BR112021005775A2 - usos terapêuticos de clusters quânticos atômicos - Google Patents

Abstract

USOS TERAPÊUTICOS DE CLUSTERS QUÂNTICOS ATÔMICOS. É fornecida uma invenção relacionada a composições e usos terapêuticos de clusters quânticos atômicos (AQCs), em particular composições consistindo essencialmente em AQCs compreendendo 5 átomos de metal de transição de valência zero para uso no tratamento de um distúrbio proliferativo celular.

Description

USOS TERAPÊUTICOS DE CLUSTERS QUÂNTICOS ATÔMICOS CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A invenção se refere a usos terapêuticos de clusters quânticos atômicos, em particular clusters quânticos atômicos que consistem em 5 átomos de metal de transição de valência zero.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] A homeostase redox é essencial para a sobrevida celular. Os tióis desempenham um papel central na manutenção do equilíbrio redox. O átomo de enxofre na cadeia lateral do aminoácido de cisteína pode existir em vários estados de oxidação diferentes. Em condições fisiológicas, o átomo de enxofre da cisteína transita reversivelmente entre os estados de tiol e dissulfeto (reduzido e oxidado, respectivamente), mas a transição para estados de oxidação mais altos (exceto para ácido sulfônico) é irreversível, o que significa que a proteína só pode ser substituída pela síntese de um novo átomo. As células em seus diferentes compartimentos, com exceção do retículo endoplasmático, reduzem continuamente as proteínas que são oxidadas espontaneamente pela presença de oxigênio. Dentro da célula, as funções das proteínas dependem de seu estado de oxidação do enxofre. Existem dois sistemas que se sobrepõem, os sistemas da glutationa e da tiorredoxina, que estão muito bem preservados ao longo da evolução e trabalham para manter as cisteínas proteicas em seu estado funcional reduzido.

[003] As espécies reativas de oxigênio (ROS) são geradas durante o metabolismo normal das células e os sistemas de glutationa e tiorredoxina protegem as células do dano oxidativo, mantendo o estado reduzido. Se os níveis de ROS estão elevados e excedem a capacidade de tamponamento dos sistemas de glutationa e tiorredoxina, pode ocorrer ativação de vias de sinalização e expressão gênica, o que induz a apoptose celular. Células do tumor ativas proliferativas apresentam respiração aumentada e, como consequência, níveis mais elevados de ROS. Além disso, os tumores humanos apresentam vascularização insuficiente que contribui para a privação de glicose e aumento de ROS devido a um desequilíbrio da homeostase redox.

[004] WO2012/059572 descreve uma combinação de pelo menos um AQC e pelo menos um medicamento antineoplásico para a prevenção e/ou tratamento de um distúrbio proliferativo celular. O pedido descreve AQCs que consistem em 2 e 25 átomos de metal de transição de valência zero tendo um efeito citotóxico e antiproliferativo em linhagens celulares cancerosas e, portanto, podem ser usados em combinação com agentes antineoplásicos para tratar distúrbios proliferativos celulares.

[005] É um objetivo da invenção fornecer composições terapêuticas aprimoradas de AQCs.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[006] Em um primeiro aspecto, a invenção fornece uma composição que compreende clusters quânticos atômicos (AQCs) consistindo em 5 átomos de metal de transição de valência zero para uso no tratamento de um distúrbio proliferativo celular.

[007] Em outro aspecto, a invenção fornece o uso da composição conforme definido neste documento, para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de um distúrbio proliferativo celular.

[008] Em outro aspecto, a invenção fornece o uso de uma composição compreendendo clusters quânticos atômicos (AQCs) consistindo em 5 átomos de metal de transição de valência zero como um agente de sensibilização de terapia de radiação para células de proliferação.

[009] Em outro aspecto, a invenção fornece um método de prevenção ou tratamento de um distúrbio proliferativo celular compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição, conforme definido neste documento, a um paciente em necessidade deste.

[010] Em outro aspecto, a invenção fornece um método de prevenção ou tratamento de um distúrbio proliferativo celular compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição compreendendo clusters quânticos atômicos (AQCs) consistindo em 5 átomos de metal de transição de valência zero, a um paciente em necessidade, em que o referido método não compreende o tratamento do paciente com um fármaco antineoplásico adicional.

[011] Em outro aspecto, a invenção fornece um método de prevenção ou tratamento de um distúrbio proliferativo celular compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição compreendendo clusters quânticos atômicos (AQCs) consistindo em 5 átomos de metal de transição de valência zero, a um paciente em necessidade, em combinação com terapia de radiação.

[012] Estes e outros aspectos são descritos em mais detalhes na descrição a seguir.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[013] Figura 1: Interação de Ag5-AQC com tiorredoxina de E. Coli. Conforme visto, o Ag5-AQC (molécula grande, cinza, de cinco membros) se liga aos resíduos de cisteína (moléculas destacadas por uma seta preta) que formam o sítio ativo. A energia da ligação é favorável (-167 kJ/mol).

[014] Figura 2: Espectros normalizados de absorção de raios-X de borda K de enxofre próximo da estrutura da borda (S-K XANES) de: cisteína (a) e glutationa (b) e as correspondentes com adição de Ag5-AQCs (c & d, respectivamente). O painel direito mostra a região aumentada do gráfico à esquerda. As linhas verticais cheias e tracejadas indicam a posição da energia associada aos diferentes estados de S- oxidação.

[015] Figura 3: Espectros S-K XANES normalizados de: (a) cisteína e cisteína tratada com Ag5-AQC em concentrações diferentes: (b) 1:106 diluído em relação à concentração de estoque de referência (RSC), (c) 1:103 diluído em relação ao RSC e (d) RSC. As linhas verticais indicam a energia correspondente para diferentes estados de S-oxidação.

[016] Figura 4: Espectros S-K XANES normalizados de: tiorredoxina em solução de água com PBS (a) antes e (b) após o tratamento com Ag5-AQC. As linhas verticais indicam a energia correspondente para diferentes estados de S-oxidação.

[017] Figura 5: Porcentagem de tiorredoxina (TRX) oxidada com Ag5-AQCs, peróxido de hidrogênio(H2O2) e radical hidroxila (HO•) sozinho ou em várias combinações, conforme mostrado no eixo x.

[018] Figura 6: Número de oxidação do enxofre de cisteínas de tiorredoxina após vários tratamentos. A oxidação do enxofre é afetada por Ag5-AQCs, peróxido de hidrogênio (H2O2) e radical hidroxila (HO•). A combinação com Ag5-AQC potencializa muito o efeito de H2O2 e HO•.

[019] Figura 7: A sobrevida de E. Coli foi medida após a adição de diferentes concentrações de ditiotreitol (DTT) sozinho (controle) ou em combinação com Ag5- AQC. Na ausência de DTT (0 mM), uma baixa concentração de Ag5-AQC mata as bactérias. Quando uma concentração aumentada de DTT (0,1 mM) é coadministrada com Ag5-AQC, a viabilidade da bactéria é parcialmente restaurada, indicando que o DTT resgata E. coli da ação de Ag5-AQC. Correspondentemente, o DTT a 10 mM é tóxico para bactérias, no entanto, a coadministração com Ag5-AQC reverte o efeito do DTT.

[020] Figura 8: Gráficos de dose-resposta (0,24-1,2 mg/L) para várias linhagens celulares após adição de Ag5-AQCs.

[021] Figura 9: Os resultados que mostram a porcentagem de viabilidade celular de uma linhagem celular A549 após a adição de grupos de 5 átomos feitos de cobre (Cu5-AQCs) quando em comparação com um controle.

[022] Figura 10: Oxidação de Ag5-AQC de grupos sulfidrila em proteínas. As células A549 foram transduzidas com Premo Cellular Redox Sensor. Após 48 horas, o imageamento de lapso de tempo foi realizado usando um microscópio confocal TCS SP5. As amostras foram excitadas com lasers de 405 e 488 nm, e a razão das emissões no canal verde (500-530 nm) foi calculada (razão de 405/488). As imagens foram obtidas a cada 10 segundos após a adição de Ag5-AQC (IC50) durante 10 minutos. Imagens de razão de cores falsas das células em pontos de tempo indicados destacam as alterações no estado redox. Em cada experimento, a razão foi quantificada para duas células individuais (pontas de seta) e representada graficamente contra o tempo.

[023] Figura 11: (a) A localização do MTF1 em resposta a Ag5-AQCs foi detectada por imunofluorescência indireta. As células A549 foram tratadas com Ag5- AQCs por 1 hora e 2 horas e depois fixadas e coradas com o anticorpo anti-MTF1 e DAPI para contracolorir o núcleo. Ag5-AQCs mostrou uma translocação clara de MTF- 1 para o núcleo (coluna da direita) em comparação com as células controle (coluna da esquerda) (b) Ag5-AQCs induzem a translocação de Nrf2 do citoplasma para o núcleo em células HEK293. A coloração por imunofluorescência foi realizada usando um anticorpo anti-Nrf2 (vermelho) e um anticorpo anti-Keap1 (verde). Os núcleos foram contrastados com Hoechst (azul). Imagens mescladas mostram a localização nuclear de Nrf2 após 30 minutos de tratamento com Ag5-AQCs (IC50) ou N- etilmaleimida (NEM) (100 μM, controle positivo).

[024] Figura 12: O tratamento com Ag5-AQC reduz o tamanho do esferoide do tumor multicelular A549 (MCTS). (a) Imagens de controle de MCTS e tratadas com Ag5-AQCs mostrando diferenças no tamanho de MCTS e densidade celular nas regiões centrais. O asterisco branco indica o dia do tratamento e as setas apontam para regiões centrais com menos densidade celular como resultado do tratamento com Ag5-AQCs (b) Cinética de crescimento do controle MCTS ou tratado com Ag5-

AQCs. Os dados representam a média ± SD. As barras de erro representam o desvio padrão; n=8. Teste de Mann Whitney ((*) p <0,05). (c) Imagens usando agente de hipóxia e coloração Hoechst para mostrar o nível de hipóxia nos tumores com ou sem tratamento com Ag5-AQC (controle).

[025] Figura 13: As células proliferativas são mais sensíveis ao efeito de Ag5- AQCs do que as células não proliferativas. (A) células A549 proliferativas e não proliferativas, (B) células U251 proliferativas e não proliferativas e (C) células A549 privadas de soro foram expostas a diferentes concentrações de Ag5-AQC por 1 hora e a viabilidade celular foi determinada por ensaio MTT. Os dados são apresentados como a média ± SD de três experimentos independentes. D) Células A549 privadas de soro ou confluentes foram tratadas com 1,2 mg / L de Ag5-AQC sozinho ou em combinação com H2O2. Um efeito sinérgico é claramente visto quando Ag5-AQC e H2O2 são coadministrados.

[026] Figura 14: Efeitos de Ag5-AQC in vivo. (a) Ag5-AQCs causam uma redução no crescimento do tumor em camundongos com câncer cerebral ortotópico.

Grupos experimentais: Ag5-AQCs (0,25 mg/kg) e controle (sem tratamento). (b-d) O tratamento com Ag5-AQCs causa uma redução no crescimento do tumor em camundongos com câncer de pulmão ortotópico. (b) Crescimento do tumor medido in vivo por luminescência (IVIS® Spectrum). Setas pretas representam os tempos de administração de tratamento no estudo. (c) Quantificação da atividade de luciferase medida ex vivo no pulmão e em linfonodos mediastinais. (d) coloração imuno- histoquímica de tumor no pulmão (setas indicam os nódulos de tumor). Grupos experimentais: CDDP (4 mg/kg), Ag5-AQCs (0,25 mg/kg) e controle (sem tratamento).

(e) Peso corporal ao longo de todo o experimento. Grupos experimentais: CDDP (4 mg/kg), Ag5-AQCs (0,25 mg/kg) e controle (sem tratamento). Os dados representam a média ± SD. As barras de erro representam o desvio padrão; n=5. Teste de Mann Whitney ((*) p <0,05).

[027] Figura 15:O tratamento de Ag5-AQC causa uma redução na viabilidade celular em células B-CLL derivadas de pacientes. (a) Redução dependente de concentração na viabilidade de células B-CLL primárias após o tratamento de Ag5- AQC. As células foram expostas a diferentes concentrações de Ag5-AQC por 30 minutos e a viabilidade celular foi avaliada após 24 horas pelo ensaio MTT. (b) tratamento de Ag5-AQC aumenta a porcentagem de células positivas DHE em 2,5 vezes em comparação com o controle. As células B-CLL foram tratadas com Ag5- AQC por 1 hora e 4 horas mais tarde as células positivas para DHE foram quantificadas por citometria de fluxo. (c) Imagens TEM de células B-CLL tratadas com Ag5-AQC mostraram sinais evidentes de apoptose, como marginalização da cromatina (setas pretas) e mitocôndrias rompidas (setas pretas).

[028] Figura 16: O tratamento com Ag5-AQC causa uma redução no volume do tumor no modelo de xenoenxerto de mieloma múltiplo. O volume do tumor foi medido ao longo de 26 dias entre três grupos de tratamento diferentes: Controle (solução salina administrada por via intravenosa, n = 4), Ag5-AQCs (0,0125 mg/kg administrado por via intravenosa, n = 4) e Bortezomibe (0,25 mg/kg administrado por via intraperitoneal, n = 4).

[029] Figura 17: Células W3T3 portadoras de um alelo RasV12 indutível por doxiciclina foram expostas a doxiciclina (barras brancas) ou veículo (controle - barras pretas) por 24 horas e depois tratadas com diferentes concentrações de Ag5-AQCs.

(a) A expressão de RasV12 foi avaliada por western blot após adição de doxiciclina e (b) a viabilidade celular foi determinada pelo ensaio MTT 24 horas depois. Os dados são apresentados como a média ± SD de pelo menos três experimentos independentes.

[030] Figura 18: O tratamento com Ag5-AQC aumenta a sensibilidade das células A549 à radiação. Os resultados do efeito da radiação em células A549 tratadas com Ag5-AQCs mostrados em A) um ensaio clonogênico e B) um ensaio de dano ao

DNA usando coloração anti-pH2AX.

[031] Figura 19: O tratamento com Ag5-AQC aumenta a sensibilidade das células U251 à radiação. Resultados do efeito da radiação em células U251 tratadas com Ag5-AQCs mostrados em A) um ensaio clonogênico e B) um ensaio de dano ao DNA usando coloração anti-pH2AX.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definições

[032] Todos os termos técnicos e científicos usados ao longo do relatório descritivo têm o mesmo significado que aqueles comumente entendidos por um versado na técnica.

[033] Ao longo do relatório descritivo, o uso do termo "cerca de" em relação a qualquer quantidade é contemplado para incluir essa quantidade.

[034] Ao longo deste relatório descritivo, a menos que o contexto requeira de outra forma, a palavra "compreender", ou variações tais como "compreende" ou "compreendendo", será entendida como implicando na inclusão de um número inteiro, etapa, grupos de números inteiros ou etapas relatados, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou etapa ou grupo de números inteiros ou grupos de etapas.

[035] Ao longo do relatório descritivo, a menos que o contexto exija de outra forma, o termo "consistindo essencialmente em" e variações como "consiste essencialmente em", serão entendidas como implicando a inclusão de um número inteiro declarado, etapa, grupo de números inteiros ou grupo de etapas, com a exclusão de qualquer outro número inteiro, etapa, grupo de inteiros ou grupo de etapas que afete materialmente as características essenciais do número inteiro, etapa, grupo de inteiros ou grupo de etapas declaradas.

[036] Ao longo deste relatório descritivo, a menos que o contexto requeira de outra forma, a palavra "consistindo em", ou variações tais como "consiste em", será entendida como implicando na inclusão de um número inteiro, etapa, grupos de números inteiros ou etapas relatados com exclusão de qualquer outro número inteiro ou etapa ou grupo de números inteiros ou grupos de etapas.

[037] O termo "clusters quânticos atômicos" ou "AQCs", conforme usado neste documento, refere-se a um grupo/cluster de 2 a 500 átomos de metal de transição de valência zero, tal como entre 2 a 200, 2 a 100, 2 a 50 ou 2 a 25 átomos de metal de transição e com um tamanho menor que 2 nm, como menor que 1 nm.

Os AQCs podem compreender átomos de metal de transição de valência zero de metais de transição idênticos (clusters mononucleares) ou diferentes (clusters heteronucleares). Será entendido que este termo não inclui íons metálicos.

[038] O termo "metal de transição" será entendido como referindo-se aos elementos da tabela periódica conhecidos como metais de transição, mas não se refere ao comportamento elétrico dos referidos elementos. O confinamento de elétrons nos AQCs origina a separação quântica dos níveis de energia produzindo mudanças importantes nas propriedades desses materiais, conforme relatado na EP1914196. Portanto, os átomos de metal nos AQCs descritos neste documento podem ter um comportamento tipo semicondutor ou mesmo tipo isolante.

[039] O termo "substancialmente livre de" pode ser usado para se referir a uma composição que é maioritariamente ou totalmente livre de uma entidade especificamente mencionada posteriormente, ou pelo menos não contém a entidade em uma quantidade tal que a entidade afete a eficácia, capacidade de armazenamento, usabilidade em relação às preocupações de segurança necessárias e/ou estabilidade da composição.

[040] O termo "tratar", "tratando" ou "tratamento" pode incluir profilaxia e meios para melhorar, aliviar os sintomas, eliminar a causa dos sintomas de forma temporária ou permanente, ou para prevenir ou retardar o aparecimento dos sintomas do distúrbio ou condição mencionados. As composições da invenção são úteis no tratamento de humanos e animais não humanos.

[041] O termo "quantidade eficaz", "quantidade terapeuticamente eficaz" ou "dose eficaz" refere-se à quantidade suficiente para desencadear os efeitos farmacológicos ou terapêuticos desejados, resultando assim na prevenção ou tratamento eficaz do distúrbio. A prevenção do distúrbio se manifesta atrasando o início dos sintomas do distúrbio em uma extensão clinicamente significativa. O tratamento do distúrbio se manifesta por uma diminuição dos sintomas associados ao distúrbio ou pela melhora da recorrência dos sintomas do distúrbio.

Composições

[042] Os presentes inventores fornecem neste documento evidências de que os clusters quânticos atômicos (AQCs) consistindo em 5 átomos de metal de transição de valência zero afetam os sistemas de glutationa e tiorredoxina, afetando assim a viabilidade celular. Uma característica fundamental da ação dos AQCs com 5 átomos em sistemas biológicos é sua especificidade para substratos, proteínas e receptores de elétrons. Evidências teóricas e experimentais são fornecidas da interação de Ag5- AQC com cisteína, glutationa e tioredoxina. E, mais importante, os inventores também fornecem evidências de que Ag5-AQCs são biologicamente dependentes da presença de aceitadores de elétrons, conforme mostrado pelo fato de que a atividade de Ag5- AQC é maior com o radical hidroxila (HO•) > H2O2 > O2 (por exemplo, Figuras 5 e 6). Sem estar limitada pela teoria, a evidência apresentada neste documento sugere que AQCs com 5 átomos aumentam o efeito de ROS agindo como uma ponte catalítica entre ROS e átomos de enxofre em proteínas para aumentar o nível de oxidação de tiol. Este mecanismo de ação é distinto de outros fármacos quimioterápicos atualmente conhecidos na técnica. O mecanismo de ação para AQCs de 5 átomos é demonstrado in vitro, em cultura de células em 2D e 3D, modelos animais e culturas primárias de células do tumor obtidas de pacientes.

[043] Portanto, de acordo com um primeiro aspecto da invenção, é fornecida uma composição compreendendo clusters quânticos atômicos (AQCs) consistindo em 5 átomos de metal de transição de valência zero para uso no tratamento de um distúrbio proliferativo celular.

[044] Os usos terapêuticos potenciais de composições compreendendo AQCs consistindo em 5 átomos de metal de transição de valência zero serão descritas neste documento. Foi surpreendentemente descoberto que tais composições possuem um efeito citotóxico nas células eucarióticas sozinhas, sem a necessidade de agentes antineoplásicos adicionais estarem presentes. Evidências teóricas e experimentais fornecidas neste documento mostram que AQCs consistindo em 5 átomos interagem seletivamente com resíduos de cisteína presentes em proteínas e resultam na oxidação de enxofre na presença de espécies reativas de oxigênio (ROS). Esse mecanismo é exclusivo para clusters desse tamanho. Portanto, este pedido fornece, pela primeira vez, a motivação para usar AQCs com 5 átomos de metal de transição de valência zero como uma monoterapia no tratamento de doenças de proliferação celular, como o câncer.

[045] A composição pode consistir essencialmente em clusters quânticos atômicos (AQCs) para uso no tratamento de um distúrbio proliferativo celular, em que a referida composição compreende AQCs consistindo em 5 átomos de metal de transição de valência zero. Em uma modalidade, os referidos AQCs são o único ingrediente ativo da composição, isto é, nenhum ingrediente ativo adicional está presente na composição.

[046] Em uma modalidade, a composição não compreende um fármaco antineoplásico. Em uma outra modalidade, a composição não compreende um fármaco antineoplásico como descrito em WO2012 / 059572, como agentes alquilantes (por exemplo, análogos de mostarda de nitrogênio, nitrosoureias, alquil sulfonatos, compostos contendo platina, etileminas e imidazotetrazinas), antibióticos citotóxicos (por exemplo, antraciclinas, actinomicinas), alcaloides vegetais e outros produtos naturais (por exemplo, derivados de camptotecina, epipodofilotoxinas, taxanos e alcaloides de vinca), antimetabólitos (por exemplo, análogos de citidina, análogos de ácido fólico, análogos de purina, análogos de pirimidina, derivados de ureia) e fármacos para terapia direcionada (por exemplo, inibidores da quinase e anticorpos monoclonais).

[047] Em uma modalidade, a composição não é usada em combinação com um fármaco antineoplásico. Em uma modalidade, a composição não é usada em combinação com um fármaco antineoplásico conforme descrito em WO2012 /059572, tais como agentes alquilantes (por exemplo, análogos de mostarda de nitrogênio, nitrosoureias, alquil sulfonatos, compostos contendo platina, etileminas e imidazotetrazinas), antibióticos citotóxicos (por exemplo, antraciclinas, actinomicinas), alcaloides vegetais e outros produtos naturais (por exemplo, derivados de camptotecina, epipodofilotoxinas, taxanos e alcaloides de vinca), antimetabólitos (por exemplo, análogos de citidina, análogos de ácido fólico, análogos de purina, análogos de pirimidina, derivados de ureia) e medicamentos para terapia direcionada (por exemplo, inibidores da quinase e anticorpos monoclonais). Será entendido que o termo "combinação", conforme usado neste documento, refere-se ao ato de reunir a composição (compreendendo AQCs) e o fármaco antineoplásico. Portanto, este termo não exclui o uso de um fármaco antineoplásico em outro momento durante o curso da terapia do câncer, se o referido uso não tiver o objetivo de usar o fármaco antineoplásico em combinação com a composição reivindicada.

[048] Em uma modalidade, a composição é para uso como uma monoquimioterapia. As referências a “monoquimioterapia” referem-se ao tratamento de uma doença proliferativa celular, como o câncer, pelo uso de um único fármaco químico. Conforme discutido neste documento, as composições da invenção têm um efeito quimioterápico próprio, sem a necessidade de serem usadas em combinação com outros fármacos e, portanto, podem ser usadas como uma monoterapia, em particular uma monoquimioterapia no contexto do tratamento do câncer.

[049] As referências a um "distúrbio proliferativo celular" referem-se a um distúrbio que resulta no crescimento novo e anormal de células ou um crescimento de células anormais sem controle fisiológico. Isso pode resultar em uma massa não estruturada, ou seja, um tumor. Em uma modalidade, o distúrbio proliferativo celular é um tumor e/ou câncer. As composições da invenção podem ser usadas para tratar distúrbios proliferativos celulares, incluindo, mas não se limitando a, tumores primários, metástases e condições pré-cancerosas (estágios pré-cancerígenos).

[050] Os cânceres podem incluir, mas não estão limitados a: baço, câncer colorretal e/ou cólon, carcinomas de cólon, carcinomas de ovário, câncer de ovário, câncer de endométrio, câncer de mama, carcinomas de útero, câncer de pulmão, câncer de estômago, câncer de esôfago, câncer de fígado, carcinomas do pâncreas, câncer de rim, câncer de bexiga, câncer de próstata, câncer testicular, câncer ósseo, câncer de tireoide, câncer de pele, como melanoma, sarcoma, sarcomas de Kaposi, cânceres cerebrais, como glioma, meduloblastoma ou neuroblastomas, cânceres de sangue, como linfomas e leucemias, miossarcomas e carcinoma de cabeça e pescoço. Em uma modalidade, o câncer é selecionado de câncer de pulmão, mama, cólon ou cérebro (em particular glioblastoma). Em uma outra modalidade, o câncer é câncer cerebral, em particular câncer cerebral selecionado de glioma (tal como glioblastoma multiforme, oligodendroglioma, ependimoma, glioma do tronco cerebral), craniofaringioma, hemangioblastoma, meningioma maligno, tumores da região pineal e schwannoma vestibular. Em ainda outra modalidade, o câncer cerebral é glioma, em particular glioblastoma.

[051] A presente invenção tem uso particular no tratamento de cânceres/tumores com uma mutação RAS, como uma mutação KRAS, NRAS ou HRAS, em particular mutações KRAS. Foi demonstrado que tais mutações causam estresse oxidativo nas células do tumor, o que resulta em altos níveis de ROS, por exemplo, ver Shaw et al. (2011) PNAS 108 (21): 8773-8778. Conforme descrito neste documento, AQCs que consistem em 5 átomos são potentes em células que compreendem níveis elevados de ROS. Portanto, em uma modalidade, o distúrbio proliferativo celular (por exemplo, câncer e/ou tumor) compreende uma mutação RAS.

Em uma outra modalidade, a mutação RAS é selecionada dentre uma mutação KRAS, NRAS ou HRAS, em particular uma mutação KRAS. Será entendido que tais cânceres/tumores também podem ser referidos como um câncer mutante RAS, por exemplo, um câncer ou tumor mutante KRAS, HRAS ou NRAS. Em ainda outra modalidade, a mutação RAS é uma mutação de ativação, ou seja, a mutação causa aumento ou atividade constitutiva de uma proteína RAS. Note-se que, à luz do mecanismo de ação dos AQCs da invenção, a composição pode ser usada para tratar células cancerosas mutantes RAS, independentemente da mutação. Isto está em contraste com as terapias atuais que são específicas para mutações particulares dos genes RAS (em particular o gene KRAS).

[052] A família de proteínas RAS são GTPases que hidrolisam GTP em GDP, permitindo a ativação de várias vias de sinalização a jusante. Por exemplo, o KRAS demonstrou estar envolvido na via da quinase ativada por mitogênio. Mutações comuns no KRAS reduzem sua função intrínseca de GTPase, evitando a hidrólise de GTP em GDP, bloqueando assim o KRAS em seu estado ativo. Isso resulta na ativação constitutiva de vias de sinalização a jusante que podem conduzir a oncogênese.

[053] Muitas mutações RAS são conhecidas na técnica e as mutações KRAS são as mutações oncogênicas mais frequentes no câncer humano. Um câncer compreende uma mutação RAS se uma ou mais das células no câncer compreendem uma mutação RAS. Sujeitos com mutações RAS podem ser identificados por métodos conhecidos na técnica, como PCR, sequenciamento de ácido nucleico, métodos de PCR específicos de alelo, análise de polimorfismo conformacional de fita simples,

análise de curva de fusão, hibridização de sonda, pirossequenciamento (ou seja, sequenciamento de extensão de nucleotídeo), genotipagem e outros métodos de sequenciamento (por exemplo, ver Anderson (2011) Expert Rev Mol Diagn. 11 (6): 635-642 e Ogino et al. (2005) J. Mol. Diagn. 7: 413-421). Conforme mostrado neste documento, AQCs compreendendo 5 átomos tiveram um efeito tóxico na linhagem celular A549, que demonstrou compreender uma mutação KRAS (como KRAS G12S onde o resíduo de glicina na posição 12 sofre mutação). Além disso, as células que compreendem uma mutação HRAS (HRasV12 onde uma mutação do resíduo de valina na posição 12 foi mutada) foram mais sensíveis aos efeitos tóxicos de AQCs compreendendo 5 átomos em comparação com as células controle.

[054] Estima-se que 30% de todos os cânceres humanos carreguem uma mutação RAS. Por exemplo, 88% dos adenocarcinomas ductais pancreáticos, 52% dos cânceres colorretais, 43% dos mielomas múltiplos, 32% dos adenocarcinomas pulmonares, 28% dos melanomas, 25% dos cânceres endometriais, 13% dos cânceres de tireoide, 12% dos cânceres de estômago, 11% das leucemias mielógenas agudas, 11% dos cânceres de bexiga, 6% dos carcinomas de células escamosas de cabeça e pescoço e 2% dos cânceres de mama são considerados portadores de mutações RAS (dados compilados da Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE); o International Cancer Genome Consortium (ICGC); e The Cancer Genome Atlas Data Portal (TCGA)). Portanto, em uma modalidade, o distúrbio proliferativo celular (em particular o distúrbio proliferativo celular com uma mutação RAS) é selecionado dentre câncer pancreático, colorretal, no sangue, de pulmão, de pele, endometrial, de tireoide, de estômago, de bexiga, de cabeça e pescoço ou de mama. Em uma outra modalidade, o distúrbio proliferativo celular (em particular o distúrbio proliferativo celular com uma mutação RAS) é selecionado dentre câncer pancreático, colorretal, no sangue, de pulmão, de pele, endometrial, de tireoide, de estômago, de bexiga ou de cabeça e pescoço.

[055] Em uma modalidade, o distúrbio proliferativo celular é câncer pancreático, por exemplo, adenocarcinoma ductal pancreático, particularmente um câncer pancreático mutante RAS, por exemplo, um adenocarcinoma ductal pancreático mutante RAS. Em uma modalidade alternativa, o distúrbio proliferativo celular é o câncer colorretal, particularmente um câncer colorretal mutante RAS. Em uma modalidade alternativa, o distúrbio proliferativo celular é câncer no sangue, por exemplo, mieloma múltiplo ou leucemia mieloide aguda, particularmente um câncer no sangue mutante RAS, por exemplo, um mieloma múltiplo mutante RAS ou leucemia mieloide aguda mutante RAS. Em uma modalidade alternativa, o distúrbio proliferativo celular é câncer de pulmão, por exemplo, câncer de pulmão de células não pequenas, como adenocarcinoma pulmonar, particularmente um câncer de pulmão mutante RAS, por exemplo, um câncer de pulmão de células não pequenas mutante RAS, como um adenocarcinoma pulmonar mutante RAS. Em uma modalidade alternativa, o distúrbio proliferativo celular é câncer de pele, por exemplo, melanoma, em particular um câncer de pele mutante RAS, por exemplo, um melanoma mutante RAS. Em uma modalidade alternativa, o distúrbio proliferativo celular é câncer endometrial, em particular um câncer endometrial mutante RAS. Em uma modalidade alternativa, o distúrbio proliferativo celular é câncer de tireoide, em particular, um câncer de tireoide mutante RAS. Em uma modalidade alternativa, o distúrbio proliferativo celular é câncer de estômago, em particular um câncer de estômago mutante RAS. Em uma modalidade alternativa, o distúrbio proliferativo celular é câncer de bexiga, em particular, um câncer de bexiga mutante RAS. Em uma modalidade alternativa, o distúrbio proliferativo celular é câncer de cabeça e pescoço, por exemplo, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, em particular um câncer de cabeça e pescoço mutante RAS, por exemplo, um carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço mutante RAS.

[056] A presente invenção tem uso particular no tratamento de cânceres com baixa acessibilidade a fármacos, tais como grandes tumores com um baixo nível de vascularização ou tumores cerebrais que são separados do sistema circulatório pela barreira sangue-cérebro. Isso se deve à carga neutra e ao pequeno tamanho dos AQCs terapêuticos, que consistem em apenas 5 átomos, permitindo que eles acessem áreas de um tumor ou câncer que não são facilmente acessíveis aos fármacos antineoplásicos tradicionais. A evidência é fornecida neste documento que mostra a capacidade de AQCs consistindo em 5 átomos para penetrar nas regiões hipóxicas centrais de esferoides de tumor multicelular.

[057] Prevenir e tratar a metástase do câncer é uma parte fundamental do tratamento do câncer para prevenir cânceres secundários e recaídas. Foi surpreendentemente descoberto que as composições da invenção têm um efeito benéfico adicional no tratamento de metástases de câncer, bem como no tumor primário (Figura 14). Portanto, de acordo com um aspecto da invenção, é fornecida a composição conforme descrita neste documento (em particular, uma composição compreendendo clusters quânticos atômicos (AQCs) consistindo em 5 átomos de metal de transição de valência zero), para uso na prevenção e/ou tratamento de metástases, tais como metástases em linfonodos, em particular para tratar e/ou prevenir metástases de câncer de pulmão. De acordo com outro aspecto da invenção, é fornecida a composição conforme descrito neste documento, para uso na prevenção e/ou tratamento de metástases de câncer em linfonodos.

[058] Em outra modalidade, o linfonodo é um nó mediastinal. Os referidos nódulos mediastinais são um grupo de nódulos linfáticos localizados na cavidade torácica do corpo.

Terapia de Combinação

[059] As composições descritas neste documento podem ser usadas em combinação com AQCs consistindo em 3 átomos de metal de transição de valência zero. Verificou-se que o tamanho dos AQCs consistindo em 3 átomos de metal de transição de valência zero permite que eles se intercalem em DNA e resultem na descompactação da cromatina. Isso pode, portanto, ser usado para aumentar a suscetibilidade das células tratadas à radiação e aprimorar a eficácia da terapia de radiação.

[060] Em uma modalidade, a composição (isto é, compreendendo AQCs consistindo em 5 átomos de metal de transição de valência zero) e AQCs consistindo em 3 átomos de metal de transição de valência zero são administrados simultaneamente. Nesta modalidade, os dois agentes são administrados ao mesmo tempo ou substancialmente ao mesmo tempo. Também podem ser administrados pela mesma via e, opcionalmente, na mesma composição. Alternativamente, eles podem ser administrados por vias diferentes, isto é, separadamente, mas ao mesmo tempo ou substancialmente ao mesmo tempo.

[061] Em uma modalidade alternativa, a composição e os AQCs consistindo em 3 átomos de metal de transição de valência zero são administrados sequencialmente. Nesta modalidade, os dois agentes são administrados em momentos diferentes de modo que um dos agentes seja administrado antes do segundo agente. Por exemplo, a composição pode ser administrada antes ou depois dos AQCs que consistem em 3 átomos de metal de transição de valência zero. Eles podem ser administrados pelas mesmas vias ou por vias diferentes.

[062] De acordo com outro aspecto da invenção, é fornecida uma composição compreendendo AQCs consistindo em 3 e 5 átomos de metal de transição de valência zero em combinação com terapia de radiação para uso no tratamento de um distúrbio proliferativo celular. Em uma modalidade, a composição consiste em AQCs consistindo em entre 2 e 5 átomos de metal de transição de valência zero. Em uma outra modalidade, a composição consiste essencialmente em AQCs consistindo em 3 e 5 átomos de metal de transição de valência zero.

[063] Os presentes inventores descobriram surpreendentemente que AQCs consistindo em 5 átomos têm um efeito catalítico na oxidação do tiol, resultando na morte celular. Portanto, esses AQCs podem ser usados por conta própria como uma terapia de câncer e, portanto, em uma modalidade, as composições descritas neste documento não incluem fármacos antineoplásicos adicionais.

[064] Em uma modalidade, as composições da presente invenção podem incluir ou ser usadas em combinação com agentes terapêuticos adicionais. Esses agentes podem ser agentes ativos que são usados em conjunto com a terapia do câncer, tais como agentes usados como tratamentos paliativos para melhorar os efeitos colaterais indesejados. Portanto, em uma modalidade, o agente terapêutico adicional é um agente usado como um tratamento paliativo. Em uma outra modalidade, o tratamento paliativo é selecionado dentre o grupo consistindo em: agentes antieméticos, medicamentos destinados a aliviar a dor, como opioides, medicamentos usados para diminuir os níveis elevados de ácido úrico no sangue, como alopurinol ou rasburicase, antidepressivos, sedativos, fármacos anticonvulsivos, laxantes, antidiarreicos e/ou antiácidos.

[065] Em uma modalidade, o agente terapêutico adicional não é um fármaco antineoplásico. Em uma modalidade alternativa, o agente terapêutico adicional é um agente antineoplásico. Em uma modalidade, o agente antineoplásico é selecionado dentre o grupo consistindo em: agentes alquilantes (por exemplo, análogos da mostarda de nitrogênio, nitrosoureias, alquil sulfonatos, compostos contendo platina, etileminas e imidazotetrazinas), antibióticos citotóxicos (por exemplo, antraciclinas, actinomicinas), alcaloides de plantas e outros produtos naturais (por exemplo, derivados de camptotecina, epipodofilotoxinas, taxanos e alcaloides de vinca), antimetabólitos (por exemplo, análogos de citidina, análogos de ácido fólico, análogos de purina, análogos de pirimidina, derivados de ureia) e medicamentos para terapia direcionada (por exemplo, inibidores de quinase e anticorpos monoclonais).

[066] Em uma modalidade, a composição e o agente terapêutico adicional são administrados simultaneamente. Nesta modalidade, os dois agentes são administrados ao mesmo tempo ou substancialmente ao mesmo tempo. Também podem ser administrados pela mesma via e, opcionalmente, na mesma composição.

Alternativamente, eles podem ser administrados por vias diferentes, isto é, separadamente, mas ao mesmo tempo ou substancialmente ao mesmo tempo.

[067] Em uma modalidade alternativa, a composição e o agente terapêutico adicional são administrados sequencialmente. Nesta modalidade, os dois agentes são administrados em momentos diferentes de modo que um dos agentes seja administrado antes do segundo agente. Eles podem ser administrados pelas mesmas vias ou por vias diferentes.

[068] Em uma modalidade, a composição é administrada antes do agente terapêutico adicional. Em uma modalidade alternativa, a composição é administrada após o agente terapêutico adicional.

Terapia de Radiação

[069] A terapia de radiação (também conhecida como radioterapia) usa altas doses de radiação para danificar o DNA celular e, portanto, matar as células cancerosas e reduzir os tumores. Essa terapia pode ser na forma de um feixe externo ou como terapia de radiação interna. A escolha da terapia de radiação pode depender do tipo de câncer, tamanho do tumor, localização do tumor, bem como outros fatores, como idade, estado geral de saúde e histórico médico do paciente e outros tipos de tratamento contra o câncer usados.

[070] A terapia de radiação é administrada em mais de 50% de todos os cânceres em todo o mundo e é de particular importância nos países em desenvolvimento e de renda média. No entanto, a eficácia da terapia de radiação é limitada por vários fatores, incluindo danos ao tecido saudável circundante, proximidade de órgãos próximos e tumores que desenvolvem resistência à radiação.

Portanto, há uma necessidade significativa não atendida de agentes para melhorar a eficácia da terapia de radiação.

[071] A aplicação de radioterapia em células cancerosas resulta em um aumento na produção de ROS. Conforme mostrado pela evidência fornecida neste documento, o efeito de AQCs consistindo em 5 átomos é potencializado na presença de ROS. Portanto, as composições da presente invenção são particularmente adequadas como agentes terapêuticos que aumentam a eficácia da terapia de radiação.

[072] De acordo com um aspecto da invenção, é fornecida a composição conforme descrito neste documento, em combinação com terapia de radiação para uso no tratamento de um distúrbio proliferativo celular, como o câncer.

[073] A terapia de radiação (também conhecida como radioterapia) usa altas doses de radiação para danificar o DNA celular e, portanto, matar as células cancerosas e reduzir os tumores. Essa terapia pode ser na forma de um feixe externo ou como terapia de radiação interna. A escolha da terapia de radiação pode depender do tipo de câncer, tamanho do tumor, localização do tumor e também de outros fatores, como idade, saúde geral e histórico médico do paciente e outros tipos de tratamento de câncer usados.

[074] De acordo com um aspecto da invenção, é fornecido o uso de uma composição conforme descrito neste documento, como um agente de sensibilização de radioterapia. De acordo com outro aspecto da invenção, é fornecido o uso da composição conforme descrito neste documento, como um agente de sensibilização de terapia de radiação para células proliferativas. Será entendido que o termo "agente de sensibilização de radioterapia", também referido como "radiossensibilizadores", refere-se a um fármaco que é usada para potencializar/aumentar o efeito citotóxico da terapia de radiação. Um câncer ou tumor afetado pela terapia de radiação é denominado "radiossensível".

[075] De acordo com outro aspecto, a invenção fornece uma composição que compreende clusters quânticos atômicos (AQCs) consistindo em 5 átomos de metal de transição de valência zero para uso como um agente de dessensibilização de terapia de radiação para células não proliferativas.

[076] As composições compreendendo clusters quânticos atômicos (AQCs) consistindo em 5 átomos de metal de transição de valência zero podem ser usadas para proteger células não proliferativas (como não em divisão) da terapia de radiação.

Será entendido que o termo "agente dessensibilizante da terapia de radiação", também referido como "radiodessensibilizantes", refere-se a um fármaco que é usado para reduzir/diminuir o efeito citotóxico da terapia de radiação.

[077] As composições da invenção são, portanto, particularmente vantajosas quando usadas em combinação com a terapia de radiação porque têm um efeito duplo de aumentar o efeito da terapia de radiação em células proliferativas (isto é, células cancerosas), enquanto também protegem as células não proliferativas (isto é, células não doentes) da radiação prejudicial. As referências a "proliferação" serão entendidas por um versado na técnica. Conforme usado neste documento, "células proliferativas" refere-se a células em proliferação celular, por exemplo, crescimento e divisão celular.

Em particular, a invenção é usada para direcionar células cancerosas que têm proliferação celular rápida, anormal e/ou não controlada. Em uma modalidade, as células proliferativas são células cancerosas, células pré-cancerosas ou outras células anormais de divisão rápida em um sujeito. Além disso, conforme usado neste documento, "células não proliferativas" se refere a células que não estão sofrendo proliferação celular. Essas células também podem ser descritas como "em repouso", "detidas", "quiescentes", "sem divisão", "sem ciclo" ou "células G0 ". Em uma modalidade, as células não proliferativas são células não cancerosas.

[078] A terapia de radiação pode ser na forma de um feixe externo ou como terapia de radiação interna.

[079] Em uma modalidade, a terapia de radiação compreende irradiação de feixe externo. A radioterapia por feixe externo usa uma fonte de radiação externa ao paciente, normalmente um radioisótopo, como Cobalto-60 (60Co), Césio-137 (137Cs) ou uma fonte de raios-X de alta energia, como uma máquina aceleradora linear (LINAC). A fonte externa produz um feixe colimado direcionado ao paciente até o sítio do tumor. O efeito adverso da irradiação de tecido saudável pode ser reduzido, mantendo uma determinada dose de radiação no tecido do tumor, projetando o feixe de radiação externa no paciente em uma variedade de ângulos de “gantry” com os feixes convergindo no sítio do tumor.

[080] Exemplos de tratamento de terapia de radiação externa incluem, mas não está limitado a radioterapia conformada, radioterapia modulada por intensidade (IMRT), radioterapia guiada por imagem (IGRT), radioterapia 4D (4D-RT), radioterapia estereotáxica e radiocirurgia, terapia de prótons, radioterapia por feixe de elétrons e radioterapia adaptativa.

[081] Em uma modalidade alternativa, a terapia de radiação compreende terapia de radiação interna. Nesta modalidade, um agente radiofarmacêutico é administrado a um paciente e colocado na área a ser tratada. Em uma modalidade, o agente radiofarmacêutico compreende um radioisótopo emissor de radiação. Os radioisótopos são bem conhecidos por um versado na técnica e podem compreender um radioisótopo metálico ou não metálico.

[082] Radioisótopos metálicos adequados incluem, mas não estão limitados a: Actínio-225, Antimônio-124, Antimônio-125, Arsênico-74, Bário-103, Bário-140, Berílio-7, Bismuto-206, Bismuto-207, Bismuto-212, Bismuto-213, Cádmio-109, Cádmio-115m, Cálcio-45, Cério-139, Cério-141, Cério-144, Césio-137, Cromo-51, Cobalto-55, Cobalto-56, Cobalto-57, Cobalto-58, Cobalto-60, Cobalto-64, Cobre-60, Cobre-62, Cobre-64, Cobre-67, Erbio-169, Európio-152, Gálio-64, Gálio-67, Gálio-68, Gadolínio-153, Gadolínio-157, Ouro-195, Ouro-199, Háfnio-175, Háfnio-175-181, Hólmio-166, Índio-110, Índio-111, Irídio-192, Ferro-55, Ferro-59, Crípton-85, Chumbo-

203, Chumbo-210, Lutécio-177, Manganês-54, Mercúrio-197, Mercúrio-203, Molibdênio-99, Neodímio-147, Netúnio-237, Níquel-63, Nióbio-95, Ósmio-185+191, Paládio-103, Paládio-109, Platina-195m, Praseodímio-143, Promécio-147, Promécio- 149, Protactínio-233, Rádio-226, Rênio-186, Rênio-188, Rubídio-86, Rutênio-97, Rutênio-103, Rutênio-105, Rutênio-106, Samário-153, Escândio-44, Escândio-46, Escândio-47, Selênio-75, Prata-10m, Prata-111, Sódio-22, Estrôncio-85, Estrôncio- 89, Estrôncio-90, Enxofre-35, Tântalo-182, Tecnécio-99m, Telúrio-125, Telúrio-132, Tálio-204, Tório-228, Tório-232, Tálio-170, Estanho-113, Estanho-114, Estanho- 117m, Titânio-44, Tungstênio-185, Vanádio-48, Vanádio-49, Itérbio-169, Ítrio-86, Ítrio- 88, Ítrio-90, Ítrio-91, Zinco-65, Zircônio-89 e Zircônio-95.

[083] Radioisótopos não metálicos adequados incluem, mas não estão limitados a: Iodo-131, Iodo-125, Iodo-123, Fósforo-32, Astatina-211, Fluorina-18, Carbono-11, Oxigênio-15, Bromo-76 e Nitrogênio-13.

[084] O tipo de radiação que é adequado para uso na presente invenção pode variar. Em uma modalidade, a terapia de radiação compreende radiação eletromagnética ou radiação de partículas. A radiação eletromagnética inclui, mas não está limitada a raios-x e raios gama. A radiação de partículas inclui, mas não está limitada a feixes de elétrons (partículas beta), partículas alfa, feixes de prótons, feixes de nêutrons e mésons pi negativos.

[085] Em uma modalidade, a terapia de radiação compreende braquiterapia.

Na braquiterapia, as fontes de radiação são colocadas diretamente no sítio do câncer ou tumor. Isso tem a vantagem de que a irradiação afeta apenas uma área muito localizada, minimizando assim a exposição à radiação de tecidos saudáveis. Além disso, isso permite que o tumor seja tratado com doses muito altas de radiação localizada, enquanto reduz a probabilidade de danos desnecessários aos tecidos saudáveis em volta.

[086] Em uma modalidade, a braquiterapia compreende tratamento intracavitário ou tratamento intersticial. O tratamento intracavitário consiste na colocação de recipientes que contêm fontes de radiação nas cavidades corporais onde o tumor está presente ou próximo de onde o tumor está presente. O tratamento intersticial consiste na colocação de recipientes que contêm fontes radioativas diretamente em um tumor ou tecido corporal. Essas fontes radioativas podem permanecer no paciente permanentemente. Na maioria das vezes, as fontes radioativas são removidas do paciente após vários dias. Os recipientes podem compreender agulhas, sementes, fios ou cateteres.

[087] Em uma modalidade, a terapia de radiação compreende terapia de radioisótopo sistêmico. Na terapia sistêmica com radioisótopos, os radiofármacos que compreendem radioisótopos são administrados por infusão ou ingestão. Os radioisótopos administrados podem ser direcionados devido às propriedades químicas do isótopo, por exemplo, o radioiodo, que é preferencialmente absorvido pela glândula tireoide. O direcionamento também pode ser alcançado pela conjugação do radioisótopo a uma porção de direcionamento, como uma molécula ou anticorpo que se liga ao tecido alvo. Em uma modalidade, o agente radiofarmacêutico compreende um conjugado radioativo. Em uma outra modalidade, o conjugado radioativo é um anticorpo marcado radioativamente.

[088] Em uma modalidade, o agente radiofarmacêutico é administrado por via oral, parenteral, intraperitoneal, intravenosa, intra-arterial, transdérmica, sublingual, intramuscular, retal, transbucal, intranasal, por inalação, vaginal, intraocular, local, subcutânea, intra-adiposal, intraarticular ou intratecalmente. Em uma modalidade, o agente radiofarmacêutico está em uma forma de dosagem de liberação lenta.

[089] A escolha da terapia de radiação pode depender do tipo de câncer, tamanho do tumor, localização do tumor e outros fatores, como idade, saúde geral e histórico médico do paciente e outros tipos de tratamento de câncer usados.

[090] Em uma modalidade, a composição e a terapia de radiação são aplicadas simultaneamente. Em uma modalidade alternativa, a composição e a terapia de radiação são aplicadas sequencialmente, preferencialmente em que a composição é aplicada antes da terapia de radiação. Se os agentes forem administrados separadamente, a radioterapia pode ser administrada enquanto a composição ainda é eficaz, isto é, a composição e a radioterapia são administradas dentro de um período que exercerá um efeito sinérgico ou pelo menos combinado na administração a um paciente. Em uma modalidade, a composição é administrada não mais de 6 horas antes da radioterapia, tal como entre 1 e 6 horas antes da radioterapia. Em uma outra modalidade, a composição é administrada cerca de 6 horas, cerca de 5 horas, cerca de 4 horas, cerca de 3 horas, cerca de 2 horas ou cerca de 1 hora antes da terapia de radiação.

[091] Em uma modalidade, o efeito terapêutico da composição e da terapia de radiação é sinérgico. Em uma modalidade, a composição sensibiliza as células cancerosas no paciente à radioterapia.

[092] Em uma modalidade, as composições da invenção são capazes de aprimorar a eficácia da terapia de radiação pelo menos duas vezes, tal como três vezes, quatro vezes, cinco vezes ou mais, em comparação com a eficácia da terapia de radiação para o tratamento do distúrbio sozinha.

Composições Farmacêuticas

[093] De acordo com um aspecto da invenção, é fornecida uma composição farmacêutica que compreende as composições descritas neste documento.

[094] As composições e combinações, quando apropriado, podem ser formuladas como uma composição farmacêutica, opcionalmente compreendendo um excipiente, diluente ou carreador farmaceuticamente aceitável. O carreador, diluente e/ou excipiente deve ser "aceitável" no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da composição e não prejudicial para o seu receptor.

[095] Exemplos de carreadores farmaceuticamente aceitáveis podem incluir um ou mais de água, solução salina, solução de salina tamponada com fosfato, dextrose, glicerol, etanol e semelhantes, bem como combinações destes.

Carreadores, excipientes ou diluentes farmacêuticos adequados são descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences", de E. W. Martin. Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis podem compreender ainda quantidades menores de substâncias auxiliares, tais como agentes molhantes ou emulsionantes, conservantes ou tampões, que aumentam o prazo de validade ou eficácia das composições da invenção. As composições farmacêuticas também podem incluir antiaderentes, aglutinantes, revestimentos, desintegrantes, sabores, cores, lubrificantes, sorventes, conservantes, adoçantes, excipientes liofilizados (incluindo lioprotetores) ou auxiliares de compressão.

[096] As composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas em uma pluralidade de formas farmacêuticas de administração, por exemplo, sólidas (como comprimidos, pílulas, cápsulas, grânulos etc.) ou líquidas (como soluções, suspensões, xaropes, pomadas, cremes, géis ou emulsões).

[097] As composições farmacêuticas da invenção podem compreender uma quantidade terapeuticamente eficaz. A quantidade terapeuticamente eficaz (isto é, a quantidade que produz um efeito para ajudar a curar ou curar o distúrbio a ser tratado) que pode ser administrada a um sujeito dependerá de vários fatores, como o estado da doença, a idade, o sexo e o peso de o indivíduo e a capacidade da composição farmacêutica de provocar uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é também aquela em que quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais da composição farmacêutica da invenção são superados pelos efeitos terapeuticamente benéficos.

[098] Em uma modalidade, os AQCs estão presentes em uma solução aquosa. Em uma outra modalidade, a solução aquosa compreende oxigênio dissolvido, tal como pelo menos 2 vezes, ou pelo menos 3 vezes, a concentração de

AQCs (em particular a concentração de AQCs compreendendo 5 átomos de metal de transição de valência zero) presente na mistura.

[099] Em uma modalidade, a composição é administrada (ou é formulada para administração) por qualquer modo adequado de distribuição, como por via intravenosa, intra-arterial, intracardial, intracutânea, subcutânea, transdérmica, interperitoneal, intramuscular, oral, lingual, sublingual, bucal, intrarretal ou por enema.

[0100] As composições da invenção podem ser administradas diretamente a um sítio alvo (isto é, o sítio do tumor) ou sistemicamente (isto é, no sistema circulatório). A administração direcionada tem a vantagem de focar o efeito terapêutico da composição no câncer ou tumor a ser tratado. Essa administração também minimiza os efeitos colaterais. No entanto, as composições da invenção também são adequadas para administração sistêmica porque o modo de ação garante que a apoptose celular ocorra apenas em células com um alto nível de ROS. Os níveis de ROS são altos em células proliferativas, por exemplo, células cancerosas. No entanto, em células normais não proliferativas, os níveis de ROS são relativamente baixos, portanto, AQCs consistindo em 5 átomos terão menos efeito sobre as células normais, o que ajuda a minimizar os efeitos colaterais adversos.

[0101] Em uma modalidade, a composição é administrada por via oral, intravenosa ou subcutânea. Em uma outra modalidade, a composição é administrada por via oral. A vantagem das composições da presente invenção é que elas podem ser esgotadas de forma relativamente rápida, portanto, quaisquer efeitos colaterais podem ser minimizados porque os AQCs não persistem no corpo por um período prolongado.

[0102] Uma aplicação tópica também é possível (por exemplo, para o tratamento de melanomas). Uma forma particular de aplicação tópica consiste em introduzir a composição em um sistema carreador, em particular um sistema de distribuição de fármaco, e implantar o referido sistema carreador nos tecidos cancerosos, em que o referido sistema carreador então libera a referida composição especificamente no sítio do tecido canceroso. Desta forma, é possível evitar os efeitos colaterais, como podem ocorrer no caso de administração sistêmica, isto é, reduzir a tensão geral do corpo.

Usos

[0103] De acordo com um aspecto da invenção, é fornecido o uso da composição conforme descrito neste documento para o tratamento de um distúrbio proliferativo celular.

[0104] De acordo com um aspecto da invenção, é fornecido o uso da composição conforme descrito neste documento para tratar e/ou prevenir metástases de câncer. Em uma modalidade, a composição é usada para tratar e/ou prevenir metástases de câncer em linfonodos. Em uma outra modalidade, a composição é usada para tratar e/ou prevenir metástases de câncer de pulmão.

[0105] De acordo com um aspecto da invenção, é fornecido o uso de uma composição compreendendo clusters quânticos atômicos (AQCs) consistindo em 5 átomos de metal de transição de valência zero como um agente de sensibilização de terapia de radiação para células proliferativas. O referido agente pode ser usado para o tratamento de um distúrbio proliferativo celular.

[0106] De acordo com um aspecto da invenção, é fornecido o uso da composição, conforme descrita neste documento, em combinação com terapia de radiação, para o tratamento de um distúrbio proliferativo celular.

[0107] De acordo com um aspecto da invenção, é fornecido o uso de uma composição, conforme descrita neste documento, na fabricação/preparação de um agente de sensibilização de terapia de radiação para células proliferativas.

[0108] De acordo com um aspecto da invenção, é fornecido o uso de uma composição compreendendo clusters quânticos atômicos (AQCs) consistindo em 5 átomos de metal de transição de valência zero como um agente de dessensibilização de terapia de radiação para células proliferativas.

[0109] De acordo com um aspecto da invenção, é fornecido o uso da composição, conforme descrita neste documento, para o preparo de uma composição farmacêutica para o tratamento de um distúrbio proliferativo celular.

[0110] De acordo com um aspecto da invenção, é fornecido o uso de uma composição, conforme descrita neste documento, na fabricação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio proliferativo celular.

Clusters Quânticos Atômicos (AQCs)

[0111] Os AQCs descritos neste documento são estáveis, isto é, conservam o número de átomos e, portanto, suas propriedades, ao longo do tempo, de modo que podem ser isolados e manipulados como qualquer outro composto químico. Os AQCs podem ser conservados por meses, até anos, sem a necessidade de um estabilizador externo.

[0112] Em uma modalidade, os átomos de metal são selecionados dentre prata (Ag), ouro (Au), cobre (Cu), platina (Pt), ferro (Fe), cromo (Cr), paládio (Pd), níquel (Ni), ródio (Rh), chumbo (Pb), irídio (Ir), rutênio (Ru), ósmio (Os), cobalto (Co), titânio (Ti), vanádio (V) ou qualquer combinação destes. Em uma outra modalidade, os átomos de metal são selecionados dentre Ag, Au, Cu, Pt ou qualquer combinação destes. Em uma outra modalidade, os átomos de metal são selecionados dentre Ag, Cu ou Pt. Em ainda outra modalidade, os átomos de metal são Ag.

[0113] A mistura de AQCs pode ser sintetizada por uma variedade de métodos conhecidos na técnica, por exemplo, aqueles descritos em EP1914196, que é incorporado neste documento por referência.

[0114] A mistura também pode ser sintetizada usando o método descrito neste documento no Exemplo 1. Mais especificamente, é fornecido um método de síntese de AQCs de prata que compreende a condução do método em uma célula eletroquímica de três eletrodos compreendendo um eletrodo de hidrogênio como eletrodo de referência e dois eletrodos como o contador e eletrodo de trabalho, em que os eletrodos de prata compreendem uma área de superfície que é maior do que 5 cm2, tal como maior que 10 cm2, por exemplo, cerca de 17 cm2. Clusters de 5 átomos podem ser obtidos aplicando-se uma corrente continuamente crescente por cerca de 5 horas (300 minutos). Por exemplo, a corrente crescente pode compreender: etapa (i) uma corrente de cerca de 200-300 μA (por exemplo, cerca de 250 μA), etapa (ii) uma corrente de cerca de 430-530 μA (por exemplo, cerca de 480 μA), etapa (iii) uma corrente de cerca de 800-1200 μA (por exemplo, cerca de 1000 μA/1 mA), etapa (iv) uma corrente de cerca de 2.000-2400 μA (por exemplo, cerca de 2200 μA/2,2 mA) e/ou etapa (v) uma corrente de cerca de 3800-4200 μA (por exemplo, cerca de 4000 μA/4 mA) ou combinações de qualquer uma das etapas (i)-(v). Em uma modalidade, cada etapa é conduzida por pelo menos 30 minutos, por exemplo, por cerca de 1 hora.

Os eletrodos de prata podem ser polidos antes e/ou durante a síntese, por exemplo, usando lixa e/ou alumina. O método pode ser conduzido em água purificada e desarejada, tal como água desarejada MilliQ. Opcionalmente, qualquer excesso de íons Ag + pode ser removido pela adição de NaCl e precipitação e filtração subsequentes.

[0115] As referências a AQCs usadas neste documento incluem aqueles na forma de um hidrato, isto é, eles têm moléculas de água ligadas ao cluster por meio de ligação não covalente.

[0116] Conforme descrito neste documento, o mecanismo de aumento da oxidação de enxofre é exclusivo para AQCs consistindo em 5 átomos de metal porque o tamanho desses clusters permite a interação entre o átomo de enxofre e ROS.

Portanto, sem ser uma teoria ligada, será entendido que as composições da invenção podem não precisar estar completamente livres de AQCs consistindo em clusters de outros tamanhos (por exemplo, clusters compreendendo menos e/ou mais de 5 átomos de metal). Em uma modalidade, a composição compreende mais do que cerca de 50%, tal como mais do que cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 97%, cerca de 99% de AQCs consistindo em 5 átomos de metal de transição de valência zero. Em particular, mais do que cerca de 95% dos AQCs presentes na composição consistem em 5 átomos de metal de transição de valência zero. Em uma modalidade, a composição consiste essencialmente em AQCs consistindo 5 átomos de metal de transição de valência zero. Em uma outra modalidade, a composição consiste em AQCs consistindo em 5 átomos de metal de transição de valência zero.

[0117] Em uma modalidade da invenção, a composição é substancialmente livre de AQCs consistindo em mais de 5 átomos de metal de transição de valência zero, por exemplo, a composição pode conter menos de cerca de 10% molar (porcentagem molar com base no conteúdo AQC total da composição), tal como menos do que cerca de 7% molar, menos do que cerca de 5% molar, menos do que cerca de 2% molar, menos do que cerca de 1% molar ou menos do que cerca de 0,5% molar de AQCs consistindo em mais de 5 átomos de metal de transição de valência zero.

[0118] Em uma modalidade da invenção, a composição é substancialmente livre de AQCs consistindo em menos de 5 átomos de metal de transição de valência zero, por exemplo, a composição pode conter menos de cerca de 10% molar (porcentagem molar com base no conteúdo AQC total da composição), tal como menos do que cerca de 7% molar, menos do que cerca de 5% molar, menos do que cerca de 2% molar, menos do que cerca de 1% molar ou menos do que cerca de 0,5% molar de AQCs consistindo em menos de 5 átomos de metal de transição de valência zero. Os AQCs consistindo em menos de 5 átomos de metal de transição de valência zero incluem AQCs consistindo em 2, 3 ou 4 átomos de metal de transição de valência zero.

[0119] Em uma modalidade, a composição é substancialmente livre de íons metálicos. Os íons metálicos são freqüentemente um subproduto durante a síntese de AQCs. Estes podem ser removidos usando, por exemplo, NaCl. Será entendido que a referência aos íons metálicos é em relação aos íons do metal de transição contido nos AQCs.

[0120] Em uma modalidade, a composição contém menos do que cerca de 20 mol%, tal como menos do que cerca de 15 mol%, 10 mol%, 5 mol%, 2 mol%, 1 mol% ou 0,5 mol% de íons metálicos (isto é, íons livres do metal de transição usado para sintetizar os AQCs).

[0121] De acordo com um outro aspecto da invenção, é fornecida uma composição que compreende clusters quânticos atômicos (AQCs) consistindo em entre 2 e 5 átomos de metal de transição de valência zero, que é substancialmente livre (isto é, menos de 20%, 15%, 10%, 5%, 2%, 1%) de AQCs consistindo em mais de 5 átomos de metal de transição de valência zero e/ou íons metálicos. De acordo com um outro aspecto da invenção, é fornecida uma composição que compreende clusters quânticos atômicos (AQCs) consistindo em 5 átomos de metal de transição de valência zero, que é substancialmente livre (isto é, menos de 20%, 15%, 10%, 5%, 2%, 1%) de AQCs consistindo em mais de 5 átomos de metal de transição de valência zero e/ou menos de 5 átomos de metal de transição de valência zero e/ou íons metálicos.

[0122] Os métodos são conhecidos na técnica para purificar composições para remover AQCs consistindo em mais ou menos do que 5 átomos de metal de transição de valência zero. Por exemplo, conforme descrito em Porto et al. (2018) Adv Mater. 30 (33): e1801317. Tais métodos podem incluir: (i) aplicar uma solução compreendendo uma mistura de AQCs a um meio de separação, em que o referido meio de separação liga ou não liga AQCs consistindo em mais de 5 átomos de metal de transição de valência zero; e (ii) isolar AQCs consistindo em 5 átomos de metal de transição de valência zero.

[0123] Em uma modalidade, o meio de separação é usado em um método cromatográfico. A cromatografia é um método usado para separar uma mistura pela passagem de uma fase móvel compreendendo a mistura, por uma fase estacionária (por exemplo, compreendendo o meio de separação descrito neste documento). A mistura é separada com base em como os constituintes da fase móvel interagem com a fase estacionária. Será entendido que a fração retida ou descartada dependerá do conteúdo e se os 5 átomos de metal de transição de valência zero estão presentes.

Por exemplo, se o meio de separação retém AQCs consistindo em mais de 5 átomos de metal de transição de valência zero, então o eluato (que compreende AQCs consistindo em 5 ou menos átomos de metal de transição de valência zero) é coletado.

Alternativamente, se o meio de separação retém AQCs consistindo em 5 átomos de metal de transição de valência zero, então o eluato (que compreende AQCs consistindo em mais e/ou menos de 5 átomos de metal de transição de valência zero) é descartado. Em uma modalidade, o meio de separação está presente em uma coluna de cromatografia. Essas colunas de cromatografia estão disponíveis comercialmente.

[0124] Os meios de separação podem compreender, por exemplo, grupos funcionais que se ligam a AQCs de tamanhos particulares, como um grupo tiol que se liga a AQCs consistindo em mais de 3 átomos de metal de transição de valência zero.

Alternativamente, o grupo funcional pode compreender um grupo aromático, tal como um grupo aromático cíclico ou policíclico. Os meios de separação também podem compreender, por exemplo, ácido desoxirribonucleico (DNA) que é substancialmente de cadeia dupla. Verificou-se que clusters de três átomos de metal interagem com o DNA por meio de intercalação, que é estritamente dependente do número de átomos no cluster e independente do tipo de pares de bases (AT ou GC) da dupla hélice.

Portanto, o DNA pode ser usado para separar AQCs consistindo em 3 átomos de metal de transição de valência zero.

[0125] Em uma modalidade, o meio de separação é usado em um método de diálise. A diálise é um método de separação de moléculas com base em suas taxas de difusão através de uma membrana semipermeável. Por exemplo, a solução que compreende uma mistura de AQCs pode ser aplicada a um meio de separação e, em seguida, colocada em um dispositivo de diálise (por exemplo, um cassete de diálise ou tubo de diálise). Tais cassetes, tubos ou dispositivos de diálise estão disponíveis comercialmente. As membranas de diálise podem ser escolhidas com um peso molecular de corte escolhido de acordo com os requisitos da separação (por exemplo, de acordo com o peso molecular do DNA usado no meio de separação).

[0126] Será entendido que um ou mais dos métodos de purificação divulgados neste documento podem ser conduzidos em combinação e/ou repetidos uma ou mais vezes. A realização do método de purificação várias vezes pode aumentar a purificação da amostra e permitir que a purificação desejada seja alcançada.

Métodos de Tratamento

[0127] De acordo com um aspecto da invenção, é fornecido um método de prevenção e/ou tratamento de um distúrbio proliferativo celular compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição compreendendo clusters quânticos atômicos (AQCs) consistindo em 5 átomos de metal de transição de valência zero, para um paciente em necessidade desta. Em uma modalidade, o referido método não compreende o tratamento do paciente com um fármaco antineoplásico adicional.

[0128] De acordo com um aspecto da invenção, é fornecido um método de prevenção e/ou tratamento de um distúrbio proliferativo celular compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição descrita neste documento, a um paciente em necessidade deste.

[0129] De acordo com um aspecto da invenção, é fornecido um método de tratamento de um paciente com um distúrbio proliferativo celular compreendendo a administração de uma composição conforme descrita neste documento. As modalidades descritas anteriormente para as composições podem ser aplicadas aos referidos métodos de tratamento (por exemplo, tempo e modo de administração, formulação da composição, etc.).

[0130] De acordo com um aspecto da invenção, é fornecido um método de prevenção e/ou tratamento de metástases de câncer, compreendendo a administração de uma composição conforme descrita neste documento. Em uma modalidade, o método previne e/ou trata metástases de câncer em linfonodos. Em uma outra modalidade, o método previne e/ou trata metástases de câncer de pulmão.

[0131] Em uma modalidade, os métodos de tratamento descritos neste documento compreendem adicionalmente o tratamento do paciente com radioterapia, tal como após a administração da composição. Conforme descrito anteriormente, a composição da invenção tem uso particular como um agente de sensibilização de radioterapia.

[0132] Em uma modalidade, a composição é administrada por via oral, intravenosa ou subcutânea.

[0133] Em uma modalidade, a composição é administrada simultaneamente ou antes da terapia de radiação.

[0134] Em uma modalidade, o método compreende adicionalmente a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição compreendendo AQCs consistindo em 3 átomos de metal de transição de valência zero. Em uma modalidade, a composição compreendendo AQCs consistindo em 3 átomos de metal de transição de valência zero é administrada simultaneamente ou sequencialmente à composição compreendendo AQCs consistindo em 5 átomos de metal de transição de valência zero.

[0135] O paciente pode ser qualquer sujeito que sofre do distúrbio. Em uma modalidade, o paciente é um mamífero. Em uma outra modalidade, o mamífero é selecionado dentre um humano ou um camundongo.

[0136] Em uma modalidade, o efeito terapêutico da composição e da terapia de radiação é sinérgico. Em uma modalidade, a composição sensibiliza as células cancerosas no paciente à radioterapia.

[0137] O método compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de radiação. A quantidade de radiação usada na terapia de radiação é medida em unidades de Gray (Gy) e varia dependendo do tipo e estágio do câncer sendo tratado. Além disso, a dose total de radiação pode ser dividida em várias doses menores, conhecidas como “frações”, por um período de vários dias, a fim de minimizar os efeitos colaterais negativos. Um esquema de fracionamento típico para adultos é de 1,8 a 2 Gy por dia, cinco dias por semana. Um esquema de fracionamento típico para crianças é de 1,5 a 1,8 Gy por dia, cinco dias por semana.

[0138] Em uma modalidade, um total de pelo menos cerca de 10 Gy, como 15 Gy, 20 Gy, 25 Gy, 30 Gy, 35 Gy, 40 Gy, 45 Gy, 50 Gy, 55 Gy, 60 Gy, 65 Gy, 70 Gy, 75 Gy, 80 Gy, 85 Gy, 90 Gy, 95 Gy ou 100 Gy é administrado a um paciente em necessidade deste. O paciente pode receber radiação três, quatro ou cinco vezes por semana. Um curso completo de tratamento pode durar de uma a sete semanas, dependendo do tipo de câncer e do objetivo do tratamento. Em uma modalidade, a terapia de radiação ocorre ao longo de um período de pelo menos 2, 3 ou 4 semanas, como 2-6 semanas, como 2-4 semanas, ou 5-8 semanas, em particular, 5-7 semanas.

Por exemplo, um paciente pode receber uma dose de 2 Gy/dia durante cerca de 30 dias (isto é, 4-5 semanas).

[0139] Em uma modalidade, a radiação é administrada pelo menos uma vez por dia durante cinco dias consecutivos por semana. Por exemplo, a radiação é administrada em pelo menos frações de 2 Gy pelo menos uma vez por dia. Em uma modalidade, a radiação é administrada em dias alternados, três vezes por semana.

Por exemplo, a radiação é administrada em frações de 10 Gy em dias alternados, três vezes por semana.

[0140] Em uma modalidade, a terapia de radiação é hipofracionada. O hipofracionamento é um regime de tratamento que fornece doses mais altas de radiação em menos visitas. Em uma modalidade alternativa, a terapia de radiação é hiperfracionada. O hiperfracionamento é um regime de tratamento que divide a dose total em mais distribuições. Será apreciado que muitos outros fatores são considerados ao selecionar uma dose, incluindo se o paciente está recebendo quimioterapia, comorbidades do paciente, se a radioterapia está sendo administrada antes ou após a cirurgia e o grau de sucesso da cirurgia.

[0141] De acordo com outro aspecto, a invenção fornece um método de prevenção de danos às células não proliferativas em um paciente submetido a terapia de radiação, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição compreendendo AQCs consistindo em 5 átomos de metal de transição de valência zero ao referido paciente antes de terapia de radiação.

[0142] De acordo com um aspecto da invenção, é fornecido um método de tratamento de metástases, como metástases de linfonodos, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição compreendendo AQCs consistindo em 5 átomos de metal de transição de valência zero, a um paciente em necessidade deste, em combinação com terapia de radiação.

Kits

[0143] De acordo com um aspecto da invenção, é fornecido um kit de peças compreendendo: a composição, conforme descrita neste documento, opcionalmente em mistura com um adjuvante, diluente ou carreador farmaceuticamente aceitável. O kit de acordo com este aspecto da invenção pode ser usado no tratamento de um distúrbio proliferativo celular.

[0144] Em uma modalidade, o kit pode ser usado em combinação com terapia de radiação para o tratamento de um distúrbio proliferativo celular.

Aspectos Adicionais

[0145] De acordo com um aspecto da invenção, é fornecido um agente apoptótico compreendendo AQCs consistindo em 5 átomos de metal de transição de valência zero. O agente apoptótico pode compreender a composição, conforme descrita neste documento.

[0146] De acordo com outro aspecto da invenção, é fornecido um método para induzir a oxidação de tiol, que compreende a administração da composição, conforme descrita neste documento, opcionalmente em combinação com espécies reativas de oxigênio (ROS). Conforme descrito neste documento, AQCs consistindo em 5 átomos fornecem uma ponte catalítica entre ROS presentes na célula e átomos de enxofre em resíduos de cisteína de proteínas. Portanto, a composição da invenção pode ser usada para aumentar a oxidação do tiol. A adição de ROS dependeria se o alvo já continha ROS.

[0147] Os presentes inventores também forneceram evidências de que AQCs consistindo em 5 átomos têm um forte efeito bactericida. Portanto, de acordo com outro aspecto da invenção, é fornecida uma composição conforme descrita neste documento para uso no tratamento de uma doença causada por bactérias.

[0148] A invenção será agora exemplificada nos seguintes exemplos não limitativos.

ABREVIAÇÕES

[0149] Todas as unidades usadas neste documento devem ser entendidas com sua definição padrão conhecida na técnica (a menos que especificado de outra forma).

A549 linhagem celular de adenocarcinoma de pulmão humano Ag Prata Ag5 5 átomos de prata AQCA cluster quântico atômico

ATCC Coleta de Cultura do Tipo Americano

BBBB Barreira sangue-cérebro

B-CLL Leucemia linfocítica crônica-B

CDDP Cisplatina

Cul3 Culina 3

Cys Cisteína

DAPI 4′, 6-Diamidino-2-fenilindol

DHE Diidroetídio

DMEM Meio de Eagle Modificado por Dulbecco

DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen

GmbH

DTT Ditiotreitol

FBS Soro fetal de bovino

GBM Glioblastoma multiforme

GPx Glutationa peroxidase

GRX1 Glutaredoxina 1

GSH Glutationa

GSSG Dissulfeto de glutationa

H2O2 Peróxido de hidrogênio

HCT116 Linhagem celular de carcinoma colorretal humano

HEK293 Linhagem celular 293 de rim embrionário humano

HMOX1 Heme oxigenase-1

Keap1 proteína associada a ECH tipo Kelch 1

Luc Gene de luciferase de vagalume norte-americano

MCF7 Linhagem celular de adenocarcinoma de mama humana

MCTS Esferoide de tumor multicelular

MEC-1 Linhagem celular de leucemia linfocítica crônica-B

MM.1S Linhagem celular de mieloma múltiplo humano MRE Elemento responsivo a metal MT Metalotioneínas MTT brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio MTF-1 Fator de transcrição responsivo a metal 1 (MTF-1 NaCl Cloreto de sódio NAD(P)H Fosfato de dinucleotídeo de nicotinamida e adenina Neh Domínio de homologia de Nrf2-ECH NEM N-etilmaleimida NQO-1 quinona oxidorredutase de NAD(P)H Nrf2 Fator nuclear (derivado de eritroide 2) tipo 2 O2 Oxigênio PBS Tampão salino fosfato PFA Paraformaldeído RL Linhagem celular de linfoma não Hodgkin humano roGFP Proteína fluorescente verde sensível à redução-oxidação ROS Espécies reativas de oxigênio TEM Microscopia de elétron de transmissão U87 Linhagem celular multifome de glioblastoma humano XANES Absorção de raios-X próximo à estrutura da borda

MATERIAIS E MÉTODOS Reagentes e Materiais

[0150] A menos que especificado de outra forma, todos os reagentes foram adquiridos de Sigma Aldrich, Co., Espanha. Folhas de prata (99%) foram adquiridas de Goodfellow Cambridge Ltd., Huntingdon, Reino Unido. Nanopartículas de alumina (tamanho médio ≈ 50 nm) e almofadas de tecido foram adquiridas de Buehler, Düsseldorf, Alemanha.

[0151] A lixa (grão 1.000) foi proporcionada por Wolfcraft España SL, Madri, Espanha. Todas as soluções aquosas foram preparadas com água de grau MilliQ usando um sistema Direct-Q8UV da Millipore (Millipore Ibérica SA, Madri, Espanha).

As folhas de mica (muscovite grau V-1) foram adquiridas a SPI Supplies, West Chester, PA, EUA.

Absorção de raios-X próxima da estrutura da borda (XANES)

[0152] Os experimentos de XANES de borda S K (2470 eV) foram realizados na linha de luz SXS do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS, Campinas, Brasil), que está equipado com um monocromador de cristal duplo InSb (111) com abertura de fenda de 1 mm, para atingir uma resolução de cerca de 0,5 eV na borda S K. Os espectros de absorção de raios-X foram registrados no modo de fluorescência, coletando os raios-X emitidos das linhas de emissão S Kα1,2 (em 2309,5 e 2308,4 eV, respectivamente) para cada borda medida. Os experimentos de absorção foram realizados em vácuo de 10-8 mbar em temperatura ambiente, e em um suporte de amostras líquidas especial projetado ad-hoc para o experimento com espécies reativas de oxigênio, em temperatura ambiente e pressão atmosférica. A energia do fóton foi calibrada atribuindo o valor de 2481,5 eV ao máximo de Na2S2O3 (correspondente à referida esfera interna), de acordo com os critérios relatados anteriormente por Vairavamurthy (1998) Spectrochim. Acta. A. Mol. Biomol.

Spectrosc. 54: 2009–2017. Os espectros de XANES finais foram obtidos após subtração de fundo e normalização para a intensidade da borda posterior, seguindo o procedimento usual descrito em outra parte. A quantificação de XANES foi realizada com o software Athena e subsequente análise no software Origin lab. Para a caracterização da glutationa, uma fração da solução foi depositada por gotejamento em discos de carbono (Ted Pella, Inc.) para ter uma concentração de Ag ou S em um valor detectável. Para as amostras de tiorredoxina, elas foram cuidadosamente montadas em um suporte de amostras líquidas, projetado ad-hoc para este experimento. A solução de PBS foi usada como solvente em todas as misturas de reação com Tioredoxina, com o objetivo de reproduzir o mesmo pH intracelular e força iônica. As soluções do radical hidroxila foram preparadas pela reação de Fenton, com H2O2 e FeCl2.

Linhagens celulares

[0153] As linhagens celulares usadas no desenvolvimento deste trabalho incluíram: A549 (adenocarcinoma de pulmão humano, DSMZ Nº: ACC 107), A549 Luc-C8 (Bioware®), MCF7 (adenocarcinoma de mama humano, DSMZ Nº: ACC 115), HCT116 (carcinoma colorretal humano, ATCC Nº: CCL-247), HEK293 (rim, embrião de humano), U87-luc (glioblastoma multiforme humano, gentilmente fornecido por Joan Seoane), U251-Luc (glioblastoma humano, gentilmente fornecido por Joan Seoane), MM. 1S (mieloma múltiplo humano, ATCC Nº: CRL-2974), RL (linfoma não- Hodgkin humano, ATCC Nº: CRL-2261) e MEC-1 (leucemia linfocítica crônica-B humana, DSMZ, Nº: ACC 497). A549, A549-Luc, MCF7, U87-Luc e HCT116 são derivados de tumores sólidos e crescem aderentemente como uma monocamada, enquanto MM.1S, RL e MEC-1 são derivados de malignidades hematológicas e crescem em suspensão. As linhagens celulares A549, A549-Luc, U251-Luc e HEK293 foram mantidas em DMEM de baixa glicose (D6046, Sigma); Linhagens celulares MCF7 e U87-Luc em DMEM com alto teor de glicose (D5671, Sigma); HCT116, MM.1S e RL em Roswell Park Memorial Institute (RPMI) meio 1640 (R-5886, Sigma) e linhagem celular MEC-1 em mistura de DMEM/mistura de nutrientes F-12 de Ham a 1:1. O meio foi suplementado com 10% de soro fetal de vitelo e 1% (v/v) de L- glutamina, penicilina e estreptomicina (Gibco). As linhagens celulares modificadas (A549-Luc e U87-Luc) foram suplementadas com puromicina (1,3 μg/ml para A549- Luc e 5 μg/ml para U87-Luc) para selecionar as células transfectadas estáveis. Todas as linhagens celulares foram cultivadas a 37°C em uma atmosfera umidificada na presença de 5% de CO2 e 95% de ar.

Animais

[0154] Os camundongos nus atímicos fêmeas pesavam cerca de 20-25 g e, com 8-12 semanas de idade, foram usados nos estudos in vivo, que foram proporcionados por Janvier Laboratories. Os animais foram aclimatados por pelo menos 1 semana antes do experimento; foram alojados em gaiolas de polipropileno ventiladas a uma temperatura média de 22°C, com exposição a 12 horas de luz e 12 horas de escuridão por dia. Todos os camundongos receberam uma dieta padrão de laboratório de comida e água ad libitum. Os experimentos foram realizados de acordo com as Normas do Comitê de Bioética da Universidade de Santiago de Compostela e em conformidade com os Princípios de Cuidado com Animais de Laboratório de acordo com a legislação nacional da Espanha (RD 53/2013).

Ensaio de Citotoxicidade In Vitro

[0155] A citotoxicidade foi avaliada pelo ensaio MTT. Células proliferativas: A549 (4 x 103 células/poço) e U251 (5 x 103 células/poço) foram semeadas em placas de 96 poços. 24 horas depois, o meio foi descartado e substituído por meios livre de soro contendo concentrações diferentes de Ag5-AQCs (1,2-0,24 mg/L) por 1 hora e foi deixado em crescimento por mais 24 horas em meio completo. A cultura primária de B-CLL (4 x 104 células/poço) foi semeada em meio livre de soro e concentrações diferentes de Ag5-AQCs (1,2-0,24 mg/L) foram adicionadas imediatamente aos poços por 30 minutos. Depois disso, o meio completo foi adicionado e as células deixadas em crescimento por 24 horas. Células não proliferativas (confluentes ou privadas de soro): células A549 (4 x 103 células/poço) e U251 (5 x 103 células/poço) foram semeadas em placas de 96 poços. As células confluentes foram deixadas em crescimento por 96 horas em meio de 10% de FBS para atingir a confluência. Para células privadas de soro, 24 horas após a semeadura, o meio foi substituído por meio de 0,05% de FBS por 72 horas. Em ambas as condições, o estado não proliferativo das células foi confirmado por citometria de fluxo. Em seguida, as células foram tratadas com Ag5-AQCs (1,2-0,24 mg/L) por 1 hora em meio livre de soro e incubadas em meio completo por mais 24 horas.

[0156] Em seguida, para todas as condições testadas, 10 μl de solução de MTT (5mg/ml) foram adicionados a cada poço e incubados a 37°C protegidos da luz.

Quatro horas depois, 100 μl de solução de solubilização (SDS/0,1 de NHCl) foram adicionados e as amostras foram incubadas por 18 horas a 37°C. A absorvância foi medida a 595 nm usando um leitor de microplacas CLARIOstar®. Protocolos semelhantes foram seguidos usando o ensaio MTT para medir a viabilidade celular com outros tipos de células.

Medição radiométrica da oxidação de GSH em células vivas

[0157] PREMO Cellular Redox Sensor Grx-1-roGFP (Molecular Probes, P36242) é um sensor geneticamente codificado usado para detectar mudanças no estado redox da glutationa em células vivas. O sensor é baseado na introdução de duas cisteínas na estrutura em barril β da proteína GFP. Sob condições de oxidação, a formação de ligações dissulfeto altera as propriedades fluorescentes do biossensor, resultando em uma mudança na intensidade de emissão após a excitação em dois comprimentos de onda diferentes (400 e 488 nm). A razão das intensidades de emissão se correlaciona com uma mudança no estado redox de roGFP.

[0158] Para analisar as mudanças no estado de oxidação de GSH na presença de Ag5-AQCs, 2,5 x 104 células A549 foram semeadas em placas de 35 mm (Mattek. P35GC-0-10-C) e transduzidas com o PREMO Cellular Redox Sensor Grx-1- roGFP logo após as células terem sido colocadas em placas. O volume do sensor foi calculado seguindo esta equação: Volume do sensor (ml) = (número de células) x (MOI)/(1 x 108) Onde “número de células” é o número de células semeadas por placa; MOI é o número de partículas virais por célula e 1 x 108 é o número de partículas virais por ml de reagente.

[0159] De acordo com os resultados obtidos na equação, foram adicionados 60 μl de PREMO Cellular Redox Sensor por mililitro de meio de cultura. As amostras foram incubadas por 48 horas para obter uma expressão ideal do sensor e as alterações redox em células vivas foram motorizadas usando o microscópio confocal Leica TCS SP5 X. Ag5-AQCs (IC50) foi adicionado ao prato e as imagens foram tiradas a cada 10 segundos durante 10 minutos. PREMO Cellular Redox Sensor foi excitado a 400 e 488 nm e a emissão foi coletada a 500-530 nm. A intensidade de fluorescência emitida por cada célula foi medida em ambas as excitações e a razão de 400ex/488ex foi calculada. As imagens foram processadas usando o software ImageJ.

Imunofluorescência

[0160] MTF-1: as células A549 (2,5 x 104) foram cultivadas em lamelas de vidro em placas de 24 poços e tratadas com Ag5-AQCs (IC50) por 1 hora em meio livre de soro e, em seguida, o meio foi substituído pelo meio completo por 2 horas. As células HEK293 (8 x 104) foram cultivadas em lamelas de vidro em placas de 24 poços e tratadas com Ag5-AQCs (IC50), DTT (0,5 mM) ou uma combinação de ambos, por 10 ou 30 minutos em meio livre de soro e, em seguida, o meio. Em seguida, as células foram lavadas duas vezes com PBS Ca2+/Mg2+ e fixadas com metanol/acetona (diluição de 1:1) por 10 minutos a -20°C. Eles foram então bloqueados com PBS contendo 10% de FBS por 1 hora, lavados duas vezes com PBS e incubados com o anticorpo primário contra MTF-1 (diluição 1: 200) (sc-48775, Santa Cruz Biotechnology) durante a noite a 4°C. Depois disso, as células foram lavadas e incubadas com o anticorpo secundário de IgG anti-coelho de cabra Alexa Fluor-594 (diluição de 1:500) (A11037, Life Technologies) e Hoechst (diluição de 1:1000) (Molecular Probes) a 0,25 μg/ml por 45 minutos. As lamelas com células coradas foram montadas em lamelas de vidro com Fluoroshield Mounting Medium (F6182, Sigma). As imagens foram obtidas usando o microscópio confocal Leica TCS SP8 e analisadas usando o software LasX.

[0161] As células Nrf2: HEK293 (3 x 104) foram semeadas em lamelas de vidro em placas de 24 poços durante a noite e tratadas com Ag5-AQCs (IC50), DTT (0,5 mM) ou uma combinação de ambos, por 10 ou 30 minutos em meio sem soro. Após o tratamento, as células foram fixadas em solução de formalina (10%) por 30 minutos, lavadas duas vezes com PBS Ca2+/Mg2+ e permeabilizadas com 0,5% de Triton X- 100 por 5-10 minutos. Em seguida, as células foram lavadas novamente e bloqueadas com PBS contendo 1% de BSA. As células foram subsequentemente incubadas com o anticorpo primário contra Nrf2 (diluição de 1:100) (sc-722, Santa Cruz Biotechnology) por 2 horas em temperatura ambiente, lavadas duas vezes com PBS e incubadas com o anticorpo secundário de IgG anti-coelho de cabra Alexa Fluor-594 (diluição de 1:250) (A11037, Life Technologies) e Hoechst (diluição de 1:1000) (Molecular Probes) por 45 minutos. Controles negativos sem anticorpo primário foram incluídos na análise (dados não mostrados). As lamelas com células coradas foram montadas em lamelas de vidro com Fluoroshield Mounting Medium (F6182, Sigma).

As imagens foram obtidas usando o microscópio confocal Leica TCS SP8 e analisadas usando o software LasX.

Medição de ROS

[0162] A medição da citometria de fluxo foi realizada usando o indicador de superóxido di-hidroetídio (DHE) (Molecular Probes, D11347). As células foram semeadas em placas de 12 poços e tratadas com Ag5-AQCs (IC50) em meio sem soro. As células foram coletadas 30 minutos, 1, 2 e 3 horas após o tratamento, lavadas duas vezes com PBS frio e incubadas com DHE (3,17 mM) durante 20 minutos em temperatura ambiente, protegidas da luz. As células coradas foram analisadas usando o citômetro de fluxo Guava EasyCyte com o software InCyte.

Esferoides do tumor multicelulares

[0163] Os esferoides do tumor multicelulares A549 e U251 (MCTSs) foram gerados pelo método da gota suspensa. 20 μl de uma suspensão de células contendo 500 células foram dispensados em uma pequena bandeja de 60 poços (Nunc). Em seguida, as bandejas foram invertidas e incubadas por 5 dias em condições padrão.

No dia 5, as bandejas foram corrigidas e os esferoides foram transferidos para uma placa de 96 poços revestida com 50 μl de 1% de agarose. Os esferoides foram então tratados com Ag5-AQCs quatro vezes em dias alternados e as imagens dos esferoides foram capturadas todos os dias até o final do tratamento usando o microscópio Olympus IX51 equipado com uma câmera Olympus DP72 e o software de imagem CellSens. As imagens foram processadas usando ImageJ para medir a área de esferoides e as diferenças nos valores de cinza como um indicador indireto da densidade celular.

[0164] No final do experimento, os esferoides foram corados com Reagente de Hipóxia Image-iT Green 5 μM (Molecular Probes, I14834) e Hoechst (1μg/μl) por 1 hora. Imagens de esferoides de controle e tratados foram obtidas em uma microscopia confocal Leica AOBS-SP5 e analisadas usando o software ImageJ.

Eficácia In vIvo de Ag5-AQCs

[0165] O modelo ortotópico de câncer de pulmão A549luc foi desenvolvido seguindo o protocolo descrito por Borrajo et al. (2016) J. Control Release 238: 263-

271. 1x106 células A549Luc suspensas em 50 μl de PBS foram injetadas através do espaço intercostal no pulmão esquerdo de camundongos nus atímicos. A evolução do tumor foi seguida por injeção de luciferina na cavidade intraperitoneal a uma dose de 150 mg/kg de peso corporal aproximadamente 5 minutos antes do imageamento. A bioluminescência da luciferase foi capturada sob anestesia com isoflurano vaporizado usando o IVIS LIVING IMAGE System (Caliper Life Sciences).

[0166] Para o tratamento com Ag5-AQCs, os camundongos foram divididos em três grupos (5 animais em cada): o primeiro grupo (controle) não recebeu tratamento, o segundo grupo foi tratado com cisplatina (CDDP) (quatro doses únicas,

4 mg/kg) e o terceiro grupo foi tratado com Ag5-AQCs (quatro doses únicas, 0,25 mg/kg). Os medicamentos foram aplicados por via intravenosa pela veia da cauda nos dias 20, 22, 24 e 26 após a inoculação dos tumores. Os camundongos foram sacrificados no dia 37. Os nódulos linfáticos do pulmão e do mediastino foram removidos e a luminescência foi quantificada por micrograma de proteína no corpo, conforme descrito em Borrajo et al. (2016).

Análise histológica

[0167] Os pulmões foram fixados em 10% de formalina tamponada neutra por 24 horas e incluídos em parafina. Seções de 4 mm de espessura foram montadas em lâminas de microscópio FLEX IHC (Dako-Agilent, Glostrup, Dinamarca) e aquecidas a 60°C por 1 hora. A técnica de imunoistoquímica foi realizada automaticamente com o AutostainerLink 48 (Dako-Agilent). Após desparafinação e recuperação de epítopo em solução de recuperação de alvo EnVision FLEX (alto pH) por 20 minutos a 97°C, as lâminas foram deixadas em arrefecimento em PT Link a 65°C e, em seguida, em tampão de lavagem Dako por 5 minutos em temperatura ambiente (RT). O protocolo de imunocoloração incluiu incubação em RT em: (1) reagente de bloqueio de peroxidase EnVision FLEX (Dako-Agilent) por 5 minutos; (2) anticorpo primário FLEX pronto para uso (Dako-Agilent) anti-CK7 (clone OV-TL12/30), por 20 minutos; (3) EnVision FLEX/HRP (polímero de dextrano conjugado com peroxidase de rábano e imunoglobulinas de cabra anti-camundongo e anti-coelho isoladas por afinidade) por 20 minutos; (4) solução de trabalho de substrato (mistura) (solução de cromogênio de tetra-hidrocloreto de 3,3'-diaminobenzidina) (Dako-Agilent) por 10 minutos; e (5) hematoxilina EnVision FLEX (Dako-Agilent) por 9 minutos. As seções foram examinadas e fotografadas usando um microscópio Olympus PROVIS AX70 equipado com uma câmera Olympus DP70.

Tratamento por radiação

[0168] As células A549 (3x104 células/poço) e U251 (3,5 x 104 células/poço)

foram semeadas em uma placa de 24 poços e incubadas por 96 horas para atingir a confluência. Em seguida, o meio foi substituído por meio sem FBS contendo diferentes diluições de Ag5-AQCs (1:50, 1:75 e 1:100 para A549 e 1:150, 1:175 e 1:200 para U251). Após pré-tratamento com Ag5-AQCs por 10 minutos, as células foram irradiadas com doses de 0-10 Gy usando um Acelerador Linear do Laboratório de Física de Radiação da Universidade de Santiago.

Análise estatística

[0169] Todas as análises estatísticas foram realizadas com o software GraphPad Prism versão 5.0 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, EUA). As diferenças foram consideradas significativas para * p <0,05 e muito significativas para * p <0,01.

EXEMPLO 1: Método de síntese de Ag5-AQC

[0170] A síntese dos clusters Ag5-AQC foi feita a 25°C usando um potenciostato biológico VMP3 (Seyssinet-Oarsetm França). Uma célula eletroquímica de três eletrodos isolada termicamente Methrom foi usada com um eletrodo de hidrogênio como referência e duas folhas de Ag (área de superfície de 17,5 cm2) como contra-eletrodos e eletrodos de trabalho. Esses eletrodos estavam frente a frente e separados a uma distância de 3 cm. Uma primeira etapa de 1 hora a 250 μA, uma segunda etapa de 1 hora de 480 μA, uma terceira etapa de 1 hora de 1 mA, uma quarta etapa de 1 hora de 2,2 mA e duas etapas finais de 30 minutos de 4 mA, cada uma a 25°C. Antes da síntese e também após 4 horas e 4 horas e meia, ambos os eletrodos de prata foram polidos com lixa seguida de alumina (cerca de 50 nm), lavados completamente com água MilliQ e sonicados (2 etapas de 5 minutos trocando a água em cada etapa). Após sonicação, e antes da síntese, foi realizada uma limpeza eletroquímica consistindo em uma etapa de 5 minutos a 250 mA em água.

[0171] Purificação: A quantidade de íons que não reagiram nas soluções foi estimada pelo eletrodo seletivo de íons e Ag (Hanna). Uma quantidade de NaCl 1,5 vezes a concentração dos íons decAg foi usada para a precipitação dos íons de Ag.

O sistema foi deixado durante a noite a 25°C para precipitação completa.

[0172] Concentração: 16 sínteses foram coletadas juntas (total de 8 L), filtradas por uma membrana de 0,1 μm e concentradas até um volume de 10 mL em um evaporador rotativo (Heidolphlaborota 20) a 35ºC (vácuo de of 30 mbar).

Finalmente, a solução foi filtrada através de uma membrana de 0,22 microns e concentrada em um frasco para 2mL. A concentração de Ag5-AQCs no final do processo de purificação e concentração é em torno de 30 mg / L, estimada por Espectroscopia de Absorção Atômica de Chama (realizada com um Perkin-Elmer 3110 com uma lâmpada de cátodo oco de prata Lumia de Perkin-Elmer (Madri, Espanha) (corrente 10 mA). A análise de espectro de massa mostra que principalmente espécies de Ag5-AQCs estão presentes (aproximadamente> 50%).

[0173] As amostras de clusters foram caracterizadas por espectroscopia de UV-Vis e fluorescência, AFM (microscopia de força atômica), HRTEM (microscopia eletrônica de transmissão de alta resolução), XANES e ESI-TOF (tempo de voo de ionização por electrospray), mostrando que a composição contém principalmente clusters com N = 5 átomos (Ag5-AQCs).

EXEMPLO 2: Modelo de interação com Ag5

[0174] Modelos teóricos da interação de Ag5-AQCs com glutationa e tioredoxina mostram que a reação é termodinamicamente possível. Além disso, os Ag5-AQCs interagem seletivamente com um domínio fundamental da tioredoxina, denominado “tiorredoxina dobra” e é encontrado em proteínas procarióticas e eucarióticas. Apesar da variabilidade da sequência em muitas regiões da dobra, as proteínas tiorredoxina compartilham uma sequência de sítio ativo comum com dois resíduos de cisteína reativos: Cys-X-Y-Cys, onde X e Y são frequentemente, mas não necessariamente, aminoácidos hidrofóbicos. Sem estar limitado pela teoria, Ag5- AQCs parecem interagir com esses dois resíduos de cisteína, conforme mostrado na Figura 1.

EXEMPLO 3: Ag5-AQCs promovem oxidação de enxofre

[0175] Ag5-AQCs promovem a oxidação de enxofre na cisteína e glutationa, conforme visto usando a absorção de raios-X perto da estrutura de borda (XANES) (Figura 2). Além disso, essa reação é dependente da dose (Figura 3). A tioredoxina de E. coli também mostrou ser oxidada na presença de Ag5-AQCs (Figura 4).

Conforme esperado, a molécula de tiorredoxina pura mostra apenas um pico em

2.474,3 eV, consistentemente com o estado de oxidação S(-2), que corresponde aos seus dois grupos de cisteínas. É importante ressaltar que a forma reduzida desta molécula pode ser confirmada, antes do tratamento catalítico com Ag5-AQCs, pois não são observados sinais de espécies de dissulfeto com splitting característico de cerca de 1,5 eV no intervalo entre 2473 e 2475 eV. Após o tratamento com AQCs, um forte pico associado a S + 6 é claramente visível.

[0176] A análise de XANES também mostra o efeito que diferentes aceitadores de elétrons têm na oxidação da tiorredoxina mediada por Ag5-AQC (Figura 5). Do ponto de vista biológico, é de grande importância verificar que os Ag5- AQCs potencializam o efeito do oxigênio, H2O2 e radicais hidroxila (HO•) na oxidação do enxofre, atingindo estados de oxidação irreversíveis nos sistemas biológicos. Isso liga a ação do Ag5-AQC ao metabolismo celular e à vascularização do tumor (Figura 6).

EXEMPLO 4: Ag5-AQC tem um efeito bactericida

[0177] Ag5-AQCs são bacteriostáticos e bactericidas contra E. Coli. Acredita- se que o mecanismo responsável seja a oxidação do tiol. Na verdade, o ditiotreitol (DTT), um agente redutor de tiol, resgata a E. Coli da ação do Ag5-AQC. O oposto também é verdadeiro, isto é, Ag5-AQCs resgatam E. Coli da ação do DTT como esperado de agentes redox com ação oposta. Clusters feitos de cobre e platina também apresentam atividade bactericida.

[0178] Na ausência de DTT (0 mM), uma baixa concentração (1,2 mg/L) de

Ag5-AQCs mata as bactérias. Quando o DTT é aumentado para 0,1 mM, a viabilidade das bactérias é parcialmente restaurada. O DTT a 10 mM é tóxico para as bactérias, no entanto, a coadministração de Ag5-AQCs reverte o efeito do DTT (Figura 7).

EXEMPLO 5: Efeito de Ag5-AQCs em linhagens celulares humanas

[0179] Um painel de nove linhagens celulares foi usado: A549 (adenocarcinoma de pulmão humano, DSMZ Nº: ACC 107), A549 Luc-C8 (BIOWARE®), MCF7 (adenocarcinoma de mama humano, DSMZ Nº: ACC 115), HCT116 (carcinoma colorretal humano, ATCC Nº: CCL-247), HEK293 (rim, embrião de humano), U87-luc (glioblastoma multiforme humano, gentilmente fornecido por Joan Seoane), MM. 1S (mieloma múltiplo humano, ATCC Nº: CRL-2974), RL (linfoma não-Hodgkin humano, ATCC nº: CRL-2261) e MEC-1 (leucemia linfocítica crônica-B humana, DSMZ, nº: ACC 497).

[0180] Todas as linhagens celulares foram sensíveis a Ag5-AQCs. Na Figura 8, os gráficos de resposta à dose (0,24-1,2 mg/L) são representados para várias linhagens celulares. É importante ressaltar que quando o DTT foi coadministrado com Ag5-AQCs, o efeito tóxico foi reduzido, indicando que o efeito do Ag5-AQC é mediado pela oxidação do tiol.

[0181] Usando a linhagem celular A549, também foi descoberto que os clusters feitos de cobre mostram efeitos citotóxicos, ver Figura 9.

[0182] O desenvolvimento de moléculas GFP sensíveis a redox permite o monitoramento do status redox em células vivas por microscopia de fluorescência. O roGFP-Grx1 chimera é um sensor codificado geneticamente para medir as mudanças na oxidação do tiol através de duas cisteínas introduzidas na estrutura do barril β da proteína GFP. A formação de dissulfeto entre as cisteínas leva à protonação de GFP e aumenta os espectros de excitação de 400 nm às custas dos espectros de excitação de 488 nm. As células A549 foram transduzidas com o sensor por 48 horas e as alterações na intensidade de fluorescência foram monitoradas por microscopia de fluorescência confocal por 10 minutos após o tratamento com Ag5-AQC (IC50 - aproximadamente 0,3 mg/L). Embora as células de controle não modifiquem seu status redox ao longo do tempo, a adição de Ag5-AQC à amostra levou a uma resposta oxidativa imediata ao sinal máximo após 6 minutos de tratamento. Um total de 34 células selecionadas aleatoriamente (pelo menos 10 células por experimento de um total de três experimentos) foram analisadas, das quais 20 células mostraram uma mudança clara em seu estado redox após a exposição ao Ag5-AQC. Além disso, 13 das células restantes modificaram seu estado de oxidação, embora o efeito não seja tão acentuado como nas 20 células mencionadas acima. roGFP responde aos níveis de GSH/GSSG através da troca de elétrons com glutaredoxina (GRX1), demonstrando assim o efeito de Ag5-AQC em GSH (Figura 10).

EXEMPLO 6: Ag5-AQCs atuam em tióis críticos presentes em proteínas

[0183] As metalotioneínas (MTs) são um grupo de proteínas de ligação a metais intracelulares ricas em cisteína de baixo peso molecular que desempenham um papel crítico na proteção contra agentes oxidantes. A expressão de MTs está sob o controle do fator de transcrição 1 responsivo a metal (MTF-1). Em condições normais, o MTF-1 fica entre o citoplasma e o núcleo, mas sob estresse diverso ele se acumula no núcleo e se liga ao elemento responsivo ao metal (MRE) induzindo a expressão de MTs entre outros genes. Em condições fisiológicas, MTs ligam o zinco através do grupo tiol de seus resíduos de cisteína formando dois clusters de zinco/tiolato, mas em condições de estresse oxidativo, o zinco é liberado através da oxidação dos clusters de zinco/tiolato levando à formação de MT-dissulfeto. Este estado de MT-dissulfeto pode ser revertido em um ambiente reduzido, levando à formação de MT-tiol que pode se associar com íons de zinco para formar MTs. Este processo constitui o ciclo redox do MT, que desempenha um papel crucial na função biológica de MTs.

[0184] Foi argumentado que Ag5-AQCs poderia catalisar a conversão de MT-

tiol em MT-dissulfeto com a liberação consequente de zinco, ativação de MTF-1 e translocação para o núcleo. Para verificar isso, a localização de MTF-1 após o tratamento com Ag5-AQC foi analisada. As células A549 foram tratadas com Ag5- AQCs (IC50 - aproximadamente 0,3 mg/L) e 2 horas depois as células foram fixadas e coradas com um anticorpo contra MTF-1. As imagens de imunofluorescência mostraram um claro acúmulo nuclear de MTF-1 em células tratadas em relação às células de controle (Figura 11a). Um total de 300 células foi contado para cada condição, das quais 242 foram positivas para localização nuclear de MTF-1 em células tratadas com Ag5-AQC e 9 em controles. Além disso, os dados de microarranjo obtidos usando a linhagem celular MM.1S, após 4 horas de tratamento com Ag5- AQCs, mostraram que os genes de MTs foram regulados positivamente em resposta ao tratamento com Ag5-AQC, conforme esperado da ativação de MTF-1.

[0185] A via de Nrf2-Keap1 é geralmente considerada uma das principais vias de defesa celular, que

[0186] controla a expressão de genes que têm funções antioxidantes dentro das células. Em condições basais,

[0187] Nrf2 é reprimido transcricionalmente por Keap1 no citoplasma que, por sua vez, facilita a poliubiquitinação mediada por Cul3 de Nrf2 levando à sua degradação proteossomal. Keap1 contém 27 cisteínas, algumas das quais foram relatadas como alvos de eletrófilos e oxidantes que os modificam facilitando a desrepressão de Nrf2. Após a exposição a estresses, Keap1 é inativado pela modificação direta de resíduos de tiol de cisteína e, subsequentemente, Nrf2 é estabilizado, evitando a degradação proteossomal e translocado para o núcleo para mediar a ativação de uma variedade de genes implicados na resposta antioxidante, como a glutationa peroxidase (GPx), NAD (P) H quinona oxidoredutase (NQO-1) e heme oxigenase-1 (HMOX1). Existem outros mecanismos que regulam Nfr2 independentemente de Keap1, incluindo a modificação de cisteínas no domínio Neh de Nrf2 que resulta no acúmulo nuclear de Nrf2. Foi argumentado que Ag5-AQCs poderiam estar envolvidos na oxidação dos grupos sulfidrila em Keap1 ou Nrf2 com a liberação consequente de Nrf2 e sua translocação para o núcleo. A imunofluorescência indireta foi usada para avaliar a localização da proteína Nrf2 em resposta a N-etilmaleimida (NEM, controle positivo) e Ag5-AQCs. NEM é um alceno que é reativo para tióis e é comumente usado para modificar resíduos de cisteína em proteínas e peptídeos. A linhagem celular A549 apresenta mutações no gene Keap1 resultando em uma alteração da atividade de Keap1 que deixa de exercer sua função repressora no Nrf2 levando a uma localização predominante do Nrf2 no núcleo em condições normais. Portanto, tal linhagem celular não é adequada para o estudo da localização celular do Nrf2. Em vez disso, células de rim embrionário humano 293 (HEK293) foram expostas a NEM (100 μM) e Ag5-AQC (IC50 - aproximadamente 0,3 mg/L) por 30 minutos e então coradas com anticorpos específicos contra Keap1 e Nrf2. O tratamento com Ag5-AQC causou um aumento na coloração da proteína Nrf2 (coloração vermelha) indicativa de estabilização da proteína e acumulação nuclear (colocalização com azul, coloração Hoechst) após 30 minutos em comparação com as células de controle, onde Nrf2 está predominantemente localizado no citoplasma (Figura 11b). Conforme esperado, o tratamento com NEM aumentou o acúmulo nuclear de Nrf2. É claro que Ag5-AQCs e NEM compartilham um padrão semelhante de coloração (uma expressão aumentada de Nfr2 devido à degradação reduzida e localização nuclear aumentada), apoiando assim a ação de Ag5-AQC em tióis.

EXEMPLO 7: Ag5-AQCs reduzem o crescimento do tumor multicelular- esferoide

[0188] Esferoides de tumor multicelulares (MCTSs) se assemelham a muitos aspectos das condições fisiopatológicas no tecido de tumor humano e são amplamente usados para testes de fármacos. MCTSs de células A549 foram, portanto, desenvolvidos como um modelo de tumor ex vivo para avaliar a atividade de

Ag5-AQC. O estado fisiológico das células no MCTS depende de seu tamanho; MCTS único de cerca de 400-500 µm de diâmetro após 4 dias de incubação é frequentemente selecionado para teste de fármacos. Portanto, os MCTSs foram selecionados de acordo com esses critérios e tratados com Ag5-AQC (2,4 mg/L) quatro vezes (dias 0, 2, 4 e 6, considerando o primeiro dia de tratamento como 0).

Imagens de controle e MCTSs tratados foram tiradas todos os dias, do dia 0 ao dia 7.

As imagens mostraram que o tratamento com Ag5-AQC reduz o crescimento de MCTSs (Figura 12a) conforme estimado medindo a área de MCTSs usando ImageJ.

A redução no tamanho do MCTS foi evidente após a primeira dose de tratamento e foi mantida ao longo do tempo, sendo significativamente diferente a partir do dia 3 (Figura 12b). Além disso, chama a atenção a existência de uma região nítida na parte central dos MCTSs tratados com Ag5-AQC, que parece ser resultado de uma menor celularidade (Figura 12a, setas). Conforme descrito anteriormente, grandes MCTSs (ou seja, tamanhos acima de 600 μm) são CARACTERIZADOS pela existência de subpopulações celulares heterogêneas, com células proliferativas ativa na periferia e células quiescentes, hipóxicas e necróticas nas regiões internas. Acredita-se que a existência dessas regiões claras nos MCTSs após o tratamento com Ag5-AQC esteja relacionada com a capacidade do Ag5-AQC de penetrar nos MCTSs alcançando essas regiões hipóxicas centrais em virtude de seu pequeno tamanho e carga neutra.

[0189] Para validar esta hipótese, avaliamos os níveis de hipóxia no tumor por meio de uma sonda fluorescente. Conforme mostrado na Figura 12c, os níveis de hipóxia aumentam na parte interna do tumor de 1.000 células. Curiosamente, a exposição do tumor ao aumento da concentração de Ag5-AQCs causou uma redução dependente da dose nas células hipóxicas.

EXEMPLO 8: A ação de Ag5-AQC é potencializada por H2O2

[0190] Os exemplos acima fornecem evidências da importância da interação de Ag5-AQC com O2, H2O2 e radicais hidroxila. São fornecidas evidências de que o mesmo também é verdadeiro em culturas de células. A atividade citotóxica do Ag5- AQC mostrou ser afetada quando a respiração celular e, portanto, os níveis de ROS, foram diminuídos, modificando assim o metabolismo celular. Na verdade, as células A549 e as células U251 com respiração reduzida (depois de permitir que elas atinjam a confluência) foram menos sensíveis à ação do Ag5-AQC (Figuras 13A e 13B).

Conforme esperado, as células A549 privadas de soro também foram menos sensíveis a Ag5-AQCs do que as células proliferativas (Figura 13C). A sensibilidade foi restaurada se uma dose baixa de H2O2 foi coadministrada com Ag5-AQCs (Figura 13D).

EXEMPLO 9:Efeitos de Ag5-AQC in vivo

[0191] O efeito in vivo do Ag5-AQC foi testado no modelo de câncer de glioma ortotópico U87luc e no modelo de câncer de pulmão ortotópico A549luc que metastatiza para os linfonodos mediastinais.

[0192] O glioma maligno de alto grau, glioblastoma multiforme (GBM), é a forma mais agressiva e letal de tumores cerebrais, com uma taxa de sobrevida inferior a 5% após 5 anos. Um dos principais fatores limitativos no tratamento de GBMs é a distribuição de agentes terapêuticos ao cérebro através da barreira hematoencefálica (BBB). Essa barreira fisiológica altamente restritiva impede que 98% dos medicamentos de moléculas pequenas e virtualmente 100% dos medicamentos de moléculas grandes cheguem ao sistema nervoso central a partir da circulação sanguínea. O pequeno tamanho dos AQCs acoplados à sua carga neutra em pH fisiológico favorece, pelo menos teoricamente, sua difusividade em tecidos biológicos.

Foi considerado se essas propriedades poderiam permitir que o Ag5-AQC se difundisse livremente pela BBB e atingisse o tumor. Para tanto, foi desenvolvido um modelo de glioma ortotópico U87luc para testar a capacidade potencial do Ag5-AQC de cruzar a BBB e reduzir tumores.

[0193] Após implantação ortotópica de células U87luc, Ag5-AQC (0,5 mg/kg)

foi administrado por via intravenosa quatro vezes. O crescimento do tumor foi seguido pela medição da bioluminescência das células do tumor no cérebro durante 14 dias usando o IVIS® Spectrum System. Os resultados mostraram que, no caso de animais controle, o tamanho do tumor aumenta exponencialmente ao longo do experimento, enquanto nos animais tratados com Ag5-AQC o crescimento do tumor foi reduzido (Figura 14a). Portanto, esses resultados mostram que os Ag5-AQC são capazes de cruzar a BBB, atingir o tumor e reduzir seu tamanho.

[0194] Outro fator limitativo no tratamento do câncer é a ocorrência de metástases. A doença metastática é amplamente incurável devido à sua natureza sistêmica e à resistência das células do tumor disseminadas aos agentes terapêuticos existentes. Isso explica por que mais de 90% da mortalidade por câncer é atribuível a metástases, mas não aos tumores primários dos quais essas lesões malignas surgem.

A capacidade do Ag5-AQC de reduzir ou eliminar o tumor primário e as metástases foi avaliada usando um modelo de câncer de pulmão ortotópico A549luc descrito anteriormente que metastatiza para os linfonodos mediastinais (Porto et al. (2018) Adv. Mater. e1801317). A linhagem celular A549 é conhecida por ser uma linhagem celular cancerosa mutante KRAS. Neste modelo, a ocorrência de metástases para os nódulos linfáticos está bem estabelecida e pode ser detectada 13 dias após a injeção das células do tumor. Portanto, a avaliação do efeito do Ag5-AQC teve início no dia 20 após o implante das células A549luc, quando as metástases linfonodais já eram evidentes. Foram estabelecidos três grupos: camundongos controle não tratados, camundongos tratados com CDDP (4 mg/kg) como controle positivo e camundongos tratados com Ag5-AQC (0,25 mg/kg). O tratamento foi administrado por via intravenosa quatro vezes (dias 20, 22, 24 e 26) e a evolução do tumor foi monitorada in vivo medindo a bioluminescência das células do tumor no pulmão durante 37 dias usando o IVIS® Spectrum System. Os resultados mostraram uma redução significativa no tamanho do tumor em ambos os camundongos tratados com CDDP e

Ag5-AQC em comparação com os animais controle, nos quais o tumor cresceu exponencialmente ao longo do experimento (Figura 14b). No dia 37, os animais foram sacrificados porque os camundongos controle apresentaram sinais evidentes de morbidade e a atividade da luciferase foi quantificada para medir a carga de células cancerosas. Os camundongos tratados com Ag5-AQC e CDDP exibiram uma redução significativa na atividade da luciferase no tumor primário e nos nódulos linfáticos mediastinais em comparação com os camundongos de controle (Figura 14c). A atividade da luciferase foi então comparada em camundongos tratados com Ag5-AQC e naqueles tratados com CDDP. Em camundongos tratados com Ag5-AQC, o sinal foi claramente mais baixo do que nos outros, tanto no tumor primário quanto nos linfonodos mediastinais (Figura 14b, c). A coloração imunoistoquímica de seções de pulmão com um anticorpo monoclonal contra citoqueratina humana, que cora especificamente células do tumor, também corroborou esses resultados (Figura 14d).

Além disso, o tratamento com Ag5-AQC não afetou o peso corporal dos animais, descartando uma toxicidade grave do composto (Figura 14e).

[0195] Juntos, esses resultados mostraram a capacidade do Ag5-AQC de atingir ambos, tumor primário e metástases, e diminuir significativamente o tamanho sem causar efeitos tóxicos adicionais. Portanto, o Ag5-AQC oferece uma nova abordagem que pode aprimorar o tratamento de tumores humanos devido à sua capacidade de cruzar a BBB e de atingir e reduzir as metástases.

EXEMPLO 10: Efeito de Ag5-AQC em culturas primárias de tumores humanos

[0196] A sensibilidade de Ag5-AQC foi avaliada ex vivo em células derivadas de pacientes com leucemia linfocítica crônica B (B-CLL) obtidas de culturas de medula óssea de rotina após o diagnóstico ter sido estabelecido. Uma avaliação do efeito citotóxico e das alterações morfológicas ultraestruturais associadas ao tratamento com Ag5-AQC foi realizada em células derivadas de 3 pacientes. As células B-CLL foram cultivadas com diferentes doses de Ag5-AQCs e a citotoxicidade foi avaliada pelo ensaio de MTT. De acordo com os resultados anteriores obtidos a partir de linhagens celulares estabelecidas, uma redução dependente da concentração na viabilidade celular foi observada após 24 horas (Figura 15a). Uma vez que Ag5-AQC em linhagens celulares cancerosas aumentou O2, quantificamos as mudanças nos níveis de O2•em células B-CLL expostas a Ag5-AQC medindo células DHE positivas por citometria de fluxo. Um aumento significativo, mais de 2 vezes, em células DHE positivas foi observado 4 horas após o tratamento (Figura 15b). Além disso, as imagens de TEM mostraram mudanças morfológicas apoptóticas evidentes e a presença de mitocôndrias interrompidas após o tratamento com Ag5-AQC (Figura 15c). Portanto, estes resultados confirmam os resultados obtidos com linhagens celulares e esferoides, discutidos nos Exemplos acima.

EXEMPLO 11:Efeito de Ag5-AQC no modelo de tumor de mieloma múltiplo

[0197] O efeito de Ag5-AQCs foi testado em um modelo de tumor de camundongo de xenoenxerto de mieloma múltiplo MM.1S. Os camundongos (n = 4 para cada grupo de tratamento) foram tratados com solução salina (controle), 0,125 mg/kg de Ag5-AQCs ou 0,25 mg/kg de Bortezomibe (um inibidor de proteassoma aprovado nos EUA e na Europa para o tratamento de mieloma múltiplo). O volume do tumor foi monitorado ao longo de vários dias e os resultados são mostrados na Figura

16. Os resultados mostram que o tratamento com Ag5-AQC teve eficácia equivalente ao Bortezomibe, mesmo sem dosagem otimizada.

EXEMPLO 12: Ag5-AQCs causa morte celular preferencialmente em células transformadas com Ras

[0198] Foi amplamente relatado que os oncogenes ativados causam um acúmulo em espécies reativas de oxigênio (Irani et al. (1997) Science). Foi argumentado que as células transformadas poderiam ser preferencialmente mortas por tratamento com Ag5-AQCs. Para testar esta hipótese, um alelo ativado de H-Ras indutível por doxiciclina (RasV12) foi introduzido em fibroblastos de camundongo imortalizados não transformados (W3T3) e os efeitos de Ag5-AQCs sobre a indução de oncogene foram analisados. Conforme mostrado na Figura 17B, Ag5-AQCs causou uma diminuição na sobrevida em W3T3 de uma forma dose-resposta. Curiosamente, as células que expressam RasV12 foram mais sensíveis aos efeitos tóxicos de Ag5- AQCs, com uma diminuição significativa na viabilidade em comparação com células não induzidas (controle) em todas as doses testadas de AQCs.

[0199] Esta morte seletiva foi revertida por tratamento com DTT, sugerindo que o acúmulo de ROS induzido por Ras foi responsável pelo efeito diferencial. Este efeito preferencial de Ag5-AQCs em células transformadas por oncogene fornece evidências para o uso de Ag5-AQCs como agentes antineoplásicos, especialmente em cânceres mutantes RAS.

EXEMPLO 13: Efeito de AQCs em combinação com terapia de radiação

[0200] O efeito do tratamento com Ag5-AQC em células tratadas com radiação foi testado. Células A549 e células U251 foram tratadas com diferentes diluições de Ag5-AQCs e imediatamente irradiadas com diferentes doses de radiação (0-10 Gy).

[0201] A sobrevida celular foi medida usando um ensaio clonogênico, conforme descrito em Franken et al. (2006) Nat. Protocolo. 1 (5): 2315-2319.

Resumidamente, após a irradiação, as células foram tripsinizadas e contadas usando o contador automatizado de células TC20 (Biorad). 100 células de cada amostra foram semeadas em uma placa de 6 poços em triplicata e incubadas a 37°C em atmosfera umidificada por 1 semana para permitir a formação de colônias macroscópicas. Em seguida, as células foram fixadas e coradas com violeta cristal. Colônias com mais de 50 células foram contadas. A fração de sobrevida (SF) foi calculada após a correção para a eficiência de plaqueamento das células de controle. Os resultados são mostrados nas Figuras 18A e 19A. Os resultados mostram que a administração de Ag5-AQCs aumenta o efeito de morte celular da radioterapia.

[0202] O dano ao DNA também foi medido em células irradiadas. Após a irradiação, as células foram tripsinizadas, fixadas com PFA (0,04%) e coradas com o anticorpo anti-pH2AX (Millipore, Produto Nº: 16-202A), conforme descrito em et al.

(2008) Nat. Protocol. 3: 1187-1193. A expressão de histona fosforilada H2AX (pH2AX) é um marcador de danos no DNA (Sharma et al. in DNA Repair Protocols, (Ed: L.

Bjergbæk), Springer Science, Nova Iorque, 2012, Ch. 40). As células coradas foram analisadas no citômetro de fluxo Guava EasyCyte usando o programa InCyte (Millipore). Os resultados são mostrados nas Figuras 18B e 19B.

[0203] O efeito de AQCs consistindo em 5 átomos de metal de transição de valência zero pode ser testado em dois modelos diferentes para determinar o efeito com terapia de radiação. A) Estudos ex-vivo usando esferoides de tumor multicelular (MCTSs): os MCTSs de células U251-luc podem ser obtidos pelo método da gota suspensa. B) Modelo in vivo: um modelo de câncer de glioblastoma ortotópico pode ser desenvolvido pela injeção de células U251-luc (uma linhagem celular de glioblastoma humano que carrega o gene da luciferase para permitir a imagem in vivo dos tumores em crescimento) no cérebro de camundongos atímicos.

CONCLUSÃO

[0204] É descrito neste documento o efeito de Ag5-AQCs na oxidação de proteínas com um alto teor de cisteína e grupos tiol acessíveis, como metalotioneínas ou glutaredoxina. Foi proposto que devido ao seu pequeno tamanho, os Ag5-AQCs devem exibir uma excelente penetração no tecido do tumor. Experimentos em MTCSs mostraram como Ag5-AQCs penetram nas regiões internas matando as células hipóxicas nessas áreas. O modelo ortotópico de câncer de pulmão que metastatiza para os linfonodos mediastinais revela a capacidade do Ag5-AQCs de atingir os tumores in vivo. Foi observada uma redução nos tamanhos dos tumores, tumor primário de pulmão e metástases de linfonodos mediastinais. Esses resultados destacam a capacidade do Ag5-AQCs de atingir e reduzir metástases, constituindo uma ferramenta inovadora para resolver dois dos principais problemas no tratamento do câncer.

[0205] Todas as patentes e pedidos de patentes referidos neste documento são incorporados por referência em sua totalidade. Além disso, todas as modalidades descritas neste documento podem ser aplicadas a todos os aspectos da invenção.

Claims (32)

REIVINDICAÇÕES

1. Composição CARACTERIZADA pelo fato de que compreende clusters quânticos atômicos (AQCs) consistindo em 5 átomos de metal de transição de valência zero para uso no tratamento de um distúrbio proliferativo celular.

2. Composição para uso de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que está em combinação com a terapia de radiação.

3. Composição para uso de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADA pelo fato de que é para administração simultânea ou sequêncial à terapia de radiação.

4. Composição para uso de acordo com a reivindicação 2 ou reivindicação 3, CARACTERIZADA pelo fato de que a terapia de radiação é a terapia de radiação de feixe externo.

5. Composição para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, CARACTERIZADA pelo fato de que a referida composição não é usada em combinação com um fármaco antineoplásico.

6. Composição para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, CARACTERIZADA pelo fato de que os referidos AQCs são os únicos ingredientes ativos da composição.

7. Composição para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, CARACTERIZADA pelo fato de que é para uso como uma monoquimioterapia.

8. Composição para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, CARACTERIZADA pelo fato de que os átomos de metal são selecionados dentre Ag, Au, Cu, Pt, Fe, Cr, Pd, Ni, Rh, Pb, Ir, Ru, Os, Co, Ti, V ou qualquer combinação destes.

9. Composição para uso de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADA pelo fato de que os átomos de metal são selecionados dentre Ag, Au, Cu, Pt ou qualquer combinação destes.

10. Composição para uso de acordo com a reivindicação 8 ou reivindicação

9, CARACTERIZADA pelo fato de que os átomos de metal são Ag.

11. Composição para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, CARACTERIZADA pelo fato de que o distúrbio proliferativo celular é um tumor e/ou câncer.

12. Composição para uso de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADA pelo fato de que o câncer é selecionado dentre câncer de cérebro, pulmão, mama ou cólon.

13. Composição para uso de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADA pelo fato de que o câncer é selecionado dentre câncer cerebral.

14. Composição para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 13, CARACTERIZADA pelo fato de que o distúrbio proliferativo celular compreende uma mutação RAS.

15. Composição para uso de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADA pelo fato de que a mutação RAS é uma mutação KRAS.

16. Composição para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 15, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição compreende um excipiente, diluente ou carreador farmaceuticamente aceitável.

17. Composição para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 16, CARACTERIZADA pelo fato de que está em combinação com AQCs consistindo em 3 átomos de metal de transição de valência zero.

18. Composição para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 17, CARACTERIZADA pelo fato de que é: (i) substancialmente livre de AQCs consistindo em mais de 5 átomos de metal de transição de valência zero, (ii) substancialmente livre de AQCs consistindo em menos de 5 átomos de metais de transição de valência zero e/ou (iii) substancialmente isentos de íons metálicos.

19. Composição para uso de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADA pelo fato de que mais do que cerca de 95% dos AQCs presentes na composição consistem em 5 átomos de metal de transição de valência zero.

20. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 19, CARACTERIZADA pelo fato de que é para uso na prevenção e/ou tratamento de metástases de câncer.

21. Composição de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADA pelo fato de que é para uso na prevenção e/ou tratamento de metástases de câncer em linfonodos.

22. Composição de acordo com a reivindicação 20 ou reivindicação 21, CARACTERIZADA pelo fato de que é para uso na prevenção e/ou tratamento de metástases de câncer de pulmão.

23. Composição para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 22, CARACTERIZADA pelo fato de que é administrada por via oral, intravenosa ou subcutânea.

24. Uso da composição de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 23, CARACTERIZADO pelo fato de ser para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de um distúrbio proliferativo celular.

25. Uso de uma composição, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende clusters quânticos atômicos (AQCs) consistindo em 5 átomos de metal de transição de valência zero como um agente de sensibilização de terapia de radiação para células proliferativas.

26. Método de prevenção ou tratamento de um distúrbio proliferativo celular, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23 a um paciente em necessidade desta.

27. Método de prevenção ou tratamento de um distúrbio proliferativo celular, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição compreendendo clusters quânticos atômicos (AQCs) consistindo em 5 átomos de metal de transição de valência zero a um paciente em necessidade, em que o referido método não compreende o tratamento do paciente com um fármaco antineoplásico adicional.

28. Método de prevenção ou tratamento de um distúrbio proliferativo celular, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição compreendendo clusters quânticos atômicos (AQCs) consistindo em 5 átomos de metal de transição de valência zero a um paciente em necessidade desta, em combinação com terapia de radiação.

29. Método de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição é administrada simultaneamente ou antes da terapia de radiação.

30. Método de acordo com a reivindicação 28 ou reivindicação 29, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição compreendendo AQCs consistindo em 3 átomos de metal de transição de valência zero.

31. Método de acordo com a reivindicação 30, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição compreendendo AQCs consistindo em 3 átomos de metal de transição de valência zero é administrada simultaneamente ou sequencialmente à composição compreendendo AQCs consistindo em 5 átomos de metal de transição de valência zero.

32. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 26 a 31, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição é administrada por via oral, intravenosa ou subcutânea.