WO2019151392A1 - 抗原特異的ｍｈｃ発現調節法 - Google Patents

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WO2019151392A1
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Definitions

  • the present invention relates to treatment or diagnosis of autoimmune diseases, organ transplant rejection, or allergic diseases.
  • MHC is an important molecule in autoimmune diseases and organ transplantation.
  • MHC type is known as a blood type of leukocytes and is a landmark for individuals. MHC is roughly classified into class I and class II, and an antigenic peptide is presented on MHC to form an MHC complex.
  • T cell receptor TCR
  • MHC complex An immune response occurs when a T cell receptor (TCR) on a T cell binds to an MHC complex and is activated specifically for an antigen peptide.
  • T cell receptors play an important role in the action of T cells.
  • T cell receptor repertoire of T cell receptors of patients suffering from a certain disease has been analyzed, and disease specific T cells have been analyzed.
  • Methods for identifying receptors have also been developed.
  • a method using a protein having a T cell receptor fragment has also been reported.
  • MHC-specific antibodies In order to regulate the response of T cells, various methods for regulating the response of T cells themselves have been studied, but considering that the immune response of T cells arises from the binding of T cell receptors and MHC complexes. It is sufficient that the expression of MHC can be specifically regulated.
  • expression regulation by MHC-specific antibodies has been performed.
  • mouse MHC class I molecules include H-2K, D, and L, and antibodies against each molecule have been prepared.
  • anti-MHC antibodies induce a decrease in expression (down-modulation) of MHC molecules (Patent Document 1).
  • Patent Document 1 since there is no antigen peptide specificity, it is estimated that side effects are large.
  • the present invention relates to an autoimmune disease by regulating the expression of MHC (Major-histocompatibility complex) on the cell surface in an antigen peptide-specific manner using the recognition mechanism of T cell receptor (TCR).
  • Another object of the present invention is to provide a method for treating or diagnosing organ transplant rejection or allergic diseases.
  • MHC molecules can present antigen peptides, but antibodies against MHC bind only to MHC, and few antigen peptides recognize and bind to MHC molecules.
  • An exception is an antibody that recognizes an OVA peptide and an MHC complex, but the production of an antibody that recognizes an MHC complex in response to an antigen peptide usually takes about 6 months and cannot be done easily. . Therefore, it is a problem that it is difficult to prepare a molecule that regulates the expression of MHC on the cell surface according to the antigen peptide.
  • the T cell receptor recognizes the antigen peptide and the MHC complex, it was thought that the T cell receptor could be used like an antibody.
  • the antigenic peptide and MHC complex can be down-modulated by a T cell receptor chimeric protein to reduce the cell surface expression, it is considered to be a lead compound for many diseases.
  • mouse MHC class I molecules include H-2K, D, and L, and antibodies against each molecule are prepared.
  • MHC molecules can present antigen peptides, but few antibodies against MHC recognize and bind to antigen peptides and MHC molecules.
  • T cell receptor (TCR) analysis technology enables the cloning of antigen peptide-specific T cell receptors (International Publication No. WO2016 / 136716), and T cell receptor chimeric proteins based on that information Can be made.
  • This T cell receptor chimeric protein is antigen peptide specific, binds to MHC and peptide complex, induces MHC down-modulation, and decreases expression.
  • T cell receptor chimeric protein that induces down-modulation of a complex of an antigen peptide and MHC and decreases its expression can be used as a drug for autoimmune disease or organ transplant rejection.
  • the present inventor has found a method for regulating the cell surface expression of an antigen peptide-specific MHC complex using a TCR chimeric protein. Thereby, it can be changed so as to suppress the reaction of T cells, and it is expected to lead to suppression of onset of autoimmune disease, suppression of rejection of organ transplant, and suppression of allergic disease.
  • a T cell receptor chimeric protein which is a fusion protein of a variable region of a T cell receptor recognizing a complex of an autoimmune disease specific antigen and an MHC molecule, and an immunoglobulin Fc region, is included as an active ingredient.
  • MHC molecule complex expression-reducing agent that binds to a specific antigen and MHC molecule complex on an antigen presenting cell or target cell recognized by a pathogenic T cell and specifically decreases the expression of the MHC molecule complex .
  • a T cell receptor chimeric protein that is a fusion protein of a variable region of a T cell receptor that recognizes a complex of a donor-derived antigen and MHC molecule specific to rejection of an organ transplant and an Fc region of an immunoglobulin. It binds to an antigen-presenting cell recognized by pathogenic T cells or a donor-specific antigen and MHC molecule complex, which is included as an active ingredient, to reduce the expression of the MHC molecule complex in an antigen-specific manner. , MHC molecule complex expression reducing agent.
  • a T cell receptor chimeric protein which is a fusion protein of a variable region of a T cell receptor that recognizes a complex of a specific antigen of an allergic disease and an MHC molecule, and an immunoglobulin Fc region, is included as an active ingredient.
  • An MHC molecule complex expression-reducing agent that binds to a complex of an antigen-presenting cell or target cell recognized by a pathogenic T cell and a complex of an MHC molecule and specifically decreases the expression of the MHC molecule complex.
  • the MHC molecule complex expression lowering agent according to any one of [1] to [3], wherein the T cell receptor chimeric protein comprises the variable region of the T cell receptor, all of CDR3, and the J region.
  • a T cell receptor chimeric protein which is a fusion protein of a variable region of a T cell receptor recognizing a complex of an autoimmune disease specific antigen and MHC molecule and an Fc region of an immunoglobulin, as an active ingredient, To bind to an antigen-presenting cell recognized by a pathogenic T cell or a complex of a specific antigen on a target cell and an MHC molecule, thereby reducing the expression of the MHC molecule complex and preventing it from being recognized by the pathogenic T cell.
  • a T cell receptor chimeric protein which is a fusion protein of a variable region of a T cell receptor that recognizes a complex of a donor-derived antigen and MHC molecule specific to rejection of an organ transplant and an Fc region of an immunoglobulin. It binds to the antigen-presenting cell recognized by the pathogenic T cell or the donor-specific antigen on the target cell and the MHC molecule complex, which is contained as an active ingredient, to reduce the expression of the MHC molecule complex.
  • a T cell function-lowering agent for reducing the function of T cells that cause rejection of organ transplantation so as not to be recognized by cells is a T cell function-lowering agent for reducing the function of T cells that cause rejection of organ transplantation so as not to be recognized by cells.
  • a T cell receptor chimeric protein which is a fusion protein of a variable region of a T cell receptor that recognizes a complex of a specific antigen of an allergic disease and an MHC molecule, and an immunoglobulin Fc region, as an active ingredient, To bind to an antigen-presenting cell recognized by a pathogenic T cell or a complex of a specific antigen on a target cell and an MHC molecule, thereby reducing the expression of the MHC molecule complex and preventing it from being recognized by the pathogenic T cell.
  • T cell function-lowering agents that cause allergic diseases.
  • T cell function-lowering agent according to any one of [10] to [17], wherein the MHC molecule is a classic MHC molecule or a non-classical MHC molecule.
  • An autoimmune disease therapeutic agent comprising the MHC molecule complex expression-reducing agent according to any one of [1] and [4] to [9].
  • An organ transplant rejection inhibitor comprising the MHC molecule complex expression-reducing agent according to any one of [2] and [4] to [9].
  • a therapeutic agent for allergic diseases comprising the MHC molecule complex expression-reducing agent according to any one of [3] to [9].
  • a therapeutic agent for an autoimmune disease comprising the T cell function-lowering agent according to any one of [10] and [13] to [18].
  • An organ transplant rejection inhibitor comprising the T cell function-lowering agent of any one of [11] and [13] to [18].
  • An allergic disease therapeutic agent comprising the T cell function-lowering agent according to any one of [12] to [18].
  • a T cell receptor chimeric protein that is a fusion protein of a variable region of a T cell receptor that recognizes a complex of an autoimmune disease specific antigen and MHC molecule and an Fc region of an immunoglobulin, and is labeled
  • the T cell receptor chimeric protein is brought into contact with cells collected from a biological sample of the subject, and the T cell receptor chimeric protein binds to cells collected from the biological sample of the subject, target cells are present in the subject.
  • a method for detecting an autoimmune disease wherein the method comprises determining that the subject is suffering from an autoimmune disease.
  • the autoimmune disease detection method according to [25] wherein the MHC molecule is a classic MHC molecule or a non-classical MHC molecule.
  • a T cell receptor chimeric protein that is a fusion protein of a variable region of a T cell receptor that recognizes a complex of an autoimmune disease specific antigen and MHC molecule and an Fc region of an immunoglobulin, and is labeled
  • a reagent for detecting an autoimmune disease comprising a T cell receptor chimeric protein.
  • a T cell receptor chimeric protein that is a fusion protein of a variable region of a T cell receptor recognizing a complex of a donor-derived antigen and MHC molecule specific to organ transplant rejection and an immunoglobulin Fc region.
  • the labeled T cell receptor chimeric protein is brought into contact with cells collected from a biological sample of the subject, and the T cell receptor chimeric protein binds to cells collected from the biological sample of the subject, the subject A method of detecting rejection that causes rejection of organ transplantation, wherein target cells are present and it is determined that rejection has occurred in a subject.
  • the rejection detection method according to [29] wherein the MHC molecule is a classic MHC molecule or a non-classical MHC molecule.
  • a T cell receptor chimeric protein which is a fusion protein of a variable region of a T cell receptor recognizing a complex of a donor-derived antigen and MHC molecule specific to rejection of an organ transplant and an Fc region of an immunoglobulin.
  • a reagent for detection of rejection comprising a labeled T cell receptor chimeric protein.
  • a T cell receptor chimeric protein that is a fusion protein of a variable region of a T cell receptor that recognizes a complex of a specific antigen of an allergic disease and an MHC molecule and an Fc region of an immunoglobulin, and is labeled
  • the T cell receptor chimeric protein is brought into contact with cells collected from a biological sample of the subject, and the T cell receptor chimeric protein binds to cells collected from the biological sample of the subject, target cells are present in the subject.
  • a method for detecting an allergic disease wherein the method determines that the subject is suffering from an allergic disease.
  • the allergic disease detection method according to [33] wherein the MHC molecule is a classic MHC molecule or a non-classical MHC molecule.
  • a T cell receptor chimeric protein that is a fusion protein of a variable region of a T cell receptor that recognizes a complex of a specific antigen of an allergic disease and an MHC molecule and an Fc region of an immunoglobulin, and is labeled
  • a reagent for detecting allergic diseases comprising a T cell receptor chimeric protein.
  • a T cell receptor (TCR) chimeric protein binds to an MHC class I or class II molecule that is a complex with an antigenic peptide and down-regulates an MHC molecule that presents an antigen of an antigen-presenting cell or disease target cell. Induces modulation and decreases expression.
  • down-modulation of the MHC molecule means that the expression of the MHC molecule is suppressed and the expression is decreased.
  • the reactivity of pathogenic T cells to antigen-presenting cells is changed, and the function of T cells is reduced.
  • autoimmune diseases, organ transplant rejection or allergic diseases can be suppressed and treated.
  • the T cell receptor chimeric protein can bind to disease target cells expressing MHC molecules, it can also be used for detection of disease target cells.
  • T cell receptor chimeric protein induces down-modulation of antigen peptide and MHC complex.
  • T cell receptor chimeric protein can be easily produced in about 2 weeks after obtaining genetic information. Compared to the conventional monoclonal antibody production time (approximately 6 months from immunization to completion of screening) , Time is greatly reduced. In the case of monoclonal antibodies, confirmation of the epitope (recognition of the recognition site) is necessary. However, since the T cell receptor is a ligand of MHC, confirmation of the recognition site is easy only by changing the antigen peptide. Can be confirmed.
  • T cell receptor chimeric proteins can be easily prepared for different antigenic peptides with the same MHC.
  • T cell receptor chimeric protein TCR-IgFc
  • TCR-IgFc T cell receptor chimeric protein
  • TCR-IgFc T cell receptor chimeric protein
  • TCR-IgFc T cell receptor chimeric protein
  • TCR-IgFc T cell receptor chimeric protein
  • FIG. 4 is a view showing TCR-IgFc binding to an antigen peptide in an in vitro cultured cell.
  • T cell receptor chimeric protein (1) Structure of T cell receptor chimeric protein In the method of the present invention, a T cell receptor (TCR: T cell receptor) variable region and an immunoglobulin Fc region are fused. Cell receptor chimeric protein is used. The T cell receptor chimeric protein is also referred to as T cell receptor-immunoglobulin chimeric protein or TCR-IgFc fusion protein.
  • the T cell receptor chimeric protein of the present invention is a chimeric protein in which the variable region (TCR V region) of the T cell receptor, all of CDR3, and the J region are bound to the IgFc portion.
  • it may be a chimeric protein in which the variable region (TCRTCV region) of the T cell receptor, all of CDR3, the J region, and a part of the C region are bound to the IgFc portion.
  • the T cell receptor chimeric protein of the present invention can be represented as TCR-IgFc.
  • variable region of the T cell receptor As the variable region of the T cell receptor, the variable region of the T cell receptor that recognizes an antigen specific for autoimmune disease, organ transplant rejection or allergic disease is used.
  • the variable region of the T cell receptor of the present invention comprises a complex of an autoimmune disease specific antigen and MHC molecule, a donor-derived antigen specific for rejection of organ transplant (antigen peptide) and a complex of MHC molecule or allergy. Recognizes a complex of MHC molecules with specific antigens of sexually transmitted diseases.
  • the T cell receptor chimeric protein of the present invention is a complex of an antigen-presenting cell or a target antigen-recognized MHC molecule on an autoimmune disease pathogenic T cell, or pathogenicity of organ transplant rejection.
  • a specific antigen derived from a donor on an antigen presenting cell or target cell recognized by a T cell and a complex of an MHC molecule, or an antigen presenting cell recognized by a pathogenic T cell of an allergic disease or a specific antigen on a target cell It binds to the complex of MHC molecule and reduces the expression of MHC molecule complex in an antigen-specific manner as well as competitive inhibition with pathogenic T cells.
  • the T cell receptor chimeric protein of the present invention can reduce the function of T cells by preventing T cells from recognizing cells expressing MHC molecules.
  • MHC is not limited to classical MHC (class Ia, class II), but also includes non-classical MHC, so-called class Ib molecules.
  • Class Ib molecules also include, for example, CD1, MR1, H2-M3, HLA-G, and the like that are found to bind to T cells (Biochemistry 81, No. 3, pp.189-199, 2009).
  • the decrease in the expression of the MHC molecule complex includes a decrease in the expression of the MHC gene and a decrease in the expression of the MHC molecule on the cell surface, preferably a decrease in the expression of the MHC molecule on the cell surface.
  • the T cell receptor is a dimer composed of an ⁇ chain and a ⁇ chain, or a ⁇ chain and a ⁇ chain, and each chain is composed of a variable region and a constant region.
  • the variable region is encoded by a plurality of gene fragments V (variable) region (V gene fragment), D (diversity) region and J (joining) region ( ⁇ chain, ⁇ chain), or V region and J region ( ⁇ chain, ⁇ chain), it will have multiple repertoires through gene rearrangement.
  • V variable region
  • D diversity
  • J joining region
  • ⁇ chain, ⁇ chain V region and J region
  • CDRs complementarity determining regions
  • the variable region of the T cell receptor of the T cell receptor chimeric protein of the present invention is an ⁇ chain or a ⁇ chain, and may be a single chain in which both the ⁇ chain and the ⁇ chain are fused.
  • one chain is a fusion protein of an immunoglobulin Fc region and an ⁇ chain of a T cell receptor, and the other chain is an immunoglobulin Fc region. It may be a fusion protein of the T cell receptor ⁇ chain.
  • the T cell receptor variable region of the T cell receptor chimeric protein may be a ⁇ chain or a ⁇ chain, and may be a single chain in which both the ⁇ chain and the ⁇ chain are fused.
  • one chain is a fusion protein of an immunoglobulin Fc region and a ⁇ chain of a T cell receptor, and the other chain is an immunoglobulin Fc region and a T cell receptor. It may be a fusion protein of the body ⁇ chain.
  • the ⁇ chain, ⁇ chain, ⁇ chain and ⁇ chain of the variable region of the T cell receptor are composed of about 200 to 400 amino acids.
  • the variable chain ⁇ chain, ⁇ chain, ⁇ chain, and ⁇ chain of the T cell receptor used in the present invention are, for example, the naturally occurring variable chain ⁇ chain, ⁇ chain, ⁇ chain, and ⁇ chain of the T cell receptor.
  • T cell receptor variable region having an amino acid sequence having 90% or more, 95% or more, 97% or more, or 99% or more identity is included.
  • the T cell receptor chimeric protein of the present invention is preferably a multimer such as a dimer or a tetramer, and an ⁇ chain- ⁇ chain combination or an ⁇ chain- ⁇ chain combination as a variable region of the dimer. And a combination of ⁇ chain and ⁇ chain.
  • the variable region of the tetramer include a combination of ⁇ chain- ⁇ chain and ⁇ chain- ⁇ chain.
  • a ⁇ chain- ⁇ chain combination, a ⁇ chain- ⁇ chain combination, and a ⁇ chain- ⁇ chain combination may be mentioned.
  • Examples of the variable region of the tetramer include a combination of ⁇ chain- ⁇ chain and ⁇ chain- ⁇ chain.
  • the variable region of the T cell receptor may be derived from any T cell as long as it binds to MHC, and may be derived from a helper T cell (CD4 positive T cell) or a killer T cell (CD8 positive T cell). It may be derived from regulatory T cells (regulatory T cell, Treg) or Th17 cells, NKT cells, effector T cells, ⁇ T cells. Any of these T cell-derived T cell receptors recognizes and binds to the MHC molecule and can be used as a constituent molecule of the T cell receptor chimeric protein of the present invention.
  • immunoglobulin Fc region refers to an immunoglobulin Fc fragment, that is, a CH2 and CH3 constant domain of a natural immunoglobulin.
  • the Fc region of an immunoglobulin is preferably derived from a human, but an immunoglobulin of a non-human animal such as a mouse immunoglobulin can also be used.
  • the immunoglobulin is preferably IgG.
  • Human IgG subclasses include IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4, and mouse immunoglobulins include IgG1, IgG2a, IgG2b and IgG3.
  • IgG1 and IgG3 are preferred because the Fc regions of IgG1 and IgG3 bind strongly to the Fc receptor, and among these, IgG1 is preferred.
  • IgG2a is preferred because the Fc region of IgG2a is likely to bind to the Fc receptor (FcR) of NK cells.
  • the Fc region of the immunoglobulin includes any of natural mutants, artificial mutants, and truncated forms. For example, the Fc region of a naturally occurring immunoglobulin, and BLAST (Basic Local Alignment Search, Tool Nat, the National National Center for Biological Information, etc.) etc. (eg, default or default settings) Fc region having an amino acid sequence having 90% or more, 95% or more, 97% or more, or 99% or more identity.
  • a linker may be included between the chains, and the two proteins only need to be tandemly bonded via the linker.
  • the linker is a peptide linker consisting of an amino acid sequence having a specific length, and the number of amino acids is not limited, but is 1 to 30, preferably 3 to 25, and more preferably 5 to 20.
  • the type of amino acid is not limited, and an amino acid having a small side chain and not having high reactivity or an amino acid having an ⁇ -helix structure when linked is preferable.
  • Such amino acids include glycine (G), serine (S), alanine (A), threonine (T), aspartic acid (D), lysine (K), glutamic acid (E), leucine (L), methionine (M ) And the like.
  • variable region of the T cell receptor recognizes a self antigen expressed in a specific autoimmune disease.
  • the variable region of the T cell receptor may be used.
  • a T cell receptor variable region for example, a T cell receptor variable region derived from a specific autoimmune disease patient can be used.
  • Autoimmune diseases to be treated in the present invention include autoimmune diabetes, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, celiac disease, inflammatory bowel diseases such as Crohn's disease and ulcerative colon, psoriasis, type I diabetes mellitus, Systemic lupus erythematosus, Hashimoto's thyroiditis, myasthenia gravis, Guillain-Barre syndrome, autoimmune uveitis, primary biliary cirrhosis, autoimmune hepatitis, autoimmune hemolytic anemia, pernicious anemia, autoimmune thrombocytopenia, Graves Disease, autoimmune ovitis, autoimmune orchitis, temporary arthritis, antiphospholipid syndrome, Wegner's granulomatosis, Behcet's disease, scleroderma, polymyositis, dermatomyositis, ankylosing spondylitis, Sjogren's syndrome, herpes zoster Dermatiti
  • lymphocytes are collected from the autoimmune disease patient, a repertoire of T cell receptors of lymphocytes is identified, and is frequently observed in the autoimmune disease patient.
  • the variable region of the T cell receptor may be used.
  • the T cell receptor recognizes a specific epitope of the autoantigen of the patient with the autoimmune disease.
  • Such a DNA encoding a T cell receptor specific for a specific epitope can be obtained by comprehensive analysis of T cell receptors of patients with autoimmune diseases. There are as many as 10 18 repertoires of T cell receptors, but now comprehensive analysis is possible. For example, T cells are collected from lymph nodes of autoimmune disease patients, and total mRNA is extracted and purified.
  • cDNA is synthesized from the total mRNA by reverse transcriptase to prepare a cDNA library.
  • the prepared cDNA library can be sequenced by a next-generation sequencer to analyze the T cell receptor repertoire. It can be determined that a T cell receptor having a high appearance frequency in a patient with an autoimmune disease is a specific T cell receptor having a high specificity for the autoimmune disease.
  • the full-length sequence of the T cell receptor is cloned.
  • a full-length sequence of the T cell receptor using a primer that binds to the 5 ′ end portion of the DNA encoding the variable region of the T cell receptor and a primer that binds to the 3 ′ end portion of the constant region of the T cell receptor. And is incorporated into a cloning vector to produce a full-length gene library encoding a T cell receptor.
  • the genes in this full-length gene library are sequenced again.
  • the T cell receptor having a high appearance frequency in the above T cell receptor repertoire analysis is used as a T cell receptor specific to autoimmune disease, and a clone having the gene sequence of this T cell receptor is used as an autoimmune disease. Selected as a clone of a specific T cell receptor.
  • the variable region of the T cell receptor is a variable of the T cell receptor that recognizes a donor-derived transplanted tissue antigen.
  • a region may be used.
  • a T cell receptor variable region for example, a T cell receptor variable region that recognizes a donor-derived target cell can be used.
  • lymphocytes are collected from the organ transplant patient (recipient), the repertoire of the T cell receptor of the lymphocyte is identified, and the organ transplant patient (recipient).
  • the variable region of the T cell receptor that is found at a high frequency may be used.
  • the T cell receptor recognizes a specific epitope of the transplanted tissue antigen from that donor.
  • a DNA encoding a T cell receptor specific for a specific epitope of a donor-derived transplanted tissue antigen can be obtained by comprehensively analyzing the T cell receptor of an organ transplant patient (recipient). Can do. There are as many as 10 18 repertoires of T cell receptors, but now comprehensive analysis is possible. For example, T cells are collected from lymph nodes of an organ transplant patient (recipient), and total mRNA is extracted and purified. Next, cDNA is synthesized from the total mRNA by reverse transcriptase to prepare a cDNA library.
  • the prepared cDNA library can be sequenced by a next-generation sequencer to analyze the T cell receptor repertoire. It can be determined that a T cell receptor having a high appearance frequency in an organ transplant patient (recipient) is a specific T cell receptor having a high specificity for organ transplant rejection.
  • the target cells derived from donors and lymphocytes from organ transplant patients are mixed and cultured, and then the lymphocytes are collected and the T cell receptor repertoire of the lymphocytes is identified.
  • the T cell receptor involved can also be identified.
  • the reacted T cells are analyzed by a method (Mixed ⁇ ⁇ ⁇ Lymphocyte Reaction) in which donor lymphocytes that have been irradiated with X-rays so that they do not proliferate in advance and lymphocytes from the transplant recipient (recipient) are mixed.
  • T cell receptors of organ transplant patients (recipients) involved in rejection of organ transplants can be identified.
  • the full-length sequence of the T cell receptor is cloned.
  • a full-length sequence of the T cell receptor using a primer that binds to the 5 ′ end portion of the DNA encoding the variable region of the T cell receptor and a primer that binds to the 3 ′ end portion of the constant region of the T cell receptor. And is incorporated into a cloning vector to produce a full-length gene library encoding a T cell receptor.
  • the genes in this full-length gene library are sequenced again.
  • a T cell receptor having a high appearance frequency is used as a T cell receptor specific to an infectious disease, that is, a T cell receptor specific to an antigen of a pathogen.
  • a clone having the sequence of the gene is selected as a clone of the antigen-specific T cell receptor of the pathogen.
  • organ transplantation of “organ transplant rejection” includes tissue transplantation.
  • variable region of the T cell receptor that recognizes allergens (allergens) expressed in a specific allergic disease is used as the variable region of the T cell receptor. That's fine.
  • a T cell receptor variable region for example, a T cell receptor variable region derived from a patient with a specific allergic disease can be used.
  • Allergic diseases to be treated in the present invention include atopic dermatitis, allergic rhinitis, allergic conjunctivitis, allergic gastroenteritis, food allergy, bronchial asthma, childhood asthma, drug allergy, urticaria, metal allergy, contact hypersensitivity Symptoms and the like.
  • lymphocytes are collected from allergic disease patients, the repertoire of T cell receptors of lymphocytes is identified, and is frequently found in patients with allergic diseases.
  • the variable region of the T cell receptor may be used.
  • the T cell receptor recognizes a specific epitope of the allergic antigen of the patient with the allergic disease.
  • Such a DNA encoding a T cell receptor specific for a specific epitope can be obtained by comprehensively analyzing the T cell receptor of an allergic disease patient. There are as many as 10 18 repertoires of T cell receptors, but now comprehensive analysis is possible. For example, T cells are collected from lymph nodes of patients with allergic diseases, and total mRNA is extracted and purified.
  • cDNA is synthesized from the total mRNA by reverse transcriptase to prepare a cDNA library.
  • the prepared cDNA library can be sequenced by a next-generation sequencer to analyze the T cell receptor repertoire. It can be determined that a T cell receptor having a high frequency of appearance in patients with allergic diseases is a specific T cell receptor having high specificity for the autoimmune disease.
  • the full-length sequence of the T cell receptor is cloned.
  • a full-length sequence of the T cell receptor using a primer that binds to the 5 ′ end portion of the DNA encoding the variable region of the T cell receptor and a primer that binds to the 3 ′ end portion of the constant region of the T cell receptor. And is incorporated into a cloning vector to produce a full-length gene library encoding a T cell receptor.
  • the genes in this full-length gene library are sequenced again.
  • the T cell receptor having a high appearance frequency in the above T cell receptor repertoire analysis is used as a T cell receptor specific for allergic disease, and a clone having the gene sequence of this T cell receptor is used as an allergic disease. Selected as a clone of a specific T cell receptor.
  • the repertoire analysis of the T cell receptor can be performed using, for example, the IMGT / V-Quest tool (http://www.imgt.org/). Moreover, it can carry out by the method as described in international publication WO2016 / 136716.
  • an organ transplant donor antigen-specific T cell receptor after determining the sequence of an autoimmune disease-specific T cell receptor, an organ transplant donor antigen-specific T cell receptor, or an allergic disease-specific T cell receptor by repertoire analysis of the T cell receptor.
  • the full length gene of T cell receptor is cloned, a library is prepared, and T cell receptor involved in recognition of autoimmune disease specific antigen, organ transplant donor antigen or allergen antigen (allergen) is identified.
  • a clone having the sequence is selected.
  • T cell receptor chimeric proteins can be obtained that allow for customized treatment.
  • both the T cell receptor and the immunoglobulin Fc region may be those of the patient, both of which use T cell receptor chimeric proteins derived from their own, so that side effects due to immune reactions are suppressed. Can do.
  • the T cell receptor can be identified by the following specific method. After summing the frequency of each specimen for the TCR frequency in autoimmune disease patients, organ transplant patients, or allergic disease patients, and calculating the average, the top 10 are extracted in order of frequency (summed single analysis). The top 10 frequencies are extracted from the TCR frequencies of healthy human peripheral blood in order of frequency. Focusing on the V region, the TCR extracted from the patient tissue is excluded from those extracted from the peripheral blood of healthy individuals, and is designated as a specific TCR. This method can be used not only to identify the T cell receptor ⁇ chain variable region but also the ⁇ chain variable region.
  • this method comprises repertoire of T cell receptor ⁇ chain variable region of autoimmune disease patient, organ transplant patient or allergic disease patient and T cell receptor ⁇ chain repertoire of lymphocytes in healthy human peripheral blood.
  • T cell receptor ⁇ -chain variable that is identified and has an abundance in lymphocytes of autoimmune disease patients, organ transplant patients or allergic disease patients, for example, twice or more of lymphocytes in peripheral blood of healthy individuals
  • Autoimmune disease patient, organ transplant patient or allergic disease patient-specific T cell receptor ⁇ chain variable region, T-cell receptor ⁇ chain variable region specific to autoimmune disease patient, organ transplant patient or allergic disease patient This is a method for specifying an area.
  • T cell receptor ⁇ chain variable region whose abundance in lymphocytes of patients with sexually impaired diseases is more than twice the abundance in lymphocytes of peripheral blood of healthy individuals, autoimmune disease patients, organ transplant patients or allergic disease patients. This is a method for identifying an autoimmune disease patient, organ transplant patient or allergic disease patient specific T cell receptor ⁇ chain variable region, which is determined as a specific human common T cell receptor ⁇ chain variable region.
  • T cell receptor chimeric protein If a comprehensive analysis of T cell receptors is performed on a plurality of patients at once, a repertoire of many T cell receptors can be obtained. A library of a large number of DNAs encoding variable regions can be prepared. T cell receptor analysis is then performed on patients with autoimmune diseases, patients with organ transplant rejection or allergic diseases who require treatment, and the T cell receptor or sequence of the patient is approximated. When a T cell receptor is present in the library, a T cell receptor chimeric protein may be produced using the DNA.
  • one ⁇ -chain variable region and / or ⁇ -chain variable region of a T cell receptor and an immunoglobulin Fc region are fused, and one fusion protein containing a linker peptide is included if necessary.
  • the dimer shown in FIG. 1 is preferable.
  • the T cell receptor chimeric protein of the present invention can form a dimer by a disulfide bond.
  • One of the two T cell receptor variable regions of the dimer may be an ⁇ chain and the other a ⁇ chain.
  • the T cell receptor chimeric protein of the present invention can be produced by a method for producing a known fusion protein, for example, a chemical synthesis method or a method using a gene recombination technique, but is preferably produced by a method using a gene recombination technique. .
  • An outline of the method using the gene recombination technique is shown in FIG.
  • the T cell receptor chimeric protein of the present invention is produced by gene recombination technology, the ⁇ chain variable region and / or ⁇ chain variable region of the T cell receptor and the Fc region of immunoglobulin, and optionally a linker Peptide-encoding DNA is linked in frame, DNA encoding the fusion protein is introduced into an expression vector to produce a recombinant vector, and the recombinant vector is used in animal cells, insect cells, plant cells, yeast, bacteria, etc. May be introduced and expressed in the host.
  • any vector that can be replicated in a host cell such as a plasmid, phage, or virus can be used.
  • the vector contains a promoter, a replication origin, and a selection marker, and may contain an enhancer, a transcription termination sequence (terminator), a ribosome binding site, a polyadenylation signal, and the like as necessary.
  • the prepared T cell receptor chimeric protein can be isolated and purified by isolation and purification means well known to those skilled in the art as needed.
  • isolation and purification methods include affinity chromatography, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, hydrophobic chromatography, mixed mode chromatography, dialysis, precipitation fractionation, electrophoresis, and the like.
  • the T cell receptor chimeric protein of the present invention can be isolated and purified by appropriately combining these methods.
  • the T cell receptor chimeric protein of the present invention can also be expressed in a cell-free translation system (cell-free system).
  • the T cell receptor chimeric protein of the present invention may be chemically modified as known to those skilled in the art.
  • the chemical modification includes polyethylene glycol (PEG) conversion, glycosylation, acetylation, amidation and the like.
  • the present invention relates to an autoimmune disease antigen-specific T cell receptor or an allergic disease-specific T cell that recognizes an autoimmune disease-specific antigen or an allergic disease-specific antigen from T cells collected from an autoimmune disease patient or an allergic disease patient.
  • T cell reception comprising cloning DNA encoding a receptor, ligating DNA encoding an Fc region of an immunoglobulin, introducing the DNA into an expression vector, introducing the expression vector into a host cell, and allowing expression in the host cell
  • the present invention analyzes T cell receptor repertoire of autoimmune disease patients or allergic disease patients using T cells collected from autoimmune disease patients or allergic disease patients.
  • a T cell receptor having a high appearance frequency is cloned as a specific T cell receptor having high specificity for an autoimmune disease or allergic disease, DNA encoding an Fc region of an immunoglobulin is ligated and introduced into an expression vector,
  • a method for producing a T cell receptor chimeric protein, which is a fusion protein of a variable region of a T cell receptor and an Fc region of an immunoglobulin which comprises introducing an expression vector into the host cell and allowing expression in the host cell. .
  • the present invention clones a DNA encoding a specific T cell receptor that recognizes an antigen specific to rejection of organ transplant and an MHC complex, and ligates the DNA encoding the Fc region of an immunoglobulin into an expression vector.
  • a T cell receptor chimeric protein which is a fusion protein of a T cell receptor variable region and an immunoglobulin Fc region, comprising introducing the expression vector into a host cell and expressing the host in a host cell.
  • the present invention analyzes a repertoire of T cell receptors of organ transplant patients, and a T cell receptor having a high frequency of appearance in organ transplant patients has a high specificity for rejection of the organ transplant.
  • a variable region of T cell receptor and immunization comprising ligating DNA encoding the Fc region of an immunoglobulin and introducing it into an expression vector, introducing the expression vector into a host cell and expressing it in the host cell And a method for producing a T cell receptor chimeric protein that is a fusion protein with the Fc region of globulin.
  • the present invention includes a complex of a T cell receptor chimeric protein that recognizes an autoimmune disease-specific antigen or an allergic disease-specific antigen and MHC of an antigen-presenting cell.
  • the present invention also provides a T cell receptor chimeric protein and an antigen presenting cell by contacting an antigen presenting cell with a T cell receptor chimeric protein that recognizes an autoimmune disease specific antigen or an allergic disease specific antigen in vitro.
  • complex is included.
  • the present invention includes a complex of a T cell receptor chimeric protein that recognizes an antigen specific for organ transplant rejection and an MHC molecule.
  • the present invention also provides a T cell receptor chimeric protein and an antigen presenting cell by contacting the antigen presenting cell with a T cell receptor chimeric protein that recognizes an antigen and MHC complex specific for organ transplant rejection in vitro.
  • complex is included.
  • T cell receptor chimeric protein Utilization of T cell receptor chimeric protein (1) Incorporation of T cell receptor chimeric protein into cells and reduction of expression of MHC complex on cell surface T cell receptor chimeric protein is used on the cell surface of MHC complex. Expression can be down-modulated and reduced. Moreover, the T cell receptor chimeric protein bound to the MHC complex can be introduced into the cell.
  • the present invention includes an agent for reducing the expression of an MHC complex in cells, which contains a T cell receptor chimeric protein as an active ingredient.
  • the T cell receptor chimeric protein of the present invention is capable of expressing an antigen-presenting cell recognized by a pathogenic T cell or an antigen or antigen peptide presenting an antigen peptide on a disease target cell and a complex of an MHC molecule.
  • reducing the expression of a complex of MHC molecules specifically for an antigen or antigen peptide means specifically reducing the expression of only a complex of a specific antigen and MHC molecule.
  • the present invention also includes an MHC molecule complex expression reducing agent containing a T cell receptor chimeric protein as an active ingredient, and a pathogenic T cell function reducing agent containing a T cell receptor chimeric protein as an active ingredient.
  • the MHC molecule complex expression-reducing agent is also referred to as an MHC molecule complex regulator. Adjustment is also called modulation.
  • the pathogenic T cell refers to a T cell that is involved in an immune reaction of an autoimmune disease or an allergic disease and causes a disease, or a T cell that causes an organ transplant rejection in an organ transplant.
  • the T cell receptor chimeric protein of the present invention can compete with and inhibit pathogenic T cells in an antigen peptide-specific manner and reduce T cell function.
  • MHC molecules also include MHC class I molecules, MHC class II molecules, and nonclassical MHC molecules. Autoimmune diseases and allergic diseases often involve MHC class II molecules, and rejection of organ transplants often involves MHC class I molecules.
  • the T cell receptor chimeric protein used as an active ingredient of the MHC complex expression reducing agent is preferably a multimer such as a dimer or a tetramer. Multimers have better clustering efficiency and higher effects of lowering the expression of MHC complexes and lowering of T cell function.
  • T cell receptor binds to MHC complex and transmits signal to T cell to exert its function.
  • the T cell receptor chimeric protein of the present invention binds to the MHC complex on the cell surface and is then taken up into the cell to reduce the cell surface expression of the MHC complex.
  • the T cell receptor chimeric protein bound to the cell surface MHC complex is taken up into the cell after 1 to 10 hours, preferably after 4 to 8 hours, and more preferably after 6 hours.
  • the MHC complex to which the T cell receptor chimeric protein of the present invention binds is not limited to class I molecules, but may be class II molecules. In mice, they are H-2K, D, L, -IA, and IE, and in humans, HLA-A, B, C, DR, DQ, DM, and E. Alternatively, it may be a non-classical MHC molecule. Non-classical MHC molecules include class Ib molecules, including CD1, MR1, H2-M3, HLA-G, etc. (Seikagaku Vol. 81, No. 3, pp.189-199, 2009).
  • the target cells are not limited to autoimmune diseases, organ transplant rejection, and allergic diseases, but target cells include all normal cells.
  • the present invention is a method for reducing the function of T cells by reducing the expression of MHC in antigen-presenting cells and cells that are targets of pathogenic T cells, using T cell receptor chimeric proteins, It is a pharmaceutical composition that can be used as a T cell function lowering agent containing a cell receptor chimeric protein as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition can be used for autoimmune disease treatment, organ transplant rejection treatment or suppression, or allergic disease treatment or allergy suppression. That is, the present invention includes an autoimmune disease therapeutic agent, an organ transplant rejection treatment or inhibitor, or an allergic disease therapeutic agent or allergy suppressor containing a T cell receptor chimeric protein as an active ingredient.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention is not limited, and various dosage forms are used depending on the usage.
  • examples of the oral preparation include tablets, powders, granules, fine granules, capsules and the like.
  • parenterals include injections, inhalation powders, inhalation solutions, eye drops, solutions, lotions, sprays, nasal drops, drops, ointments, suppositories, patches, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared by a pharmacologically known technique according to the dosage form.
  • pharmaceutical additives include pharmaceutical additives such as excipients, disintegrants, binders, lubricants, diluents, buffers, isotonic agents, preservatives, stabilizers, solubilizers, etc. It is done.
  • the pharmaceutical additive includes physiological saline, water for injection and the like.
  • composition of the present invention various administration methods are used depending on the usage.
  • oral administration intravenous administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, intraperitoneal administration, local administration and the like can be mentioned.
  • the dose of the protein of the present invention which is an active ingredient thereof, depends on the patient's age, sex, weight, disease As appropriate, it is determined depending on the degree, dosage form, administration route and the like. For example, when administered to an adult by oral administration, it may be determined in the range of 0.1 ⁇ g / kg to 1000 mg / kg / day. The daily dose may be administered once, twice or three times. In addition, when administered parenterally to an adult, it can be determined within the range of 0.01 ⁇ g / kg / to 1000 mg / kg / day.
  • the daily dose for parenteral administration is preferably 0.1 ⁇ g / kg to 10 ⁇ g / kg / day, 1 ⁇ g / kg to 100 ⁇ g / kg / day, or 10 ⁇ g / kg to 1000 ⁇ g / kg / day, depending on the dosage form.
  • a range may be used.
  • the present invention binds to an MHC complex of a target cell containing a T cell receptor chimeric protein, which is a fusion protein of a variable region of a T cell receptor and an Fc region of an immunoglobulin, as an active ingredient. Includes methods of inducing down modulation to reduce expression.
  • the present invention also includes a method in which a T cell receptor chimeric protein is bound to an MHC complex on a target cell and incorporated into the target cell.
  • the T cell receptor chimeric protein of the present invention is a pathogenic T of autoimmune disease.
  • Target cell MHC molecule and autoantigen complex, donor-derived target cell MHC molecule and donor-specific antigen complex that causes organ transplant rejection, or allergic disease Since it binds to a complex of an MHC molecule of a target cell that is a target of a pathogenic T cell and an allergen (allergen), it can be used for detection of these target cells in a subject.
  • a subject can be determined to be suffering from an autoimmune disease if target cells that are targets of pathogenic T cells of the autoimmune disease are detected.
  • a donor-derived target cell that causes organ transplant rejection When a donor-derived target cell that causes organ transplant rejection is detected, it can be determined that a rejection causing organ transplant rejection has occurred in the subject. Furthermore, when a target cell that is a target of a pathogenic T cell of an allergic disease is detected, it can be determined that the subject is suffering from an allergic disease.
  • the determination that a subject is suffering from an autoimmune disease is referred to as detection of autoimmune disease
  • the determination that a subject has a rejection that causes rejection of organ transplantation is referred to as detection of rejection.
  • the determination that the subject is suffering from an allergic disease is referred to as detection of the allergic disease.
  • the T cell receptor chimeric protein When the T cell receptor chimeric protein is used for detection of a target cell for autoimmune disease, a target cell derived from a donor causing rejection of organ transplant or a target cell for allergic disease, the T cell receptor chimeric protein is used as a fluorescent dye. And labeled with an enzyme such as a quenching dye, fluorescent protein, alkaline phosphatase (ALP) or horseradish peroxidase (HRP). Labeling with a labeling substance can be performed by a known protein labeling method, and labeling may be performed using a biotin-avidin (streptavidin) system.
  • streptavidin biotin-avidin
  • the detection can be performed using a FACS or a flow cytometer, or by immunocytochemistry.
  • a flow cytometer for example, FACSCanto IV II (manufactured by Becton Dickinson) may be used.
  • Measurement by immunocytochemistry may be performed by fixing the collected target cells of autoimmune disease, donor-derived target cells that cause organ transplant rejection or allergic disease target cells on a glass slide. .
  • staining can be determined with a microscope or the naked eye, or an appropriate optical measuring device may be used.
  • the cells When cells are collected from a biological sample such as blood or tissue of a subject, brought into contact with the T cell receptor chimeric protein, and cells that bind to the T cell receptor chimeric protein exist, the cells are considered to cause autoimmune diseases. It is determined that the target cell is expressed, and it is determined that the self-antigen causing the autoimmune disease is expressed. Further, when a donor-derived target cell is detected in a biological sample of the subject, the subject can determine that an organ transplant rejection has occurred. Furthermore, when cells are collected from a biological sample such as blood or tissue of a subject, contacted with a T cell receptor chimeric protein, and cells that bind to the T cell receptor chimeric protein are present, the cells are allergic diseases.
  • Detection using a T cell receptor chimeric protein can provide auxiliary data for autoimmune disease diagnosis, organ transplant rejection diagnosis, or allergic disease diagnosis.
  • the present invention includes a reagent for detecting an autoimmune disease containing a T cell receptor chimeric protein, a reagent for detecting rejection of organ transplantation, or a reagent for detecting an allergic disease, wherein the T cell receptor chimeric protein is preferably labeled. Yes.
  • a patient who is determined to have an autoimmune disease or an allergic disease may be treated using the T cell function-lowering agent of the present invention. It can also be treated in combination with symptomatic therapy such as anti-inflammatory therapy. What is necessary is just to treat with the T cell function decreasing agent of this invention with respect to the patient who judged that rejection of organ transplant has occurred. It can also be treated by administering an immunosuppressant.
  • T cell receptor (TCR) repertoire analysis Equal volume of complete Freund's adjuvant (CFA) is mixed with OVA peptide (257-264: SIINFEKL) to prepare an emulsion and inoculated subcutaneously on C57BL / 6 mice on Day 0 and Day 7 (sensitization) )did.
  • the inoculation (sensitization) schedule is shown in FIG.
  • lymphocytes in regional lymph nodes and spleen were collected. Two mice were used.
  • lymphocytes in the spleen were collected from mouse OT-1 transfected with an OVA peptide (257-264) -specific TCR.
  • RNA was extracted from the above sample by a conventional method to prepare a cDNA library.
  • an adapter was added and PCR was performed to amplify the TCR chain gene, which was used as an analysis sample.
  • an adapter is added to the cDNA library, and then the antisense strand (or sense strand) of the double-stranded adapter is digested with an enzyme.
  • an adapter ligation PCR method using a primer based on the base sequence of the remaining adapter part and a TCR-specific primer, non-specific primer binding is suppressed and gene-specific amplification becomes possible.
  • the gene non-bias amplification method is described in International Publication No. WO2016 / 136716.
  • the following method is used.
  • UNG uracil DNA glycosylase
  • the extension reaction using only the forward primer does not occur, the extension reaction using the reverse primer occurs, and after the complementary strand of the adapter sense strand is formed, the forward primer anneals to the complementary strand and the extension reaction occurs. Since the extension by the primer and the extension by the forward primer occur in one direction in this order, the target gene can be amplified by the PCR method without biasing in one direction.
  • Double-stranded adapter DNA used for non-biased gene amplification having the following characteristics: (a) the sense strand and the antisense strand are annealed, and the base length of the sense strand and the antisense strand is the same or the sense strand is long; (b) the base length of the sense strand is 15-40 bp; (c) The antisense strand contains a plurality of uracils, and the adapter is treated with uracil DNA glycosylase (UNG) to remove uracil, followed by heat treatment to degrade the antisense strand; (d) at least one end of the adapter DNA has a blunt-ended form; (e) binds to the target gene to be amplified at one end; and (f) part or all of the sense strand is the forward primer sequence used for gene amplification.
  • UNG uracil DNA glycosylase
  • TCR T cell receptor
  • SIINFEKL T cell receptor for OVA peptide
  • the TCR of OT-1 mice is V region: TRAV14-1-01 J region: TRAJ33-01 CDR3 (amino acid sequence): AASDNYQLI (SEQ ID NO: 2)
  • the T cell receptor of OVA peptide (SIINFEKL) (SEQ ID NO: 1) sensitized mouse N1 is V region: TRAV14-1-01 J region: TRAJ33-01 CDR3 (amino acid sequence): AASPVDSNYQLI (SEQ ID NO: 3)
  • TCR of sensitized mouse N2 is V region: TRAV14D-1-01 J region: TRAJ33-01 CDR3 (amino acid sequence): AAGSNYQLI (SEQ ID NO: 4). Therefore, an OVA peptide (257-264) sensitized mouse N1 T cell receptor was arbitrarily selected and subjected to the following experiment.
  • T cell receptor chimeric protein 1) Gene cloning of T cell receptor and expression plasmid construction V region: TRAV14-1-01 J region: TRA33-01 CDR3 (amino acid sequence): T cell of AASPVDSNYQLI (SEQ ID NO: 3) The receptor was cloned from a spleen sample cDNA library 15 days after EL4 transplantation using the following PCR primers, from the L region of the TCR ⁇ chain to a part of the C region.
  • FIG. 2 shows an outline of a method for producing a T cell receptor chimeric protein.
  • T cell receptor chimeric protein (TCR-IgFc fusion protein) After introducing the T cell receptor chimeric protein plasmid into HEK293 cells, ultra IgG-FCS (both IgG is contaminated in the subsequent purification process) In order to avoid this, the cells were cultured in a presence medium for 4 days. The culture supernatant was collected and purified using Hi Trap protein G column (GE Healthcare Japan) according to the manufacturer's protocol.
  • This T cell receptor chimeric protein is a chimeric protein in which a part of TCR V region, CDR3, J region and C region are bound to an IgFc portion.
  • OVA peptide (SIINFEKL) -specific TCR-IgFc binding Figure 5
  • Mouse thymoma cells EL4 are tumor cells expressing H-2K b. 50 ⁇ g / ml of OVA peptide (SIINFEKL) was added to EL4 and cultured at 37 ° C. for 1 hour.
  • TRAV14-1-01-CDR3 AASPVDSNYQLI
  • TRAJ33-01 identified from OVA-sensitized mouse N1 and mIgG2a Fc chimeric protein (TRAV14 N1-IgFc) or OT-1 mouse-derived TCR ⁇ chain and mIgG2a Fc chimeric protein (TRAV14 -1-01-CDR3 (AASDNYQLI) -TRAJ33-01-IgFc (TRAV14-Fc) was biotinylated, added at 2.5 ⁇ g / ml, and allowed to stand at 4 ° C. After washing the cells, streptavidin-PE was added. After labeling and allowing to stand at 4 ° C. for 20 minutes, detection was performed with a flow cytometer.
  • the cells were washed with 2 %% FCS / PBS, 100 ⁇ l of BD Fix / Perm buffer was added, and the cells were allowed to stand at 4 ° C. for 30 minutes to fix and permeabilize the cells. Thereafter, labeling with biotinylated anti-H-2K b D b antibody and streptavidin-Dyelight488 was performed. Observation was performed with TCP SP8 (Leica) (FIGS. 6A and B), and image analysis was performed with Image J Plot Profile (FIGS. 6C and D). The addition of OVA N1-IgFc was found to induce intracellular localization of MHC class I.
  • TCR chimeric protein complex bound to MHC molecule (Figs. 7 and 8)
  • Mouse thymoma cells EL4 are collected and 2 ⁇ 10 5 cells are suspended in 5% FCS / RPMI.
  • TCR chimeric protein TCR-IgFc (mTRAV8-Fc) that has been found to bind to MHC class I of EL4 cells
  • 2.5 ⁇ g / g of biotinylated TCR-IgFc biotinylated TCR-IgFc
  • THC-IgFc (mTRAV8-Fc) is bound to the MHC class I at 0h and is present on the cell surface (19.6%), but at 6h, MHC to which mTRAV8-Fc is bound.
  • the complex was thought to have migrated into the cell and was hardly detected on the cell surface (2.16%).
  • expression of MHC class I was extremely high at 0h (Fig. 8B, histogram broken line), but at 6h, MHC expressed on the cell surface due to intracellular movement of MHC class I bound to mTRAV8-Fc.
  • FIG. 8A indicates the percentage (%) of positive cells, and the numerical values in FIG. 8B indicate Mean Fluorescence Intensity (MFI).
  • FIG. 8C is a graph showing MFI of MHC class I expression expressed on the cell surface due to intracellular movement of MHC class I. From these results, it was clarified that the binding of TCR-Fc to MHC class I caused a decrease in the expression of MHC class I expressed on the cell surface.
  • EAE Experimental autoimmune encephalomyelitis
  • Figure 9 50 ⁇ g myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) 35-55 peptide suspended in complete Freund's adjuvant (CFA) containing 5 mg / ml killed Mycobacterium tuberculosis H37Ra in 6-8 week old female C57BL / 6 mice (MOG: MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK) (SEQ ID NO: 7) (ANASPEC) was administered subcutaneously and sensitized by intraperitoneal administration of 400 ng pertussis toxin (BD Difco) on the same day and 2 days later (Stromenes IM et al., Nat protoc ; 1: 1810-9, 2006).
  • CFA complete Freund's adjuvant
  • FIG. 9 shows the experimental method.
  • T cell receptor chimeric protein based on T cell receptor that is elevated in EAE T cell receptor (TCR) ⁇ chain (TRAV9-2D-2 + CDR3 (VYFCALRSYNFG ( SEQ ID NO: 10)) (V ⁇ 3.2J ⁇ 18), ⁇ chain TRBV16-04 + CDR3 (CASSLDCGANP (SEQ ID NO: 11)) + TRBJ1-1-01) (V ⁇ 11DJ ⁇ 1.1) (Battelli E et al., J Exp Med 197: 1073-1081, 2003), a T cell receptor chimeric protein was prepared.
  • TCR EAE T cell receptor
  • TCR ⁇ chain V ⁇ 3.2J ⁇ 18: TRAV9D-2
  • TCR ⁇ chain V ⁇ 11DJ ⁇ 1.1: TRBV16-04
  • pFUSE-mIgG2A-Fc plasmid invivogen
  • Plasmid TP359
  • ⁇ 11DJ ⁇ 1.1-IgFc plasmid TP360
  • HEK293 cells were transfected with plasmid DNA.
  • the medium was changed to DMEM containing Ultralow IgG and cultured for 5 days. After collecting the culture supernatant, the protein was purified by affinity chromatography using Protein G sepharose (GE Healthcare).
  • the T cell receptor chimeric protein fraction was confirmed by electrophoresis using SDS-PAGE.
  • T cell receptor chimeric protein (TRAV9D-2-Fcfusion protein, TRBV16-04-Fc fusion protein) based on T cell receptor was prepared, and the protein was converted to a commercially available biotinylation kit (Dojindo biotin labeling kit; Biotinylated using Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • TCR ⁇ -IgFc chimeric protein TRBV16-04-Fc chimeric protein
  • spleen cells were collected from C57BL / 6 mice. 20 ⁇ g / ml MOG peptide or OVA peptide was added to 3 ⁇ 10 5 spleen cells, cultured at 4 ° C. for 1 hour, and then washed with PBS containing 2% FBS.
  • RAW264.7 cells which are a cultured cell line. 20 ⁇ g / ml MOG peptide or OVA peptide was added to 3 ⁇ 10 5 RAW264.7 cells, cultured at 4 ° C. for 1 hour, and then washed with PBS containing 2% FBS. Then, in order to inhibit Fc receptor, it pre-treated with 2.4G2 antibody as an Fc block, added TRBV16-04-Fc 2.5 ⁇ g / ml, and cultured at 4 ° C. for 1 hour. The cells were washed, labeled with streptavidin-PE, allowed to stand at 4 ° C.
  • TCR ⁇ -IgFc chimeric protein (TRBV16-04-Fc chimeric protein) hardly binds to the OVA peptide, but the TRBV16-04-Fc chimera to the MOG peptide. Increased binding of the protein (TRBV16-04-Fc chimeric protein) was observed. The numerical value indicates the percentage of positive cells (%).
  • FIG. 12A is a schematic diagram of the experimental method
  • B is a photograph taken with a confocal microscope
  • C is a result of quantitative image analysis performed on the confocal microscope photograph.
  • TRBV16-04-Fc chimeric protein migrates MHC class II into the cell, indicating that the T cell receptor chimeric protein regulates the expression of MHC class II.
  • EAE model Day 15 spleen and inguinal lymph nodes were collected, 2 ⁇ 10 5 cells MOG 20 ⁇ g / ml and T cell receptor chimeric protein (TRBV16-04-Fc chimeric protein, TRAV9D-2-Fc chimeric protein) 5ug Groups with and without / ml were prepared and cultured for 48 hours. Furthermore, PMA 50 ng / ml and ionomycin 500 ng / ml were added to the medium and cultured for 4.5 hours.
  • FIG. 13A is a schematic diagram of the experimental method
  • FIG. 13B shows the ratio of IFN- ⁇ positive CD4 + T cells.
  • the TRAV9D-2-Fc chimeric protein (V ⁇ 3.2J ⁇ 18-IgFc chimeric protein) showed no inhibitory effect, but the TRBV16-04-Fc chimeric protein (V ⁇ 11DJ ⁇ 1.1-IgFc chimeric protein) was added. The proportion of IFN- ⁇ positive CD4 + T cells was decreased and an inhibitory effect was observed.
  • TRBV16-04-Fc not only inhibits competition with pathogenic T cells but also regulates MHC expression to induce activation of pathogenic T cells and suppression of cell proliferation.
  • TCR T cell receptor
  • MLR mixed lymphocyte culture
  • FIGS. 16 and 17 Lymphocyte mixed culture
  • Spleens were removed from 8-week-old female Balb / c mice (H-2K d D d ), separated into mononuclear cells, and then hemolyzed. After suspending this in 5% FCS / RPMI, X-ray irradiation (20 Gy) was performed to obtain a stimulator cell in this experiment.
  • a cell suspension was similarly prepared from the spleen of an 8-week-old female C57BL / 6 mouse (H-2K b D b ) and used as a Responder cell.
  • the cells were cultured at 37 ° C. for 7 days in RPMI1640 complete medium containing 10% FCS. After culturing, the cells were collected and T cell repertoire analysis was performed by the above method. For control, cells prepared from the spleen of C57BL / 6 mice (H-2K b D b ) were used. T cell receptor repertoire analysis was performed by the method described above.
  • FIG. 16 shows the results of T cell receptor repertoire analysis and ⁇ chain in mixed lymphocyte culture
  • FIG. 17 shows the results of ⁇ chain.
  • Arbitrary TCR was cloned in it.
  • the cloned TCR is as follows.
  • TCR ⁇ chain TRAV 7D-4-1 CDR3 AARLTGNTGKLI TRAJ 37-01 (SEQ ID NO: 8: TRAV7D-4-1)
  • TCR ⁇ chain TRBV31-01 CDR3 AWRDWGNYAEQF TRBJ 2-1-01
  • SEQ ID NO: 9: TRBV31- 01 Using these cloned TCRs, a T cell receptor chimeric protein was prepared by the method described above.
  • Responder cells are prepared to 1 ⁇ 10 6 cells / 50 ⁇ l (in 10% FCS / RPMI) and 96-well U-bottom so that the R: S ratio is 1: 1, 5: 1, 10: 1. Plates were seeded with S adjusted to 50 ⁇ l.
  • TCR ⁇ (TRAV 7D-4-1 CDR3 AARLTGNTGKLI TRAJ 37-01) and ⁇ chain (TRBV31-01 CDR3 AWRDWGNYAEQF TRBJ 2-1-01) identified by in vitro MLR were respectively used in pFuse mIgG2a vector (invivogen: TRAV7D).
  • -4-1-Fc, TRBV31-01-Fc) were prepared.
  • the proportion of the H-2K d -CD8a + CD62Llow cell population was decreased in both the group to which the T cell receptor ⁇ chain chimeric protein and the T cell receptor ⁇ chain chimeric protein were added. .
  • the numerical value in the figure indicates the percentage (%) of cells in the fraction.
  • This H-2K d -CD8a + CD62Llow cell is an activated cell, and this reduction in proportion means that both TRAV7D-4-1-Fc and TRBV31-01-Fc inhibit MLR activation. doing.
  • T cell receptor ⁇ chain chimeric protein and T cell receptor ⁇ chain chimeric protein not only bind to donor MHC and inhibit competitive inhibition with pathogenic T cells, but also regulate expression of donor MHC. It was thought to inhibit the activation and proliferation of sex T cells.
  • mice were sensitized with palladium and restimulated in vitro as shown in FIG. On Day 0 and Day 7, sensitization was performed by subcutaneously administering 125 ⁇ l each of a mixed solution of 10 mM PdCl 2 and 10 ⁇ g / ml LPS to both inguinal parts. Seven days after the second sensitization, spleens were harvested and 1 ⁇ 10 6 cells were restimulated with 0,100 ⁇ M PdCl 2 for 16 hours.
  • chimeric protein of TCR ⁇ chain (TRAV8-1-01-CDR3 (ATLYSGGSNAKLT) -TRAJ42-01) identified in palladium allergy and mIgG2aFc region. Then, IFN- ⁇ was measured by flow cytometry by intracellular staining.
  • Example 2 EAE treatment experiment (1) Construction of soluble TCR and protein purification Already reported MOG-reactive TCR (: 2D2 TCR) (TRAV9-2D-2 + CDR3 (VYFCALRSYNFG (SEQ ID NO: 10)) + TRAJ23, TRBV16- 04 + CDR3 (CASSLDCGANP (SEQ ID NO: 11)) + TRBJ1-1-01) was recombined into human IgG Hole / pcDNA3.4 and human IgG Knob / pcDNA3.4 by HiFi Assembly, respectively.
  • MOG-reactive TCR (: 2D2 TCR) (TRAV9-2D-2 + CDR3 (VYFCALRSYNFG (SEQ ID NO: 10)) + TRAJ23, TRBV16- 04 + CDR3 (CASSLDCGANP (SEQ ID NO: 11)) + TRBJ1-1-01) was recombined into human IgG Hole / pcDNA3.4 and human IgG Knob
  • EAE experimental autoimmune encephalomyelitis
  • model creation and EAE treatment experiment 6-8 weeks old female C57BL / 6J contains 5 mg / ml of dead Mycobacterium tuberculosis H37Ra 200 ⁇ g myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) 35-55 peptide (MOG: MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK) (SEQ ID NO: 7)
  • ANASPEC suspended in complete Freund's adjuvant suspended in complete Freund's adjuvant (CFA) was administered subcutaneously 10 days before and 0 days, and MOG Immunization was performed by intraperitoneal administration of 200 ng pertussis toxin (BD Difco) on the same day and 2 days after the subcutaneous administration of the peptide.
  • CFA complete Freund's adjuvant
  • the Fc fusion protein was administered subcutaneously 4 hours before the MOG peptide administration.
  • PBS was administered as a control (cont).
  • Onset was evaluated by a clinical score based on the degree of paralysis (0: asymptomatic, 1: loss of tension in the tail, 2: paralysis of the lower limbs, 3: paralysis of the lower limbs, 4: inability to walk alone, 5: lethal).
  • FIG. 22 shows an outline of the experimental method. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 23, when Fc fusion protein (TCR-Fc 2D2 TCR ⁇ -Fc) was administered, the progression of symptoms could be suppressed. Furthermore, FIG. 24 shows the results of the ratio of mice that reached a clinical score of 3 or higher up to the 17th day.
  • mice that achieved a clinical score of 3 or higher by day 17 were 66.7% (6/9) in the Fc protein non-administered group (w / o Fc-protein), whereas TCR-Fc (2D2 TCR ⁇ -Fc)
  • TCR-Fc (2D2 TCR ⁇ -Fc) The 10 ⁇ g ⁇ 2 administration group was 33.3% (1/3), and the TCR-Fc (2D2 TCR ⁇ -Fc) 25 ⁇ g ⁇ 2 administration group was 0% (0/3). From this result, it was clarified that the score of 3 or more was significantly decreased by the administration of TCR-Fc. That is, administration of 2D2 TCR ⁇ -Fc suppressed the seriousness of EAE symptoms. From the above, 2D2 TCR ⁇ -Fc was shown not only to suppress the progression of EAE symptoms but also to suppress the seriousness of EAE.
  • TCR-Fc and protein purification TCR ⁇ (TRAV7-2-02 + CDR3 (AATSSGSWQLI (SEQ ID NO: 12)), which was recognized by induction of palladium allergy in C57BL / 6 mice ) + TRAJ22-01) was recombined into the pFuse mIgG2a vector (invivogen), and a plasmid of a fusion protein with mIgG2a was constructed (mTRAV7-Fc / pFuse). This plasmid was introduced into Expi293F cells (Thermo Fisher Sciences) by lipofection. Thereafter, the cells were cultured for 7 days at 37 ° C., 8% CO 2 , 125 rpm, and the Fc fusion protein was purified from the culture supernatant using a Protein G Sepharose (GE Healthcare) column.
  • AATSSGSWQLI SEQ ID NO: 12
  • Soluble TCR is 10 mM each for mTRAV7-Fc and mIgGFc (cont) 1 hour before sensitization and challenge, and 1 mg / Kg of olopadazine (OLP), one of the antihistamines, as a positive control. It was administered intraperitoneally.
  • FIG. 25 shows an outline of the experimental method. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 26, when the TCR-Fc fusion protein (TRAV7-Fc) was administered, the thickening of the footpad thickness was suppressed to the same extent as the positive control. Therefore, it was shown that TCR-Fc is as effective as an antihistamine which is an existing drug in metal allergy.
  • the T cell receptor chimeric protein of the present invention can be used for the treatment and detection of autoimmune diseases, organ transplant rejection and allergic diseases.

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Abstract

抗原特異的MHC発現調節法を用いた自己免疫疾患、臓器移植の拒絶反応、アレルギー性疾患の治療及び診断方法の提供。　自己免疫疾患の特異的抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域、臓器移植の拒絶反応の原因となる特異的な抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域又はアレルギー性疾患の特異的抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質を有効成分として含む、MHC分子の発現を調節することにより前記自己免疫疾患、臓器移植の拒絶反応又はアレルギー性疾患を抑制させるための、Ｔ細胞機能低下剤。

Description

抗原特異的ＭＨＣ発現調節法
　本発明は、自己免疫疾患、臓器移植の拒絶反応、又はアレルギー性疾患の治療又は診断に関する。
　自己免疫疾患は、免疫細胞の異常応答による疾患であり、MHC型と強い相関があることが報告されている。臓器移植においては、MHC型の一部を一致させることでその拒絶反応を防ぐという試みもなされている。このように、自己免疫疾患や臓器移植においては、MHCは重要な分子である。
　MHC型は白血球の血液型として知られており、個人の目印となっている。MHCには、大別してクラスIとクラスIIがあり、MHC上に抗原ペプチドを提示して、MHC複合体を形成する。
　免疫応答は、Ｔ細胞上にあるＴ細胞受容体（TCR）が、MHC複合体と結合して抗原ペプチド特異的に活性化することによって起こる。Ｔ細胞の作用にはＴ細胞受容体が重要な役割を果たしており、近年は、ある疾患に罹患している患者のＴ細胞受容体のＴ細胞受容体レパートリーを分析し、疾患特異的なＴ細胞受容体を同定する方法も開発されている。また、Ｔ細胞受容体の断片を有するタンパク質を利用する方法も報告されている。
　Ｔ細胞の反応を調節するためには、Ｔ細胞自体の反応調節の方法も種々検討されているものの、Ｔ細胞の免疫応答がＴ細胞受容体とMHC複合体との結合からおこることを考えると、MHCの発現を特異的に調節することができればよい。従来技術は、MHC特異的抗体による発現調節が行われてきた。例えば、マウスMHCクラス I分子には、H-2K, D, Lがあり、それぞれの分子に対する抗体が作成されている。抗MHC抗体は、MHC分子の発現低下（ダウンモジュレーション）を誘導することは知られている（特許文献１）。しかし、抗原ペプチド特異性はないため副作用が大きいと推測される。
特開2017-128585号公報
　本発明は、Ｔ細胞受容体（TCR)の認識機構を用いて、抗原ペプチド特異的にMHC（Major histocompatibility complex; 主要組織適合遺伝子複合体）の細胞表面の発現を調節することによる、自己免疫疾患、臓器移植の拒絶又はアレルギー性疾患の治療又は診断方法の提供を目的とする。
　MHC分子は抗原ペプチドを提示できるが、MHCに対する抗体は、MHCのみに結合して、抗原ペプチドとMHC分子を認識して結合するものはほとんどない。例外としてOVAペプチドとMHC複合体を認識する抗体があるものの、抗原ペプチドに応じたMHC複合体を認識する抗体の作製は、通常6か月程度の作製期間を要し簡単にはできない状況にある。したがって、抗原ペプチドに応じた細胞表面にあるMHCの発現調節を行う分子の作製が困難なことが問題であった。
　そこで、Ｔ細胞受容体は抗原ペプチドとMHC複合体を認識することを利用して、Ｔ細胞受容体を抗体のように利用できないかと考えた。また、抗原ペプチドとMHC複合体をＴ細胞受容体キメラタンパク質によってダウンモジュレーションして細胞表面の発現を低下することができれば、多くの疾患に対する薬のリード化合物になりうると考えた。
　従来、細胞表面分子の発現調節には、モノクローナル抗体が用いられてきた。例えば、マウスMHCクラスI分子には、H-2K, D, Lがあり、それぞれの分子に対する抗体が作製されている。MHC分子は抗原ペプチドを提示できるが、MHCに対する抗体は、抗原ペプチドとMHC分子を認識して結合するものはほとんどない。また、抗原ペプチドに応じたMHC複合体を認識する抗体の作製は困難な状況にある。したがって、抗原ペプチドに応じたMHCの発現調節を行う分子の作製は困難であった。
　今回、T細胞受容体（TCR）解析技術により、抗原ペプチド特異的Ｔ細胞受容体をクローニングできるようになり（国際公開第WO2016/136716号）、その情報をもとにしたＴ細胞受容体キメラタンパク質を作製できるようになった。
　このＴ細胞受容体キメラタンパク質は、抗原ペプチド特異的で、MHCとペプチド複合体に結合し、MHCのダウンモジュレーションを誘導し、発現を低下させる。
　自己免疫疾患は、MHC型と疾患の相関が高く、ある特定のMHC型を発現していることが多い。そのため、抗原ペプチドとMHCの複合体のダウンモジュレーションを誘導し、発現を低下させるＴ細胞受容体キメラタンパク質は、自己免疫疾患や臓器移植の拒絶反応に対する創薬として利用可能である。
　このようにして、本発明者は、TCRキメラタンパク質を用いて、抗原ペプチド特異的なMHC複合体の細胞表面発現調節法を見出した。これにより、Ｔ細胞の反応を抑えるように変えることができ、自己免疫疾患の発症の抑制、臓器移植の拒絶反応の抑制、アレルギー性疾患の抑制につながると期待されている。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]　自己免疫疾患の特異的抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質を有効成分として含む、病原性Ｔ細胞が認識する抗原提示細胞又は標的細胞上の特異的抗原とMHC分子の複合体と結合して、抗原特異的にMHC分子複合体の発現を低下させる、MHC分子複合体発現低下剤。
[２]　臓器移植の拒絶に特異的なドナー由来の抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質を有効成分として含む、病原性Ｔ細胞が認識する抗原提示細胞又は標的細胞上のドナー由来の特異的抗原とMHC分子の複合体と結合して、抗原特異的にMHC分子複合体の発現を低下させる、MHC分子複合体発現低下剤。
[３]　アレルギー性疾患の特異的抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質を有効成分として含む、病原性Ｔ細胞が認識する抗原提示細胞又は標的細胞上の特異的抗原とMHC分子の複合体と結合して、抗原特異的にMHC分子複合体の発現を低下させるMHC分子複合体発現低下剤。
[４]　Ｔ細胞受容体キメラタンパク質がＴ細胞受容体の可変領域とCDR3の全てとJ領域を含む、[１]～[３]のいずれかのMHC分子複合体発現低下剤。
[５]　Ｔ細胞受容体の可変領域が、Ｔ細胞受容体のα鎖及び／又はβ鎖である、[１]～[４]のいずれかのMHC分子複合体発現低下剤。
[６]　免疫グロブリンのFc領域がIgGのFc領域である、[１]～[５]のいずれかのMHC分子複合体発現低下剤。
[７]　２つのＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質からなる２量体であり、前記２つのタンパク質がジスルフィド結合により結合している、[１]～[６]のいずれかのMHC分子複合体発現低下剤。
[８]　Ｔ細胞受容体が抗原とMHC分子の複合体と結合する、[１]～[７]のいずれかのMHC分子複合体発現低下剤。
[９]　MHC分子が、古典的MHC分子又は非古典的MHC分子である、[１]～[８]のいずれかのMHC分子複合体発現低下剤。
[１０]　自己免疫疾患の特異的抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質を有効成分として含む、病原性Ｔ細胞が認識する抗原提示細胞又は標的細胞上の特異的抗原とMHC分子の複合体と結合して、MHC分子複合体の発現を低下させ、病原性Ｔ細胞に認識されないようにするための、自己免疫疾患を引き起こすＴ細胞機能低下剤。
[１１]　臓器移植の拒絶に特異的なドナー由来の抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質を有効成分として含む、病原性Ｔ細胞が認識する抗原提示細胞又は標的細胞上のドナー由来の特異的抗原とMHC分子の複合体と結合して、MHC分子複合体の発現を低下させ、病原性Ｔ細胞に認識されないようにするための、臓器移植の拒絶を引き起こすＴ細胞の機能を低下させるための、Ｔ細胞機能低下剤。
[１２]　アレルギー性疾患の特異的抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質を有効成分として含む、病原性Ｔ細胞が認識する抗原提示細胞又は標的細胞上の特異的抗原とMHC分子の複合体と結合して、MHC分子複合体の発現を低下させ、病原性Ｔ細胞に認識されないようにするための、アレルギー性疾患を引き起こすＴ細胞機能低下剤。
[１３]　Ｔ細胞受容体キメラタンパク質がＴ細胞受容体の可変領域とCDR3の全てとJ領域を含む、[１０]～[１２]のいずれかのＴ細胞機能低下剤。
[１４]　Ｔ細胞受容体の可変領域が、Ｔ細胞受容体のα鎖及び／又はβ鎖である、[１０]～[１３]のいずれかのＴ細胞機能低下剤。
[１５]　免疫グロブリンのFc領域がIgGのFc領域である、[１０]～[１４]のいずれかのＴ細胞機能低下剤。
[１６]　２つのＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質からなる２量体であり、前記２つのタンパク質がジスルフィド結合により結合している、[１０]～[１５]のいずれかのＴ細胞機能低下剤。
[１７]　Ｔ細胞受容体が抗原とMHC分子の複合体と結合する、[１０]～[１６]のいずれかのＴ細胞機能低下剤。
[１８]　MHC分子が、古典的MHC分子又は非古典的MHC分子である、[１０]～[１７]のいずれかのＴ細胞機能低下剤。
[１９]　[１]及び[４]～[９]のいずれかのMHC分子複合体発現低下剤を含む、自己免疫疾患治療剤。
[２０]　[２]及び[４]～[９]のいずれかのMHC分子複合体発現低下剤を含む、臓器移植拒絶反応抑制剤。
[２１]　[３]～[９]のいずれかのMHC分子複合体発現低下剤を含む、アレルギー疾患治療剤。
[２２]　[１０]及び[１３]～[１８]のいずれかのＴ細胞機能低下剤を含む、自己免疫疾患治療剤。
[２３]　[１１]及び[１３]～[１８]のいずれかのＴ細胞機能低下剤を含む、臓器移植拒絶反応抑制剤。
[２４]　[１２]～[１８]のいずれかのＴ細胞機能低下剤を含む、アレルギー疾患治療剤。
[２５]　自己免疫疾患の特異的抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質であって標識されたＴ細胞受容体キメラタンパク質を被験体の生体試料から採取した細胞と接触させ、前記Ｔ細胞受容体キメラタンパク質が被験体の生体試料から採取した細胞と結合した場合に、被験体中に標的細胞が存在し、被験体は自己免疫疾患に罹患していると判定する、自己免疫疾患検出方法。
[２６]　MHC分子が、古典的MHC分子又は非古典的MHC分子である、[２５]の自己免疫疾患検出方法。
[２７]　自己免疫疾患の特異的抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質であって標識されたＴ細胞受容体キメラタンパク質を含む自己免疫疾患検出用試薬。
[２８]　MHC分子が、古典的MHC分子又は非古典的MHC分子である、[２７]の自己免疫疾患検出用試薬。
[２９]　臓器移植の拒絶に特異的なドナー由来の抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質であって標識されたＴ細胞受容体キメラタンパク質を被験体の生体試料から採取した細胞と接触させ、前記Ｔ細胞受容体キメラタンパク質が被験体の生体試料から採取した細胞と結合した場合に、被験体中に標的細胞が存在し、被験体において拒絶反応が生じていると判定する、臓器移植の拒絶の原因となる拒絶反応検出方法。
[３０]　MHC分子が、古典的MHC分子又は非古典的MHC分子である、[２９]の拒絶反応検出方法。
[３１]　臓器移植の拒絶に特異的なドナー由来の抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質であって標識されたＴ細胞受容体キメラタンパク質を含む拒絶反応検出用試薬。
[３２]　MHC分子が、古典的MHC分子又は非古典的MHC分子である、[３１]の拒絶反応検出用試薬。
[３３]　アレルギー性疾患の特異的抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質であって標識されたＴ細胞受容体キメラタンパク質を被験体の生体試料から採取した細胞と接触させ、前記Ｔ細胞受容体キメラタンパク質が被験体の生体試料から採取した細胞と結合した場合に、被験体中に標的細胞が存在し、被験体はアレルギー性疾患に罹患していると判定する、アレルギー性疾患検出方法。
[３４]　MHC分子が、古典的MHC分子又は非古典的MHC分子である、[３３]のアレルギー性疾患検出方法。
[３５]　アレルギー性疾患の特異的抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質であって標識されたＴ細胞受容体キメラタンパク質を含むアレルギー性疾患検出用試薬。
[３６]　MHC分子が、古典的MHC分子又は非古典的MHC分子である、[３５]のアレルギー性疾患検出用試薬。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2018-015908号の開示内容を包含する。
　Ｔ細胞受容体(TCR)キメラタンパク質は、抗原ペプチドとの複合体であるMHCクラスI分子又はクラスII分子に結合し、抗原提示細胞又は疾患の標的細胞の抗原を提示しているMHC分子のダウンモジュレーションを誘導し、発現を低下させる。ここで、MHC分子のダウンモジュレーションとは、MHC分子の発現を抑制的に調節して、発現を低下させることをいう。この結果、病原性Ｔ細胞の抗原提示細胞に対する反応性が変化し、Ｔ細胞の機能が低下する。Ｔ細胞の機能を低下させることにより、自己免疫疾患、臓器移植の拒絶反応又はアレルギー性疾患を抑制し、治療することができる。
　さらに、Ｔ細胞受容体キメラタンパク質は、MHC分子を発現している疾患標的細胞に結合することができるため、疾患標的細胞の検出に用いることもできる。
　これまで、Ｔ細胞受容体キメラタンパク質が、抗原ペプチドとMHC複合体のダウンモジュレーションを誘導するという報告はない。Ｔ細胞受容体キメラタンパク質は、遺伝子情報が得られて2週間程度で容易に作製できるものであり、従来のモノクローナル抗体の作製時間（抗原を免疫してからスクリーニング完了まで約6か月）に比べ、時間が大幅に短縮される。また、モノクローナル抗体の場合、エピトープの確認（認識部位の確認）が必要であるが、Ｔ細胞受容体は、MHCのリガンドであるため、認識部位の確認は、抗原ペプチドを変更するのみで、容易に確認できる。
　さらに、同じMHCで異なった抗原ペプチドに対しても、Ｔ細胞受容体キメラタンパク質は容易に作製できる。
Ｔ細胞受容体キメラタンパク質（TCR-IgFc）の構造を示す図である。 Ｔ細胞受容体キメラタンパク質（TCR-IgFc）の遺伝子組換え技術による製造方法の概要を示す図である。 OVAに対するTCRレパートリー解析の実験方法を示す図である。 OVAペプチドを感作したマウスと、OT-1マウスのTCRを比較した図である。 OVA257ペプチドを認識するTCR-IgFcを示す図である。 MHCクラスI分子に結合したＴ細胞受容体キメラタンパク質の細胞内在化を示す図である。 MHC分子に結合したTCR-IgFc複合体の挙動を調べる実験方法を示す図である。 MHC分子に結合したTCR-IgFc複合体が細胞内に移動して、細胞表面のMHCを調節していることを示す図である。 実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)モデルマウスの作製方法を示す図である。 実験的自己免疫性脳脊髄炎において、TCR-IgFcの抗原ペプチド特異的結合を示す図である。 in vitro培養細胞において、TCR-IgFcが抗原ペプチド特異的結合を示す図である。 MHCクラスII分子に結合したTCR-IgFcの細胞内在化を示す図である。 実験的自己免疫性脳脊髄炎において、TCR-IgFcの抑制効果を示す図である。 実験的自己免疫性脳脊髄炎において、病原性Ｔ細胞に対するTCR-IgFcの抑制効果を示す図である。 実験的自己免疫性脳脊髄炎において、病原性Ｔ細胞に対するTCR-IgFcの抑制効果を示す図である。 マウスリンパ球混合培養試験において、反応するＴ細胞受容体α鎖のレパートリー解析した図である。 マウスリンパ球混合培養試験において、反応するＴ細胞受容体β鎖のレパートリー解析した図である。 マウスリンパ球混合培養試験において、TCR-IgFcの抑制効果を示す図である。 マウスリンパ球混合培養試験において、TCR-IgFcの抑制効果を示す図である。 金属アレルギーにおけるTCR-IgFcによる活性化Ｔ細胞の阻害実験の方法を示す図である。 金属アレルギーにおけるTCR-IgFcによる活性化Ｔ細胞の阻害効果を示す図である。 実験的自己免疫性脳脊髄炎に対するTCR-IgFcの治療実験の方法の概要を示すである。 実験的自己免疫性脳脊髄炎に対するTCR-IgFcによる治療効果を示す図である。 実験的自己免疫性脳脊髄炎に対するTCR-IgFcによる治療において、17日目までの臨床スコア３以上に到達したマウスの比率を示す図である。 金属アレルギーに対するTCR-IgFcの治療実験の方法の概要を示すである。 金属アレルギーに対するTCR-IgFcによる治療効果を示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
１．Ｔ細胞受容体キメラタンパク質
（１）Ｔ細胞受容体キメラタンパク質の構造
　本発明の方法においては、Ｔ細胞受容体(TCR：T cell receptor)の可変領域と免疫グロブリンのFc領域とを融合させたＴ細胞受容体キメラタンパク質を用いる。該Ｔ細胞受容体キメラタンパク質をＴ細胞受容体-イムノグロブリンキメラタンパク質やTCR-IgFc fusion proteinとも呼ぶ。
　本発明のＴ細胞受容体キメラタンパク質は、Ｔ細胞受容体の可変領域（TCR V領域）とCDR3の全てとJ領域を、IgFc部分と結合させたキメラタンパク質である。また、Ｔ細胞受容体の可変領域（TCR V領域）とCDR3の全てとJ領域とＣ領域の一部を、IgFc部分と結合させたキメラタンパク質であってもよい。本発明のＴ細胞受容体キメラタンパク質をTCR-IgFcと表すことができる。
　Ｔ細胞受容体の可変領域としては、自己免疫疾患や臓器移植の拒絶反応やアレルギー性疾患に特異的な抗原を認識するＴ細胞受容体の可変領域を用いる。本発明のＴ細胞受容体の可変領域は、自己免疫疾患の特異的抗原とMHC分子の複合体、臓器移植の拒絶に特異的なドナー由来の抗原(抗原ペプチド）とMHC分子の複合体又はアレルギー性疾患の特異的抗原とMHC分子の複合体を認識する。その結果、本発明のＴ細胞受容体キメラタンパク質は、自己免疫疾患の病原性Ｔ細胞が認識する抗原提示細胞又は標的細胞上の特異的抗原とMHC分子の複合体、臓器移植拒絶反応の病原性Ｔ細胞が認識する抗原提示細胞又は標的細胞上のドナー由来の特異的抗原とMHC分子の複合体、又はアレルギー性疾患の病原性Ｔ細胞が認識する抗原提示細胞又は標的細胞上の特異的抗原とMHC分子の複合体と結合し、病原性Ｔ細胞との競合阻害のみならず抗原特異的にMHC分子複合体の発現を低下させる。その結果、本発明のＴ細胞受容体キメラタンパク質は、Ｔ細胞がMHC分子が発現している細胞を認識できないようにすることにより、Ｔ細胞の機能を低下させることができる。本発明において、MHCは、古典的MHC（クラスIa、クラスII）に限ったものではなく、非古典的MHC、いわゆるクラスIb分子も含む。クラスIb分子は、例えば、T細胞との結合が認められるCD1、MR1、H2-M3、HLA-Gなども含む（生化学　第81巻　第3号、pp.189-199, 2009)。MHC分子複合体の発現の低下は、MHC遺伝子の発現低下とMHC分子の細胞表面における発現低下を含み、好ましくはMHC分子の細胞表面における発現低下である。
　Ｔ細胞受容体はα鎖とβ鎖、又はγ鎖とδ鎖から構成される２量体であり、それぞれの鎖が可変領域と定常領域から構成される。可変領域は複数の遺伝子断片Ｖ(variable)領域（Ｖ遺伝子断片）、Ｄ(diversity)領域及びＪ（joining)領域（β鎖、δ鎖）、あるいはＶ領域及びＪ領域によりコードされ（α鎖、γ鎖）、遺伝子再構成を通して多数のレパートリーを有するようになる。さらに、可変領域にはCDR（complementarity determining region：相補性決定領域）と呼ばれる超可変領域が３つ存在し、これらの領域の体細胞突然変異によりさらに多数のレパートリーを有するようになる。特にCDR3領域は抗原特異性に関与しており、配列の変異が生じやすく配列の多様性が大きい。
　本発明のＴ細胞受容体キメラタンパク質が有するＴ細胞受容体の可変領域は、α鎖又はβ鎖であり、α鎖とβ鎖の両方を融合した１本鎖であってもよい。また、２量体を構成するＴ細胞受容体キメラタンパク質において、一方の鎖が免疫グロブリンのFc領域とＴ細胞受容体のα鎖の融合タンパク質であって、他方の鎖が免疫グロブリンのFc領域とＴ細胞受容体のβ鎖の融合タンパク質であってもよい。あるいは、Ｔ細胞受容体キメラタンパク質が有するＴ細胞受容体の可変領域は、γ鎖又はδ鎖であり、γ鎖とδ鎖の両方を融合した１本鎖であってもよい。また、２量体を構成するＴ細胞キメラタンパク質において、一方の鎖が免疫グロブリンのFc領域とＴ細胞受容体のγ鎖の融合タンパク質であり、他方の鎖が免疫グロブリンのFc領域とＴ細胞受容体のδ鎖の融合タンパク質であってもよい。Ｔ細胞受容体の可変領域のα鎖、β鎖、γ鎖及びδ鎖は約200～400個のアミノ酸からなる。本発明で用いるＴ細胞受容体の可変領域のα鎖、β鎖、γ鎖及びδ鎖は、例えば、天然に存在するＴ細胞受容体の可変領域のα鎖、β鎖、γ鎖及びδ鎖、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、90％以上、95％以上、97％以上、又は99％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するＴ細胞受容体可変領域を含む。
　本発明のＴ細胞受容体キメラタンパク質は、好ましくは２量体又は４量体等の多量体であり、２量体の可変領域として、α鎖-α鎖の組合せ、α鎖-β鎖の組合せ、β鎖-β鎖の組合せが挙げられる。４量体の可変領域として、α鎖-α鎖とβ鎖-β鎖の組合せが挙げられる。また、γ鎖-γ鎖の組合せ、γ鎖-δ鎖の組合せ、δ鎖‐δ鎖の組合せが挙げられる。４量体の可変領域として、γ鎖-γ鎖とδ鎖‐δ鎖の組合せが挙げられる。
　Ｔ細胞受容体の可変領域はMHCに結合するものであれば、いずれのＴ細胞由来のものでもよく、ヘルパーＴ細胞(CD4陽性T細胞）、キラーＴ細胞(CD8陽性T細胞）由来のものでもよく、制御性Ｔ細胞（regulatory T cell、Treg)由来のものでもよく、Th17細胞、NKT細胞、エフェクターＴ細胞、γδT細胞由来のものでもよい。これらのいずれのＴ細胞由来のＴ細胞受容体もMHC分子を認識し結合するので、本発明のＴ細胞受容体キメラタンパク質の構成分子として用いることができる。
　本発明において、「免疫グロブリンのFc領域」とは、免疫グロブリンのFcフラグメント、すなわち、天然の免疫グロブリンのCH2及びCH3定常ドメインをいう。免疫グロブリンのFc領域はヒト由来のものを用いることが好ましいが、マウス免疫グロブリン等非ヒト動物の免疫グロブリンを用いることもできる。免疫グロブリンは好ましくはIgGである。ヒトIgGのサブクラスにはIgG1、IgG2、IgG3及びIgG4があり、マウス免疫グロブリンにはIgG1、IgG2a、IgG2b及びIgG3がある。ヒトIgGでは、IgG1及びIgG3のFc領域がFc受容体に強く結合するため、IgG1及びIgG3が好ましく、その中でもIgG1が好ましい。マウスIgGでは、IgG2aのFc領域はNK細胞のFc受容体（FcR)に結合しやすいため、IgG2aが好ましい。前記免疫グロブリンのFc領域には、天然の突然変異体、人工変異体、及びトランケートされた形態のいずれも含まれる。例えば、天然に存在する免疫グロブリンのFc領域と、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、90％以上、95％以上、97％以上、又は99％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するFc領域を含む。
　Ｔ細胞受容体キメラタンパク質において、Ｔ細胞受容体の可変領域の間と免疫グロブリンのFc領域の間、あるいはＴ細胞受容体の可変領域のα鎖とβ鎖の両方を有する場合のα鎖とβ鎖の間には、リンカーが含まれていてもよく、２つのタンパク質がリンカーを介してタンデムに結合していればよい。リンカーは、特定の長さのアミノ酸配列からなるペプチドリンカーであり、アミノ酸数は限定されないが、１～３０個、好ましくは３～２５個、さらに好ましくは５～２０個である。アミノ酸の種類は限定されず、側鎖が小さく反応性が大きくないアミノ酸や連結したときにαへリックス構造をとるアミノ酸が好ましい。このようなアミノ酸として、グリシン（G）、セリン（S）、アラニン（A）、トレオニン（T）、アスパラギン酸（D）、リシン（K）、グルタミン酸（E）、ロイシン（L）、メチオニン（M）等が挙げられる。
（２）Ｔ細胞受容体（TCR）の特定方法
　自己免疫疾患におけるＴ細胞受容体を特定する場合、Ｔ細胞受容体の可変領域としては、特定の自己免疫疾患に発現する、自己抗原を認識するＴ細胞受容体の可変領域を用いればよい。このようなＴ細胞受容体の可変領域としては、例えば、特定の自己免疫疾患患者由来のＴ細胞受容体の可変領域を用いることができる。本発明で治療対象となる自己免疫疾患として、自己免疫性糖尿病、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、セリアック病、クローン病及び潰瘍性結腸のような炎症性腸疾患、乾癬、I型真性糖尿病、全身性エリテマトーデス、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、ギラン-バレー症候群、自己免疫ブドウ膜炎症、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫肝炎、自己免疫溶血性貧血、悪性貧血、自己免疫血小板減少症、グレーブス病、自己免疫卵巣炎、自己免疫精巣炎、一時的関節炎、抗リン脂質症候群、ウェグナー肉芽腫症、ベーチェット病、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、剛直性脊椎炎、シェーグレン症候群、疱疹状皮膚炎、尋常性天疱瘡、白斑、乾癬性関節炎、骨関節炎、ステロイド耐性喘息、慢性閉塞性肺病、円形脱毛症、及びアテローム性動脈硬化症等が挙げられる。
　自己免疫疾患患者ごとに適切な治療を行うためには、自己免疫疾患患者からリンパ球を採取し、リンパ球のＴ細胞受容体のレパートリーを同定し、その自己免疫疾患患者に高頻度で認められるＴ細胞受容体の可変領域を用いればよい。この場合、Ｔ細胞受容体はその自己免疫疾患患者の自己抗原の特定のエピトープを認識する。このような、特定のエピトープに特異的なＴ細胞受容体をコードするDNAは、自己免疫疾患患者のＴ細胞受容体を網羅的に解析することにより得ることができる。Ｔ細胞受容体には、1018ものレパートリーがあるが、現在では網羅的解析が可能である。例えば、自己免疫疾患患者のリンパ節より、Ｔ細胞を採取し、トータルmRNAを抽出精製する。次いで、トータルmRNAから逆転写酵素によりcDNAを合成し、cDNAライブラリーを作製する。作製したcDNAライブラリーについて次世代シークエンサーにより配列を決定し、Ｔ細胞受容体のレパートリーを解析することができる。自己免疫疾患患者において出現頻度が高いＴ細胞受容体をその自己免疫疾患に対する特異性が高い特異的Ｔ細胞受容体であると判断することができる。
　次いで、Ｔ細胞受容体の全長配列をクローニングする。この際、Ｔ細胞受容体の可変領域をコードするDNAの5'末端部分に結合するプライマーとＴ細胞受容体の定常領域の3'末端部分に結合するプライマーを用いてＴ細胞受容体の全長配列を増幅し、クローニングベクターに組込み、Ｔ細胞受容体をコードする全長遺伝子のライブラリーを作製する。この全長遺伝子ライブラリーの遺伝子について、再度シークエンスする。前記のＴ細胞受容体のレパートリー解析で、出現頻度が高かったＴ細胞受容体を自己免疫疾患に特異的なＴ細胞受容体とし、このＴ細胞受容体の遺伝子の配列を有するクローンを自己免疫疾患特異的Ｔ細胞受容体のクローンとして選択する。
　臓器移植の拒絶反応でドナーを標的細胞としている場合にＴ細胞受容体を特定する際には、Ｔ細胞受容体の可変領域としては、ドナー由来の移植組織抗原を認識するＴ細胞受容体の可変領域を用いればよい。このようなＴ細胞受容体の可変領域としては、例えば、ドナー由来の標的細胞を認識するＴ細胞受容体の可変領域を用いることができる。患者ごとに適切な臓器移植の拒絶治療を行うためには、臓器移植患者（レシピエント）からリンパ球を採取し、リンパ球のＴ細胞受容体のレパートリーを同定し、その臓器移植患者（レシピエント）に高頻度で認められるＴ細胞受容体の可変領域を用いればよい。この場合、Ｔ細胞受容体はそのドナー由来の移植組織抗原の特定のエピトープを認識する。このような、ドナー由来の移植組織抗原の特定のエピトープに特異的なＴ細胞受容体をコードするDNAは、臓器移植患者（レシピエント）のＴ細胞受容体を網羅的に解析することにより得ることができる。Ｔ細胞受容体には、1018ものレパートリーがあるが、現在では網羅的解析が可能である。例えば、臓器移植患者（レシピエント）のリンパ節より、Ｔ細胞を採取し、トータルmRNAを抽出精製する。次いで、トータルmRNAから逆転写酵素によりcDNAを合成し、cDNAライブラリーを作製する。作製したcDNAライブラリーについて次世代シークエンサーにより配列を決定し、Ｔ細胞受容体のレパートリーを解析することができる。臓器移植患者（レシピエント）において出現頻度が高いＴ細胞受容体を臓器移植の拒絶反応に対する特異性が高い特異的Ｔ細胞受容体であると判断することができる。
　また、ドナー由来の標的細胞と臓器移植患者（レシピエント）のリンパ球を混合培養した後、リンパ球を採取しリンパ球のＴ細胞受容体のレパートリーを同定することで、臓器移植の拒絶反応にかかわるＴ細胞受容体を同定することもできる。より簡便な方法として、あらかじめ増殖しないようにX線照射したドナーのリンパ球と臓器移植患者（レシピエント）のリンパ球を混合培養する方法（Mixed Lymphocyte Reaction）により、反応したT細胞を解析することで臓器移植の拒絶反応にかかわる臓器移植患者（レシピエント）のＴ細胞受容体を同定することができる。
　次いで、Ｔ細胞受容体の全長配列をクローニングする。この際、Ｔ細胞受容体の可変領域をコードするDNAの5'末端部分に結合するプライマーとＴ細胞受容体の定常領域の3'末端部分に結合するプライマーを用いてＴ細胞受容体の全長配列を増幅し、クローニングベクターに組込み、Ｔ細胞受容体をコードする全長遺伝子のライブラリーを作製する。この全長遺伝子ライブラリーの遺伝子について、再度シークエンスする。前記のＴ細胞受容体のレパートリー解析で、出現頻度が高かったＴ細胞受容体を感染症に特異的なＴ細胞受容体すなわち病原体の抗原に特異的なＴ細胞受容体とし、このＴ細胞受容体の遺伝子の配列を有するクローンを病原体の抗原特異的Ｔ細胞受容体のクローンとして選択する。なお、本発明において、「臓器移植の拒絶反応」の臓器移植は組織移植も含む。
　アレルギー性疾患患者におけるＴ細胞受容体を特定する場合、Ｔ細胞受容体の可変領域としては、特定のアレルギー性疾患に発現する、アレルギー抗原（アレルゲン）を認識するＴ細胞受容体の可変領域を用いればよい。このようなＴ細胞受容体の可変領域としては、例えば、特定のアレルギー性疾患患者由来のＴ細胞受容体の可変領域を用いることができる。本発明で治療対象となるアレルギー性疾患として、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性胃腸炎、食物アレルギー、気管支喘息、小児喘息、薬物アレルギー、蕁麻疹、金属アレルギー、接触過敏症等が挙げられる。
　アレルギー性疾患患者ごとに適切な治療を行うためには、アレルギー性疾患患者からリンパ球を採取し、リンパ球のＴ細胞受容体のレパートリーを同定し、そのアレルギー性疾患患者に高頻度で認められるＴ細胞受容体の可変領域を用いればよい。この場合、Ｔ細胞受容体はそのアレルギー性疾患患者のアレルギー抗原の特定のエピトープを認識する。このような、特定のエピトープに特異的なＴ細胞受容体をコードするDNAは、アレルギー性疾患患者のＴ細胞受容体を網羅的に解析することにより得ることができる。Ｔ細胞受容体には、1018ものレパートリーがあるが、現在では網羅的解析が可能である。例えば、アレルギー性疾患患者のリンパ節より、Ｔ細胞を採取し、トータルmRNAを抽出精製する。次いで、トータルmRNAから逆転写酵素によりcDNAを合成し、cDNAライブラリーを作製する。作製したcDNAライブラリーについて次世代シークエンサーにより配列を決定し、Ｔ細胞受容体のレパートリーを解析することができる。アレルギー性疾患患者において出現頻度が高いＴ細胞受容体をその自己免疫疾患に対する特異性が高い特異的Ｔ細胞受容体であると判断することができる。
　次いで、Ｔ細胞受容体の全長配列をクローニングする。この際、Ｔ細胞受容体の可変領域をコードするDNAの5'末端部分に結合するプライマーとＴ細胞受容体の定常領域の3'末端部分に結合するプライマーを用いてＴ細胞受容体の全長配列を増幅し、クローニングベクターに組込み、Ｔ細胞受容体をコードする全長遺伝子のライブラリーを作製する。この全長遺伝子ライブラリーの遺伝子について、再度シークエンスする。前記のＴ細胞受容体のレパートリー解析で、出現頻度が高かったＴ細胞受容体をアレルギー性疾患に特異的なＴ細胞受容体とし、このＴ細胞受容体の遺伝子の配列を有するクローンをアレルギー性疾患特異的Ｔ細胞受容体のクローンとして選択する。
　Ｔ細胞受容体のレパートリー解析は、例えば、IMGT/V-Questツール（http://www.imgt.org/）を利用して行うことができる。また、国際公開第WO2016/136716号に記載の方法で行うことができる。
　上記の方法では、Ｔ細胞受容体のレパートリー解析により、自己免疫疾患特異的Ｔ細胞受容体、臓器移植のドナー抗原特異的Ｔ細胞受容体又はアレルギー疾患特異的Ｔ細胞受容体の配列を決定した後に、再度Ｔ細胞受容体の全長遺伝子をクローニングし、ライブラリーを作製し、その中から自己免疫疾患特異的抗原、臓器移植のドナー抗原又はアレルギー抗原（アレルゲン）の認識に関与するＴ細胞受容体の配列を有するクローンを選択する。
　自己免疫疾患患者、臓器移植患者（レシピエント）又はアレルギー性疾患患者のＴ細胞受容体の網羅的解析は、採血後、１～２週間で行うことができる。その後、Ｔ細胞受容体をクローニングし、キメラタンパク質を製造すればよく、最短で、採血から３～５週間程度で特定の自己免疫疾患患者、臓器移植患者（レシピエント）又はアレルギー性疾患患者に適した個別化（カスタムメイド）治療を可能にするＴ細胞受容体キメラタンパク質を得ることができる。この際、Ｔ細胞受容体も免疫グロブリンのFc領域も患者のものを用いてもよく、いずれも自己のもの由来のＴ細胞受容体キメラタンパク質を用いることになるため、免疫反応による副作用を抑えることができる。
　さらに、以下の具体的な方法でＴ細胞受容体を特定することができる。
　自己免疫疾患患者、臓器移植患者又はアレルギー性疾患患者におけるTCR頻度についてそれぞれの検体の頻度を合算、平均を求めた後、頻度順に並べ上位１０程度を抽出する（合算シングル解析）。健常人末梢血のTCR頻度を頻度順にならべ上位１０程度の頻度を抽出する。V領域に着目して、患者組織で抽出したTCRの中で健常人末梢血から抽出したものと重複するものを除外し、特定TCRとする。本方法は、Ｔ細胞受容体α鎖可変領域のみならず、β鎖可変領域の特定にも利用できる。
　すなわち、この方法は、自己免疫疾患患者、臓器移植患者又はアレルギー性疾患患者のＴ細胞受容体α鎖可変領域のレパートリー及び健常人の末梢血中のリンパ球のＴ細胞受容体α鎖のレパートリーを同定し、自己免疫疾患患者、臓器移植患者又はアレルギー性疾患患者のリンパ球における存在量が健常人の末梢血中のリンパ球における存在量の、例えば２倍以上であるＴ細胞受容体α鎖可変領域を自己免疫疾患患者、臓器移植患者又はアレルギー性疾患患者特異的Ｔ細胞受容体α鎖可変領域とする、自己免疫疾患患者、臓器移植患者又はアレルギー性疾患患者特異的Ｔ細胞受容体α鎖可変領域を特定する方法である。また、複数の自己免疫疾患患者、臓器移植患者又はアレルギー性疾患患者のリンパ球の混合物と複数の健常人の末梢血中のリンパ球の混合物を用いて、自己免疫疾患患者、臓器移植患者又はアレルギー性疾患患者のリンパ球における存在量が健常人の末梢血中のリンパ球における存在量の２倍以上であるＴ細胞受容体α鎖可変領域を自己免疫疾患患者、臓器移植患者又はアレルギー性疾患患者特異的ヒト共通Ｔ細胞受容体α鎖可変領域と決定する、自己免疫疾患患者、臓器移植患者又はアレルギー性疾患患者特異的Ｔ細胞受容体α鎖可変領域を特定する方法である。
（３）Ｔ細胞受容体キメラタンパク質の製造
　一度に複数の患者について、Ｔ細胞受容体の網羅的解析を行えば、多数のＴ細胞受容体のレパートリーを取得することができ、Ｔ細胞受容体の可変領域をコードする多数のDNAのライブラリーを作製しておくことができる。その後に治療を必要とする自己免疫疾患患者、臓器移植拒絶反応がある患者又はアレルギー性疾患患者に対して、Ｔ細胞受容体の解析を行い、その患者が有するＴ細胞受容体あるいは配列が近似しているＴ細胞受容体が前記のライブラリーに存在する場合は、そのDNAを用いてＴ細胞受容体キメラタンパク質を製造すればよい。
　本発明のＴ細胞受容体キメラタンパク質は、Ｔ細胞受容体のα鎖可変領域及び／又はβ鎖可変領域と免疫グロブリンのFc領域が融合し、必要に応じてリンカーペプチドを含む融合タンパク質を１つ有する単量体も、２つ有する２量体も含む。好ましくは、図１に示す２量体が好ましい。本発明のＴ細胞受容体キメラタンパク質は、ジスルフィド結合により２量体を形成し得る。２量体の２つのＴ細胞受容体の可変領域の一方がα鎖で他方がβ鎖であってもよい。
　本発明のＴ細胞受容体キメラタンパク質は、公知の融合タンパク質を作製する方法、例えば化学合成法、遺伝子組み換え技術による方法で作製することができるが、遺伝子組換え技術による方法で作製することが好ましい。遺伝子組換え技術による方法の概要を図２に示す。遺伝子組換え技術により本発明のＴ細胞受容体キメラタンパク質を作製する場合には、Ｔ細胞受容体のα鎖可変領域及び／又はβ鎖可変領域と免疫グロブリンのFc領域、さらに必要に応じてリンカーペプチドコードするDNAをインフレームで連結し、融合タンパク質をコードするDNAを発現ベクターに導入し組換えベクターを作製し、さらに、該組換えベクターを動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、細菌等の宿主に導入し発現させればよい。
　ベクターとしては、プラスミド、ファージ、ウイルス等の宿主細胞において複製可能ないかなるベクターも用いることができる。ベクターは、プロモーター、複製開始点、選択マーカーを含み、必要に応じてエンハンサー、転写終結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル等を含んでいてもよい。
　作製したＴ細胞受容体キメラタンパク質は、必要に応じて、当該技術分野の当業者にとって周知の単離及び精製手段により、単離及び精製することができる。例えば、単離及び精製方法としては、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ミックスモードクロマトグラフィー、透析、沈殿分画法、電気泳動等が挙げられる。これらの方法を適宜組み合わせて、本発明のＴ細胞受容体キメラタンパク質を単離及び精製することができる。
　また、本発明のＴ細胞受容体キメラタンパク質は無細胞翻訳系（セルフリーシステム）で発現させることもできる。
　本発明のＴ細胞受容体キメラタンパク質は、当業者にとって公知の化学修飾がされていてもよい。例えば、化学修飾には、ポリエチレングリコール（PEG）化、グリコシル化、アセチル化、アミド化等が挙げられる。
　本発明は、自己免疫疾患患者又はアレルギー疾患患者から採取したＴ細胞から自己免疫疾患特異的抗原又はアレルギー疾患特異的抗原を認識する自己免疫疾患抗原特異的Ｔ細胞受容体又はアレルギー疾患特異的Ｔ細胞受容体をコードするDNAをクローニングし、免疫グロブリンのFc領域をコードするDNAを連結し発現ベクターに導入し、該発現ベクターを宿主細胞に導入し、宿主細胞で発現させることを含む、Ｔ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質を製造する方法を包含する。また、本発明は自己免疫疾患患者又はアレルギー疾患患者から採取したＴ細胞を用いて自己免疫疾患患者又はアレルギー疾患患者の有するＴ細胞受容体のレパートリーを解析し、自己免疫疾患患者又はアレルギー疾患患者において出現頻度が高いＴ細胞受容体をその自己免疫疾患又はアレルギー疾患に対する特異性が高い特異的Ｔ細胞受容体としてクローニングし、免疫グロブリンのFc領域をコードするDNAを連結し発現ベクターに導入し、該発現ベクターを宿主細胞に導入し、宿主細胞で発現させることを含む、Ｔ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質を製造する方法を包含する。
　さらに、本発明は臓器移植の拒絶に特異的な抗原及びMHC複合体を認識する特異的Ｔ細胞受容体をコードするDNAをクローニングし、免疫グロブリンのFc領域をコードするDNAを連結し発現ベクターに導入し、該発現ベクターを宿主細胞に導入し、宿主細胞で発現させることを含む、Ｔ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質を製造する方法を包含する。また、本発明は、臓器移植の患者のＴ細胞受容体のレパートリーを解析し、臓器移植患者において出現頻度が高いＴ細胞受容体をその臓器移植の拒絶に対する特異性が高い特異的Ｔ細胞受容体としてクローニングし、免疫グロブリンのFc領域をコードするDNAを連結し発現ベクターに導入し、該発現ベクターを宿主細胞に導入し、宿主細胞で発現させることを含む、Ｔ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質を製造する方法を包含する。
　本発明は、自己免疫疾患特異的抗原又はアレルギー性疾患特異的抗原を認識するＴ細胞受容体キメラタンパク質と抗原提示細胞のMHCとの複合体を包含する。また、本発明は、in vitroで自己免疫疾患特異的抗原又はアレルギー性疾患特異的抗原を認識するＴ細胞受容体キメラタンパク質と抗原提示細胞を接触させることによりＴ細胞受容体キメラタンパク質と抗原提示細胞の複合体を作製する方法を包含する。
　さらに、本発明は、臓器移植の拒絶に特異的な抗原を認識するＴ細胞受容体キメラタンパク質とMHC分子の複合体を包含する。また、本発明は、in vitroで臓器移植の拒絶に特異的な抗原及びMHC複合体を認識するＴ細胞受容体キメラタンパク質と抗原提示細胞を接触させることによりＴ細胞受容体キメラタンパク質と抗原提示細胞の複合体を作製する方法を包含する。
２．Ｔ細胞受容体キメラタンパク質の利用
（１）Ｔ細胞受容体キメラタンパク質の細胞への取り込み、及び細胞表面のMHC複合体の発現の低下
　Ｔ細胞受容体キメラタンパク質により、MHC複合体の細胞表面上の発現をダウンモジュレーションし、低下させることができる。また、MHC複合体へ結合したＴ細胞受容体キメラタンパク質を細胞内へ導入させることができる。
　本発明は、Ｔ細胞受容体キメラタンパク質を有効成分として含む、細胞におけるMHC複合体の発現低下剤を包含する。本発明のＴ細胞受容体キメラタンパク質は、病原性Ｔ細胞が認識する抗原提示細胞又は疾患の標的細胞上の抗原又は抗原ペプチドを提示している抗原若しくは抗原ペプチドとMHC分子の複合体の発現を低下させることにより、抗原又は抗原ペプチド特異的にそのMHC複合体を認識し標的とする病原性Ｔ細胞の反応性を調節し、その結果、該病原性Ｔ細胞の機能を低下させる。ここで、「抗原又は抗原ペプチド特異的にMHC分子の複合体の発現を低下させる」とは、特定の抗原とMHC分子の複合体のみの発現を特異的に低下させることをいう。本発明は、Ｔ細胞受容体キメラタンパク質を有効成分として含む、MHC分子複合体発現低下剤、及びＴ細胞受容体キメラタンパク質を有効成分として含む、病原性Ｔ細胞機能低下剤も包含する。MHC分子複合体発現低下剤をMHC分子複合体調節剤ともいう。調節を変調ともいう。ここで、病原性Ｔ細胞とは、自己免疫疾患やアレルギー性疾患の免疫反応に関与し、疾患を引き起こすＴ細胞、あるいは、臓器移植において、臓器移植の拒絶反応を引き起こすＴ細胞をいう。本発明のＴ細胞受容体キメラタンパク質は、抗原ペプチド特異的に病原性Ｔ細胞と競合し阻害し、Ｔ細胞の機能を低下させることができる。また、MHC分子は、MHCクラスI分子もMHCクラスII分子も、非古典的MHC分子も含む。自己免疫疾患及びアレルギー疾患には、MHCクラスII分子が関与することが多く、臓器移植の拒絶反応には、MHCクラスI分子が関与することが多い。
　該MHC複合体の発現低下剤の有効成分として用いるＴ細胞受容体キメラタンパク質は、好ましくは２量体又は４量体等の多量体である。多量体の方が、クラスタリング効率がよく、MHC複合体の発現低下の効果及びＴ細胞機能低下の効果が高い。
　Ｔ細胞受容体は、MHC複合体と結合してＴ細胞に信号を伝えて機能を発揮する。本発明のＴ細胞受容体キメラタンパク質は細胞表面のMHC複合体と結合して、その後該細胞内に取り込まれることでMHC複合体の細胞表面の発現を低下させる。細胞表面のMHC複合体に結合したＴ細胞受容体キメラタンパク質は、１～１０時間後、好ましくは４～８時間後、さらに好ましくは６時間後に細胞内に取り込まれる。
　本発明のＴ細胞受容体キメラタンパク質が結合するMHC複合体はクラスI分子に限定せず、クラスII分子でもよい。マウスではH-2K,D,L, I-A, I-Eであり、ヒトでは、HLA-A,B,C,DR, DQ,DM,Eである。あるいは、非古典的MHC分子でもよい。非古典的MHC分子としてクラスIb分子が挙げられ、CD1、MR1、H2-M3、HLA-Gなどを含む（生化学　第81巻　第3号、pp.189-199, 2009)。また、標的細胞は、自己免疫疾患、臓器移植の拒絶反応、アレルギー性疾患に限定したものではなく、正常細胞を含むあらゆる細胞を対象とする。
　本発明は、Ｔ細胞受容体キメラタンパク質を用いて、抗原提示細胞、ならびに病原性Ｔ細胞の標的となる細胞のMHCの発現を低下させて、該Ｔ細胞の機能を低下させる方法であり、Ｔ細胞受容体キメラタンパク質を有効成分として含むＴ細胞の機能低下剤として用い得る医薬組成物である。該医薬組成物は、自己免疫疾患治療、臓器移植の拒絶反応治療若しくは抑制、又はアレルギー性疾患治療若しくはアレルギー抑制に用いることができる。すなわち、本発明は、Ｔ細胞受容体キメラタンパク質を有効成分として含む、自己免疫疾患治療剤、臓器移植の拒絶反応治療若しくは抑制剤、又はアレルギー疾患の治療剤若しくはアレルギー抑制剤を包含する。
　本発明の医薬組成物の剤形は限定されず、用法に応じ種々の剤型のものが使用される。例えば、経口剤としては、錠剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、カプセル剤等が挙げられる。また、非経口剤としては、注射剤、吸入粉末剤、吸入液剤、点眼剤、液剤、ローション剤、スプレー剤、点鼻剤、点滴剤、軟膏剤、坐剤、貼付剤等を挙げることができる。本発明の医薬組成物は、その剤型に応じ、製剤学的に公知の手法により調製することができる。例えば、医薬品添加物としては、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、希釈剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、安定化剤、溶解補助剤等の医薬品添加物が挙げられる。前記医薬品添加物には、生理食塩水、注射用水等も含まれる。
　本発明の医薬組成物は、用法に応じ種々の投与方法が用いられる。例えば、経口投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与、局所投与等が挙げられる。
　本発明の医薬組成物を自己免疫疾患治療、臓器移植の拒絶反応治療又はアレルギー性疾患治療に用いる場合、その有効成分である本発明のタンパク質の投与量は、患者の年齢、性別、体重、疾患の程度、剤型、投与経路等により、適宜決定される。例えば、成人に対して経口投与により投与する場合、0.1μg/kg ～1000mg/kg／日の範囲で定めればよい。１日投与量を、１回、２回又は３回に分けて投与してもよい。また、成人に対して非経口投与で投与する場合、0.01μg/kg ～1000mg/kg／日範囲で定めることもできる。非経口投与の1日投与量は、剤型に応じて、好ましくは0.1μg/kg ～10μg/kg／日、1μg/kg ～100μg/kg／日、又は10μg/kg ～1000μg/kg／日の範囲とすればよい。
　本発明は、Ｔ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質を有効成分として含む、標的細胞のMHC複合体と結合して、MHC複合体のダウンモジュレーションを誘導して発現を低下させる方法を包含する。また、本発明は、Ｔ細胞受容体キメラタンパク質を、標的細胞上のMHC複合体と結合させ、標的細胞内に取り込ませる方法を包含する。
（２）自己免疫疾患の原因となる自己抗原、臓器移植の拒絶反応のドナー標的細胞又はアレルギー抗原（アレルゲン）の検出
　さらに、本発明のＴ細胞受容体キメラタンパク質は、自己免疫疾患の病原性Ｔ細胞の標的となる標的細胞のMHC分子と自己抗原の複合体、臓器移植の拒絶反応の原因となる、ドナー由来の標的細胞のMHC分子とドナー特異的抗原の複合体、あるいは、アレルギー性疾患の病原性Ｔ細胞の標的となる標的細胞のMHC分子とアレルギー抗原（アレルゲン）との複合体に結合するため、被験体中のこれら標的細胞の検出に利用することができる。自己免疫疾患の病原性Ｔ細胞の標的となる標的細胞が検出された場合、被験体は自己免疫疾患に罹患していると判定することができる。また、臓器移植の拒絶反応の原因となるドナー由来の標的細胞が検出された場合、被験体において臓器移植の拒絶の原因となる拒絶反応が生じていると判定することができる。さらに、アレルギー性疾患の病原性Ｔ細胞の標的となる標的細胞が検出された場合、被験体はアレルギー性疾患に罹患していると判定することができる。被験体が自己免疫疾患に罹患しているとの判定を自己免疫疾患の検出といい、被験体において臓器移植の拒絶の原因となる拒絶反応が生じているとの判定を拒絶反応の検出といい、被験体がアレルギー性疾患に罹患しているとの判定をアレルギー性疾患の検出という。また、自己免疫疾患の原因となる自己抗原や臓器移植の拒絶反応の原因となるドナー特異的抗原やアレルギー性疾患の原因となるアレルギー抗原（アレルゲン）の検出を行うことができる。
　Ｔ細胞受容体キメラタンパク質を自己免疫疾患の標的細胞、臓器移植の拒絶反応の原因となるドナー由来の標的細胞又はアレルギー性疾患の標的細胞の検出に用いる場合、Ｔ細胞受容体キメラタンパク質を蛍光色素、消光色素、蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ（ALP)や西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP)などの酵素等で標識して用いればよい。標識物質による標識は、公知のタンパク質の標識方法で行うことができ、ビオチン-アビジン（ストレプトアビジン）系を利用して標識してもよい。
　検出は、FACSやフローサイトメーターを用いて行うこともできるし、免疫細胞化学の手法により行うこともできる。フローサイトメーターとしては、例えば、FACSCanto II(ベクトン・ディッキンソン社製)等を用いればよい。免疫細胞化学の手法による測定は、採取した自己免疫疾患の標的細胞、臓器移植の拒絶反応の原因となるドナー由来の標的細胞又はアレルギー性疾患の標的細胞をスライドガラス上に固定して行えばよい。免疫細胞化学において、染色は顕微鏡や肉眼で判断することもできるし、適当な光学的測定装置を用いてもよい。
　被験体の血液や組織等の生体試料から細胞を採取し、Ｔ細胞受容体キメラタンパク質と接触させ、Ｔ細胞受容体キメラタンパク質に結合する細胞が存在した場合、該細胞は自己免疫疾患の原因となる標的細胞であると判定され、自己免疫疾患の原因となる自己抗原を発現していると判定される。また、被験体の生体試料中にドナー由来の標的細胞が検出されたとき、被験体は臓器移植の拒絶反応が起こっていると判断することができる。さらに、被験体の血液や組織等の生体試料から細胞を採取し、Ｔ細胞受容体キメラタンパク質と接触させ、Ｔ細胞受容体キメラタンパク質に結合する細胞が存在した場合、該細胞はアレルギー性疾患の原因となる標的細胞であると判定され、アレルギー性疾患の原因となるアレルギー抗原（アレルゲン）を発現していると判定される。Ｔ細胞受容体キメラタンパク質を用いた検出により、自己免疫疾患診断、臓器移植の拒絶反応診断又はアレルギー性疾患診断のための補助的データを得ることができる。
　本発明は、Ｔ細胞受容体キメラタンパク質を含む自己免疫疾患検出用試薬、臓器移植の拒絶反応検出用試薬又はアレルギー性疾患検出用試薬を含み、該Ｔ細胞受容体キメラタンパク質は好ましくは標識されている。
　自己免疫疾患やアレルギー性疾患に罹患していると判断した患者に対しては、本発明のＴ細胞機能低下剤を用いて治療すればよい。また、抗炎症療法など対症療法と併用して治療することもできる。臓器移植の拒絶反応が起こっていると判断した患者に対しては、本発明のＴ細胞機能低下剤を用いて治療すればよい。また、免疫抑制剤を投与して治療することもできる。
　本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
[実施例１]
１．Ｔ細胞受容体（TCR）レパートリー解析
　OVAペプチド（257-264:SIINFEKL）に完全フロイントアジュバント（CFA）を等量混和してエマルジョンを作成し、Day0及びDay7にC57BL/6マウス皮下に接種（感作）した。接種（感作）スケジュールを図３に示す。Day15に、所属リンパ節及び脾臓中のリンパ球を採取した。マウスは２匹ずつ用いた。対照として、OVAペプチド（257-264）特異的TCRを遺伝子導入したマウスOT-1から、脾臓中のリンパ球を採取した。
　上記サンプルから通法にて、total RNAを抽出、cDNA libraryを作成した。「遺伝子特異的非バイアス増幅法」を用いて、アダプターを付与しPCRを行ってTCR鎖の遺伝子増幅を行い、これを解析サンプルとした。
　遺伝子非バイアス増幅法とは、cDNA libraryにアダプターを付与した後、2重鎖アダプターのアンチセンス鎖（あるいはセンス鎖）を酵素にて消化する。残ったアダプター部分の塩基配列を基にしたプライマー及びTCR特異的プライマーを用いて、アダプターライゲーションPCR法を行うことで非特異的なプライマー結合を抑制し、遺伝子特異的な増幅が可能となる。遺伝子非バイアス増幅法については、国際公開第WO2016/136716号に記載されている。
　具体的には以下の方法で行う。
(i)　２本鎖cDNAの両端に以下の[１]～[３]のいずれかの２本鎖アダプターDNAをライゲーションする工程；
(ii)　２本鎖アダプターDNAをライゲーションした遺伝子をウラシルDNAグリコシラーゼ（UNG)で処理し、さらに加熱処理することによりアダプターDNAのアンチセンス鎖を分解する工程；
(iii)　２本鎖アダプターDNAのアンチセンス鎖の一部又は全部の配列からなるフォワードプライマー及び標的遺伝子に特異的にアニーリングするリバースプライマーを用いてPCR増幅を行う工程。
　この方法では、フォワードプライマーのみによる伸長反応は起こらず、リバースプライマーによる伸長反応が起こり、アダプターのセンス鎖の相補鎖が形成された後に、該相補鎖にフォワードプライマーがアニーリングし伸長反応が起こり、リバースプライマーによる伸長及びフォワードプライマーによる伸長がこの順序で一方向に起こることにより、標的遺伝子を一方向にバイアスをかけずにPCR法により増幅させることができる。
[１]　以下の特徴を有する非バイアス遺伝子増幅に用いる２本鎖アダプターDNA：
　(a)　センス鎖とアンチセンス鎖がアニーリングしており、センス鎖とアンチセンス鎖の塩基長は同じであるか、又はセンス鎖が長い；
　(b)　センス鎖の塩基長は15～40bpである；
　(c)　アンチセンス鎖に複数のウラシルを含み、ウラシルDNAグリコシラーゼ（UNG)でアダプターを処理することにより、ウラシルが除去され、その後加熱処理することによりアンチセンス鎖が分解される；
　(d)　アダプターDNAの少なくとも１端は平滑末端の形態を有する；
　(e)　一方の末端で増幅しようとする標的遺伝子に結合する；及び
　(f)　センス鎖の一部又は全部が遺伝子増幅に用いるフォワードプライマーの配列である。
[２]　アンチセンス鎖に含まれるウラシルの数がアンチセンス鎖の塩基数の10～25％であり、５～10塩基ごとにウラシルが存在する、[１]記載の２本鎖アダプターDNA。
[３]　アンチセンス鎖の5'末端にリン酸基が結合しており、3'末端にアミノ基が結合している、[１]又は[２]の２本鎖アダプターDNA。
　次世代シークエンサーは、illumina MiSeqを用い、メーカーのプロトコールに従って、サンプルを解析した。
　その結果のＴ細胞受容体(TCR)を図４に示す。
OVAペプチド（SIINFEKL）（配列番号１）に対するＴ細胞受容体は、感作したマウス及びOT-1マウスともにα鎖のV領域、J領域は類似しているもののCDR3領域に違いがみられた。OT-1マウスのTCRは、
V領域：TRAV14-1-01　J領域：TRAJ33-01　CDR3（アミノ酸配列）：AASDNYQLI（配列番号２）
OVAペプチド（SIINFEKL）（配列番号１）感作マウスN1のＴ細胞受容体は、
V領域：TRAV14-1-01　J領域：TRAJ33-01　CDR3（アミノ酸配列）：AASPVDSNYQLI（配列番号３）
OVAペプチド（SIINFEKL）（配列番号１）感作マウスN2のTCRは、
V領域：TRAV14D-1-01　J領域：TRAJ33-01　CDR3（アミノ酸配列）：AAGSNYQLI（配列番号４）であった。
　そこで、OVAペプチド（257-264）感作マウスN1のＴ細胞受容体を任意に選び、以下の実験に供した。
２．Ｔ細胞受容体キメラタンパク質の作製
１）Ｔ細胞受容体の遺伝子クローニングと発現プラスミド構築
　V領域：TRAV14-1-01　J領域：TRAJ33-01　CDR3（アミノ酸配列）：AASPVDSNYQLI（配列番号３）のＴ細胞受容体を、EL4移植15日後の脾臓サンプルcDNA libraryから、以下のPCRプライマーを用いてTCRα鎖のＬ領域からＣ領域の一部まで含む領域をクローニングした。
Primer配列：
TO1771（Ｖ領域sense鎖、EcoRI　siteを付与）:GAG AAT TCG CAG CAG CAG GTG AGA CAA AG（配列番号５）
TO1881（Ｃ領域を一部含むAntisense鎖、Bgl II siteを付与）:GAT AGA TCT TTC TGG GTT CTG GAT GTC TGG CTT TAT AAT TAG（配列番号６）
　市販のpFUSE-mIgG2A-Fcプラスミド（invivogen社）のEco RI、Bgl　II部位に、 cDNAを挿入して、Ｔ細胞受容体キメラタンパク質プラスミドを構築した（TP352と命名）。
　図２にＴ細胞受容体キメラタンパク質の作製法の概要を示す。
２）Ｔ細胞受容体キメラタンパク質（TCR-IgFc fusion protein）の産生及び精製
　Ｔ細胞受容体キメラタンパク質プラスミドをHEK293細胞に遺伝子導入した後、ultralow IgG-FCS(その後の精製過程でウシIgGが混入することを避けるため)存在培地中で、４日培養した。培養上清を回収し、Hi Trap protein Gカラム（GEヘルスケア・ジャパン社）を用いてメーカーのプロトコールに従って、精製を行った。
　このＴ細胞受容体キメラタンパク質は、TCR V領域とCDR3とＪ領域とＣ領域の一部を、IgFc部分と結合させたキメラタンパク質である。
３．OVAペプチド(SIINFEKL)特異的TCR-IgFcの結合（図５）
　マウス胸腺腫細胞EL4は、H-2Kbを発現している腫瘍細胞である。EL4にOVAペプチド(SIINFEKL)を50 μg/ml添加し、37℃1時間培養した。その後、OVA感作マウスN1から同定したTRAV14-1-01-CDR3 (AASPVDSNYQLI)-TRAJ33-01とmIgG2a Fcキメラタンパク質 (TRAV14 N1-IgFc)又はOT-1マウス由来TCRα鎖とmIgG2a Fcキメラタンパク質(TRAV14-1-01-CDR3(AASDNYQLI)-TRAJ33-01-IgFc(TRAV14-Fc)をビオチン化した後に2.5 μg/ml添加し、4℃1時間静置した。細胞を洗浄後、ストレプトアビジン-PEを加え標識して4℃, 20分間静置した後にフローサイトメーターにより検出した。
　OT-1α-IgFc では、OVAペプチドの存在の有無で違いが認められなかったが、TRAV14 N1-Fc においては、OVAペプチド存在下でOVA N1-IgFc（TRAV14 N1-IgFc)の結合性が37.3％から62.7％に増加した。この結果から、TRAV14 N1-IgFcは、抗原ペプチド特異的にMHCクラスI複合体と結合することが明らかとなった。図の数値は、TCR-IgFcが結合している細胞の割合（％）を示したものである。
４．TCR-IgFcによる抗原ペプチド依存的なMHCクラスI細胞内在化の誘導（図６）
マウス胸腺腫細胞EL4にOVAペプチド(SIINFEKL) 50μg/mlを添加し、37℃で1時間培養した。その後、OVAペプチド特異的TCRキメラタンパク質TRAV14 N1-Fc(TRAV14-1-01-CDR3(AASPVDSNYQLI)-TRAJ33-01-IgFc) 2.5μg/mlを添加し、37℃でさらに2時間培養した。細胞を2％% FCS/PBSで洗浄後、BD社Fix/Perm buffer 100μlを加え、4℃で30分間静置し、細胞の固定と透過化を行った。その後、ビオチン化した抗H-2KbDb抗体、さらにストレプトアビジン-Dyelight488による標識を行った。観察はTCP SP8 (Leica)で行い（図６A,B）、画像解析はImage J Plot Profileにより行った(図６C,D)。OVA N1-IgFc の添加によりMHCクラスIの細胞内局在が誘導されることが分かった。
５．MHC分子に結合したTCRキメラタンパク質複合体の挙動（図７、図８）
マウス胸腺腫細胞EL4を回収し、2×105 cellsを5％FCS/RPMIに懸濁する。EL4細胞のMHC クラスIに結合することが判明しているTCRキメラタンパク質TCR-IgFc(mTRAV8-Fc)を用いて、ビオチン化したTCR-IｇFc(bio-mTRAV8Ig)を細胞懸濁液に2.5μg/ml添加し、37℃ ６時間静置した。細胞を2％FCS/PBSで2回洗浄後、ストレプトアビジン(SA)-Phycoerythrin (PE)及びFITC-抗MHCクラスI (H-2KbDb)抗体をそれぞれ2.5μg/ml 添加し、4℃20分静置し染色した。細胞を３回洗浄後、フローサイトメーターにより、TCR-Fc（mTRAV8-Fc）、MHCクラスI抗体の結合性を検討した。対照群は、ビオチン化TCR-IgFc（io-mTRAV8 Fc)）添加後、4℃　1時間静置した後にSA-PE, FITC-抗MHCクラスI (H-2KbDb)抗体を加えた。図７は実験方法を示した図である。
　図８Aで示すように、0hでは、MHC クラスIにTCR-IgFc(mTRAV8-Fc)が結合して細胞表面上に存在している（19.6％）が、6hでは、mTRAV8-Fcが結合したMHC複合体が細胞内に移動したと考えられ細胞表面上にはほとんど検出されなかった（2.16％）。また、0hではMHC クラスI の発現が非常に高かったが（図８B、ヒストグラム破線）、6hでは、mTRAV8-Fcが結合したMHCクラスIの細胞内移動により、細胞表面上に発現しているMHCクラスIの発現の低下、すなわち、発現調節が認められた。図８Aの数値は、陽性細胞の割合（％）を示し、図８Bの数値は、Mean Fluorescence Intensity (MFI)を示している。図８Cは、MHCクラスIの細胞内移動により、細胞表面上に発現しているMHCクラスIの発現のMFIを示したグラフである。これらの結果から、MHC クラスIにTCR-Fcが結合することにより、細胞表面上に発現しているMHCクラスIの発現の低下がおこることが明らかとなった。
６．Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE：実験的自己免疫性脳脊髄炎)モデル作製（図９）
　6-8週齢メスC57BL/6マウスに5mg/mlの結核菌(Mycobacterium tuberculosis H37Ra)の死菌を含有する完全フロイントアジュバント(CFA)に懸濁した50μgのmyelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) 35-55ペプチド(MOG: MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)（配列番号７）(ANASPEC社)を皮下投与し、同日及び２日後に百日咳毒素(BD Difco)400ngを腹腔内投与することで感作した（Stromenes IM et al., Nat protoc; 1: 1810-9, 2006)。EAEの発症は麻痺の程度を指標とする臨床スコアにて評価した (0: 無症状、1:尾の緊張消失、 2:片側下肢の麻痺、3:両側下肢の麻痺、 4:自力歩行不可、5:致死)。図９に実験方法を示す。
７．EAEにおいて亢進しているＴ細胞受容体をもとにしたキメラタンパク質作製
　EAEにおいて亢進していることが報告されているＴ細胞受容体(TCR)α鎖(TRAV9-2D-2+ CDR3(VYFCALRSYNFG(配列番号１０）)（Vα3.2Jα18）、β鎖TRBV16-04+CDR3(CASSLDCGANP（配列番号１１）)+TRBJ1-1-01) (Vβ11DJβ1.1 ) (Battelli E et al., J Exp Med 197: 1073-1081, 2003)に対するＴ細胞受容体キメラタンパク質を作製した。pFUSE-mIgG2A-Fcプラスミド（invivogen社）にTCRα鎖（Vα3.2Jα18:以下TRAV9D-2）、またはTCR β鎖(Vβ11DJβ1.1: 以下 TRBV16-04)の配列をそれぞれライゲーションしてVα3.2Jα18-IgFcプラスミド（TP359）、およびβ11DJβ1.1-IgFcプラスミド（TP360）を作製した。HEK293細胞にプラスミドDNAをトランスフェクションした。翌日にUltralow IgGを含むDMEMへ培地交換し5日間培養した。培養上清を回収した後に、Protein G sepharose (GE Healthcare)を用いたアフィニティークロマトグラフィーによりタンパク精製した。SDS-PAGE法での電気泳動によりＴ細胞受容体キメラタンパク質分画を確認した。
　Ｔ細胞受容体をもとにしたＴ細胞受容体キメラタンパク質（TRAV9D-2-Fcfusion protein、TRBV16-04-Fc fusion protein）を作製したので、そのタンパク質を市販のビオチン化キット（Dojindo biotin labeling kit; 和光純薬株式会社）を用いてビオチン化した。
８．抗原ペプチド特異的Ｔ細胞受容体キメラタンパク質の結合（図１０、図１１）
　TCRβ-IgFcキメラタンパク質（TRBV16-04-Fcキメラタンパク質）が、MOGペプチド特異的か否かを調べるため、C57BL/6マウスから脾臓細胞を採取した。脾臓細胞3×105個に対し、20μg/ml MOGペプチド又はOVAペプチドを添加し、4℃で1時間培養した後、2％FBS入りPBSで細胞を洗浄した。その後、Fc受容体を阻害するためFc blockとして2.4G2抗体で前処理し、TCRβ-IgFcキメラタンパク質（TRBV16-04-Fcキメラタンパク質）2.5μg/mlを添加して4℃で1時間培養した。2％FBS入りのPBSで細胞を洗浄した。Dye Light, Alexa 488 (BioLegend, Clone M5/114.15.2)を加え標識した。FACS CantoII (BD Biosciences )及びFlowJoソフトウェア(TreeStar)を用いて解析した。
　図１０で示すように、MOGペプチドの添加で、TRBV16-04-Fcキメラタンパク質の結合の増加が認められた。数値は、陽性細胞の割合（％）を示している。
　さらに、培養細胞株であるRAW264.7細胞を用いて、同様の実験を試みた。RAW264.7細胞を3×105個に対し、20μg/ml MOGペプチド又はOVAペプチドを添加し、4℃で1時間培養した後、2％FBS入りPBSで細胞を洗浄した。その後、Fc受容体を阻害するためFc blockとして2.4G2抗体で前処理し、TRBV16-04-Fc2.5μg/mlを添加して4℃で1時間培養した。細胞を洗浄後、ストレプトアビジン-PEを加え標識して4℃, 20分間静置した後にFACS CantoII (BD Biosciences )及びFlowJoソフトウェア(TreeStar)を用いて解析した。図１１で示すように、OVAペプチドに対しては、TCRβ-IgFcキメラタンパク質（TRBV16-04-Fc キメラタンパク質）はほとんど結合を認めなかったが、MOGペプチドに対しては、TRBV16-04-Fc キメラタンパク質（TRBV16-04-Fcキメラタンパク質）の結合の増加が認められた。数値は陽性細胞の割合（％）を示している。
９．MHCクラス２分子の細胞内移動（図１２）
　RAW264.7細胞3×105個に対し、20μg/mlのMOGペプチドを添加して1時間培養した。細胞を洗浄した後、TRBV16-04-Fcキメラタンパク質2.5μg/mlを加え、1時間結合させた。細胞を洗浄後、抗I-A/I-E抗体(BioLegend, Clone M5/114.15.2)で1時間染色し、MHCクラスIIを標識した。一群はそのまま観察し（0hr）、もう一群は、37℃で1時間培養した後（37℃　1hr）、共焦点顕微鏡(Leica TCS SP8)で観察した。画像解析はImage J Plot Profileにより行った(図１２C)。図１２Aは、実験方法の模式図、Bは共焦点顕微鏡による観察写真、Cは共焦点顕微鏡写真について定量的画像解析を行った結果を示している。
　TRBV16-04-Fcキメラタンパク質の添加によりMHC クラスIIが細胞内へ移動することが分かり、Ｔ細胞受容体キメラタンパク質はMHC クラスIIの発現を調節することが示された。
１０．EAEモデルにおけるＴ細胞受容体キメラタンパク質による病原性T細胞に対する阻害効果（図１３、図１４、図１５）
　EAEモデル15日目の脾臓及び鼠径リンパ節を採取し、2×105 cellsをMOG 20μg/ml及びＴ細胞受容体キメラタンパク質（TRBV16-04-Fc キメラタンパク質、TRAV9D-2-Fcキメラタンパク質）5ug/mlを添加した群及び添加しない群を作製して48時間培養した。さらに、PMA 50 ng/ml及びイオノマイシン500 ng/mlを培地中に加え4.5時間培養した。その後、抗CD4抗体(BioLegend; Clone GK1.5)にて細胞表面標識を行った後に、30分間permeabilization buffer 100μl中で懸濁し細胞膜透過処置とした。抗IFN-γ抗体 (BioLegend; Clone XMG1.2)、抗IL-17抗体 (BioLegend; Clone B114205)にて細胞内染色を行った。FACS Canto II (BD Biosciences )及びFlowJoソフトウェア(TreeStar)を用いて解析した。図１３Aは実験方法の模式図、図１３Bは、IFN-γ陽性CD4+ T細胞の割合を示している。図１３Bにおいて、TRAV9D-2-Fcキメラタンパク質（Vα3.2Jα18-IgFcキメラタンパク質）では阻害効果を認めなかったが、TRBV16-04-Fcキメラタンパク質（Vβ11DJβ1.1-IgFc キメラタンパク質）を添加することでIFN-γ陽性CD4+ T細胞の割合が減少しており、阻害効果を認めた。
　MOG 20μg/ml及びFc融合タンパク投与下に2日間培養後の細胞をPMA及びイオノマイシンにて再刺激した後に、フローサイトメトリーにより解析したところ、脾臓及び鼠径リンパ節いずれもTRAV9D-2-Fcでは阻害効果を認めなかったが、TRBV16-04-Fcキメラタンパク質投与群が非投与群と比較して少なかった(図１４A、B)。また、CD4+ T細胞の割合も著明に減少していた(図１４C、D)。MOG 0, 2, 20μg/ml及びＴ細胞受容体キメラタンパク質2.5μg/ml存在下に2日間培養した細胞を、PMA及びイオノマイシンにて刺激した後に、フローサイトメトリーにより解析した。生細胞と思われる集団の割合がTRBV16-04-FcT投与群で減少しており(図１５A)、CD4+ Ｔ細胞の割合が減少していた(図１５B)。
　これらの結果は、TRBV16-04-Fcは、病原性Ｔ細胞との競合阻害のみならず、MHCの発現を調節して、病原性Ｔ細胞の活性化、細胞増殖の抑制を誘導すると考えられた。
１１．移植拒絶モデルであるリンパ球混合培養（MLR）を用いたＴ細胞受容体（TCR）レパートリー解析（図１６、図１７）
　リンパ球混合培養は以下の方法で行った。8週齢雌のBalb/cマウス (H-2KdDd)から脾臓を摘出して単核球に分離後、溶血を行った。これを5％FCS/RPMIに懸濁した後に、X線照射(20 Gy)を行い、本実験におけるStimulator cellとした。次に8週齢雌のC57BL/6マウス(H-2KbDb)脾臓から同様に細胞懸濁液を調製し、Responder cellとした。10％FCS入りRPMI1640完全培地で7日間、37℃で培養した。培養後、細胞を回収して上記の方法にてＴ細胞レパートリー解析を行った。コントロールには、C57BL/6マウス(H-2KbDb)脾臓から調整した細胞を用いた。上記の方法でＴ細胞受容体レパートリー解析を行った。
　図１６は、リンパ球混合培養におけるＴ細胞受容体レパートリー解析、α鎖の結果であり、図１７は、β鎖の結果である。図で示すようにα鎖、β鎖それぞれ複数のMLRで反応するTCRを特定することができた。その中で任意のTCRをクローニングした。このクローニングしたTCRは以下のとおりである。TCRα鎖：TRAV 7D-4-1 CDR3 AARLTGNTGKLI TRAJ 37-01（配列番号８：以下 TRAV7D-4-1)及びTCRβ鎖：TRBV31-01 CDR3 AWRDWGNYAEQF TRBJ 2-1-01（配列番号９: 以下 TRBV31-01）。これらクローニングしたTCRを用いて、上記の方法により、Ｔ細胞受容体キメラタンパク質を作製した。
１２．in vitro MLRにおけるresponder T cell の活性化・増殖に対するTCR-Fcの効果（図１８、図１９）
　8週齢雌のBalb/cマウス (H-2KdDd)から脾臓を摘出し、通法により細胞懸濁液を調製した。これを5％FCS/RPMIに懸濁した後に、X線照射 (20 Gy)を行い、本実験におけるStimulator cell (S)とした。次に8週齢雌のC57BL/6マウス(H-2KbDb)脾臓から同様に細胞懸濁液を調製し、Responder cell (R)とした。細胞増殖の検討のために一部の細胞は、CFSE (5μM)によりラベルを行った。
　Responder cell (R)は1×106 cells /50μl (in 10％ FCS / RPMI)に調製し、R:S比が 1 :1 , 5 :1, 10: 1となるように96-well U底プレートにSを50μlに調整して播種した。また、in vitro MLRにより同定したTCRα(TRAV 7D-4-1 CDR3 AARLTGNTGKLI TRAJ 37-01)及びβ鎖(TRBV31-01 CDR3 AWRDWGNYAEQF TRBJ 2-1-01)をそれぞれpFuse mIgG2a vector (invivogen:以下それぞれTRAV7D-4-1-Fc, TRBV31-01-Fc)に組換え、Ｔ細胞受容体キメラタンパク質を作製した。Ｔ細胞受容体キメラタンパク質を含む培養上清100μlを in vitro MLRに添加してその反応を観察した。Responder cell (R)の活性化は培養72時間後にH-2Kd-CD8a+CD62Llowを、細胞増殖はCD8a+CFSElow細胞として、フローサイトメトリー法により検討した。
　図１８に示すように、Ｔ細胞受容体α鎖キメラタンパク質及びＴ細胞受容体β鎖キメラタンパク質を加えた群のどちらにおいても、H-2Kd-CD8a+CD62Llow細胞集団の割合が減少していた。図の数値は当該分画の細胞の割合（％）を示している。このH-2Kd-CD8a+CD62Llow細胞は、活性化細胞でありこの割合の減少は、TRAV7D-4-1-Fc, TRBV31-01-Fcの両方とも、MLRの活性化を阻害することを意味している。
　図１９では、TRAV7D-4-1-Fc, TRBV31-01-Fcを加えた群のどちらにおいても、CD8a+CFSElow細胞の細胞増殖が減少していた。図の数値は当該分画の細胞の割合（％）を示している。すなわち、Ｔ細胞受容体α鎖キメラタンパク質及びＴ細胞受容体β鎖キメラタンパク質の両方とも、MLRにおける活性化細胞の細胞増殖を阻害することを示している。
　MLRは、臓器移植拒絶反応のin vitro簡易実験系であり、ドナーMHCに対するＴ細胞が臓器移植拒絶反応の主たる病原性Ｔ細胞と考えられている。したがって、Ｔ細胞受容体α鎖キメラタンパク質及びＴ細胞受容体β鎖キメラタンパク質は、ドナーMHCに結合して病原性Ｔ細胞との競合阻害のみならず、ドナーMHCの発現を調節することで、病原性Ｔ細胞の活性化及び増殖を阻害するものと考えられた。
１３．金属アレルギーにおけるTCR-IgFc による活性化Ｔ細胞の阻害効果（図２０、図２１）
　金属アレルギーマウスモデルを用いて、図２０に示すようにマウスのパラジウム感作とin vitroでの再刺激を行った。Day 0, Day 7に10 mM PdCl2と10μg/ml LPSの混合溶液を両鼠径部に125μlずつ皮下投与して感作を行った。2回目感作の7日後に、脾臓を採取し、1×106個の細胞を 0, 100 μMのPdCl2で16時間再刺激を行った。一部のウェルにはパラジウムアレルギーにおいて同定したTCRα鎖(TRAV8-1-01-CDR3(ATLYSGGSNAKLT)-TRAJ42-01)とmIgG2aFc領域とのキメラタンパク質を0, 10μg/ml添加した。その後、細胞内染色によりIFN-γをフローサイトメトリーにより測定した。
　図２１において、CD8T細胞は、100μMのPdCl2添加により細胞の増加が認められるが、TCRα鎖キメラタンパク質を加えることで、細胞の増加は抑制された。このことは、金属アレルギーにおける病原性T細胞の活性化・増殖をＴ細胞キメラタンパク質が抑制できることを意味している。金属アレルギーは、金属アレルギー物質がMHCで抗原提示されるため起こると考えられている。Ｔ細胞キメラタンパク質は、病原性Ｔ細胞との競合阻害のみならず、MHCの発現を調節することで、病原性Ｔ細胞の活性化及び増殖を阻害するものと考えられた。
[実施例２]
１．EAE治療実験
（１）可溶型TCRの構築及びタンパク質精製
　すでに報告されているMOG反応性TCR(:2D2 TCR) (TRAV9-2D-2+ CDR3(VYFCALRSYNFG(配列番号１０）)+TRAJ23, TRBV16-04+CDR3(CASSLDCGANP（配列番号１１）)+TRBJ1-1-01) を、それぞれヒトIgG Hole /pcDNA3.4, ヒトIgG Knob / pcDNA3.4にHiFi Assemblyにより組換えた。これら２つのプラスミドをExpi293Fにリポフェクションにより導入し、knob-into-holeにより、TCRα-TCRβの可溶型ヘテロ二量体を産生させた。37℃ 8% CO2, 125 rpmで7日間培養し、培養上清をProtein G Sepharose(GE Healthcare)カラムを用いて、TCR-Fc融合タンパク質(2D2 TCRαβ-Fc)を精製した。
（２）Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE：実験的自己免疫性脳脊髄炎)モデル作製及びEAE治療実験
　6-8週齢メスC57BL/6Jに5mg/mlの結核菌(Mycobacterium tuberculosis H37Ra)の死菌を含有する完全フロイントアジュバント (CFA)に懸濁した200μgのmyelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) 35-55ペプチド(MOG: MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)（配列番号７）(ANASPEC社)を10日前および0日目に皮下投与し、MOGペプチド皮下投与同日および2日後に百日咳毒素(BD Difco)200ngを腹腔内投与することで免疫した。Fc融合タンパク質は、MOGペプチド投与4時間前に皮下投与した。対照(cont)として、PBSを投与した。発症は麻痺の程度を指標とする臨床スコアにて評価した (0: 無症状、1:尾の緊張消失、2:片側下肢の麻痺、3:両側下肢の麻痺、 4:自力歩行不可、5:致死)。
　図２２に実験方法の概要を示す。
　結果を図２３に示す。図２３に示すように、Fc融合タンパク質（TCR-Fc 2D2 TCRαβ-Fc)を投与した場合に、症状の進行を抑制することができた。
　さらに、17日目までの臨床スコア３以上に到達したマウスの比率の結果を図２４に示す。17日目までの臨床スコア3以上に到達したマウスは、Fcタンパク非投与群(w/o Fc-protein)では66.7% (6/9)であったのに対して、TCR-Fc（2D2 TCRαβ-Fc） 10μg x2投与群は33.3% (1/3)、TCR-Fc（2D2 TCRαβ-Fc） 25μg x2投与群は0% (0/3)であった。この結果から、TCR-Fcの投与により、スコア３以上は有意に減少していることが明らかになった。すなわち、2D2 TCRαβ-Fcの投与によりEAEの症状の重篤化が抑制された。以上のことから2D2 TCRαβ-Fcは、EAEの症状の進行を抑制するのみならず、EAEの重篤化の抑制に効果があることが示された。
２．金属アレルギー治療実験
（１）可溶型TCR-Fcの構築及びタンパク質精製
　C57BL/6マウスへのパラジウムアレルギー誘導により、上昇が認められたTCRα (TRAV7-2-02+ CDR3 (AATSSGSWQLI(配列番号１２）) + TRAJ22-01)をpFuse mIgG2a ベクター(invivogen)に組換え、mIgG2aとの融合タンパク質のプラスミドを構築した(mTRAV7-Fc/pFuse)。本プラスミドをExpi293F 細胞(Thermo Fisher Sciences)にリポフェクションにより導入した。その後、37℃ 8% CO2, 125 rpmで7日間培養し、培養上清をProtein G Sepharose(GE Healthcare)カラムを用いて、Fc融合タンパク質を精製した。
（２）金属アレルギーモデルマウスの作製及び可溶型TCR-Fc投与による治療実験
　0日め、7日めに野生型C57BL/6マウスに10 mM PdCl2, 10 μg/ml LPSに調製した混合液を、両鼠径部に125μlずつ皮下投与し、感作を行った。その7日後、PdCl2 10 mMを後肢footpadに25μl皮下投与し、アレルギーを惹起した。24時間毎に足蹠厚を測定した。可溶型TCRは感作および惹起の1時間前にmTRAV7-Fc, mIgGFc (対照（cont))をそれぞれ10 mM、陽性対照として抗ヒスタミン薬の１つであるオロパダジン（OLP)を1 mg/Kg腹腔内投与した。
　図２５に実験方法の概要を示す。
　結果を図２６に示す。図２６に示すように、TCR-Fc融合タンパク質（TRAV7-Fc)を投与した場合に、足蹠厚の肥大は陽性対照と同程度に抑制された。したがって、TCR-Fcは、金属アレルギーにおいて、既存薬である抗ヒスタミン薬と同程度の効果があることが示された。
　本発明のＴ細胞受容体キメラタンパク質は、自己免疫疾患や臓器移植の拒絶反応やアレルギー性疾患の治療や検出に用いることができる。
配列番号１～４、７～１２　合成
配列番号５、６　プライマー
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (36)

  1. 　自己免疫疾患の特異的抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質を有効成分として含む、病原性Ｔ細胞が認識する抗原提示細胞又は標的細胞上の特異的抗原とMHC分子の複合体と結合して、抗原特異的にMHC分子複合体の発現を低下させる、MHC分子複合体発現低下剤。
  2. 　臓器移植の拒絶に特異的なドナー由来の抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質を有効成分として含む、病原性Ｔ細胞が認識する抗原提示細胞又は標的細胞上のドナー由来の特異的抗原とMHC分子の複合体と結合して、抗原特異的にMHC分子複合体の発現を低下させる、MHC分子複合体発現低下剤。
  3. 　アレルギー性疾患の特異的抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質を有効成分として含む、病原性Ｔ細胞が認識する抗原提示細胞又は標的細胞上の特異的抗原とMHC分子の複合体と結合して、抗原特異的にMHC分子複合体の発現を低下させるMHC分子複合体発現低下剤。
  4. 　Ｔ細胞受容体キメラタンパク質がＴ細胞受容体の可変領域とCDR3の全てとJ領域を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のMHC分子複合体発現低下剤。
  5. 　Ｔ細胞受容体の可変領域が、Ｔ細胞受容体のα鎖及び／又はβ鎖である、あるいはγ鎖及び／又はδ鎖である請求項１～４のいずれか１項に記載のMHC分子複合体発現低下剤。
  6. 　免疫グロブリンのFc領域がIgGのFc領域である、請求項１～５のいずれか１項に記載のMHC分子複合体発現低下剤。
  7. 　２つのＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質からなる２量体であり、前記２つのタンパク質がジスルフィド結合により結合している、請求項１～６のいずれか１項に記載のMHC分子複合体発現低下剤。
  8. 　Ｔ細胞受容体が抗原とMHC分子の複合体と結合する、請求項１～７のいずれか１項に記載のMHC分子複合体発現低下剤。
  9. 　MHC分子が、古典的MHC分子又は非古典的MHC分子である、請求項１～８のいずれか１項に記載のMHC分子複合体発現低下剤。
  10. 　自己免疫疾患の特異的抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質を有効成分として含む、病原性Ｔ細胞が認識する抗原提示細胞又は標的細胞上の特異的抗原とMHC分子の複合体と結合して、MHC分子複合体の発現を低下させ、病原性Ｔ細胞に認識されないようにするための、自己免疫疾患を引き起こすＴ細胞機能低下剤。
  11. 　臓器移植の拒絶に特異的なドナー由来の抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質を有効成分として含む、病原性Ｔ細胞が認識する抗原提示細胞又は標的細胞上のドナー由来の特異的抗原とMHC分子の複合体と結合して、MHC分子複合体の発現を低下させ、病原性Ｔ細胞に認識されないようにするための、臓器移植の拒絶を引き起こすＴ細胞の機能を低下させるための、Ｔ細胞機能低下剤。
  12. 　アレルギー性疾患の特異的抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質を有効成分として含む、病原性Ｔ細胞が認識する抗原提示細胞又は標的細胞上の特異的抗原とMHC分子の複合体と結合して、MHC分子複合体の発現を低下させ、病原性Ｔ細胞に認識されないようにするための、アレルギー性疾患を引き起こすＴ細胞機能低下剤。
  13. 　Ｔ細胞受容体キメラタンパク質がＴ細胞受容体の可変領域とCDR3の全てとJ領域を含む、請求項１０～１２のいずれか１項に記載のＴ細胞機能低下剤。
  14. 　Ｔ細胞受容体の可変領域が、Ｔ細胞受容体のα鎖及び／又はβ鎖である、あるいはγ鎖及び／又はδ鎖である請求項１０～１３のいずれか１項に記載のＴ細胞機能低下剤。
  15. 　免疫グロブリンのFc領域がIgGのFc領域である、請求項１０～１４のいずれか１項に記載のＴ細胞機能低下剤。
  16. 　２つのＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質からなる２量体であり、前記２つのタンパク質がジスルフィド結合により結合している、請求項１０～１５のいずれか１項に記載のＴ細胞機能低下剤。
  17. 　Ｔ細胞受容体が抗原とMHC分子の複合体と結合する、請求項１０～１６のいずれか１項に記載のＴ細胞機能低下剤。
  18. 　MHC分子が、古典的MHC分子又は非古典的MHC分子である、請求項１０～１７のいずれか１項に記載のＴ細胞機能低下剤。
  19. 　請求項１及び４～９のいずれか１項に記載のMHC分子複合体発現低下剤を含む、自己免疫疾患治療剤。
  20. 　請求項２及び４～９のいずれか１項に記載のMHC分子複合体発現低下剤を含む、臓器移植拒絶反応抑制剤。
  21. 　請求項３～９のいずれか１項に記載のMHC分子複合体発現低下剤を含む、アレルギー疾患治療剤。
  22. 　請求項１０及び１３～１８のいずれか１項に記載のＴ細胞機能低下剤を含む、自己免疫疾患治療剤。
  23. 　請求項１１及び１３～１８のいずれか１項に記載のＴ細胞機能低下剤を含む、臓器移植拒絶反応抑制剤。
  24. 　請求項１２～１８のいずれか１項に記載のＴ細胞機能低下剤を含む、アレルギー疾患治療剤。
  25. 　自己免疫疾患の特異的抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質であって標識されたＴ細胞受容体キメラタンパク質を被験体の生体試料から採取した細胞と接触させ、前記Ｔ細胞受容体キメラタンパク質が被験体の生体試料から採取した細胞と結合した場合に、被験体中に標的細胞が存在し、被験体は自己免疫疾患に罹患していると判定する、自己免疫疾患検出方法。
  26. 　MHC分子が、古典的MHC分子又は非古典的MHC分子である、請求項２５記載の自己免疫疾患検出方法。
  27. 　自己免疫疾患の特異的抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質であって標識されたＴ細胞受容体キメラタンパク質を含む自己免疫疾患検出用試薬。
  28. 　MHC分子が、古典的MHC分子又は非古典的MHC分子である、請求項２７記載の自己免疫疾患検出用試薬。
  29. 　臓器移植の拒絶に特異的なドナー由来の抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質であって標識されたＴ細胞受容体キメラタンパク質を被験体の生体試料から採取した細胞と接触させ、前記Ｔ細胞受容体キメラタンパク質が被験体の生体試料から採取した細胞と結合した場合に、被験体中に標的細胞が存在し、被験体において拒絶反応が生じていると判定する、臓器移植の拒絶の原因となる拒絶反応検出方法。
  30. 　MHC分子が、古典的MHC分子又は非古典的MHC分子である、請求項２９記載の拒絶反応検出方法。
  31. 　臓器移植の拒絶に特異的なドナー由来の抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質であって標識されたＴ細胞受容体キメラタンパク質を含む拒絶反応検出用試薬。
  32. 　MHC分子が、古典的MHC分子又は非古典的MHC分子である、請求項３１記載の拒絶反応検出用試薬。
  33. 　アレルギー性疾患の特異的抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質であって標識されたＴ細胞受容体キメラタンパク質を被験体の生体試料から採取した細胞と接触させ、前記Ｔ細胞受容体キメラタンパク質が被験体の生体試料から採取した細胞と結合した場合に、被験体中に標的細胞が存在し、被験体はアレルギー性疾患に罹患していると判定する、アレルギー性疾患検出方法。
  34. 　MHC分子が、古典的MHC分子又は非古典的MHC分子である、請求項３３記載のアレルギー性疾患検出方法。
  35. 　アレルギー性疾患の特異的抗原とMHC分子の複合体を認識するＴ細胞受容体の可変領域と免疫グロブリンのFc領域との融合タンパク質であるＴ細胞受容体キメラタンパク質であって標識されたＴ細胞受容体キメラタンパク質を含むアレルギー性疾患検出用試薬。
  36. 　MHC分子が、古典的MHC分子又は非古典的MHC分子である、請求項３５記載のアレルギー性疾患検出用試薬。
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