WO2020065115A2 - Usos terapéuticos de clústeres cuánticos atómicos - Google Patents

Usos terapéuticos de clústeres cuánticos atómicos Download PDF

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WO2020065115A2
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Fernando DOMÍNGUEZ PUENTE
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    • B22F2202/11—Use of irradiation

Definitions

  • the invention relates to therapeutic uses of atomic quantum clusters, in particular atomic quantum clusters consisting of 5 zero-valence transition metal atoms.
  • Redox homeostasis is essential for cell survival.
  • Thiols play a major role in maintaining redox balance.
  • the sulfur atom in the side chain of the amino acid cysteine can exist in several different oxidation states. Under physiological conditions, the sulfur atom of cysteine transits reversibly between the thiol and disulfide states (reduced and oxidized, respectively), but the transition to higher oxidation states (except for sulfonic acid) is irreversible, which it means that the protein can only be replaced by the synthesis of a new one.
  • the cells in their different compartments with the sole exception of the endoplasmic reticulum, continually reduce proteins that are spontaneously oxidized by the presence of oxygen. Within the cell, the functions of proteins depend on their oxidation state of sulfur. There are two overlapping systems, the glutathione and thioredoxin systems, which are very well conserved throughout evolution and work to keep cysteine proteins in their reduced and functional state.
  • ROS Reactive oxygen species
  • glutathione and thioredoxin systems protect cells from oxidative damage by maintaining the reduced state. If ROS levels are high and exceed the buffering capacity of the glutathione and thioredoxin systems, activation of signaling pathways and gene expression may occur, leading to cellular apoptosis. Active proliferative tumor cells show increased respiration and consequently higher levels of ROS. Furthermore, human tumors show insufficient vascularization that contributes to glucose deprivation and increased ROS due to an imbalance of redox homeostasis.
  • WO2012 / 059572 describes a combination of at least one AQC and at least one antineoplastic drug for the prevention and / or treatment of a cell proliferative disorder.
  • the application describes AQCs consisting of between 2 and 25 zero-valence transition metal atoms that have a cytotoxic and antiproliferative effect in cancer cell lines and therefore can be used in combination with antineoplastic agents to treat cell proliferative disorders.
  • the invention provides a composition comprising atomic quantum clusters (AQCs) consisting of 5 zero-valence transition metal atoms for use in treating a cellular proliferative disorder.
  • AQCs atomic quantum clusters
  • the invention provides the use of the composition as defined herein, for the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment of a cell proliferative disorder.
  • the invention provides the use of a composition comprising atomic quantum clusters (AQCs) consisting of 5 zero-valence transition metal atoms as a radiotherapy sensitizing agent for proliferative cells.
  • AQCs atomic quantum clusters
  • the invention provides a method of preventing or treating a cell proliferative disorder comprising administering a therapeutically effective amount of the composition as defined herein, to a patient in need.
  • the invention provides a method of preventing or treating a cell proliferative disorder comprising administering a therapeutically effective amount of a composition comprising atomic quantum clusters (AQCs) consisting of 5 zero-valence transition metal atoms, to a patient in need, where said method does not include treating the patient with an additional antineoplastic drug.
  • AQCs atomic quantum clusters
  • the invention provides a method of preventing or treating a disorder.
  • cell proliferative comprising administering a therapeutically effective amount of a composition comprising atomic quantum clusters (AQCs) consisting of 5 zero-valence transition metal atoms, to a patient in need, in combination with radiation therapy.
  • AQCs atomic quantum clusters
  • FIG. 1 Interaction of Ag5-AQC with thioredoxin from E. Coli.
  • Ag5-AQC large, gray, five-membered molecule
  • cysteine residues molecules highlighted by a black arrow
  • the energy of the union is favorable (-167 kJ / mol).
  • Figure 2 Normalized X-ray absorption spectra close to the edge structure at the sulfur edge K (SK XANES) of (SK XANES): cysteine (a) and glutathione (b) and the corresponding ones with the addition of Ag5- AQC (c and d, respectively).
  • the right panel shows the enlarged region of the graph on the left.
  • the complete and dashed vertical lines indicate the position of energy associated with the different S-oxidation states.
  • Figure 3 SK XANES normalized spectra of: (a) cysteine and Ag5-AQC-treated cysteine at different concentrations: (b) 1: 106 diluted with respect to the reference standard concentration (RSC), (c) 1: 103 diluted with respect to RSC and (d) RSC.
  • the vertical lines indicate the corresponding energy for different S-oxidation states.
  • Figure 4 S-K XANES normalized spectra of: thioredoxin in aqueous solution with PBS (a) before and (b) after treatment with Ag5-AQC.
  • the vertical lines indicate the corresponding energy for different S-oxidation states.
  • Figure 5 Percentage of thioredoxin (TRX) oxidized with Ag5-AQC, hydrogen peroxide (H2O2) and hydroxyl radical (HO) alone or in various combinations, as shown on the x-axis.
  • Figure 6 Sulfur oxidation number of thioredoxin cysteines after various treatments. Sulfur oxidation is affected by Ag5-AQC, hydrogen peroxide (H2O2) and the hydroxyl radical (HO ⁇ ) ⁇ The combination with Ag5-AQC greatly enhances the effect of H2O2 and HO ⁇ .
  • FIG. 7 E. Coli survival was measured after the addition of different concentrations of dithiothreitol (DTT) either alone (control) or in combination with Ag5-AQC.
  • DTT dithiothreitol
  • a low concentration of Ag5-AQC destroys bacteria.
  • DTT dithiothreitol
  • Figure 8 Dose response graphs (0.24-1, 2 mg / l) for various cell lines after addition of Ag5-AQC.
  • Figure 9 Results showing the percentage of cell viability of an A549 cell line after the addition of clusters of 5 copper atoms (Cus-AQC) compared to a control.
  • FIG. 10 Ag5-AQC oxidation of sulfhydryl groups in proteins.
  • A549 cells were transduced with a Premo cellular redox sensor. After 48 hours, images were taken at intervals using a Leica TCS SP5 confocal microscope. The samples were excited with 405 and 488 nm lasers, and the ratio of emissions in the green channel (500-530 nm) (ratio 405/488) was calculated. Images were taken every 10 seconds after the addition of Ag5-AQC (IC50) for 10 minutes. False color ratio images of cells at indicated time points highlight changes in redox state. In each experiment, the ratio was quantified for two individual cells (arrowheads) and plotted against time.
  • FIG 11 (a) The location of MTF1 was detected in response to Ag5-AQC by indirect immunofluorescence. A549 cells were treated with Ag5-AQC for 1 hour and 2 hours and then fixed and stained with anti-MTF1 antibody and DAPI to counterstaining the core. Ag5-AQC showed a clear translocation of MTF-1 in the nucleus (right column) compared to control cells (left column) (b) Ag5-AQC induces translocation of Nrf2 from the cytoplasm to the nucleus in HEK293 cells. Immunofluorescence staining was performed using an anti-Nrf2 antibody (red) and an anti-Keap1 antibody (green). The nuclei were counterstained with Hoechst (blue). The fused images show the nuclear location of Nrf2 after 30 minutes of treatment with Ag5-AQC (IC50) or N-ethylmaleimide (NEM) (100mM, positive control).
  • IC50 anti-Nrf2 antibody
  • NEM
  • FIG. 12 Ag5-AQC treatment reduces the size of the A549 multicellular tumor spheroid (MCTS).
  • MCTS A549 multicellular tumor spheroid
  • (b) Growth kinetics of the MCTS control or treated with Ag5-AQC. The data represents the mean ⁇ SD. Error bars represent the standard deviation; n 8. Mann Whitney test ((*) p ⁇ 0.05).
  • FIG. 13 Proliferative cells are more sensitive to the effect of Ag5-AQC than non-proliferative cells.
  • A proliferative and non-proliferative A549 cells
  • B proliferative and non-proliferative U251 cells
  • C serum-deprived A549 cells were exposed to different concentrations of Ag5-AQC for 1 hour and cell viability was determined. using an MTT test. Data are shown as the mean ⁇ SD of three independent experiments.
  • FIG 14 Effects of Ag5-AQC in vivo,
  • Ag5-AQC cause a reduction in tumor growth in mice with orthotopic brain cancer.
  • Experimental groups Ag5-AQC (0.25 mg / kg) and control (no treatment)
  • Ag5-AQC (0.25 mg / kg) and control (no treatment)
  • Treatment with Ag5-AQC causes a reduction in tumor growth in mice with orthotopic lung cancer.
  • c Quantification of luciferase activity measured ex vivo in the lung and in the mediastinal lymph nodes.
  • FIG. 15 Ag5-AQC treatment causes a reduction in cell viability in patient-derived B-CLL lymphocytes
  • B-CLL lymphocytes were treated with Ag5-AQC for 1 hour and 4 hours later, DHE-positive cells were quantified by flow cytometry (c) TEM images of Ag5-AQC-treated B-CLL lymphocytes showed obvious signs of apoptosis, such as chromatin marginalization (black arrows) and altered mitochondria (black arrows).
  • FIG 17 W3T3 cells carrying a doxycycline-inducible RasV12 allele were exposed to doxycycline (white bars) or vehicle (control - black bars) for 24 hours and then treated with different concentrations of Ag5-AQC.
  • RasV12 expression was evaluated by Western blot after the addition of doxycycline and
  • cell viability was determined by MTT assay 24 hours later. Data are shown as the mean ⁇ SD of at least three independent experiments.
  • Figure 18 Ag5-AQC treatment increases the sensitivity of A549 cells to radiation. The results of the radiation effect on A549 cells treated with Ag5-AQC are shown in A) a clonogenic assay and B) a DNA damage assay using anti-pH2AX staining.
  • FIG. 19 Ag5-AQC treatment increases the sensitivity of U251 cells to radiation.
  • the results of the radiation effect on Ag25-AQC treated U251 cells are shown in A) a clonogenic assay and B) a DNA damage assay using anti-pH2AX staining.
  • atomic quantum clusters refers to a group / cluster of 2 to 500 zero-valence transition metal atoms, such as between 2 and 200, 2 and 100 , 2 and 50 or 2 and 25 transition metal atoms, and with a size of less than 2 nm, such as less than 1 nm.
  • AQCs can comprise identical transition metal zero-valence transition metal atoms (mononuclear clusters) or different (heteronuclear clusters). It will be understood that this term does not include metal ions.
  • transition metal shall be understood to refer to the elements of the periodic table known as transition metals, but does not refer to the electrical behavior of such elements.
  • the confinement of electrons in the AQCs causes the quantum separation of energy levels that produce important changes in the properties of these materials, as reported in EP1914196. Therefore, the metal atoms in the AQCs described herein can have a behavior similar to a semiconductor or even an insulator.
  • substantially free of can be used to refer to a composition that is most or completely free of an entity specifically mentioned below, or at least does not contain the entity in an amount such that the entity affects efficacy, storage capacity, usability with respect to necessary safety concerns, and / or composition stability.
  • treat may include prophylaxis and means to improve, alleviate symptoms, eliminate the cause of symptoms temporarily or permanently, or prevent or delay the onset of symptoms of the mentioned disorder or condition.
  • compositions of the invention are useful in the treatment of humans and non-human animals.
  • an effective amount refers to the amount sufficient to elicit pharmacological or therapeutic effects desired, thus resulting in effective prevention or treatment of the disorder.
  • Prevention of the disorder manifests itself by delaying the onset of symptoms of the disorder to a medically significant degree. Treatment of the disorder is manifested by a decrease in symptoms associated with the disorder or an improvement in the return of symptoms of the disorder.
  • AQCs atomic quantum clusters
  • a fundamental characteristic of the action of AQCs with 5 atoms in biological systems is their specificity for both substrates, proteins and electron acceptors.
  • Theoretical and experimental evidence of the interaction of Ag5-AQC with cysteine, glutathione and thioredoxin is provided.
  • the inventors also provide evidence that Ag5-AQCs are biologically dependent on the presence of electron acceptors, as evidenced by the fact that Ag5-AQC activity is greater with the hydroxyl radical (HO ⁇ )> H2O2> O2 (for example, Figures 5 and 6).
  • HO ⁇ hydroxyl radical
  • H2O2> O2 for example, Figures 5 and 6
  • the evidence presented herein suggests that AQCs with 5 atoms increase the effect of ROS by acting as a catalytic bridge between ROS and sulfur atoms in proteins to increase the level of thiol oxidation. This mechanism of action is different from other chemotherapeutic drugs currently known in the art.
  • the mechanism of action for 5-atom AQCs is demonstrated in vitro, in cell culture in 2D and 3D animal models, and primary cultures of tumor cells obtained from patients.
  • composition comprising atomic quantum clusters (AQCs) consisting of 5 zero-valence transition metal atoms for use in the treatment of a cellular proliferative disorder.
  • AQCs atomic quantum clusters
  • compositions comprising AQCs consisting of 5 zero-valence transition metal atoms will be described herein. Surprisingly, it has been found that such Compositions have a cytotoxic effect on eukaryotic cells themselves, without the need for additional antineoplastic agents.
  • AQCs consisting of 5 atoms selectively interact with cysteine residues present in proteins and cause sulfur oxidation in the presence of reactive oxygen species (ROS). This mechanism is unique for clusters of this size. Therefore, this application provides, for the first time, the motivation to use AQC with 5 zero-valence transition metal atoms as monotherapy in the treatment of cell proliferation diseases, such as cancer.
  • ROS reactive oxygen species
  • the composition may consist essentially of atomic quantum clusters (AQC) for use in treating a cell proliferative disorder, wherein said composition comprises AQC consisting of 5 zero-valence transition metal atoms.
  • AQC atomic quantum clusters
  • said AQCs are the only active ingredient in the composition, i.e., there are no more active ingredients present in the composition.
  • the composition does not comprise an antineoplastic drug.
  • the composition does not comprise an antineoplastic drug as described in WO2012 / 059572, such as alkylating agents (eg, nitrogen mustard analogs, nitrosoureas, alkylsulfonates, platinum-containing compounds, ethylemines, and imidazotetrazines), antibiotics cytotoxic (eg, anthracyclines, actinomycin), plant alkaloids, and other natural products (eg, derivatives of canfothecin, epipodophyllotoxins, taxanes, and vinca alkaloids), antimetabolites (eg, cytidine analogs, folic acid analogues, purine, pyrimidine analogues, urea derivatives) and drugs for targeted therapy (eg, kinase inhibitors and monoclonal antibodies).
  • alkylating agents eg, nitrogen mustard analogs, nitrosoureas, alkylsulfonates
  • the composition is not used in combination with an antineoplastic drug.
  • the composition is not used in combination with an antineoplastic drug as described in WO2012 / 059572, such as alkylating agents (eg, nitrogen mustard analogs, nitrosoureas, alkylsulfonates, platinum-containing compounds, ethylemines, and imidazotetrazines ), cytotoxic antibiotics (eg anthracyclines, actinomycins), plant alkaloids, and other natural products (eg derivatives of canfothecin, epipodophyllotoxins, taxanes, and vinca alkaloids), antimetabolites (eg cytidine analogs, folic acid analogs, purine analogs, pyrimidine analogs, urea derivatives), and drugs for targeted therapy (eg, kinase inhibitors and monoclonal antibodies).
  • alkylating agents eg, nitrogen mustard analogs, nitrosoureas, alkylsul
  • the composition is for use as monochemotherapy.
  • references to "monochemotherapy” refer to the treatment of a proliferative cell disease, such as cancer, through the use of a single chemical drug.
  • the compositions of the invention have a chemotherapeutic effect of their own, without the need to be used in combination with other drugs, and therefore can be used as a monotherapy, in particular a monochemotherapy in the context of cancer treatment.
  • references to a "cell proliferative disorder” refer to a disorder that produces abnormal new cell growth or abnormal cell growth without physiological control. This can produce an unstructured mass, that is, a tumor.
  • the cell proliferative disorder is a tumor and / or cancer.
  • the compositions of the invention can be used to treat cellular proliferative disorders including, but not limited to, primary tumors, metastases, and precancerous conditions (pre-cancer stages).
  • Cancers may include, but are not limited to, spleen cancer, colorectal and / or colon cancer, colon carcinomas, ovarian carcinomas, ovarian cancer, endometrial cancer, breast cancer, carcinomas of the uterus, lung cancer, cancer stomach, esophageal cancer, liver cancer, carcinomas of the pancreas, kidney cancer, bladder cancer, prostate cancer, testicular cancer, bone cancer, thyroid cancer, skin cancer, such as melanoma, sarcoma, sarcomas Kaposi's, brain cancers, such as glioma, medulloblastoma, or neuroblastoma, blood cancers, such as lymphomas and leukemias, myosarcomas, and head and neck carcinoma.
  • the cancer is selected from lung, breast, colon, or brain cancer (in particular, glioblastoma).
  • the Cancer is brain cancer, in particular brain cancer selected from glioma (such as glioblastoma multiforme, oligodendroglioma, ependymomas, brain stem glioma), craniopharyngioma, hemangioblastoma, malignant meningioma, tumors of the pineal region, and vestibular schwannoma.
  • the brain cancer is glioma, in particular glioblastoma.
  • the present invention has a particular use in the treatment of cancers / tumors with a RAS mutation, such as a KRAS, NRAS or HRAS mutation, in particular KRAS mutations.
  • a RAS mutation such as a KRAS, NRAS or HRAS mutation, in particular KRAS mutations.
  • Such mutations have been shown to cause oxidative stress in tumor cells, resulting in high levels of ROS, for example, see Shaw et al. (201 1) PNAS 108 (21): 8773-8778.
  • AQCs consisting of 5 atoms are potent in cells that comprise high levels of ROS. Therefore, in one embodiment, the cellular proliferative disorder (eg, cancer and / or tumor) comprises a RAS mutation.
  • the RAS mutation is selected from a KRAS, NRAS or HRAS mutation, in particular a KRAS mutation. It will be understood that such cancers / tumors may also be referred to as mutant cancer in RAS, eg, a mutant cancer or tumor in KRAS, HRAS or NRAS.
  • the RAS mutation is an activating mutation, i.e., the mutation causes increased or constitutive activity of a RAS protein. It is noted that, in light of the AQC mechanism of action of the invention, the composition can be used to treat RAS mutant cancer cells, regardless of the mutation. This is in contrast to current therapies that are specific to particular mutations in the RAS genes (in particular, the KRAS gene).
  • the RAS family of proteins are GTPases that hydrolyze GTP to GDP allowing the activation of various downstream signaling pathways.
  • KRAS has been shown to be involved in the mitogen-activated kinase pathway.
  • Common mutations in KRAS reduce its intrinsic GTPase function, preventing hydrolysis of GTP to GDP, thus blocking KRAS in its active state. This results in constitutive activation of downstream signaling pathways that can lead to oncogenesis.
  • RAS mutations are known in the art, and KRAS mutations are the most common oncogenic mutations in human cancer.
  • a cancer it comprises a RAS mutation if one or more of the cancer cells comprise one or more RAS mutations.
  • Subjects having RAS mutations can be identified by methods known in the art such as PCR, nucleic acid sequencing, allele-specific PCR methods, single-stranded conformational polymorphism analysis, fusion curve analysis, probe hybridization, pyrosequencing (en ie, nucleotide extension sequencing), genotyping, and other sequencing methods (eg, see Anderson (201 1) Expert Rev Mol Diagn. 11 (6): 635-642 and Ogino et al. (2005) J. Mol. Diagn.
  • AQCs comprising 5 atoms had a toxic effect on cell line A549, which has been shown to comprise a mutation in KRAS (such as KRAS G12S where the glycine residue at position 12 is mutated ). Furthermore, cells comprising a mutation in HRAS (HRasV12 where a mutation of the valine residue was mutated at position 12) were more sensitive to the toxic effects of AQCs comprising 5 atoms compared to control cells.
  • RAS mutations An estimated 30% of all human cancers have a RAS mutation. For example, it is believed that 88% of pancreatic ductal adenocarcinomas, 52% of colorectal cancers, 43% of multiple myelomas, 32% of lung adenocarcinomas, 28% of melanomas, 25% of endometrial cancers, 13% of thyroid cancers, 12% of stomach cancers, 1 1% of acute myelogenous leukemias, 1 1% of bladder cancers, 6% of carcinomas cell carcinoma of the head and neck, and 2% of breast cancers carry RAS mutations (data compiled from the Cancer Cell Une Encyclopedia (CCLE); the International Cancer Genome Consortium (ICGC); and The Cancer Genome Atlas Data Portal (TCGA)).
  • CCLE Cancer Cell Une Encyclopedia
  • ICGC International Cancer Genome Consortium
  • TCGA Cancer Genome Atlas Data Portal
  • the cell proliferative disorder (in particular the cell proliferative disorder with a RAS mutation) is selected from cancer of the pancreas, colorectal, blood, lung, skin, endometrium, thyroid, stomach, bladder, head and neck or breast.
  • the cell proliferative disorder (particularly the cell proliferative disorder with a RAS mutation) is selected from cancer of the pancreas, colorectal, blood, lung, skin, endometrium, thyroid, stomach, bladder, or head and neck.
  • the cellular proliferative disorder is pancreatic cancer, eg, pancreatic ductal adenocarcinoma, particularly a mutant pancreatic cancer in RAS, for example, a mutant pancreatic ductal adenocarcinoma in RAS.
  • the cell proliferative disorder is colorectal cancer, particularly mutant colorectal cancer in RAS.
  • the cell proliferative disorder is blood cancer, eg, multiple myeloma or acute myelogenous leukemia, particularly a mutant blood cancer in RAS, eg, a mutant multiple myeloma in RAS or mutant acute myelogenous leukemia in RAS.
  • the cell proliferative disorder is lung cancer, eg, non-small cell lung cancer, such as adenocarcinoma of the lung, particularly a mutant lung cancer in RAS, eg, a cell lung cancer no small mutant in RAS, such as a mutant lung adenocarcinoma in RAS.
  • the cell proliferative disorder is skin cancer, for example melanoma, in particular a mutant skin cancer in RAS, for example a mutant melanoma in RAS.
  • the cell proliferative disorder is endometrial cancer, in particular mutant endometrial cancer in RAS.
  • the cellular proliferative disorder is thyroid cancer, in particular a mutant thyroid cancer in RAS.
  • the cellular proliferative disorder is stomach cancer, in particular mutant stomach cancer in RAS.
  • the cell proliferative disorder is bladder cancer, in particular a mutant bladder cancer in RAS.
  • the cell proliferative disorder is head and neck cancer, eg, squamous cell carcinoma of the head and neck, in particular a mutant head and neck cancer in RAS, eg, squamous cell carcinoma of RAS. Mutant head and neck in RAS.
  • the present invention has a particular use in the treatment of cancers with low drug accessibility, such as large tumors with a low level of vascularization or brain tumors that are separated from the circulatory system by the blood-brain barrier. This is due to the neutral charge and small size of therapeutic AQCs consisting of just 5 atoms, allowing them to access areas in a tumor or cancer that are not easily accessible by traditional antineoplastic drugs. Evidence is provided herein showing the ability of AQCs consisting of 5 atoms to penetrate the central hypoxic regions of multicellular tumor spheroids.
  • the compositions of the invention have been found to have an additional beneficial effect of treating cancer metastases as well as the primary tumor ( Figure 14). Therefore, in accordance with one aspect of the invention, the composition is provided as described herein (in particular, a composition comprising atomic quantum clusters (AQC) consisting of 5 zero-valence transition metal atoms ), for use in the prevention and / or treatment of metastases, such as lymph node metastasis, in particular to treat and / or prevent lung cancer metastases. In accordance with another aspect of the invention, the composition is provided as described herein, for use in the prevention and / or treatment of cancer metastases in the lymph nodes.
  • AQC atomic quantum clusters
  • the lymph node is a mediastinal node.
  • These mediastinal nodes are a group of lymph nodes located in the thoracic cavity of the body.
  • compositions described herein can be used in combination with AQCs consisting of 3 zero-valence transition metal atoms.
  • AQCs consisting of 3 zero-valence transition metal atoms has been found to allow them to intercalate in DNA and result in chromatin decompaction. Therefore, it can be used to increase the susceptibility of the treated cells to radiation and to improve the effectiveness of radiation therapy.
  • the composition ie, comprising AQCs consisting of 5 zero-valence transition metal atoms
  • AQCs consisting of 3 zero-valence transition metal atoms are administered simultaneously.
  • the two agents are administered at the same time or substantially the same time. They can also be administered by the same route and, optionally, in the same composition. Alternatively, they can be administered by different routes, i.e. separately, but at the same time or substantially at the same time.
  • the composition and AQC's consisting of 3 zero-valence transition metal atoms are administered sequentially.
  • the two agents are administered at different times, so that one of the agents is administered before the second agent.
  • the composition can be administered before or after AQCs consisting of 3 zero-valence transition metal atoms. They can be administered by the same or different routes.
  • compositions comprising AQCs consisting of 3 and 5 zero valence transition metal atoms in combination with radiation therapy for use in the treatment of a cell proliferative disorder.
  • the composition consists of AQCs consisting of between 2 and 5 zero valence transition metal atoms.
  • the composition consists essentially of AQCs consisting of 3 and 5 zero valence transition metal atoms.
  • AQCs consisting of 5 atoms have a catalytic effect on thiol oxidation resulting in cell disappearance. Therefore, these AQC's can be used by itself as cancer therapy and, therefore, in one embodiment, the compositions described herein do not include additional antineoplastic drugs.
  • compositions of the present invention can include or be used in combination with additional therapeutic agents.
  • additional therapeutic agents can be active agents that are used in conjunction with cancer therapy, such as agents used as palliative treatments to improve unwanted side effects.
  • the additional therapeutic agent is an agent used as a palliative treatment.
  • palliative treatment is selected from the group consisting of: antiemetic agents, medications intended to relieve pain, such as opioids, medications used to decrease high levels of uric acid in the blood, such as allopurinol or rasburicase, antidepressants, sedatives, anticonvulsant drugs, laxatives, antidiarrheals and / or antacids.
  • the additional therapeutic agent is not an antineoplastic drug.
  • the additional therapeutic agent is an antineoplastic agent.
  • the antineoplastic agent is selected from the group consisting of: alkylating agents (eg, nitrogen mustard analogs, nitrosoureas, alkylsulfonates, platinum-containing compounds, ethylemines, and imidazotetrazines), cytotoxic antibiotics (eg, anthracyclines, actinomycins) , plant alkaloids and other natural products (for example, derivatives of canfothecin, epipodophyllotoxins, taxanes and vinca alkaloids), antimetabolites (for example, cytidine analogs, folic acid analogs, purine analogs, pyrimidine analogues, urea derivatives ) and drugs for targeted therapy (eg, kinase inhibitors and monoclonal antibodies).
  • alkylating agents eg, nitrogen mustard analogs, nitrosoureas, alky
  • the composition and the additional therapeutic agent are administered simultaneously.
  • the two agents are administered at the same time or substantially the same time. They can also be administered by the same route and, optionally, in the same composition. Alternatively, they can be administered by different routes, that is, separately, but at the same time or substantially at the same time.
  • composition and additional therapeutic agent are administered sequentially.
  • the two agents are administered at different times, so that one of the agents is administered before the second agent. They can be administered by the same routes or by different routes.
  • the composition is administered before the additional therapeutic agent. In an alternative embodiment, the composition is administered after the additional therapeutic agent.
  • Radiation therapy uses high doses of radiation to damage cellular DNA, thereby destroying cancer cells and shrinking tumors. Such therapy may be in the form of an external beam or as internal radiation therapy.
  • the choice of radiation therapy may depend on the type of cancer, the size of the tumor, the location of the tumor, as well as other factors, such as the patient's age, general health, and medical history, and other types of treatment for the cancer used. Radiation therapy is given to more than 50% of all cancers, worldwide, and is of particular importance in developing and middle-income countries. However, the effectiveness of radiation therapy is limited by various factors, including damage to the surrounding healthy tissue, the proximity of nearby organs, and tumors that develop resistance to radiation. Therefore, there is a significant unmet need for agents to improve the effectiveness of radiation therapy.
  • compositions of the present invention are particularly suitable as therapeutic agents that enhance the efficacy of radiation therapy.
  • the composition is provided as described herein, in combination with radiation therapy for use in the treatment of a cell proliferative disorder, such as cancer.
  • Radiation therapy also known as radiation therapy
  • Such therapy may be in the form of an external beam or as internal radiation therapy.
  • the choice of radiation therapy may depend on the type of cancer, the size of the tumor, the location of the tumor, and other factors, such as the patient's age, general health, and medical history, and other types of cancer treatment. that are used.
  • a composition as described herein as a radiotherapy sensitizing agent.
  • the use of the composition is provided as described herein, as a radiation therapy sensitizing agent for proliferative cells.
  • radiation therapy sensitizing agent also called “radiosensitizers” will be understood to refer to a drug that is used to improve / enhance the cytotoxic effect of radiation therapy.
  • the invention provides a composition comprising atomic quantum clusters (AQCs) consisting of 5 zero-valence transition metal atoms for use as a radiation desensitizing agent for non-proliferative cells.
  • AQCs atomic quantum clusters
  • compositions comprising atomic quantum clusters (AQCs) consisting of 5 zero-valence transition metal atoms can be used to protect non-proliferating cells (such as non-dividing ones) from radiation therapy.
  • AQCs atomic quantum clusters
  • radiation therapy desensitizing agent also called “radio desensitizers” will be understood to refer to a drug used to reduce / decrease the cytotoxic effect of radiation therapy.
  • compositions of the invention are particularly advantageous when used in combination with radiation therapy because they have a dual effect of enhancing the effect of radiation therapy on proliferative cells (i.e. cancer cells) while also protecting non-proliferative cells. (i.e. unaffected cells) from harmful radiation.
  • proliferation will be understood by one skilled in the art.
  • proliferative cells refers to cells that undergo cell proliferation, eg, cell growth and division.
  • the invention is used to target cancer cells that have rapid, abnormal, and / or uncontrolled cell proliferation.
  • the proliferative cells are cancer cells, precancerous cells, or other abnormal cells that rapidly divide in a subject.
  • non-proliferative cells refers to cells that do not undergo cell proliferation. These cells can also be described as “resting cells”, “stopped”, “inactive”, “undivided”, “non-cyclized” or “Go cells”. In one embodiment, the nonproliferative cells are noncancerous cells.
  • Such therapy may be in the form of an external beam or as internal radiation therapy.
  • radiation therapy comprises external beam irradiation.
  • External beam radiation therapy uses a source of radiation external to the patient, typically a radioisotope, such as Cobalt-60 (60Co), Cesium-137 (137Cs), or a high-energy X-ray source, such as a linear accelerator (LINAC).
  • the external source produces a collimated beam directed at the patient toward the tumor site.
  • the adverse effect of irradiation of healthy tissue can be reduced, while maintaining a given dose of radiation in the tumor tissue, by projecting the external radiation beam onto the patient at a variety of "gantry" angles with the beams converging at the site of the tumor.
  • Examples of external radiation therapy treatment include, but are not limited to, conformational radiation therapy, intensity modulated radiation therapy (IMRT), image-guided radiation therapy (IGRT), four-dimensional radiation therapy (4D-RT), stereotactic radiation therapy and radiosurgery, proton therapy, radiation therapy with electron beam, and adaptive radiation therapy.
  • IMRT intensity modulated radiation therapy
  • IGRT image-guided radiation therapy
  • 4D-RT four-dimensional radiation therapy
  • stereotactic radiation therapy and radiosurgery proton therapy
  • proton therapy radiation therapy with electron beam
  • adaptive radiation therapy adaptive radiation therapy.
  • radiation therapy comprises internal radiation therapy.
  • a radiopharmaceutical agent is administered to a patient and placed on the area to be treated.
  • the radiopharmaceutical agent comprises a radiation emitting radioisotope.
  • Radioisotopes are well known to one of skill in the art and may comprise a metallic or non-metallic radioisotope.
  • Suitable metal radioisotopes include, but are not limited to: Actinium-225, Antimony-124, Antimony-125, Arsenic-74, Barium-103, Barium-140, Beryllium-7, Bismuth-206, Bismuth-207, Bismuth-212, Bismuth-213, Cadmium-109, Cadmium-115m, Calcium-45, Cerium-139, Cerium-141, Cerium-144, Cesium-137, Chromium-51, Cobalt-55, Cobalt-56, Cobalt-57, Cobalt- 58, Cobalt-60, Cobalt-64, Copper-60, Copper-62, Copper-64, Copper- 67, Erbium-169, Europium-152, Gallium-64, Gallium-67, Gallium-68, Gadolinium-153, Gadolinium-157 Gold-195, Gold-199, Hafnium-175, Hafnium-175-181, Holmium-166, lndium-110, lndium-11
  • Suitable non-metallic radioisotopes include, but are not limited to: Iodine-131, Iodine-125, Iodine-123, Phosphorus-32, Astatum-21 1, Fluorine-18, Carbon-1 1, Oxygen-15, Bromine-76, and Nitrogen-13.
  • radiation therapy comprises electromagnetic radiation or particulate radiation.
  • Electromagnetic radiation includes, but is not limited to, X-rays and gamma rays.
  • Particle radiation includes, but is not limited to, electron beams (beta particles), alpha particles, proton beams, neutron beams, and pi negative mesons.
  • radiation therapy comprises brachytherapy.
  • brachytherapy radiation sources are placed directly at the site of the cancer or tumor. This has the advantage that irradiation only affects a very localized area, thus minimizing radiation exposure of healthy tissues. In addition, this allows the tumor to be treated with very high doses of localized radiation, while reducing the likelihood of unnecessary damage to surrounding healthy tissue.
  • brachytherapy comprises intracavitary or interstitial treatment.
  • Intracavitary treatment consists of placing containers containing radiation sources in the body cavities where the tumor is present or close to where the tumor is present.
  • Interstitial treatment involves placing containers containing radioactive sources directly into a tumor or body tissue. These radioactive sources can remain in the patient permanently. Most often, radioactive sources are removed from the patient after several days.
  • the packages may comprise needles, seeds, wires, or catheters.
  • radiation therapy comprises systemic radioisotope therapy.
  • radiopharmaceutical agents comprising radioisotopes are administered by infusion or ingestion.
  • the administered radioisotopes can be targeted due to the chemical properties of the isotope, eg radioiodine which is preferably absorbed by the thyroid gland.
  • the Targeting can also be accomplished by conjugating the radioisotope with a targeting moiety, such as a molecule or antibody that binds to the target tissue.
  • the radiopharmaceutical agent comprises a radioactive conjugate.
  • the radioactive conjugate is a radiolabeled antibody.
  • the radiopharmaceutical agent is administered orally, parenterally, intraperitoneally, intravenously, intraarterially, transdermally, sublingually, intramuscularly, rectally, transorally, intranasally, via inhalation, vaginal, intraocular, local, subcutaneous, intra-adipose, intraarticular or intrathecal.
  • the radiopharmaceutical agent is in a slow release dosage form.
  • the choice of radiation therapy may depend on the type of cancer, the size of the tumor, the location of the tumor, and other factors, such as the patient's age, general health, and medical history, and other types of cancer treatment. that are used.
  • the composition and radiation therapy are applied simultaneously. In an alternative embodiment, the composition and radiation therapy are applied sequentially, preferably when the composition is applied prior to radiation therapy. If the agents are administered separately, radiation therapy can be administered while the composition remains effective, i.e., the composition and radiation therapy are administered within a time frame that will exert a synergistic, or at least combined, effect on administration to a patient.
  • the composition is administered no more than 6 hours prior to radiation therapy, such as 1-6 hours prior to radiation therapy. In a further embodiment, the composition is administered approximately 6 hours, approximately 5 hours, approximately 4 hours, approximately 3 hours, approximately 2 hours, or approximately 1 hour prior to radiation therapy.
  • the therapeutic effect of the composition and radiation therapy is synergistic.
  • the composition sensitizes cancer cells in the patient to radiation therapy.
  • compositions of the invention can improve the effectiveness of radiation therapy at least twice, such as three times, four times, five times or more, compared to the efficacy of radiation therapy for treating the disorder alone.
  • compositions as described herein comprising the compositions as described herein.
  • compositions, and combinations where appropriate can be formulated as a pharmaceutical composition, optionally comprising a pharmaceutically acceptable carrier, diluent, or carrier.
  • a pharmaceutically acceptable carrier diluent, or carrier.
  • the vehicle, diluent and / or excipient must be "acceptable" in the sense of being compatible with the other ingredients of the composition and not detrimental to the recipient thereof.
  • Examples of pharmaceutically acceptable carriers include one or more of water, saline, phosphate buffered saline, dextrose, glycerol, ethanol, and the like, as well as combinations thereof. Suitable pharmaceutical carriers, excipients, or diluents are described in E. W. Martin's "Remington's Pharmaceutical Sciences”. Pharmaceutically acceptable carriers may further comprise small amounts of auxiliary substances such as wetting or emulsifying agents, preservatives, or buffers, which enhance the shelf life or efficacy of the compositions of the invention.
  • compositions may also include non-sticks, binders, coatings, disintegrants, flavors, colors, lubricants, sorbents, preservatives, sweeteners, lyophilized excipients (including lyoprotectants) or compression aids.
  • compositions of the invention can be administered in a plurality of pharmaceutical administration forms, for example, solids (such as tablets, pills, capsules, granules, etc.) or liquids (such as solutions, suspensions, syrups, ointments, creams , gels or emulsions).
  • solids such as tablets, pills, capsules, granules, etc.
  • liquids such as solutions, suspensions, syrups, ointments, creams , gels or emulsions.
  • the pharmaceutical compositions of the invention may comprise a therapeutically effective amount.
  • the therapeutically effective amount i.e., the amount that produces an effect to help heal or cure the disorder to be treated
  • the therapeutically effective amount will depend on multiple factors, such as the individual's pathology, age, sex, and weight, and the ability of the pharmaceutical composition to elicit a desired response in the individual.
  • a therapeutically effective amount is also an amount with which any toxic or detrimental effects of the composition are offset by the therapeutically beneficial effects.
  • the AQCs are present in an aqueous solution.
  • the aqueous solution comprises dissolved oxygen, such as at least 2 times, or at least 3 times, the AQC concentration (in particular, the AQC concentration comprising 5 zero-valence transition metal atoms) present in the mix.
  • the composition is administered (or formulated for administration) by any suitable mode of administration, such as intravenous, intraarterial, intracardial, intracutaneous, subcutaneous, transdermal, interperitoneal, intramuscular, oral, lingual, sublingual, buccal. , intrarectal or by enema.
  • suitable mode of administration such as intravenous, intraarterial, intracardial, intracutaneous, subcutaneous, transdermal, interperitoneal, intramuscular, oral, lingual, sublingual, buccal. , intrarectal or by enema.
  • compositions of the invention can be administered directly to a target site (i.e., the tumor site) or systemically (i.e., to the circulatory system).
  • Targeted administration has the advantage of targeting the therapeutic effect of the composition on the cancer or tumor to be treated. Such administration also minimizes side effects.
  • the compositions of the invention are also suitable for systemic administration because the mode of action ensures that cellular apoptosis only occurs in cells with a high level of ROS.
  • ROS levels are high in proliferative cells, for example cancer cells.
  • ROS levels are relatively low, therefore, AQCs consisting of 5 atoms will have less effect on normal cells, helping to minimize adverse side effects.
  • the composition is administered orally, intravenously, or subcutaneously. In a further embodiment, the composition is administered orally.
  • the advantage of the compositions of the present invention is that they can be exhausted relatively quickly, therefore, any side effect can be minimized because AQCs do not persist in the body for a long period.
  • Topical application is also possible (eg for the treatment of melanomas).
  • a particular form of topical application is to introduce the composition into a transporter system, in particular a drug delivery system, and implant said transporter system into the cancerous tissues, where said transporter system then releases said composition specifically at the site of the cancerous tissue . In this way, it is possible to avoid side effects, as can occur in the case of systemic administration, that is, to reduce the general tension in the body.
  • compositions as described herein for the treatment of a cellular proliferative disorder.
  • the use of the composition as described herein is provided to treat and / or prevent cancer metastases.
  • the composition is used to treat and / or prevent lymph node cancer metastasis.
  • the composition is used to treat and / or prevent metastasis of lung cancer.
  • composition comprising atomic quantum clusters (AQCs) consisting of 5 zero-valence transition metal atoms as a radiotherapy sensitizing agent for proliferative cells.
  • AQCs atomic quantum clusters
  • Said agent can be used for the treatment of a cell proliferative disorder.
  • composition is provided as described herein, in combination with radiation therapy for the treatment of a cellular proliferative disorder.
  • compositions as described herein in the manufacture / preparation of a radiotherapy sensitizing agent for proliferative cells.
  • a composition comprising atomic quantum clusters (AQCs) consisting of 5 zero-valence transition metal atoms as a radiation therapy desensitizing agent for non-proliferative cells.
  • AQCs atomic quantum clusters
  • the use of the composition as described herein is provided for the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment of a cell proliferative disorder.
  • compositions as described herein are provided in the manufacture of a medicament for the treatment of a cell proliferative disorder.
  • Atomic Quantum Clusters AQC
  • the AQCs described herein are stable, that is, they retain the number of atoms, and therefore their properties, over time so that they can be isolated and handled like any other chemical compound. AQCs can be kept for months, even years, without the need for an external stabilizer.
  • the metal atoms are selected from silver (Ag), gold (Au), copper (Cu), platinum (Pt), iron (Fe), chromium (Cr), palladium (Pd), nickel (Ni) , rhodium (Rh), lead (Pb), iridium (Ir), ruthenium (Ru), osmium (Os), cobalt (Co), titanium (Ti), vanadium (V), or any combination thereof.
  • the metal atoms are selected from Ag, Au, Cu, Pt, or any combination thereof.
  • the metal atoms are selected from Ag, Cu, or Pt.
  • the metal atoms are Ag.
  • the AQC mixture can be synthesized by various methods known in the art, for example, those described in EP1914196, which is incorporated by reference herein.
  • the mixture can also be synthesized using the procedure described herein.
  • Document in Example 1 More specifically, a method for synthesizing silver AQC is provided which comprises performing the method in a three electrode electrochemical cell comprising a hydrogen electrode as the reference electrode and two silver electrodes as the counter electrode and the working electrode, where the silver electrodes comprise a surface area that is greater than 5 cm 2 , such as greater than 10 cm 2 , for example, approximately 17 cm 2 .
  • Clusters of 5 atoms can be obtained by applying a constantly increasing current for approximately 5 hours (300 minutes).
  • the increasing current may comprise: step (i) a current of about 200-300 mA (eg, about 250 mA), step (ii) a current of about 430-530 pA (eg, about 480 pA), step (iii) a current of about 800-1200 pA (for example, about 1000 pA / 1 mA), step (iv) a current of about 2000-2400 pA (for example, about 2200 pA / 2, 2 mA) and / or step (v) a current of about 3800-4200 pA (eg, about 4000 pA / 4 mA), or combinations of any of steps (i) - (v).
  • each step is performed for at least 30 minutes, for example, for about 1 hour.
  • Silver electrodes can be polished before and / or during synthesis, for example, using sandpaper and / or alumina.
  • the procedure can be carried out in purified, deaerated water, such as deaerated MilliQ water.
  • any excess Ag + ions can be removed by adding NaCI and subsequent precipitation and filtration.
  • references to the AQCs used herein include those that are in the hydrate form, that is, have water molecules attached to the cluster via a non-covalent bond.
  • the mechanism for increasing sulfur oxidation is unique to AQCs consisting of 5 metal atoms because the size of these clusters allows for interaction between the sulfur atom and ROS. Therefore, without being bound by theory, it will be understood that the compositions of the invention may not need to be completely free of AQCs consisting of clusters of other sizes (for example, clusters comprising less than and / or more than 5 atoms of metal).
  • the composition comprises more than about 50%, such as more than about 55%, about 60%, about 65%, about 70%, about 75%, about 80%, about 85%, about 90%, about 95%, about 97%, about 99% of AQCs consisting of 5 zero-valence transition metal atoms.
  • compositions consist of 5 zero-valence transition metal atoms.
  • the composition consists essentially of AQC consisting of 5 zero valence transition metal atoms.
  • the composition consists of AQCs consisting of 5 zero valence transition metal atoms.
  • the composition is substantially free of AQCs consisting of more than 5 zero-valence transition metal atoms, for example, the composition may contain less than about 10 mol% (mole percent based on total AQC content of the composition), such as less than about 7 mole%, less than about 5 mole%, less than about 2 mole%, less than about 1 mole% or less than about 0.5 mole% AQC consisting of more than 5 zero-valence transition metal atoms.
  • the composition is substantially free of AQCs consisting of less than 5 zero-valence transition metal atoms, for example, the composition may contain less than about 10 mol% (mole percent based on total AQC content of the composition), such as less than about 7 mole%, less than about 5 mole%, less than about 2 mole%, less than about 1 mole% or less than about 0.5 mole% AQC consisting of less than 5 zero valence transition metal atoms.
  • AQCs consisting of less than 5 zero-valence transition metal atoms include AQCs consisting of 2, 3, or 4 zero-valence transition metal atoms.
  • the composition is substantially free of metal ions.
  • Metal ions are frequently a by-product during the synthesis of AQCs. These can be removed using, for example, NaCI. It will be understood that the reference to metal ions is with respect to the transition metal ions contained in the AQCs.
  • the composition contains less than about 20 mol%, such as less than 15 mol%, 10 mol%, 5 mol%, 2 mol%, 1 mol% or 0.5 mol% of metal ions (ie, ion-free ions of the transition metal used to synthesize the AQCs).
  • composition comprising atomic quantum clusters (AQCs) consisting of between 2 and 5 zero-valence transition metal atoms, which is substantially free (i.e. less than 20% , 15%, 10%, 5%, 2%, 1%) of AQC consisting of more than 5 zero-valence transition metal atoms and / or metal ions.
  • AQCs atomic quantum clusters
  • a composition comprising atomic quantum clusters (AQCs) consisting of 5 zero-valence transition metal atoms, which is substantially free (i.e. less than 20%, 15% , 10%, 5%, 2%, 1%) of AQC consisting of more than 5 zero-valence transition metal atoms and / or less than 5 zero-valence transition metal atoms and / or metal ions.
  • Such methods may include: (i) applying a solution comprising a mixture of AQC to a separation medium, where said separation medium binds or does not bind to AQC consisting of more than 5 zero valence transition metal atoms ; and (ii) isolate AQCs consisting of 5 zero-valence transition metal atoms.
  • the separation medium is used in a chromatographic procedure.
  • Chromatography is a procedure used to separate a mixture by passing a mobile phase comprising the mixture through a stationary phase (eg, comprising the separation medium described herein). The mixture is separated based on how the components of the mobile phase interact with the stationary phase. It will be understood that the fraction retained or discarded will depend on the content and whether the 5 zero-valence transition metal atoms are present. For example, if the separation medium retains AQCs consisting of more than 5 zero-valence transition metal atoms, then the eluate (comprising AQCs consisting of 5 or fewer zero-valence transition metal atoms) will be collected. ).
  • the separation medium retains the AQCs that consist of 5 zero valence transition metal atoms, then the eluate (comprising AQCs consisting of more and / or less than 5 zero valence transition metal atoms) is discarded.
  • the separation medium is present on a chromatography column. Such chromatography columns are commercially available.
  • the separation media may comprise, for example, AQC-binding functional groups of particular sizes, such as an AQC-binding thiol group consisting of more than 3 zero-valence transition metal atoms.
  • the functional group may comprise an aromatic group, such as a cyclic or polycyclic aromatic group.
  • the separation media may also comprise, for example, deoxyribonucleic acid (DNA) which is substantially double-stranded.
  • DNA deoxyribonucleic acid
  • Three metal atom clusters have been found to interact with DNA through intercalation that is strictly dependent on the number of atoms in the cluster and independent of the type of base pairs (GC AT) of the double helix. Therefore, DNA can be used to separate AQCs consisting of 3 zero-valence transition metal atoms.
  • the separation medium is used in a dialysis procedure.
  • Dialysis is a procedure for separating molecules that is based on their diffusion rates through a semipermeable membrane.
  • the solution comprising a mixture of AQC could be applied to a separation medium and then placed in a dialysis device (for example, a dialysis cassette or a dialysis tube).
  • a dialysis device for example, a dialysis cassette or a dialysis tube.
  • Such cassettes, tubes, or devices for dialysis are commercially available.
  • Dialysis membranes can be chosen with a molecular weight cutoff chosen according to the separation requirements (eg, according to the molecular weight of the DNA used in the separation medium).
  • one or more of the purification procedures disclosed herein can be performed in combination and / or repeated one or more times. Carrying out the purification procedure several times can increase the purification of the sample and allow the desired purification to be achieved.
  • Treatment methods in accordance with one aspect of the invention, there is provided a method of preventing or treating a cellular proliferative disorder comprising administering a therapeutically effective amount of a composition comprising atomic quantum clusters (AQCs) consisting of 5 valence transition metal atoms zero, to a patient who needs it.
  • AQCs atomic quantum clusters
  • said method does not comprise treating the patient with an additional antineoplastic drug.
  • a method of preventing and / or treating a cellular proliferative disorder comprising administering a therapeutically effective amount of the composition described herein, to a patient in need.
  • a method of treating a patient with a cellular proliferative disorder comprising administering a composition as described herein.
  • the embodiments described herein above for the compositions can be applied to such treatment methods (eg, time and mode of administration, formulation of the composition, etc.).
  • a method of preventing and / or treating cancer metastasis which comprises administering a composition as described herein.
  • the method prevents and / or treats cancer metastasis in the lymph nodes.
  • the method prevents and / or treats lung cancer metastasis.
  • the treatment methods described herein further comprise treating the patient with radiation therapy, such as after administration of the composition.
  • the composition of the invention has particular use as a sensitizing agent to radiation therapy.
  • the composition is administered orally, intravenously, or subcutaneously.
  • the composition is administered simultaneously or prior to radiation therapy.
  • the method further comprises administering a therapeutically effective amount of a composition comprising AQCs consisting of 3 zero valence transition metal atoms.
  • the composition comprising AQC consisting of 3 zero valence transition metal atoms is administered simultaneously or sequentially to the composition comprising AQC consisting of 5 zero valence transition metal atoms.
  • the patient can be any subject suffering from the disorder.
  • the patient is a mammal.
  • the mammal is selected from a human or a mouse.
  • the therapeutic effect of the composition and radiation therapy is synergistic.
  • the composition sensitizes cancer cells in the patient to radiation therapy.
  • the method comprises administering a therapeutically effective amount of radiation.
  • the amount of radiation used in radiation therapy is measured in Gray (Gy) units and varies depending on the type and stage of the cancer being treated.
  • the total radiation dose can be divided into multiple smaller doses known as "fractions" over a period of several days to minimize negative side effects.
  • a typical fractionation schedule for adults is 1.8 to 2 Gy per day, five days a week.
  • a typical fractionation schedule for children is 1.5 to 1.8 Gy a day, five days a week.
  • a total of at least about 10 Gy is administered, such as 15 Gy, 20 Gy, 25 Gy, 30 Gy, 35 Gy, 40 Gy, 45 Gy, 50 Gy, 55 Gy, 60 Gy, 65 Gy, 70 Gy, 75 Gy, 80 Gy, 85 Gy, 90 Gy, 95 Gy or 100 Gy to a patient who needs it.
  • the patient can receive radiation three, four, or five times per week.
  • a full course of treatment can last from one to seven weeks, depending on the type of cancer and the goal of the treatment.
  • radiation therapy occurs over a period of at least 2, 3, or 4 weeks, such as 2-6 weeks, such as 2-4 weeks, or 5-8 weeks, in particular 5-7 weeks.
  • a patient can receive a dose of 2 Gy / day for approximately 30 days (i.e.
  • the radiation is administered at least once a day for five consecutive days per week.
  • radiation is administered in fractions of at least about 2 Gy at least once a day.
  • the radiation is administered every other day, three times a week.
  • radiation is administered in 10 Gy fractions every other day, three times a week.
  • radiation therapy is hypofractionated.
  • Hypofractionation is a treatment regimen that delivers higher doses of radiation in fewer visits.
  • radiation therapy is hyperfractionated. Hyperfractionation is a treatment regimen that divides the total dose into more administrations. It will be appreciated that many other factors are considered when selecting a dose, including whether the patient is receiving chemotherapy, patient comorbidities, whether radiation therapy is given before or after surgery, and the degree of success of the surgery.
  • the invention provides a method of preventing damage to non-proliferative cells in a patient undergoing radiation therapy, which comprises administering a therapeutically effective amount of a composition comprising AQC consisting of 5 transition metal atoms of zero valence to said patient before radiation therapy.
  • a method of treating metastases such as lymph node metastases, which comprises administering a therapeutically effective amount of a composition comprising AQC consisting of 5 zero-valence transition metal atoms, to a patient in need, in combination with radiation therapy.
  • kits of parts comprising: the composition as described herein, optionally in admixture with a pharmaceutically acceptable adjuvant, diluent, or vehicle.
  • the kit according to this aspect of the invention can be used in the treatment of a cell proliferative disorder.
  • the kit can be used in combination with radiation therapy for the treatment of a cell proliferative disorder.
  • an apoptotic agent comprising AQCs consisting of 5 zero valence transition metal atoms.
  • the apoptotic agent may comprise the composition as described herein.
  • a method of inducing thiol oxidation which comprises administering the composition as described herein, optionally in combination with reactive oxygen species (ROS).
  • ROS reactive oxygen species
  • AQCs consisting of 5 atoms provide a catalytic bridge between ROS present in the cell and the sulfur atoms in the cysteine residues of the proteins. Therefore, the composition of the invention can be used to improve the oxidation of thiol.
  • the addition of ROS would depend on whether the target already contained ROS.
  • composition is provided, as described herein, for use in treating a disease caused by bacteria.
  • MEC-1 Human B-cell chronic lymphocytic leukemia cell line
  • MTF-1 Metal Sensitive Transcription Factor 1
  • NAD H Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate Neh Homology domain Nrf2-ECH
  • the sandpaper 1,000 grit was supplied by Wolfcraft Espa ⁇ a S.L., Madrid, Spain. All aqueous solutions were prepared with MilliQ quality water using a Millipore Direct-Q8UV system (Millipore Ibérica S.A., Madrid, Spain).
  • the mica sheets (V-1 grade Muscovite) were purchased from SPI Supplies, West Chester, PA, USA.
  • XANES experiments of the SK edge (2470 eV) were performed on the SXS beam line at the National Synchrotron Light Laboratory (LNLS, Campi ⁇ as, Brazil) which is equipped with a double crystal monochromator from InSb (111) with an aperture of 1 mm, to achieve a resolution of approximately 0.5 eV at the S K edge.
  • X-ray absorption spectra were recorded in fluorescence mode, collecting X-rays emitted from emission lines S Ka1, 2 (at 2309 , 5 and 2308.4 eV, respectively) for each measured edge.
  • A549 human lung adenocarcinoma, DSMZ #: ACC 107
  • A549 Luc-C8 Bioware®
  • MCF7 human breast adenocarcinoma, DSMZ #: ACC 115
  • HCT1 16 human colorectal carcinoma, ATCC #: CCL-247
  • HEK293 Kidney, human embryo
  • U87-luc human glioblastoma multiforme, kindly provided by Joan Seoane
  • U251-Luc glioblastoma Human, kindly provided by Joan Seoane
  • MM.1 S Human Multiple Myeloma, ATCC #: CRL-2974
  • RL Human Non-Hodgkin Lymphoma, ATCC #: CRL-2261
  • MEC-1 Leukemia chronic human B lymphocyte lymphocyte, DSMZ, No.: ACC 497.
  • A549, A549-Luc, MCF7, U87-Luc, and HCT116 are derived from solid tumors and grow adherently as a monolayer, while MM.1S, RL, and MEC-1 are derived from hematologic malignancies and grow in suspension.
  • the A549, A549-Luc, U251-Luc and HEK293 cell lines were maintained on glucose high in DMEM content (D6046, Sigma); MCF7 and U87-Luc cell lines in glucose with high DMEM content (D5671, Sigma); HCT1 16, MM. IS and RL in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (R-5886, Sigma) and the DMEM / Ham F-12 nutrient mix 1: 1 cell line MEC-1.
  • RPMI Roswell Park Memorial Institute
  • the medium was supplemented with 10% fetal calf serum and 1% v / v L-glutamine, penicillin, and streptomycin (Gibco).
  • the modified cell lines (A549-Luc and U87-Luc) were supplemented with puromycin (1.3 pg / ml for A549-Luc and 5 pg / ml for U87-Luc) to select stable transfected cells. All cell lines were grown at 37 ° C in a humidified atmosphere in the presence of 5% CO2 and 95% air.
  • mice Female athymic hairless mice weighing approximately 20-25 g and aged 8-12 weeks were used in the in vivo studies, which were supplied by Janvier Laboratories. The animals were acclimatized for at least 1 week before experimentation, they were housed in ventilated polypropylene cages at an average temperature of 22 ° C, with an exposure of 12 hours of light and 12 hours of darkness every day. All mice received a standard food and water laboratory diet ad libitum. The experiments were carried out in accordance with the Norms of the Bioethics Committee of the University of Santiago de Compostela and in accordance with the Principles of Laboratory Animal Care according to Spanish national legislation (RD 53/2013).
  • Cytotoxicity was assessed using the MTT assay.
  • Proliferative cells A549 (4 x 10 3 cells / well) and U251 (5 x 10 3 cells / well) were seeded in 96-well plates. 24 hours later, the medium was discarded and replaced with serum-free media containing different concentrations of Ag5-AQC (1, 2-0.24 mg / l) for 1 hour and allowed to grow for a further 24 hours in complete medium .
  • the primary culture of B-CLL (4 x 10 4 cells / well) was seeded in serum-free medium and different concentrations of Ag5-AQC (1.2-0.24 mg / l) were immediately added to the wells for 30 minutes . After that, complete medium was added and the cells were allowed to grow for 24 hours.
  • Nonproliferative cells (confluent or serum deprived): A549 cells (4 x 10 3 cells / well) and U251 (5 x 10 3 cells / well) were seeded in 96-well plates. Confluent cells were allowed to grow for 96 hours in 10% -FBS medium to reach confluence. For serum-deprived cells, 24 hours after seeding the medium was replaced with 0.05% FBS-medium for 72 hours. Under both conditions, the non-proliferative state of the cells was confirmed by flow cytometry. The cells were then treated with Ag5-AQC (1.2-0.24 mg / L) for 1 hour in serum-free medium and incubated in complete medium for an additional 24 hours.
  • Ag5-AQC (1.2-0.24 mg / L
  • MTT solution 5 mg / ml
  • 100 ⁇ l of a solubilization solution SDS / 0.1 N HCI
  • SDS / 0.1 N HCI solubilization solution
  • the PREMO Grx-1-roGFP Cellular Redox Sensor (Molecular Probes, P36242) is a genetically encoded sensor used to detect changes in glutathione redox status in living cells.
  • the sensor is based on the introduction of two cysteines in the barrel b structure of the GFP protein. Under oxidation conditions, the formation of disulfide bonds alters the fluorescent properties of the biosensor, resulting in a change in emission intensity after excitation at two different wavelengths (400 and 488 nm). The ratio of emission intensities is correlated with a change in the redox state of roGFP.
  • cell number is the number of cells seeded per plate; MOI is the number of viral particles per cell, and 1x10 8 is the number of viral particles per ml of reagent.
  • MTF-1 A549 cells (2.5 x 10 4 ) were grown on glass coverslips in 24-well plates and treated with Ag5-AQC (IC50) for 1 hour in medium without serum and then the medium was replaced with half full for 2 hours.
  • Nrf2 HEK293 cells (3 x 10 4 ) were seeded on glass coverslips in 24-well plates overnight and treated with Ag5-AQC (IC50), DTT (0.5mM), or a combination of both, for 10 or 30 minutes in medium without serum. After treatment, the cells were fixed in a formalin solution (10%) for 30 minutes, washed twice with PBS Ca2 + / Mg2 + and permeabilized with 0.5% Triton X-100 for 5-10 minutes. The cells were then washed again and blocked with PBS containing 1% BSA.
  • the cells were incubated with the primary antibody against Nrf2 (1: 100 dilution) (sc-722, Santa Cruz Biotechnology) for 2 hours at room temperature, washed twice with PBS and incubated with the secondary anti-IgG antibody.
  • Stained cell coverslips were mounted on glass slides with Fluoroshield mounting medium (F6182, Sigma). Images were obtained with the Leica TCS SP8 confocal microscope and analyzed with LasX software.
  • DHE superoxide dihydroetidium indicator
  • the multicellular tumor spheroids A549 and U251 were generated using the hanging drop method. 20 pl of a cell suspension containing 500 cells were dispensed into a 60-well mini-tray (Nunc). After that, the trays were inverted and incubated for 5 days under standard conditions. On day 5, the trays were placed straight and the spheroids were transferred to a 96-well plate coated with 50 ⁇ l of 1% agarose. The spheroids were then treated with Ag5-AQC four times every other day and images of the spheroids were taken every day until the end of treatment using the Olympus 1X51 microscope equipped with an Olympus DP72 camera and CellSens Imaging software. Images were processed using ImageJ to measure spheroid area and differences in gray values as an indirect indicator of cell density.
  • the spheroids were stained with 5mM Image- ⁇ T Green Hypoxia Reagent (Molecular Probes, 114834) and Hoechst (1 pg / ml) for 1 hour. Images of control and treated spheroids were taken on a Leica AOBS-SP5 confocal microscopy and analyzed using ImageJ software.
  • the A549luc orthotopic lung cancer model was developed following the protocol described by Borrajo et al. (2016) J. Control Release 238: 263-271. 1x10 6 A549Luc cells suspended in 50 ml PBS were injected through the intercostal space into the left lung of nude hairless mice. The evolution of the tumor was followed by injection of luciferin into the intraperitoneal cavity at a dose of 150 mg / kg of body weight approximately 5 minutes before imaging. Bioluminescence of luciferase was imaged under isoflurane anesthesia vaporized using the IVIS LIVING IMAGE system (Caliper Life Sciences).
  • mice were divided into three groups (5 animals in each): the first group (control) did not undergo treatment, the second group was treated with cisplatin (CDDP) (four single doses, 4 mg / kg), and the third group was treated with Ag5-AQC (four single doses, 0.25 mg / kg).
  • the drugs were applied intravenously through the tail vein on days 20, 22, 24, and 26 after inoculation of the tumors. Mice were sacrificed on day 37. Lungs and mediastinal lymph nodes were excised and luminescence was quantified per microgram of protein in the body as described in Borrajo et al. (2016).
  • the lungs were fixed in formalin with 10% neutral buffer for 24 hours and embedded in paraffin. 4mm thick sections were mounted on FLEX IHC microscope slides (Dako-Agilent, Glostrup, Denmark) and heated at 60 ° C for 1 hour. The immunohistochemical technique was performed automatically using an AutostainerLink 48 (Dako-Agilent). After deparaffinization and epitope recovery in the EnVision FLEX target recovery solution (high pH) for 20 min at 97 ° C, the slides were allowed to cool in PT Link to 65 ° C and then in a wash buffer Dako for 5 minutes at room temperature (RT).
  • RT room temperature
  • the immunostaining protocol included incubation at room temperature in: (1) EnVision FLEX peroxidase blocking reagent (Dako-Agilent) for 5 minutes; (2) ready-to-use primary FLEX antibody (Dako-Agilent) anti-CK7 (clone OV-TL12 / 30), for 20 minutes; (3) EnVision FLEX / HRP (horseradish peroxidase-conjugated dextran polymer and affinity isolated goat anti-mouse and anti-rabbit immunoglobulins) for 20 minutes; (4) working solution of the substrate (mixture) (3,3'-diaminobenzidine tetrachlorohydrate chromogenic solution) (Dako-Agilent) for 10 minutes; and (5) hematoxylin EnVision FLEX (Dako-Agilent) for 9 minutes.
  • the sections were examined and photographed using an Olympus PROVIS AX70 microscope equipped with an Olympus DP70 camera.
  • A549 cells (3x10 4 cells / well) and U251 (3.5 x10 4 cells / well) were seeded in a 24-well plate and incubated for 96 hours to reach confluence.
  • the medium was then replaced with FBS-free medium containing different dilutions of Ag5-AQC (1:50, 1:75 and 1: 100 for A549 and 1:50, 1: 175 and 1: 200 for U251).
  • the cells were irradiated with doses of 0-10 Gy using a linear accelerator from the Radiation Physics Laboratory of the University of Santiago.
  • the synthesis of the Ag5-AQC clusters was performed at 25 ° C using a VMP3 biological potentiostat (Seyssinet-Oarsetm, France).
  • both silver electrodes were polished with sandpaper followed by alumina (approximately 50 nm), vigorously washed with MilliQ water and sonicated (2 steps 5 minutes changing the water in each stage). After sonication, and before synthesis, an electrochemical cleaning was carried out consisting of a 5 minute step at 250 mA in water.
  • the Ag5-AQC concentration at the end of the purification process is approximately 30 mg / l, estimated by flame atomic absorption spectroscopy (performed with a Perkin-Elmer 3110 with a Perkin Lumia silver hollow cathode lamp). Elmer (Madrid, Spain) (current 10 mA)). Mass spectrum analysis shows that mainly Ag5-AQC species are present (approximately> 50%).
  • Ag5-AQCs promote oxidation of sulfur to cysteine and glutathione as seen using near-edge X-ray absorption (XANES) ( Figure 2). Furthermore, this reaction depends on the dose ( Figure 3). Thioredoxin from E.Coli has also been shown to oxidize in the presence of Ag5-AQC ( Figure 4). How I know I expected, the pure thioredoxin molecule only shows a peak at 2474.3 eV, consistent with the oxidation state S (-2), which corresponds to its two groups of cysteines.
  • Ag5-AQCs are bacteriostatic and bactericidal against E. Coli.
  • the responsible mechanism is believed to be oxidation of thiol.
  • dithiothreitol (DTT) a thiol reducing agent
  • rescues E. Coli from the action of Ag5-AQC rescues E. Coli from the action of Ag5-AQC.
  • Ag5-AQCs rescue E. Coli from DTT action as expected from redox agents with opposite action.
  • Clusters made of copper and platinum also have bactericidal activity.
  • a panel of nine cell lines was used: A549 (human lung adenocarcinoma, DSMZ #: ACC 107), A549 Luc-C8 (BIOWARE ®), MCF7 (human breast adenocarcinoma, DSMZ #: ACC 115), HCT1 16 (human colorectal carcinoma, ATCC #: CCL-247), HEK293: (Kidney, human embryo), U87-luc (glioblastoma multiforme Human, kindly provided by Joan Seoane), MM.1 S (Human Multiple Myeloma, ATCC #: CRL-2974), RL (Human Non-Hodgkin Lymphoma, ATCC #: CRL-2261), and MEC-1 (Leukemia chronic human B lymphocyte lymphocyte, DSMZ #: ACC 497).
  • the development of redox sensitive GFP molecules allows monitoring of the redox state within living cells by fluorescence microscopy.
  • the roGFP-Grx1 chimera is a genetically encoded sensor to measure changes in thiol oxidation through two cysteines introduced into the B-barrel structure of the GFP protein. Disulfide formation between cysteines leads to GFP protonation and increases the 400nm excitation spectra at the expense of the 488nm excitation spectra.
  • A549 cells were transduced with the sensor for 48 hours and changes in fluorescence intensity were monitored by confocal fluorescence microscopy for 10 minutes after treatment with Ag5-AQC (IC50 - approximately 0.3 mg / l).
  • EXAMPLE 6 Ag5-AQC act on critical thiols present in proteins Metallothioneins (MT) are a group of low molecular weight, cysteine-rich intracellular metal binding proteins that play a critical role in protection against oxidizing agents. MT expression is under the control of metal-sensitive transcription factor 1 (MTF-1). Under normal conditions, MTF-1 spreads between the cytoplasm and the nucleus, but after various stresses it accumulates in the nucleus and binds to the metal-sensitive element (MRE) that induces MT expression among other genes.
  • MTF-1 metal-sensitive transcription factor 1
  • MTs Under physiological conditions, MTs bind to zinc through the thiol group of their cysteine residues forming two zinc / thiolate clusters, but under conditions of oxidative stress, zinc is released through oxidation of the zinc clusters / thiolate that lead to the formation of MT-disulfide.
  • This state of MT-disulfide can be reversed in a reduced environment, leading to the formation of MT-thiol that can associate with zinc ions to form MT.
  • This process constitutes the MT redox cycle, which plays a crucial role in the biological function of MT.
  • Nrf2-Keap1 pathway is generally considered an important cellular defense pathway, which controls the expression of genes that have antioxidant functions within cells. Initially, Nrf2 is transcriptionally repressed by Keapl in the cytoplasm, which in turn facilitates Cul3-mediated poly-ubiquitination of Nrf2 leading to its proteosomal degradation. Keapl contains 27 cysteines, some of the which were reported to be the target of electrophiles and oxidants that modify them, facilitating the elimination of Nrf2 repression.
  • Keapl Upon exposure to stress, Keapl is inactivated by direct modification of cysteine thiol residues, and subsequently Nrf2 stabilizes, preventing proteasomal degradation and translocating to the nucleus to mediate the activation of a variety of genes involved in the antioxidant response such as glutathione peroxidase (GPx), NAD (P) H quinone oxidoreductase (NQO-1) and heme oxygenase-1 (HMOX1).
  • Gx glutathione peroxidase
  • NAD NAD
  • NQO-1 H quinone oxidoreductase
  • HMOX1 heme oxygenase-1
  • NEM N-ethylmaleimide
  • the A549 cell line has mutations in the Keapl gene that results in an alteration of Keapl activity that stops exerting its repressive function on Nrf2, which leads to a predominant localization of Nrf2 in the nucleus under normal conditions. Therefore, this cell line is not suitable for studying the cellular location of Nrf2. Instead, 293 human embryonic kidney cells (HEK293) were exposed to NEM (100mM) and Ag5-AQC (IC50 - approximately 0.3mg / L) for 30 minutes and then stained with specific antibodies against Keapl and Nrf2 .
  • Ag5-AQC treatment caused an increase in Nrf2 protein staining (red staining) indicative of protein stabilization and nuclear accumulation (blue colocalization, Hoechst staining) after 30 minutes compared to control cells, where Nrf2 is predominantly found in the cytoplasm ( Figure 11 b).
  • treatment with NEM increased nuclear accumulation of Nrf2. It is evident that Ag5-AQC and NEM share a similar staining pattern (increased expression of Nfr2 due to reduced degradation and increased nuclear localization), thus supporting the action of Ag5-AQC on thiols.
  • Multicellular tumor spheroids resemble many aspects of pathophysiological conditions within human tumor tissue and are widely used for drug testing. Therefore, the MCTS of A549 cells were developed as an ex vivo tumor model to assess Ag5-AQC activity.
  • the physiological state of cells in MCTS depends on their size; a single MCTS approximately 400-500 pm in diameter after 4 days of incubation is frequently selected for drug testing. Therefore, MCTS were selected according to these criteria and treated with Ag5-AQC (2.4 mg / l) four times (days 0, 2, 4 and 6, considering the first day of treatment as 0). Control and treated MCTS images were taken every day from day 0 to day 7.
  • hypoxia levels in the tumoroid were evaluated using a fluorescent probe. As shown in Figure 12c, hypoxia levels increase inside the tumor of 1,000 cells. Interestingly, exposure of the tumoroid to the increasing concentration of Ag5-AQC caused a dose-dependent reduction in hypoxic cells.
  • GBM glioblastoma multiforme
  • EHB blood-brain barrier
  • Another limiting factor in cancer treatment is the appearance of metastases. Metastatic disease is largely incurable due to its systemic nature and the resistance of disseminated tumor cells to existing therapeutic agents. This explains why more than 90% of cancer mortality is attributable to metastasis, but not to the primary tumors from which these neoplastic lesions arise.
  • the ability of Ag5-AQC to reduce or eliminate both the primary tumor and metastases was assessed using a previously described A549luc orthotopic lung cancer model that metastasizes to mediastinal lymph nodes (Porto et al. (2016) Adv. Mater. e1801317).
  • the A549 cell line is known to be a mutant cancer cell line in KRAS.
  • mice treated with Ag5-AQC and CDDP exhibited a significant reduction in luciferase activity in the primary tumor and in the mediastinal lymph nodes compared to control mice ( Figure 14c). Luciferase activity was compared in mice treated with Ag5-AQC and those treated with CDDP.
  • Ag5-AQCs offer a new approach that can improve the treatment of human tumors due to their ability to cross the EHB and to reach and reduce metastasis.
  • Ag5-AQC sensitivity was assessed ex vivo in cells derived from patients with chronic B-cell lymphocytic leukemia (B-CLL) obtained from routine bone marrow cultures after the diagnosis was established.
  • B-CLL chronic B-cell lymphocytic leukemia
  • An evaluation of the cytotoxic effect and ultrastructural morphological changes associated with Ag5-AQC treatment was performed on cells derived from 3 patients.
  • B-CLL cells were cultured with different doses of Ag5-AQC and cytotoxicity was assessed by the MTT assay. Consistent with the above results obtained from established cell lines, a concentration dependent reduction in cell viability was observed after 24 hours (Figure 15a).
  • EXAMPLE 11 Effect of Ag5-AQC on a multiple myeloma tumor model
  • EXAMPLE 12 Ag5-AQC cause cell death preferably in Ras transformed cells
  • DNA damage was also measured in irradiated cells. After irradiation, cells were trypsinized fixed with PFA (0.04%) and stained with anti-pH2AX antibody (Millipore, Product No.: 16-202A) as described in Muslimovic et al. (2008) Nat. Protocol. 3: 1187-1193. Expression of phosphorylated histone H2AX (pH2AX) is a marker of DNA damage (Sharma et al. In DNA Repair Protocols, (Ed: L. Bjergbask), Springer Science, New York, 2012, ch. 40). Stained cells were analyzed on the Guava EasyCyte flow cytometer using the InCyte program (Millipore). The results are shown in Figures 18B and 19B.
  • AQCs consisting of 5 zero-valence transition metal atoms can be further tested in two different models to determine the effect with radiation therapy.

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Abstract

Se proporciona una invención relacionada con composiciones y usos terapéuticos de clústeres cuánticos atómicos (AQC), en particular composiciones que consisten esencialmente en AQC que comprenden 5 átomos de metal de transición de valencia cero para su uso en el tratamiento de un trastorno proliferativo celular.

Description

USOS TERAPÉUTICOS DE CLÚSTERES CUÁNTICOS ATÓMICOS CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención se refiere a usos terapéuticos de clústeres cuánticos atómicos, en particular clústeres cuánticos atómicos que consisten en 5 átomos de metal de transición de valencia cero.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La homeostasis redox es esencial para la supervivencia celular. Los tioles desempeñan un papel principal en el mantenimiento del equilibrio redox. El átomo de azufre en la cadena lateral del aminoácido cisteína puede existir en varios estados de oxidación diferentes. En condiciones fisiológicas, el átomo de azufre de la cisteína transita de manera reversible entre los estados de tiol y disulfuro (reducido y oxidado, respectivamente), pero la transición a estados de oxidación superiores (excepto para el ácido sulfónico) es irreversible, lo que significa que la proteína solo puede ser reemplazada por la síntesis de una nueva. Las células en sus diferentes compartimentos, con la única excepción del retículo endoplasmático, reducen continuamente las proteínas que se oxidan espontáneamente por la presencia de oxígeno. Dentro de la célula, las funciones de las proteínas dependen de su estado de oxidación del azufre. Hay dos sistemas superpuestos, los sistemas de glutatión y tiorredoxina, que están muy bien conservados a lo largo de la evolución y trabajan para mantener las proteínas cisteínas en su estado funcional y reducido.
Las especies reactivas de oxígeno (ROS) se generan durante el metabolismo normal de las células y los sistemas de glutatión y tiorredoxina protegen a las células del daño oxidativo al mantener el estado reducido. Si los niveles de ROS son elevados y exceden la capacidad de tamponamiento de los sistemas de glutatión y tiorredoxina, puede producirse la activación de las vías de señalización y la expresión génica, lo que induce la apoptosis celular. Las células tumorales proliferativas activas muestran un aumento de la respiración y, como consecuencia, niveles más altos de ROS. Además, los tumores humanos muestran una vascularización insuficiente que contribuye a la privación de glucosa y el aumento de ROS debido a un desequilibrio de la homeostasis redox. El documento WO2012/059572 describe una combinación de al menos un AQC y al menos un fármaco antineoplásico para la prevención y/o el tratamiento de un trastorno proliferativo celular. La solicitud describe AQC que consisten en entre 2 y 25 átomos de metales de transición de valencia cero que tienen un efecto citotóxico y antiproliferativo en líneas celulares cancerosas y, por lo tanto, pueden usarse en combinación con agentes antineoplásicos para tratar trastornos proliferativos celulares.
Es un objeto de la invención proporcionar composiciones terapéuticas mejoradas de AQC.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
En un primer aspecto, la invención proporciona una composición que comprende clústeres cuánticos atómicos (AQC) que consisten en 5 átomos de metal de transición de valencia cero para su uso en el tratamiento de un trastorno proliferativo celular.
En otro aspecto, la invención proporciona el uso de la composición como se define en el presente documento, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un trastorno proliferativo celular.
En otro aspecto, la invención proporciona el uso de una composición que comprende clústeres cuánticos atómicos (AQC) que consisten en 5 átomos de metal de transición de valencia cero como agente sensibilizador a la radioterapia para células proliferativas.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para prevenir o tratar un trastorno proliferativo celular que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición como se define en el presente documento, a un paciente que lo necesite.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para prevenir o tratar un trastorno proliferativo celular que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende clústeres cuánticos atómicos (AQC) que consisten en 5 átomos de metal de transición de valencia cero, a un paciente que lo necesite, donde dicho método no comprende tratar al paciente con un fármaco antineoplásico adicional.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para prevenir o tratar un trastorno proliferativo celular que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende clústeres cuánticos atómicos (AQC) que consisten en 5 átomos de metal de transición de valencia cero, a un paciente que lo necesite, en combinación con radioterapia.
Estos y otros aspectos se describen con más detalle en la siguiente descripción.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1 : Interacción de Ag5-AQC con tiorredoxina de E. Coli. Como se observa, Ag5- AQC (molécula grande, gris, de cinco miembros) se une a los residuos de cisteína (moléculas resaltadas por una flecha negra) que forman el sitio activo. La energía de la unión es favorable (-167 kJ/mol).
Figura 2: Espectros normalizados de absorción de rayos X cercana a la estructura del borde en el borde de azufre K (S-K XANES) de (S-K XANES): cisteína (a) y glutatión (b) y los correspondientes con la adición de Ag5-AQC (c y d, respectivamente). El panel derecho muestra la región aumentada del gráfico de la izquierda. Las líneas verticales completas y discontinuas indican la posición de energía asociada a los diferentes estados de S-oxidación.
Figura 3: Espectros S-K XANES normalizados de: (a) cisteína y cisteína tratada con Ag5-AQC a diferentes concentraciones: (b) 1 : 106 diluidos con respecto a la concentración madre de referencia (RSC), (c) 1 :103 diluidos con respecto a RSC y (d) RSC. Las líneas verticales indican la energía correspondiente para diferentes estados de S-oxidación.
Figura 4: Espectros S-K XANES normalizados de: tiorredoxina en solución acuosa con PBS (a) antes y (b) después del tratamiento con Ag5-AQC. Las líneas verticales indican la energía correspondiente para diferentes estados de S-oxidación.
Figura 5: Porcentaje de tiorredoxina (TRX) oxidada con Ag5-AQC, peróxido de hidrógeno (H2O2) y radical hidroxilo (HO) en solitario o en diversas combinaciones, como se muestra en el eje x. Figura 6: Número de oxidación de azufre de tiorredoxina cisteínas después de diversos tratamientos. La oxidación de azufre se ve afectada por Ag5-AQC, peróxido de hidrógeno (H2O2) y el radical hidroxilo (HO·)· La combinación con Ag5-AQC potencia enormemente el efecto de H2O2 y HO·.
Figura 7: La supervivencia de E. Coli se midió después de la adición de diferentes concentraciones de ditiotreitol (DTT) ya sea en solitario (control) o en combinación con Ag5-AQC. En ausencia de DTT (0 mM), una baja concentración de Ag5-AQC destruye las bacterias. Cuando se administra conjuntamente una mayor concentración de DTT (0, 1 mM) con Ag5-AQC, la viabilidad de las bacterias se restablece parcialmente, lo que indica que el DTT rescata a E. Coli de la acción de Ag5-AQC. Por consiguiente, el DTT a 10 mM es tóxico para las bacterias, sin embargo, la administración conjunta con Ag5- AQC revierte el efecto del DTT.
Figura 8: Gráficos de respuesta a la dosis (0,24-1 ,2 mg/l) para diversas líneas celulares tras la adición de Ag5-AQC.
Figura 9: Resultados que muestran el porcentaje de viabilidad celular de una línea celular A549 tras la adición de clústeres de 5 átomos de cobre (Cus-AQC) en comparación con un control.
Figura 10: Oxidación de Ag5-AQC de grupos sulfhidrilo en proteínas. Las células A549 se transdujeron con un sensor redox celular Premo. Después de 48 horas, se tomaron imágenes en intervalos utilizando un microscopio confocal Leica TCS SP5. Las muestras se excitaron con láseres de 405 y 488 nm, y se calculó la relación de emisiones en el canal verde (500-530 nm) (relación 405/488). Las imágenes se tomaron cada 10 segundos después de la adición de Ag5-AQC (CI50) durante 10 minutos. Las imágenes de relación de color falso de las células en los puntos de tiempo indicados resaltan los cambios en el estado redox. En cada experimento, la relación se cuantificó para dos células individuales (puntas de flecha) y se representó gráficamente con respecto al tiempo.
Figura 11 : (a) Se detectó la ubicación de MTF1 en respuesta a Ag5-AQC por inmunofluorescencia indirecta. Las células A549 se trataron con Ag5-AQC durante 1 hora y 2 horas y después se fijaron y se tiñeron con el anticuerpo anti-MTF1 y DAPI para contrateñir el núcleo. Ag5-AQC mostró una clara translocación de MTF-1 en el núcleo (columna derecha) en comparación con las células de control (columna izquierda) (b) los Ag5-AQC inducen la translocación de Nrf2 del citoplasma al núcleo en las células HEK293. La tinción de inmunofluorescencia se realizó usando un anticuerpo anti-Nrf2 (rojo) y un anticuerpo anti-Keap1 (verde). Los núcleos se contratiñeron con Hoechst (azul). Las imágenes fusionadas muestran la ubicación nuclear de Nrf2 después de 30 minutos de tratamiento con Ag5-AQC (CI50) o N-etilmaleimida (NEM) (100 mM, control positivo).
Figura 12: El tratamiento con Ag5-AQC reduce el tamaño del esferoide tumoral multicelular (MCTS) A549. (a) Imágenes de control de MCTS y tratadas con Ag5-AQC que muestran diferencias en el tamaño de MCTS y la densidad celular en las regiones centrales. El asterisco blanco indica el día del tratamiento y las flechas apuntan a regiones centrales con menor densidad celular como resultado del tratamiento con Ag5- AQC (b) Cinética de crecimiento del control de MCTS o tratada con Ag5-AQC. Los datos representan la media ± DE. Las barras de error representan la desviación estándar; n = 8. Prueba de Mann Whitney ((*) p <0,05). (c) Imágenes con agente de hipoxia y tinción de Hoechst para mostrar el nivel de hipoxia en los tumoroides con o sin tratamiento con Ag5-AQC (control).
Figura 13: Las células proliferativas son más sensibles al efecto de los Ag5-AQC que las células no proliferativas. (A) las células A549 proliferativas y no proliferativas, (B) las células U251 proliferativas y no proliferativas, y (C) las células A549 privadas de suero se expusieron a diferentes concentraciones de Ag5-AQC durante 1 hora y la viabilidad celular se determinó mediante un ensayo MTT. Los datos se muestran como la media ± DE tres experimentos independientes. D) Las células A549 privadas de suero o confluentes se trataron con 1 ,2 mg/l de Ag5-AQC en solitario o en combinación con H2O2. Se observa claramente un efecto sinérgico cuando se administran conjuntamente Ag5-AQC y H2O2.
Figura 14: Efectos de Ag5-AQC in vivo, (a) Los Ag5-AQC causan una reducción en el crecimiento tumoral en ratones con cáncer cerebral ortotópico. Grupos experimentales: Ag5-AQC (0,25 mg/kg) y control (sin tratamiento) (b-d) El tratamiento con Ag5-AQC causa una reducción en el crecimiento tumoral en ratones con cáncer de pulmón ortotópico. (b) Crecimiento tumoral medido in vivo por luminiscencia (I VIS® Spectrum). Las flechas negras representan los tiempos de administración del tratamiento en el estudio (c) Cuantificación de la actividad de la luciferasa medida ex vivo en el pulmón y en los ganglios linfáticos mediastínicos. (d) Tinción inmunohistoquímica del tumor de pulmón (las flechas indican los nodulos tumorales). Grupos experimentales: CDDP (4 mg/kg), Ag5-AQC (0,25 mg/kg) y control (sin tratamiento) (e) Peso corporal durante todo el experimento. Grupos experimentales: CDDP (4 mg/kg), Ag5-AQC (0,25 mg/kg) y control (sin tratamiento). Los datos representan la media ± DE. Las barras de error representan la desviación estándar; n = 5. Prueba de Mann Whitney ((*) p <0,05).
Figura 15: El tratamiento con Ag5-AQC causa una reducción en la viabilidad celular en linfocitos B-CLL derivados de los pacientes (a) Reducción dependiente de la concentración en la viabilidad de linfocitos primarios B-CLL después del tratamiento con Ag5-AQC. Las células se expusieron a diferentes concentraciones de Ag5-AQC durante 30 minutos y la viabilidad celular se evaluó después de 24 horas mediante el ensayo MTT. (b) El tratamiento con Ag5-AQC aumenta el porcentaje de células positivas a DHE 2,5 veces en comparación con el control. Los linfocitos B-CLL se trataron con Ag5-AQC durante 1 hora y 4 horas después, las células positivas a DHE se cuantificaron por citometría de flujo (c) Las imágenes TEM de linfocitos B-CLL tratados con Ag5-AQC mostraron signos evidentes de apoptosis, tal como marginación de la cromatina (flechas negras) y las mitocondrias alteradas (flechas negras).
Figura 16: El tratamiento con Ag5-AQC causa una reducción en el volumen tumoral en el modelo de xenoinjerto de mieloma múltiple. El volumen tumoral se midió en el transcurso de 26 días entre tres grupos de tratamiento diferentes: Control (solución salina administrada por vía intravenosa, n = 4), Ag5-AQC (0,0125 mg/kg administrados por vía intravenosa, n = 4) y Bortezomib (0,25 mg/kg administrados por vía intraperitoneal, n = 4).
Figura 17: Las células W3T3 que portaban un alelo RasV12 inducible por doxiciclina se expusieron doxiciclina (barras blancas) o vehículo (control - barras negras) durante 24 horas y después se trataron con diferentes concentraciones de Ag5-AQC. (a) La expresión de RasV12 se evaluó mediante Western blot tras la adición de doxiciclina y (b) la viabilidad celular se determinó mediante ensayo MTT 24 horas después. Los datos se muestran como la media ± DE al menos tres experimentos independientes. Figura 18: El tratamiento con Ag5-AQC aumenta la sensibilidad de las células A549 a la radiación. Los resultados del efecto de la radiación en las células A549 tratadas con Ag5-AQC se muestran en A) un ensayo clonogénico y B) un ensayo de daño del ADN usando tinción anti-pH2AX.
Figura 19: El tratamiento con Ag5-AQC aumenta la sensibilidad de las células U251 a la radiación. Los resultados del efecto de la radiación en las células U251 tratadas con Ag5-AQC se muestran en A) un ensayo clonogénico y B) un ensayo de daño del ADN usando tinción anti-pH2AX.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Definiciones
Todos los términos técnicos y científicos usados en la memoria descriptiva tienen el mismo significado que los entendidos comúnmente por un experto en la materia.
En toda la memoria descriptiva, el uso del término "aproximadamente" con respecto a cualquier cantidad se contempla de manera que incluye esa cantidad.
En toda la memoria descriptiva, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que la palabra "comprender" y variaciones tales como "comprende" y "que comprende", implican la inclusión de un integrante, etapa, grupo de integrantes o grupo de etapas indicados pero no la exclusión ningún otro integrante, etapa, grupo de integrantes o grupo de etapas.
En toda la memoria descriptiva, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que el término "que consiste esencialmente en" y variaciones tales como "consiste esencialmente en" implican la inclusión de un integrante, etapa, grupo de integrantes o grupo de etapas indicados, con la exclusión de cualquier otro integrante, etapa, grupo de integrantes o grupo de etapas que afecte materialmente las características esenciales del integrante, etapa, grupo de integrantes o grupo de etapas.
En toda la memoria descriptiva, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que el término "que consiste en" y variaciones tales como "consiste en", implican la inclusión de un integrante, etapa, grupo de integrantes o grupo de etapas indicados, con la exclusión de cualquier otro integrante, etapa, grupo de integrantes o grupo de etapas.
El término "clústeres cuánticos atómicos" o "AQC" como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo/clúster de 2 a 500 átomos de metales de transición de valencia cero, tal como de entre 2 y 200, 2 y 100, 2 y 50 o 2 y 25 átomos de metales de transición, y con un tamaño inferior a 2 nm, tal como inferior a 1 nm. Los AQC pueden comprender átomos de metales de transición de valencia cero de metales de transición idénticos (clústeres mononucleares) o diferentes (clústeres heteronucleares). Se entenderá que este término no incluye iones metálicos.
Se entenderá que el término "metal de transición" se refiere a los elementos de la tabla periódica conocidos como metales de transición, pero no se refiere al comportamiento eléctrico de dichos elementos. El confinamiento de electrones en los AQC origina la separación cuántica de los niveles de energía que producen cambios importantes en las propiedades de estos materiales, como se comunicó en el documento EP1914196. Por lo tanto, los átomos metálicos en los AQC descritos en el presente documento pueden tener un comportamiento similar a un semiconductor o incluso a un aislante.
El término "sustancialmente libre de" puede usarse para referirse a una composición que está mayor parte o completamente libre de una entidad específicamente mencionada a continuación, o al menos no contiene la entidad en una cantidad de tal forma que la entidad afecte a la eficacia, la capacidad de almacenamiento, la usabilidad con respecto a las preocupaciones de seguridad necesarias, y/o la estabilidad de la composición.
El término "tratar", "que trata" o "tratamiento" puede incluir la profilaxis y los medios para mejorar, aliviar los síntomas, eliminar la causa de los síntomas de forma temporal o permanente, o prevenir o retrasar la aparición de los síntomas del trastorno o afección mencionados. Las composiciones de la invención son útiles en el tratamiento de seres humanos y animales no humanos.
El término "cantidad eficaz", "cantidad terapéuticamente eficaz" o "dosis eficaz" se refiere a la cantidad suficiente para provocar los efectos farmacológicos o terapéuticos deseados, dando como resultado así una prevención o tratamiento eficaz del trastorno. La prevención del trastorno se manifiesta al retrasar la aparición de los síntomas del trastorno en un grado médicamente significativo. El tratamiento del trastorno se manifiesta por una disminución de los síntomas asociados con el trastorno o una mejora de la reaparición de los síntomas del trastorno.
Composiciones
Los presentes inventores en el presente documento proporcionan evidencia de que los clústeres cuánticos atómicos (AQC) que consisten en 5 átomos de metal de transición de valencia cero afectan tanto los sistemas de glutatión como de tiorredoxina, afectando así a la viabilidad celular. Una característica fundamental de la acción de los AQC con 5 átomos en sistemas biológicos es su especificidad tanto para sustratos, proteínas como aceptores de electrones. Se proporciona evidencia teórica y experimental de la interacción de Ag5-AQC con cisteína, glutatión y tiorredoxina. Y, lo que es más importante, los inventores también proporcionan evidencia de que los Ag5-AQC dependen biológicamente de la presencia de aceptores de electrones, como lo demuestra el hecho de que la actividad de Ag5-AQC es mayor con el radical hidroxilo (HO·) > H2O2 > O2 (por ejemplo, las Figuras 5 y 6). Sin limitarse a la teoría, la evidencia presentada en el presente documento sugiere que los AQC con 5 átomos aumentan el efecto de ROS al actuar como un puente catalítico entre ROS y los átomos de azufre en las proteínas para aumentar el nivel de oxidación de tiol. Este mecanismo de acción es distinto de otros fármacos quimioterapéuticos actualmente conocidos en la técnica. El mecanismo de acción para los AQC de 5 átomos se demuestra in vitro, en cultivo celular en modelos animales 2D y 3D, y cultivos primarios de células tumorales obtenidas de pacientes.
Por lo tanto, de acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona una composición que comprende clústeres cuánticos atómicos (AQC) que consisten en 5 átomos de metal de transición de valencia cero para su uso en el tratamiento de un trastorno proliferativo celular.
En el presente documento se describirán los posibles usos terapéuticos de composiciones que comprenden AQC que consisten en 5 átomos de metales de transición de valencia cero. Sorprendentemente, se ha encontrado que dichas composiciones tienen un efecto citotóxico en las células eucariotas por sí mismas, sin la necesidad de agentes antineoplásicos adicionales. La evidencia teórica y experimental proporcionada en el presente documento muestra que los AQC que consisten en 5 átomos interactúan selectivamente con los residuos de cisteína presentes en las proteínas y producen oxidación de azufre en presencia de especies reactivas de oxígeno (ROS). Este mecanismo es único para clústeres de este tamaño. Por lo tanto, esta solicitud proporciona, por primera vez, la motivación para usar AQC con 5 átomos de metal de transición de valencia cero como monoterapia en el tratamiento de enfermedades de proliferación celular, tal como el cáncer.
La composición puede consistir esencialmente en clústeres cuánticos atómicos (AQC) para su uso en el tratamiento de un trastorno proliferativo celular, donde dicha composición comprende AQC que consisten en 5 átomos de metal de transición de valencia cero. En una realización, dichos AQC son el único principio activo de la composición, es decir, no hay más principios activos presentes en la composición.
En una realización, la composición no comprende un fármaco antineoplásico. En una realización adicional, la composición no comprende un fármaco antineoplásico como se describe en el documento WO2012/059572, tal como agentes alquilantes (por ejemplo, análogos de mostaza nitrogenada, nitrosoureas, alquilsulfonatos, compuestos que contienen platino, etileminas e imidazotetrazinas), antibióticos citotóxicos (por ejemplo, antraciclinas, actinomicinas), alcaloides vegetales y otros productos naturales (por ejemplo, derivados de canfotecina, epipodofilotoxinas, taxanos y alcaloides de la vinca), antimetabolitos (por ejemplo, análogos de citidina, análogos de ácido fólico, análogos de purina, análogos de pirimidina, derivados de urea) y fármacos para terapia dirigida (por ejemplo, inhibidores de cinasa y anticuerpos monoclonales).
En una realización, la composición no se usa en combinación con un fármaco antineoplásico. En una realización, la composición no se usa en combinación con un fármaco antineoplásico como se describe en el documento WO2012/059572, tal como agentes alquilantes (por ejemplo, análogos de mostaza nitrogenada, nitrosoureas, alquilsulfonatos, compuestos que contienen platino, etileminas e imidazotetrazinas), antibióticos citotóxicos (por ejemplo, antraciclinas, actinomicinas), alcaloides vegetales y otros productos naturales (por ejemplo, derivados de canfotecina, epipodofilotoxinas, taxanos y alcaloides de la vinca), antimetabolitos (por ejemplo, análogos de citidina, análogos de ácido fólico, análogos de purina, análogos de pirimidina, derivados de urea) y fármacos para terapia dirigida (por ejemplo, inhibidores de cinasa y anticuerpos monoclonales). Se entenderá que el término "combinación" como se usa en el presente documento, se refiere al acto de unir la composición (que comprende AQC) y el fármaco antineoplásico. Por lo tanto, este término no excluye el uso de un fármaco antineoplásico en otro momento durante el curso de la terapia contra el cáncer, si dicho uso no tiene como objetivo el uso del fármaco antineoplásico en combinación con la composición reivindicada.
En una realización, la composición es para su uso como monoquimioterapia. Las referencias a la "monoquimioterapia" se refieren al tratamiento de una enfermedad proliferativa celular, tal como cáncer, mediante el uso de un solo fármaco químico. Como se analiza en el presente documento, las composiciones de la invención tienen un efecto quimioterapéutico propio, sin la necesidad de usarse en combinación con otros fármacos, y por lo tanto, pueden usarse como una monoterapia, en particular, una monoquimioterapia en el contexto del tratamiento del cáncer.
Las referencias a un "trastorno proliferativo celular" aluden a un trastorno que produce un nuevo crecimiento anómalo de células o un crecimiento de células anómalas sin control fisiológico. Esto puede producir una masa no estructurada, es decir, un tumor. En una realización, el trastorno proliferativo celular es un tumor y/o cáncer. Las composiciones de la invención pueden usarse para tratar trastornos proliferativos celulares que incluyen, pero sin limitación, tumores primarios, metástasis y afecciones precancerosas (estadios previos al cáncer).
Los cánceres pueden incluir, pero sin limitación, cáncer de bazo, cáncer colorrectal y/o de colon, carcinomas de colon, carcinomas de ovario, cáncer de ovario, cáncer de endometrio, cáncer de mama, carcinomas del útero, cáncer de pulmón, cáncer de estómago, cáncer de esófago, cáncer de hígado, carcinomas del páncreas, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de testículo, cáncer de huesos, cáncer de tiroides, cáncer de piel, tal como melanoma, sarcoma, sarcomas de Kaposi, cánceres de cerebro, tal como glioma, meduloblastoma o neuroblastoma, cánceres de la sangre, tales como linfomas y leucemias, miosarcomas y carcinoma de cabeza y cuello. En una realización, el cáncer se selecciona de entre cáncer de pulmón, de mama, de colon o de cerebro (en particular, glioblastoma). En una realización adicional, el cáncer es cáncer de cerebro, en particular cáncer de cerebro seleccionado de glioma (tal como glioblastoma multiforme, oligodendroglioma, ependimomas, glioma del tronco encefálico), craneofaringioma, hemangioblastoma, meningioma maligno, tumores de la región pineal y schwannoma vestibular. En aún una realización adicional, el cáncer de cerebro es glioma, en particular glioblastoma.
La presente invención tiene un uso particular en el tratamiento de cánceres/tumores con una mutación en RAS, tal como una mutación en KRAS, NRAS o HRAS, en particular mutaciones en KRAS. Se ha demostrado que dichas mutaciones causan estrés oxidativo en las células tumorales, lo que da como resultado altos niveles de ROS, por ejemplo, véase Shaw et al. (201 1) PNAS 108(21): 8773-8778. Como se describe en el presente documento, los AQC que consisten en 5 átomos son potentes en las células que comprenden altos niveles de ROS. Por lo tanto, en una realización, el trastorno proliferativo celular (por ejemplo, cáncer y/o tumor) comprende una mutación en RAS. En una realización adicional, la mutación en RAS se selecciona de una mutación en KRAS, NRAS o HRAS, en particular una mutación en KRAS. Se entenderá que dichos cánceres/tumores también pueden denominarse cáncer muíante en RAS, por ejemplo, un cáncer o tumor muíante en KRAS, HRAS o NRAS. En aún una realización adicional, la mutación en RAS es una mutación activadora, es decir, la mutación provoca una actividad aumentada o constitutiva de una proteína RAS. Se observa que, a la luz del mecanismo de acción de los AQC de la invención, la composición puede usarse para tratar células cancerosas mutantes en RAS, independientemente de la mutación. Esto contrasta con las terapias actuales que son específicas de mutaciones particulares de los genes RAS (en particular, el gen KRAS).
La familia de proteínas RAS son GTPasas que hidrolizan GTP a GDP permitiendo la activación de varias vías de señalización aguas abajo. Por ejemplo, se ha demostrado que KRAS está involucrado en la vía de la cinasa activada por mitógeno. Las mutaciones comunes en KRAS reducen su función intrínseca de GTPasa, evitando la hidrólisis de GTP a GDP, bloqueando así KRAS en su estado activo. Esto da como resultado la activación constitutiva de las vías de señalización aguas abajo que pueden conducir a la oncogénesis.
Se conocen muchas mutaciones en RAS en la técnica y las mutaciones en KRAS son las mutaciones oncogénicas más frecuentes en el cáncer humano. Un cáncer comprende una mutación en RAS si una o más de las células del cáncer comprenden una o más mutaciones en RAS. Los sujetos que tienen mutaciones en RAS pueden identificarse mediante métodos conocidos en la técnica tales como PCR, secuenciación de ácidos nucleicos, métodos de PCR específicos de alelos, análisis de polimorfismo conformacional monocatenario, análisis de curva de fusión, hibridación de sonda, pirosecuenciación (es decir, secuenciación de extensión de nucleótidos), genotipado y otros métodos de secuenciación (por ejemplo, véase Anderson (201 1) Expert Rev Mol Diagn. 11 (6): 635-642 y Ogino et al. (2005) J. Mol. Diagn. 7: 413-421). Como se muestra en el presente documento, los AQC que comprenden 5 átomos tuvieron un efecto tóxico en la línea celular A549, que se ha demostrado que comprende una mutación en KRAS (tal como KRAS G12S donde el residuo de glicina en la posición 12 está mutado). Además, las células que comprenden una mutación en HRAS (HRasV12 donde se mutó una mutación del residuo de valina en la posición 12) fueron más sensibles a los efectos tóxicos de los AQC que comprenden 5 átomos en comparación con las células de control.
Se estima que el 30 % de todos los cánceres humanos tienen una mutación en RAS. Por ejemplo, se cree que el 88 % de los adenocarcinomas ductales pancreáticos, el 52 % de los cánceres colorrectales, el 43 % de los mielomas múltiples, el 32 % de los adenocarcinomas de pulmón, el 28 % de los melanomas, el 25 % de los cánceres de endometrio, el 13 % de los cánceres de tiroides, el 12 % de los cánceres de estómago, el 1 1 % de las leucemias mielógenas agudas, el 1 1 % de los cánceres de vejiga, el 6 % de los carcinomas de células escamosas de cabeza y cuello, y el 2 % de los cánceres de mama portan mutaciones en RAS (datos compilados de la Cáncer Cell Une Encyclopedia (CCLE); el International Cáncer Genome Consortium (ICGC); y The Cáncer Genome Atlas Data Portal (TCGA)). Por lo tanto, en una realización, el trastorno proliferativo celular (en particular el trastorno proliferativo celular con una mutación en RAS) se selecciona de cáncer de páncreas, colorrectal, sangre, pulmón, piel, endometrio, tiroides, estómago, vejiga, cabeza y cuello o mama. En una realización adicional, el trastorno proliferativo celular (en particular el trastorno proliferativo celular con una mutación en RAS) se selecciona de cáncer de páncreas, colorrectal, sangre, pulmón, piel, endometrio, tiroides, estómago, vejiga o cabeza y cuello.
En una realización, el trastorno proliferativo celular es cáncer de páncreas, por ejemplo, adenocarcinoma ductal pancreático, particularmente un cáncer de páncreas muíante en RAS, por ejemplo, un adenocarcinoma ductal pancreático muíante en RAS. En una realización alternativa, el trastorno proliferativo celular es cáncer colorrectal, particularmente un cáncer colorrectal muíante en RAS. En una realización alternativa, el trastorno proliferativo celular es cáncer de sangre, por ejemplo, mieloma múltiple o leucemia mielógena aguda, particularmente un cáncer de sangre muíante en RAS, por ejemplo, un mieloma múltiple muíante en RAS o leucemia mielógena aguda muíante en RAS. En una realización alternativa, el trastorno proliferativo celular es cáncer de pulmón, por ejemplo, cáncer de pulmón de células no pequeñas, tal como el adenocarcinoma de pulmón, particularmente un cáncer de pulmón muíante en RAS, por ejemplo, un cáncer de pulmón de células no pequeñas muíante en RAS, tal como un adenocarcinoma de pulmón muíante en RAS. En una realización alternativa, el trastorno proliferativo celular es cáncer de piel, por ejemplo, melanoma, en particular un cáncer de piel muíante en RAS, por ejemplo, un melanoma muíante en RAS. En una realización alternativa, el trastorno proliferativo celular es cáncer de endometrio, en particular un cáncer de endometrio muíante en RAS. En una realización alternativa, el trastorno proliferativo celular es cáncer de tiroides, en particular un cáncer de tiroides muíante en RAS. En una realización alternativa, el trastorno proliferativo celular es cáncer de estómago, en particular un cáncer de estómago muíante en RAS. En una realización alternativa, el trastorno proliferativo celular es cáncer de vejiga, en particular un cáncer de vejiga muíante en RAS. En una realización alternativa, el trastorno proliferativo celular es el cáncer de cabeza y cuello, por ejemplo, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, en particular un cáncer de cabeza y cuello muíante en RAS, por ejemplo, un carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello muíante en RAS.
La presente invención tiene un uso particular en el tratamiento de cánceres con baja accesibilidad a fármacos, tales como tumores grandes con un bajo nivel de vascularización o tumores cerebrales que están separados del sistema circulatorio por la barrera hematoencefálica. Esto se debe a la carga neutra y al pequeño tamaño de los AQC terapéuticos que consisten en solo 5 átomos, lo que les permite acceder a áreas en un tumor o cáncer que no son fácilmente accesibles para los fármacos antineoplásicos tradicionales. En el presente documento se proporciona evidencia que muestra la capacidad de los AQC que consisten en 5 átomos para penetrar en las regiones hipóxicas centrales de los esferoides tumorales multicelulares.
La prevención y el tratamiento de la metástasis cancerosa es una parte fundamental del tratamiento del cáncer para prevenir los cánceres secundarios y la recidiva. Sorprendentemente, se ha encontrado que las composiciones de la invención tienen un efecto beneficioso adicional de tratar metástasis de cáncer, así como el tumor primario (Figura 14). Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona la composición como se describe en el presente documento (en particular, una composición que comprende clústeres cuánticos atómicos (AQC) que consisten en 5 átomos de metal de transición de valencia cero), para su uso en la prevención y/o tratamiento de metástasis, tal como metástasis de ganglios linfáticos, en particular para tratar y/o prevenir metástasis de cáncer de pulmón. De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona la composición como se describe en el presente documento, para su uso en la prevención y/o tratamiento de metástasis de cáncer en los ganglios linfáticos.
En una realización adicional, el ganglio linfático es un ganglio mediastínico. Dichos ganglios mediastínicos son un grupo de ganglios linfáticos ubicados en la cavidad torácica del cuerpo.
Terapia de combinación
Las composiciones descritas en el presente documento pueden usarse en combinación con AQC que consisten en 3 átomos de metal de transición de valencia cero. Se ha encontrado que el tamaño de los AQC que consisten en 3 átomos de metal de transición de valencia cero les permite intercalarse en el ADN y dar como resultado la descompactación de la cromatina. Por lo tanto, puede usarse para aumentar la susceptibilidad de las células tratadas a la radiación y mejorar la eficacia de la radioterapia.
En una realización, la composición (es decir, que comprende AQC que consisten en 5 átomos de metal de transición de valencia cero) y los AQC que consisten en 3 átomos de metal de transición de valencia cero se administran simultáneamente. En esta realización, los dos agentes se administran al mismo tiempo o sustancialmente al mismo tiempo. También pueden administrarse por la misma vía y, opcionalmente, en la misma composición. Como alternativa, pueden administrarse por vías diferentes, es decir, por separado, pero al mismo tiempo o sustancialmente al mismo tiempo. En una realización alternativa, la composición y los AQC que consisten en 3 átomos de metal de transición de valencia cero se administran secuencialmente. En esta realización, los dos agentes se administran en momentos diferentes, de manera que uno de los agentes se administra antes que el segundo agente. Por ejemplo, la composición puede administrarse antes o después de los AQC que consisten en 3 átomos de metal de transición de valencia cero. Pueden administrarse por las mismas vías o por vías diferentes.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona una composición que comprende AQC que consisten en 3 y 5 átomos de metal de transición de valencia cero en combinación con radioterapia para su uso en el tratamiento de un trastorno proliferativo celular. En una realización, la composición consiste en AQC que consisten en entre 2 y 5 átomos de metal de transición de valencia cero. En una realización adicional, la composición consiste esencialmente en AQC que consisten en 3 y 5 átomos de metal de transición de valencia cero.
Los presentes inventores han encontrado sorprendentemente que los AQC que consisten en 5 átomos tienen un efecto catalítico sobre la oxidación de tiol que da como resultado la desaparición celular. Por lo tanto, estos AQC pueden usarse por sí mismo como terapia contra el cáncer y, por lo tanto, en una realización, las composiciones descritas en el presente documento no incluyen fármacos antineoplásicos adicionales.
En una realización, las composiciones de la presente invención pueden incluir o usarse en combinación con agentes terapéuticos adicionales. Dichos agentes pueden ser agentes activos que se usan junto con la terapia contra el cáncer, tales como agentes usados como tratamientos paliativos para mejorar los efectos secundarios no deseados. Por lo tanto, en una realización, el agente terapéutico adicional es un agente utilizado como tratamiento paliativo. En una realización adicional, el tratamiento paliativo se selecciona del grupo que consiste en: agentes antieméticos, medicamentos destinados a aliviar el dolor, tales como opioides, medicamentos utilizados para disminuir los niveles altos de ácido úrico en la sangre, tales como alopurinol o rasburicasa, antidepresivos, sedantes, fármacos anticonvulsivos, laxantes, antidiarreicos y/o antiácidos.
En una realización, el agente terapéutico adicional no es un fármaco antineoplásico. En una realización alternativa, el agente terapéutico adicional es un agente antineoplásico. En una realización, el agente antineoplásico se selecciona del grupo que consiste en: agentes alquilantes (por ejemplo, análogos de mostaza nitrogenada, nitrosoureas, alquilsulfonatos, compuestos que contienen platino, etileminas e imidazotetrazinas), antibióticos citotóxicos (por ejemplo, antraciclinas, actinomicinas), alcaloides vegetales y otros productos naturales (por ejemplo, derivados de canfotecina, epipodofilotoxinas, taxanos y alcaloides de la vinca), antimetabolitos (por ejemplo, análogos de citidina, análogos de ácido fólico, análogos de purina, análogos de pirimidina, derivados de urea) y fármacos para terapia dirigida (por ejemplo, inhibidores de cinasa y anticuerpos monoclonales).
En una realización, la composición y el agente terapéutico adicional se administran simultáneamente. En esta realización, los dos agentes se administran al mismo tiempo o sustancialmente al mismo tiempo. También pueden administrarse por la misma vía y, opcionalmente, en la misma composición. Como alternativa, pueden administrarse por vías diferentes, es decir, por separado, pero al mismo tiempo o sustancialmente al mismo tiempo.
En una realización alternativa, la composición y el agente terapéutico adicional se administran secuencialmente. En esta realización, los dos agentes se administran en momentos diferentes, de manera que uno de los agentes se administra antes que el segundo agente. Pueden ser administrados por las mismas vías o por vías diferentes.
En una realización, la composición se administra antes del agente terapéutico adicional. En una realización alternativa, la composición se administra después del agente terapéutico adicional.
Radioterapia
La terapia por radiación (también conocida como radioterapia) usa altas dosis de radiación para dañar el ADN celular y, por lo tanto, destruir las células cancerosas y reducir el tamaño de los tumores. Dicha terapia puede estar en forma de un haz externo o como radioterapia interna. La elección de la radioterapia puede depender del tipo de cáncer, el tamaño del tumor, la ubicación del tumor, así como otros factores, tales como la edad, el estado general de salud y el historial médico del paciente y los otros tipos de tratamiento para el cáncer que se usen. La radioterapia se administra a más del 50 % de todos los cánceres, en todo el mundo, y es de particular importancia en los países en desarrollo y de ingresos medios. Sin embargo, la eficacia de la radioterapia está limitada por diversos factores, incluido el daño al tejido sano circundante, la proximidad de los órganos cercanos y los tumores que desarrollan resistencia a la radiación. Por lo tanto, existe una importante necesidad insatisfecha de agentes para mejorar la eficacia de la radioterapia.
La aplicación de radioterapia a las células cancerosas da como resultado una mayor producción de ROS. Como se muestra por la evidencia proporcionada aquí, el efecto de los AQC que consisten en 5 átomos se potencia en presencia de ROS. Por lo tanto, las composiciones de la presente invención son particularmente adecuadas como agentes terapéuticos que mejoran la eficacia de la radioterapia. De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona la composición como se describe en el presente documento, en combinación con radioterapia para su uso en el tratamiento de un trastorno proliferativo celular, tal como cáncer.
La radioterapia (también conocida como radioterapia) usa altas dosis de radiación para dañar el ADN celular y, por lo tanto, destruir las células cancerosas y reducir el tamaño de los tumores. Dicha terapia puede estar en forma de un haz externo o como radioterapia interna. La elección de la radioterapia puede depender del tipo de cáncer, el tamaño del tumor, la ubicación del tumor y otros factores, tales como la edad, el estado general de salud y el historial médico del paciente y los otros tipos de tratamiento para el cáncer que se usen.
De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona el uso de una composición como se describe en el presente documento, como un agente sensibilizador a la radioterapia. De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona el uso de la composición como se describe en el presente documento, como un agente sensibilizador a la radioterapia para células proliferativas. Se entenderá que el término "agente sensibilizador a la radioterapia", también denominado "radiosensibilizadores", se refiere a un fármaco que se utiliza para mejorar/aumentar el efecto citotóxico de la radioterapia. Un cáncer o tumor afectado por la radioterapia se denomina "radiosensible". De acuerdo con otro aspecto, la invención proporciona una composición que comprende clústeres cuánticos atómicos (AQC) que consisten en 5 átomos de metal de transición de valencia cero para su uso como agente desensibilizante a la radioterapia para células no proliferativas.
Las composiciones que comprenden clústeres cuánticos atómicos (AQC) que consisten en 5 átomos de metal de transición de valencia cero se pueden usar para proteger las células no proliferativas (tal como las que no se dividen) de la radioterapia. Se entenderá que el término "agente desensibilizante a la radioterapia", también denominado "radiodesensibilizadores", se refiere a un fármaco que se usa para reducir/disminuir el efecto citotóxico de la radioterapia.
Por lo tanto, las composiciones de la invención son particularmente ventajosas cuando se usan en combinación con radioterapia porque tienen un doble efecto de potenciar el efecto de la radioterapia sobre las células proliferativas (es decir, células cancerosas) mientras que también protegen las células no proliferativas (es decir, células no afectadas) de radiaciones nocivas. Las referencias a "proliferación" serán entendidas por un experto en la técnica. Como se usa en el presente documento, "células proliferativas" se refiere a células que experimentan proliferación celular, por ejemplo, crecimiento y división celular. En particular, la invención se usa para dirigirse a células cancerosas que tienen una proliferación celular rápida, anormal y/o no controlada. En una realización, las células proliferativas son células cancerosas, células precancerosas u otras células anormales que se dividen rápidamente en un sujeto. Además, como se usa en el presente documento, "células no proliferativas" se refiere a células que no experimentan proliferación celular. Estas células también pueden describirse como "células en reposo", "detenidas", "inactivas", "no divididas", "no cicladas" o "células Go". En una realización, las células no proliferativas son células no cancerosas.
Dicha terapia puede estar en forma de un haz externo o como radioterapia interna.
En una realización, la radioterapia comprende irradiación por haz externo. La radioterapia por haz externo utiliza una fuente de radiación externa al paciente, típicamente un radioisótopo, tal como Cobalto-60 (60Co), Cesio-137 (137Cs), o una fuente de rayos X de alta energía, tal como un acelerador lineal (LINAC). La fuente externa produce un haz colimado dirigido al paciente hacia el sitio del tumor. El efecto adverso de la irradiación de tejido sano puede reducirse, mientras se mantiene una dosis dada de radiación en el tejido tumoral, proyectando el haz de radiación externo hacia el paciente en una diversidad de ángulos "gantry" con los haces convergentes en el sitio del tumor.
Los ejemplos de tratamiento de radioterapia externa incluyen, pero sin limitación, radioterapia conformacional, radioterapia de intensidad modulada (IMRT), radioterapia guiada por imagen (IGRT), radioterapia tetradimensional (4D-RT), radioterapia estereotáctica y radiocirugía, terapia de protones, radioterapia con haz de electrones, y radioterapia adaptativa.
En una realización alternativa, la radioterapia comprende radioterapia interna. En esta realización, se administra un agente radiofarmacéutico a un paciente y se coloca en el área a tratar. En una realización, el agente radiofarmacéutico comprende un radioisótopo emisor de radiación. Los radioisótopos se conocen bien por un experto en la técnica y pueden comprender un radioisótopo metálico o no metálico.
Los radioisótopos metálicos adecuados incluyen, pero sin limitación: Actinio-225, Antimonio-124, Antimonio-125, Arsénico-74, Bario-103, Bario-140, Berilio-7, Bismuto- 206, Bismuto-207, Bismuto-212, Bismuto-213, Cadmio-109, Cadmio-115m, Calcio-45, Cerio-139, Cerio-141 , Cerio-144, Cesio-137, Cromo-51 , Cobalto-55, Cobalto-56, Cobalto-57, Cobalto-58, Cobalto-60, Cobalto-64, Cobre-60, Cobre-62, Cobre-64, Cobre- 67, Erbio-169, Europio-152, Galio-64, Galio-67, Galio-68, Gadolinio-153, Gadolinio-157 Oro-195, Oro-199, Hafnio-175, Hafnio-175-181 , Holmio-166, lndio-110, lndio-11 1 , Iridio- 192, Hierro 55, Hierro-59, Criptón-85, Plomo-203, Plomo-210, Lutecio-177, Manganeso- 54, Mercurio-197, Mercurio-203, Molibdeno-99, Neodimio-147, Neptunio-237, Níquel- 63, Niobio-95, Osmio-185+191 , Paladio-103, Paladio-109, Platino-195m, Praseodimio- 143, Prometio-147, Prometio-149, Protactinio-233, Radio-226, Renio-186, Renio-188, Rubidio-86, Rutenio-97, Rutenio-103, Rutenio-105, Rutenio-106, Samario-153, Escandio-44, Escandio-46, Escandio-47, Selenio-75, Plata-10m, Plata-11 1 , Sodio-22, Estroncio-85, Estroncio-89, Estroncio-90, Azufre-35, Tántalo-182, Tecnecio-99m, Telurio-125, Telurio-132, Talio-204, Torio-228, Torio-232, Talio-170, Estaño-113, Estaño-114, Estaño-117m, Titanio-44, Tungsteno- 185, Vanadio-48, Vanadio-49, Iterbio- 169, ltrio-86, ltrio-88, ltrio-90, ltrio-91 , Cinc-65, Circonio-89, y Circonio-95.
Los radioisótopos no metálicos adecuados incluyen, pero sin limitación: Yodo-131 , Yodo-125, Yodo-123, Fósforo-32, Ástato-21 1 , Flúor-18, Carbono-1 1 , Oxígeno-15, Bromo-76, y Nitrógeno-13.
El tipo de radiación que es adecuado para su uso en la presente invención puede variar. En una realización, la radioterapia comprende radiación electromagnética o radiación en partículas. La radiación electromagnética incluye, pero sin limitación, rayos X y rayos gamma. La radiación de partículas incluye, pero sin limitación, haces de electrones (partículas beta), partículas alfa, haces de protones, haces de neutrones y mesones pi negativos.
En una realización, la radioterapia comprende braquiterapia. En braquiterapia, las fuentes de radiación se colocan directamente en el sitio del cáncer o tumor. Esto tiene la ventaja de que la irradiación solo afecta a un área muy localizada, minimizando así la exposición a la radiación de tejidos sanos. Además, esto permite que el tumor se trate con dosis muy altas de radiación localizada, al tiempo que se reduce la probabilidad de daño innecesario a los tejidos sanos circundantes.
En una realización, la braquiterapia comprende tratamiento intracavitario o tratamiento intersticial. El tratamiento intracavitario consiste en colocar recipientes que contienen fuentes de radiación en las cavidades corporales donde está presente el tumor o cerca de donde está presente el tumor. El tratamiento intersticial consiste en colocar recipientes que contengan fuentes radiactivas directamente en un tumor o tejido corporal. Estas fuentes radiactivas pueden permanecer en el paciente de forma permanente. Muy a menudo, las fuentes radiactivas se eliminan del paciente después de varios días. Los envases pueden comprender agujas, semillas, alambres o catéteres.
En una realización, la radioterapia comprende terapia de radioisótopos sistémicos. En la terapia de radioisótopos sistémicos, los agentes radiofarmacéuticos que comprenden radioisótopos se administran a través de infusión o ingestión. Los radioisótopos administrados pueden dirigirse debido a las propiedades químicas del isótopo, por ejemplo, radioyodo que es absorbido preferiblemente por la glándula tiroides. La orientación también se puede lograr conjugando el radioisótopo con un resto de direccionamiento, tal como una molécula o anticuerpo que se une al tejido objetivo. En una realización, el agente radiofarmacéutico comprende un conjugado radiactivo. En una realización adicional, el conjugado radiactivo es un anticuerpo radiomarcado.
En una realización, el agente radiofarmacéutico se administra por vía oral, parenteral, intraperitoneal, intravenosa, intraarterial, transdérmica, sublingual, intramuscular, rectal, transbucal, intranasal, a través de inhalación, vaginal, intraocular, local, subcutánea, intra-adiposa, intraarticular o intratecal. En una realización, el agente radiofarmacéutico está en una forma de dosificación de liberación lenta.
La elección de la radioterapia puede depender del tipo de cáncer, el tamaño del tumor, la ubicación del tumor y otros factores, tales como la edad, el estado general de salud y el historial médico del paciente y los otros tipos de tratamiento para el cáncer que se usen.
En una realización, la composición y la radioterapia se aplican simultáneamente. En una realización alternativa, la composición y la radioterapia se aplican secuencialmente, preferiblemente cuando la composición se aplica antes de la radioterapia. Si los agentes se administran por separado, la radioterapia se puede administrar mientras la composición sigue siendo eficaz, es decir, la composición y la radioterapia se administran dentro de un marco de tiempo que ejercerá un efecto sinérgico, o al menos combinado, sobre la administración a un paciente. En una realización, la composición se administra no más de 6 horas antes de la radioterapia, tal como entre 1 y 6 horas antes de la radioterapia. En una realización adicional, la composición se administra aproximadamente 6 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 2 horas o aproximadamente 1 hora antes de la radioterapia.
En una realización, el efecto terapéutico de la composición y la radioterapia es sinérgico. En una realización, la composición sensibiliza las células cancerosas en el paciente a la radioterapia.
En una realización, las composiciones de la invención pueden mejorar la eficacia de la radioterapia al menos dos veces, tal como tres veces, cuatro veces, cinco veces o más, en comparación con la eficacia de la radioterapia para el tratamiento del trastorno en solitario.
Composiciones farmacéuticas
De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende las composiciones tal como se describen en el presente documento.
Las composiciones, y las combinaciones cuando sea apropiado, pueden formularse como una composición farmacéutica, que comprende opcionalmente un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. El vehículo, diluyente y/o excipiente debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los demás ingredientes de la composición y no perjudicial para el receptor de la misma.
Los ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. Los vehículos, excipientes o diluyentes farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E. W. Martin. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden comprender además pequeñas cantidades de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que potencian la vida útil o la eficacia de las composiciones de la invención. Las composiciones farmacéuticas también pueden incluir antiadherentes, aglutinantes, recubrimientos, desintegrantes, saporíferos, colores, lubricantes, sorbentes, conservantes, edulcorantes, excipientes liofilizados (incluidos lioprotectores) o auxiliares de compresión.
Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden administrar en una pluralidad de formas farmacéuticas de administración, por ejemplo, sólidos (tales como comprimidos, píldoras, cápsulas, gránulos, etc.) o líquidos (tales como soluciones, suspensiones, jarabes, pomadas, cremas, geles o emulsiones).
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender una cantidad terapéuticamente eficaz. La cantidad terapéuticamente eficaz (es decir, la cantidad que produce un efecto para ayudar a sanar o curar el trastorno a tratar) que puede administrarse a un sujeto dependerá de múltiples factores, tales como la patología, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad de la composición farmacéutica para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz también es una cantidad con la cual cualquier efecto tóxico o perjudicial de la composición se ve compensado por los efectos terapéuticamente beneficiosos.
En una realización, los AQC están presentes en una solución acuosa. En una realización adicional, la solución acuosa comprende oxígeno disuelto, tal como al menos 2 veces, o al menos 3 veces, la concentración de AQC (en particular, la concentración de AQC que comprenden 5 átomos de metales de transición de valencia cero) presentes en la mezcla.
En una realización, la composición se administra (o se formula para la administración) por cualquier modo adecuado de administración, tal como por vía intravenosa, intraarterial, intracardial, intracutánea, subcutánea, transdérmica, interperitoneal, intramuscular, oral, lingual, sublingual, bucal, intrarrectal o por enema.
Las composiciones de la invención pueden administrarse directamente a un sitio objetivo (es decir, el sitio del tumor) o sistémicamente (es decir, al sistema circulatorio). La administración dirigida tiene la ventaja de enfocar el efecto terapéutico de la composición sobre el cáncer o tumor a tratar. Dicha administración también minimiza los efectos secundarios. Sin embargo, las composiciones de la invención también son adecuadas para administración sistémica porque el modo de acción asegura que la apoptosis celular solo se produce en células con un alto nivel de ROS. Los niveles de ROS son altos en las células proliferativas, por ejemplo, las células cancerosas. Sin embargo, en las células normales no proliferativas, los niveles de ROS son relativamente bajos, por lo tanto, los AQC que consisten en 5 átomos tendrán un efecto menor en las células normales, lo que ayuda a minimizar los efectos secundarios adversos.
En una realización, la composición se administra por vía oral, intravenosa o subcutánea. En una realización adicional, la composición se administra por vía oral. La ventaja de las composiciones de la presente invención es que pueden agotarse relativamente rápido, por lo tanto, cualquier efecto secundario puede minimizarse porque los AQC no persisten en el cuerpo durante un periodo prolongado. También es posible una aplicación tópica (por ejemplo, para el tratamiento de melanomas). Una forma particular de aplicación tópica consiste en introducir la composición en un sistema transportador, en particular un sistema de administración de fármacos, e implantar dicho sistema transportador en los tejidos cancerosos, donde dicho sistema transportador libera entonces dicha composición específicamente en el sitio del tejido canceroso. De esta manera, es posible evitar los efectos secundarios, como puede ocurrir en el caso de la administración sistémica, es decir, reducir la tensión general en el organismo.
Usos
De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona el uso de la composición como se describe en el presente documento, para el tratamiento de un trastorno proliferativo celular.
De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona el uso de la composición como se describe en el presente documento para tratar y/o prevenir metástasis de cáncer. En una realización, la composición se usa para tratar y/o prevenir metástasis de cáncer de ganglios linfáticos. En una realización adicional, la composición se usa para tratar y/o prevenir metástasis de cáncer de pulmón.
De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona el uso de una composición que comprende clústeres cuánticos atómicos (AQC) que consisten en 5 átomos de metal de transición de valencia cero como agente sensibilizador a la radioterapia para células proliferativas. Dicho agente puede usarse para el tratamiento de un trastorno proliferativo celular.
De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona el uso de la composición como se describe en el presente documento, en combinación con radioterapia para el tratamiento de un trastorno proliferativo celular.
De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona el uso de una composición como se describe en el presente documento, en la fabricación/preparación de un agente sensibilizador a la radioterapia para células proliferativas. De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona el uso de una composición que comprende clústeres cuánticos atómicos (AQC) que consisten en 5 átomos de metal de transición de valencia cero como agente desensibilizante de radioterapia para células no proliferativas.
De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona el uso de la composición como se describe en el presente documento, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un trastorno proliferativo celular.
De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona el uso de una composición como se describe en el presente documento, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno proliferativo celular. Clústeres Cuánticos Atómicos (AQC)
Los AQC descritos en el presente documento son estables, es decir, conservan el número de átomos y, por lo tanto, sus propiedades, con el tiempo, de manera que puedan aislarse y manipularse como cualquier otro compuesto químico. Los AQC pueden conservarse durante meses, incluso años, sin necesidad de un estabilizador externo.
En una realización, los átomos metálicos se seleccionan de entre plata (Ag), oro (Au), cobre (Cu), platino (Pt), hierro (Fe), cromo (Cr), paladio (Pd), níquel (Ni), rodio (Rh), plomo (Pb), iridio (Ir), rutenio (Ru), osmio (Os), cobalto (Co), titanio (Ti), vanadio (V) o cualquier combinación de los mismos. En una realización adicional, los átomos metálicos se seleccionan de entre Ag, Au, Cu, Pt o cualquier combinación de los mismos. En una realización adicional, los átomos metálicos se seleccionan de Ag, Cu o Pt. En una realización adicional más, los átomos metálicos son Ag.
La mezcla de AQC puede sintetizarse mediante diversos métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, los descritos en el documento EP1914196, que se incorpora por referencia en el presente documento. La mezcla también se puede sintetizar usando el procedimiento descrito en el presente documento en el Ejemplo 1. Más específicamente, se proporciona un método para sintetizar AQC de plata que comprende realizar el método en una celda electroquímica de tres electrodos que comprende un electrodo de hidrógeno como electrodo de referencia y dos electrodos de plata como el contraelectrodo y el electrodo de trabajo, donde los electrodos de plata comprenden un área de superficie que es mayor de 5 cm2, tal como mayor de 10 cm2, por ejemplo, aproximadamente 17 cm2. Se pueden obtener clústeres de 5 átomos aplicando una corriente en constante aumento durante aproximadamente 5 horas (300 minutos). A partir del ejemplo, la corriente creciente puede comprender: la etapa (i) una corriente de aproximadamente 200-300 mA (por ejemplo, aproximadamente 250 mA), etapa (ii) una corriente de aproximadamente 430- 530 pA (por ejemplo, aproximadamente 480 pA), etapa (iii) una corriente de aproximadamente 800-1200 pA (por ejemplo, aproximadamente 1000 pA/1 mA), etapa (iv) una corriente de aproximadamente 2000-2400 pA (por ejemplo, aproximadamente 2200 pA/2,2 mA) y/o la etapa (v) una corriente de aproximadamente 3800-4200 pA (por ejemplo, aproximadamente 4000 pA/4 mA), o combinaciones de cualquiera de las etapas (i)-(v). En una realización, cada etapa se realiza durante al menos 30 minutos, por ejemplo, durante aproximadamente 1 hora. Los electrodos de plata pueden pulirse antes y/o durante la síntesis, por ejemplo, usando papel de lija y/o alúmina. El procedimiento se puede llevar a cabo en agua purificada, desaireada, tal como agua MilliQ desaireada. Opcionalmente, cualquier exceso de iones Ag+ puede eliminarse mediante la adición de NaCI y la posterior precipitación y filtración.
Las referencias a los AQC usados en el presente documento incluyen las que están en forma de hidrato, es decir, tienen moléculas de agua unidas al clúster mediante un enlace no covalente.
Como se describe en el presente documento, el mecanismo para aumentar la oxidación de azufre es exclusivo de los AQC que consisten en 5 átomos de metal porque el tamaño de estos clústeres permite la interacción entre el átomo de azufre y ROS. Por lo tanto, sin quedar ligando a la teoría, se entenderá que las composiciones de la invención pueden no necesitar estar completamente libres de AQC que consisten en clústeres de otros tamaños (por ejemplo, clústeres que comprenden menos de y/o más de 5 átomos de metal). En una realización, la composición comprende más de aproximadamente el 50 %, tal como más de aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 99 % de los AQC que consisten en 5 átomos de metal de transición de valencia cero. En particular, más de aproximadamente el 95 % de los AQC presentes en la composición consisten en 5 átomos de metal de transición de valencia cero. En una realización, la composición consiste esencialmente en AQC que consisten en 5 átomos de metal de transición de valencia cero. En una realización adicional, la composición consiste en AQC que consisten en 5 átomos de metal de transición de valencia cero.
En una realización de la invención, la composición está sustancialmente libre de AQC que consisten en más de 5 átomos de metales de transición de valencia cero, por ejemplo, la composición puede contener menos de aproximadamente el 10 % en moles (porcentaje molar basado en el contenido total de AQC de la composición), tal como menos de aproximadamente el 7 % en moles, menos de aproximadamente el 5 % en moles, menos de aproximadamente el 2 % en moles, menos de aproximadamente el 1 % en moles o menos de aproximadamente el 0,5 % en moles de AQC que consisten en más de 5 átomos de metales de transición de valencia cero.
En una realización de la invención, la composición está sustancialmente libre de AQC que consisten en menos de 5 átomos de metales de transición de valencia cero, por ejemplo, la composición puede contener menos de aproximadamente el 10 % en moles (porcentaje molar basado en el contenido total de AQC de la composición), tal como menos de aproximadamente el 7 % en moles, menos de aproximadamente el 5 % en moles, menos de aproximadamente el 2 % en moles, menos de aproximadamente el 1 % en moles o menos de aproximadamente el 0,5 % en moles de AQC que consisten en menos de 5 átomos de metales de transición de valencia cero. Los AQC que consisten en menos de 5 átomos de metal de transición de valencia cero incluyen AQC que consisten en 2, 3 o 4 átomos de metal de transición de valencia cero.
En una realización, la composición está sustancialmente libre de iones metálicos. Los iones metálicos son frecuentemente un subproducto durante la síntesis de los AQC. Estos se pueden eliminar utilizando, por ejemplo, NaCI. Se entenderá que la referencia a los iones metálicos es con respecto a los iones del metal de transición contenido en los AQC. En una realización, la composición contiene menos de aproximadamente el 20 % en moles, tal como menos de aproximadamente el 15 % en moles, el 10 % en moles, el 5 % en moles, el 2 % en moles, el 1 % en moles o el 0,5 % en moles de iones metálicos (es decir, iones libres de iones del metal de transición usado para sintetizar los AQC).
De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona una composición que comprende clústeres cuánticos atómicos (AQC) que consisten en entre 2 y 5 átomos de metal de transición de valencia cero, que está sustancialmente libre (es decir, menos del 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 2 %, 1 %) de AQC que consisten en más de 5 átomos de metal de transición de valencia cero y/o iones metálicos. De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona una composición que comprende clústeres cuánticos atómicos (AQC) que consisten en 5 átomos de metal de transición de valencia cero, que está sustancialmente libre (es decir, menos del 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 2 %, 1 %) de AQC que consisten en más de 5 átomos de metal de transición de valencia cero y/o menos de 5 átomos de metal de transición de valencia cero y/o iones metálicos.
Se conocen en la técnica métodos para purificar composiciones para eliminar AQC que consisten en más o menos de 5 átomos de metal de transición de valencia cero. Por ejemplo, como se describe en Porto et al. (2018) Adv Mater. 30(33): e1801317. Dichos métodos pueden incluir: (i) aplicar una solución que comprende una mezcla de AQC a un medio de separación, donde dicho medio de separación se une o no se une a AQC que consisten en más de 5 átomos de metal de transición de valencia cero; y (ii) aislar AQC que consisten en 5 átomos de metal de transición de valencia cero.
En una realización, el medio de separación se usa en un procedimiento cromatográfico. La cromatografía es un procedimiento usado para separar una mezcla haciendo pasar una fase móvil que comprende la mezcla a través de una fase estacionaria (por ejemplo, que comprende el medio de separación descrito en el presente documento). La mezcla se separa basándose en el modo en que interaccionan los componentes de la fase móvil con la fase estacionaria. Se entenderá que la fracción retenida o desechada dependerá del contenido y de si están presentes los 5 átomos de metal de transición de valencia cero. Por ejemplo, si el medio de separación retiene los AQC que consisten en más de 5 átomos de metales de transición de valencia cero, entonces se recogerá el eluato (que comprende los AQC que consisten en 5 o menos átomos de metales de transición de valencia cero). Como alternativa, si el medio de separación retiene los AQC que consisten en 5 átomos de metales de transición de valencia cero, entonces el eluato (que comprende los AQC que consisten en más y/o menos de 5 átomos de metales de transición de valencia cero) se descarta. En una realización, el medio de separación está presente en una columna de cromatografía. Dichas columnas de cromatografía están disponibles comercialmente.
Los medios de separación pueden comprender, por ejemplo, grupos funcionales que se unen a AQC de tamaños particulares, tales como un grupo tiol que se une a AQC que consisten en más de 3 átomos de metal de transición de valencia cero. Como alternativa, el grupo funcional puede comprender un grupo aromático, tal como un grupo aromático cíclico o policíclico. Los medios de separación también pueden comprender, por ejemplo, ácido desoxirribonucleico (ADN) que es sustancialmente bicatenario. Se ha encontrado que los clústeres de tres átomos de metal interactúan con el ADN a través de la intercalación que depende estrictamente del número de átomos en el clúster e independiente del tipo de pares de bases (AT de GC) de la doble hélice. Por lo tanto, el ADN puede usarse para separar los AQC que consisten en 3 átomos de metal de transición de valencia cero.
En una realización, el medio de separación se usa en un procedimiento de diálisis. La diálisis es un procedimiento de separación de moléculas que se basa en sus tasas de difusión a través de una membrana semipermeable. Por ejemplo, la solución que comprende una mezcla de AQC podría aplicarse a un medio de separación y a continuación colocarse en un dispositivo de diálisis (por ejemplo, una casete de diálisis o un tubo de diálisis). Dichas casetes, tubos o dispositivos para diálisis están disponibles comercialmente. Las membranas de diálisis se pueden elegir con un corte de peso molecular elegido de acuerdo con los requisitos de la separación (por ejemplo, de acuerdo con el peso molecular del ADN usado en el medio de separación).
Se entenderá que uno o más de los procedimientos de purificación divulgados en el presente documento pueden realizarse en combinación y/o repetirse una o más veces. Al llevar a cabo el procedimiento de purificación varias veces puede aumentar la purificación de la muestra y permitir que se logre la purificación deseada.
Métodos de tratamiento De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un método para prevenir o tratar un trastorno proliferativo celular que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende clústeres cuánticos atómicos (AQC) que consisten en 5 átomos de metal de transición de valencia cero, a un paciente que lo necesite. En una realización, dicho método no comprende tratar al paciente con un fármaco antineoplásico adicional.
De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un método para prevenir y/o tratar un trastorno proliferativo celular que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición descrita en el presente documento, a un paciente que lo necesite.
De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un método para tratar a un paciente con un trastorno proliferativo celular que comprende administrar una composición como se describe en el presente documento. Las realizaciones descritas anteriormente en el presente documento para las composiciones pueden aplicarse a dichos métodos de tratamiento (por ejemplo, tiempo y modo de administración, formulación de la composición, etc.).
De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un método para prevenir y/o tratar la metástasis de cáncer que comprende administrar una composición como se describe en el presente documento. En una realización, el método previene y/o trata la metástasis de cáncer en los ganglios linfáticos. En una realización adicional, el método previene y/o trata la metástasis de cáncer de pulmón.
En una realización, los métodos de tratamiento descritos en el presente documento comprenden adicionalmente tratar al paciente con radioterapia, tal como después de la administración de la composición. Como se ha descrito anteriormente en el presente documento, la composición de la invención tiene un uso particular como agente sensibilizador a la radioterapia.
En una realización, la composición se administra por vía oral, intravenosa o subcutánea.
En una realización, la composición se administra simultáneamente o antes de la radioterapia. En una realización, el método comprende adicionalmente administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende AQC que consisten en 3 átomos de metal de transición de valencia cero. En una realización, la composición que comprende AQC que consisten en 3 átomos de metal de transición de valencia cero, se administra simultánea o secuencialmente a la composición que comprende AQC que consisten en 5 átomos de metal de transición de valencia cero.
El paciente puede ser cualquier sujeto que padezca el trastorno. En una realización, el paciente es un mamífero. En una realización adicional, el mamífero se selecciona de un ser humano o un ratón.
En una realización, el efecto terapéutico de la composición y la radioterapia es sinérgico. En una realización, la composición sensibiliza las células cancerosas en el paciente a la radioterapia.
El método comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de radiación. La cantidad de radiación utilizada en la radioterapia se mide en unidades Gray (Gy) y varía según el tipo y el estadio del cáncer que se está tratando. Además, la dosis total de radiación se puede dividir en múltiples dosis más pequeñas conocidas como "fracciones" durante un periodo de varios días para minimizar los efectos secundarios negativos. Un horario de fraccionamiento típico para adultos es de 1 ,8 a 2 Gy al día, cinco días a la semana. Un horario de fraccionamiento típico para niños es de 1 ,5 a 1 ,8 Gy al día, cinco días a la semana.
En una realización, se administran un total de al menos aproximadamente 10 Gy, tal como 15 Gy, 20 Gy, 25 Gy, 30 Gy, 35 Gy, 40 Gy, 45 Gy, 50 Gy, 55 Gy, 60 Gy, 65 Gy, 70 Gy, 75 Gy, 80 Gy, 85 Gy, 90 Gy, 95 Gy o 100 Gy a un paciente que lo necesite. El paciente puede recibir radiación tres, cuatro o cinco veces por semana. Un curso completo de tratamiento puede durar de una a siete semanas, según el tipo de cáncer y el objetivo del tratamiento. En una realización, la radioterapia se produce durante un periodo de al menos 2, 3 o 4 semanas, tal como 2-6 semanas, tal como 2-4 semanas, o 5-8 semanas, en particular 5-7 semanas. Por ejemplo, un paciente puede recibir una dosis de 2 Gy/día durante aproximadamente 30 días (es decir, 4-5 semanas). En una realización, la radiación se administra al menos una vez al día durante cinco días consecutivos por semana. Por ejemplo, la radiación se administra en fracciones de al menos aproximadamente 2 Gy al menos una vez al día. En una realización, la radiación se administra cada dos días, tres veces por semana. Por ejemplo, la radiación se administra en fracciones de 10 Gy cada dos días, tres veces por semana.
En una realización, la radioterapia es hipofraccionada. El hipofraccionamiento es un régimen de tratamiento que administra dosis más altas de radiación en menos visitas. En una realización alternativa, la radioterapia es hiperfraccionada. El hiperfraccionamiento es un régimen de tratamiento que divide la dosis total en más administraciones. Se apreciará que se consideran muchos otros factores al seleccionar una dosis, incluyendo si el paciente está recibiendo quimioterapia, comorbilidades del paciente, si se administra radioterapia antes o después de la cirugía, y el grado de éxito de la cirugía.
De acuerdo con otro aspecto, la invención proporciona un método para prevenir el daño a las células no proliferativas en un paciente sometido a radioterapia, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende AQC que consisten en 5 átomos de metal de transición de valencia cero a dicho paciente antes de terapia de radiación.
De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un método para tratar metástasis, tal como metástasis de ganglios linfáticos, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende AQC que consisten en 5 átomos de metal de transición de valencia cero, a un paciente que lo necesite, en combinación con radioterapia.
Kits
De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un kit de piezas que comprende: la composición como se describe en el presente documento, opcionalmente en mezcla con un adyuvante, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. El kit de acuerdo con este aspecto de la invención se puede usar en el tratamiento de un trastorno proliferativo celular. En una realización, el kit puede usarse en combinación con radioterapia para el tratamiento de un trastorno proliferativo celular.
Aspectos adicionales
De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un agente apoptótico que comprende AQC que consisten en 5 átomos de metal de transición de valencia cero. El agente apoptótico puede comprender la composición como se describe en el presente documento.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un método para inducir la oxidación de tiol que comprende administrar la composición como se describe en el presente documento, opcionalmente en combinación con especies reactivas de oxígeno (ROS). Como se describe en el presente documento, los AQC que consisten en 5 átomos proporcionan un puente catalítico entre ROS presente en la célula y los átomos de azufre en los residuos de cisteína de las proteínas. Por lo tanto, la composición de la invención puede usarse para mejorar la oxidación de tiol. La adición de ROS dependería de si el objetivo ya contenía ROS.
Los presentes inventores también han proporcionado evidencia de que los AQC que consisten en 5 átomos tienen un fuerte efecto bactericida. Por lo tanto, de acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona una composición, como se describe en el presente documento, para su uso en el tratamiento de una enfermedad causada por bacterias.
A continuación la invención se ilustrará en los siguientes ejemplos no limitativos.
ABREVIATURAS
Todas las unidades utilizadas en el presente documento deben entenderse con su definición estándar conocida en la técnica (a menos que se especifique de otro modo).
A549 Línea celular de adenocarcinoma de pulmón humano
Ag Plata Ag5 5 átomos de plata
AQC Clúster cuántico atómico
ATCC Colección Americana de Cultivos Tipo
BHE Barrera hematoencefálica
B-CLL leucemia linfocítica crónica de linfocitos B
CDDP Cisplatino
Cul3 Culina 3
Cys Cisteína
DAPI 4',6-Diamidino-2-fenilindol
DHE Dihidroetidio
DMEM medio de Eagle modificado por Dulbecco
DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH
DTT Ditiotreitol
FBS Suero bovino fetal
GBM Glioblastoma multiforme
GPx Glutatión peroxidasa
GRX1 Glutarredoxina 1 GSH Glutatión
GSSG Glutatión disulfuro
H2O2 Peróxido de hidrógeno
HCT116 Línea celular de carcinoma colorrectal humano
HEK293 Línea celular 293 de riñón embrionario humano
HMOX1 Hemo oxigenasa-1
Keapl Proteína 1 asociada a ECH de tipo Kelch
Luc Gen de luciferasa de libélula norteamericana
MCF7 Línea celular de adenocarcinoma de mama humano
MCTS Esferoide tumoral multicelular
MEC-1 Línea celular de leucemia linfocítica crónica de linfocitos B humana
MM.1S Línea celular de mieloma múltiple humano
MRE Elemento sensible a metal
MT Metalotioneínas
MTT Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio
MTF-1 Factor 1 de transcripción sensible a metal (MTF-1
NaCI Cloruro sódico
NAD(P)H Fosfato de dinucleótido de nicotinamida adenina Neh Dominio de homología Nrf2-ECH
NEM N-etilmaleimida
NQO-1 NAD(P)H quinona oxidorreductasa
Nrf2 Factor nuclear (derivado de eritroide 2) de tipo 2
O2 Oxígeno
PBS Solución salina tamponada con fosfato
PFA Paraformaldehído
RL Línea celular de linfoma no Hodgkin humano roGFP Proteína fluorescente verde sensible a la reducción-oxidación
ROS Especie de oxígeno reactivo
TEM Microscopía electrónica de transmisión
U87 Línea celular de glioblastoma multiforme humano
XANES Absorción de rayos X cercana a la estructura del borde
MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS Reactivos y materiales
A menos que se especifique lo contrario, todos los reactivos se adquirieron en Sigma Aldrich, Co., España. Las láminas de plata (99%) se adquirieron en Goodfellow Cambridge Ltd., Huntingdon, Reino Unido. Las nanopartículas de alúmina (tamaño promedio « 50 nm) y las almohadillas de tela se adquirieron en Buehler, Düsseldorf, Alemania.
El papel de lija (grano 1.000) se suministró por Wolfcraft España S.L., Madrid, España. Todas las soluciones acuosas se prepararon con agua de calidad MilliQ usando un sistema Direct-Q8UV de Millipore (Millipore Ibérica S.A., Madrid, España). Las láminas de mica (moscovita de calidad V-1) se adquirieron en SPI Supplies, West Chester, PA, EE.UU.
Absorción de rayos X cercana a la estructura del borde (XANES)
Los experimentos XANES del borde S K (2470 eV) se realizaron en la línea de haz SXS en el Laboratorio Nacional de Luz Sincrotrón (LNLS, Campiñas, Brasil) que está equipado con un monocromador de doble cristal de InSb (111) con una apertura de 1 mm, para lograr una resolución de aproximadamente 0,5 eV en el borde S K. Los espectros de absorción de rayos X se registraron en modo de fluorescencia, recogiendo los rayos X emitidos de las líneas de emisión S Ka1 ,2 (a 2309,5 y 2308,4 eV, respectivamente) para cada borde medido. Los experimentos de absorción se realizaron en un vacío de 10-8 mbar a temperatura ambiente, y en un portamuestras de líquido especial diseñado ad-hoc para el experimento con especies reactivas de oxígeno, a temperatura ambiente y presión atmosférica. La energía fotónica se calibró asignando el valor 2481 ,5 eV al máximo más alto de Na2S2C>3 (correspondiente a la llamada esfera interna), de acuerdo con los criterios previamente informados por Vairavamurthy (1998) Spectrochim. Acta. A. Mol. Biomol. Spectrosc. 54: 2009-2017. Los espectros finales de XANES se obtuvieron después de la sustracción de fondo y la normalización con respecto a la intensidad del borde posterior, siguiendo el procedimiento habitual descrito en otra parte. La cuantificación de XANES se realizó con el software Athena y su posterior análisis en el software de laboratorio Origin. Para la caracterización del glutatión, se depositó una fracción de la solución por depósito por goteo en discos de carbono (Ted Pella, Inc.) para tener una concentración de Ag o S en un valor detectable. Para las muestras de tiorredoxina, se montaron cuidadosamente en un portamuestras de líquido, diseñado ad-hoc para este experimento. La solución de PBS se usó como disolvente en todas las mezclas de reacción con tiorredoxina, con el fin de reproducir el mismo pH intracelular y fuerza iónica. Las soluciones de radicales hidroxilo se prepararon por reacción de Fenton, con H2O2 y FeCL. Líneas celulares
Las líneas celulares utilizadas en el desarrollo de este trabajo incluyeron: A549 (adenocarcinoma de pulmón humano, DSMZ N.°: ACC 107), A549 Luc-C8 (Bioware®), MCF7 (adenocarcinoma de mama humano, DSMZ N.°: ACC 115), HCT1 16 (carcinoma colorrectal humano, ATCC N.°: CCL-247), HEK293 (Riñón, embrión de ser humano), U87-luc (glioblastoma multiforme humano, amablemente proporcionado por Joan Seoane), U251-Luc (glioblastoma humano, amablemente proporcionado por Joan Seoane), MM.1 S (mieloma múltiple humano, ATCC N.°: CRL-2974), RL (linfoma no Hodgkin humano, ATCC N.°: CRL-2261) y MEC-1 (leucemia linfocítica crónica de linfocitos B humana, DSMZ, N.°: ACC 497). A549, A549-Luc, MCF7, U87-Luc y HCT116 se derivan de tumores sólidos y crecen de forma adherente como una monocapa, mientras que MM.1S, RL y MEC-1 se derivan de tumores malignos hematológicos y crecen en suspensión. Las líneas celulares A549, A549-Luc, U251-Luc y HEK293 se mantuvieron en glucosa con alto contenido de DMEM (D6046, Sigma); las líneas celulares MCF7 y U87-Luc en glucosa con alto contenido de DMEM (D5671 , Sigma); HCT1 16, MM. IS y RL en medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (R-5886, Sigma) y la línea celular MEC-1 en 1 : 1 de DMEM/mezcla Ham F-12 de mezcla de nutrientes. El medio se complementó con suero de ternera fetal al 10 % y el 1 % v/v de L-glutamina, penicilina y estreptomicina (Gibco). Las líneas celulares modificadas (A549-Luc y U87-Luc) se complementaron con puromicina (1 ,3 pg/ml para A549-Luc y 5 pg/ml para U87-Luc) para seleccionar las células transfectadas estables. Todas las líneas celulares se cultivaron a 37 °C en una atmósfera humidificada en presencia de CO2 al 5 % y aire al 95 %.
Animales
Se usaron ratones sin pelo atímicos hembra que pesaban aproximadamente 20-25 g y a la edad de 8-12 semanas en los estudios in vivo, que se suministraron por Janvier Laboratories. Los animales se aclimataron durante al menos 1 semana antes de la experimentación, se alojaron en jaulas de polipropileno ventiladas a una temperatura media de 22 °C, con una exposición de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad cada día. Todos los ratones recibieron una dieta estándar de laboratorio de alimentos y agua ad libitum. Los experimentos se realizaron de acuerdo con las Normas del Comité de Bioética de la Universidad de Santiago de Compostela y de conformidad con los Principios del Cuidado de Animales de Laboratorio según la legislación nacional española (RD 53/2013).
Ensayo de citotoxicidad in vitro
La citotoxicidad se evaluó mediante el ensayo MTT. Células proliferativas: Se sembraron A549 (4 x 103 células/pocillo) y U251 (5 x 103 células/pocillo) en placas de 96 pocilios. 24 horas más tarde, el medio se desechó y se reemplazó con medios sin suero que contenían diferentes concentraciones de Ag5-AQC (1 ,2-0,24 mg/l) durante 1 hora y se dejó crecer durante 24 horas más en medio completo. El cultivo primario de B-CLL (4 x 104 células/pocillo) se sembró en medio sin suero y se añadieron inmediatamente diferentes concentraciones de Ag5-AQC (1 ,2-0,24 mg/l) a los pocilios durante 30 minutos. Después de eso, se añadió medio completo y se dejó que las células crecieran durante 24 horas. Células no proliferativas (confluentes o privadas de suero): Se sembraron células A549 (4 x 103 células/pocillo) y U251 (5 x 103 células/pocillo) en placas de 96 pocilios. Se permitió que las células confluentes crecieran durante 96 horas en medio-FBS al 10 % para alcanzar la confluencia. Para las células privadas de suero, 24 horas después de sembrar el medio se reemplazó con medio-FBS al 0,05 % durante 72 horas. En ambas condiciones, el estado no proliferativo de las células se confirmó por citometría de flujo. Después, las células se trataron con Ag5-AQC (1 ,2-0,24 mg/l) durante 1 hora en medio sin suero y se incubaron en medio completo durante 24 horas más.
Después, para todas las condiciones ensayadas, se añadieron 10 pl de solución de MTT (5 mg/ml) a cada pocilio y se incubaron a 37 °C protegidos de la luz. Cuatro horas más tarde, se añadieron 100 pl de una solución de solubilización (SDS/HCI 0,1 N) y las muestras se incubaron durante 18 horas a 37 °C. La absorbancia se midió a 595 nm utilizando un lector de microplacas CLARIOstar®. Se siguieron protocolos similares utilizando el ensayo MTT para medir la viabilidad celular con otros tipos de células.
Medición radiométrica de la oxidación de GSH en células vivas.
El sensor de redox celular PREMO Grx-1-roGFP (Molecular Probes, P36242) es un sensor codificado genéticamente que se utiliza para detectar cambios en el estado redox del glutatión en las células vivas. El sensor se basa en la introducción de dos cisteínas en la estructura del barril b de la proteína GFP. En condiciones de oxidación, la formación de enlaces disulfuro altera las propiedades fluorescentes del biosensor, dando como resultado un cambio en la intensidad de emisión después de la excitación a dos longitudes de onda diferentes (400 y 488 nm). La relación de intensidades de emisión se correlaciona con un cambio en el estado redox de roGFP.
Para analizar los cambios en el estado de oxidación de GSH en presencia de Ag5-AQC, se sembraron 2,5x104 células A549 en placas de 35 mm (Mattek. P35GC-0-10-C) y se transdujeron con el sensor de redox celular PREMO Grx-1-roGFP justo después de que las células se colocasen en placas. El volumen del sensor se calculó siguiendo esta ecuación:
Volumen del sensor (mi) = (número de células) x (MOI)/(1x108).
Donde "número de células" es el número de células sembradas por placa; MOI es el número de partículas virales por célula, y 1x108 es el número de partículas virales por mi de reactivo.
De acuerdo con los resultados obtenidos a partir de la ecuación, se añadieron 60 pl de sensor de redox celular PREMO por mililitro de medio de cultivo. Las muestras se incubaron durante 48 horas para obtener una expresión óptima del sensor y los cambios redox en las células vivas se monitorizan utilizando el microscopio confocal Leica TCS SP5 X. Se añadió Ag5-AQC (CI50) a la placa y se tomaron imágenes cada 10 segundos durante 10 minutos. El sensor de redox celular PREMO se excitó a 400 y 488 nm y la emisión se recogió a 500-530 nm. La intensidad de fluorescencia emitida por cada célula se midió en ambas excitaciones y se calculó la relación 400ex/488ex. Las imágenes se procesaron usando el software ImageJ.
Inmunofluorescencia
MTF-1 : Las células A549 (2,5 x 104) se cultivaron en cubreobjetos de vidrio en placas de 24 pocilios y se trataron con Ag5-AQC (CI50) durante 1 hora en medio sin suero y después el medio se reemplazó con medio completo durante 2 horas. Las células HEK293 (8 x 104) se cultivaron en cubreobjetos de vidrio en placas de 24 pocilios y se trataron con Ag5-AQC (CI50), DTT (0,5 mM) o una combinación de ambos, durante 10 o 30 minutos en medio sin suero y después el medio. Después de eso, las células se lavaron dos veces con PBS Ca2+/Mg2+ y se fijaron con metanol/acetona (dilución 1 : 1) durante 10 minutos a -20 °C. Después, se bloquearon con PBS que contenía FBS al 10 % durante 1 hora, se lavaron dos veces con PBS y se incubaron con el anticuerpo primario contra MTF-1 (dilución 1 :200) (sc-48775, Santa Cruz Biotechnology) durante una noche a 4 °C. Después de eso, las células se lavaron y se incubaron con el anticuerpo secundario de IgG anti-conejo de cabra Alexa Fluor-594 (dilución 1 :500) (A11037, Life Technologies) y Hoechst (dilución 1 : 1000) (Molecular Probes) a 0,25 pg/ml durante 45 minutos. Los cubreobjetos con células teñidas se montaron en portaobjetos de vidrio con medio de montaje Fluoroshield (F6182, Sigma). Las imágenes se obtuvieron con el microscopio confocal Leica TCS SP8 y se analizaron con el software LasX.
Nrf2: Las células HEK293 (3 x 104) se sembraron en cubreobjetos de vidrio en placas de 24 pocilios durante una noche y se trataron con Ag5-AQC (CI50), DTT (0,5 mM) o una combinación de ambos, durante 10 o 30 minutos en medio sin suero. Después del tratamiento, las células se fijaron en una solución de formalina (10 %) durante 30 minutos, se lavaron dos veces con PBS Ca2+/Mg2+ y se permeabilizaron con Tritón X- 100 al 0,5 % durante 5-10 minutos. Después, las células se lavaron de nuevo y se bloquearon con PBS que contenía BSA al 1 %. Posteriormente, las células se incubaron con el anticuerpo primario contra Nrf2 (dilución 1 : 100) (sc-722, Santa Cruz Biotechnology) durante 2 horas a temperatura ambiente, se lavaron dos veces con PBS y se incubaron con el anticuerpo secundario de IgG anti-conejo de cabra Alexa Fluor- 594 (dilución 1 :250) (A11037, Life Technologies) y Hoechst (dilución 1 : 1000) (Molecular Probes) durante 45 minutos. Los controles negativos sin anticuerpo primario se incluyeron en el análisis (datos no mostrados). Los cubreobjetos con células teñidas se montaron en portaobjetos de vidrio con medio de montaje Fluoroshield (F6182, Sigma). Las imágenes se obtuvieron con el microscopio confocal Leica TCS SP8 y se analizaron con el software LasX.
Medición de ROS
La medición por citometría de flujo se realizó utilizando el indicador de superóxido dihidroetidio (DHE) (Molecular Probes, D11347). Las células se sembraron en placas de 12 pocilios y se trataron con Ag5-AQC (CI50) en medio sin suero. Las células se recogieron 30 minutos, 1 , 2 y 3 horas después del tratamiento, se lavaron dos veces con PBS frío y se incubaron con DHE (3,17 mM) durante 20 minutos a temperatura ambiente, protegidas de la luz. Las células teñidas se analizaron usando el citómetro de flujo Guava EasyCyte con el software InCyte.
Esferoides tumorales multicelulares
Los esferoides tumorales multicelulares A549 y U251 (MCTS) se generaron mediante el método en gota colgante. Se dispensaron 20 pl de una suspensión celular que contenía 500 células en una minibandeja de 60 pocilios (Nunc). Después de eso, las bandejas se invirtieron y se incubaron durante 5 días en condiciones estándar. El día 5, las bandejas se pusieron rectas y los esferoides se transfirieron a una placa de 96 pocilios recubierta con 50 pl de agarosa al 1 %. Después, los esferoides se trataron con Ag5-AQC cuatro veces en días alternos y se tomaron imágenes de los esferoides todos los días hasta el final del tratamiento utilizando el microscopio Olympus 1X51 equipado con una cámara Olympus DP72 y el software CellSens Imaging. Las imágenes se procesaron usando ImageJ para medir el área de esferoides y las diferencias en los valores en gris como un indicador indirecto de la densidad celular.
Al final del experimento, los esferoides se tiñeron con reactivo de hipoxia verde Image- ¡T 5 mM (Molecular Probes, 114834) y Hoechst (1 pg/mI) durante 1 hora. Se tomaron imágenes de esferoides de control y tratados en una microscopía confocal Leica AOBS- SP5 y se analizaron usando el software ImageJ.
Eficacia in vivo de los Ag5-AQC
El modelo de cáncer de pulmón ortotópico A549luc se desarrolló siguiendo el protocolo descrito por Borrajo et al. (2016) J. Control Release 238: 263-271. Se inyectaron 1x106 células A549Luc suspendidas en 50 mI de PBS a través del espacio intercostal en el pulmón izquierdo de ratones sin pelo atímicos. La evolución del tumor fue seguida de inyección de luciferina en la cavidad intraperitoneal a una dosis de 150 mg/kg de peso corporal aproximadamente 5 minutos antes de la obtención de imágenes. La bioluminiscencia de la luciferasa se obtuvo en imágenes bajo anestesia de isoflurano vaporizado usando el sistema IVIS LIVING IMAGE (Caliper Life Sciences).
Para el tratamiento con Ag5-AQC, los ratones se dividieron en tres grupos (5 animales en cada uno): el primer grupo (control) no se sometió a tratamiento, el segundo grupo se trató con cisplatino (CDDP) (cuatro dosis únicas, 4 mg/kg), y el tercer grupo se trató con Ag5-AQC (cuatro dosis únicas, 0,25 mg/kg). Los medicamentos se aplicaron por vía intravenosa a través de la vena de la cola los días 20, 22, 24 y 26 después de la inoculación de los tumores. Los ratones se sacrificaron el día 37. Se extirparon los pulmones y los ganglios linfáticos mediastínicos y se cuantificó la luminiscencia por microgramo de proteína en el cuerpo como se describe en Borrajo et al. (2016).
Análisis histológico
Los pulmones se fijaron en formalina con tampón neutro al 10 % durante 24 horas y se incluyeron en parafina. Se montaron secciones de 4 mm de grosor en portaobjetos de microscopio FLEX IHC (Dako-Agilent, Glostrup, Dinamarca) y se calentaron a 60 °C durante 1 hora. La técnica inmunohistoquímica se realizó automáticamente usando un AutostainerLink 48 (Dako-Agilent). Después de la desparafinación y la recuperación del epítopo en la solución de recuperación de la diana EnVision FLEX (pH alto) durante 20 minutos a 97°C, se dejó enfriar los portaobjetos en PT Link a 65°C y a continuación en un tampón de lavado Dako durante 5 minutos a temperatura ambiente (TA). El protocolo de inmunotinción incluyó la incubación a temperatura ambiente en: (1) Reactivo de bloqueo de peroxidasa EnVision FLEX (Dako-Agilent) durante 5 minutos; (2) anticuerpo FLEX primario listo para usar (Dako-Agilent) anti-CK7 (clon OV-TL12/30), durante 20 minutos; (3) EnVision FLEX / HRP (polímero de dextrano conjugado con peroxidasa de rábano picante e inmunoglobulinas anti-ratón y anti-conejo de cabra aisladas por afinidad) durante 20 minutos; (4) solución de trabajo del sustrato (mezcla) (solución cromógena de tetraclorhidrato de 3,3'-diaminobencidina) (Dako-Agilent) durante 10 minutos; y (5) hematoxilina EnVision FLEX (Dako-Agilent) durante 9 minutos. Las secciones se examinaron y se fotografiaron usando un microscopio PROVIS AX70 de Olympus equipado con una cámara Olympus DP70.
Tratamiento por radiación
Las células A549 (3x104 células/pocillo) y U251 (3,5 x104 células/pocillo) se sembraron en una placa de 24 pocilios y se incubaron durante 96 horas para alcanzar la confluencia. Después, el medio se reemplazó con medio sin FBS que contenía diferentes diluciones de Ag5-AQC (1 :50, 1 :75 y 1 : 100 para A549 y 1 : 150, 1 :175 y 1 :200 para U251). Después del pretratamiento con Ag5-AQC durante 10 minutos, las células se irradiaron con dosis de 0-10 Gy utilizando un acelerador lineal del Laboratorio de Física de Radiación de la Universidad de Santiago.
Análisis estadístico
Todos los análisis estadísticos se realizaron con el software GraphPad Prism versión 5.0 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, EE.UU.). Las diferencias se consideraron significativas para *p <0,05, y muy significativas para * p <0,01.
EJEMPLO 1 : Método de síntesis de Ag5-AQC
La síntesis de los clústeres Ag5-AQC se realizó a 25 °C utilizando un potenciostato biológico VMP3 (Seyssinet-Oarsetm, Francia). Se usó una celda electroquímica de tres electrodos aislada térmicamente de Methrom con un electrodo de hidrógeno como referencia y dos láminas de Ag (área superficial de 17,5 cm2) como contraelectrodo y electrodo de trabajo. Estos electrodos se pusieron uno frente al otro y se separaron a una distancia de 3 cm. Una primera etapa de 1 hora a 250 mA, una segunda etapa de 1 hora de 480 pA, una tercera etapa de 1 hora de 1 mA, una cuarta etapa de 1 hora de 2,2 mA, y dos etapas finales de 30 minutos de 4 mA cada una a 25 °C. Antes de la síntesis y también después de 4 horas, y 4 horas y media, ambos electrodos de plata se pulieron con papel de lija seguido de alúmina (aproximadamente 50 nm), se lavaron vigorosamente con agua MilliQ y se sometieron a sonicación (2 etapas de 5 minutos cambiando el agua en cada etapa). Después de la sonicación, y antes de la síntesis, se realizó una limpieza electroquímica que consistió en una etapa de 5 minutos a 250 mA en agua.
Purificación: La cantidad de iones sin reaccionar en las soluciones se estimó mediante el electrodo selectivo de iones Ag (Hanna). Se usó una cantidad de NaCI 1 ,5 veces la concentración de iones Ag para la precipitación de iones Ag. El sistema se dejó durante la noche a 25 °C para lograr una precipitación completa. Concentración: Se recogieron juntas 16 síntesis (8 L en total), se filtraron a través de una membrana de 0, 1 pm, y se concentraron hasta un volumen de 10 mi en un evaporador rotatorio (Heidolphlaborota 20) a 35 °C (vacío de «30 mbar). Finalmente, la solución se filtró a través de una membrana de 0,22 micrómetros y se concentró adicionalmente en un vial hasta 2 mi. La concentración de Ag5-AQC al final del proceso de purificación, la concentración es de aproximadamente 30 mg/l, estimada por espectroscopia de absorción atómica de llama (realizada con un Perkin-Elmer 3110 con una lámpara de cátodo hueco plateado Lumia de Perkin-Elmer (Madrid, España) (corriente 10 mA)). El análisis de espectros de masas muestra que están presentes principalmente especies de Ag5-AQC (aproximadamente >50 %).
Las muestras de clústeres se caracterizaron por espectroscopia UV-Vis y fluorescencia, AFM (microscopía de fuerza atómica), HRTEM (microscopía electrónica de transmisión de alta resolución), XANES y ESI-TOF (espectrometría de masas de ionización por electronebulización de tiempo de vuelo) que muestran que la composición contiene principalmente clústeres con N = 5 átomos (Ag5-AQC).
EJEMPLO 2: Modelo de interacción con Ag5
Los modelos teóricos de la interacción de Ag5-AQC con glutatión y tiorredoxina muestran que la reacción es termodinámicamente posible. Además, los Ag5-AQC interactúan selectivamente con un dominio fundamental de tiorredoxina, denominado "pliegue de tiorredoxina" y se encuentra tanto en proteínas procariotas como eucariotas. A pesar de la variabilidad de secuencia en muchas regiones del pliegue, las proteínas de tiorredoxina comparten una secuencia de sitio activo común con dos residuos de cisteína reactivos: Cys-X-Y-Cys, donde X e Y son a menudo, pero no necesariamente, aminoácidos hidrófobos. Sin quedar limitados por la teoría, los Ag5-AQC parecen interactuar con estos dos residuos de cisteína como se muestra en la Figura 1.
EJEMPLO 3: Los Ag5-AQC promueven la oxidación de azufre
Los Ag5-AQC promueven la oxidación de azufre en cisteína y glutatión como se ve usando la absorción de rayos X cercana a la estructura del borde (XANES) (Figura 2). Además, esta reacción depende de la dosis (Figura 3). También se ha demostrado que la tiorredoxina de E.Coli se oxida en presencia de los Ag5-AQC (Figura 4). Como se esperaba, la molécula de tiorredoxina pura solo muestra un pico a 2474,3 eV, de manera consistente con el estado de oxidación S(-2), que corresponde a sus dos grupos de cisteínas. Es importante tener en cuenta que la forma reducida de esta molécula puede confirmarse, antes del tratamiento catalítico con Ag5-AQC, porque no se observan señales de especies disulfuro con la división característica de aproximadamente 1 ,5 eV en el intervalo entre 2473 y 2475 eV. Después del tratamiento con AQC, es claramente visible un pico fuerte asociado a S+6.
El análisis XANES también muestra el efecto que tienen los diferentes aceptores de electrones en la oxidación de tiorredoxina mediada por Ag5-AQC (Figura 5). Desde un punto de vista biológico, es de gran importancia ver que los Ag5-AQC potencian el efecto del oxígeno, H2O2 y los radicales hidroxilo (HO) en la oxidación de azufre, alcanzando estados de oxidación que son irreversibles en los sistemas biológicos. Esto vincula la acción de Ag5-AQC con el metabolismo celular y la vascularización tumoral (Figura 6).
EJEMPLO 4: Los Ag5-AQC tienen un efecto bactericida
Los Ag5-AQC son bacteriostáticos y bactericidas contra E. Coli. Se cree que el mecanismo responsable es la oxidación de tiol. De hecho, el ditiotreitol (DTT), un agente reductor de tiol, rescata a E. Coli de la acción de Ag5-AQC. Lo contrario también es cierto, es decir, los Ag5-AQC rescatan a E. Coli de la acción del DTT como se esperaba de los agentes redox con acción opuesta. Los clústeres hechos de cobre y platino también tienen actividad bactericida.
En ausencia de DTT (0 mM), una baja concentración (1 ,2 mg/l) de Ag5-AQC destruye las bacterias. Cuando el DTT se aumenta a 0,1 mM, la viabilidad de las bacterias se restablece parcialmente. El DTT a 10 mM es tóxica para las bacterias, sin embargo, la administración conjunta de Ag5-AQC revierte el efecto del DTT (Figura 7).
EJEMPLO 5: Efecto de los Ag5-AQC sobre las líneas celulares humanas
Se usó un panel de nueve líneas celulares: A549 (adenocarcinoma de pulmón humano, DSMZ N.°: ACC 107), A549 Luc-C8 (BIOWARE ®), MCF7 (adenocarcinoma de mama humano, DSMZ N.°: ACC 115), HCT1 16 (carcinoma colorrectal humano, ATCC N.°: CCL-247), HEK293: (Riñón, embrión de ser humano), U87-luc (glioblastoma multiforme humano, amablemente proporcionado por Joan Seoane), MM.1 S (mieloma múltiple humano, ATCC N.°: CRL-2974), RL (linfoma no Hodgkin humano, ATCC N.°: CRL-2261) y MEC-1 (leucemia linfocítica crónica de linfocitos B humana, DSMZ N.°: ACC 497).
Todas las líneas celulares eran sensibles a los Ag5-AQC. En la Figura 8, los gráficos de respuesta a la dosis (0,24-1 ,2 mg/l) se representan para diversas líneas celulares. Es importante destacar que cuando el DTT se administró conjuntamente con los Ag5- AQC, el efecto tóxico se redujo, lo que indica que el efecto Ag5-AQC está mediado por la oxidación de tiol.
Usando la línea celular A549, también se encontró que los clústeres hechos de cobre muestran efectos citotóxicos, véase la Figura 9.
El desarrollo de moléculas GFP sensibles a redox permite la monitorización del estado redox dentro de las células vivas por microscopía de fluorescencia. La quimera roGFP- Grx1 es un sensor genéticamente codificado para medir los cambios en la oxidación de tiol a través de dos cisteínas introducidas en la estructura del barril b de la proteína GFP. La formación de disulfuro entre las cisteínas conduce a la protonación de GFP y aumenta los espectros de excitación de 400 nm a expensas de los espectros de excitación de 488 nm. Las células A549 se transdujeron con el sensor durante 48 horas y los cambios en la intensidad de fluorescencia se monitorizaron mediante microscopía de fluorescencia confocal durante 10 minutos después del tratamiento con Ag5-AQC (CI50 - aproximadamente 0,3 mg/l). Si bien las células de control no modifican su estado redox con el tiempo, la adición de Ag5-AQC a la muestra condujo a una pronta respuesta oxidativa a la señal máxima después de 6 minutos de tratamiento. Se analizaron un total de 34 células seleccionadas al azar (al menos 10 células por experimento de un total de tres experimentos), de las cuales 20 células mostraron un cambio claro en su estado redox después de la exposición a Ag5-AQC. Además, 13 de las células restantes modificaron su estado de oxidación, aunque el efecto no es tan marcado como en las 20 células mencionadas anteriormente. roGFP responde a los niveles de GSH/GSSG a través del intercambio de electrones con glutarredoxina (GRX1), lo que demuestra el efecto de Ag5-AQC en GSH (Figura 10).
EJEMPLO 6: Los Ag5-AQC actúan sobre tioles críticos presentes en las proteínas Las metalotioneínas (MT) son un grupo de proteínas de unión a metales intracelulares ricas en cisteína de bajo peso molecular que desempeñan un papel crítico en la protección contra agentes oxidantes. La expresión de MT está bajo el control del factor de transcripción sensible al metal 1 (MTF-1). En condiciones normales, el MTF-1 se extiende entre el citoplasma y el núcleo, pero tras un estrés diverso se acumula en el núcleo y se une al elemento sensible al metal (MRE) que induce la expresión de MT entre otros genes. En condiciones fisiológicas, las MT se unen al cinc a través del grupo tiol de sus residuos de cisteína formando dos clústeres de cinc/tiolato, pero en condiciones de estrés oxidativo, el cinc se libera a través de la oxidación de los clústeres de cinc/tiolato que conducen a la formación de MT-disulfuro. Este estado de MT- disulfuro puede revertirse en un entorno reducido, lo que lleva a la formación de MT-tiol que puede asociarse con iones de cinc para formar las MT. Este proceso constituye el ciclo redox de MT, que desempeña un papel crucial en la función biológica de las MT.
Se razonó que los Ag5-AQC podrían catalizar la conversión de MT-tiol en MT-disulfuro con la consiguiente liberación de cinc, activación de MTF-1 y translocación en el núcleo. Para verificar esto, se analizó la ubicación de MTF-1 después del tratamiento con Ag5- AQC. Las células A549 se trataron con Ag5-AQC (CI50 - aproximadamente 0,3 mg/l) y 2 horas después las células se fijaron y se tiñeron con un anticuerpo contra MTF-1. Las imágenes de inmunofluorescencia mostraron una clara acumulación nuclear de MTF-1 en las células tratadas con respecto a las células de control (Figura 11 a). Se contaron un total de 300 células para cada condición, de las cuales 242 fueron positivas para la localización nuclear de MTF-1 en células tratadas con Ag5-AQC y 9 en controles. Además, los datos de micromatrices obtenidos usando la línea celular MM.1 S, después de 4 horas de tratamiento con los Ag5-AQC, mostraron que los genes MT se regulaban positivamente en respuesta al tratamiento con Ag5-AQC como se esperaba de la activación de MTF-1.
La ruta Nrf2-Keap1 generalmente se considera una ruta de defensa celular importante, que controla la expresión de genes que tienen funciones antioxidantes dentro de las células. En condiciones iniciales, Nrf2 se reprime transcripcionalmente por Keapl en el citoplasma, lo que a su vez facilita la poli-ubiquitinación mediada por Cul3 de Nrf2 que conduce a su degradación proteosómica. Keapl contiene 27 cisteínas, algunas de las cuales se informó que son el objetivo de electrófilos y oxidantes que las modifican, facilitando la eliminación de la represión de Nrf2. Tras la exposición al estrés, Keapl se inactiva por modificación directa de los residuos de cisteína tiol, y posteriormente Nrf2 se estabiliza, evitando la degradación proteasómica y se transloca al núcleo para mediar la activación de una diversidad de genes implicados en la respuesta antioxidante tal como glutatión peroxidasa (GPx), NAD(P)H quinona oxidorreductasa (NQO-1) y hemo oxigenasa-1 (HMOX1). Existen otros mecanismos que regulan Nfr2 independientemente de Keapl , incluida la modificación de cisteínas en el dominio Neh de Nrf2 que da como resultado la acumulación nuclear de Nrf2. Se razonó que los Ag5- AQC podrían estar involucrados en la oxidación de los grupos sulfhidrilo en Keapl o Nrf2 con la consiguiente liberación de Nrf2 y su translocación en el núcleo. La inmunofluorescencia indirecta se utilizó para evaluar la localización de la proteína Nrf2 en respuesta a N-etilmaleimida (NEM, control positivo) y los Ag5-AQC. NEM es un alqueno que es reactivo a los tioles y se usa comúnmente para modificar los residuos de cisteína en proteínas y péptidos. La línea celular A549 presenta mutaciones en el gen Keapl que da como resultado una alteración de la actividad de Keapl que deja de ejercer su función represiva sobre Nrf2 lo que conduce a una localización predominante de Nrf2 en el núcleo en condiciones normales. Por lo tanto, esta línea celular no es adecuada para el estudio de la ubicación celular de Nrf2. En cambio, las células de riñón embrionario humano 293 (HEK293) se expusieron a NEM (100 mM) y Ag5-AQC (CI50 - aproximadamente 0,3 mg/l) durante 30 minutos y después se tiñeron con anticuerpos específicos contra Keapl y Nrf2. El tratamiento con Ag5-AQC causó un aumento en la tinción de proteínas Nrf2 (tinción roja) indicativa de estabilización de proteínas y la acumulación nuclear (colocalización con azul, tinción de Hoechst) después de 30 minutos en comparación con las células de control, donde Nrf2 se encuentra predominantemente en el citoplasma (Figura 11 b). Como se esperaba, el tratamiento con NEM aumentó la acumulación nuclear de Nrf2. Resulta evidente que los Ag5-AQC y NEM comparten un patrón similar de tinción (una mayor expresión de Nfr2 debido a una degradación reducida y una mayor localización nuclear), apoyando así la acción de Ag5-AQC sobre los tioles.
EJEMPLO 7: Los Ag5-AQC reducen el crecimiento tumoral de esferoides multicelulares
Los esferoides tumorales multicelulares (MCTS) se parecen a muchos aspectos de las condiciones fisiopatológicas dentro del tejido tumoral humano y se usan ampliamente para pruebas de fármacos. Por lo tanto, los MCTS de las células A549 se desarrollaron como un modelo tumoral ex vivo para evaluar la actividad de Ag5-AQC. El estado fisiológico de las células en MCTS depende de su tamaño; un MCTS único de aproximadamente 400-500 pm de diámetro después de 4 días de incubación se selecciona con frecuencia para pruebas de fármacos. Por lo tanto, los MCTS se seleccionaron de acuerdo con estos criterios y se trataron con Ag5-AQC (2,4 mg/l) cuatro veces (días 0, 2, 4 y 6, considerando el primer día de tratamiento como 0). Las imágenes de MCTS de control y tratados se tomaron todos los días, desde el día 0 hasta el día 7. Las imágenes mostraron que el tratamiento con Ag5-AQC reduce el crecimiento de MCTS (Figura 12a) como se estima midiendo el área de MCTS usando ImageJ. La reducción en el tamaño de MCTS fue evidente después de la primera dosis de tratamiento y se mantuvo con el tiempo, siendo significativamente diferente del día 3 (Figura 12b). Además, es notable la existencia de una región clara en la parte central de los MCTS tratados con Ag5-AQC, que parece ser el resultado de una menor celularidad (Figura 12a, flechas). Como se ha descrito previamente, los MCTS grandes (es decir, tamaños superiores a 600 pm) se caracterizan por la existencia de subpoblaciones celulares heterogéneas, con células que proliferan activamente en la periferia y células quiescentes, hipóxicas y necróticas en las regiones internas. Se cree que la existencia de estas regiones claras en los MCTS después del tratamiento con Ag5-AQC está relacionada con la capacidad de Ag5-AQC de penetrar en los MCTS que alcanzan estas regiones hipóxicas centrales en virtud de su pequeño tamaño y carga neutra.
Para validar esta hipótesis, se evaluaron los niveles de hipoxia en el tumoroide usando una sonda fluorescente. Como se muestra en la Figura 12c, los niveles de hipoxia aumentan en la parte interna del tumor de 1.000 células. Curiosamente, la exposición del tumoroide a la concentración creciente de Ag5-AQC causó una reducción dependiente de la dosis en las células hipóxicas.
EJEMPLO 8: La acción de Ag5-AQC se potencia por H2O2
Los Ejemplos anteriores proporcionan evidencia de la importancia de la interacción de Ag5-AQC con 02, H2O2 y radicales hidroxilo. En el presente documento se proporciona evidencia de que lo mismo también es cierto en cultivos celulares. Se demostró que la actividad citotóxica de Ag5-AQC se vio afectada cuando la respiración celular, y por lo tanto los niveles de ROS, disminuyeron modificando así el metabolismo celular. De hecho, las células A549 y las células U251 con respiración reducida (después de permitirles alcanzar la confluencia) fueron menos sensibles a la acción de Ag5-AQC (Figuras 13A y 13B). Como se esperaba, las células A549 privadas de suero también fueron menos sensibles a Ag5-AQC que las células proliferativas (Figura 13C). La sensibilidad se restableció si se administró conjuntamente una dosis baja de H2O2 con Ag5-AQC (Figura 13D).
EJEMPLO 9: Efectos de Ag5-AQC in vivo
El efecto in vivo de Ag5-AQC se probó en el modelo de cáncer de glioma ortotópico U87luc y en el modelo de cáncer de pulmón ortotópico A549luc que hace metástasis a los ganglios linfáticos mediastínicos.
El glioma maligno de alto grado, el glioblastoma multiforme (GBM), es la forma más agresiva y letal de tumores cerebrales con una tasa de supervivencia inferior al 5 % después de 5 años. Uno de los principales factores limitantes en el tratamiento de GBM es la administración de agentes terapéuticos al cerebro a través de la barrera hematoencefálica (BHE). Esta barrera fisiológica altamente restrictiva evita que el 98 % de los fármacos de molécula pequeña y prácticamente el 100 % de los fármacos de molécula grande lleguen al sistema nervioso central desde la circulación sanguínea. El pequeño tamaño de los AQC acoplados a su carga neutra a pH fisiológico favorece, al menos teóricamente, su difusividad en los tejidos biológicos. Se consideró si estas propiedades podrían permitir que Ag5-AQC se difundiera libremente a través de la BHE y alcanzara el tumor. Con este objetivo, se desarrolló un modelo de glioma ortotópico U87luc para probar la capacidad potencial de Ag5-AQC para cruzar la BHE y reducir los tumores.
Después de la implantación ortotópica de las células U87luc, se administró Ag5-AQC (0,5 mg/kg) por vía intravenosa cuatro veces. El crecimiento tumoral se siguió de la medición de la bioluminiscencia de las células tumorales en el cerebro durante 14 días usando el sistema IVIS® Spectrum. Los resultados mostraron que, en el caso de los animales de control, el tamaño tumoral aumenta exponencialmente a lo largo del experimento, mientras que en los animales tratados con Ag5-AQC, el crecimiento del tumor se redujo (Figura 14a). Por lo tanto, estos resultados muestran que Ag5-AQC puede cruzar la BHE, alcanzar el tumor y reducir su tamaño.
Otro factor limitante en el tratamiento del cáncer es la aparición de metástasis. La enfermedad metastásica es en gran parte incurable debido a su naturaleza sistémica y la resistencia de las células tumorales diseminadas a los agentes terapéuticos existentes. Esto explica por qué más del 90 % de la mortalidad por cáncer es atribuible a metástasis, pero no a los tumores primarios de los que surgen estas lesiones neoplásicas. La capacidad de Ag5-AQC para reducir o eliminar tanto el tumor primario como las metástasis se evaluó utilizando un modelo de cáncer de pulmón ortotópico A549luc descrito previamente que hace metástasis a los ganglios linfáticos mediastínicos (Porto et al. (2018) Adv. Mater. e1801317). Se sabe que la línea celular A549 es una línea celular de cáncer muíante en KRAS. En este modelo, la aparición de metástasis en los ganglios linfáticos está bien establecida y podría detectarse 13 días después de la inyección de células tumorales. Por lo tanto, la evaluación del efecto de Ag5-AQC comenzó el día 20 después de la implantación de las células A549luc, cuando las metástasis en los ganglios linfáticos ya eran evidentes. Se establecieron tres grupos: ratones no tratados de control, ratones tratados con CDDP (4 mg/kg) como control positivo, y ratones tratados con Ag5-AQC (0,25 mg/kg). El tratamiento se administró por vía intravenosa cuatro veces (días 20, 22, 24 y 26) y la evolución del tumor se monitorizó in vivo midiendo la bioluminiscencia de las células tumorales en el pulmón durante 37 días utilizando el sistema IVIS® Spectrum. Los resultados mostraron una reducción significativa en el tamaño del tumor tanto en ratones tratados con CDDP como con Ag5- AQC en comparación con los animales de control, en los que el tumor creció exponencialmente a lo largo del experimento (Figura 14b). El día 37, se sacrificaron los animales porque los ratones de control mostraron signos evidentes de morbilidad y se cuantificó la actividad de la luciferasa para medir la carga de células cancerosas. Los ratones tratados con Ag5-AQC y CDDP exhibieron una reducción significativa en la actividad de luciferasa en el tumor primario y en los ganglios linfáticos mediastínicos en comparación con los ratones de control (Figura 14c). La actividad de luciferasa se comparó en ratones tratados con Ag5-AQC y en los tratados con CDDP. En los ratones tratados con Ag5-AQC, la señal fue claramente menor que en los demás, tanto en el tumor primario como en los ganglios linfáticos mediastínicos (Figura 14b, c). La tinción inmunohistoquímica de secciones de pulmón con un anticuerpo monoclonal contra la citoqueratina humana, que tiñe específicamente las células tumorales, también corroboró estos resultados (Figura 14d). Además, el tratamiento con Ag5-AQC no afectó al peso corporal de los animales, descartando una toxicidad grave del compuesto
(Figura 14e).
Juntos, estos resultados mostraron la capacidad de Ag5-AQC para alcanzar tanto tumores primarios como metástasis, y para disminuir significativamente el tamaño sin causar efectos tóxicos adicionales. Por lo tanto, los Ag5-AQC ofrecen un nuevo enfoque que puede mejorar el tratamiento de tumores humanos debido a su capacidad de cruzar la BHE y alcanzar y reducir las metástasis.
EJEMPLO 10: Efecto de Ag5-AQC en cultivos primarios de tumores humanos
La sensibilidad a Ag5-AQC se evaluó ex vivo en células derivadas de pacientes con leucemia linfocítica crónica de linfocitos B (B-CLL) obtenidas de cultivos de médula ósea de rutina después de que se estableció el diagnóstico. Se realizó una evaluación del efecto citotóxico y los cambios morfológicos ultraestructurales asociados con el tratamiento con Ag5-AQC en células derivadas de 3 pacientes. Las células de B-CLL se cultivaron con diferentes dosis de Ag5-AQC y la citotoxicidad se evaluó mediante el ensayo MTT. De acuerdo con los resultados anteriores obtenidos de líneas celulares establecidas, se observó una reducción dependiente de la concentración en la viabilidad celular después de 24 horas (Figura 15a). Dado que Ag5-AQC en las líneas celulares de cáncer aumentó el O2·-, se cuantificaron los cambios en los niveles de O2·- en células de B-CLL expuestas a Ag5-AQC midiendo las células positivas a DHE mediante citometría de flujo. Se observó un aumento significativo, más de 2 veces, en las células positivas a DHE durante 4 horas después del tratamiento (Figura 15b). Además, las imágenes TEM mostraron cambios morfológicos apoptóticos evidentes y la presencia de mitocondrias alteradas después del tratamiento con Ag5-AQC (Figura 15c). Por lo tanto, estos resultados confirman los resultados obtenidos con líneas celulares y esferoides, analizados en los Ejemplos anteriores.
EJEMPLO 11 : Efecto de Ag5-AQC sobre un modelo de tumor de mieloma múltiple
El efecto de Ag5-AQC se probó en un modelo de tumor de ratón MM.1S con xenoinjerto de mieloma múltiple. Los ratones (n = 4 para cada grupo de tratamiento) se trataron con una solución salina (control), 0, 125 mg/kg de Ag5-AQC o 0,25 mg/kg de Bortezomib (un inhibidor de proteasoma aprobado en EE.UU. y Europa para tratar mieloma múltiple). El volumen tumoral se controló durante varios días y los resultados se muestran en la Figura 16. Los resultados muestran que el tratamiento con Ag5-AQC tenía una eficacia equivalente a Bortezomib, incluso sin una dosificación optimizada.
EJEMPLO 12: Los Ag5-AQC causan la muerte celular preferiblemente en células transformadas con Ras
Se ha informado ampliamente que los oncogenes activados causan una acumulación en especies reactivas de oxígeno (Iraní et al. (1997) Science). Se razonó que las células transformadas podrían destruirse preferiblemente mediante tratamiento con Ag5-AQC. Para probar esta hipótesis, se introdujo un alelo activado inducible por doxiciclina de H- Ras (RasV12) en fibroblastos de ratón inmortalizados no transformados (W3T3) y se analizaron los efectos de los Ag5-AQC sobre la inducción del oncogén. Como se muestra en la Figura 17B, los Ag5-AQC causaron una disminución en la supervivencia en W3T3 de una manera dosis-respuesta. Curiosamente, las células que expresan RasV12 fueron más sensibles a los efectos tóxicos de Ag5-AQC, con una disminución significativa en la viabilidad en comparación con las células no inducidas (control) en todas las dosis probadas de AQC.
Esta destrucción selectiva fue revertida por el tratamiento con DTT, lo que sugiere que la acumulación de ROS inducida por Ras fue responsable del efecto diferencial. Este efecto preferencial de los Ag5-AQC sobre las células transformadas por oncogenes proporciona evidencia del uso de Ag5-AQC como agentes antineoplásicos, especialmente en cánceres mutantes en RAS.
EJEMPLO 13: Efecto de los AQC en combinación con radioterapia
Se probó el efecto del tratamiento con Ag5-AQC en las células tratadas con radiación. Las células A549 y las células U251 se trataron con diferentes diluciones de Ag5-AQC y se irradiaron inmediatamente con diferentes dosis de radiación (0-10 Gy).
La supervivencia celular se midió usando un ensayo clonogénico como se describe en Franken et al. (2006) Nat. Protocol. 1 (5): 2315-2319. Brevemente, después de la irradiación, las células se tripsinizaron y se contaron usando el contador de células automatizado TC20 (Biorad). Se sembraron 100 células de cada muestra en una placa de 6 pocilios por triplicado y se incubaron a 37 °C en una atmósfera humidificada durante 1 semana para permitir la formación de colonias macroscópicas. Después, las células se fijaron y se tiñeron con cristal violeta. Se contaron colonias con más de 50 células. La fracción de supervivencia (SF) se calculó después de la corrección por la eficacia en placas de las células de control. Los resultados se muestran en las Figuras 18A y 19A. Los resultados muestran que la administración de los Ag5-AQC aumenta el efecto de destrucción celular de la radioterapia.
El daño del ADN también se midió en células irradiadas. Después de la irradiación, las células se tripsinizaron fijadas con PFA (0,04 %) y se tiñeron con el anticuerpo anti- pH2AX (Millipore, Producto N.°: 16-202A) como se describe en Muslimovic et al. (2008) Nat. Protocol. 3: 1187-1193. La expresión de la histona fosforilada H2AX (pH2AX) es un marcador de daño en el ADN (Sharma et al. en DNA Repair Protocols, (Ed: L. Bjergbask), Springer Science, Nueva York, 2012, cap. 40). Las células teñidas se analizaron en el citómetro de flujo Guava EasyCyte usando el programa InCyte (Millipore). Los resultados se muestran en las Figuras 18B y 19B.
El efecto de los AQC que consisten en 5 átomos de metal de transición de valencia cero puede probarse adicionalmente en dos modelos diferentes para determinar el efecto con radioterapia. A) Estudios ex-vivo, utilizando esferoides tumorales multicelulares (MCTS): Los MCTS de las células U251-luc se pueden obtener mediante el método en gota colgante. B) Modelo in vivo : Se puede desarrollar un modelo de cáncer de glioblastoma ortotópico mediante la inyección de células U251-luc (una línea celular de glioblastoma humano que transporta el gen de luciferasa para permitir la obtención de imágenes in vivo de los tumores en crecimiento) en el cerebro de ratones atímicos.
CONCLUSIÓN
En el presente documento se describe el efecto de los Ag5-AQC en la oxidación de proteínas con un alto contenido de cisteína y grupos tiol accesibles tales como metalotioneínas o glutarredoxina. Se propusoque debido a su pequeño tamaño, los Ag5- AQC deberían presentar una excelente penetración en el tejido tumoral. Los experimentos en MTCS mostraron cómo los Ag5-AQC penetran en las regiones internas destruyendo las células hipóxicas en estas áreas. El modelo de cáncer de pulmón ortotópico que hace metástasis en los ganglios linfáticos mediastínicos revela la capacidad de los Ag5-AQC para alcanzar tumores in vivo. Se observó una reducción en el tamaño del tumor, tanto en el tumor primario de pulmón como en las metástasis de los ganglios linfáticos mediastínicos. Estos resultados destacan la capacidad de los Ag5- AQC para alcanzar y reducir las metástasis que constituyen una herramienta innovadora para resolver dos de los principales problemas en el tratamiento del cáncer.
Todas las patentes y solicitudes de patentes a las que se hace referencia en el presente documento se incorporan por referencia en su totalidad. Además, todas las realizaciones descritas en el presente documento pueden aplicarse a todos los aspectos de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende clústeres cuánticos atómicos (AQC) que consisten en 5 átomos de metal de transición de valencia cero para su uso en el tratamiento de un trastorno proliferativo celular.
2. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 , en combinación con radioterapia.
3. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 2, para administración simultánea o secuencial a la radioterapia.
4. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 2 o la reivindicación 3, donde la radioterapia es radioterapia de haz externo.
5. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde dicha composición no se usa en combinación con un fármaco antineoplásico.
6. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde dichos AQC son el único principio activo de la composición.
7. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para su uso como una monoquimioterapia.
8. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde los átomos metálicos se seleccionan de Ag, Au, Cu, Pt, Fe, Cr, Pd, Ni, Rh, Pb, Ir, Ru, Os, Co, Ti, V o cualquier combinación de los mismos.
9. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, donde los átomos metálicos se seleccionan de Ag, Au, Cu, Pt o cualquier combinación de los mismos.
10. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 8 o la reivindicación 9, donde los átomos metálicos son Ag.
11. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde el trastorno proliferativo celular es un tumor y/o cáncer.
12. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 1 , donde el cáncer se selecciona de cáncer de cerebro, pulmón, mama o colon.
13. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 12, donde el cáncer se selecciona de cáncer de cerebro.
14. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde el trastorno proliferativo celular comprende una mutación en RAS.
15. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 14, donde la mutación en RAS es una mutación en KRAS.
16. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, donde la composición comprende un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
17. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en combinación con los AQC que consisten en 3 átomos de metal de transición de valencia cero.
18. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, que es: (i) sustancialmente libre de AQC que consisten en más de 5 átomos de metal de transición de valencia cero, (ii) sustancialmente libre de AQC que consisten en menos de 5 átomos de metal de transición de valencia cero, y/o (iii) sustancialmente libres de iones metálicos.
19. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 18, donde más de aproximadamente el 95 % de los AQC presentes en la composición consisten en 5 átomos de metal de transición de valencia cero.
20. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, para su uso en la prevención y/o tratamiento de metástasis de cáncer.
21. La composición de acuerdo con la reivindicación 20, para su uso en la prevención y/o tratamiento de metástasis de cáncer de ganglios linfáticos.
22. La composición de acuerdo con la reivindicación 20 o la reivindicación 21 , para su uso en la prevención y/o tratamiento de metástasis de cáncer de pulmón.
23. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, que se administra por vía oral, intravenosa o subcutánea.
24. Uso de la composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un trastorno proliferativo celular.
25. Uso de una composición que comprende clústeres cuánticos atómicos (AQC) que consisten en 5 átomos de metal de transición de valencia cero como agente sensibilizador a la radioterapia para células proliferativas.
26. Un método para prevenir o tratar un trastorno proliferativo celular que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, a un paciente que lo necesite.
27. Un método para prevenir o tratar un trastorno proliferativo celular que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende clústeres cuánticos atómicos (AQC) que consisten en 5 átomos de metal de transición de valencia cero, a un paciente que lo necesite, donde dicho método no comprende tratar al paciente con un fármaco antineoplásico adicional.
28. Un método para prevenir o tratar un trastorno proliferativo celular que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende clústeres cuánticos atómicos (AQC) que consisten en 5 átomos de metal de transición de valencia cero, a un paciente que lo necesite, en combinación con radioterapia.
29. El método de acuerdo con la reivindicación 28, donde la composición se administra simultáneamente o antes de la radioterapia.
30. El método de acuerdo con la reivindicación 28 o la reivindicación 29, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende AQC que consisten en 3 átomos de metal de transición de valencia cero.
31. El método de acuerdo con la reivindicación 30, donde la composición que comprende AQC que consisten en 3 átomos de metal de transición de valencia cero, se administra simultánea o secuencialmente a la composición que comprende AQC que consisten en 5 átomos de metal de transición de valencia cero.
32. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 31 , donde la composición se administra por vía oral, intravenosa o subcutánea.
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