のカウント（計数）を容易に行うことも可能となっている。
　また、本実施形態の培養容器によれば、凹部に培養対象物を収容して、凹部、及び容器本体と天板の間に形成された流路に、培地、洗浄液、又は細胞保存液を満たした状態で、培養対象物を保管又は輸送することも容易に行うことが可能となっている。
　このように本実施形態の培養容器は、凹部、及び容器本体と天板の間に形成された流路に、培地や洗浄液などを充填して、培地交換や洗浄、輸送等を行うものであり、容器本体や天板において、貫通孔などを有していないことは言うまでもない。
　本実施形態における培養対象物３０としては、スフェアのみならず、細胞や生体組織などを用いることもできる。培養対象物３０には、洗浄対象物も含まれる。
　すなわち、容器本体１０と天板２０の間に形成される流路の幅を培養対象物３０のサイズに適した値にすることで、様々な培養対象物３０の培養に適用することができ、またこれらを洗浄することなどが可能である。
　さらに、本実施形態の培養容器において、容器本体１０及び／又は天板２０を軟包材からなるものとすることができ、培養バッグとして構成することが可能である。
　すなわち、本実施形態の培養容器では、容器本体１０に天板２０を押しつけることで、天板突起部２１の先端部を、容器本体１０の第一の面の一部に容易に接触させることができ、その状態を維持することが可能である。
　このとき、例えば、バネやマグネット、あるいは吸引を行うことにより、天板２０で容器本体１０を押圧することができ、容器本体１０と天板２０の間に形成される流路の幅を適切に制御することが可能となっている。
　また、このように本実施形態の培養容器では、容器本体１０に天板２０を押しつけることで、容器本体１０と天板２０の間に形成される流路の幅を容易に制御することができ、また天板突起部２１の幅が、凹部１１における開口部１２の幅よりも小さいため、天板突起部２１は凹部１１に対してどこに配置されていても良く、容器本体１０と天板２０との厳密な位置合わせを不要にすることが可能になっている。
　ここで、シングルセル（単一細胞）の大きさは、６μｍ～１５μｍ程度であり、１０μｍ程度のものが多い。１個のスフェアは、約３００個から数千個程度のシングルセルを凝集させることによって形成させることができる。このようにして形成されたスフェアの大きさは、小さいもので、５０μｍ～１００μｍ程度であり、大きいものでは、２００μｍ～３００μｍ程度である。
　そこで、培養対象物をスフェアとする場合、本実施形態の培養容器において、容器本体１０と天板２０の間に形成される流路（間隙）の幅（天板突起部２１の高さ）を、目的とするスフェアのサイズに応じて設定することが望ましい。例えば、小さいスフェアを作成する場合には、１０μｍ，２０μｍ，３０μｍ，４０μｍ程度とすることが好ましい。また、大きいスフェアを作成する場合には、５０μｍ，６０μｍ，７０μｍ，８０μｍ，９０μｍ，１００μｍ程度とすることが好ましい。
　また、培養対象物をシングルセルとする場合、本実施形態の培養容器において、容器本体１０と天板２０の間に形成される流路の幅を、例えば、２μｍ，３μｍ，４μｍ，５μｍ程度とすることが好ましい。
　さらに、培養対象物を生体組織とする場合も、本実施形態の培養容器において、容器本体１０と天板２０の間に形成される流路の幅を、目的とする生体組織のサイズに応じて設定することが望ましい。
　また、本実施形態の培養容器において、容器本体１０の凹部１１の形状は、図１及び図２の例では半球形状としているが、これに限定されず、円錐形状や円錐台形状、多角柱形状、多角錐形状、多角錐台形状等にすることも可能である。
　本実施形態の培養容器における容器本体１０と天板２０の材料としては、ポリエチレンやポリプロピレンなどのポリオレフィン系樹脂などを好適に用いることができる。例えば、ポリエチレン、エチレンとα－オレフィンの共重合体、エチレンと酢酸ビニルの共重合体、エチレンとアクリル酸やメタクリル酸共重合体と金属イオンを用いたアイオノマー等を挙げることができる。また、ポリオレフィン、スチレン系エラストマー、ポリエステル系熱可塑性エラストマー、シリコーン系熱可塑性エラストマー、シリコーン樹脂等を用いることもできる。さらに、シリコーンゴム、軟質塩化ビニル樹脂、ポリブタジエン樹脂、エチレン－酢酸ビニル共重合体、塩素化ポリエチレン樹脂、ポリウレタン系熱可塑性エラストマー、ポリエステル系熱可塑性エラストマー、シリコーン系熱可塑性エラストマー、スチレン系エラストマー、例えば、ＳＢＳ（スチレン・ブタジエン・スチレン）、ＳＩＳ（スチレン・イソプレン・スチレン）、ＳＥＢＳ（スチレン・エチレン・ブチレン・スチレン）、ＳＥＰＳ（スチレン・エチレン・プロピレン・スチレン）、ポリオレフィン樹脂、フッ素系樹脂等を用いてもよい。
　本実施形態における天板突起部２１及び後述する本体突起部１３ｂなどの材料についても同様である。
　また、培養対象物３０をスフェアとする場合、本実施形態の培養容器において、容器本体１０の第一の面１０－１及び凹部１１の側壁を形成する面には、スフェアやシングルセルが接着しないように、低接着性表面処理塗工を行うことが好ましい。具体的には、細胞接着抑制剤（細胞低接着処理剤）を塗布しておくことが好ましい。
　細胞接着抑制剤としては、リン脂質ポリマー、ポリビニルアルコール誘導体、リン脂質・高分子複合体、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリビニルアルコール、アガロース、キトサン、ポリエチレングリコール、アルブミン等を用いることができる。また、これらを組み合わせて用いてもよい。
　培養対象物３０をスフェアとする場合、本実施形態の培養容器は、スフェアを形成する工程、スフェア状態を維持したまま培養して増殖させる工程、及びスフェア状態で分化誘導する工程等に用いることができる。
　また、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞、その他幹細胞から既に分化誘導工程を経て得られた分化細胞を使用してスフェアを形成させる方法や、分化誘導した細胞を一度凍結保存し、再度解凍後にスフェアを形成する方法等において用いることもできる。
　さらに、目的の分化誘導細胞を含む形で形成されたスフェアを生体に投与する前に、リン酸緩衝液や生理食塩水などで洗浄したり、あるいは注射用水などに懸濁する調整工程などにおいて用いることも可能である。
　ここで、スフェアの洗浄としては、本実施形態の培養容器でスフェアの形成を行った後、そのまま培養容器に洗浄液を通液して洗浄するほか、バイオリアクターなどの他の培養容器で形成した後、本実施形態の培養容器にスフェアを移して、スフェアが重ならない状態で洗浄することが考えられる。
　また、上述したように、分化誘導した細胞を一度凍結保存し、再度解凍後にスフェアを形成する場合に行うことも考えられる。
　すなわち、接着培養又はスフェア状態で分化誘導した細胞は、必ずしも即座に生体に投与される訳ではなく、一旦凍結保存して、使用する際に解凍して投与される場合がある。
　細胞の性質として、スフェア状態での凍結は難しく、一旦スフェアで分化誘導をしたとしても、シングルセルにほぐしてから凍結行う必要がある。
　分化誘導後のシングルセルは解凍後、投与のために再度スフェア形成する必要があるが、投与の前にはスフェア形成時の培養液やデブリ等を取り除くため、スフェアの洗浄を行うことが必要である。
　しかし、スフェアの洗浄は上述の通り手間がかかるだけでなく、開放系での作業となる場合が多いため、コンタミネーションのリスクが生じる。また、その品質管理にもコストがかかる。
　本実施形態の培養容器を用いれば、スフェアの培養にあたって、培地交換のみならず、スフェアの洗浄をも容易に行うことができるため、スフェアの培養において、非常に有利である。また、例えばバイオリアクター等でスフェアを大量培養し、シングルセルに戻して凍結された場合、その後、１投与ごとに本実施形態の培養容器を用いて、スフェアの形成と洗浄、及びその後の注射用水への懸濁を行うことも容易である。
　また、本実施形態の培養容器は、特に、軟包材からなる培養バッグに好適に用いることが可能であり、これによって、従来の多数の凹部を培養面に有する培養バッグにおける問題を解消することが可能になっている。
　すなわち、このような培養バッグでは、培地交換を行うために、バッグ内に培地を送液すると、スフェアは簡単にウェルから飛び出して他のウェルに移動するため、例えば外径が１００ｍｍ×５０ｍｍ、ウェルが直径１ｍｍの円形で深さ０．５ｍｍの培養容器の場合、流速０．２ｍｌ／分程度の速度でしか培地を送ることができなかった。
　また、このような培養バッグでは、ポート付近の流速が特に速くなり、ポート付近のスフェアが移動しやすくなる。このため、ポート付近のスフェアの移動を十分に抑止するためには、さらに流速０．０２ｍｌ／分程度の速度でしか培地を送ることができない場合もあった。
　これに対して、本実施形態の培養容器によれば、流速を考慮せずに培地を送液できるため、スフェアを効率的に培養することが可能になっている。例えば、本実施形態の培養容器によれば、５ｍｌ／分の速度で、培地を送ることも可能である。
　なお、本実施形態の培養容器は、軟包材からなる培養バッグに限定されるものではなく、ディッシュ状のリジッドな培養容器とすることも可能である。
　図３及び図４に、本実施形態に係る培養容器として作成された培養容器の写真を示す。
　この培養容器は、ポリエチレンからなる、１２ｃｍ×７ｃｍのサイズの容器本体１０と天板２０をヒートシールによって貼り合わせて作成したものであり、両端部にポートが備えられ、凹部の直径は２ｍｍ、天板突起部の高さは５０μｍ、天板突起部の幅は１００μｍである。また、天板突起部は、２ｍｍの間隔で培養面全体を覆うように配置されている。
　この培養容器の凹部に、スフェアの代わりに直径２００μｍのビーズを入れて、天板を容器本体に押圧した状態で培地を通液し、ビーズが凹部から飛び出して隣の凹部に移動することがないことを確認した。
　また培養容器を反転させて凹部から全ての培地を排出してもビーズは凹部に保持されたままであった。
［第二実施形態］
　次に、本発明の第二実施形態に係る培養容器、培養方法、及び輸送方法について、図５を参照して説明する。図５は、本実施形態に係る培養容器の一部を拡大した模式平面図と断面図を示す図である。
　本実施形態の培養容器は、培養対象物を収容するための複数の凹部を備えた培養容器であり、図５に示すように、容器本体１０ｂと天板２０ｂを備えている。
　容器本体１０ｂは、凹部１１ｂにおける開口部１２ｂが形成された第一の面１０ｂ－１を有し、この第一の面１０ｂ－１と凹部１１ｂの側壁を形成する面を培養面として、培養容器の底部を構成する。
　天板２０ｂは、容器本体１０ｂの第一の面１０ｂ－１に対面する第二の面２０ｂ－１を有する。
　すなわち、容器本体１０ｂの第一の面１０ｂ－１に天板２０ｂの第二の面２０ｂ－１を向かい合わせて培養容器を形成し、容器本体１０ｂと天板２０ｂの一部を接触させることにより、容器本体１０ｂと天板２０ｂの間に流路が形成されており、この流路の幅が、培養対象物３０の最小径より小さくなっている。
　具体的には、本実施形態の培養容器は、容器本体１０ｂの第一の面１０ｂ－１側に本体突起部１３ｂが備えられている。
　本体突起部１３ｂの高さは、培養対象物３０の最小径より小さい。
　そして、本体突起部１３ｂの先端部が、天板２０の第二の面２０ｂ－１の一部に接触することによって、容器本体１０ｂの第一の面１０ｂ－１と天板２０ｂの第二の面２０ｂ－１に間隙が形成されている。
　図５には、このような培養容器の一部に、培養対象物３０としてスフェアを収容した様子を示す模式平面図、及びＢＢ’断面図を示している。
　ＢＢ’断面図において、本体突起部１３ｂは、三角柱状に第一の面１０－１から突出し、全ての凹部間において均等に配置されているが、本体突起部１３ｂの形状及び配置はこれに限定されず、第一の面１０ｂ－１と第二の面２０ｂ－１に間隙を形成できる範囲で、様々な形状及び配置にすることができる。
　すなわち、本体突起部１３ｂを、例えば半円柱状に第一の面１０ｂ－１から突出したものとし、第一の面１０ｂ－１においてランダムに配置させたものすることもできる。
　容器本体１０ｂの第一の面１０ｂ－１と天板２０ｂの第二の面２０ｂ－１の間隙は、本体突起部１３ｂの高さと同一であり、本体突起部１３ｂの高さは、培養対象物の直径より小さい。
　したがって、第一の面１０ｂ－１と第二の面２０ｂ－１の間隙を、培養対象物は通過することができず、凹部１１ｂ内に保持することが可能となっている。
　本実施形態の培養容器におけるその他の構成及び効果については、第一実施形態と同様である。
［第三実施形態］
　本発明の第三実施形態に係る培養容器、培養方法、及び輸送方法について、図６を参照して説明する。図６は、本実施形態に係る培養容器の一部を拡大した模式平面図と断面図を示す図である。
　本実施形態の培養容器は、培養対象物を収容するための複数の凹部を備えた培養容器であり、図６に示すように、容器本体１０ｃと天板２０ｃを備えている。
　容器本体１０ｃは、凹部１１ｃにおける開口部１２ｃが形成された第一の面１０ｃ－１を有し、この第一の面１０ｃ－１と凹部１１ｃの側壁を形成する面を培養面として、培養容器の底部を構成する。
　天板２０ｃは、容器本体１０ｃの第一の面１０ｃ－１に対面する第二の面２０ｃ－１を有する。図４においては、これらの面の一部が接触している。
　すなわち、容器本体１０ｃの第一の面１０ｃ－１に天板２０ｃの第二の面２０ｃ－１を向かい合わせて培養容器を形成し、容器本体１０ｃと天板２０ｃの一部を接触させることにより、容器本体１０ｃと天板２０ｃの間に流路が形成されており、この流路の幅が、培養対象物３０の最小径より小さくなっている。
　具体的には、本実施形態の培養容器は、容器本体１０ｃの第一の面１０ｃ－１側に本体流路部１４ｃが備えられている。
　本体流路部１４ｃは、全ての凹部１１ｃを一つの空間に連結するように凹部１１ｃ間に備えられている。
　「全ての凹部１１ｃを一つの空間に連結する」とは、第一の面１０ｃ－１と第二の面２０ｃ－１の一部を接触させた状態において、全ての凹部１１ｃが一つの空間を形成し、全ての凹部１１ｃに培地を通液できることを意味する。これは、第四実施形態においても同様である。
　本体流路部１４ｃの幅は、培養対象物３０の最小径より小さい。
　本実施形態では、第一の面１０ｃ－１と第二の面２０ｃ－１の一部（開口部１２ｃ及び本体流路部１４ｃに対応する領域以外）が接触し、容器本体１０ｃと天板２０ｃの間に本体流路部１４ｃが形成されている。
　図６には、このような培養容器の一部に、培養対象物３０としてスフェアを収容した様子を示す模式平面図、及びＣＣ’断面図を示している。
　ＣＣ’断面図において、本体流路部１４ｃは、略円柱状に全ての凹部間において均等に形成されているが、本体流路部１４ｃの形状及び配置はこれに限定されず、容器本体１０ｃと天板２０ｃの間に流路を形成できる範囲で、様々な形状及び配置にすることができる。
　すなわち、本体流路部１４ｃを、例えば角柱状とし、全ての凹部１１ｃを一つの空間に連結するように、ランダムに配置させたものすることもできる。
　本実施形態では、第一の面１０ｃ－１と第二の面２０ｃ－１（開口部１２ｃ及び本体流路部１４ｃに対応する領域以外）が接触し、かつ、本体流路部１４ｃの幅は、培養対象物の直径より小さい。
　したがって、培養対象物は本体流路部１４ｃを通過することができず、凹部１１ｃ内に保持することが可能となっている。
　本実施形態の培養容器におけるその他の構成及び効果については、第一実施形態と同様である。
［第四実施形態］
　本発明の第四実施形態に係る培養容器、培養方法、及び輸送方法について、図７を参照して説明する。図７は、本実施形態に係る培養容器の一部を拡大した模式平面図と断面図を示す図である。
　本実施形態の培養容器は、培養対象物を収容するための複数の凹部を備えた培養容器であり、図７に示すように、容器本体１０ｄと天板２０ｄを備えている。
　容器本体１０ｄは、凹部１１ｄにおける開口部１２ｄが形成された第一の面１０ｄ－１を有し、この第一の面１０ｄ－１と凹部１１ｄの側壁を形成する面を培養面として、培養容器の底部を構成する。
　天板２０ｄは、容器本体１０ｄの第一の面１０ｄ－１に対面する第二の面２０ｄ－１を有する。図７においては、これらの面の一部が接触している。
　すなわち、容器本体１０ｄの第一の面１０ｄ－１に天板２０ｄの第二の面２０ｄ－１を向かい合わせて培養容器を形成し、容器本体１０ｄと天板２０ｄの一部を接触させることにより、容器本体１０ｄと天板２０ｄの間に流路が形成されており、この流路の幅が、培養対象物３０の最小径より小さくなっている。
　具体的には、本実施形態の培養容器は、天板２０ｄの第二の面１０ｄ－１側に天板流路部２２ｄが備えられている。
　天板流路部２２ｄは、全ての凹部１１ｄを一つの空間に連結するように天板２０に備えられている。
　天板流路部２２ｄの幅は、培養対象物３０の最小径より小さい。
　本実施形態では、第一の面１０ｄ－１と第二の面２０ｄ－１の一部（開口部１２ｄ及び天板流路部２２ｄに対応する領域以外）が接触し、容器本体１０ｄと天板２０ｄの間に天板流路部２２ｄが形成されている。
　図７には、このような培養容器の一部に、培養対象物３０としてスフェアを収容した様子を示す模式平面図、及びＤＤ’断面図を示している。
　ＤＤ’断面図において、天板流路部２２ｄは略円柱状であり、全ての凹部を連結するように均等に形成されているが、天板流路部２２ｄの形状及び配置はこれに限定されず、容器本体１０ｄと天板２０ｄの間に流路を形成できる範囲で、様々な形状及び配置にすることができる。
　すなわち、天板流路部２２ｄを、例えば角柱状とし、全ての凹部１１ｄを一つの空間に連結するように、ランダムに配置させたものすることもできる。
　本実施形態では、第一の面１０ｄ－１と第二の面２０ｄ－１の一部（開口部１２ｄ及び天板流路部２２ｄに対応する領域以外）が接触し、かつ、天板流路部２２ｄの幅は、培養対象物の直径より小さい。
　したがって、培養対象物は天板流路部２２ｄを通過することができず、凹部１１ｄ内に保持することが可能となっている。
　本実施形態の培養容器におけるその他の構成及び効果については、第一実施形態と同様である。
　また、第一実施形態から第四実施形態までの培養容器の構成を組み合わせたものとすることも可能である。
　具体的には、第一実施形態と第二実施形態の培養容器の構成を組み合わせて、第二の面に天板突起部を備えると共に、第一の面における複数の凹部間に本体突起部を備えた構成とすることもできる。
　この場合、天板突起部の高さと本体突起部の高さを同一にして、これらの高さと同一で、培養対象物の最小径より小さい間隙が第一の面と前記第二の面の間に形成される。
　また、第一実施形態及び／又は第二実施形態と、第三実施形態の培養容器の構成を組み合わせて、天板突起部と本体突起部の少なくともいずれか一方を備えると共に、第一の面に本体流路部を備えた構成とすることもできる。
　この場合、第一の面と第二の面は接触せずに間隙が形成され、本体流路部の幅と第一の面と第二の面の間隙の幅の合計が、培養対象物の最小径より小さくなっている。
　また、第一実施形態及び／又は第二実施形態と、第四実施形態の培養容器の構成を組み合わせて、天板突起部と本体突起部の少なくともいずれか一方を備えると共に、第二の面に天板流路部を備えた構成とすることもできる。
　この場合、第一の面と第二の面は接触せずに間隙が形成され、天板流路部の幅と第一の面と第二の面の間隙の幅の合計が、培養対象物の最小径より小さくなっている。
　また、第三実施形態と第四実施形態の培養容器の構成を組み合わせて、本体流路部と天板流路部を備えた構成とすることもできる。
　この場合、第一の面と第二の面の一部が接触し、本体流路部の幅と天板流路部の幅の合計が、培養対象物の最小径より小さくなっている。
　また、第一実施形態から第四実施形態の培養容器の構成を全て組み合わせた構成とすることもできる。
　この場合、天板突起部の高さと本体突起部の高さが同一であり、第一の面と第二の面は接触せずに間隙が形成され、第一の面と第二の面の間隙の幅と本体流路部の幅と天板流路部の幅の合計が、培養対象物の最小径より小さくなっている。
　以上説明したように、本発明の実施形態に係る培養容器、培養方法、及び輸送方法によれば、スフェアなどの培養対象物を培養するための複数の凹部が形成された培養容器において、凹部間での培地などの液状物の通液や目的の培養対象物の最小径より小さい細胞やデブリの通過を可能とし、かつ凹部間での培養対象物の移動を抑制することが可能である。
　本発明は、以上の実施形態及び実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
　例えば、培養容器の大きさは、実施形態に示したものに限定されず、例えば５０万個～１００万個のスフェアを形成可能な大きさのものにするなど適宜変更することが可能である。
　本発明は、等間隔に配列された均一なサイズのスフェアを効率的に大量に作成する場合などに、好適に利用することが可能である。
　この明細書に記載の文献及び本願のパリ優先の基礎となる日本出願明細書の内容を全てここに援用する。
　１０，１０ｂ，１０ｃ，１０ｄ　容器本体
　１０－１，１０ｂ－１，１０ｃ－１，１０ｄ－１　第一の面
　１１，１１ｂ，１１ｃ，１１ｄ　凹部
　１２，１２ｂ，１２ｃ，１２ｄ　開口部
　１３ｂ　本体突起部
　１４ｃ　本体流路部
　２０，２０ｂ，２０ｃ，２０ｄ　天板
　２０－１，２０ｂ－１，２０ｃ－１，２０ｄ－１　第二の面
　２１　天板突起部
　２２ｄ　天板流路部
　３０　培養対象物
 

Claims (12)

  1. 　培養対象物を収容するための複数の凹部を備えた培養容器であって、
    　前記凹部が形成された第一の面を有する容器本体と、前記第一の面に対面する第二の面を有する天板を備え、
    　前記第一の面側及び／又は前記第二の面側に突起部及び／又は流路部が備えられ、
    　前記容器本体と前記天板の一部が接触して、前記容器本体と前記天板の間に流路が形成され、前記流路の幅が、前記培養対象物の最小径より小さい
    　ことを特徴とする培養容器。
  2. 　前記第二の面側に天板突起部が備えられ、
    　前記天板突起部の幅が、前記凹部における開口部の幅よりも小さく、かつ、前記天板突起部の高さが、前記培養対象物の最小径より小さく、
    　前記天板突起部が、前記第一の面の一部に接触して、前記第一の面と前記第二の面に間隙が形成された
    　ことを特徴とする請求項１記載の培養容器。
  3. 　前記第一の面側における前記複数の凹部間に本体突起部が備えられ、
    　前記本体突起部の高さが、前記培養対象物の最小径より小さく、
    　前記本体突起部が、前記第二の面の一部に接触して、前記第一の面と前記第二の面に間隙が形成された
    　ことを特徴とする請求項１又は２記載の培養容器。
  4. 　前記第一の面側に本体流路部が備えられ、
    　前記本体流路部は、全ての前記凹部を一つの空間に連結するように前記凹部間に備えられ、
    　前記本体流路部の幅が、前記培養対象物の最小径より小さく、
    　前記第一の面と前記第二の面の一部が接触して、前記容器本体と前記天板の間に流路が形成された
    　ことを特徴とする請求項１記載の培養容器。
  5. 　前記第二の面側に天板流路部が備えられ、
    　前記天板流路部は、全ての前記凹部を一つの空間に連結するように備えられ、
    　前記天板流路部の幅が、前記培養対象物の最小径より小さく、
    　前記第一の面と前記第二の面の一部が接触して、前記容器本体と前記天板の間に流路が形成された
    　ことを特徴とする請求項１記載の培養容器。
  6. 　前記第一の面側に本体流路部が備えられ、
    　前記本体流路部は、全ての前記凹部を一つの空間に連結するように前記凹部間に備えられ、
    　前記本体流路部の幅と前記第一の面と前記第二の面の間隙の幅の合計が、前記培養対象物の最小径より小さく、
    　前記容器本体と前記天板の一部が接触して、前記容器本体と前記天板の間に流路が形成された
    　ことを特徴とする請求項２又は３記載の培養容器。
  7. 　前記第二の面側に天板流路部が備えられ、
    　前記天板流路部は、全ての前記凹部を一つの空間に連結するように備えられ、
    　前記天板流路部の幅と前記第一の面と前記第二の面の間隙の幅の合計が、前記培養対象物の最小径より小さく、
    　前記容器本体と前記天板の一部が接触して、前記容器本体と前記天板の間に流路が形成された
    　ことを特徴とする請求項２又は３記載の培養容器。
  8. 　前記培養対象物が、細胞、スフェア、オルガノイド、又は、生体組織のいずれかであることを特徴とする請求項１～７のいずれかに記載の培養容器。
  9. 　前記容器本体及び／又は前記天板が軟包材からなることを特徴とする請求項１～８のいずれかに記載の培養容器。
  10. 　請求項１～９のいずれかに記載の培養容器を用いて、前記容器本体と前記天板の間に形成された前記流路を通じて、培地又は洗浄液を出し入れすることを特徴とする培養方法。
  11. 　培地又は洗浄液が注入された前記培養容器を傾斜又は反転させて、前記流路を通じて培地又は洗浄液を出し入れすることを特徴とする請求項１０記載の培養方法。
  12. 　請求項１～９のいずれかに記載の培養容器を用いて、前記凹部に前記培養対象物を収容し、前記凹部、及び前記容器本体と前記天板の間に形成された前記流路に、培地、洗浄液、又は細胞保存液を満たした状態で、前記培養対象物を保管又は輸送することを特徴とする輸送方法。
     
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