WO2019198735A1 - 植物の土壌伝染性病害防除方法 - Google Patents

植物の土壌伝染性病害防除方法 Download PDF

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WO2019198735A1
WO2019198735A1 PCT/JP2019/015543 JP2019015543W WO2019198735A1 WO 2019198735 A1 WO2019198735 A1 WO 2019198735A1 JP 2019015543 W JP2019015543 W JP 2019015543W WO 2019198735 A1 WO2019198735 A1 WO 2019198735A1
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glutamic acid
pseudomonas
soil
present
bacteria
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PCT/JP2019/015543
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香純 竹内
茂美 瀬尾
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国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/27—Pseudomonas
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
    • A01G7/00—Botany in general
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
    • A01G7/00—Botany in general
    • A01G7/06—Treatment of growing trees or plants, e.g. for preventing decay of wood, for tingeing flowers or wood, for prolonging the life of plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N25/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N37/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids
    • A01N37/44—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids containing at least one carboxylic group or a thio analogue, or a derivative thereof, and a nitrogen atom attached to the same carbon skeleton by a single or double bond, this nitrogen atom not being a member of a derivative or of a thio analogue of a carboxylic group, e.g. amino-carboxylic acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for controlling plants from soil-borne diseases. More specifically, the present invention relates to a method for controlling soil-borne diseases of plants using Pseudomonas bacteria and glutamic acid, and a composition and kit that can be used in the method.
  • Chemical chemical pesticides such as fungicides and insecticides are widely used for the purpose of protecting plant diseases.
  • chemical pesticides have a high plant protection effect, there is a possibility that the load on the environment is high, and the plant and the human body are adversely affected by exposure to residual pesticides and pesticides.
  • plant-protecting bacteria bacteria that have an effect of protecting plants from diseases
  • plant-protecting bacteria have been used as biological pesticides in order to eliminate concerns about such chemical pesticides.
  • plant-protecting bacteria several strains of bacteria belonging to the genus Pseudomonas are actually used as microbial pesticides.
  • Specific products include cell seedling spirit (Taki Chemical, Patent Document 1), Veggie Keeper (registered trademark) water Examples include a summing agent (central glass).
  • Plant pest control technology with biological pesticides has many advantages such as low environmental impact, but because it uses biological functions, its effects are not sustained compared to chemical pesticides.
  • problems unique to biological materials such as difficult handling as agricultural chemicals. Therefore, it is desired to make further improvements while deepening the understanding of the ecology and phenotype of the microorganisms used.
  • an object of this invention is to provide the method, composition, and kit which control a plant effectively from a soil infectious disease in the system using microorganisms.
  • the present inventors have focused on Pseudomonas bacteria as useful microorganisms and have intensively studied substances that enhance the plant protective action of the bacteria. I found it effective. Based on this knowledge, the present inventor has completed the present invention.
  • a method for controlling soil infectious diseases of plants comprising a step of applying Pseudomonas bacteria and glutamic acid to soil or plants.
  • Aspect 2 The method according to Aspect 1, wherein the plant is a seed or a seedling.
  • Aspect 3 The method according to Aspect 1 or 2, wherein the plant is a rooted seed.
  • Aspect 4 The method according to any one of Aspects 1 to 3, wherein the Pseudomonas bacterium and glutamic acid are imparted before planting or within 3 days after sowing.
  • Aspect 5 The method according to any one of Aspects 1 to 4, wherein one of Pseudomonas bacteria and glutamic acid is applied, and the other is applied within 3 days after the application.
  • Aspect 6 The method according to any one of Aspects 1 to 5, wherein a Pseudomonas bacterium is provided first, followed by glutamic acid.
  • Aspect 7 The method according to any one of Aspects 1 to 6, further comprising the step of adding glutamic acid after adding Pseudomonas bacteria and glutamic acid.
  • a plant soil-borne disease control kit comprising a Pseudomonas genus bacterium and glutamic acid.
  • plants can be effectively controlled from soil infectious diseases.
  • Pseudomonas bacteria used in the present invention have a track record of use as biological pesticides, and glutamic acid is a kind of natural amino acids. Therefore, the technique provided by the present invention is considered to have high safety against the use of general chemical pesticides. Moreover, in this invention, since the plant protection effect is show
  • FIG. 1 is a photograph showing the disease control effect of Pseudomonas bacteria and glutamic acid against the pathogenic microorganism Picium. From the left of the photograph, water treatment, glutamic acid alone treatment, Pseudomonas bacteria alone treatment, and both treated are shown.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of examining the effectiveness of glutamic acid (Glu) and histidine (His) for the combined effect with Pseudomonas bacteria.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of examining the effectiveness of a plurality of types of amino acids with respect to the combined effect with Pseudomonas bacteria.
  • FIG. 4 shows Pseudomonas sp.
  • FIG. 5 is a graph showing the disease control effect of Pseudomonas bacteria and glutamic acid against the pathogenic microorganism Rhizoctonia.
  • One embodiment of the present invention is a method for controlling soil-borne diseases of plants, which includes a step of imparting Pseudomonas bacteria and glutamic acid to soil or plants.
  • the Pseudomonas genus bacterium is a bacterium belonging to the family Proteobacterium gamma proteobacteria Pseudomonas and is a gram-negative aerobic gonococcus. It is known that Pseudomonas bacteria grow in a wide range and inhabit soil, fresh water, seawater, plants, or animals.
  • the Pseudomonas bacteria in the present invention are not particularly limited, but those having a plant protecting action are preferably used. Specific examples thereof include Pseudomonas Purotegensu (Pseudomonas protegens), Pseudomonas fluorescens (Pseudomonas fluorescens), Pseudomonas syringae (Pseudomonas syringae), Pseudomonas chlororaphis (Pseudomonas chlororaphis), Pseudomonas Shinki Santa (Pseudomonas synxantha), Pseudomonas brush skein alum (Pseudomonas brassica acerum), Pseudomonas putida (Pseudomonas putida), Pseudomonas rhodesia (Pseudomonas
  • the St29 strain can also be used, and these bacteria are the National Institute of Technology and Evaluation (NITE), Biotechnology Center, Patent Microbiology Deposit Center (NPMD) (Kazusa, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan) In Kamashita 2-5-8), the deposit numbers NITE P-02053 (date of trust: May 20, 2015) and NITE P-02054 (date of trust: May 20, 2015) were deposited respectively. Yes.
  • St29 strain is used in the present invention.
  • strains of Pseudomonas protegens Pseudomonas protegens CHA0 strain and Pseudomonas protegens Cab57 strain are preferably used, but are not particularly limited thereto.
  • Pseudomonas bacteria may be those that have been isolated by themselves, may be those that have been distributed from a facility, or Pseudomonas bacteria that are commercially available as biopesticidal products (ie, commercially available products). May be used, and the use thereof is not particularly limited.
  • Glutamic acid is a kind of amino acid and is a compound represented by the chemical formula HOOC (CH 2 ) 2 CH (NH 2 ) COOH (or C 5 H 9 NO 4 ). Further, glutamic acid is classified as a hydrophilic amino acid, a polar amino acid, a polar charged amino acid (polar negatively charged amino acid), or an acidic amino acid, and may be represented by an abbreviation of Glu or E. Glutamic acid is contained in plants and animals, and specifically, it is known to be contained in seaweed, flour, soybeans, sugar cane and the like.
  • glutamic acid can be any of D-form (D-glutamic acid), L-form (L-glutamic acid), and DL-form (DL-glutamic acid), and is not particularly limited.
  • L-form glutamic acid (L-glutamic acid) is preferred.
  • the CAS number of D-form glutamic acid is 6893-26-1 and the CAS number of L-form glutamic acid is 56-86-0.
  • glutamic acid may be a salt.
  • the salt of glutamic acid include alkali metal salts such as sodium and potassium (specifically, sodium glutamate and potassium glutamate), and alkaline earth metal salts such as calcium and magnesium (specifically, calcium glutamate and glutamic acid). Magnesium), zinc glutamate, and iron glutamate.
  • the method for obtaining glutamic acid is not particularly limited, and may be any natural product isolated and purified from animals or plants, or one obtained by chemical synthesis or fermentation.
  • glutamic acid one purified by itself or a commercially available product may be used, and the use thereof is not particularly limited.
  • commercially available glutamic acid is preferably used.
  • soil in this specification means soil in which plants can grow.
  • the soil used in the present invention may be indicated by a name such as cultivated soil, cultured soil, nursery soil, or nursery soil. Further, the soil of Yamano that has not been subjected to any processing may be used as it is.
  • the particle size of the soil is not particularly limited, and may be any soil as long as the plant can grow.
  • the soil to be applied in the present invention is preferably soil in the vicinity of the plant (for example, soil in a range within 10 cm from the plant).
  • the plant in the present invention is not particularly limited, but is preferably an agricultural product.
  • agricultural products include, but are not limited to, vegetables, cereals, fruits, flowers, beans, and the like. Specific examples thereof include cucumbers (cucumbers, watermelons, pumpkins, zucchini, gourds, loofahs, tougans, teppouri, yugao, tsurureishi (nigauri, bitter gourd), melons, etc.), potatoes (potatoes, sweet potatoes, taros, potatoes) , Yam, etc.), root vegetables (cubs, Japanese radish, Japanese radish, horseradish, horseradish, burdock, chorogi, ginger, carrots, sea bream, lotus root, lily root, etc., leafy vegetables (green mustard, cabbage, watercress, kale) Komatsuna, Saishin, Sanchu, Shandong Vegetable, Sengoku, Sirona, Celery, Celery, Taasai
  • the state of the plant to be granted in the present invention is not particularly limited, and may be a seed or a seedling or a state in which a plant has already grown, but is preferably a seed or a seedling, and more preferably a seed.
  • a seed or a seedling By being in the early stages of growth such as seeds and seedlings, it is possible to suppress the beginning of morbidity of soil infectious diseases, and it is possible to more effectively control soil infectious diseases in plants.
  • the plant tissue is young, Pseudomonas bacteria and glutamic acid easily penetrate into the plant, and in this respect, it is possible to more effectively control soil infectious diseases.
  • the plant is particularly preferably a rooted seed.
  • the Pseudomonas bacterium and glutamic acid can be imparted to any part of the plant such as root, leaf, stem, branch, or trunk.
  • the aforementioned Pseudomonas bacteria and glutamic acid are imparted to soil or plants, but the method and means relating to the impartation are not particularly limited as long as the effects of the present invention can be obtained.
  • the application operation may be performed by preparing water (aqueous solution) suspended or dissolved together with Pseudomonas bacteria and glutamic acid, or separately, and bringing the prepared water (aqueous solution) into contact with soil or a plant. it can.
  • the form of Pseudomonas bacteria and glutamic acid may be liquid or solid.
  • pseudomonas genus bacteria and glutamic acid can be provided to soil or a plant by operation, such as spraying, dripping, or immersion.
  • a container may be prepared separately, and a holed container containing soil or a plant may be put into the container containing the liquid to perform the operation.
  • the form of Pseudomonas bacteria and glutamic acid is solid, it may be applied by placing the solid on or in the soil, or by contacting the solid with the surface of the plant body. May be.
  • the amounts of Pseudomonas bacteria and glutamic acid to be applied to the soil or the plant are not particularly limited, and can be appropriately set according to the application form, the type of target plant, and the like.
  • Pseudomonas bacteria when they are applied to soil, they can be applied to 1 cm 3 of soil at a bacterial count of 10 4 to 10 20 CFU, preferably 10 6 to 10 10 CFU per time.
  • glutamic acid when glutamic acid is applied to soil, it can be applied in an amount of 0.01 mM to 1 M, preferably 0.1 mM to 100 mM per 1 cm 3 of soil.
  • the application amount of Pseudomonas bacteria and glutamic acid can be adjusted by the concentration in the preparation containing them and the application amount of the preparation.
  • Pseudomonas bacteria when imparted to a plant, it can be imparted to each individual plant at a bacterial count of 10 4 to 10 20 CFU, preferably 10 6 to 10 10 CFU. .
  • glutamic acid when glutamic acid is added to a plant, it can be applied to an individual plant in an amount of 0.01 mM to 1 M, preferably 0.1 mM to 100 mM per time.
  • the application amount of Pseudomonas bacteria and glutamic acid can be adjusted by the concentration in the preparation containing them and the application amount of the preparation.
  • glutamic acid is a salt, the amount of glutamic acid can be calculated from the molecular weight corresponding to the free form (glutamic acid ion).
  • Pseudomonas bacteria and glutamic acid may be applied before, during or after planting (including seedling and planting periods), but is not particularly limited. Within 3 days before or after sowing.
  • seeding in the present specification means that a plant is planted in soil as a starting point of growth, and includes, for example, sowing seeds in soil and planting seedlings in soil.
  • the specific timing is not particularly limited. For example, within 7 days before sowing, within 6 days before sowing, within 5 days before sowing, and 4 days before sowing. Within 3 days before sowing, within 2 days before sowing, within 1 day before sowing, within 12 hours before sowing, within 6 hours before sowing, within 3 hours before sowing, within 1 hour before sowing, within 30 minutes before sowing, Within 10 minutes before sowing, within 5 minutes before sowing, within 1 minute before sowing, or within 30 seconds before sowing.
  • the granting time may be within 7 days after sowing, within 6 days after sowing, within 5 days after sowing, or within 4 days after sowing, or within 2 days after sowing.
  • Within 1 day after sowing within 12 hours after sowing, within 6 hours after sowing, within 3 hours after sowing, within 1 hour after sowing, within 30 minutes after sowing, within 10 minutes after sowing, within 5 minutes after sowing, sowing It may be within 1 minute after, or within 30 seconds after sowing.
  • the application time is typically within 7 days before and after sowing.
  • Pseudomonas bacteria and glutamic acid may be added simultaneously or separately. Although it does not specifically limit in the method of this invention, after giving any one among Pseudomonas bacteria and glutamic acid, the other can be provided within the 3rd.
  • the time interval between the two is within 2 days, within 1 day, within 12 hours, within 6 hours, within 3 hours, within 1 hour, within 30 minutes, within 10 minutes, within 5 minutes, within 1 minute, or 30 It may be within seconds.
  • glutamic acid is considered to have a function of dramatically enhancing the soil infectious disease control action of Pseudomonas bacteria, and therefore it is preferable that the interval between the two application times does not become long.
  • the interval between the application times in the case of applying Pseudomonas bacteria and glutamic acid is at least one day or less.
  • inoculation of the plant mentioned above is applied as a time when any one is provided, and the other can be provided within 3 days after the application.
  • Pseudomonas bacteria or glutamic acid may be added first. That is, Pseudomonas bacteria may be applied first, followed by glutamic acid, or glutamic acid may be applied first, followed by Pseudomonas bacteria. In the present invention, although not particularly limited, it is preferable to give Pseudomonas bacteria first and then give glutamic acid. If Pseudomonas spp. Is applied first, the adhesion of Pseudomonas spp. To the surface of the plant (eg, seed) can be enhanced, thereby more effectively controlling soil infectious diseases in the plant. It is considered possible.
  • the method of the present invention can also include a step of further adding glutamic acid after adding Pseudomonas bacteria and glutamic acid. It is expected that further enhancement of glutamic acid can sustain the effect of controlling Pseudomonas bacteria in controlling soil-borne diseases, and it is expected that soil-borne diseases can be controlled more effectively. Further application of glutamic acid can be performed once or more, and may be performed twice or more, three times or more, four times or more, or five times or more. Further application of glutamic acid is typically 1 to 20 times, preferably 2 to 10 times, more preferably 3 to 8 times.
  • the time interval for further applying glutamic acid is not particularly limited, and can be, for example, 6 hours or more, 12 hours or more, 1 day or more, 2 days or more, 3 days or more, or 4 days or more. Or less, 7 days or less, 6 days or less, 5 days or less, 4 days or less, 3 days or less, 2 days or less, 1 day or less, or 12 hours or less.
  • the time interval for further application of glutamic acid is typically 6 hours to 10 days, preferably 12 hours to 7 days, more preferably 1 to 3 days.
  • the form and means for further adding glutamic acid are not particularly limited, and can be the same as described above.
  • the amount of glutamic acid to be further added is not particularly limited, and can be the same as described above.
  • the soil infectious disease targeted in the present invention is not particularly limited as long as it is a disease caused by pathogenic microorganisms that survive in the soil.
  • pathogenic microorganisms that survive in the soil include filamentous fungi (fungi, oomycetes, etc.).
  • filamentous fungi include the genus Pythium (Pythium ultimum), Pythium aphanidermatum, Pythium megacalumumum, Pythium megagalumumum, etc.
  • Genus fungus (Fusarium oxysporum), Fusarium graminearum, Fusarium solani, etc., Rhizotonia opiumi sis) spp., and the like.
  • pathogenic microorganisms other than filamentous fungi, Erwinia genus bacteria (Erwinia carotovora), Ralstonia genus bacteria (Ralstonia solanaacearum), Pectinobacter Pecto (Pectobacterium carotovorum, etc.), Burkholderia (Burkholderia glumae, etc.), Agrobacterium (Agrobacterium) genus Agrobacterium (Agrobacterium) Pathogenic microorganisms in. The present invention Faciens) etc.) and the like, it is preferable to target fungi.
  • soil infectious diseases include seedling blight, psium rot, bed replacement root rot, wilt, leaf rot, root rot, vine split disease, blight, yellow rot, buttocks rot , Root rot debilitating disease, cone browning disease, rot disease, leaf blight disease, dry rot disease, plant blight disease, red mold disease, bulb rot disease, stem rot wilt disease, stem rot disease, root rot wilt disease, black stripe Real rot, half blight, black spot, panama disease, brown rot, fusarium disease, strain rot, coat blight, bud blight, spider web disease, brown blight, underbrush disease, rhizoctonia disease , Corm rot, black bruise, perforated leaf blight, dry root rot, large white silk disease, tiger spot disease, lie rot, real rot, hip fold disease, forest root rot, buttocks rot Skin rot, brown bruise, brown
  • composition for controlling soil infectious diseases of plants is a composition for controlling soil infectious diseases of plants, which comprises Pseudomonas bacteria and glutamic acid.
  • the Pseudomonas bacterium and glutamic acid used in the composition of the present invention are as described above.
  • the amount of Pseudomonas bacteria contained in the composition of the present invention can be appropriately set according to the bacterial species, the nature of the bacteria (such as drought resistance), the type of plant to be applied, the type of dosage form, and the like.
  • the content of Pseudomonas bacteria in the composition of the present invention is, for example, 10 4 to 10 20 CFU, preferably 10 6 to 10 12 CFU per 100 g of the composition, but is not particularly limited.
  • the method for adding Pseudomonas bacteria to the composition of the present invention is not particularly limited, and may be added as it is.
  • Pseudomonas bacteria are cultivated by a method known to those skilled in the art, and if a liquid medium is collected by centrifugation or the like, if it is a solid medium, formed colonies are collected with a platinum loop or the like to obtain the composition of the present invention. Can be added.
  • lyophilization may be performed by a method known per se from the state stored in a liquid, and Pseudomonas bacteria may be added to the composition of the present invention as a solid substance.
  • the amount of glutamic acid contained in the composition of the present invention can be appropriately set according to the type of plant to be applied and the type of dosage form.
  • the glutamic acid content in the composition of the present invention is, for example, 0.01 mM to 1 M, preferably 0.1 mM to 100 mM per 100 g of the composition, but is not particularly limited.
  • the composition of the present invention may contain additives such as excipients, thickeners, binders, stabilizers, preservatives, pH adjusters, colorants, and flavoring agents.
  • additives are not particularly limited, and materials known in the technical field of biopesticides can be used, and the amount of the additives can be appropriately adjusted based on the known techniques of those skilled in the art.
  • the form of the composition of the present invention may be any form such as liquid, solid, gel, paste, and the like, and can be appropriately set according to the usage situation and the like.
  • the composition of the present invention may be in the form of a concentrate.
  • the concentration factor is not particularly limited, and can be, for example, 2 to 1000 times, 5 to 100 times, or 10 to 50 times.
  • the composition of this invention can dilute suitably using solvents, such as water, and the dilution can be provided to soil or a plant.
  • the content of Pseudomonas bacteria and glutamic acid in the composition of the present invention can be set according to the concentration factor.
  • composition of the present invention may also be configured as a single preparation containing Pseudomonas bacteria and glutamic acid, or may be configured as two preparations containing Pseudomonas bacteria and glutamic acid separately. Good.
  • composition of the present invention is constituted as two preparations, it is preferable that the two preparations are used in combination (that is, a combination preparation).
  • the composition of the present invention is configured as two preparations, the two preparations may be different types of dosage forms or the same type of dosage form.
  • the composition of the present invention is used for controlling soil infectious diseases of plants.
  • the target plant and soil infectious disease are not particularly limited, and specific examples thereof are the same as those described above.
  • the composition of the present invention can also be used as a biopesticide or a microbial pesticide. Therefore, the composition of the present invention can also be referred to as an agrochemical composition.
  • Plant soil-borne disease control kit One embodiment of the present invention is a plant soil-borne disease control kit containing Pseudomonas bacteria and glutamic acid.
  • the Pseudomonas bacteria and glutamic acid used in the kit of the present invention are as described above.
  • the Pseudomonas bacterium and glutamic acid in the kit of the present invention may be a reagent or a preparation, and the form thereof is not particularly limited. Moreover, both Pseudomonas bacteria and glutamic acid may be contained in the same formulation, or may be separately contained in separate formulations. When Pseudomonas bacteria and glutamic acid are divided into separate preparations, the preparations may be in different types or in the same type.
  • the form of the preparation used in the kit of the present invention is not particularly limited, and may be any form such as a liquid, a solid, a gel, and a paste.
  • the contents of Pseudomonas bacteria and glutamic acid in the preparation are not particularly limited, and can be arbitrarily set according to the above-described composition of the present invention.
  • the preparation used in the kit of the present invention may be individually packaged for single use as a single use, or multiple times (for example, 2, 3, 4, 5, 10 times, (Or more) may be packaged in a form including the amount used.
  • the container to be used is not particularly limited, and can be appropriately set according to the amount of the preparation used.
  • kits of the present invention When the Pseudomonas bacterium and glutamic acid are separated into separate reagents or preparations in the kit of the present invention, both do not need to be incorporated in the same package, and are packaged separately and used together at the time of use It may be. Moreover, the kit of this invention may contain the instruction manual regarding use of Pseudomonas genus bacteria and glutamic acid.
  • the kit of the present invention is used for controlling soil infectious diseases of plants.
  • the target plant and soil infectious disease are not particularly limited, and specific examples thereof are the same as those described above.
  • the kit of the present invention can also be used as a biopesticide or a microbial pesticide.
  • Cucumber seeds were arranged on a filter paper soaked with sterilized water and placed in the dark at 26 ° C. for 24 hours.
  • Pseudomonas genus bacterium Pseudomonas protogens CHA0 strain was used, and cultured with shaking in a NYB medium (Nutrient broth: 25 g, Yeast extract: 5 g, H 2 O: 1000 ml) at 30 ° C., 180 rpm for 24 hours.
  • the prepared vermiculite was equally divided into 50 mL each in a seedling raising tray (5 cm square per section, depth 5 cm) having a hole at the bottom and allowing water to permeate. Two cucumber seeds with rooting confirmed were spread on vermiculite.
  • Pseudomonas bacteria and glutamic acid were added to cucumber seeds and the nearby soil. Specifically, 4 mL of an adjusted aqueous solution of Pseudomonas bacteria was added to each section of the seedling raising tray toward the cucumber seeds, and vermiculite that had been separated without infecting Psium bacteria was added Each of the seedling trays was covered with 15 mL from the top, and the seedling tray was immersed in water in a vat or a 10 mM glutamic acid (L-glutamic acid) aqueous solution (10 mL for each section of the seedling tray). The application of Pseudomonas bacteria and glutamic acid was performed within 2 hours after sowing of cucumber seeds, and the interval between the application periods of Pseudomonas bacteria and glutamic acid was within 1 hour.
  • the seedling tray was placed in a plant incubator set at 25 ° C.
  • the light period was set to 16 hours and the dark period was set to 8 hours.
  • the cultivation period in the incubator was 2 weeks, and water in the vat or 10 mM glutamic acid aqueous solution was replaced every other day.
  • FIG. 1 The results of this experimental example are shown in FIG. As shown in the photograph of FIG. 1, it was revealed that the effect of controlling soil infectious diseases is enhanced by using Pseudomonas bacteria together with glutamic acid. In addition, since glutamic acid itself did not seem to have a high soil infectious disease control effect, glutamic acid acts on Pseudomonas bacteria and has the effect of enhancing the soil infectious disease control action of Pseudomonas bacteria. It was thought that there was.
  • a 10 mM histidine (L-histidine) aqueous solution was prepared and used instead of the glutamic acid aqueous solution in Experimental Example 1 above.
  • the vermiculite adhering to the root of the cucumber was thoroughly washed away.
  • Rhizoctonia genus Rhizotonia solani MAFF726551 strain
  • Pseudomonas protegens Cab57 strain was used as a Pseudomonas genus bacterium.
  • the technology provided by the present invention is useful in the agricultural field from the viewpoint of effectively controlling agricultural products as a plant from soil-borne diseases.
  • the Pseudomonas bacterium and glutamic acid provided by the present invention can be used in the field of agricultural chemicals, in particular, in the field of biological agricultural chemicals.

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Abstract

本発明は、微生物を利用した系において、植物を土壌伝染性病害から効果的に防除する方法、組成物及びキットを提供することを目的とする。　本発明は、シュードモナス属細菌及びグルタミン酸を土又は植物に付与する工程を含む、植物の土壌伝染性病害防除方法を提供する。本発明はまた、シュードモナス属細菌及びグルタミン酸を含む土壌伝染性病害防除用組成物、及び土壌伝染性病害防除用キットを提供する。

Description

植物の土壌伝染性病害防除方法
　本発明は、植物を土壌伝染性病害から防除する方法に関する。より具体的には、本発明は、シュードモナス属細菌及びグルタミン酸を利用した植物の土壌伝染性病害防除方法、並びに当該方法に利用可能な組成物及びキットに関する。
　植物の病害保護を目的として、殺菌剤や殺虫剤等の化学農薬が広く一般に使用されている。しかしながら、化学農薬は高い植物保護効果を有する一方で、環境への負荷が高かったり、残留農薬や農薬曝露によって植物や人体に悪影響を及ぼしたりする可能性がある。
　このような化学農薬の懸念を解消する点から、近年では、植物を病害から保護する効果を有する細菌（植物保護細菌）が生物農薬として利用されている。例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（シュードモナス）属細菌のいくつかの系統が実際に微生物農薬として利用されており、具体的な製品としては、セル苗元気（多木化学、特許文献１）、ベジキーパー（登録商標）水和剤（セントラル硝子）等が挙げられる。
　生物農薬による植物の病害防除技術は、環境への負荷が低いことなど多くの利点を有している一方で、生物機能を利用するが故に、化学農薬と比較して効果が持続的に発揮されないことや、農薬としての取り扱いが難しいことなど、生物素材ならではの問題点も多い。そのため、使用する微生物の生態や表現型に理解を深めつつ、更なる改良を加えることが望まれている。
　上記のような現状において、生物農薬と化学農薬とは別個に研究開発が行われており、双方を併用した技術は極めて限定的であると考えられる。微生物と化学物質とが併用された例として、フザリウム・オキシスポルム等の有用微生物、プロペナゾール等の植物病害抵抗性誘導物質、及び石灰等の土壌ｐＨ矯正物質の３成分を利用した土壌伝染性病害防除方法が、これまでに報告されている（特許文献２）。
特許第４０７９２０９号 特許第６１８３８５１号
　上述したように、生物農薬は環境への負荷が低いこと等の利点を有する一方で、化学農薬と比較して効果が持続しない等の問題も有している。そこで、本発明は、微生物を利用した系において、植物を土壌伝染性病害から効果的に防除する方法、組成物及びキットを提供することを目的とする。
課題を解決しようとする手段
　以上に鑑み、本発明者は、有用微生物としてシュードモナス属細菌に着目し、当該細菌の植物保護作用を増強させる物質を鋭意検討したところ、驚くべきことにグルタミン酸がシュードモナス属細菌との併用において非常に有効であることを見出した。かかる知見に基づき、本発明者は、本発明を完成するに至った。
　本発明は、好ましくは以下に記載するような態様により行われるが、これに限定されるものではない。
［態様１］シュードモナス属細菌及びグルタミン酸を土又は植物に付与する工程を含む、植物の土壌伝染性病害防除方法。
［態様２］植物が種子又は幼苗である、態様１に記載の方法。
［態様３］植物が、発根した種子である、態様１又は２に記載の方法。
［態様４］植物の播種前又は播種後３日以内にシュードモナス属細菌及びグルタミン酸を付与する、態様１～３のいずれか１に記載の方法。
［態様５］シュードモナス属細菌及びグルタミン酸のうちいずれか一方を付与し、当該付与後３日以内に他方を付与する、態様１～４のいずれか１に記載の方法。
［態様６］シュードモナス属細菌を先に付与し、次いでグルタミン酸を付与する、態様１～５のいずれか１に記載の方法。
［態様７］シュードモナス属細菌及びグルタミン酸を付与した後でさらにグルタミン酸を付与する工程を含む、態様１～６のいずれか１に記載の方法。
［態様８］シュードモナス属細菌及びグルタミン酸を含む、植物の土壌伝染性病害防除用組成物。
［態様９］シュードモナス属細菌及びグルタミン酸を含む、植物の土壌伝染性病害防除用キット。
　本発明を利用することによって、効果的に植物を土壌伝染性病害から防除することができる。本発明において使用されるシュードモナス属細菌は生物農薬としての使用実績があり、グルタミン酸も天然アミノ酸のうちの一種である。そのため、本発明で提供される技術は、一般的な化学農薬の使用に対して高い安全性を有するものと考えられる。また、本発明では細菌１種類と化学物質１種類の合計２成分のみで植物保護効果が奏されることから、本発明の技術は簡便に利用することができる。
図１は、病原微生物ピシウム属菌に対するシュードモナス属細菌及びグルタミン酸の病害防除効果を示す写真である。写真の左より、水処理、グルタミン酸単独処理、シュードモナス属細菌単独処理、両方を処理したもの、を示す。 図２は、シュードモナス属細菌との併用効果に関して、グルタミン酸（Ｇｌｕ）及びヒスチジン（Ｈｉｓ）の有効性を調べた結果を示すグラフである。 図３は、シュードモナス属細菌との併用効果に関して、複数種類のアミノ酸の有効性を調べた結果を示すグラフである。 図４は、シュードモナス属細菌Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．　Ｏｓ１７株に対するグルタミン酸の効果を示すグラフである。 図５は、病原微生物リゾクトニア属菌に対するシュードモナス属細菌及びグルタミン酸の病害防除効果を示すグラフである。
　以下に、本発明について詳述するが、本発明はこれらに限定されるものではない。本明細書で特段に定義されない限り、本発明に関連して用いられる科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものである。
（１）植物の土壌伝染性病害防除方法
　本発明の一態様は、シュードモナス属細菌及びグルタミン酸を土又は植物に付与する工程を含む、植物の土壌伝染性病害防除方法である。
　シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌は、プロテオバクテリア門ガンマプロテオバクテリア網シュードモナス科に属する細菌であり、グラム陰性好気性桿菌であることを特徴とする。シュードモナス属細菌の生育域は幅広く、土壌、淡水、海水、植物、又は動物に生息することが知られている。
　本発明におけるシュードモナス属細菌は、特に限定されないが、植物保護作用を有するものが好適に用いられる。その具体例としては、シュードモナス　プロテゲンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｒｏｔｅｇｅｎｓ）、シュードモナス　フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス　シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｙｒｉｎｇａｅ）、シュードモナス　クロロラフィス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）、シュードモナス　シンキサンタ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｙｎｘａｎｔｈａ）、シュードモナス　ブラシカセアルム（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｒｕｍ）、シュードモナス　プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）、及びシュードモナス　ロデシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｒｈｏｄｅｓｉｄｅ）等が挙げられる。また、本発明では、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．　Ｏｓ１７株、及びシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．　Ｓｔ２９株も利用することができ、これらの細菌は独立行政法人製品評価技術基盤機構（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（ＮＩＴＥ））　バイオテクノロジーセンター　特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）において、それぞれ受託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０２０５３（受託日：２０１５年５月２０日）及び受託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－０２０５４（受託日：２０１５年５月２０日）として寄託されている。好ましくは、シュードモナス　プロテゲンス、シュードモナスｓｐ．　Ｏｓ１７株、及びシュードモナスｓｐ．　Ｓｔ２９株が本発明において使用される。シュードモナス　プロテゲンスの細菌株のうち、好ましくはシュードモナス　プロテゲンスＣＨＡ０株、及びシュードモナス　プロテゲンスＣａｂ５７株が用いられるが、特にこれらに限定されない。
　シュードモナス属細菌は、自ら単離してきたものを使用してもよく、施設から分譲されたものを使用してもよく、或いは生物農薬製品として市場で利用可能なシュードモナス属細菌（即ち、市販品）を使用してもよく、その使用に関しては特に限定されない。
　グルタミン酸は、アミノ酸の一種であり、化学式ＨＯＯＣ（ＣＨ２）２ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＯＨ（又はＣ５Ｈ９ＮＯ４）で表される化合物である。また、グルタミン酸は、親水性アミノ酸、極性アミノ酸、極性電荷アミノ酸（極性負電荷アミノ酸）、又は酸性アミノ酸に分類され、Ｇｌｕ又はＥの略号で表されることもある。グルタミン酸は、植物及び動物に含まれており、具体的には海藻、小麦粉、大豆、サトウキビ等に含まれることが知られている。
　本発明においてグルタミン酸は、Ｄ体（Ｄ－グルタミン酸）、Ｌ体（Ｌ－グルタミン酸）、及びＤＬ体（ＤＬ－グルタミン酸）のいずれもが使用可能であり、特に限定されない。本発明では、Ｌ体のグルタミン酸（Ｌ－グルタミン酸）が好ましい。なお、Ｄ体のグルタミン酸のＣＡＳ番号は６８９３－２６－１であり、Ｌ体のグルタミン酸のＣＡＳ番号は５６－８６－０である。
　本発明においてグルタミン酸は、塩であってもよい。グルタミン酸の塩としては、例えば、ナトリウムやカリウム等のアルカリ金属塩（具体的には、グルタミン酸ナトリウム、グルタミン酸カリウム等）、カルシウムやマグネシウム等のアルカリ土類金属塩（具体的には、グルタミン酸カルシウム、グルタミン酸マグネシウム等）、グルタミン酸亜鉛、及びグルタミン酸鉄等が挙げられる。
　グルタミン酸について、その入手方法は特に限定されず、動物や植物から単離精製された天然のもの、或いは化学合成法や発酵法等により得られたもののいずれであってもよい。グルタミン酸は、自ら精製したものを使用してもよいし、或いは市販品を使用してもよく、その使用に関しては特に限定されない。本発明では、好ましくは市販されているグルタミン酸が用いられる。
　本発明の方法において、シュードモナス属細菌及びグルタミン酸は土又は植物に付与される。ここで、本明細書において「土」とは、植物が生育可能な土壌を意味する。本発明で用いられる土は、例えば、培土、培養土、育苗土、又は育苗培土等の名称で示されるものであってよい。また、何らの処理も行われていない山野の土をそのまま用いてもよい。土の粒度も特に限定されず、植物が生育可能である限りいかなる土であってもよい。本発明において付与対象とされる土は、植物の近辺の土（例えば、植物から１０ｃｍ以内の範囲にある土）であることが好ましい。
　本発明における植物は、特に限定されないが、農産物であることが好ましい。農産物の種類としては、例えば、野菜、穀物、果物、花、及び豆類等が挙げられるが、特にこれらに限定されない。また、その具体例としては、ウリ類（キュウリ、スイカ、カボチャ、ズッキーニ、ヒョウタン、ヘチマ、トウガン、テッポウウリ、ユウガオ、ツルレイシ（ニガウリ、ゴーヤ）、メロン等）、イモ類（ジャガイモ、サツマイモ、サトイモ、ナガイモ、ヤマノイモ等）、根菜類（カブ、ダイコン、ハツカダイコン、ワサビ、ホースラディッシュ、ゴボウ、チョロギ、ショウガ、ニンジン、ラッキョウ、レンコン、ユリ根等）、葉菜類（カラシナ、キャベツ、クレソン、ケール（ハゴロモカンラン）、コマツナ、サイシン、サンチュ、山東菜、シュンギク、シロナ、セリ、セロリ、タアサイ、ダイコンナ（スズシロ）、タカナ、チンゲンサイ、ニラ、菜の花、野沢菜、白菜、パセリ、ハルナ、フダンソウ（スイスチャード）、ホウレンソウ、ミズナ、ミブナ、ミツバ、メキャベツ、ルッコラ、レタス（チシャ）、はなっこりー、ワサビナ等）、果菜類（ナス、ペピーノ、トマト（ミニトマト、フルーツトマト等）、タマリロ、タカノツメ、トウガラシ、シシトウガラシ、ハバネロ、ピーマン（パプリカ、カラーピーマンを含む）、カボチャ、ズッキーニ、キュウリ、ツノニガウリ（キワノ）、シロウリ、ツルレイシ（ゴーヤ、ニガウリ）、トウガン、ヘチマ、ユウガオ、オクラ等）、穀物類（トウモロコシ等）、マメ類（アズキ、インゲンマメ、エンドウ、枝豆（エダマメ）、ササゲ、シカクマメ、ソラマメ、ダイズ、ナタマメ、ラッカセイ、レンズマメ、ゴマ等）、菌茸類（エノキタケ、エリンギ、キクラゲ、キヌガサタケ、シイタケ、シメジ、シロキクラゲ、タモギタケ、チチタケ、ナメコ、ナラタケ、ハタケシメジ、ヒラタケ、ブナシメジ、ブナピー、ポルチーニ、ホンシメジ、マイタケ、マッシュルーム、マツタケ、ヤマブシタケ等）等が挙げられる。
　本発明において付与対象とされる植物の状態は特に限定されず、種子若しくは幼苗、又は既に植物が生育した状態であってよいが、好ましくは種子又は幼苗であり、より好ましくは種子である。種子や幼苗といった生育初期の段階であることにより、土壌伝染性病害の罹りはじめを抑制することができ、より効果的に植物における土壌伝染性病害の防除を行うことができる。また、植物の組織が幼若であることにより、シュードモナス属細菌及びグルタミン酸は植物内に浸透しやすくなり、その点でも土壌伝染性病害の防除をより効果的に行うことができる。土壌伝染性病害防除の観点から、本発明において植物は、発根した種子であることが特に好ましい。なお、既に植物が生育した状態である場合は、植物の根、葉、茎、枝、又は幹等のいずれの部位に対してもシュードモナス属細菌及びグルタミン酸の付与を行うことができる。
　上述したシュードモナス属細菌及びグルタミン酸は土又は植物に対して付与されるが、その付与に関する方法及び手段は、本発明の効果が得られる限りにおいて特に限定されない。例えば、シュードモナス属細菌及びグルタミン酸を共に、又は別々に、懸濁又は溶解した水（水溶液）を準備して、その準備した水（水溶液）を土又は植物に接触させることにより付与操作を行うことができる。
　シュードモナス属細菌及びグルタミン酸の形態は、液体であってもよいし、固体であってもよい。当該形態が液体である場合は、吹き付け、滴下、又は浸漬等の操作によって、シュードモナス属細菌及びグルタミン酸を土又は植物に付与することができる。浸漬操作の場合には、容器を別途準備して、当該液体が入った容器の中に土又は植物が入った穴あき容器を入れて作業を行ってもよい。シュードモナス属細菌及びグルタミン酸の形態が固体である場合は、土の上又は土の中に当該固体を置くことによって付与してもよいし、或いは植物体の表面に当該固体を接触させることによって付与してもよい。
　土又は植物に付与するシュードモナス属細菌及びグルタミン酸の量は、特に限定されず、付与形態や対象とする植物の種類等に応じて適宜設定することができる。例えば、土に対してシュードモナス属細菌を付与する場合は、１ｃｍ３の土に対して１回あたり１０４～１０２０ＣＦＵ、好ましくは１０６～１０１０ＣＦＵの細菌数で付与することができる。また、土に対してグルタミン酸を付与する場合は、１ｃｍ３の土に対して１回あたり０．０１ｍＭ～１Ｍ、好ましくは０．１ｍＭ～１００ｍＭの量で付与することができる。シュードモナス属細菌及びグルタミン酸の付与量は、これらを含む製剤中の濃度と当該製剤の付与量によって調整することができる。また、例えば、植物に対してシュードモナス属細菌を付与する場合は、植物１個体に対して１回あたり１０４～１０２０ＣＦＵ、好ましくは１０６～１０１０ＣＦＵの細菌数で付与することができる。また、植物に対してグルタミン酸を付与する場合は、植物１個体に対して１回あたり０．０１ｍＭ～１Ｍ、好ましくは０．１ｍＭ～１００ｍＭの量で付与することができる。シュードモナス属細菌及びグルタミン酸の付与量は、これらを含む製剤中の濃度と当該製剤の付与量によって調整することができる。なお、グルタミン酸が塩である場合は、その遊離体（グルタミン酸イオン）に相当する分子量をもってグルタミン酸の量を計算することができる。
　シュードモナス属細菌及びグルタミン酸を付与する時期は、植物の播種前、播種時、及び播種後（育苗期、定植期等を含む）のいずれであってもよく、特に限定されないが、好ましくは植物の播種前又は播種後３日以内である。ここで、本明細書において「播種」とは、生育の出発点として植物を土壌に植えることを意味し、例えば、土壌への種まきや土壌に苗を植えること等が包含される。
　植物の播種前にシュードモナス属細菌及びグルタミン酸を付与する場合、その具体的な時期は特に限定されないが、例えば、播種前７日以内、播種前６日以内、播種前５日以内、播種前４日以内、播種前３日以内、播種前２日以内、播種前１日以内、播種前１２時間以内、播種前６時間以内、播種前３時間以内、播種前１時間以内、播種前３０分以内、播種前１０分以内、播種前５分以内、播種前１分以内、又は播種前３０秒以内である。また、植物の播種後に付与する場合、その付与時期は、播種後７日以内、播種後６日以内、播種後５日以内、又は播種後４日以内としてもよく、或いは、播種後２日以内、播種後１日以内、播種後１２時間以内、播種後６時間以内、播種後３時間以内、播種後１時間以内、播種後３０分以内、播種後１０分以内、播種後５分以内、播種後１分以内、又は播種後３０秒以内としてもよい。上記の付与時期は、典型的には播種前後７日以内である。本発明では、植物の生育初期の段階でシュードモナス属細菌及びグルタミン酸と植物とが接触することが好ましいため、そのような観点から上記の付与時期と植物播種時期との間の期間は短い方が好ましく、例えば、少なくとも播種前後３日以内、或いは少なくとも播種前後１日以内に付与を行うのが好ましい。
　本発明の方法においては、シュードモナス属細菌及びグルタミン酸は同時に付与されてもよいし、別々に付与されてもよい。本発明の方法では、特に限定されないが、シュードモナス属細菌及びグルタミン酸のうちいずれか一方を付与した後でその３日以内に他方を付与することができる。双方の付与時期の間隔は、２日以内、１日以内、１２時間以内、６時間以内、３時間以内、１時間以内、３０分以内、１０分以内、５分以内、１分以内、又は３０秒以内であってもよい。本発明においてグルタミン酸は、シュードモナス属細菌の土壌伝染性病害防除作用を飛躍的に増強させる働きを有していると考えられることから、双方の付与時期の間隔は長くならない方が好ましい。そのような観点から、シュードモナス属細菌とグルタミン酸とを付与する場合の双方の付与時期の間隔は、少なくとも１日以内であることが好ましい。なお、上述した植物の播種に対するシュードモナス属細菌及びグルタミン酸の付与時期は、いずれか一方が付与される時期として適用され、他方は当該付与後３日以内に付与することができる。
　シュードモナス属細菌とグルタミン酸とは、いずれを先に付与してもよい。すなわち、シュードモナス属細菌を先に付与し、次いでグルタミン酸を付与してもよいし、或いはグルタミン酸を先に付与し、次いでシュードモナス属細菌を付与してもよい。本発明では、特に限定されないが、シュードモナス属細菌を先に付与し、次いでグルタミン酸を付与することが好ましい。シュードモナス属細菌を先に付与すれば、植物（例えば、種子）の表面へのシュードモナス属細菌の接着性を高めることができ、それによって植物における土壌伝染性病害の防除をより効果的に行うことができると考えられる。
　本発明の方法はまた、シュードモナス属細菌及びグルタミン酸を付与した後でさらにグルタミン酸を付与する工程を含むことができる。グルタミン酸の更なる付与により、シュードモナス属細菌の土壌伝染性病害防除作用の増強効果を持続できると考えられ、さらに効果的に土壌伝染性病害を防除できることが期待される。グルタミン酸の更なる付与は１回以上行うことができ、２回以上、３回以上、４回以上、又は５回以上としてもよい。グルタミン酸の更なる付与は、典型的には１～２０回、好ましくは２～１０回、より好ましくは３～８回である。
　グルタミン酸の更なる付与は継続的に行うことができる。グルタミン酸をさらに付与する時期の間隔は、特に限定されないが、例えば、６時間以上、１２時間以上、１日以上、２日以上、３日以上、又は４日以上とすることができ、また、１０日以下、７日以下、６日以下、５日以下、４日以下、３日以下、２日以下、１日以下、又は１２時間以下としてもよい。グルタミン酸をさらに付与する時期の間隔は、典型的には６時間～１０日、好ましくは１２時間～７日、より好ましくは１～３日である。
　グルタミン酸をさらに付与する形態や手段は特に限定されず、上述した内容と同様にすることができる。また、グルタミン酸をさらに付与する量も特に限定されず、上記と同様にすることができる。
　本発明で対象とされる土壌伝染性病害は、土壌中に生存する病原微生物によって発生する病害である限り特に限定されない。土壌中に生存する病原微生物としては、例えば糸状菌（真菌類や卵菌類等）などが挙げられる。病原微生物である糸状菌の具体例としては、ピシウム（Ｐｙｔｈｉｕｍ）属菌（ピシウム　ウルティマム（Ｐｙｔｈｉｕｍ　ｕｌｔｉｍｕｍ）、ピシウム　アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ　ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）、ピシウム　メガラカンタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ　ｍｅｇａｌａｃａｎｔｈｕｍ）等）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属菌（フザリウム　オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム　グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム　ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｓｏｌａｎｉ）等）、リゾクトニア（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）属菌（リゾクトニア　ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ　ｓｏｌａｎｉ）等）、ティエラビオプシス（Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ）属菌等が挙げられる。また、糸状菌以外の病原微生物の具体例としては、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属菌（エルウィニア　カロトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ　ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属菌（ラルストニア　ソラナセアラム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ　ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）、ペクトバクテリウム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌（ペクトバクテリウム　カロトボラム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ）等）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属菌（バークホルデリア　グルメ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｇｌｕｍａｅ）等）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌（アグロバクテリウム　ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）等）等が挙げられる。本発明における病原微生物としては、糸状菌を対象とすることが好ましい。
　土壌伝染性病害としては、例えば、苗立枯病、ピシウム腐敗病、床替苗根腐病、萎凋病、葉腐病、根腐病、つる割病、立枯病、萎黄病、尻腐病、根腐衰弱病、球果褐変病、腐敗病、葉枯病、乾腐病、株枯病、赤かび病、球根腐敗病、茎腐萎凋病、茎腐病、根腐萎凋病、黒すじ実腐病、半枯病、黒しみ病、パナマ病、褐色腐敗病、フザリウム病、株腐病、紋枯病、芽枯病、くもの巣病、褐色紋枯病、すそ枯病、リゾクトニア病、球茎腐敗病、黒あざ病、せん孔葉枯病、乾性根腐病、大粒白絹病、虎斑病、すそ腐病、実腐病、腰折病、林地根腐病、尻腐病、莢腐敗、皮腐病、褐色あざ病、根朽病、褐色斑点病、白色葉腐病、リゾクトニア葉鞘腐敗病、リゾクトニア根腐病、水耕苗根腐病等が挙げられるが、これらに限定されない。
（２）植物の土壌伝染性病害防除用組成物
　本発明の一態様は、シュードモナス属細菌及びグルタミン酸を含む、植物の土壌伝染性病害防除用組成物である。
　本発明の組成物に用いられるシュードモナス属細菌及びグルタミン酸については、上述した通りである。
　本発明の組成物に含まれるシュードモナス属細菌の量は、細菌種、細菌の性質（耐乾燥性など）、適用する植物の種類、剤形の種類等に応じて適宜設定することができる。本発明の組成物中のシュードモナス属細菌の含有量は、例えば、組成物１００ｇ当たり１０４～１０２０ＣＦＵ、好ましくは１０６～１０１２ＣＦＵであるが、特に限定されるわけではない。
　本発明の組成物へのシュードモナス属細菌の添加方法は特に限定されず、そのまま添加してもよい。例えば、当業者に公知の方法でシュードモナス属細菌を培養し、液体培地であれば遠心分離等で回収し、固体培地であれば形成コロニーを白金耳等で回収して、本発明の組成物に添加することができる。或いは、液体中に保存していた状態から自体公知の方法で凍結乾燥処理を行い、シュードモナス属細菌を固体物として本発明の組成物に添加してもよい。
　本発明の組成物に含まれるグルタミン酸の量は、適用する植物の種類や剤形の種類等に応じて適宜設定することができる。本発明の組成物中のグルタミン酸の含有量は、例えば、組成物１００ｇ当たり０．０１ｍＭ～１Ｍ、好ましくは０．１ｍＭ～１００ｍＭであるが、特に限定されるわけではない。
　本発明の組成物は、賦形剤、増粘剤、結合剤、安定化剤、防腐剤、ｐＨ調整剤、着色剤、着香剤等の添加剤を含んでいてもよい。各種の添加剤は、特に限定されないが、生物農薬の技術分野において公知の材料を用いることができ、その配合量は、当業者の公知技術に基づいて適宜調整することができる。また、本発明の組成物の形態は、液体、固体、ゲル、ペースト等のいずれの形態であってもよく、使用状況等に応じて適宜設定することができる。
　本発明の組成物は、濃縮物の状態であってもよい。その場合の濃縮倍率は特に限定されず、例えば、２～１０００倍、５～１００倍、又は１０～５０倍とすることができる。本発明の組成物が濃縮物である場合は、水等の溶媒を用いて適宜希釈を行い、その希釈物を土又は植物に付与することができる。本発明の組成物中のシュードモナス属細菌及びグルタミン酸の含有量は、濃縮倍率に応じて設定することができる。
　本発明の組成物はまた、シュードモナス属細菌及びグルタミン酸が含まれる単一の製剤として構成されていてもよく、或いは、シュードモナス属細菌とグルタミン酸とが別々に含まれる二つの製剤として構成されていてもよい。本発明の組成物が二つの製剤として構成される場合は、当該二つの製剤は併用されること（即ち、併用剤であること）が好ましい。また、本発明の組成物が二つの製剤として構成される場合、当該二つの製剤は異なる種類の剤形であってもよいし、同一種類の剤形であってもよい。
　本発明の組成物は、植物の土壌伝染性病害防除用として用いられる。対象とする植物や土壌伝染性病害は特に限定されるものではなく、その具体例としては上記の内容と同様である。本発明の組成物は、生物農薬又は微生物農薬としても使用することができる。そのため、本発明の組成物は農薬組成物と称することもできる。
（３）植物の土壌伝染性病害防除用キット
　本発明の一態様は、シュードモナス属細菌及びグルタミン酸を含む、植物の土壌伝染性病害防除用キットである。
　本発明のキットに用いられるシュードモナス属細菌及びグルタミン酸については、上述した通りである。
　本発明のキットにおけるシュードモナス属細菌及びグルタミン酸は、試薬であってもよいし、或いは調製物であってもよく、その形態は特に限定されない。また、シュードモナス属細菌及びグルタミン酸は、双方が同一の製剤に含まれていてもよいし、別個の製剤にそれぞれ分けて含まれていてもよい。シュードモナス属細菌及びグルタミン酸が別個の製剤に分けられている場合、当該製剤は異なる種類の剤形であってもよいし、同一種類の剤形であってもよい。
　本発明のキットにおいて用いられる製剤の形態は特に限定されず、液体、固体、ゲル、ペースト等のいずれの形態であってもよい。また、製剤中のシュードモナス属細菌及びグルタミン酸の含有量も特に限定されず、上述した本発明の組成物に準じて任意に設定することができる。
　本発明のキットにおいて用いられる製剤は、シングルユースとして一回当たりの使用量が個別に包装されていてもよいし、複数回（例えば、２回、３回、４回、５回、１０回、又はそれ以上）の使用量を含んだ形態で包装されていてもよい。使用される容器も特に限定されず、製剤の使用量等に応じて適宜設定することができる。
　本発明のキットにおいてシュードモナス属細菌及びグルタミン酸が別個の試薬又は製剤に分けられている場合、双方は同一のパッケージに組み込まれている必要はなく、別々にパッケージングされていて使用時に併用されるものであってもよい。また、本発明のキットは、シュードモナス属細菌及びグルタミン酸の使用に関する取扱説明書を含んでいてもよい。
　本発明のキットは、植物の土壌伝染性病害防除用として用いられる。対象とする植物や土壌伝染性病害は特に限定されるものではなく、その具体例としては上記の内容と同様である。本発明のキットは、生物農薬又は微生物農薬としても使用することができる。
　以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾及び変更を加えることができ、それらも本発明の技術的範囲に含まれる。
＜実験例１＞
　植物としてキュウリを使用し、土壌病原菌であるピシウム属菌（Ｐｙｔｈｉｕｍ　ｕｌｔｉｍｕｍ　ＭＡＦＦ４２５４９４株）による伝染性病害について、シュードモナス属細菌とグルタミン酸の病害防除効果を調べた。
　滅菌水をしみ込ませた濾紙の上にキュウリの種子を並べ、２６℃、２４時間、暗黒下に置いた。シュードモナス属細菌としてはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｒｏｔｅｇｅｎｓ　ＣＨＡ０株を使用し、ＮＹＢ培地（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　ｂｒｏｔｈ：２５ｇ、Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ：５ｇ、Ｈ２Ｏ：１０００ｍｌ）にて３０℃、１８０ｒｐｍ、２４時間の条件で振盪培養した。シュードモナス属細菌の培養液は、遠心分離して上清を取り除き、ＯＤ６００＝０．１になるよう滅菌水で懸濁した。
　バーミキュライトに水を加えてなじませた。バーミキュライトに対して、雑穀（あわ）に感染させておいたピシウム属菌を雑穀ごと加え、十分に混ぜた。バーミキュライト１Ｌに対し、ピシウム属菌を感染した雑穀を７ｇ加えた。なお、一部のバーミキュライトについては、ピシウム属菌を感染した雑穀は添加せずに取り分けておいた。
　準備したバーミキュライトを、底部に穴があり水が透過可能な育苗用トレイ（１区画あたり５ｃｍ四方、深さ５ｃｍ）に５０ｍＬずつ均等に分けた。発根が確認されたキュウリの種子を２粒ずつバーミキュライトの上にまいた。
　シュードモナス属細菌及びグルタミン酸をキュウリ種子及びその近辺の土に付与した。具体的には、１区画の育苗用トレイに対してシュードモナス属細菌の調整済み水溶液を４ｍＬずつ、キュウリ種子にめがけて添加し、ピシウム属菌を感染させずに取り分けておいたバーミキュライトをキュウリ種子の上から１５ｍＬずつかぶせ、この育苗用トレイを、バットに入った水又は１０ｍＭグルタミン酸（Ｌ－グルタミン酸）水溶液（育苗用トレイ１区画につき１０ｍＬ）の中に浸した。なお、シュードモナス属細菌及びグルタミン酸の付与はキュウリ種子の播種後２時間以内に行い、シュードモナス属細菌とグルタミン酸との付与時期の間隔は１時間以内とした。
　育苗用トレイは、２５℃に設定した植物用インキュベーターに入れた。なお、明期は１６時間、暗期は８時間に設定した。インキュベーターでの栽培期間は２週間とし、１日おきにバット中の水又は１０ｍＭグルタミン酸水溶液を交換した。
　本実験例の結果を図１に示す。図１の写真に示された通り、シュードモナス属細菌にグルタミン酸を併用させることにより、土壌伝染性病害の防除効果が高まることが明らかとなった。また、グルタミン酸それ自体の土壌伝染性病害防除効果は高くないようであったことから、グルタミン酸はシュードモナス属細菌に作用して、シュードモナス属細菌の土壌伝染性病害防除作用を増強させる効力を有していると考えられた。
＜実験例２＞
　実験例１と同様の方法を用いて、シュードモナス属細菌との併用効果として、グルタミン酸及びヒスチジンの有効性を調べた。
　ヒスチジンの付与に関しては、１０ｍＭヒスチジン（Ｌ－ヒスチジン）水溶液を準備して、上記実験例１でのグルタミン酸水溶液の代わりに使用した。また、キュウリの栽培数は各群ｎ＝１２として、２週間の栽培後、キュウリの重量を測定し、その平均値を算出した。キュウリの重量測定では、キュウリの根に付着したバーミキュライトは十分に洗い流すようにした。
　本実験例の結果を図２に示す。本実験例により、植物の土壌伝染性病害防除効果が数値化され、グルタミン酸の添加によりシュードモナス属細菌の病害防除効果が高まることがより明確に示された（ｔ検定による有意差あり）。一方、ヒスチジンに関しては、シュードモナス属細菌の病害防除効果を高める作用はなく、むしろ減弱させてしまう可能性があることが示唆された。
＜実験例３＞
　ヒスチジン以外の各種アミノ酸について、シュードモナス属細菌との併用効果を調べた。本実験例では実験例１と同様の方法を用い、アミノ酸としては、グルタミン酸（Ｇｌｕ）に加え、グルタミン（Ｇｌｎ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、アルギニン（Ａｒｇ）、リジン（Ｌｙｓ）、バリン（Ｖａｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）及びトリプトファン（Ｔｒｐ）を評価した。いずれのアミノ酸も１０ｍＭ濃度の水溶液を準備して使用した。なお、本実験例ではシュードモナス属細菌としてＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｒｏｔｅｇｅｎｓ　Ｃａｂ５７株を用い、アミノ酸は全てＬ体のものを用いた。
　本実験例ではキュウリの栽培数は各群ｎ＝１２～１８とし、実験例２と同様にして、２週間の栽培後、キュウリの重量を測定し、その平均値を算出した。各群のキュウリ重量の平均値について、シュードモナス属細菌のみを添加した群の結果を１としてその相対値を求めた。
　本実験例の結果を図３に示す。この結果から、使用したアミノ酸のうちグルタミン酸以外のものはいずれもシュードモナス属細菌の病害防除効果を高める作用は強くないことが示された。なお、グルタミン酸については、シュードモナス属細菌の細菌株が異なっても同様の効果が発揮されることが示された（ｔ検定による有意差あり）。
＜実験例４＞
　本実験例では、シュードモナス属細菌としてＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．　Ｏｓ１７株を用いて、当該細菌に対するグルタミン酸の効果を調べた。
　本実験例では実験例１と同様の方法を用い、キュウリの栽培数は各群ｎ＝１７とし、実験例３と同様にして、２週間の栽培後のキュウリ重量について、シュードモナス属細菌のみを添加した群の結果を１としてその相対値を求めた。
　本実験例の結果を図４に示す。この結果から、グルタミン酸は、シュードモナス属細菌がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．　Ｏｓ１７株の場合であっても同様の効果が発揮されることが示された（ｔ検定による有意差あり）。
＜実験例５＞
　シュードモナス属細菌とグルタミン酸との土壌伝染性病害防除効果について、病原微生物が異なった場合にも同様の効果が見られるかどうか調べた。
　本実験例では、病原微生物としてリゾクトニア属菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ　ｓｏｌａｎｉ　ＭＡＦＦ７２６５５１株）を用いた。また、シュードモナス属細菌としては、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｒｏｔｅｇｅｎｓ　Ｃａｂ５７株を用いた。
　本実験例では実験例１と同様の方法を用い、ピシウム属菌を感染した雑穀７ｇに代えて、リゾクトニア属菌を感染した雑穀１ｇをバーミキュライト１Ｌに対して添加した。また、キュウリの栽培期間は５日間とした。キュウリの栽培数は各群ｎ＝８～１２とし、実験例３と同様にして、栽培後のキュウリ重量について、シュードモナス属細菌のみを添加した群の結果を１としてその相対値を求めた。
　本実験例の結果を図５に示す。この結果から、シュードモナス属細菌とグルタミン酸との土壌伝染性病害防除効果は、病原微生物の種類が異なった場合にも見られることが明らかとなった（ｔ検定による有意差あり）。
　本発明により提供される技術は、植物として農産物を効果的に土壌伝染性病害から防除できる観点から農業分野において有用である。本発明により提供されるシュードモナス属細菌とグルタミン酸は、農薬分野、特に生物農薬の分野において利用することができる。

Claims (9)

  1. 　シュードモナス属細菌及びグルタミン酸を土又は植物に付与する工程を含む、植物の土壌伝染性病害防除方法。
  2. 　植物が種子又は幼苗である、請求項１に記載の方法。
  3. 　植物が、発根した種子である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　植物の播種前又は播種後３日以内にシュードモナス属細菌及びグルタミン酸を付与する、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　シュードモナス属細菌及びグルタミン酸のうちいずれか一方を付与し、当該付与後３日以内に他方を付与する、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　シュードモナス属細菌を先に付与し、次いでグルタミン酸を付与する、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　シュードモナス属細菌及びグルタミン酸を付与した後でさらにグルタミン酸を付与する工程を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　シュードモナス属細菌及びグルタミン酸を含む、植物の土壌伝染性病害防除用組成物。
  9. 　シュードモナス属細菌及びグルタミン酸を含む、植物の土壌伝染性病害防除用キット。
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