WO2020050318A1 - 炎症性サイトカイン産生抑制剤 - Google Patents

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    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01023—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase

Definitions

  • the present invention relates to an inflammatory cytokine production inhibitor, and more particularly, to an inflammatory cytokine production inhibitor comprising an enzyme-treated whey obtained by treating whey (enzyme) as an active ingredient, and an inflammatory cytokine production inhibitor.
  • the present invention relates to foods and drinks that suppress the production of sex cytokines.
  • Inflammatory cytokines are substances produced from lymphocytes, macrophages, and the like, and are involved in inflammatory reactions associated with bacterial and viral infections, tumors, and tissue damage.
  • inflammatory cytokines such as interleukin-1 ⁇ (IL-1 ⁇ ), interleukin-6 (IL-6), and tumor necrosis factor (TNF- ⁇ ) activate immune functions against the invasion of pathogenic bacteria.
  • IL-1 ⁇ interleukin-1 ⁇
  • IL-6 interleukin-6
  • TNF- ⁇ tumor necrosis factor
  • inflammation is a biological defense reaction that occurs when a foreign substance enters the living body or when a harmful stimulus acts, and it is known that the inflammatory response can cause atherosclerosis, neurological disease, cancer, and the like.
  • a drug that suppresses the production of these inflammatory cytokines such as IL-1 ⁇ and TNF- ⁇ in such a condition is being studied.
  • anti-inflammatory drugs such as ibuprofen and indomethacin
  • Patent Documents 1 to 3 Various chemical substances have been proposed (for example, Patent Documents 1 to 3).
  • Patent Documents 1 to 3 since these diseases often follow a chronic course and the treatment is prolonged, effective compounds have not yet emerged under the current situation where safe compounds without side effects are particularly required.
  • whey whey
  • whey which has been separated from solid matter during the cheese production process, is mostly discarded, but it contains high protein, low fat, inorganic nutrients such as calcium derived from milk components, and vitamin B group.
  • whey whey
  • whey has been recognized as an excellent food because of its high nutritional value such as various vitamins, quick digestion, and promotion of protein synthesis and insulin secretion.
  • whey protein glycoprotein contained in whey is obtained by treating its sugar chain with a specific enzyme and cleaving it. It has been newly found that a treated product, that is, an enzyme-treated whey (note: a product treated with a specific enzyme of whey) has an excellent inhibitory effect on the production of inflammatory cytokines, thereby completing the present invention.
  • the present invention suppresses the production of inflammatory cytokines, TNF- ⁇ and IL-1 ⁇ , and causes rheumatoid arthritis, ulcerative colitis, Crohn's disease, type 2 diabetes, etc. caused by overproduction of these inflammatory cytokines. It is an object of the present invention to provide an inflammatory cytokine production inhibitor which can be applied as a pharmaceutical product effective for inflammatory diseases and foods and drinks such as health foods.
  • an inflammatory cytokine production inhibitor comprising, as an active ingredient, an enzyme-treated whey obtained by contacting whey (whey) with ⁇ -galactosidase; (2) the inflammatory cytokine production inhibitor according to (1), wherein the enzyme-treated whey is an enzyme-treated whey further contacted with sialidase; (3) The inflammatory cytokine according to (1) or (2), wherein the inflammatory cytokine is interleukin-1 ⁇ (IL-1 ⁇ ), interleukin-6 (IL-6) or tumor necrosis factor (TNF- ⁇ ) Production inhibitors; (4) The inflammatory cytokine production inhibitor according to any one of (1) to (3), which contains a protein in the range of 0.02 ⁇ g to 40 mg / kg / dose as a whey enzyme-treated product; (5) a medicament or a food or drink, comprising the inflammatory cytokine production inhibitor according to (1) to (3); (6) the medicament, food or drink
  • Preparation method (8) The preparation method according to (7), wherein the ⁇ -galactosidase is ⁇ -galactosidase derived from Escherichia coli or bovine liver; (9) the method for preparing an enzyme-treated whey having an inhibitory action on inflammatory cytokine production according to (7) or (8), which is further contacted with sialidase; It is.
  • an inflammatory cytokine production inhibitor and inflammatory cytokine production-suppressed food or drink which are highly safe and can be orally administered or ingested.
  • the inflammatory cytokine production inhibitor provided by the present invention include inflammatory cytokines such as interleukin-1 ⁇ (IL-1 ⁇ ), interleukin-6 (IL-6), and tumor necrosis factor (TNF- ⁇ ) Suppresses excessive production of, resulting in chronic inflammation such as rheumatoid arthritis and ulcerative colitis caused by overproduction of these cytokines, Crohn's disease, furthermore, type 2 diabetes, depression, obesity, sepsis, atheroma Atherosclerosis, dermatitis, dementia, schizophrenia, can be an effective therapeutic agent for various diseases such as Parkinson's disease, and foods and beverages containing the inflammatory cytokine production inhibitor of the present invention. It has an advantage that daily health management can be effectively performed by daily oral ingestion.
  • FIG. 1 is a diagram showing a test schedule for examining the effect of the enzyme-treated whey (CWP) of the present invention on a lipopolysaccharide (LPS) reaction in Example 2.
  • FIG. 2 is a diagram showing changes in body weight of test mice after LPS administration in Example 2.
  • FIG. 3 is a diagram showing a change in body weight in a comparison between test group 1 (CWP administration group) and control group 1 (Saline administration group) for 5 days in Example 2.
  • FIG. 4 is a diagram showing changes in food intake during the administration period in Example 2 for a comparison between test group 1 (CWP administration group) and control group 1 (Saline administration group) for 5 days.
  • FIG. 1 is a diagram showing a test schedule for examining the effect of the enzyme-treated whey (CWP) of the present invention on a lipopolysaccharide (LPS) reaction in Example 2.
  • FIG. 2 is a diagram showing changes in body weight of test mice after LPS administration in Example 2.
  • FIG. 5 is a graph showing the amount of food consumed 24 hours after administration on the fifth day, according to the administration schedule in the comparison between the test group 1 (CWP administration group) and the control group 1 (Saline administration group) in Example 2. It is.
  • FIG. 6 is a graph showing the change in blood TNF- ⁇ after LPS administration, which is the result 2 of Example 2.
  • FIG. 7 is a graph showing the change in blood IL-1 ⁇ after LPS administration, which is the result 2 of Example 2.
  • the present invention relates to a inflammatory cytokine production inhibitor characterized by comprising, as an active ingredient, an enzyme-treated whey obtained by bringing whey (whey) into contact with ⁇ -galactosidase.
  • the whey (whey) used herein is a pale yellow-green liquid that is generally produced in large quantities as a by-product generated when solids generated during the cheese manufacturing process are separated. Is not limited thereto, and those distributed as whey (whey) can also be used.
  • the milk used as a raw material for cheese production may be not only cow-derived milk but also whey (whey) obtained from milk of other mammals such as sheep, goats and camels. In this case, any type of cattle can be used regardless of the type of cattle, such as Holstein, Japanese black, and buffalo.
  • whey (whey) is simply described as “whey”.
  • the enzyme-treated whey as the inflammatory cytokine production inhibitor provided by the present invention is an enzyme-treated whey obtained by contacting the above-mentioned whey with ⁇ -galactosidase.
  • the ⁇ -galactosidase used in this case is not particularly limited, and any known types can be used. Examples of such substances include those derived from Escherichia coli and those derived from bovine liver. Among them, ⁇ -galactosidase derived from Escherichia coli is used. Is good.
  • Such a ⁇ -galactosidase is commercially available, for example, as described in Catalog No. of Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • 072-04141 (derived from Escherichia coli), ⁇ -galactosidase (derived from Escherichia coli) manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd., and G1875 (derived from bovine liver) manufactured by SIGMA-ALDRICH.
  • the enzyme-treated whey which is an inflammatory cytokine production inhibitor provided by the present invention, cleaves the ⁇ -1,6-glycosidic bond of the protein in whey with the ⁇ -galactosidase, that is, cleaves the carbohydrate. Thereby, a processed product having a desired protein content is produced, and the inflammatory cytokine production inhibitory effect is exerted.
  • whey itself not subjected to such enzyme treatment that is, the enzyme Untreated whey had no inhibitory effect on inflammatory cytokine production.
  • sialidase which is a glycolytic enzyme that removes an ⁇ -glycoside-linked sialic acid residue from a glycolipid sugar chain terminal.
  • sialidase is not particularly limited, and any well-known sialidase can be used, for example, those derived from C. perfringenes, those derived from streptococcus 6646K, and those obtained from cholera ( Vibrio cholerae) and those derived from Arthrobacter ureafaciens.
  • Commercially available products include, for example, product numbers (Sigma Prod.
  • the contact treatment (enzyme treatment) between whey and ⁇ -galactosidase or between ⁇ -galactosidase and sialidase is carried out by contacting with a sufficient amount of enzyme for a sufficient period of time. It is preferable that the treatment is performed to such an extent that the reaction does not proceed.
  • the type of the enzyme for example, as a ⁇ -galactosidase, the catalog No. of Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd. When using 072-04141, it is sufficient to use about 65 mU of enzyme for 100 ⁇ L of whey.
  • SIGMA-ALDRICH product number N2876
  • the enzyme treatment can be carried out by adding these enzymes to whey in any vessel.
  • a buffer commonly used in this field can be used to adjust the total protein concentration in whey. It is better to do this in addition.
  • examples of such a buffer include physiological saline, phosphate buffered saline (SPB), Ringer's solution, and the like.
  • the temperature of the enzyme treatment is not particularly limited as long as it is a temperature at which the enzyme exhibits an activity, but is usually a temperature around 37 ° C. at which the enzyme exhibits a high activity.
  • the enzyme treatment is terminated by deactivating the enzyme by heating (heat treatment).
  • the heat treatment is not particularly limited as long as it can inactivate the enzyme.
  • the heat treatment can be performed by heating at about 60 ° C. for about 10 minutes.
  • the enzyme treatment in the present invention can also be performed using a generally known enzyme immobilized on a solid phase (immobilized enzyme).
  • the enzyme-treated whey thus prepared can be used as it is, or it can be used as a concentrated liquid by removing the solvent or as a dried product.
  • ordinary drying means such as reduced-pressure drying, freeze-drying, and spray-drying can be employed, and among them, it is preferable to obtain a dried product by freeze-drying.
  • an enzyme-treated whey exhibiting a desired protein content can be obtained as a whey enzyme-treated product.
  • the enzyme-treated whey provided by the present invention has an excellent effect on suppressing the production of inflammatory cytokines such as IL-1 ⁇ , IL-6, and TNF- ⁇ , and is useful as an inhibitor of inflammatory cytokine production. is there.
  • Administration of the inflammatory cytokine production inhibitor of the present invention depends on the purpose of administration, the type of disease, and symptoms, and is not particularly limited, but the dosage form is a tablet, capsule, granule, powder, powder, It can be administered directly in the form of a liquid or the like, or can be administered as a mixture with food or drinking water. Oral administration is desirable.
  • these dosage forms can be produced by a conventionally known ordinary method, and if necessary, dextrin, lactose, corn starch, an emulsifier, an antiseptic, a preservative, as long as the effects of the present invention are not impaired. It is also possible to add additives such as a shaping agent, a bulking agent, a sweetening agent, a flavoring agent and a coloring agent.
  • the inflammatory cytokine production inhibitor can be administered as a whey enzyme-treated product at a dose containing a protein in the range of 0.02 ⁇ g to 40 mg / kg / dose.
  • the inflammatory cytokine production inhibitor of the present invention can also be used as foods and drinks, such as soft drinks, non-alcoholic drinks such as juices, alcoholic drinks, fermented drinks such as yogurt, Examples include solid confectionery such as tablet confectionery (tablet confectionery) and candy, chewable confectionery of gum and gummy candy sugar, and nutritional supplements containing vitamins, minerals, amino acids, proteins and the like.
  • foods and drinks functionally include foods for specified health use (so-called “Tokuho”), nutritionally functional foods, functionally labeled foods, and the like.
  • Such agents and foods and drinks have the ability to suppress the production of inflammatory cytokines, they can be very useful in preventing, treating, ameliorating, and preventing recurrence of various disease states caused by overproduction of inflammatory cytokines. is there.
  • target diseases include chronic inflammation such as rheumatoid arthritis and ulcerative colitis caused by excessive production of cytokines, Crohn's disease, and furthermore, type 2 diabetes, sepsis, depression, obesity, sepsis, and atheroma.
  • Various diseases such as arteriosclerosis, dermatitis, dementia, schizophrenia and Parkinson's disease can be mentioned.
  • the dose for exerting its inflammatory cytokine production inhibitory ability depends on the purpose of administration, the type of disease, and the symptoms, and is not particularly limited.
  • the amount may be adjusted so that 1 to 5,000 mg, preferably 5 to 1,000 mg, more preferably 10 to 200 mg can be taken per day. That is, it is preferable to ingest a whey enzyme-treated product at a dose containing a protein in the range of 0.02 ⁇ g to 40 mg / kg / dose.
  • the enzyme-treated whey of the present invention is obtained by enzymatic treatment of whey that can be ingested on a daily basis, is highly safe, and has a low toxicity in the amount used in the present invention. It doesn't matter.
  • Example 1 Preparation of Enzyme-treated Whey Crude cheese-free milk (whey obtained from Zao Dairy Center), which was subjected to cheese removal from bovine milk (milk), was centrifuged at 8,000 rpm and 4 ° C. for 1 hour. Note the precipitate and collect the supernatant. Distilled water (Mill-Q grade; the same grade was used unless otherwise specified) was added to the recovered supernatant, and the mixture was dialyzed with a pencil type module UF membrane (Funakoshi, AIP-0013D). At this time, dialysis was performed until the filtrate reached the same volume as the added distilled water to obtain a cheese-free milk (whey: whey). The protein concentration of the obtained de-cheese component milk (whey: whey) was determined by measuring absorbance at a wavelength of 570 nm (using a calibration curve created for bovine serum albumin (SIGMA, A4503)).
  • the de-cheese component milk (whey) obtained above was dispensed so as to have a protein amount of 6 g, and immobilized on the de-cheese component milk (whey) with formyl resin (TOYOPEARL, Formy-650M).
  • formyl resin TOYOPEARL, Formy-650M
  • ⁇ -galactosidase manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd., derived from Escherichia coli
  • the formyl resin was washed with distilled water and stored for repeated use.
  • the filtrate was filter-sterilized with a lab disk (Advantech Toyo Co., Ltd., 50CP020AS).
  • the sterilized filtrate was lyophilized into a powder to obtain a storable powdered enzyme-treated whey.
  • Example 2 Effect of enzyme-treated whey of the present invention on LPS reaction ⁇ Method> According to the test schedule shown in FIG. 1, the effect of the enzyme-treated whey (CWP: Cheese Whey Protein) on the LPS reaction was examined.
  • CWP Enzyme-treated whey Untreated CWP: Enzyme-untreated whey
  • Test schedule The test sample was administered twice a day (11:00 and 17:00) on a schedule of intraperitoneal (ip) administration for 5 consecutive days.
  • ip intraperitoneal
  • the body weight of the experimental animal was measured, and the amount of food consumed during the administration period and the amount of food consumed 24 hours after administration for 5 days were measured.
  • the administration was performed until 11:00 on the 6th day after the start of the test, and the body weight was measured and blood was collected at 15:00 on the 6th day.
  • the significant difference was tested by statistical processing by the Tukey-Kramer test.
  • the dose of CWP and Untreated CWP was 10 mg / kg, and the dose of LPS was 0.33 mg / kg.
  • FIG. 2 shows changes in body weight after LPS administration.
  • LPS as an endotoxin (endotoxin), promotes the secretion of various inflammatory cytokines by a signaling pathway via TLR4 (Toll-like Receptor 4), and causes an inflammatory response.
  • TLR4 Toll-like Receptor 4
  • FIG. 3 shows the change in body weight in comparison between the test group 1 (CWP administration group) and the control group 1 (Saline administration group) for 5 days.
  • the CWP administration group was the same as the control group 1 (Saline administration group). It is understood that CWP is a change in body weight and toxicity is not recognized.
  • FIG. 4 shows the change in food intake during the administration period in comparison between the test group 1 (CWP administration group) and the control group 1 (Saline administration group) for 5 days. (Saline-administered group) had the same food intake. From this point, it is understood that CWP has no toxicity.
  • FIG. 5 shows the amount of food consumed 24 hours after the administration on the fifth day according to the administration schedule in the comparison between the test group 1 (CWP administration group) and the control group 1 (Saline administration group).
  • the administration group showed the same food intake as the control group 1 (Saline administration group), and it was confirmed that no pathological condition causing eating disorders occurred in the test mice.
  • FIG. 6 shows changes in blood TNF- ⁇ after LPS administration.
  • the administration of LPS promoted the production of TNF- ⁇ as an inflammatory cytokine (compared to control group 1 and control group 2). It is understood that the administration significantly reduces the production of TNF- ⁇ as an inflammatory cytokine (comparison between control group 1, control group 2, test group 1 and test group 2).
  • FIG. 7 shows changes in blood IL-1 ⁇ after LPS administration.
  • the administration of LPS promotes the production of IL-1 ⁇ as an inflammatory cytokine (comparison between control group 1 and control group 2).
  • the CWP of the present invention is simultaneously administered, It is understood that the production of IL-1 ⁇ as an inflammatory cytokine is significantly suppressed (comparison between control group 1, control group 2, test group 1 and test group 2).
  • the specific enzyme-treated whey (CWP: Cheese @ Whey @ Protein) provided by the present invention has better inflammatory cytokine production than the enzyme-untreated whey (Untreated @ CWP) without enzyme treatment.
  • An inhibitory effect was exhibited, and thus it was shown that the enzyme-treated whey of the present invention has an anti-inflammatory effect.
  • an inflammatory cytokine production inhibitor highly safe by oral administration or ingestion examples include inflammatory cytokines such as interleukin-1 ⁇ (IL-1 ⁇ ), interleukin-6 (IL-6), and tumor necrosis factor (TNF- ⁇ ) Suppresses excessive production of, resulting in chronic inflammation such as rheumatoid arthritis and ulcerative colitis caused by overproduction of these cytokines, Crohn's disease, furthermore, type 2 diabetes, depression, obesity, sepsis, atheroma It can be an effective remedy for various diseases such as atherosclerosis, dermatitis, dementia, schizophrenia, Parkinson's disease, and by taking it orally on a daily basis, effective daily health management It has the advantages that it can do, and its industrial applicability is enormous.
  • IL-1 ⁇ interleukin-1 ⁇
  • IL-6 interleukin-6
  • TNF- ⁇ tumor necrosis factor

Abstract

炎症性サイトカインであるＴＮＦ－αやＩＬ－１βの産生を抑制し、これら炎症性サイトカインの過剰産生に起因するリウマチ性関節炎、潰瘍性大腸炎などの慢性炎症、クローン病、更には、２型糖尿病、うつ病、肥満症、敗血症、アテローム性動脈硬化症、皮膚炎、認知症、総合失調症、パーキンソン病などの炎症性疾患に有効な医薬品、及び健康食品等の飲食物としの応用が可能な、炎症性サイトカイン産生抑制剤を提供することであり、ホエイ（乳清）をβ－ガラクトシダーゼと接触させてなる酵素処理ホエイを有効成分とすることを特徴とする炎症性サイトカイン産生抑制剤であり、酵素処理ホエイが、さらにシアリダーゼと接触させてなる酵素処理ホエイである炎症性サイトカイン産生抑制剤。

Description

炎症性サイトカイン産生抑制剤
　本発明は、炎症性サイトカイン産生抑制剤に関し、より詳細には、ホエイ（乳清）を酵素処理してなる酵素処理ホエイを有効成分とすることを特徴とする炎症性サイトカイン産生抑制剤、及び炎症性サイトカイン産生抑制飲食品に関する。
　炎症性サイトカインとは、リンパ球やマクロファージなどから産生され、細菌やウイルス感染、腫瘍、組織損傷に伴う炎症反応に関与する物質である。例えば、インターロイキン－１β（ＩＬ－１β）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ－α）などの炎症性サイトカインは、病原菌の侵入に対して免疫機能を賦活化させるなど、本来的には合目的的な機能を有しているが、何らかの原因により過剰に産生され続けるとリウマチ性関節炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、２型糖尿病、肥満症（特にインスリン抵抗性）など様々な炎症性の疾病を引き起こすことが知られている。
　更には、神経炎症の観点から、うつ病などを引き起こすことが知られている。
　すなわち、炎症は、生体内に異物が侵入したときや有害刺激が作用したときに生じる生体防御反応であり、炎症反応は、アテローム性動脈硬化症、神経疾患、癌などの原因となり得ることが知られている。
　そのために、このような病態において、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－αなどのこれら炎症性サイトカインの産生を抑制する薬剤の開発が検討されており、例えば、イブプロフェンやインドメタシン等の既存の抗炎症剤のほか、これまでに種々の化学物質等が提案されている（例えば、特許文献１～３）。しかしながら、これらの疾病は慢性的な経過をたどることが多く、治療は長期化することから、副作用がなく安全な化合物が特に求められている現状下では、いまだ有効なものは登場してきていない。
　かかる観点から、有機化合物に限らず、安全性の確保を主体として、果実の果汁及び／又は抽出物、或いは鉄結合性の糖タンパク質であるラクトフェリンを有効成分とする炎症性サイトカイン産生抑制剤の提案（特許文献４、５）などもなされている。
　ところで、チーズの生産過程で固形物と分離されたホエイ（Whey：乳清）は、その大半は廃棄されているが、高タンパク・低脂肪で乳成分由来カルシウムなどの無機栄養分やビタミンＢ群をはじめ各種ビタミン類など栄養価が高く、消化が速くタンパク質合成・インスリン分泌を促進する点などから、優れた食品であるとの認識が高まってきており、最近になってホエイ（乳清）の有効利用が種々提案されてきている。
　本発明者らも、このホエイ（乳清）の有効利用を検討してきたなかで、ホエイ中に含まれる乳清タンパク質（グリコプロテイン）についてその糖鎖を特定の酵素で処理して切断してなる酵素処理物、すなわち、酵素処理ホエイ（注：ホエイの特定酵素による処理物）に、優れた炎症性サイトカインの産生を抑制する作用があることを新規に見出し、本発明を完成させるに至った。
特開２０１５－１７４８５０号公報 特開２０１４－１０１３２９号公報 特開２００９－０１３１０６号公報 特開２００５－０８９３０４号公報 特開２００６－０６９９９５号公報 特開２００２－０８０３８７号公報
　したがって、本発明は、炎症性サイトカインであるＴＮＦ－αやＩＬ－１βの産生を抑制し、これら炎症性サイトカインの過剰産生に起因するリウマチ性関節炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、２型糖尿病などの炎症性疾患に有効な医薬品、及び健康食品等の飲食物としの応用が可能な、炎症性サイトカイン産生抑制剤を提供することを課題とする。
　かかる課題を解決するための本発明は、基本的態様として、
（１）ホエイ（乳清）をβ－ガラクトシダーゼと接触させてなる酵素処理ホエイを有効成分とすることを特徴とする炎症性サイトカイン産生抑制剤；
（２）酵素処理ホエイが、さらにシアリダーゼと接触させてなる酵素処理ホエイである（１）記載の炎症性サイトカイン産生抑制剤；
（３）炎症性サイトカインとしてインターロイキン－１β（ＩＬ－１β）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）又は腫瘍壊死因子（ＴＮＦ－α）である（１）または（２）に記載の炎症性サイトカイン産生抑制剤；
（４）ホエイ酵素処理物として、０．０２μｇ～４０ｍｇ／ｋｇ／用量の範囲のタンパク質を含むことを特徴とする（１）ないし（３）のいずれかに記載の炎症性サイトカイン産生抑制剤；
（５）上記（１）ないし（３）に記載の炎症性サイトカイン産生抑制剤を含有する、医薬品又は飲食品；
（６）経口投与或いは経口的摂取の形態にある上記（５）に記載の医薬品又は飲食品；
（７）ホエイ（乳清）をβ－ガラクトシダーゼと接触させることにより、ホエイ中のタンパク質のβ－１，６－グリコシド結合を切断させることからなる、炎症性サイトカイン産生抑制作用を有する酵素処理ホエイの調製方法；
（８）β－ガラクトシダーゼが、大腸菌（Escherichia coli）またはウシ肝臓（bovine liver）由来のβ－ガラクトシダーゼである（７）に記載の調製方法；
（９）さらにシアリダーゼと接触させてなる（７）または（８）に記載の炎症性サイトカイン産生抑制作用を有する酵素処理ホエイの調製方法；
である。
　本発明により、安全性の高い、経口的な投与、或いは経口摂取可能な、炎症性サイトカインの産生抑制剤、及び炎症性サイトカイン産生抑制飲食品が提供される。
　本発明が提供する炎症性サイトカインの産生抑制剤は、例えば、インターロイキン－１β（ＩＬ－１β）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、並びに腫瘍壊死因子（ＴＮＦ－α）などの炎症性サイトカインの過剰の産生を抑制することから、これらサイトカインの過剰産生に起因するリウマチ性関節炎、潰瘍性大腸炎などの慢性炎症、クローン病、更には、２型糖尿病、うつ病、肥満症、敗血症、アテローム性動脈硬化症、皮膚炎、認知症、総合失調症、パーキンソン病など様々な疾病に対する有効な治療薬となり得るものであり、また、本発明の炎症性サイトカインの産生抑制剤を含有する飲食品を日常的に経口摂取することにより、日々の健康管理を有効に行える利点を有するものである。
図１は、実施例２におけるリポポリサッカライド（ＬＰＳ）反応に対する本発明の酵素処理ホエイ（ＣＷＰ）の作用を検討した試験スケジュールを示した図である。 図２は、実施例２におけるＬＰＳ投与後の、試験マウスの体重の変化を示した図である。 図３は、実施例２における５日間の試験群１（ＣＷＰ投与群）と対照群１（Saline投与群）の対比における体重変化を示した図である。 図４は、実施例２における５日間の試験群１（ＣＷＰ投与群）と対照群１（Saline投与群）の対比における投与期間中の摂食量の変化を示した図である。 図５は、実施例２における試験群１（ＣＷＰ投与群）と、対照群１（Saline投与群）の対比における投与スケジュールに従った、５日目の投与後２４時間における摂食量を示した図である。 図６は、実施例２の結果２である、ＬＰＳ投与後の血中ＴＮＦ－αの変化を示した図である。 図７は、実施例２の結果２である、ＬＰＳ投与後の血中ＩＬ－１βの変化を示した図である。
　上記したように、本発明は、その基本的態様は、ホエイ（Whey：乳清）をβ－ガラクトシダーゼと接触させてなる酵素処理ホエイを有効成分とすることを特徴とする炎症性サイトカイン産生抑制剤である。
　ここで使用するホエイ（乳清）とは、一般的にチーズの製造過程において生じる固形物が分離されたときに生じる副産物として大量に作られる淡黄緑色の液体であるが、本発明にあってはこれに限定されず、ホエイ（乳清）として流通しているものも使用することができる。
　また、チーズ製造の原料となる乳は、ウシ由来の牛乳のみならず、他の哺乳類としてのヒツジ、ヤギ、ラクダ等の乳から得られるホエイ（乳清）であってもよい。
　この場合のウシにあっても、ホルスタイン種、黒毛和種、水牛などのウシの種類にかかわらず、いずれの種のものをも使用することができる。
　なお、以下本明細書においては、ホエイ（乳清）について、単に「ホエイ」として表記する。
　本発明が提供する炎症性サイトカイン産生抑制剤としての酵素処理ホエイは、上記したホエイをβ－ガラクトシダーゼと接触させてなる酵素処理ホエイである。
　この場合に使用するβ－ガラクトシダーゼは、特に制限はなく、周知のいずれの種類のものも使用することができる。そのようなものとしては、例えば、大腸菌（Escherichia coli）由来のもの、ウシ肝臓（bovine liver）由来のものなどを挙げることができるが、なかでも大腸菌（Escherichia coli）由来のβ－ガラクトシダーゼを用いるのが良い。
　そのようなβ－ガラクトシダーゼとして市販されている、例えば、富士フイルム和光純薬（株）のカタログＮｏ．０７２－０４１４１（Escherichia coli由来）、オリエンタル酵母工業（株）製のβ－ガラクトシダーゼ（Escherichia coli由来）、ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ社のＧ１８７５（bovine liver由来）などを挙げることができる。
　本発明が提供する炎症性サイトカイン産生抑制剤である酵素処理ホエイは、ホエイをかかるβ－ガラクトシダーゼにより、ホエイ中のタンパク質のβ－１，６－グリコシド結合を切断させること、すなわち糖質を切断することにより、所望のタンパク質含有量の処理物を生成し、炎症性サイトカイン産生抑制作用を発揮するものであり、後記する実施例からも判明するように、かかる酵素処理をしないホエイ自体、すなわち、酵素未処理ホエイには、炎症性サイトカイン産生抑制作用は認められなかった。
　本発明にあっては、上記したβ－ガラクトシダーゼによる処理に加えて、更に糖脂質糖鎖末端からα－グリコシド結合シアル酸残基を脱離する糖分解酵素であるシアリダーゼと処理することもできる。
　そのようなシアリダーゼとしては、特に限定なく、周知のいずれの種類のものも使用することができ、例えば、ウェルシュ菌（Clostridium perfringenes）由来のもの、レンサ球菌（Streptococcus 6646K）由来のもの、コレラ菌（Vibrio cholerae）由来のもの、アースロバクター・ウレアファシエンス（Arthrobacter ureafaciens）由来のものなどを挙げることができる。
　市販されているものとしては、例えば、ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ社の製品番号（Sigma Prod. Nos.）Ｎ２８７６、Ｎ２１３３、Ｎ２９０４、Ｎ３００１、Ｎ５６３１、生化学バイオビジネス社のコード番号（Code Number）１２００５２、ＢｉｏＬａｂｓ社のカタログ番号（Catalog ＃）Ｐ０７２０Ｌ、Ｐ０７２０Ｓなどがあげられる。
　本発明におけるホエイとβ－ガラクトシダーゼ、若しくは、β－ガラクトシダーゼとシアリダーゼとの接触処理（酵素処理）は、それぞれ、十分な量の酵素を用いて十分な時間接触させることにより、それ以上実質的に酵素反応が進行しない程度まで行うことによる処理が好ましい。
　このような目的には、酵素の種類にもよるが、例えば、β－ガラクトシダーゼとして富士フイルム和光純薬（株）のカタログＮｏ．０７２－０４１４１を用いる場合、ホエイ１００μＬに対して、酵素を６５ｍＵ程度使用すれば十分である。また、例えば、シアリダーゼとしてＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ社の製品番号（Ｎ２８７６）を用いる場合、ホエイ１００μＬに対して、酵素を６５ｍＵ程度使用すれば十分である。この場合の酵素処理の時間としては、３時間程度行えば十分である。
　酵素処理は、任意の容器中で、これら酵素を、ホエイに添加して実施することができるが、所望により、ホエイ中の総タンパク質濃度を調整するために、この分野で通常用いられる緩衝液を加えて行うのがよい。そのような緩衝液としては、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＳＰＢ）、リンゲル液などを挙げることができる。
　なお、酵素処理の温度は、酵素が活性を示す温度であれば特に限定はないが、通常酵素が高い活性を示す３７℃付近の温度である。
　酵素処理は、加熱（熱処理）により、酵素を失活させることにより終了する。かかる熱処理は、酵素を失活させることができる限り特に限定されないが、例えば、６０℃付近の温度で、約１０分間加熱することにより、実施することができる。
　なお、本発明における酵素処理は、一般的に知られている固相に固定した酵素（固定化酵素）を用いて行うこともできることはいうまでもない。
　かくして、調製された酵素処理ホエイは、そのまま使用することができる以外、溶媒を留去して濃縮液として、或いは乾燥物として使用することができる。
　乾燥にあたっては、減圧乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥等の通常の乾燥手段を採用することができるが、なかでも凍結乾燥により乾燥物とするのが好ましい。
　かくして、ホエイ酵素処理物として、所望のタンパク質含量を示す、酵素処理ホエイを得ることができる。
　本発明が提供する酵素処理ホエイは、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α等の炎症性サイトカインの産生抑制に対して優れた作用を示し、炎症性サイトカインの産生抑制剤として有益なものである。
　本発明の炎症性サイトカインの産生抑制剤の投与は、投与目的、疾患の種類、症状によって異なり、特に限定されるものではないが、剤型は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、液剤等にして直接投与したり、食品や飲水に混ぜて投与したりすることができ、経口的に投与することが望ましい。
　また、これらの剤型は、従来から知られている通常の方法で製造することができ、本発明の効果を損なわない範囲で、必要に応じてデキストリン、乳糖、コーンスターチ、乳化剤、防腐剤、賦形剤、増量剤、甘味剤、香味剤、着色剤等の添加剤を配合することも可能である。
　この場合の炎症性サイトカイン産生抑制剤としては、ホエイ酵素処理物として、０．０２μｇ～４０ｍｇ／ｋｇ／用量の範囲のタンパク質を含む用量で投与することができる。
　一方、本発明の炎症性サイトカイン産生抑制剤は、飲食品として使用することもでき、そのような飲食品としては、清涼飲料水、ジュース等の非アルコール飲料、アルコール飲料、ヨーグルト等の発酵飲料、錠菓（タブレット菓子）や飴等の固形菓子、ガムやグミ菓子糖のチュアブル菓子、並びに、ビタミン、ミネラル、アミノ酸、蛋白等を含有する栄養補助食品等の形態を挙げることができる。
　かかる飲食品には、機能的に特定保健用食品（いわゆる、「トクホ」）、栄養機能食品、及び機能性表示食品等が含まれる。
　これらの剤及び飲食品は、炎症性サイトカインの産生抑制能を有するので、炎症性サイトカインの過剰産生により引き起こされるさまざまな病態の予防、治療、改善、再発防止に非常に有益なものとなり得るものである。
　そのような対象疾患としては、サイトカインの過剰産生に起因するリウマチ性関節炎、潰瘍性大腸炎などの慢性炎症、クローン病、更には、２型糖尿病、敗血症、うつ病、肥満症、敗血症、アテローム性動脈硬化症、皮膚炎、認知症、総合失調症、パーキンソン病など様々な疾病を挙げることができる。
　本発明の炎症性サイトカイン産生抑制剤については、その炎症性サイトカイン産生抑制能を発揮させるための投与量としては、投与目的、疾患の種類、症状によって異なり、特に限定されないが、酵素処理ホエイとして、一日当たり１～５，０００ｍｇ、好ましくは５～１，０００ｍｇ、さらに好ましくは、１０～２００ｍｇ摂取できるよう配合量等を調整すれば良い。
　すなわち、ホエイ酵素処理物として、０．０２μｇ～４０ｍｇ／ｋｇ／用量の範囲のタンパク質を含む用量で摂取することが好ましい。
　なお、本発明の酵素処理ホエイは、日常的に摂食することが可能であるホエイの酵素処理により得られるものであり、安全性が高いものであり、本発明において使用される量では毒性は問題にならない。
　以下に、実施例及び試験例を示し、本発明についてより詳細に説明するが、これらは単に例示するのみであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
実施例１：酵素処理ホエイの調製
　ウシ乳（牛乳）より脱チーズ成分処理した粗脱チーズ成分乳（一般財団法人蔵王酪農センターから入手した乳清）を８，０００ｒｐｍ、４℃で１時間遠心し、沈殿物に注意して、上清を回収した。回収した上清と等量の蒸留水（Ｍｉｌｌ－Ｑグレード。以下、特に断りの無い限り同じグレードのものを使用）を加え、ペンシル型モジュールＵＦ膜（フナコシ、ＡＩＰ－００１３Ｄ）で透析処理した。この時、濾液が加えた蒸留水と等量に達するまで透析を行い、脱チーズ成分乳（ホエイ：乳清）を得た。
　得られた脱チーズ成分乳（ホエイ：乳清）のタンパク質濃度を、波長５７０ｎｍでの吸光度測定により決定（ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ、ＳＩＧＭＡ、Ａ４５０３）について作成した検量線を使用）した。
　上記で得た脱チーズ成分乳（ホエイ）を、そのタンパク量が６ｇとなるように分注し、該脱チーズ成分乳（ホエイ）に、ホルミル樹脂（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ社、Ｆｏｒｍｙ－６５０Ｍ）で固定化したβ－ガラクトシダーゼ（オリエンタル酵母工業（株）製、大腸菌由来）を４ｇ／６，０００Ｕ添加し、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、反応液をグラスフィルターで濾過し、ホルミル樹脂を分離した。ホルミル樹脂は蒸留水で洗浄し、繰り返し使用のため保存した。濾液を、ラボディスク（アドバンテック東洋（株）、５０ＣＰ０２０ＡＳ）でフィルター滅菌した。滅菌した濾液は、凍結乾燥して粉末化し、保存可能な粉末状の酵素処理ホエイとした。
実施例２：ＬＰＳ反応に対する本発明の酵素処理ホエイの作用
＜手法＞
　図１に示した試験スケジュールにより、ＬＰＳ反応に対する本発明の酵素処理ホエイ（ＣＷＰ：Cheese Whey Protein）の作用を検討した。
　なお、以下の記載（明細書及び図中）において、「ＣＷＰ」、「Untreated ＣＷＰ」の表記を使用する場合もあるが、これらはそれぞれ、以下を意味する。
　ＣＷＰ：酵素処理ホエイ
　Untreated ＣＷＰ：酵素未処理ホエイ
（１）実験動物
　１２～１５週齢のオスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本チャールス・リバー社）を使用した。
（２）試験スケジュール
　１日２回（１１時と１７時）、試験試料を腹腔内（ｉｐ）投与するスケジュールで連続５日間投与した。
　なお、１日２回の投与時において実験動物の体重測定を行い、投与期間中の摂食量と、５日間投与後２４時間の摂食量を測定した。
　試験開始後６日目の１１時までの投与を行い、６日目の１５時に体重測定と採血を行い、血液中のＴＮＦ－α及びＩＬ－１βの濃度を、それぞれのＥＬＩＳＡキットにより測定した。
　なお、Tukey-Kramer検定による統計学的処理により、有意差を検定した。
（３）試験試料投与群
　試験試料投与群は、以下のとおりとした（ｎは、用いた動物数である）。
　　○対照群１　　：生理食塩水（Saline）＋生理食塩水（Saline）(ｎ＝１０)
　　○対照群２　　：生理食塩水（Saline）＋ＬＰＳ（ｎ＝１２）
　　○試験群１　　：ＣＷＰ＋生理食塩水（Saline）（ｎ＝５）
　　○試験群２　　：ＣＷＰ＋ＬＰＳ（ｎ＝９）
　　○比較試験群１：Untreated ＣＷＰ＋生理食塩水（Saline）（ｎ＝６）
　　○比較試験群２：Untreated ＣＷＰ＋ＬＰＳ（ｎ＝６）
　なお、ＣＷＰ及びUntreated ＣＷＰの投与量は１０ｍｇ／ｋｇとし、ＬＰＳの投与量は０．３３ｍｇ／ｋｇとした。
（４）採血の方法
　採血は、眼窩動脈よりチューブにて採血した。なお、チューブには、０．２Ｍ ＥＤＴＡの１０μＬ、及びアプロチニン０．１ｍｇを含む。
（５）血漿の分離
　４℃で、３，０００×ｇにて４分間遠心し血漿を採取し、アッセイまで－８０℃で保存した。
（６）血中ＴＮＦ－α及びＩＬ－１βの測定方法
　ＴＮＦ－αは、マウスＱｕａｎｔｉｋｅ ＴＮＦ－α ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ社）を用い、ＩＬ－１βは、マウスＱｕａｎｔｉｋｅ ＩＬ－１β ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ社）を用い、それぞれのキットの説明書に従って行った。
＜結果＞
結果１：ＬＰＳ投与後の体重変化について
　図２に、ＬＰＳ投与後の体重の変化を示した。
　ＬＰＳは、エンドトキシン（内毒素）として、ＴＬＲ４（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　４）を介するシグナル伝達経路により種々の炎症性サイトカインの分泌を促進し、炎症反応を引き起こす。
　図中に示した結果から判明するように、ＬＰＳ投与により体重の減少が観察されるが、ＣＷＰ投与群では体重減少が有意に抑制されており、ＬＰＳによるサイトカイン産生増加による摂食抑制作用が減弱していることが明らかとなった。
　一方、これに対してUntreated ＣＷＰ投与群では、ＬＰＳ投与による体重減少の抑制は観察されず、ＣＷＰに特異的な炎症性サイトカインの産生抑制作用があることが理解される。
　図３に、５日間の試験群１（ＣＷＰ投与群）と対照群１（Saline投与群）の対比における体重変化を示したが、ＣＷＰ投与群は、対照群１（Saline投与群）と同様の体重変化であり、ＣＷＰには毒性が認められるものでないことが理解される。
　同様に、図４に５日間の試験群１（ＣＷＰ投与群）と対照群１（Saline投与群）の対比における投与期間中の摂食量の変化を示したが、ＣＷＰ投与群は、対照群１（Saline投与群）と同様の摂食量であり、この点からも、ＣＷＰには毒性が認められるものでないことが理解される。
　また、図５に、試験群１（ＣＷＰ投与群）と、対照群１（Saline投与群）の対比における投与スケジュールに従った、５日目の投与後２４時間における摂食量を示したが、ＣＷＰ投与群は、対照群１（Saline投与群）と同様の摂食量を示しており、試験マウスにおいては摂食障害を引き起こす病態がなんら発生していないことが確認された。
結果２：ＬＰＳ投与後の血中ＴＮＦ－α及びＩＬ－１βの変化について
（１）血中ＴＮＦ－αの変化
　図６にＬＰＳ投与後の血中ＴＮＦ－αの変化を示した。
　図中に示した結果から判明するように、ＬＰＳの投与により炎症性サイトカインとしてのＴＮＦ－αの産生が促進されているが（対照群１および対照群２の対比）、同時に本発明のＣＷＰを投与すると、炎症性サイトカインとしてのＴＮＦ－αの産生が有意に抑制されていることが理解される（対照群１、対照群２、試験群１および試験群２での対比）。
　これに対してUntreated ＣＷＰ投与群では、ＬＰＳ投与による炎症性サイトカインであるＴＮＦ－αの産生増加に対する抑制作用は観察されず、本発明のＣＷＰ（酵素処理ホエイ）には、特異的な炎症性サイトカインの産生抑制作用があることが理解される。
（２）血中ＩＬ－１βの変化
　図７にＬＰＳ投与後の血中ＩＬ－１βの変化を示した。
　上記したＴＮＦ－αと同様に、ＬＰＳの投与により炎症性サイトカインとしてのＩＬ－１βの産生が促進されているが（対照群１および対照群２の対比）、同時に本発明のＣＷＰを投与すると、炎症性サイトカインとしてのＩＬ－１βの産生が有意に抑制されていることが理解される（対照群１、対照群２、試験群１および試験群２での対比）。
　これに対してUntreated ＣＷＰ投与群では、ＬＰＳ投与による炎症性サイトカインであるＩＬ－１βの産生増加に対する抑制作用は観察されず、本発明のＣＷＰ（酵素処理ホエイ）に特異的な炎症性サイトカインの産生抑制作用があることが理解される。
　以上の検討から、本発明が提供する特異的な酵素処理ホエイ（ＣＷＰ：Cheese Whey Protein）は、酵素処理をしていない酵素未処理ホエイ（Untreated ＣＷＰ）に比較して、良好に炎症性サイトカイン産生抑制効果が発揮されており、したがって、本発明の酵素処理ホエイに抗炎症作用があることが示された。
　本発明により、経口的な投与、或いは摂取により安全性の高い炎症性サイトカインの産生抑制剤が提供される。
　本発明が提供する炎症性サイトカインの産生抑制剤は、例えば、インターロイキン－１β（ＩＬ－１β）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、並びに腫瘍壊死因子（ＴＮＦ－α）などの炎症性サイトカインの過剰の産生を抑制することから、これらサイトカインの過剰産生に起因するリウマチ性関節炎、潰瘍性大腸炎などの慢性炎症、クローン病、更には、２型糖尿病、うつ病、肥満症、敗血症、アテローム性動脈硬化症、皮膚炎、認知症、総合失調症、パーキンソン病など様々な疾病に対する有効な治療薬となり得るものであり、また、日常的に経口摂取することにより、日々の健康管理を有効に行える利点を有するものであり、その産業上の利用性は多大なものである。

Claims (9)

  1. 　ホエイ（乳清）をβ－ガラクトシダーゼと接触させてなるホエイ酵素処理物を有効成分とすることを特徴とする炎症性サイトカイン産生抑制剤。
  2. 　酵素処理物が、さらにシアリダーゼと接触させてなるホエイ酵素処理物である請求項１記載の炎症性サイトカイン産生抑制剤。
  3. 　炎症性サイトカインとしてインターロイキン－１β（ＩＬ－１β）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）又は腫瘍壊死因子（ＴＮＦ－α）である請求項１または２に記載の炎症性サイトカイン産生抑制剤。
  4. 　ホエイ酵素処理物として、０．０２μｇ～４０ｍｇ／ｋｇ／用量の範囲のタンパク質を含むことを特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載の炎症性サイトカイン産生抑制剤。
  5. 　請求項１ないし３に記載の炎症性サイトカイン産生抑制剤を含有する、医薬品又は飲食品。
  6. 　経口投与或いは経口的摂取の形態にある請求項５に記載の医薬品又は飲食品。
  7. 　ホエイ（乳清）をβ－ガラクトシダーゼと接触させることにより、ホエイ中のタンパク質のβ－１，６－グリコシド結合を切断させることからなる、炎症性サイトカイン産生抑制作用を有するホエイ酵素処理物の調製方法。
  8. 　β－ガラクトシダーゼが、大腸菌（Eschericia coli）またはウシ肝臓（bovine liver）由来のβ－ガラクトシダーゼである請求項７に記載の調製方法。
  9. 　さらにシアリダーゼと接触させてなる請求項７または８に記載の炎症性サイトカイン産生抑制作用を有するホエイ酵素処理物の調製方法。
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Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002080387A (ja) 2000-06-28 2002-03-19 Kikkoman Corp 抗アレルギー剤およびその製造方法
JP2004196707A (ja) * 2002-12-18 2004-07-15 Meiji Milk Prod Co Ltd 炎症性サイトカイン産生抑制活性を有するペプチド
JP2005089304A (ja) 2003-09-12 2005-04-07 Nippon Menaade Keshohin Kk 炎症性サイトカインの産生抑制剤
JP2006069995A (ja) 2004-09-06 2006-03-16 Snow Brand Milk Prod Co Ltd 炎症性サイトカイン産生抑制剤
JP2009013106A (ja) 2007-07-04 2009-01-22 Yoshihiro Futamura 炎症性サイトカイン産生抑制作用を有するキサントン誘導体、それらの製造方法、それからなる食品製剤、化粧品、抗炎症剤
JP2011173798A (ja) * 2010-02-23 2011-09-08 Yakult Honsha Co Ltd 腸間膜脂肪低減剤
JP2013507134A (ja) * 2009-10-16 2013-03-04 デアリ オーストラリア リミテッド 酸処理水性乳清タンパク質抽出物を使用したアレルギー治療
JP2014101329A (ja) 2012-11-21 2014-06-05 Kao Corp 抗炎症剤
JP2014101305A (ja) * 2012-11-19 2014-06-05 Snow Brand Milk Products Co Ltd アレルギー改善剤
JP2015174850A (ja) 2014-03-17 2015-10-05 佐賀県 抗炎症化合物
WO2016039356A1 (ja) * 2014-09-09 2016-03-17 森永乳業株式会社 抗炎症剤

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101626291B1 (ko) * 2013-11-13 2016-06-02 충남대학교산학협력단 알칼리 단백분해효소를 이용한 유청 단백질의 가수분해물을 함유하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물
WO2015132402A1 (en) * 2014-03-06 2015-09-11 Arla Foods Amba Lactose-reduced milk products containing galacto-oligosaccharides and monosaccharides and a method of production
JPWO2016194914A1 (ja) * 2015-06-01 2018-04-26 再生ファーマ株式会社 乳酵素処理物、その製造方法、組成物および製品

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002080387A (ja) 2000-06-28 2002-03-19 Kikkoman Corp 抗アレルギー剤およびその製造方法
JP2004196707A (ja) * 2002-12-18 2004-07-15 Meiji Milk Prod Co Ltd 炎症性サイトカイン産生抑制活性を有するペプチド
JP2005089304A (ja) 2003-09-12 2005-04-07 Nippon Menaade Keshohin Kk 炎症性サイトカインの産生抑制剤
JP2006069995A (ja) 2004-09-06 2006-03-16 Snow Brand Milk Prod Co Ltd 炎症性サイトカイン産生抑制剤
JP2009013106A (ja) 2007-07-04 2009-01-22 Yoshihiro Futamura 炎症性サイトカイン産生抑制作用を有するキサントン誘導体、それらの製造方法、それからなる食品製剤、化粧品、抗炎症剤
JP2013507134A (ja) * 2009-10-16 2013-03-04 デアリ オーストラリア リミテッド 酸処理水性乳清タンパク質抽出物を使用したアレルギー治療
JP2011173798A (ja) * 2010-02-23 2011-09-08 Yakult Honsha Co Ltd 腸間膜脂肪低減剤
JP2014101305A (ja) * 2012-11-19 2014-06-05 Snow Brand Milk Products Co Ltd アレルギー改善剤
JP2014101329A (ja) 2012-11-21 2014-06-05 Kao Corp 抗炎症剤
JP2015174850A (ja) 2014-03-17 2015-10-05 佐賀県 抗炎症化合物
WO2016039356A1 (ja) * 2014-09-09 2016-03-17 森永乳業株式会社 抗炎症剤

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANDO, KUNIO: " About whey", SCIENCE OF COOKERY, vol. 19, no. 2, 1986, pages 8 - 12, XP009527200, ISSN: 0910-5360 *
CHEN X Y ET AL.: "Review Lactose and lactose-derived oligosaccharides : More than prebiotics?", INT DAIRY J., vol. 67, 2017, pages 61 - 72, XP055693005 *
See also references of EP3848041A4
YOSHIMURA, AKIHIKO: "Elucidation of the control mechanism of inflammatory disease by cytokines", UEHARA MEMORIAL FOUNDATION RESEARCH REPORTS, vol. 25, no. 73, 2011, pages 1 - 7, XP009527201, ISSN: 2433-3441 *
YU L ET AL.: "Production of galactooligosaccharides using a hyperthermophilic beta-galactosidase in permeabilized whole cells of Lactococcus lactis", J DAIRY SCI., vol. 97, no. 2, 2014, pages 694 - 703, XP055693007 *

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