WO2020050102A1

WO2020050102A1 - 癒着防止材

Info

Publication number: WO2020050102A1
Application number: PCT/JP2019/033549
Authority: WO
Inventors: 田口　哲志
Original assignee: 国立研究開発法人物質・材料研究機構
Priority date: 2018-09-05
Filing date: 2019-08-27
Publication date: 2020-03-12
Also published as: CN112512602A; JPWO2020050102A1; US20210316046A1; JP7127888B2; EP3848066B1; EP3848066A1; EP3848066A4

Abstract

癒着防止性に優れ、手術部位の複雑な形状に沿って貼付することが容易な癒着防止材及び該癒着防止材を施与する工程を含む癒着防止法を提供する。　（１）ゼラチン誘導体を含む第１剤であって、該ゼラチン誘導体は、　（ａ）下記式で表される構造を含み、　ＧｌｔｎＮＨ－ＣＨＲ^１Ｒ^２　上式においてＧｌｔｎはゼラチン残基であり、Ｒ^１は炭素数５～１７のアルキル基であり、Ｒ^２は水素原子または炭素数５～１７のアルキル基である；　（ｂ）イミノ基／アミノ基（モル比）が１／９９～３０／７０であり；　（ｃ）重量平均分子量が１０,０００～５０,０００である、第１剤、及び　（２）該ゼラチン誘導体の架橋剤を含む第２剤からなる癒着防止材。

Description

癒着防止材

　本発明は、生体組織の癒着防止材に関し、詳細には所定の疎水性基を有するゼラチン誘導体を主剤とする生体吸収性の癒着防止材にする。

　癒着防止材は、手術後の癒着の軽減を目的に、手術時に適用部位に直接使用する生体吸収性の合成材料として定義され（「特定医療材料及びその材料価格（材料価格基準）」平成２８年厚生労働省告示第４０２号）、一般的には「癒着防止吸収性バリア」と呼ばれる。癒着防止材には、手術部位に貼付して施与されるシート型と、液状もしくは使用時に液状に調製されて、噴霧により施与されるスプレー型がある。前者の例として、ヒアルロン酸ナトリウムとカルボキシメチルセルロースを主成分とするもの（セプラフィルム（商標）、科研製薬株式会社）、ゼラチンを主成分とするもの（ゼルフィルム（商標）、ファイザー株式会社、及び特許文献１）、後者の例としてＮ－ヒドロキシスクシンイミド化デキストリンと炭酸ナトリウム／炭酸水素ナトリウムの２剤から成るもの（アドスプレー（商標）、テルモ株式会社）がある。

　癒着防止材には、組織表面を覆って保護することが必要とされるが、フィルム状のものは手術部位の複雑な形状に沿って貼付することが困難である。またセプラフィルムは一旦水に濡れると著しく操作性が低下するため、位置を修正することは実際上不可能である。その点、スプレー型のものは手術部位に沿って、且つより広く施与することができる。

　ところで、本発明者らは、疎水性基を導入したゼラチン誘導体（以下「疎水化ゼラチン」という場合がある）と硬化剤とをスプレーにより組織に施与する外科用シーラントの開発を進めてきた（例えば特許文献２、特許文献３）。同シーラントは、疎水性基を有することによって組織への親和性が高く、該疎水基を有しないゼラチンやフィブリンシーラントに比べて顕著に高いシーリング強度を有する。

特開２０１３－２２６１６６号公報ＷＯ２０１４／１１２２０８号特許第５９９５１２８号

　上記シーラントは組織への高い接着性から、手術部位以外の組織への接着が危惧された。しかし、驚くことに、該シーラントは硬化されて膜となった後には、優れた癒着防止効果を奏することを見出し、本発明を完成した。

　即ち、本発明は、下記のものである：
（１）ゼラチン誘導体を含む第１剤であって、該ゼラチン誘導体は、
　（ａ）下記式で表される構造を含み、

　　　ＧｌｔｎＮＨ－ＣＨＲ^１Ｒ^２

　　　上式においてＧｌｔｎはゼラチン残基であり、Ｒ^１は炭素数５～１７のアルキル基であり、Ｒ^２は水素原子または炭素数５～１７のアルキル基である；
　（ｂ）イミノ基／アミノ基（モル比）が１／９９～３０／７０であり；
　（ｃ）重量平均分子量が１０,０００～５０,０００である、
第１剤、及び
（２）該ゼラチン誘導体の架橋剤を含む第２剤
からなる癒着防止材。

　癒着防止材は噴霧により組織に施与することができるので、複雑な形状の手術部位でも容易に施与することができる。該癒着防止材の硬化膜は、優れた癒着防止性を示す。手術部位への接着性も高いので、接着性癒着防止材として、又は癒着防止性を有する外科用シーラントとしても使用できる。また、主剤であるゼラチン誘導体は水性溶媒中で作ることができ、製造環境及び体内において安全であるだけでなく、一段工程で簡易に且つ高い収率で合成することができる。

図１は、細胞接着数を示すグラフである。図２は、細胞透過性試験に用いた装置の模式図である。図３は、細胞透過率を示すグラフである。図４ａは手術後１週間の手術部位の組織の断面写真である。図４ｂは手術後２週間の手術部位の組織の断面写真である。破裂強度の結果を示すグラフである。破裂強度測定後の試験片の断面写真である。タンパク質透過性試験に用いた装置の模式図である。タンパク質透過割合を示すグラフである。膨潤度の経時変化を示すグラフである。酵素文献による重量減を示すグラフである。

　本発明の癒着防止材は、実質的に硬化膜を形成する主剤としてゼラチン誘導体を含む第１剤と該ゼラチン誘導体の架橋剤を含む第２剤からなる、２剤型である。第１剤と第２剤は別々に包装されて供され、使用に際して混合される。以下、それらの詳細について説明する。
＜第１剤＞
　本発明の癒着防止材において、第１剤はゼラチン誘導体を含む。該ゼラチン誘導体はイミノ基、即ち、－ＮＨ－、を介して結合された疎水性基を有し、下記式示される構造を含む。

ＧｌｔｎＮＨ－ＣＨＲ^１Ｒ^２

上式において、Ｇｌｔｎはゼラチン残基であり、Ｒ^１は炭素数５～１７のアルキル基であり、Ｒ^２は水素原子又は炭素数５～１７のアルキル基である。Ｎは、ゼラチン中の主としてリジン（Ｌｙｓ）のε－アミノ基由来である。好ましくは、Ｒ^２が水素原子である。該式（１）のＮＨ構造は、例えばＦＴ‐ＩＲスペクトルにおいて３３００ｃｍ^－１付近のバンドにより検出することができる。

　Ｒ^２が炭素数５～１７のアルキル基である場合、Ｒ^１と同じでも互いに異なっていてもよい。該アルキル基は分岐を含んでいてもよい。該アルキル基の例としては、ヘキシル基、オクチル基（又はカプリル基）、ノニル基（又はペラルゴルニル基）、ドデジシル基（又はラウリル基）、テトラデシル基（又はミリスチル基）等が挙げられる。好ましくは、Ｒ^１が炭素数５～１１の直鎖アルキル基であり、Ｒ^２が水素原子である。

　該ゼラチン誘導体中の誘導化率は、アルキル基が結合されたイミノ基の、原料ゼラチン中のアミノ基量に対するモル％で、１～２０モル％、好ましくは５～１０モル％である。言い換えれば、得られたゼラチン誘導体におけるイミノ基／アミノ基（モル比）は、１／９９～２０／８０であり、好ましくは５／９５～１０／９０である。該誘導化率は、原料ゼラチン中のアミノ基と、アルキル基を結合した後のアミノ基量を、２，４，６-トリニトロベンゼンスルホン酸法（ＴＮＢＳ法）によって定量することで、或いは、ＮＭＲ等によりアルキル基の同定及び定量を行うことによって求めることができる。

　原料ゼラチンは、天然由来、合成、発酵又は遺伝子組換えにより得られるゼラチンのいずれであってもよく、好ましくはブタ、ウシ等の動物由来、スケトウダラ等の魚由来のゼラチンが使用される。また、酸処理ゼラチン、アルカリ処理ゼラチン、遺伝子組み換えゼラチンのいずれであってもよいが、好ましくはアルカリ処理ゼラチンであり、より好ましくは低エンドトキシン化ゼラチンである。また、該ゼラチンの分子量の範囲は、ゼラチン誘導体の重量平均分子量（Ｍｗ）が１０，０００～１００，０００となる範囲であることが好ましく、１０，０００～５０，０００となる範囲であることがより好ましい。該分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により定法に従い測定することができる。

　第１剤は、上記ゼラチン誘導体に加えて、誘導体化されていないゼラチンを含んでもよい。該ゼラチンとしては、上述の各種ゼラチンを用いることができる。誘導体化されていないゼラチンの量は、ゼラチン誘導体との合計重量の０～９９ｗｔ％であり、好ましくは、０～５０ｗｔ％である。

　第１剤は、該ゼラチン誘導体を溶解又は分散するための水性溶媒をさらに含んでよい。利便性の点から、該ゼラチン誘導体を該水性溶媒に溶解又は分散して水性液（以下、単に「水溶液」という場合がある）として供してもよい。該水性溶媒としては、超純水、生理食塩水、ホウ酸、リン酸、炭酸等各種酸とその塩を含む緩衝液又はこれらの混合物を用いることができる。好ましくはｐＨ８～１１、より好ましくはｐＨ９～１０のホウ酸緩衝液が使用される。該水性溶媒は、ゼラチン誘導体が１０～８０ｗｔ／ｖ％、好ましくは１５～３０ｗｔ／ｖ％となるような量で使用される。誘導体化されていないゼラチンを含む場合には、ゼラチン誘導体との合計重量が上記濃度となる量である。

＜第２剤＞
本発明において、第２剤はゼラチン誘導体の架橋剤であり、架橋により水、血液等の体液に不溶性の構造体、例えば膜を形成する。該架橋剤としては、ゼラチン中のアミノ基、主として側鎖の第一級アミノ基、と反応性の官能基を分子中に少なくとも２つ以上有するものの少なくとも一種が使用される。架橋剤の例としては、ゲニピン、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドもしくはＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミドで活性化された多塩基酸、アルデヒド化合物、酸無水物、及びジイソチオシアンネートが挙げられる。

　多塩基酸としては、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、グルタル酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、オキサロ酢酸、cis－アコニット酸、２－ケトグルタル酸、ポリ酒石酸、ポリクエン酸、ポリリンゴ酸、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、カルボキシメチル化デキストリン、カルボキシメチル化デキストラン、カルボキシメチル化デンプン、カルボキシメチル化セルロース、カルボキシメチル化キトサン、カルボキシメチル化プルラン等が例示され、これらのカルボキシル基が活性エステル化されたもの、例えばジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、ジスクシンイミジルタートレート（ＤＳＴ）等を使用することができる。

　また、ポリエチレングリコールもしくはポリエチレングリコールエーテルの、多塩基酸エステルで、該多塩基酸の、ポリエチレングリコールと反応していないカルボキシル基の少なくとも１つが活性エステル化されたもの、例えば４，７，１０，１３，１６－ペンタオキサノナデカン二酸ジ（Ｎ-スクシンイミジル)、及び下記式で表されるポリエチレングリコール　ジ（スクシンイミジル　スクシネート）（ＳＳ－ＰＥＧ－ＳＳ）:

（ｎはＭｗが約１０，０００～２０，０００となる数）；
さらに、下記式で表されるペンタエリスリトール‐ポリエチレングリコールエーテル　テトラスクシンイミジル　グルタレート（４Ｓ－ＰＥＧ）：

（ｎはＭｗが約３，０００～３０，０００、好ましくは約５，０００～２７，０００、より好ましくは約１０，０００～２０，０００となる数）；
が挙げられる。

　アルデヒド化合物としては、１分子中に２つ以上のアルデヒド基が導入された、アルデヒド基導入多糖類、例えばアルデヒド基導入デンプン、アルデヒド基導入デキストラン、アルデヒド基導入デキストリン及びアルデヒド基導入ヒアルロン酸が、酸無水物としては、無水グルタル酸、無水マレイン酸、及び無水コハク酸が、ジイソチオシアンネートとしてはヘキサメチレンジイソチオシアネート等が例示される。これらのうち、上記活性化ポリエチレングリコール多塩基酸エステル、及びアルデヒド基導入多糖類が好ましく使用される。

　これらの架橋剤は、ゼラチン誘導体のアミノ基１当量に対して、該架橋剤中の官能基、例えばＮ－ヒドロキシスクシンイミドで活性化されたエステル基、が０．２～３当量、好ましくは０．２～２当量、より好ましくは０．２～１．０当量、最も好ましくは０．２～０．６となる量で使用される。２種以上の架橋剤の混合物を用いてもよく、その場合はそれらの合計当量が上記範囲となる量とする。

　第２剤も、該架橋剤を溶解するための水性溶媒をさらに含んでよい。但し、該架橋剤と該水性溶媒とを別々の容器で供し、使用に際して、使用の約２時間前以後に、両者を適量混合して水性溶液（以下、単に「水溶液」という場合がある）として使用することが好ましい。該水性溶媒については、第１剤について上記したものを使用することができる。好ましくは、ｐＨ３～８、より好ましくはｐＨ４～６のリン酸緩衝液が使用される。最も好ましくは、第１剤の水溶液と第２剤の水溶液を同体積で混合した際に、ｐＨが８～１０となるように双方の水性溶媒のイオン強度が調整される。例えば、第１剤水溶液をｐＨ９、イオン強度０．０５～０．１のホウ酸緩衝液とし、第２剤水溶液をｐＨ４、イオン強度０．０１～０．０３のリン酸緩衝液とすることで、同体積で混合した際に８～１０のｐＨとすることができる。又は、第１剤水溶液をｐＨ１０、イオン強度０．０５～０．１のホウ酸緩衝液として、第２剤水溶液をｐＨ４、イオン強度０．０１～０．０７のリン酸緩衝液としてもよい。

第２剤中の架橋剤濃度は、第１剤中のアミノ基の当量に対する第２剤中の官能基の当量、即ち（第２剤中の官能基当量／第１剤中のアミノ基当量）が、上記範囲になるように調整される。２種以上の架橋剤の混合物を用いてもよく、その場合はそれらの合計が上記範囲となる量とする。

＜添加剤＞
　上記第１剤及び／又は第２剤は、各種添加剤を本発明の目的を阻害しない量でさらに含んでよい。該添加剤としては、着色料、ｐＨ調整剤、粘度調整剤、保存剤等が挙げられる。好ましくは、癒着防止材の適用箇所が分かり易いように、第１剤あるいは２剤水溶液中に着色料、例えばブリリアントブルーを添加する。添加量は、例えば１０～１００μg／ｍＬであってよい。

＜製造方法＞
　本発明の癒着防止材は、第１剤と第２剤を個別に調製して包装し、所望により滅菌することによって得ることができる。
［第１剤の調製法］
（１）原料ゼラチン水性溶液の調製
　出発材料のゼラチンを５～５０ｗｔ／ｖ％となる量で、４０～９０℃で加熱して水性溶媒に溶解する。該水性溶媒としては、水と水溶性有機溶媒との混合物を用いる。該水溶性有機溶媒としては、炭素数１～３のアルコール、エステル等を用いることができ、好ましくはエタノールが使用される。

（２）誘導体化
　工程（１）で得られたゼラチン水溶液に、導入するアルキル基を有する誘導体化薬剤を添加し、所定時間撹拌して反応させる。該誘導体化薬剤としては、上記アルキル基を有するアルデヒドもしくはケトン、例えばドデカナール、テトラデカナール、デシルエチルケトンが使用される。反応温度は３０～８０℃、反応時間は０．５～１２時間であり、通常、撹拌するだけでゼラチンのアミノ基にシッフ塩基（ＧｌｔｎＮ＝ＣＲ^１Ｒ^２）を介してアルキル基が結合されたゼラチンを得ることができる。アルデヒドの使用量は、所望の誘導化率に相当する化学量論量に対して１～４倍とする。より好ましくは、１～２倍とする。

　次いで、該シッフ塩基を還元する。還元剤としてはシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ_３ＣＮ）、水素化トリアセトキシホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ（ＯＡｃ）_３）、２－ピコリンボラン、ピリジンボラン等の、公知の還元剤を使用することができる。これらのうち、２－ピコリンボランが好ましい。ピコリンボランは安定性であり、水性溶媒中でアルデヒドもしくはケトンの還元アミノ化反応を一段（ワンポット）で行うことが可能である。また、８０～９０％の収率を達成することができ、これはシアノ水素化ホウ素ナトリウムが７０～７５％であるのに比べて顕著に高い。２－ピコリンボランの使用量は、誘導体化薬剤の当量に対して１～３当量であることが好ましい。

（３）精製
　工程（２）で得られた反応溶液に、大過剰の貧溶媒、例えば冷エタノールを加えて、ゼラチン誘導体を沈殿させる。該沈殿を濾別した後、エタノール等で洗浄して、最終生成物を得る。

（４）第１剤の調製
　工程（３）で得られたゼラチン誘導体は粉末状の形態で、又はホウ酸緩衝液等の水性溶媒中の水溶液の形態で、容器に充填して供する。容器としては、ガラス製又はプラスチック製の、バイアル、ボトル、ディスペンサ、シリンジ等を用いることができる。所望により、誘導体化されていないゼラチン、その他添加剤を添加してよい。ゼラチン誘導体を粉末状で供する場合には、別途、ホウ酸緩衝液等の水性溶媒を容器に充填して供する。ゼラチン誘導体を水溶液で供する場合には、癒着防止材を患部に適用する際に使用する、先端部で両剤を混合することができるダブルシリンジ型ディスペンサ等の一方に充填してもよい。なお、本発明の癒着防止材が、ダブルシリンジ型ディスペンサや、混合用のバイアル、予備の水性溶媒等を付属品として含んでもよいことは言うまでもない。

［第２剤の調製法］
第２剤として例示した上記各架橋剤は、公知の方法で合成してもよいし、市販されているものを使用してもよい。該架橋剤と、それを溶解するための、例えばリン酸緩衝液等の水性溶媒を別々の容器、例えば架橋剤をガラス製のバイアルに、水性溶媒をプラスチックボトルに入れて供する。所望により、添加剤を添加してよい。第１剤の量と該第２剤の量は、（該架橋剤の官能基の当量／該ゼラチン誘導体のアミノ基の当量）が０．２～２となる量で供されるが、第１剤と第２剤を夫々独立に補充できる形態で供されてもよい。

＜滅菌＞
次いで、ディスペンサ等に充填された水溶液の形態の第１剤又はバイアル等に充填されたゼラチン誘導体粉末とボトル等に充填された水性溶媒との組み合わせの形態の第１剤、及び、バイアル等に充填された粉末形態の架橋剤とボトル等に充填された該架橋剤を溶解するための水性溶媒との組み合わせの形態の第２剤を夫々滅菌する。ゼラチン誘導体粉末および粉末形態の架橋剤の滅菌法は、放射線滅菌が好ましい。該放射線としては、電子線、ガンマ線、制動放射線が挙げられ、電子線滅菌が好ましい。総吸収線量としては、従来広く用いられている（第十四改正日本薬局方、第二部、参考情報、第1235頁、右欄、2.2　放射線法）２０ｋＧｙ以上であればよく、好ましくは２５ｋＧｙ～４５ｋＧｙである。総吸収線量が２０ｋＧｙ以上となればよく、ゼラチン誘導体や架橋剤への損傷を防ぐために、電子線を複数回に分けて照射しても、滅菌効果には変わりはない。例えば総吸収線量３０ｋＧｙで滅菌する場合には、１０ｋＧｙの照射を３回照射してもよい。ゼラチン誘導体水溶液の滅菌法は、オートクレーブあるいはフィルター滅菌が好ましい。

＜組織への適用方法等＞
　本発明は、ヒト又はヒト以外の動物である対象の患部に、第１剤及び第２剤を施与する工程を含む癒着防止材膜の製造方法、及びその癒着防止材膜の製造方法を含む、対象の癒着防止方法も提供する。本発明の癒着防止材は、皮膚、血管、腱、神経、腸、及びリンパ管等の管状組織、肝臓、膵臓、及び心臓などの臓器の断裂部分に適用することができる。なかでも、湿潤組織、例えば、血管、肺等に好適に適用される。癒着防止材の適用方法としては、上述のとおり第２剤を、好ましくは使用直前に水溶液とする。その際の架橋剤の濃度は、既に述べたとおりである。得られた第２剤水溶液を、既に第１剤水溶液が充填されているダブルシリンジ型ディスペンサの空いている方のシリンジに充填して適用し、又は、ダブルシリンジを備えるエアアシストスプレーで噴霧して患部に施与する。施与後、数分～１０分程度で膜が形成され、患部を封じることができる。

　以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
＜ゼラチン誘導体の調製＞
　特許文献３（特許第５９９５１２８号）に記載の方法でゼラチン誘導体を調製した。例として、オクタナールを用いてゼラチン誘導体１を調製した方法を示す。
　スケトウダラ由来のゼラチン（Ｍｗ３３，０００、新田ゼラチン（株）製）３０ｇを５０℃で水１０５ｍＬに溶解したところへ、該ゼラチンのアミノ基の１０モル％に相当する化学量論量のｎ－オクタナール１３９μＬを４０ｍＬのエタノールに溶解した溶液を加え、５０℃で１時間攪拌した。そこへ、２-ピコリンボラン１４３μＬを５ｍＬのエタノールに溶解した溶液を加えた。得られた反応混合物を５０℃で１７時間攪拌した後、反応混合物の１０倍体積量の冷エタノール中に該反応混合物を滴下して、ゼラチン誘導体を沈殿させ、吸引濾過を行った。得られた沈殿物を冷エタノールで３回洗浄し後、濾別した。得られた濾過物を減圧乾燥して、ゼラチン誘導体１を得た。

　ゼラチン誘導体１の赤外線スペクトル（ＦＴＩＲ－８４００、島津製作所株式会社）及び^１３Ｃ－ＮＭＲスペクトル（ＡＬ３００、日本電子株式会社）を測定し、誘導体化を確認した。赤外線スペクトルでは、３２８０ｃｍ^－１において第二級アミン、２９３６ｃｍ^－１及び２８７９ｃｍ^－１にメチレン基のピーク増加が、^１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルでは１７－１７．５ｐｐｍに第一級炭素由来のピークが、夫々、認められ、アルキル基が導入されたことが確認された。

　誘導化率を以下の方法で測定した。ゼラチン誘導体１を体積比１：１のジメチルホルムアミド／水混合溶媒中に溶解して０．１ｗ／ｖ％溶液を得た。該溶液に０．１ｖ／ｖ％トリエチルアミン水溶液及び０．１ｗ／ｖ％トリニトロベンゼンスルホン酸水溶液を加えて、約１分間攪拌してトリニトロベンゼンスルホン酸を該ゼラチン誘導体中のアミノ基と反応させた後、マイクロプレートリーダー（ＳＰＡＲＫ　１０Ｍ、テカンジャパン株式会社）で３４０ｎｍの吸光度を測定した。ゼラチン誘導体１の誘導化率は、７．２モル％であった。

　ｎ－オクタナールをｎ－デカナール又はｎ－ドデカナールに変えたこと、及びＭｗ３８，０００のゼラチンに変えたことを除き、上記ゼラチン誘導体の調製方法と同様の方法で、表１に示すゼラチン誘導体を調製した。なお、表１等において、例えば「Ｃ８」はＣ８アルデヒドによって誘導化されたゼラチン（式（１）においてＲ^１がヘプチル基であり、Ｒ^２が水素原子）を表す。

　上記各ゼラチン誘導体を、ｐＨ９．５の０．１Ｍホウ酸緩衝液に１５ｗ／ｖ％の濃度で溶解し、第１剤とした。

＜第２剤の調製＞
　第２剤として、ペンタエリスリトール‐ポリエチレングリコールエーテル　テトラスクシンイミジル　グルタレート（４Ｓ－ＰＥＧ、日油（株）社製）を用いた。下記各評価の直前に、ｐＨ４．０の０．０１Ｍリン酸緩衝液に、第１剤と同体積で混合した際に第１剤の残存アミノ基１当量に対して０．４当量（実施例４では０．５当量）となるように４Ｓ－ＰＥＧを溶解した。

＜膜の調製法＞
　ダブルシリンジ型ディスペンサで同体積の第１剤と第２剤を各試験における基材上に押し出して、実施例の膜を組織上に塗布した。また、表２に示すように、比較例としては誘導化前のゼラチン（比較例１：Ｏｒｇ）と、フィブリン（比較例２：ｆｉｂｒｉｎ；商品名ボルヒール、化学及び血清療法研究所製）、セプラフィルム（比較例３：ＨＡ／ＣＭＣ　Ｆｉｌｍ；商標、科研製薬株式会社）を、夫々の添付文書に従って用いた。比較例２及び３は実施例と同面積になる量で用いた。

なお、図３等において、比較例２は”Ｆｉｂｒｉｎ”, 比較例３は“ＨＡ／ＣＭＣ”と表記する。

　癒着防止性を評価するために、インビトロでの細胞接着試験、細胞透過試験及びインビボ癒着防止試験を行った。
＜細胞接着性＞
　４８ウェルプレートの底面上に、実施例２～５、及び比較例１の第１剤と第２剤を夫々１５０μＬずつ施与して膜を形成し、紫外線を１時間照射して滅菌した。膜上にＬ９２９線維芽細胞を播種し（１．０×１０^５細胞／ウェル）、炭酸ガス下、１０％ウシ胎児血清及び１％ペニシリン/ストレプトマイシン溶液を含むＲＰＭＩ－１６４０培地中、３７℃で培養した。２４時間後、細胞をＤ－ＰＢＳで洗浄し、ＷＳＴ－８アッセイキットを用いて膜上に付着した細胞数を計測した。コントロールとして、膜の無いものを用いた。

　結果を図１に示す。同図から分かるように、コントロールに比べて、いずれの実施例も細胞の接着が少なく、インビトロでの優れた癒着防止性を示唆した。

＜細胞透過性＞
　図２に模式的に示すような細胞培養インサート（トランズウェルインサート、ＰＴＦＥメンブレン口径８．０μｍ、コーニングインターナショナル株式会社）を用いて、細胞透過性を評価した。インサートの底面上に、実施例１及び比較例１の第１剤と第２剤を夫々１００μＬずつ、及び同面積となる量の比較例２、３を施与して膜を形成し、紫外線を１時間照射して滅菌した。膜上にＬ９２９線維芽細胞を播種し（１．０×１０⁶細胞／ウェル）、炭酸ガス下、１０％ウシ胎児血清及び１％ペニシリン/ストレプトマイシン溶液を含むＲＰＭＩ－１６４０培地中、３７℃で培養した。２４時間後、ウェル下部に透過した細胞数を計測し、膜を形成しない未処理の場合に対する割合（％）を求めた。結果を図３に示す。

　図３から分かるように、実施例はセプラフィルムに比べて細胞の透過性が有意に低く、この事が癒着防止性に寄与しているものと考えられる。

＜インビボ癒着防止性評価＞
　ラット（Ｗｉｓｔａｒ、７週雌、日本チャールス・リバー株式会社）を開腹して盲腸腹膜壁欠損モデルを用意した。盲腸壁（Ｃｅｃｕｍ）を医療用ガーゼで擦って出血させ、盲腸壁を損傷させた。該損傷個所に対向する腹膜壁（Ａｂｄｏｍｉｎａｌ　ｗａｌｌ）を医療用ナイフで所定の大きさ（１．０×２．０ｃｍ）切除することで腹膜壁欠損を用意した。腹膜壁欠損と盲腸損傷の双方に実施例１及び比較例１～３の癒着防止材を、傷の全範囲を覆うように塗布した後、開腹部を縫合した。

　手術１週間後及び２週間後に、ラットを犠死させ手術部位の組織３カ所の断面の試験片を採取し、１０％ホルマリン中性緩衝液中で固定して、ヘマトキシリン・エオジン染色し、光学顕微鏡により観察した。１週間後の写真を図４ａに、２週間後の写真を図４ｂに示す。図中、“Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ”は、欠損部に何も適用しなかったことを示す。各試験片の癒着（Ａｄｈｅｓｉｏｎ）を表３の基準で評価した結果を表４、５に示す。スコアが低い試験片数が多いほど癒着が少ないことを示す。

　表４、５に示すように、未処置試料及びフィブリンを適用した組織には顕著に癒着が認められたが、実施例１は２週間後においても全く癒着が無く、優れた癒着防止性が確認された。

＜シーリング強度＞
　ＡＳＴＭ（Ｆ２３９２－０４）に従い、ブタ大腸（φ３０ｍｍ）を基材として用い、シーリング強度（耐圧強度）を測定した。実施例１、比較例１～３の第１剤と第２剤をそれぞれ１００μＬずつ混合し（架橋剤中のスクシンイミドエステル基の当量／ゼラチン誘導体中のアミノ基の当量＝０．４）、前記ブタ大腸に塗布することで、厚さ１．０ｍｍ、直径１５ｍｍの癒着防止材膜を調製した。塗布後、５．０ｇ／ｍｍ^２の荷重により１０分間の圧着を行った後、３７℃の生理食塩水を２ｍｌ／分で流し、破裂したときの圧力の測定を行った。結果を図５に示す。また、破裂した後の試験片組織を中性緩衝ホルマリン液で固定後ヘマトキシリン・エオジン染色を行い、組織と試料との界面の観察を行った（図６）。

　図５に示すとおり、本発明の癒着防止材は、他の試料に比べて顕著に高いシーリング強度を示し、特許文献３に示した結果が再確認された。また、図６に示すように、フィブリン膜とセプラフィルムは、膜とブタ大腸との界面で剥離したが、本発明の癒着防止材は、癒着防止材膜自体が凝集破壊された。ここから、本発明の癒着防止材は接着強度にも優れることが分かる。

＜タンパク質透過性＞
　図７に示すような細胞培養インサート（トランズウェルインサート、ＰＴＦＥメンブレン口径８．０μｍ、コーニングインターナショナル株式会社）を用い、D.Nwa et al.,J.Biomed.Mater.Res.B, 2013,101B,1251-1258記載の方法に従い、タンパク質透過性を調べた。インサートの底面上に、第１剤と第２剤を夫々１００μＬずつ施与して膜を形成し、紫外線を１時間照射して滅菌した。インサートを０．９ｍＬのＤ－ＰＢＳ中に浸漬した。フルオロセインイソシアネート標識アルブミンの０．１ｗ／ｖ％水溶液の０．１ｍＬを該膜上に滴下した。２４時間後の透過率を、該インサートの裏面の蛍光測定と画像解析システム（ＩＶＩＳ　Ｌｕｍｉｎａ　ＩＩ、パーキンエルマ－社）を用いて求めた。結果を図８に示す。

　図８に示すように、実施例１はフィブリン膜及びセプラフィルムに比べて顕著に低いタンパク質透過率（約２０％）を示し、大半のタンパク質は表面上に留まっていた。このタンパク質透過抑制作用が、癒着防止性に寄与しているものと考えられる。誘導化されていないゼラチン膜も透過率は低かったが、タンパク質が厚み全体に広がっていた。

＜膨潤度＞
　実施例１、比較例１の第１剤と第２剤を夫々１０００μＬずつ、厚さ０．５ｍｍのシリコーンゴムをスペーサーとする２枚のガラス板間に流し込み、板状の癒着防止材硬化物を作成した。得られた癒着防止材硬化物を直径４ｍｍのポンチでくりぬくことにより、厚さ０．５ｍｍ、直径４ｍｍの円形膜を調製した。凍結乾燥した後の重さ（Ｗ_ｄ）を測定した。膜を３７℃の生理食塩水中に浸漬し、経過時間による癒着防止材膜の重量（Ｗ_ｓ）の変化から下記式に従い膨潤度を算出して調べた。

膨潤度（％）＝｛（Ｗ_ｓ－Ｗ_ｄ）／Ｗ_ｄ｝×１００

　図９に時間による膨潤度の変化を示す。試験を行った時間内では両者の試料に有意差は見られなかった。

＜酵素分解性＞
　実施例１及び比較例１について、第１剤と第２剤を夫々１０００μＬずつ、厚さ１．０ｍｍのシリコーンゴムをスペーサーとする２枚のガラス板間に流し込み、板状の癒着防止材硬化物を作成した。得られた癒着防止材硬化物を直径１０ｍｍのポンチでくりぬくことにより、厚さ１．０ｍｍ、直径１０ｍｍの円形膜を調製し、初期重量（Ｗ_ｔ０）を測定した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）とのカルシウム塩形成を防ぐだめに、試験片をトリス塩酸緩衝液（２．５ｍＭ　ＣａＣｌ_２、ｐＨ７．４）に一晩浸漬した。トリス塩酸緩衝液に１００μｇ／ｍＬの濃度でコラゲナーゼを溶解し、試験片を２ｍＬのコラゲナーゼ溶液中に浸漬した。経過時間による癒着防止材膜の重量（Ｗ_ｔ）の変化から下記式により分解されずに残った重量（％）を算出して調べた。

重量（％）＝（Ｗ_ｔ／Ｗ_ｔ０）×１００

上式においてＷ_ｔ０は初期重量、Ｗ_ｔは浸漬後ｔ時間における重量である。結果を図１０に示す。
図１０に示すように、実施例の膜は比較例に比べて分解時間が長く、手術部をより長時間保護することができることが確認された。

　本発明の癒着防止材は複雑な形状の手術部位に適用することができ、接着性を有する癒着防止材として、又は癒着防止性を有する外科用シーラントとして臨床での使用に大変適する。また、本発明の癒着防止法は、従来の方法では難しい部位に簡易に施すことができる。

Claims

　（１）ゼラチン誘導体を含む第１剤であって、該ゼラチン誘導体は、
　　（ａ）下記式で表される構造を含み、

　　ＧｌｔｎＮＨ－ＣＨＲ^１Ｒ^２

　　　上式においてＧｌｔｎはゼラチン残基であり、Ｒ^１は炭素数５～１７のアルキル基であり、Ｒ^２は水素原子または炭素数５～１７のアルキル基である；
　　（ｂ）イミノ基／アミノ基（モル比）が１／９９～３０／７０であり；
　　（ｃ）重量平均分子量が１０,０００～５０,０００である、
第１剤、及び
　（２）該ゼラチン誘導体の架橋剤を含む第２剤
からなる癒着防止材。
　該ゼラチンが、スケトウダラ由来のゼラチンである、請求項１記載の癒着防止材。
　Ｒ^１が炭素数５～１１のアルキル基であり、Ｒ^２は水素原子である、請求項１又は２記載の癒着防止材。
　該架橋剤が、少なくとも２つの活性化されたエステル基を有する、ポリエチレングリコールエーテル多塩基酸エステルである、請求項１～３のいずれか１項記載の癒着防止材。
　組織接着性癒着防止材である、請求項１～４のいずれか１項記載の癒着防止材。
　ヒト以外の動物である対象の患部の癒着を防止する方法であって、
　該患部に癒着防止材を施与する工程を含み、該癒着防止材が、
　（１）ゼラチン誘導体を含む第１剤であって、該ゼラチン誘導体は、
　　（ａ）下記式で表される構造を含み、

　　ＧｌｔｎＮＨ－ＣＨＲ^１Ｒ^２

　　　上式においてＧｌｔｎはゼラチン残基であり、Ｒ^１は炭素数５～１７のアルキル基であり、Ｒ^２は水素原子または炭素数５～１７のアルキル基である；
　　（ｂ）イミノ基／アミノ基（モル比）が１／９９～３０／７０であり；
　　（ｃ）重量平均分子量が１０,０００～５０,０００である、
第１剤、及び
　（２）該ゼラチン誘導体の架橋剤を含む第２剤
からなる、癒着を防止する方法。
　該患部に癒着防止材を施与する工程が、ダブルシリンジ型ディスペンサ又はダブルシリンジを備えるエアアシストスプレーにより、第１剤及び第２剤を噴霧する工程を含む、請求項６記載の方法。