JP2014505471A - アポトーシスを誘導する架橋ポリペプチド - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
[0005]MHC分子の主要な免疫機能は、抗原ペプチドに結合して「提示」し、リンパ球の抗原特異的T細胞受容体(TCR)による認識及び結合のために細胞の表面にMHC−ペプチド(MHC−p)複合体を形成することである。その機能に関しては、次の2つのクラスのMHC−ペプチド複合体が区別できる。
(i)MHCクラスI−ペプチド複合体は、ほとんどすべての有核細胞により発現されて、CD8+細胞傷害性T細胞を引き付けることが可能である。
(ii)MHCクラスII−ペプチド複合体は、いわゆる抗原提示細胞(APC)(例えば、Bリンパ球、マクロファージ、樹状細胞(DC))上でのみ構成的に発現される。
[0017]すなわち、本発明は、特定のMHC−ペプチド複合体に特異的に結合する少なくとも4つのドメインを含むポリペプチドであって、前記ドメインはリンカーアミノ酸配列により分離されており、それにより、各ドメインには別個のMHC−ペプチド複合体に結合する能力が付与される、ポリペプチドを提供する。本発明によれば、典型的には、アミノ酸配列により分離されているすべての必要なMHC−ペプチド複合体結合ドメインを含む1個のポリペプチドが提供される。このことは、本発明のすべての分子がMHC−ペプチドのみに結合する単一ポリペプチド鎖のみからなり得るということではない。例えば、MHC−ペプチド複合体結合ドメインを含む一本鎖ポリペプチド上に、非MHC−ペプチド特異性のある他の結合ドメインを付与することが可能である。第2の結合ドメインは、典型的には第1のドメインのような抗体由来結合ドメインを含まないが、結合ポリペプチドに他の望ましい特性(例えば、改良された半減期)を付与する。例えば、結合ポリペプチド上にヒト血清アルブミン(HSA)を付加すれば、半減期の延長等のために有用になり得る。本発明の分子は、後にHSAに結合することができるように、HSA等の分子に対する結合ドメインを含むこともできる。
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKEREGVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS(配列番号11、AH5)
に本質的に一致する結合ドメインを有する。
EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWLSYISSDGSTIYYADSVKGRFTVSRDNAKNSLSLQMNSLRADDTAVYYCAVSPRGYYYYGLDLWGQGTTVTVSS(配列番号12、11H)
を含む結合ドメインを有する。
MAQLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKEREGVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSSGSTSGSMAQLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKEREGVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSSGSTSGSMAQLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKEREGVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSSGSTSGSMAQLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKEREGVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSSGSTSGSMAQLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKEREGVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSSGSTSGSMAQLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKEREGVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS(配列番号4、Hexa−AH5);又は
EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWLSYISSDGSTIYYADSVKGRFTVSRDNAKNSLSLQMNSLRADDTAVYYCAVSPRGYYYYGLDLWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTAEVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWLSYISSDGSTIYYADSVKGRFTVSRDNAKNSLSLQMNSLRADDTAVYYCAVSPRGYYYYGLDLWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTAEVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWLSYISSDGSTIYYADSVKGRFTVSRDNAKNSLSLQMNSLRADDTAVYYCAVSPRGYYYYGLDLWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTAEVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWLSYISSDGSTIYYADSVKGRFTVSRDNAKNSLSLQMNSLRADDTAVYYCAVSPRGYYYYGLDLWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTAEVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWLSYISSDGSTIYYADSVKGRFTVSRDNAKNSLSLQMNSLRADDTAVYYCAVSPRGYYYYGLDLWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTAEVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWLSYISSDGSTIYYADSVKGRFTVSRDNAKNSLSLQMNSLRADDTAVYYCAVSPRGYYYYGLDLWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC(配列番号13、Hexa−11HCH1);又は
EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWLSYISSDGSTIYYADSVKGRFTVSRDNAKNSLSLQMNSLRADDTAVYYCAVSPRGYYYYGLDLWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGSQLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKEREGVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSSGSTSGSGKSPGSGEGTKGEVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWLSYISSDGSTIYYADSVKGRFTVSRDNAKNSLSLQMNSLRADDTAVYYCAVSPRGYYYYGLDLWGQGTTVTVSSEFAKTTAPSVYPLAPVLESSGSGQLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKEREGVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWLSYISSDGSTIYYADSVKGRFTVSRDNAKNSLSLQMNSLRADDTAVYYCAVSPRGYYYYGLDLWGQGTTVTVSSGSTSGSGKSPGSGEGTKGQLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKEREGVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS(配列番号17、Hexa−11HAH5)
に本質的に一致するアミノ酸配列を有する。
[0086]A.A.:アミノ酸;Ab:抗体;ADA:抗薬物抗体;AFP:アルファフェトプロテイン;APC:抗原提示細胞;β2−M:β2−ミクログロブリン;CDR:相補性決定領域;CEA:癌胎児性抗原;CHO:チャイニーズハムスター卵巣;CT:癌精巣抗原;CTL:細胞傷害性Tリンパ球;DC:樹状細胞;EBV:エプスタインバーウイルス;ELISA:酵素結合免疫吸着アッセイ;HEK:ヒト胎児腎臓;HLA:ヒト白血病抗原;i.v.:静脈内に;kDa:キロダルトン;MAGE:黒色腫関連抗原;MHC:主要組織適合遺伝子複合体;MHC−p:MHC−ペプチド;PBSM:2%脱脂粉乳を含有するPBS;sc−Fv:一本鎖可変断片;VHH又はsdAb:単一ドメイン抗体;TCR:T細胞受容体;VH、Vh又はVH:抗体重ドメインの可変アミノ酸配列。
[0087]HLA−A0201提示マルチMAGE−AエピトープY−L−E−Y−R−Q−V−P−Gに特異的なヒト抗体断片(配列番号5)を得るために、以前de Haardら(2)により記載された手順に従ってヒトFabファージディスプレイライブラリーが構築され、本質的にChamesら(3)により記載されたようにして、選択のために使用された。ヒトFabファージ(1013コロニー形成単位)はまず2%脱脂粉乳を含有するPBS(PBSM)中室温で1時間プレインキュベートされた。並行して、200μlのストレプトアビジン被膜ビーズ(Dynal)はPBSM中1時間平衡化された。それに続くラウンドでは、100μlのビーズが使用された。パンMHCバインダーを枯渇させるため、それぞれの選択ラウンドでは、無関係なペプチドを含有するビオチン化MHCクラスI−ペプチド(MHC−p)複合体(Sanquin、the Netherlands)200nMがファージに添加され、回転下30分間インキュベートされた。平衡化されたビーズが添加され、その混合物は回転下15分間インキュベートされた。ビーズは磁力を用いてチューブの側面に引き付けられた。枯渇されたファージ画分に、それに続いて減少する量のビオチン化MHC−p複合体(第1ラウンドでは200nM、第2及び第3ラウンドでは20nM)が添加され、連続回転させながら室温で1時間インキュベートされた。同時に、パンMHCクラスI結合可溶性Fab(D3)がファージMHC−p複合体混合物に添加された(それぞれ1〜3ラウンドで50、10及び5μg)。平衡化されたストレプトアビジン被膜ビーズが添加され、その混合物は回転下15分間インキュベートされた。ファージは磁力により選択された。非結合ファージは、PBSMを用いた5回洗浄ステップ、0.1%TWEEN(登録商標)を含有するPBSを用いた5ステップ及びPBSを用いた5ステップにより取り除かれた。ファージは、500μlの新たに調製されたトリエチルアミン(100mM)と一緒の10分間インキュベーションによりビーズから溶出された。溶液のpHは、500μlの1M Tris(pH7.5)の添加により中和された。溶出されたファージは、37℃で30分間、対数増殖するイーコリ(E.Coli)TG1細胞(0.5のOD600nm)と一緒にインキュベートされた。細菌は2×TYAGプレート上で一晩増殖させた。次の日、コロニーは採取され、50mlの2×TYAGにおいて10μlの接種材料が使用された。細胞は0.5のOD600nmまで増殖させ、5mlのこの懸濁液にM13k07ヘルパーファージ(5×1011コロニー形成単位)を感染させた。37℃での30分間のインキュベーション後、細胞は遠心分離され、25mlの2×TYAKに再懸濁され、30℃で一晩増殖させた。ファージは既に記載された通りに培養上清から回収され、次のラウンドのパニングのために使用された。3回の選択ラウンド後、261倍の濃縮が得られ、解析された282クローンのうち46がHLA−A2−マルチMAGE−A複合体に特異的であることが明らかにされた(図1)。HLA−A0201/マルチMAGE−A複合体及びJCウイルス由来ペプチドとのHLA−A0201複合体を使用するELISAを用いて、選択されたFabの特異性が決定された。
[0088]選択されたFabファージは、マルチMAGE−AペプチドY−L−E−Y−R−Q−V−P−Vが負荷されたHLA−A0201陽性EBV形質転換B−LCLに結合する能力について解析された。B−LCL株BSM(0.5×106)は、37℃で30分間、マルチMAGE−Aペプチド(100μl PBS中10μg)を負荷され、続いてFabファージAH5、CB1、CG1、BD5及びBC7と一緒にインキュベートされ、フローサイトメトリーにより解析された。図2に示されるように、Fab AH5、CB1及びCG1はペプチド負荷細胞のみに特異的に結合するが、Fab BD5及びBC7は、マルチMAGE−Aペプチドが負荷されていないBSMに対して非特異的結合を示した。AH5、CB1及びCG1による非ペプチド負荷細胞への結合は観察されなかった。
[0090]複数のペプチド/MHC複合体を使用するELISAによってFab−AH5の特異性が確認された。この目的のために、ペプチド マルチMAGE−A、gp100、JCV及びMAGE−C2を提示するHLA−A0201複合体、並びにHLA−A1/MAGE−A1複合体は96ウェルプレート上に固定され、Fab AH5及び対照Fab G8を表示するファージと一緒にインキュベートされた。図4に示されるように、AH5はHLA−A0201/マルチMAGE−Aのみに結合し、無関係な複合体HLA−A0201/gp100、HLA−A0201/MAGE−C2、HLA−A0201/JCV及びHLA−A0101/MAGE−A1には結合しない。陽性対照Fab G8はその関連標的HLA−A0101/MAGE−A1のみに結合する。
2.1 六量体AH5 VHタンパク質の産生のための遺伝子の設計
[0091]ヒト抗体生殖系列遺伝子VH3はラマ単一ドメインVHHに高い相同性を示す。ヒトVH3遺伝子におけるアミノ酸44、45及び47をラマVHHに存在するこれらの位置のアミノ酸で交換すると、ヒトVH3遺伝子の安定性及び発現が増強されることが明らかにされている(5)。AH5 VHは生殖系列遺伝子VH3−33*01に対して低い相同性(IMGT相同性サーチにより決定された場合71%)を示すが、その発現及び安定性は、ラクダ化と呼ばれるプロセスである、アミノ酸44、45及び47をラマVHHアミノ酸で交換することから利益を得る可能性がある。さらに、発現すると6つのAH5 VHドメインを含むことになる遺伝子が収集された。この目的のために、6つのコドン最適化ラクダ化AH5 VHドメイン(これは、各AH5 VHドメイン間にGSTSGSリンカーを有する。)に作動可能に連結されたpelB分泌シグナルを含む遺伝子(Hexa−AH5と呼ぶ。)が設計された(DNA配列は配列番号1、アミノ酸配列は配列番号4参照)。この遺伝子は「Geneart」(Regensburg、Germany)により合成され、イーコリにおける発現のためにpStaby1.2ベクター(Delphi genetics、Belgium)にクローニングされた。
[0092]六量体AH5 VHタンパク質(Hexa−AH5)(DNA配列は配列番号1、アミノ酸配列は配列番号4参照)の発現のために、pStaby−Hexa−AH5ベクターはエレクトロポレーションを介してSE1細菌に導入された。陽性クローンは、OD600=0.8まで30℃、2%グルコースの存在下で増殖させた。次いで、細菌TYAG培地は、発現を誘導するために、1mMのIPTGを含有するTY培地に置き換えられた。30℃で一晩の培養後、細菌及び培地は採取された。ペリプラズム画分は、氷上での30分間のPBS/EDTA/NaClと一緒の細菌のインキュベーション後に収集された。次いで、タンパク質発現がSDS−PAGEにより解析された。図5に示されるように、Hexa−AH5タンパク質は培地に分泌され、細菌ペリプラズムに存在していた。
[0094]パンMHCクラスI及びβ2M特異的抗体によるMHCクラスI分子の架橋結合によりアポトーシスの誘導が生じる(6)。このプロセスはカスパーゼ9依存性であることが明らかにされており、インビトロ及びインビボでMHCクラスI陽性腫瘍細胞の根絶をもたらす。パンMHCクラスI抗体及び抗β2M特異的抗体によるアポトーシスの誘導は、腫瘍特異的抗原を発現している腫瘍に特異的ではない。これとは対照的に、特異的ペプチド/MHC複合体に結合するT細胞受容体に似ている分子の相互作用を通じてペプチド/MHC分子が架橋結合すると、腫瘍特異的アポトーシス誘導が生じることになる。効率的架橋結合は、同時に治療分子が結合するペプチド/MHC複合体の数に依拠することになる。
[0095]六量体AH5−VHタンパク質は、HLA−A0201とMAGE−A遺伝子の両方を発現することが知られている多様な腫瘍細胞と一緒にインキュベートすることによりアポトーシスを誘導する能力について解析された。細胞株、Daju、Mel624(黒色腫)、PC346C(前立腺癌)及びMAGE−A陰性細胞(911及びHEK293T)は、10μg/mlのHexa−AH5タンパク質と一緒にインキュベートされた(DMEM培地中、pen/strep、グルタミン及び非必須アミノ酸が補充されている)。4時間後、細胞は、組織培養プレートからの細胞の剥離及び膜小疱形成などのアポトーシスの古典的徴候について目視で検査された。図6に示されるように、Daju細胞は実際、Hexa−AH5タンパク質と一緒のインキュベーション後にのみ組織培養プレートから剥離する。これは、Mel624及びPC346C細胞でも見られた。インキュベーションが一晩まで延長されると、Daju、Mel624及びPC346C細胞は分解され、処理された培養物に特に不在であった。Hexa−AH5タンパク質で処理されなかった細胞、並びにHLA−A0201(HEK293T)及びMAGE−A遺伝子(911及びHEK293T)を発現しない細胞は影響を受けなかった。
[0096]アポトーシスに対する古典的な細胞内の顕著な特徴は活性カスパーゼ−3の存在である。六量体AH5タンパク質が活性カスパーゼ−3を誘導するかどうかを判定するために、Daju細胞は10μg/mlのHexa−AH5タンパク質と一緒にインキュベートされた。4時間後、カスパーゼ−3/7に対する蛍光的に標識された阻害剤であるFAM−DEVD−FMKが組織培養培地に添加された。この物質は細胞膜を通過することができる。そして、活性カスパーゼ−3が存在する場合のみ、明るい蛍光シグナルが例えば蛍光顕微鏡法により検出されることになる。
[0098]三次元ヒト腫瘍におけるHexa−AH5タンパク質のアポトーシス活性を実証するために、同所性前立腺癌モデルが使用された。この目的のために、ヒトPC346C前立腺癌細胞がオスNOD−SCIDマウスの前立腺に注射され、超音波誘導検査により腫瘍が検出可能になるまで増殖させた。
[0099]NOD−SCIDマウスのヒトPC346C前立腺腫瘍に10μgのHexa−AH5タンパク質(20μl総容量中)が1回直接注射された。次の日、腫瘍は取り除かれ、固定化されパラフィン包埋された。パラフィン包埋腫瘍からスライドが調製され、アポトーシスの古典的マーカーである断片化DNAを検出するアッセイのTunnel Universalアポトーシス検出キット(Genescript)を用いて染色された。手短に言えば、スライドは60℃で30分間加熱され、PBSで3回洗浄され、プロテイナーゼK溶液と一緒に1時間インキュベートされた。次いで、スライドはブロッキング溶液(メタノール中3%H2O2)と一緒に10分間インキュベートされ、PBSで洗浄され、タネル反応混合液(平衡バッファー、ビオチン−11−dUTP及びTdT)と一緒に37℃で1時間インキュベートされた。3回洗浄後、スライドは、37℃で30分間、ストレプトアビジン−HRP溶液と一緒にインキュベートされ、最後にDAB基質(DABバッファー、PBS中H2O2)と一緒にインキュベートされた。
4.2.1 前立腺腫瘍細胞はHexa−AH5の静脈内注射後ニックの入ったDNAを示す
[00101]次の実験では、同所性ヒトPC346C前立腺腫瘍を有するNOD−scidマウスは、25μgのHexa−AH5(150μl総容量中)を尾部静脈を介して1回注射された。次の日、腫瘍は取り除かれ、パラフィン包埋され、腫瘍スライドはタネルアッセイを用いてニック入りのDNAについて染色された。
[00103]同所性PC346C腫瘍を有するNOD−scidマウスは、25μgのHexa−AH5(150μl総容量中)を尾部静脈から1回注射された。次の日、これらのマウスは、蛍光的に標識されたカスパーゼ阻害剤であるFLIVO(Immunohistochemistry Ltd)の注射を受けた。この阻害剤は1時間循環し細胞膜を通過するままにされた。次いで、腫瘍は取り除かれ、固定され、パラフィン包埋された。
[00105]治療タンパク質の薬物動態特性(例えば、分布、代謝、排出)は、形状、電荷及びサイズなどの要因に依存する。大半の小血漿分子(MW<50〜60kDa)の有する半減期は非常に短いが、ヒト血清アルブミン(HSA)及び免疫グロブリン(Ig)などのもっと大きな血漿タンパク質は半減期が非常に長い(HSAで19日間、Igで1〜4週間)。実際、IgG−Fc又はヒト血清アルブミンを添加すると、治療タンパク質に連結した場合、循環時間、腫瘍浸潤及び抗腫瘍効果を伸ばすことが示されている。
[00106]六量体AH5構築物はIgG1−Fc領域に又はヒト血清アルブミンに連結され、真核細胞での発現のためにコドン最適化され、pcDNA−3.1+ベクター(Geneart、Regensburg、Germany)にクローニングされた(Hexa−AH5Fcについては配列番号2のDNA配列及び配列番号5のアミノ酸配列、Hexa−AH5HSAについては配列番号3のDNA配列及び配列番号6のアミノ酸配列参照)。
[00107]六量体AH5−Fc及びAH5−HSA構築物は、pcDNA−3.1+にクローニングされて、293T細胞において発現された。トランスフェクションの4日後に得られた上清を用いて、HLA−A0201及びMAGE−A遺伝子を発現することが知られている黒色腫624細胞においてアポトーシスを誘導した。この目的のために、黒色腫624細胞は24ウェルプレートに播種され(0.25×106細胞/ウェル)、一晩付着させておいた。次の日、培地は、トランスフェクトされた293T細胞から得られた培地に置き換えられた。結果は、Hexa−AH5−FcとHexa−AH5−HSAの両方で処理された624黒色腫細胞について陽性カスパーゼ−3染色を示した。単純な培地と一緒にインキュベートされた624細胞又はHLA−A0201陽性、MAGE−A陰性911細胞では染色は観察されなかった(図11)。
[00108]黒色腫細胞株Daju(HLA−A0201/MAGE−A陽性)を接種されたマウスは、六量体AH5タンパク質の静脈内注射で処置された(2.5μg/2回/週)。1)腫瘍なしマウス、及び2)腫瘍増殖が示されている(図12)。
[00109]真核細胞における発現のために、AH5CH1及び11HCH1配列は、pMSec SUMOSTARベクターに導入された(六量体AH5CH1及び11HCH1はCaPO4を用いたトランスフェクション後293T細胞の上清中で産生された)。293T上清(DMEM中に1対1で希釈された、5%FCS)と一緒のDaju及びMEL624黒色腫細胞のインキュベーション1時間後、膜小疱形成及び細胞の剥離が観察された。
振盪フラスコにおける30℃又は37℃でのSE1における六量体AH5の発現は、多くの望ましくない比較的小さな産物を生じることが示された。増殖及び産生中に25℃まで温度を下げると、産生の著しい改善が生じた。タンパク質の収率が上がっただけでなく、得られた副産物は少なくなるか、全くなくなった(図14A及び14B)。
(1)Stephanie Graff−Dubois,Olivier Faure,David−Alexandre Gross,Pedro Alves,Antonio Scardino,Salem Chouaib,Francois A.Lemonnier and Kostas Kosmatopoulos. Generation of CTL Recognizing an HLA−A*0201−Restricted Epitope Shared by MAGE−A1,−A2,−A3,−A4,−A6,−A10,and −A12 Tumor Antigens: Implication in a Broad−Spectrum Tumor Immunotherapy. The Journal of Immunology,2002, 169:575−580.
(2)Hans J.de Haard,Nicole van Neer,Anneke Reurs,Simon E.Hufton,Rob C.Roovers,Paula Henderikx,Adriaan P.de Bruine,Jan−Willem Arends,and Hennie R.Hoogenboom. A Large Non−immunized Human Fab Fragment Phage Library That Permits Rapid Isolation and Kinetic Analysis of High Affinity Antibodies. The Journal of Biological Chemistry,1999, 274:18218−18230.
(3)P.Chames,H.R.Hoogenboom,and P.Henderikx. Selection of antigens against biotinylated antigens. In Antibody phage display,methods and protocols, Edited by P.M.O’Brien and R.Aitken. Methods in Molecular Biology,2002, 178:147−159.
(4)Patrick Chames,Simon E.Hufton,Pierre G.Coulie,Barbara Uchanska−Ziegler,Hennie R.Hoogenboom. Direct selection of a human antibody fragment directed against the tumor T−cell epitope HLA−A1−MAGE−A1 from a nonimmunized phage−Fab library. PNAS,2000, 97:7969−7974.
(5)Lutz Riechmann,Serge Muyldermans. Single domain antibodies: comparison of camel VH and camelized human VH domains. Journal of Immunological Methods,1999, 231:25−38.
(6)Jing Yang,PhD and Qing Yi. Killing Tumor Cells Through Their Surface b2−Microglobulin or Major Histocompatibility Complex Class I Molecules. Cancer,2010, 116:1638−1645.
SEQ ID NO:1. DNA sequence Hexa−AH5:
1 CAGCTGCAGC TGCAAGAAAG CGGTGGTGGT GTTGTTCAGC CTGGTCGTAG CCTGCGTCTG
61 AGCTGTGCAG CAAGCGGTTT TACCTTTAGC AGCTATGGTA TGCATTGGGT TCGTCAGGCA
121 CCGGGTAAGG AACGTGAAGG TGTTGCAGTT ATTAGCTATG ATGGCAGCAA CAAATATTAT
181 GCCGATAGCG TTAAAGGTCG CTTTACCATT AGCCGTGATA ATAGCAAAAA CACCCTGTAT
241 CTGCAGATGA ATAGCCTGCG TGCAGAAGAT ACCGCAGTTT ATTATTGTGC CGGTGGTAGC
301 TATTATGTTC CGGATTATTG GGGTCAGGGC ACCCTGGTTA CCGTTAGCAG CGGTAGCACC
361 AGCGGTAGCA TGGCCCAGCT GCAATTACAA GAATCAGGTG GTGGCGTGGT GCAGCCAGGT
421 CGTTCACTGC GTCTGTCATG TGCAGCATCA GGCTTTACCT TCAGTTCATA CGGCATGCAC
481 TGGGTGCGCC AAGCTCCAGG CAAAGAACGC GAAGGCGTGG CCGTTATTTC ATACGATGGC
541 TCCAATAAAT ACTATGCGGA TTCAGTGAAA GGCCGTTTTA CCATTTCACG CGATAACAGT
601 AAAAACACCT TATACCTGCA AATGAATTCA CTGCGTGCCG AGGATACAGC CGTGTATTAC
661 TGTGCGGGTG GTTCATATTA CGTGCCTGAT TATTGGGGAC AAGGTACACT GGTGACAGTT
721 AGCAGTGGTA GTACCTCAGG TTCAATGGCC CAGTTACAAC TGCAAGAATC TGGCGGTGGT
781 GTTGTGCAAC CGGGTCGCTC TCTGCGTCTG AGTTGCGCTG CATCAGGTTT TACATTTTCA
841 AGCTACGGAA TGCACTGGGT TAGACAGGCT CCCGGTAAGG AAAGAGAAGG CGTTGCGGTT
901 ATCAGTTATG ACGGTAGCAA TAAGTATTAT GCGGACTCTG TTAAGGGTCG TTTTACAATT
961 TCTCGGGACA ATAGCAAGAA TACACTGTAC TTACAGATGA ACTCTCTGAG AGCAGAAGAT
1021 ACAGCCGTAT ACTATTGCGC AGGCGGTAGT TATTATGTGC CTGACTACTG GGGCCAGGGA
1081 ACGCTGGTGA CCGTGAGTAG CGGTTCAACC AGCGGTTCAA TGGCGCAACT GCAACTTCAA
1141 GAGTCTGGTG GCGGTGTGGT ACAGCCTGGC CGTTCTCTGC GTTTAAGCTG CGCAGCCTCT
1201 GGTTTTACGT TTTCATCTTA TGGAATGCAT TGGGTACGCC AAGCCCCTGG AAAAGAACGT
1261 GAGGGCGTAG CAGTGATCTC TTATGATGGT TCGAACAAAT ATTACGCGGA CTCCGTGAAA
1321 GGACGCTTTA CAATCTCTCG TGATAACTCA AAAAATACGC TGTATCTTCA AATGAACTCC
1381 TTACGTGCGG AAGATACTGC GGTCTATTAC TGCGCTGGCG GTTCTTACTA TGTACCAGAT
1441 TACTGGGGAC AGGGGACCTT AGTTACAGTT AGCTCAGGTA GCACCAGTGG TTCTATGGCT
1501 CAATTACAGT TACAAGAAAG TGGCGGTGGC GTGGTCCAAC CTGGCCGTAG TCTGCGCCTG
1561 TCTTGCGCAG CGAGCGGCTT TACATTTTCT AGTTATGGCA TGCATTGGGT GAGACAAGCT
1621 CCGGGGAAAG AGCGCGAAGG GGTTGCGGTG ATTTCTTATG ACGGCAGTAA TAAATACTAC
1681 GCAGATAGTG TGAAAGGTCG TTTCACAATT AGTCGCGATA ACTCCAAAAA CACATTATAT
1741 TTGCAGATGA ACAGTTTGCG TGCGGAGGAC ACGGCTGTAT ATTATTGTGC AGGGGGTTCC
1801 TACTATGTGC CCGACTACTG GGGTCAAGGG ACCTTAGTGA CCGTTTCAAG CGGTAGTACC
1861 TCTGGTAGTA TGGCTCAACT TCAGCTGCAA GAGTCAGGCG GAGGCGTTGT CCAGCCTGGA
1921 CGCTCACTGC GCTTAAGTTG TGCAGCCAGT GGCTTTACGT TTAGCTCTTA CGGGATGCAT
1981 TGGGTCCGGC AGGCGCCTGG GAAGGAACGC GAAGGTGTAG CTGTGATTAG TTACGATGGC
2041 AGTAATAAGT ATTACGCCGA TTCAGTAAAA GGTCGCTTCA CGATTTCGCG TGATAATTCT
2101 AAGAATACCC TTTACCTTCA GATGAATTCG TTACGCGCAG AGGATACCGC TGTATACTAC
2161 TGTGCTGGCG GATCATATTA TGTCCCAGAC TATTGGGGGC AGGGTACTCT GGTAACGGTT
2221 AGCTCT
1 CAGCTCCAGC TGCAGGAAAG CGGCGGAGGC GTCGTGCAGC CTGGCAGAAG CCTGAGACTG
61 AGCTGTGCCG CCAGCGGCTT CACCTTCAGC AGCTACGGCA TGCACTGGGT CCGACAGGCC
121 CCTGGCAAAG AACGGGAAGG CGTGGCCGTG ATCAGCTACG ACGGCAGCAA CAAGTACTAC
181 GCCGACAGCG TGAAGGGCCG GTTCACCATC AGCCGGGACA ACAGCAAGAA CACCCTGTAC
241 CTGCAGATGA ACAGCCTGCG GGCCGAGGAC ACCGCCGTGT ACTATTGTGC CGGCGGAAGC
301 TACTACGTGC CCGACTATTG GGGCCAGGGC ACCCTCGTGA CCGTGTCTAG CGGCAGCACC
361 AGCGGCTCCA TGGCTCAGCT CCAGCTCCAG GAATCTGGCG GCGGAGTCGT CCAGCCCGGA
421 AGATCTCTGC GGCTGTCTTG TGCCGCCTCT GGCTTTACCT TCTCCTCCTA TGGAATGCAT
481 TGGGTCCGCC AGGCTCCCGG AAAGGAAAGG GAAGGGGTCG CAGTGATCTC CTACGATGGC
541 TCCAACAAGT ATTATGCCGA TTCTGTGAAG GGGCGCTTTA CCATCTCCCG CGACAACTCC
601 AAGAACACAC TCTATCTCCA GATGAATTCC CTGAGAGCCG AGGATACAGC CGTCTATTAC
661 TGCGCTGGCG GCTCCTACTA TGTGCCTGAT TACTGGGGAC AGGGAACCCT GGTCACAGTG
721 TCCTCCGGCT CCACCAGCGG CAGTATGGCA CAGCTGCAGC TCCAGGAATC TGGAGGCGGG
781 GTCGTGCAGC CAGGACGCTC CCTGAGACTG TCCTGTGCTG CCTCCGGATT CACCTTTAGC
841 TCTTATGGGA TGCACTGGGT CAGGCAGGCA CCAGGGAAAG AACGCGAGGG GGTGGCAGTG
901 ATTTCTTATG ATGGGAGCAA CAAATATTAC GCTGACTCCG TCAAGGGCCG CTTCACAATC
961 TCCAGAGATA ATTCCAAGAA TACTCTGTAC CTCCAGATGA ATTCTCTGCG CGCTGAGGAC
1021 ACTGCTGTCT ACTACTGCGC AGGGGGCAGC TATTACGTCC CCGATTACTG GGGGCAGGGG
1081 ACACTCGTCA CCGTCAGCAG CGGCTCTACC TCCGGCTCTA TGGCTCAGCT GCAGCTCCAG
1141 GAATCCGGGG GAGGTGTCGT GCAGCCTGGG AGATCCCTGC GCCTGAGTTG CGCCGCTTCC
1201 GGCTTCACTT TTTCCTCTTA CGGCATGCAT TGGGTCAGGC AGGCTCCAGG CAAGGAACGA
1261 GAGGGCGTCG CCGTGATTTC CTATGACGGA TCTAACAAGT ACTATGCAGA CTCCGTGAAA
1321 GGGCGATTCA CCATTAGCAG AGACAACTCT AAAAACACTC TGTATCTGCA GATGAATTCA
1381 CTCCGGGCCG AAGATACCGC AGTGTATTAC TGTGCAGGCG GGTCTTATTA CGTGCCAGAC
1441 TACTGGGGAC AGGGGACACT GGTCACTGTC TCAAGCGGCT CCACCTCTGG AAGTATGGCC
1501 CAGCTCCAGC TCCAGGAAAG TGGGGGCGGA GTCGTCCAGC CAGGCAGAAG CCTCAGGCTG
1561 TCTTGCGCTG CCAGCGGATT CACATTTTCC AGTTACGGAA TGCACTGGGT CAGACAGGCT
1621 CCTGGAAAGG AACGCGAAGG TGTCGCTGTC ATCAGCTATG ACGGGTCCAA CAAGTACTAT
1681 GCTGATAGTG TGAAAGGCCG GTTTACAATC TCTCGCGATA ATAGCAAGAA TACCCTCTAT
1741 CTGCAGATGA ATAGTCTGAG AGCTGAGGAT ACCGCTGTGT ACTACTGTGC TGGGGGCTCA
1801 TATTATGTCC CTGACTATTG GGGGCAGGGA ACTCTCGTCA CTGTGTCCAG CGGAAGCACA
1861 TCCGGATCAA TGGCACAGCT CCAGCTGCAG GAAAGCGGAG GGGGGGTCGT CCAGCCTGGC
1921 CGATCACTGA GACTGTCATG CGCCGCCAGT GGGTTTACAT TCAGCTCCTA CGGGATGCAT
1981 TGGGTCCGCC AGGCACCTGG GAAAGAGCGA GAAGGCGTCG CAGTCATTAG CTACGATGGA
2041 AGTAACAAGT ATTACGCAGA TAGCGTCAAG GGGAGATTCA CCATCTCTAG GGACAATTCC
2101 AAAAACACCC TCTACCTGCA GATGAATTCC CTGCGGGCAG AAGACACCGC TGTCTATTAT
2161 TGCGCCGGAG GATCTTACTA CGTCCCAGAT TATTGGGGAC AGGGCACTCT GGTCACAGTC
2221 AGCAGCGGAT CCACAAGCGG CAGCGGAGCC GCCGACAAGA CCCACACCTG TCCCCCTTGC
2281 CCTGCCCCTG AGCTGCTGGG AGGCCCTAGC GTGTTCCTGT TCCCCCCAAA GCCCAAGGAC
2341 ACCCTGATGA TCAGCCGGAC CCCCGAAGTG ACCTGCGTGG TGGTGGACGT GTCCCACGAG
2401 GACCCTGAAG TGAAGTTCAA TTGGTACGTG GACGGCGTGG AAGTGCACAA CGCCAAGACC
2461 AAGCCCAGAG AGGAACAGTA CAACAGCACC TACCGGGTGG TGTCCGTGCT GACCGTGCTG
2521 CACCAGGACT GGCTGAACGG CAAAGAGTAC AAGTGCAAGG TCTCCAACAA GGCCCTGCCT
2581 GCCCCCATCG AGAAAACCAT CAGCAAGGCC AAGGGCCAGC CCCGCGAGCC TCAGGTGTAC
2641 ACACTGCCTC CCAGCCGGGA CGAGCTGACC AAGAACCAGG TGTCCCTGAC CTGCCTGGTC
2701 AAGGGCTTCT ACCCCAGCGA TATCGCCGTG GAATGGGAGA GCAACGGCCA GCCCGAGAAC
2761 AACTACAAGA CCACCCCCCC TGTGCTGGAC AGCGACGGCT CATTCTTCCT GTACAGCAAG
2821 CTGACCGTGG ACAAGAGCCG GTGGCAGCAG GGCAACGTGT TCAGCTGCTC CGTGATGCAC
2881 GAGGCCCTGC ACAACCACTA CACCCAGAAG TCCCTGTCCC TGAGCCCCGG CAAG
1 CAGCTCCAGC TGCAGGAAAG CGGCGGAGGC GTCGTGCAGC CTGGCAGAAG CCTGAGACTG
61 AGCTGTGCCG CCAGCGGCTT CACCTTCAGC AGCTACGGCA TGCACTGGGT CCGACAGGCC
121 CCTGGCAAAG AACGGGAAGG CGTGGCCGTG ATCAGCTACG ACGGCAGCAA CAAGTACTAC
181 GCCGACAGCG TGAAGGGCCG GTTCACCATC AGCCGGGACA ACAGCAAGAA CACCCTGTAC
241 CTGCAGATGA ACAGCCTGCG GGCCGAGGAC ACCGCCGTGT ACTATTGTGC CGGCGGAAGC
301 TACTACGTGC CCGACTATTG GGGCCAGGGC ACCCTCGTGA CCGTGTCTAG CGGCAGCACC
361 AGCGGCTCCA TGGCTCAGCT CCAGCTCCAG GAATCTGGCG GCGGAGTCGT CCAGCCCGGA
421 AGATCTCTGC GGCTGTCTTG TGCCGCCTCT GGCTTTACCT TCTCCTCCTA TGGAATGCAT
481 TGGGTCCGCC AGGCTCCCGG AAAGGAAAGG GAAGGGGTCG CAGTGATCTC CTACGATGGC
541 TCCAACAAGT ATTATGCCGA TTCTGTGAAG GGGCGCTTTA CCATCTCCCG CGACAACTCC
601 AAGAACACAC TCTATCTCCA GATGAATTCC CTGAGAGCCG AGGATACAGC CGTCTATTAC
661 TGCGCTGGCG GCTCCTACTA TGTGCCTGAT TACTGGGGAC AGGGAACCCT GGTCACAGTG
721 TCCTCCGGCT CCACCAGCGG CAGTATGGCA CAGCTGCAGC TCCAGGAATC TGGAGGCGGG
781 GTCGTGCAGC CAGGACGCTC CCTGAGACTG TCCTGTGCTG CCTCCGGATT CACCTTTAGC
841 TCTTATGGGA TGCACTGGGT CAGGCAGGCA CCAGGGAAAG AACGCGAGGG GGTGGCAGTG
901 ATTTCTTATG ATGGGAGCAA CAAATATTAC GCTGACTCCG TCAAGGGCCG CTTCACAATC
961 TCCAGAGATA ATTCCAAGAA TACTCTGTAC CTCCAGATGA ATTCTCTGCG CGCTGAGGAC
1021 ACTGCTGTCT ACTACTGCGC AGGGGGCAGC TATTACGTCC CCGATTACTG GGGGCAGGGG
1081 ACACTCGTCA CCGTCAGCAG CGGCTCTACC TCCGGCTCTA TGGCTCAGCT GCAGCTCCAG
1141 GAATCCGGGG GAGGTGTCGT GCAGCCTGGG AGATCCCTGC GCCTGAGTTG CGCCGCTTCC
1201 GGCTTCACTT TTTCCTCTTA CGGCATGCAT TGGGTCAGGC AGGCTCCAGG CAAGGAACGA
1261 GAGGGCGTCG CCGTGATTTC CTATGACGGA TCTAACAAGT ACTATGCAGA CTCCGTGAAA
1321 GGGCGATTCA CCATTAGCAG AGACAACTCT AAAAACACTC TGTATCTGCA GATGAATTCA
1381 CTCCGGGCCG AAGATACCGC AGTGTATTAC TGTGCAGGCG GGTCTTATTA CGTGCCAGAC
1441 TACTGGGGAC AGGGGACACT GGTCACTGTC TCAAGCGGCT CCACCTCTGG AAGTATGGCC
1501 CAGCTCCAGC TCCAGGAAAG TGGGGGCGGA GTCGTCCAGC CAGGCAGAAG CCTCAGGCTG
1561 TCTTGCGCTG CCAGCGGATT CACATTTTCC AGTTACGGAA TGCACTGGGT CAGACAGGCT
1621 CCTGGAAAGG AACGCGAAGG TGTCGCTGTC ATCAGCTATG ACGGGTCCAA CAAGTACTAT
1681 GCTGATAGTG TGAAAGGCCG GTTTACAATC TCTCGCGATA ATAGCAAGAA TACCCTCTAT
1741 CTGCAGATGA ATAGTCTGAG AGCTGAGGAT ACCGCTGTGT ACTACTGTGC TGGGGGCTCA
1801 TATTATGTCC CTGACTATTG GGGGCAGGGA ACTCTCGTCA CTGTGTCCAG CGGAAGCACA
1861 TCCGGATCAA TGGCACAGCT CCAGCTGCAG GAAAGCGGAG GGGGGGTCGT CCAGCCTGGC
1921 CGATCACTGA GACTGTCATG CGCCGCCAGT GGGTTTACAT TCAGCTCCTA CGGGATGCAT
1981 TGGGTCCGCC AGGCACCTGG GAAAGAGCGA GAAGGCGTCG CAGTCATTAG CTACGATGGA
2041 AGTAACAAGT ATTACGCAGA TAGCGTCAAG GGGAGATTCA CCATCTCTAG GGACAATTCC
2101 AAAAACACCC TCTACCTGCA GATGAATTCC CTGCGGGCAG AAGACACCGC TGTCTATTAT
2161 TGCGCCGGAG GATCTTACTA CGTCCCAGAT TATTGGGGAC AGGGCACTCT GGTCACAGTC
2221 AGCAGCGGAT CCACAAGCGG CAGCGGAGCC GCTGGAGGCG GATCTGGCGG CAGAGCTTCT
2281 GGCGGAGGCA GCGACGCCCA CAAGAGCGAA GTGGCCCACA GATTCAAGGA CCTGGGCGAG
2341 GAAAACTTCA AGGCCCTGGT GCTGATTGCC TTCGCCCAGT ACCTGCAGCA GTGCCCCTTC
2401 GAGGACCACG TGAAGCTGGT CAACGAAGTG ACCGAGTTCG CCAAGACCTG CGTGGCCGAC
2461 GAGAGCGCCG AGAACTGCGA CAAGAGCCTG CACACCCTGT TCGGCGACAA GCTGTGCACC
2521 GTGGCCACCC TGCGGGAAAC CTACGGCGAG ATGGCCGACT GCTGCGCCAA GCAGGAACCC
2581 GAGCGGAACG AGTGCTTCCT GCAGCACAAG GACGACAACC CCAACCTGCC CAGACTCGTG
2641 CGGCCCGAGG TGGACGTGAT GTGCACCGCC TTCCACGACA ACGAGGAAAC CTTCCTGAAG
2701 AAGTACCTGT ACGAGATCGC CAGACGGCAC CCCTACTTCT ACGCCCCCGA GCTGCTGTTC
2761 TTCGCCAAGC GGTACAAGGC CGCCTTCACC GAGTGCTGCC AGGCCGCCGA TAAGGCCGCC
2821 TGCCTGCTGC CCAAGCTGGA CGAGCTGCGG GATGAGGGCA AGGCCAGCTC CGCCAAGCAG
2881 AGACTGAAGT GCGCCAGCCT GCAGAAGTTC GGCGAGCGGG CCTTTAAGGC CTGGGCCGTG
2941 GCCAGACTGA GCCAGAGATT CCCCAAGGCC GAGTTTGCCG AGGTGTCCAA GCTGGTCACC
3001 GACCTGACCA AGGTGCACAC CGAGTGTTGT CACGGCGACC TGCTGGAATG CGCCGACGAC
3061 AGAGCCGATC TGGCCAAGTA CATCTGCGAG AACCAGGACA GCATCAGCAG CAAGCTGAAA
3121 GAGTGCTGCG AGAAGCCCCT GCTGGAAAAG AGCCACTGTA TCGCCGAGGT GGAAAACGAC
3181 GAGATGCCCG CCGACCTGCC TAGCCTGGCC GCCGATTTCG TGGAAAGCAA GGACGTGTGC
3241 AAGAATTACG CCGAGGCCAA GGATGTGTTC CTGGGCATGT TCCTGTATGA GTACGCCAGG
3301 CGCCACCCCG ACTACAGCGT GGTCCTGCTG CTGCGGCTGG CCAAGACCTA CGAGACAACC
3361 CTGGAAAAGT GCTGCGCCGC TGCCGACCCC CACGAGTGTT ACGCCAAGGT GTTCGACGAG
3421 TTCAAGCCTC TGGTGGAAGA ACCCCAGAAC CTGATCAAGC AGAACTGCGA GCTGTTCGAG
3481 CAGCTGGGCG AGTACAAGTT CCAGAACGCC CTGCTCGTGC GGTACACCAA GAAGGTGCCC
3541 CAGGTCAGCA CCCCCACCCT GGTGGAAGTG TCCCGGAACC TGGGCAAAGT GGGCAGCAAG
3601 TGCTGCAAGC ACCCTGAGGC CAAGCGGATG CCCTGCGCCG AGGACTACCT GAGCGTGGTG
3661 CTGAACCAGC TGTGCGTGCT GCACGAGAAA ACCCCCGTGT CCGACAGAGT GACCAAGTGC
3721 TGTACCGAGA GCCTGGTCAA CAGACGGCCC TGCTTCAGCG CCCTGGAAGT GGACGAGACA
3781 TACGTGCCCA AAGAGTTCAA CGCCGAGACA TTCACCTTCC ACGCCGACAT CTGCACCCTG
3841 AGCGAGAAAG AGCGGCAGAT CAAGAAACAG ACCGCACTGG TGGAACTGGT CAAGCACAAG
3901 CCCAAGGCCA CCAAAGAACA GCTGAAGGCC GTGATGGACG ACTTCGCCGC CTTCGTGGAA
3961 AAGTGTTGCA AGGCCGACGA CAAAGAGACA TGCTTCGCCG AAGAGGGCAA GAAACTGGTG
4021 GCCGCCAGTC AGGCCGCTCT GGGACTG
1 QLQLQESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS SYGMHWVRQA PGKEREGVAV
51 ISYDGSNKYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAGGS
101 YYVPDYWGQG TLVTVSSGST SGSMAQLQLQ ESGGGVVQPG RSLRLSCAAS
151 GFTFSSYGMH WVRQAPGKER EGVAVISYDG SNKYYADSVK GRFTISRDNS
201 KNTLYLQMNS LRAEDTAVYY CAGGSYYVPD YWGQGTLVTV SSGSTSGSMA
251 QLQLQESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS SYGMHWVRQA PGKEREGVAV
301 ISYDGSNKYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAGGS
351 YYVPDYWGQG TLVTVSSGST SGSMAQLQLQ ESGGGVVQPG RSLRLSCAAS
401 GFTFSSYGMH WVRQAPGKER EGVAVISYDG SNKYYADSVK GRFTISRDNS
451 KNTLYLQMNS LRAEDTAVYY CAGGSYYVPD YWGQGTLVTV SSGSTSGSMA
501 QLQLQESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS SYGMHWVRQA PGKEREGVAV
551 ISYDGSNKYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAGGS
601 YYVPDYWGQG TLVTVSSGST SGSMAQLQLQ ESGGGVVQPG RSLRLSCAAS
651 GFTFSSYGMH WVRQAPGKER EGVAVISYDG SNKYYADSVK GRFTISRDNS
701 KNTLYLQMNS LRAEDTAVYY CAGGSYYVPD YWGQGTLVTV SS
1 QLQLQESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS SYGMHWVRQA PGKEREGVAV
51 ISYDGSNKYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAGGS
101 YYVPDYWGQG TLVTVSSGST SGSMAQLQLQ ESGGGVVQPG RSLRLSCAAS
151 GFTFSSYGMH WVRQAPGKER EGVAVISYDG SNKYYADSVK GRFTISRDNS
201 KNTLYLQMNS LRAEDTAVYY CAGGSYYVPD YWGQGTLVTV SSGSTSGSMA
251 QLQLQESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS SYGMHWVRQA PGKEREGVAV
301 ISYDGSNKYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAGGS
351 YYVPDYWGQG TLVTVSSGST SGSMAQLQLQ ESGGGVVQPG RSLRLSCAAS
401 GFTFSSYGMH WVRQAPGKER EGVAVISYDG SNKYYADSVK GRFTISRDNS
451 KNTLYLQMNS LRAEDTAVYY CAGGSYYVPD YWGQGTLVTV SSGSTSGSMA
501 QLQLQESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS SYGMHWVRQA PGKEREGVAV
551 ISYDGSNKYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAGGS
601 YYVPDYWGQG TLVTVSSGST SGSMAQLQLQ ESGGGVVQPG RSLRLSCAAS
651 GFTFSSYGMH WVRQAPGKER EGVAVISYDG SNKYYADSVK GRFTISRDNS
701 KNTLYLQMNS LRAEDTAVYY CAGGSYYVPD YWGQGTLVTV SSGSTSGSGA
751 ADKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE
801 DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY
851 KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV
901 KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ
951 GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK
1 QLQLQESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS SYGMHWVRQA PGKEREGVAV
51 ISYDGSNKYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAGGS
101 YYVPDYWGQG TLVTVSSGST SGSMAQLQLQ ESGGGVVQPG RSLRLSCAAS
151 GFTFSSYGMH WVRQAPGKER EGVAVISYDG SNKYYADSVK GRFTISRDNS
201 KNTLYLQMNS LRAEDTAVYY CAGGSYYVPD YWGQGTLVTV SSGSTSGSMA
251 QLQLQESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS SYGMHWVRQA PGKEREGVAV
301 ISYDGSNKYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAGGS
351 YYVPDYWGQG TLVTVSSGST SGSMAQLQLQ ESGGGVVQPG RSLRLSCAAS
401 GFTFSSYGMH WVRQAPGKER EGVAVISYDG SNKYYADSVK GRFTISRDNS
451 KNTLYLQMNS LRAEDTAVYY CAGGSYYVPD YWGQGTLVTV SSGSTSGSMA
501 QLQLQESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS SYGMHWVRQA PGKEREGVAV
551 ISYDGSNKYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAGGS
601 YYVPDYWGQG TLVTVSSGST SGSMAQLQLQ ESGGGVVQPG RSLRLSCAAS
651 GFTFSSYGMH WVRQAPGKER EGVAVISYDG SNKYYADSVK GRFTISRDNS
701 KNTLYLQMNS LRAEDTAVYY CAGGSYYVPD YWGQGTLVTV SSGSTSGSGA
751 AGGGSGGRAS GGGSDAHKSE VAHRFKDLGE ENFKALVLIA FAQYLQQCPF
801 EDHVKLVNEV TEFAKTCVAD ESAENCDKSL HTLFGDKLCT VATLRETYGE
851 MADCCAKQEP ERNECFLQHK DDNPNLPRLV RPEVDVMCTA FHDNEETFLK
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Y−L−E−Y−R−Q−V−P−G
E−G−D−C−A−P−E−E−K
Y−L−E−Y−R−Q−V−P−D
Y−L−E−Y−R−Q−V−P−V
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKEREGVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS
EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWLSYISSDGSTIYYADSVKGRFTVSRDNAKNSLSLQMNSLRADDTAVYYCAVSPRGYYYYGLDLWGQGTTVTVSS
EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWLSYISSDGSTIYYADSVKGRFTVSRDNAKNSLSLQMNSLRADDTAVYYCAVSPRGYYYYGLDLWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTAEVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWLSYISSDGSTIYYADSVKGRFTVSRDNAKNSLSLQMNSLRADDTAVYYCAVSPRGYYYYGLDLWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTAEVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWLSYISSDGSTIYYADSVKGRFTVSRDNAKNSLSLQMNSLRADDTAVYYCAVSPRGYYYYGLDLWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTAEVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWLSYISSDGSTIYYADSVKGRFTVSRDNAKNSLSLQMNSLRADDTAVYYCAVSPRGYYYYGLDLWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTAEVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWLSYISSDGSTIYYADSVKGRFTVSRDNAKNSLSLQMNSLRADDTAVYYCAVSPRGYYYYGLDLWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTAEVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWLSYISSDGSTIYYADSVKGRFTVSRDNAKNSLSLQMNSLRADDTAVYYCAVSPRGYYYYGLDLWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
T−F−P−D−L−E−S−E−F
I−M−P−K−A−G−L−L−I
K−K−L−L−T−Q−H−F−V−Q−E−N−Y−L−E−Y
EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWLSYISSDGSTIYYADSVKGRFTVSRDNAKNSLSLQMNSLRADDTAVYYCAVSPRGYYYYGLDLWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGSQLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKEREGVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSSGSTSGSGKSPGSGEGTKGEVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWLSYISSDGSTIYYADSVKGRFTVSRDNAKNSLSLQMNSLRADDTAVYYCAVSPRGYYYYGLDLWGQGTTVTVSSEFAKTTAPSVYPLAPVLESSGSGQLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKEREGVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWLSYISSDGSTIYYADSVKGRFTVSRDNAKNSLSLQMNSLRADDTAVYYCAVSPRGYYYYGLDLWGQGTTVTVSSGSTSGSGKSPGSGEGTKGQLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKEREGVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS
Claims (27)
- 特定のMHC−ペプチド複合体に特異的に結合する少なくとも4つのドメインを含むポリペプチドであって、前記ドメインはリンカーアミノ酸配列により分離されており、それにより、各ドメインには別個のMHC−ペプチド複合体に結合する能力が付与される、ポリペプチド。
- エフェクター機能を有するアミノ酸配列をさらに含む、請求項1に記載のポリペプチド。
- 6つのMHC−ペプチド複合体結合ドメインを有する、請求項1又は2に記載のポリペプチド。
- 前記特異的結合ドメインのうちの少なくとも1つは免疫グロブリン断片を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記少なくとも1つの免疫グロブリン断片は、天然の、突然変異した及び/又は合成のVHである、請求項4に記載のポリペプチド。
- 前記特異的結合ドメインのうちの少なくとも1つは一本鎖T細胞受容体ドメインを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記特異的結合ドメインはMHC−I−ペプチド複合体に結合できる、請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記特異的結合ドメインは、腫瘍関連抗原由来のペプチドを含むMHC−I−ペプチド複合体、特に種々のMAGEペプチドを含むMHC−I−ペプチド複合体に結合できる、請求項6に記載のポリペプチド。
- 前記特異的結合ドメインのうちの少なくとも1つは、
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKEREGVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS又はEVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWLSYISSDGSTIYYADSVKGRFTVSRDNAKNSLSLQMNSLRADDTAVYYCAVSPRGYYYYGLDLWGQGTTVTVSS
に本質的に一致するアミノ酸配列を有する、請求項5に記載のポリペプチド。 - 前記リンカーのうちの少なくとも1つは、(Gly4Ser)N、(GSTSGS)n、GSTSGSGKPGSGEGSTKG、EFAKTTAPSVYPLAPVLESSGSG、若しくはタンパク質フォールディングに対する柔軟性を付与する他の任意のリンカー、又はEPKSCDKTHT(IgG1)、ELKTPLGDTTHT(IgG3)若しくはESKYGPP(IgG4)に本質的に一致するアミノ酸配列を有する、請求項5に記載のポリペプチド。
- Hexa−AH5:QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKEREGVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSSGSTSGSMAQLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKEREGVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSSGSTSGSMAQLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKEREGVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSSGSTSGSMAQLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKEREGVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSSGSTSGSMAQLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKEREGVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSSGSTSGSMAQLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKEREGVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS;又は
Hexa−11HCH1:EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWLSYISSDGSTIYYADSVKGRFTVSRDNAKNSLSLQMNSLRADDTAVYYCAVSPRGYYYYGLDLWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTAEVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWLSYISSDGSTIYYADSVKGRFTVSRDNAKNSLSLQMNSLRADDTAVYYCAVSPRGYYYYGLDLWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTAEVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWLSYISSDGSTIYYADSVKGRFTVSRDNAKNSLSLQMNSLRADDTAVYYCAVSPRGYYYYGLDLWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTAEVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWLSYISSDGSTIYYADSVKGRFTVSRDNAKNSLSLQMNSLRADDTAVYYCAVSPRGYYYYGLDLWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTAEVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWLSYISSDGSTIYYADSVKGRFTVSRDNAKNSLSLQMNSLRADDTAVYYCAVSPRGYYYYGLDLWGQGTTVTVSSEPKSCDKTHTAEVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWLSYISSDGSTIYYADSVKGRFTVSRDNAKNSLSLQMNSLRADDTAVYYCAVSPRGYYYYGLDLWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC;又は
Hexa−11HAH5:EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWLSYISSDGSTIYYADSVKGRFTVSRDNAKNSLSLQMNSLRADDTAVYYCAVSPRGYYYYGLDLWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGSQLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKEREGVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSSGSTSGSGKSPGSGEGTKGEVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWLSYISSDGSTIYYADSVKGRFTVSRDNAKNSLSLQMNSLRADDTAVYYCAVSPRGYYYYGLDLWGQGTTVTVSSEFAKTTAPSVYPLAPVLESSGSGQLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKEREGVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWLSYISSDGSTIYYADSVKGRFTVSRDNAKNSLSLQMNSLRADDTAVYYCAVSPRGYYYYGLDLWGQGTTVTVSSGSTSGSGKSPGSGEGTKGQLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKEREGVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGSYYVPDYWGQGTLVTVSS
に本質的に一致するアミノ酸配列を有する、請求項5に記載のポリペプチド。 - 前記特異的結合ドメインは、本質的にもっぱら前記MHC−ペプチド複合体に結合する能力を有し、前記ペプチド自体、別のMHC−ペプチド複合体又は空のMHCには結合しない、請求項5に記載のポリペプチド。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
- 請求項13に記載の核酸を含むベクター。
- 請求項13に記載の核酸を宿主細胞のゲノムに組み込むための手段をさらに含む、請求項14に記載のベクター。
- 請求項13に記載の核酸に作動可能に連結された分泌シグナルをさらに含む、請求項14又は15に記載のベクター。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載のポリペプチドの発現のための宿主細胞であって、請求項11、12又は13に記載の核酸が組み込まれた宿主細胞。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載のポリペプチドを製造するための方法であって、請求項18に記載の宿主細胞を培養するステップと、請求項13に記載の核酸を発現させるステップと、請求項1〜12のいずれか一項に記載のポリペプチドを採取するステップと、を含む方法。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載のポリペプチドと、適切な希釈剤及び/又は賦形剤と、を含む医薬組成物。
- 従来の細胞増殖抑制及び/又は殺腫瘍剤をさらに含む、請求項19に記載の医薬組成物。
- 癌の治療において使用するための、請求項1〜12のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 癌のアジュバンド治療において使用するための、請求項1〜12のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 癌の組合せ化学療法において使用するための、請求項1〜12のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 異なるHLA対立遺伝子を対象とする本発明の少なくとも2種の異なるポリペプチドを含むキットオブパーツ。
- 異なるMHC−ペプチド複合体を対象とする本発明の少なくとも2種の異なるポリペプチドを含むキットオブパーツ。
- エクスビボ又はインビボ画像処理における検出のための手段をさらに含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載のポリペプチドと、細胞増殖抑制又は殺腫瘍剤と、のコンジュゲート。
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