WO2019147092A1 - 스핑고신-1-포스페이트 유사체 및 이의 합성 방법 - Google Patents

스핑고신-1-포스페이트 유사체 및 이의 합성 방법 Download PDF

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WO2019147092A1
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sphingosine
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김용태
홍인석
김은진
전찬희
조성환
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주식회사 세종바이오메드
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    • C07C239/20—Hydroxylamino compounds or their ethers or esters having oxygen atoms of hydroxylamino groups etherified
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    • G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic

Definitions

  • S1P Sphingosine-1-Phosphate
  • Sphingosine-1-Phosphate is a kind of sphingolipid in the lysate and is also called D-erythro-Sphingosine-1-phosphate (D-erythro-Sphingosine-1-Phosphate).
  • S1P is produced by phosphorylation of sphingosine by sphingo-phosphorylase. Especially, it accumulates in platelets and is known to be released into the blood by the activation of platelets.
  • S1P may be a new therapeutic target for diagnosing and treating bone-related degenerative diseases such as osteoporosis and rheumatoid arthritis.
  • S1P is a marker for diagnosing various pathological ecological conditions, especially cancer, inflammation, angiogenesis, heart disease, asthma, and autoimmune diseases as well as bone related diseases, and furthermore, S1P can be a therapeutic target Research results are being reported. Therefore, in order to develop a kit for diagnosis of various diseases, it is required to develop an economical and efficient synthetic process for S1P or S1P analogue.
  • S1P-fluorescein S1P-fluorescein
  • S1P-TAMRA S1P and S1P analogs.
  • the preparation of the immunoassay kit involves fixing the S1P analogue to the plate or the support member, and the thiol-S1P disclosed in the patent specification of El Pas can not be directly bonded to the plate or the support member. Therefore, the thiol-S1P must be accompanied by a separate linker to be fixed to the plate or support member.
  • thiol-S1P is a separate linker, IOA (Iodoacetamide) or SMCC (Succinimidyl-4- (N (N) -maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate. Therefore, the manufacturing process of the immunoassay kit becomes complicated.
  • the present inventors have been studying S1P analogues useful for the preparation of immunoassay kits, And the S1P analogue which can be attached to the plate of the immunoassay kit and a method for synthesizing the same, and completed the present application.
  • One task to achieve by the present disclosure is to provide a new Sphingosine-1-Phosphate (S1P) analog.
  • Another object to be achieved by the contents disclosed by the present application is to provide a method for synthesizing a novel S1P analogue.
  • a further object to be achieved by the present disclosure is to provide new S1P analogues and / or methods of synthesis thereof.
  • S1P sphingosine-1-phosphate
  • the S1P analog is an S1P analog compound selected from the following compounds.
  • n is selected from integers from 2 to 13.
  • a method for synthesizing a novel S1P analog comprises the steps of: a) preparing a compound of Formula 4 by changing the hydroxyl group contained in the compound of Formula 3 to another functional group that is less reactive than the hydroxyl group; b) using the amino alcohol precursor from the compound of formula (4) to prepare a compound of formula (5); c) using a reducing agent from a compound of the formula (5) to prepare a compound of the formula (6); d) using an anhydride from the compound of formula (6) to prepare a compound of formula (7); e) converting the functional group introduced in step a) from the compound of formula (7) to a hydroxyl group to prepare a compound of formula (8); f) converting the hydroxyl group contained in the compound of formula (8) to a better leaving group than the hydroxyl group to prepare a compound of formula (9); g) converting the functional group introduced in step f) from the compound of formula
  • n is selected from an integer of 2 to 13]
  • a plate comprising: a plate; And a sphingosine-1-phosphate (S1P) analog selected from the compound of formula (1) immobilized on the plate.
  • S1P sphingosine-1-phosphate
  • S1P Sphingosine-1-Phosphate
  • a method for synthesizing a new S1P analogue can be provided. Furthermore, it becomes possible to provide a method for synthesizing S1P analogues having a higher economic efficiency and a higher yield.
  • the economically synthesized S1P analogue can be more easily applied to the immunoassay kit, thereby contributing to the immune diagnosis of S1P-related pathophysiological conditions.
  • FIG. 1 shows a Sphingosine-1-Phosphate (S1P) analog according to one embodiment.
  • Figure 2 shows S1P analogs of a particular chemical structure, according to one embodiment.
  • 3 shows a) process of the synthesis method of S1P analog according to one embodiment.
  • Fig. 4 shows a step b) of the synthesis method of S1P analog according to one embodiment.
  • FIG. 5 shows a step c) of the synthesis method of S1P analog according to one embodiment.
  • FIG. 6 shows a step d) of the method for synthesizing the S1P analog according to one embodiment.
  • Figure 7 shows e) process of the synthesis method of S1P analog according to one embodiment.
  • Figure 8 shows the process f) of the synthesis method of S1P analog according to one embodiment.
  • FIG. 10 shows a process h) of a method of synthesizing an S1P analog according to one embodiment.
  • Fig. 11 shows the process i) of the synthesis method of the S1P analog according to one embodiment.
  • FIG. 13 shows k) process of the synthesis method of S1P analog according to one embodiment.
  • Figure 14 illustrates the entire synthesis process of S1P analogs of a particular chemical structure, according to one embodiment.
  • FIGS 15 and 16 illustrate an immunoassay kit comprising an S1P analog according to one embodiment.
  • analogue refers to a compound having a chemical structure similar to that of a specific organic compound, for example, a part of atoms constituting a molecule is substituted, added or deleted by another element.
  • biomarker is an intracorporeal biochemical having specific molecular characteristics that makes it possible to measure the progress of a disease or the effect of treatment.
  • S1P is a biomarker for cancer, inflammation, angiogenesis, heart disease, asthma, autoimmune, or osteoporosis.
  • immunodiagnosis refers to the determination of the presence and degree of an antigen in a biological sample, which is diagnosed according to the test results obtained by immunological techniques.
  • methods known in the art may be used, for example, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), point-of-care testing (POCT) ), but are not limited thereto.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • POCT point-of-care testing
  • precipitation, agglutination, immunofluorescence staining, enzyme immunoassay, radioimmunoassay, and chemiluminescence immunoassay are used. But is not limited thereto.
  • antigenic determinant refers to a specific portion of an antigen that allows an immune system such as an antibody, B cell, T cell, etc. to identify the antigen.
  • separation means removing or diluting one or more other compounds from the active compound.
  • Compounds that can be removed or diluted during the separation or purification step include chemical reaction products, unreacted chemicals, proteins, carbohydrates, lipids and unbound molecules.
  • &quot about " is used to refer to a reference quantity, level, value, number, frequency, percentage, dimension, size, quantity, Level, value, number, frequency, percent, dimension, size, quantity, weight or length of a variable, such as 4, 3, 2 or 1%.
  • Lipids and their derivatives are now recognized as important targets for medical research, not as a simple structural element in the cell membrane or as an energy source for [beta] -oxidation, corresponding action or other metabolic processes.
  • certain bioactive lipids serve as important signaling mediators in animal and human diseases.
  • Most lipids in the plasma membrane only play a structural role, very few of them play a role in delivering extracellular stimuli into the cells.
  • the lipid signaling pathway is activated by a variety of extracellular stimulators, including growth factors, inflammatory cytokines, and regulates cell fate determinations such as apoptosis, differentiation, and proliferation.
  • Lysolygia is a low molecular weight lipid containing a polar head and a single hydrocarbon backbone. With respect to the polar head at sn-3, the hydrocarbon chain may be located at the sn-2 and / or sn-1 position (s). These lipids represent signaling bioactive lipids, and their biological and medical significance is emphasized in that they can be achieved by targeting lipid signaling molecules for healing, diagnosis / prevention or research purposes. A specific example of medically important lysozyme is S1P (sphingoid skeleton).
  • lysozides include, but are not limited to, LPA (glycerol skeleton), sphingosine, lysophosphatidylcholine (LPC), sphingosylphosphorylcholine (resource fingol myelin), ceramides, ceramid-1-phosphate, sphinganine 1-phosphate, and N-acetyl-ceramide-1-phosphate.
  • LPA glycol skeleton
  • sphingosine lysophosphatidylcholine
  • LPC lysophosphatidylcholine
  • sphingosylphosphorylcholine source fingol myelin
  • ceramides ceramid-1-phosphate
  • sphinganine 1-phosphate sphinganine 1-phosphate
  • N-acetyl-ceramide-1-phosphate N-acetyl-ceramide-1-phosphate.
  • Sphingolipids are a group of lipids containing a backbone of sphingoid bases and containing a collection of aliphatic amino alcohols. Sphingolipids are the primary structural component of cell membranes that also act as cell signaling and regulatory molecules.
  • the structural backbone of S1P, dihydro-S1P (DHS1P) and sphingosylphosphorylcholine (SPC) is based on sphingosine derived from sphingomyelin.
  • Serum (CER), sphingosine (SPH) and sphingosine-1-phosphate (S1P) have been extensively studied in the sphingolipid signaling mediators and have recently been recognized for their role in cardiovascular, angiogenesis and tumor biology .
  • S1P Sphingosine-1-Phosphate
  • S1P receptors Extensive expression of cell surface S1P receptors allows S1P to affect cellular responses in a variety of spectra including proliferation, adhesion, contractility, motility, morphogenesis, differentiation, and survival. This response spectrum is dependent on the overlapping or unique expression pattern of the S1P receptor in the cell and tissue system. Control of various cell processes involving S1P has particular impact on neuronal signaling, vascular tone, wound healing, immune cell trafficking, reproduction, and cardiovascular function. Altering the endogenous levels of S1P in such systems may have adverse effects on inducing several pathophysiological conditions, including cancer, inflammation, angiogenesis, heart disease, asthma, and autoimmune diseases. Thus, S1P can be a biomarker that can diagnose various pathological ecological conditions, particularly the risk of developing cancer, inflammation, angiogenesis, heart disease, asthma, autoimmune, or bone related diseases.
  • the plate may be one element constituting the immunoassay kit, and may provide a space for storing biomarkers, buffers, and the like.
  • the plate may be made of a polymer material such as polystyrene, polypropylene, polycarbonate, or nylon, but is not limited thereto.
  • the plate may be composed of various synthetic polymers such as, but not limited to, nitrocellulose, cellulose, cellulose acetate, polyethylene, and the like.
  • the support member may be another component of the immunoassay kit.
  • the support member may directly or indirectly contact the plate to provide a support for supporting the biomarker S1P.
  • the support member may be composed of glass, polysaccharide, polyacrylamide, polystyrene, polyvinyl alcohol, silicone or protein molecules, but is not limited thereto.
  • S1P is a chemical structure with a hydrocarbon chain at sn-1 and a polar head at sn-3.
  • the polar head which is a major part of the S1P antigenic determinator, must be exposed.
  • the S1P immunoassay kit is required to be immobilized on the plate using the sn-2 or sn-1 moiety except for the polar head portion of the S1P analog. It is not easy to fix on the plate using the sn-2 or sn-1 part of the hydrocarbon chain of S1P in terms of reactivity. Therefore, a method of synthesizing S1P analogue which is easy to fix on the plate to use S1P as a biomarker, and fixing the analogue to the plate of the immunoassay kit should be used.
  • Alkoxyamines can form chemical bonds through chemical reactions with specific functional groups.
  • the alkoxyamine is highly reactive with an epoxy group and can form a chemical bond.
  • the alkoxyamine is highly reactive with a molecule having a carbonyl group to form a chemical bond to form a very stable oxime compound.
  • the molecule having the carbonyl group may be a molecule including, but not limited to, an aldehyde, a ketone, a carboxylic acid and derivatives thereof, an ester and an amide, and a ketene.
  • the S1P-alkoxyamine compound can be provided for the manufacture of immunodiagnostic kits.
  • a method of synthesizing a novel S1P analog is provided.
  • an S1P analog particularly a S1P-alkoxyamine, from a 1-alkane-n-ol (HCC (CH 2 ) n -OH).
  • a method for synthesizing S1P analogs specifically S1P-alkoxyamine, from 1-alkane-n-ol (HCC (CH 2 ) n -OH) 2 ) n -OH), which is a S1P analogue,
  • step e) converting the functional group introduced in step a) from the compound of formula (7) to a hydroxyl group to prepare a compound of formula (8);
  • step f) converting the functional group introduced in step f) from the compound of formula 9 to form a compound of formula 10;
  • the step a) is a step of preparing a compound of the following formula (4) by changing the hydroxyl group contained in the compound of the following formula (3) to another functional group having a lower reactivity than the hydroxyl group.
  • Hydrogen in the hydroxyl group may be removed from the compound of formula (3) by the above-mentioned step a).
  • the hydrogen of the hydroxyl group in the compound of Formula 3 may be substituted with another functional group that is less reactive than the hydroxyl group by the process a) to prepare the compound of Formula 4.
  • the hydrogen of the hydroxyl group may be substituted with a hydroxyl group protecting group to prepare the compound of Formula 4.
  • the above step a) is for protecting the oxygen atom at the sn-1 position of the hydrocarbon chain during the steps to be described later.
  • the hydroxyl group protecting group may have a lower reactivity than the hydroxyl group for the processes described below.
  • the hydroxyl group protecting group may be protected by the compound used in step e)
  • the silyl protecting group may be substituted again with a hydrogen atom.
  • the hydroxy is less reactive than the other functional groups are hydroxyl groups tert - butyl-diphenyl-silyl ether (tert -Butyldiphenylsilyl ether) and triisopropyl silyl ether reel (triisopropylsilyl ether) - butyl-dimethyl-silyl ether (tert -Butyldimethylsilyl ether), tert And at least one selected from the group consisting of.
  • Other functional groups having smaller reactivity than the hydroxyl group may be used in an amount of 1 to 4 equivalents, but are not limited thereto.
  • the step b) is a step of preparing a compound of the following formula (5) using the amino alcohol precursor from the compound of the formula (4) (FIG. 4).
  • Hydrogen linked to the carbon triple bond in the compound of formula (IV) may be removed by step b) above.
  • hydrogen connected to the carbon triple bond may be substituted with an amino alcohol precursor to prepare the compound of formula (5).
  • the step b) is for providing an amino alcohol precursor at the sn-3 position of the hydrocarbon chain during the steps described below.
  • the step b) is to provide the aminoalcohol by the steps described below.
  • the aminoalcohol precursor may be changed to aminoalcohol by the compound used in step h) .
  • hydrogen connected to the carbon triple bond at the sn-3 position of the hydrocarbon chain of the compound of formula (4) may provide an aminoalcohol precursor in steps c) through g).
  • the amino alcohol precursor may be a compound having a structure in which N of the amino alcohol comes forward and a structure in which a hydroxyl group is rearward.
  • the amino alcohol precursor may be Garner's aldehyde represented by the following formula (13).
  • an organic lithium compound may be used together with the amino alcohol precursor.
  • the organic lithium compound includes at least one selected from the group consisting of n-butyllithium, sec-butyllithium, and tert -butyllithium.
  • the organic lithium compound may be used in an amount of 1 to 4 equivalents, but is not limited thereto.
  • the step c) is a step of preparing a compound of the following formula (6) from the compound of the formula (5) using a reducing agent (Fig. 5).
  • the carbon triple bond in the compound of Formula 5 may be changed to a carbon double bond by the process c).
  • the compound of Formula 5 may be prepared by introducing hydrogen into the carbon triple bond in the compound of Formula 5 by the process c).
  • the carbon triple bond in the compound of Formula 5 may be reduced to produce the compound of Formula 6 having a carbon double bond.
  • a reducing agent may be used to reduce the carbon triple bond.
  • the reducing agent may be a reagent for reducing the carbon triple bond to a carbon double bond while retaining a structure in which N at the sn-3 position is forward and a structure in which the hydroxyl group is backward.
  • the step c) is for providing a carbon double bond form to the hydrocarbon chain during the steps to be described later.
  • the reducing agent may be red-Al (sodium bis (2-methoxyethoxy) aluminum hydride; NaAlH 2 (OCH 2 CH 2 OCH 3 ) 2 )
  • Step d) is a step of preparing a compound of formula (7) using an anhydride from the compound of formula (6) (Fig. 6).
  • Hydrogen may be removed from the hydroxyl group bonded to the carbon atom 3 in the compound of Formula 6 by the above-mentioned Step d).
  • Hydrogen of the hydroxyl group bonded to carbon number 3 in the compound of formula (6) may be acetylated by the above step d).
  • step d) the hydrogen of the hydroxyl group bonded to the carbon atom 3 in the compound of formula 6 may be substituted with an acetyl group to prepare the compound of formula 7.
  • the hydrogen of the hydroxyl group may be acetylated by the anhydride provided with pyridine to produce the compound of Formula 7.
  • the step d) may have a characteristic that the carbon number 3 at the carbon number 3 is lower than that of the hydroxyl group. Further, as described in step h), the step d) The acetyl group may be further substituted with a hydrogen atom.
  • the anhydride includes at least one selected from the group consisting of acetic anhydride and acetyl halide (CH 3 -CO-X).
  • the anhydride compound may be used in an amount of 10 to 20 equivalents, but is not limited thereto.
  • X is selected from a halogen atom.
  • Step e) is a step of preparing a compound of the following formula (8) by changing the functional group introduced in the step a) to a hydroxyl group from the compound of the formula (7).
  • the hydroxyl group protecting group may be removed from the compound of formula (7) by the above step e).
  • the compound of Formula 8 may be prepared by substituting a hydroxyl group protecting group with a hydrogen atom in Step e).
  • the hydroxyl group protecting group may be substituted with a hydrogen atom to produce the compound of Formula 8 having a hydroxyl group at sn-1 of the hydrocarbon chain.
  • Step e) is for providing a hydroxyl group in step f) described later.
  • the hydroxyl group may have a higher reactivity than the hydroxyl group protecting group for the processes described below. Further, as described in detail in the step f), the hydroxyl group may be protected by the compound used in the step f) The lock group can be replaced again.
  • the hydroxyl group protecting group at the sn-1 position of the hydrocarbon chain of the compound of the formula (7) is substituted with the hydroxyl group at the sn-1 position of the compound of the formula (8) and is provided in the process described below.
  • the step e) may use a compound containing at least one selected from the group consisting of KF, CsF, HF, and n-Bu 4 NF.
  • the compound may be used in an amount of 5 to 10 equivalents, but is not limited thereto.
  • the step f) is a step of preparing a compound of the following formula (9) by changing the hydroxyl group contained in the compound of the formula (8) to a leaving group better than the hydroxyl group.
  • the hydroxyl group may be removed from the compound of formula (8) by the above step (f).
  • the compound of formula (9) can be prepared by substituting the hydroxyl group of the compound of formula (8) with another functional group having a better function as a leaving group.
  • the good leaving group is a functional group that performs a nucleophilic reaction better than a hydroxyl group.
  • the hydroxyl group may be substituted with a better leaving group to prepare the compound of formula (9).
  • the step f) is for imparting a functional group which is more prone to nucleophilic reaction than the hydroxyl group at the sn-1 position of the hydrocarbon chain during the course of the processes described below.
  • the good leaving group may have a better leaving group as compared to the hydroxyl group for the processes described below and will be described in detail in step g), but the good leaving group is removed by the compound used in step g) .
  • the hydroxyl group at the sn-1 position of the hydrocarbon chain of the compound of Formula 8 is substituted with a good leaving group at the sn-1 position of the compound of Formula 9, and is provided in the process described below.
  • Good leaving more hydroxyl groups of the above-mentioned step f) group is para-toluene sulfonic acid (p -toluenesulfonate), methanesulfonic acid (methanesulfonate), para-nitrobenzoate (p -nitrobenzoate), para-nitrobenzene-sulfonic acid (p - nitrobenzenesulfonate, p-bromobenzenesulfonate, and trifluoromethanesulfonate.
  • the term " hydroxymethanesulfonate " The functional group may be used in an amount of 10 to 30 equivalents, but is not limited thereto.
  • the step g) is a step of preparing a compound of the following formula (10) by changing the functional group introduced in the step f) from the compound of the formula (9).
  • the compound that alters the functional group introduced in step g) may be an N-Boc-hydroxylamine compound of formula (16).
  • a good leaving group in the compound of the formula (9) can cause a nucleophilic reaction with an N-Boc-hydroxylamine compound.
  • the N-Boc-hydroxylamine can be used in combination with DBU (1,8-Diazabicyclo [5.4.0] undec-7-ene).
  • the DBU can provide the function of activating the hydroxyl group of N-Boc-hydroxylamine.
  • the good leaving group at the sn-1 position in the compound of formula (9) can be replaced with O-N-Boc to prepare the compound of formula (10).
  • Step g) is to provide 0-NH-Boc at the sn-1 position of the hydrocarbon chain during the course of the processes described below.
  • the 0-NH-Boc serves to provide a precursor of an amine, more specifically a precursor of an alkoxyamine, to the processes described below, and also to a compound used in step k)
  • the 0-NH-Boc may be substituted with an alkoxyamine.
  • the compound of formula (9) is substituted for 0-NH-Boc at the sn-1 position of the formula (10) in the sn-1 position of the hydrocarbon chain.
  • the step h) is a step of reacting the compound of formula 10 with tetrahydrofuran (THF) and hydrochloric acid to prepare a compound of formula (2) (FIG. 10).
  • the amino alcohol precursor may be changed in the compound of formula (10) by the step h).
  • the compound of formula (10) can be prepared by changing the amino alcohol precursor to the amino alcohol in step (h).
  • the compound of formula (10) can be prepared by changing the acetonide to the aminoalcohol in the compound of formula (10) by the step h).
  • Boc can be removed from the compound of formula (10) by the step h).
  • step (h) Boc in the compound of formula (10) may be substituted with a hydrogen atom to prepare the compound of formula (11).
  • the amino alcohol precursor may be reduced in the compound of Formula 10 to prepare the compound of Formula 11 having amino alcohol at the sn-3 position.
  • the step h) may provide the amino alcohol at the sn-3 position during the course of the processes described below.
  • step i) a part of the hydrogen atoms of the aminoalcohol in step i) .
  • amino alcohol precursor at the sn-3 position of the hydrocarbon chain of the compound of formula (10) is substituted with the amino alcohol at the sn-3 position of the formula (11), and is provided in the process described below.
  • n is selected from integers from 2 to 13.
  • the step i) is a step of preparing a compound of the following general formula (11) by changing an amine group contained in the compound of the general formula (2) to another functional group less reactive than the amine group.
  • step i) one hydrogen atom of the amine group at the sn-1 position and the amine group connected to the 2-carbon atom in the compound of the general formula (2) are removed.
  • the compound of Formula 11 may be prepared by substituting Boc for an amine group linked to the carbon atom 2 and a hydrogen atom of the amine group at the sn-1 position in the compound of Formula 2 by the process i).
  • the reactivity may be smaller than the amine group.
  • the Boc may function as an amine group protecting group.
  • the amine group connected to the carbon atom 2 and the hydrogen atom of the amine group at the sn-1 position may be substituted with another functional group that is less reactive than the hydrogen atom to prepare the compound of Formula 11.
  • the amine group connected to the carbon atom 2 and the hydrogen atom of the amine group at the sn-1 position may be substituted with the Boc to prepare the compound of Formula 11.
  • Said step i) is intended to protect the amine group at the 2-carbon and the amine group at the sn-1 position during the course of the processes described below.
  • the amine group protecting group may have a lower reactivity than the amine group in the processes described below. Further, as described in detail in process k), the amine group protecting group may be further substituted with hydrogen Lt; / RTI >
  • the amine group at the 2-carbon atom of the hydrocarbon chain of the compound of formula 2 and the amine group at the sn-1 position can be protected from step j).
  • step i) group is di - tert - butyl dicarbonate (di- tert -butyl dicarbonate; Boc 2 O), 9- fluorenyl-methyl-carbamate (9-fluorenylmethyl carbamate), tert t-butyl carbamate (tert -butyl carbamate), carbamate (benzyl carbamate), acetamide (acetamide), triple ruro acetamide (trifluoroacetamide), phthalimide (phthalimide), benzyl amine (benzylamine), triphenyl methylamine (triphenylmethylamine), benzylidene amine (benzylideneamine) and para-toluene sulfonamide may include at least one selected from the group consisting of (p -toluenesulfonamide). Other functional groups having smaller reactivity than the amine group may be used in an amount
  • yet another method of synthesizing an S1P analog, specifically a S1P-alkoxyamine is provided.
  • a process for preparing a sphingosine-1-phosphate analogue further comprising preparing a compound of formula (12) from a compound of formula (11) using a phosphonate ester do.
  • the step (j) is a step of preparing a compound of the following formula (12) using a phosphonate ester from the compound of the formula (11) (FIG. 12).
  • Hydrogen in the hydroxyl group at the sn-3 position in the compound of the formula (11) can be removed by the above step j).
  • Hydrogen in the hydroxyl group linked to carbon number 1 in the compound of formula (11) can be removed by the above step (j).
  • the hydrogen of the hydroxyl group at the sn-3 position in the compound of the formula (11) can be replaced with PO (OR 1,2 ) 2 by the process j) to prepare the compound of the formula (12).
  • the hydrogen of the hydroxyl group at the sn-3 position may be substituted with PO (OR 1,2 ) 2 to prepare the compound of Formula 12.
  • the step j) is for providing a phosphonic acid ester at the sn-3 position of the hydrocarbon chain during the processes described below.
  • the phosphonic acid ester can provide phosphate for the processes described below and, as will also be described in detail in process k), by the compound used in process k), the moiety of the phosphonic acid ester can be replaced by a hydrogen atom have.
  • N-methylimidazole represented by the following formula (17) may be used together with the phosphonic acid ester in the above step j).
  • the NMI can be used as a base to activate a hydroxyl group attached to carbon number 1.
  • the phosphonic acid ester may include at least one selected from the group consisting of a phosphonate ester (R 3 PO (OR 1,2 ) 2 ) represented by the following general formula (18).
  • the phosphonic acid ester compound may be used in an amount of 2 to 20 equivalents, but is not limited thereto.
  • R 3 is halogen, HSO 4, and a para except fluorine-is selected from toluene sulfonic acid (p -toluenesulfonate);
  • R 1,2 are selected from H or an alkyl group of 1 to 7 carbon atoms.
  • yet another method of synthesizing an S1P analog, specifically a S1P-alkoxyamine is provided.
  • k a process for preparing a sphingosine-1-phosphate analogue further comprising a step of preparing a compound represented by the following formula (1) by replacing the O-acyl group in the compound of formula (12) with a hydrogen atom do.
  • Step k) is a step of preparing a compound represented by the following formula (1) by changing an O-acyl group included in the compound of formula (12) to a hydrogen atom.
  • the O-acyl group contained in the compound of formula (12) can be removed by the above step k).
  • the O-acyl group may be substituted with a hydrogen atom to prepare the compound of formula (13).
  • the O-acyl group is Boc at the Boc bonding at the OR 1 , OR 2 , 2 carbon of the phosphonic acid ester and Boc at the sn-1 position.
  • OR < 1 > and OR < 2 > of the phosphonic acid ester are substituted with hydrogen atoms to provide a phosphate at the sn-3 position of the compound 13.
  • Boc in the position 2 and Boc in the sn-1 position are substituted with hydrogen atoms to provide an amine at the 2-carbon atom of the compound 13 and an alkoxyamine group at the sn-1 position.
  • the O-acyl group of formula (12) provides phosphate at the sn-3 position of the compound 13, an amine group at the carbon number 2, and an alkoxyamine group at the sn-1 position.
  • the reaction for converting the O-acyl group into a hydrogen atom may be carried out by using trimethylsilyl bromide (Me 3 SiBr), tribromoborane (BBr 3 ), hydrobromic acid (HBr) and dimethylformamide
  • the compound which alters the O-acyl group to a hydrogen atom may be used in an amount of 5 to 15 equivalents.
  • a compound that converts the O-acyl group to a hydrogen atom can be used together with water.
  • n is selected from integers from 2 to 13]
  • a method for synthesizing a sphingosine analog specifically a sphingosine-alkoxyamine, from a 1-alkane-n-ol (HCC (CH 2 ) n -OH) .
  • a method for synthesizing a sphingosine analog specifically a sphingosine-alkoxyamine, from a 1-alkane-n-ol (HCC (CH 2 ) n -OH) (CH 2 ) n -OH) from the compound of formula (3) as a sphingosine analogue,
  • step e) preparing a compound of formula 8 by converting the functional group introduced in step a) to a hydroxyl group from the compound of formula 7;
  • new sphingosine-1-phosphate (S1P) analog compounds are provided.
  • S1P sphingosine-1-phosphate
  • a sphingosine analog specifically a sphingosine-alkoxyamine of the formula (2).
  • n is selected from an integer of 2 to 13]
  • the novel S1P analogues disclosed herein are characterized by having an alkoxyamine group at sn-1.
  • the alkoxyamine group is hydrophilic and has a chemical characteristic that is a functional group having high oxidation degree. Accordingly, the S1P-alkoxyamine, a new S1P analogue disclosed herein, is water soluble and has little or no additional oxidation in the air, resulting in high stability against oxidation in air.
  • the alkoxyamine group may form a bond with a specific functional group that specifically or selectively performs a chemical reaction.
  • the specific functional group includes, but is not limited to, an epoxy group, a carbonyl group, and the like.
  • the carbonyl group may include, but is not limited to, aldehydes, ketones, carboxylic acids and derivatives thereof, esters and amides, ketenes, and the like. Accordingly, the S1P-alkoxyamine, a new S1P analogue disclosed herein, can form a bond with a specific functional group which specifically or selectively performs a chemical reaction.
  • an S1P analogue improved in water solubility and stability against oxidation in air. Also provided are S1P analogs capable of forming a bond with a specific functional group that specifically or selectively chemically reacts with an alkoxyamine.
  • an immunoassay kit comprising S1P analogs, as new S1P analog compounds and / or methods of synthesizing them.
  • an immunoassay kit comprising an S1P analog, specifically a S1P-alkoxyamine.
  • an immunoassay kit comprising a sphingosine-1-phosphate analog selected from a compound of formula 1 that is immobilized on the plate.
  • n is selected from integers from 2 to 13.
  • the plate may be one in which S1P is applied.
  • the plate may be made of a polymer material of polystyrene, polypropylene, polycarbonate, or nylon, but is not limited thereto.
  • the plate may be composed of various synthetic polymers such as, but not limited to, nitrocellulose, cellulose, cellulose acetate, polyethylene, and the like.
  • the plate may have a functional group capable of reacting with the alkoxyamine group of the S1P analog.
  • the functional groups include, but are not limited to, an epoxy group, a carbonyl group, and the like.
  • the carbonyl group may include, but is not limited to, aldehydes, ketones, carboxylic acids and derivatives thereof, esters and amides, ketenes, and the like.
  • the plate can directly and / or indirectly immobilize the S1P analog.
  • the plate comprises a functional group, and the alkoxyamine group of the functional group and the S1P analog may form a bond through a chemical reaction.
  • the S1P analog may be immobilized directly and / or indirectly on the plate comprising the functional group.
  • the S1P-alkoxyamine compound may be immobilized directly and / or indirectly to the epoxidized plate.
  • the S1P-alkoxyamine compound can be immobilized directly and / or indirectly on a plate comprising a carbonyl group.
  • An immunoassay kit comprising a sphingosine-1-phosphate analog selected from compounds of formula (1) immobilized on said plate,
  • An immunoassay kit further comprising a support member is provided.
  • the support member may serve to mediate the S1P analogue with the plate.
  • the support member may have a structure in contact with the plate.
  • the support member may be in contact with the S1P analog.
  • the support member may be of a structure that is in direct and / or indirect contact with the plate.
  • the support member may be of a structure that is in direct and / or indirect contact with the S1P analog.
  • the support member may be composed of glass, polysaccharide, polyacrylamide, polystyrene, polyvinyl alcohol, silicone or protein molecules, but is not limited thereto.
  • the support member may preferably be a polyacrylamide or protein molecule.
  • the support member may more preferably be a protein molecule.
  • the support member may have a functional group capable of reacting with the alkoxyamine group of the sphingosine-1-phosphate analog.
  • the functional groups include, but are not limited to, an epoxy group, a carbonyl group, and the like.
  • the carbonyl group may include, but is not limited to, aldehydes, ketones, carboxylic acids and derivatives thereof, esters and amides, ketenes, and the like.
  • the support member may be in physical or chemical contact with the plate.
  • the support member may fix the S1P analog directly and / or indirectly.
  • the support member includes a functional group, and the alkoxyamine group of the functional group and the S1P analog may form a bond through a chemical reaction.
  • the S1P analog can be directly and / or indirectly fixed to the support member comprising the functional group.
  • the S1P-alkoxyamine compound can be directly fixed to the epoxidized support member.
  • the S1P-alkoxyamine compound may be fixed directly and / or indirectly to a support member comprising a carbonyl group.
  • the support member may be in contact with the plate.
  • the support member may indirectly fix the S1P analog to the plate through contact with the plate.
  • the immunoassay kit may be, but is not limited to, an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit or a point-of-care testing (POCT) kit.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • POCT point-of-care testing
  • the ELISA includes direct ELISA, indirect ELISA, sandwich ELISA, and competitive ELISA.

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Abstract

본 명세서는 스핑고신-1-포스페이트(sphingosine-1-phosphate; S1P) 유사체 및 이의 합성 방법에 관한 것이다. 본 명세서에 의해 개시되는 내용에 따른 새로운 S1P 유사체는 알콕시아민기(alkoxyamine)로 인하여 수용성 및 안정성이 높다. 따라서, 면역 진단을 위한 키트 제작에 사용하는데 있어 이점이 있다.

Description

스핑고신-1-포스페이트 유사체 및 이의 합성 방법
본 명세서에 의해 개시되는 내용은 스핑고신-1-포스페이트(Sphingosine-1-Phosphate; S1P) 유사체 및 이의 합성 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로, S1P 유사체인 S1P-알콕시아민 화합물 및 이의 합성 방법에 관한 것이다.
스핑고신-1-포스페이트(Sphingosine-1-Phosphate; S1P)는 리소지질 중 스핑고지질의 일종으로, D-에리트로-스핑고신-1-포스페이트(D-erythro-Sphingosine-1-Phosphate)라고도 한다. S1P는 스핑고-인산화효소에 의한 스핑고신의 인산화로 생성된다. 특히 혈소판에 많이 축적하며, 혈소판의 활성화로 혈중에 방출되는 것으로 알려져 있다.
미 국립보건원 산하 국립 알레르기 및 감염증연구소 NIAID(National Institute of Allergy and Infectious Diseases)의 연구진은 논문을 통해 혈액 중의 S1P가 뼈의 생성과 파괴 간의 균형을 유지하는 데 중요한 역할을 한다고 발표하였다(Sphingosine-1-phosphate mobilizes osteoclast precursors and regulates bone homeostasis, Nature, Feb 8, 2009). 이는 S1P가 골다공증과 류마티스 관절염 등 뼈와 관련된 퇴행성질환을 진단 및 치료하는 새로운 치료 표적일 수 있음을 시사한다.
재단법인 아산사회복지재단에서는 S1P가 골절을 가지고 있는 개체에서 골 밀도와 무관하게 높은 수치로 나타남을 바탕으로 S1P를 포함하는 골절 또는 골다공증 발생 위험 예측용 마커 조성물에 관한 특허를 출원하여 등록 받은 바 있다(KR101486368B1).
현재 S1P는 골 관련 질환뿐 아니라 여러 병리생태학적 병태, 특히 암, 염증, 혈관신생, 심장 질환, 천식, 자가면역질환 발생 위험을 진단할 수 있는 마커가 되며, 나아가 S1P를 치료 표적으로 할 수 있다는 연구 결과가 보고되고 있다. 따라서, 다양한 질병의 진단을 위한 키트 개발을 위하여, S1P 또는 S1P 유사체에 대한 경제적이고 효율 높은 합성 공정에 대한 개발이 요구되는 실정이다.
종래에 echelon 사는 S1P 및 S1P 유사체인 S1P-플루오레세인(S1P-fluorescein), S1P-TAMRA를 제조하여 판매하고 있다. 또한, 엘파스사(Lpath, Inc.)는 US20070281320A1 특허를 통하여 S1P의 sn-1에 설프히드릴기, 카르복실산기, 시아노기, 에스테르, 하이드록시기, 알켄, 알킨, 산 클로라이드기, 또는 할로겐 원자를 가지는 S1P 유사체를 개시한다. 엘파스사의 특허 명세서에서 주된 S1P 유사체로 개시하고 있는 하기 화학식의 싸이올-S1P(thiolated-S1P)는 수용성이 낮아 유기용매 또는 열을 가해야 조작할 수 있고, 공기중에서 쉽게 산화되어 이황화결합(disulfide bond)을 형성하는 등의 화학적 성질 때문에 정제, 보관 및 사용이 용이하지 않다. 이에 따라, S1P를 이용한 면역 진단 키트에 이용하는 데 용이하지 않다.
[화학식]
Figure PCTKR2019001159-appb-I000001
또한, 면역 진단 키트 제작은 플레이트 또는 지지 부재에 S1P 유사체를 고정시키는 작업을 거치는 데, 종래 엘파스사의 특허 명세서에서 개시하고있는 싸이올-S1P는 플레이트 또는 지지 부재에 직접 결합될 수 없다. 따라서 싸이올-S1P는 플레이트 또는 지지부재에 고정되기 위하여 별도의 링커가 필수적으로 동반되어야 한다. 예를 들어, 싸이올-S1P는 지지부재로서 단백질 분자인 KLH(keyhole limpet hemocyanin) 또는 BSA(bovine serum albumin)에 고정되기 위하여, 별도의 링커인 IOA(Iodoacetamide) 또는 SMCC(Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate)가 필수적으로 동반되어야 한다. 따라서, 면역 진단 키트 제작 공정이 복잡해지는 단점이 있다.
이에 따라, 정제, 보관 및 사용이 용이한 S1P 유사체 화합물 및 상기 화합물을 대량 합성하는 방법의 출현이 요구되는 실정에서, 본 발명자들은 면역 진단 키트 제작에 유용한 S1P 유사체를 연구하던 중, 수용성 및 산화에 대한 안정성이 높으며, 별도의 링커가 없더라도 면역 진단 키트의 플레이트에 부착될 수 있는 S1P 유사체 및 그의 합성 방법을 확인하고, 본 출원을 완성하였다.
본 출원에 의해 개시되는 내용에 의해 달성하고자 하는 일 과제는, 새로운 스핑고신-1-포스페이트(Sphingosine-1-Phosphate; S1P) 유사체를 제공하는 것에 있다.
본 출원에 의해 개시되는 내용에 의해 달성하고자 하는 다른 과제는, 새로운 S1P 유사체의 합성 방법을 제공하는 것에 있다.
본 출원에 의해 개시되는 내용에 의해 달성하고자 하는 또 다른 과제는 새로운 S1P 유사체 및/또는 이들의 합성 방법의 용도를 제공하는 데 있다.
전술한 일 과제를 달성하기 위하여, 본 출원에 의해 개시되는 기술의 일 양태에 따르면, 새로운 스핑고신-1-포스페이트(sphingosine-1-phosphate; S1P) 유사체가 제공된다. 상기 S1P 유사체는 하기 화학식 1의 화합물로부터 선택되는 S1P 유사체 화합물이다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2019001159-appb-I000002
[상기 화학식 1에서, n은 2 내지 13의 정수로부터 선택된다.]
전술한 다른 과제를 달성하기 위하여, 본 출원에 의해 개시되는 기술의 다른 양태에 따르면, 새로운 S1P 유사체의 합성 방법이 제공된다. 상기 합성 방법은 a) 하기 화학식 3의 화합물에 포함된 하이드록실기를 상기 하이드록실기보다 반응성이 작은 다른 기능기로 변경하여 하기 화학식 4의 화합물을 제조하고; b) 하기 화학식 4의 화합물로부터 아미노알코올 전구 물질을 이용하여 하기 화학식 5의 화합물을 제조하고; c) 하기 화학식 5의 화합물로부터 환원제를 이용하여 하기 화학식 6의 화합물을 제조하고; d) 하기 화학식 6의 화합물로부터 무수화물을 이용하여 하기 화학식 7의 화합물을 제조하고; e) 하기 화학식 7의 화합물로부터 상기 a) 공정에서 도입된 기능기를 하이드록실기로 변경하여 하기 화학식 8의 화합물을 제조하고; f) 하기 화학식 8의 화합물에 포함된 하이드록실기를 상기 하이드록실기보다 좋은 이탈기로 변경하여 하기 화학식 9의 화합물을 제조하고; g) 하기 화학식 9의 화합물로부터 상기 f) 공정에서 도입된 기능기를 변경하여 하기 화학식 10의 화합물을 제조하고; h) 하기 화학식 10의 화합물로부터 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran; THF) 및 염산으로 반응시켜 하기 화학식 2의 화합물을 제조하는 것을 포함하는 하기 화학식 1의 화합물의 제조 방법이다. 상기 합성 방법에 의해 합성되는 S1P 유사체는 하기 화학식 1의 구조를 가진다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2019001159-appb-I000003
[화학식 2]
Figure PCTKR2019001159-appb-I000004
[화학식 3]
Figure PCTKR2019001159-appb-I000005
[화학식 4]
Figure PCTKR2019001159-appb-I000006
[화학식 5]
Figure PCTKR2019001159-appb-I000007
[화학식 6]
Figure PCTKR2019001159-appb-I000008
[화학식 7]
Figure PCTKR2019001159-appb-I000009
[화학식 8]
Figure PCTKR2019001159-appb-I000010
[화학식 9]
Figure PCTKR2019001159-appb-I000011
[화학식 10]
Figure PCTKR2019001159-appb-I000012
[상기 화학식 1 내지 화학식 10에서, n은 2 내지 13의 정수로부터 선택된다.]
전술한 또 다른 과제를 달성하기 위하여, 본 출원에 의해 개시되는 또 다른 양태에 따르면, 플레이트; 및 상기 플레이트에 고정되는 상기 화학식 1의 화합물로부터 선택되는 스핑고신-1-포스페이트(sphingosine-1-phosphate; S1P)유사체를 포함하는 면역 진단 키트가 제공된다.
본 명세서에 의해 개시되는 기술에 따르면, 다음과 같은 효과가 발생한다.
첫째, 새로운 스핑고신-1-포스페이트(Sphingosine-1-Phosphate; S1P) 유사체를 제공할 수 있다. 나아가, 보다 더 반응성이 좋고 수용성이 높은 S1P 유사체를 제공할 수 있게 된다.
둘째, 새로운 S1P 유사체의 합성 방법을 제공할 수 있다. 나아가, 보다 더 경제적이고 높은 수득률을 가지는 S1P 유사체의 합성 방법을 제공할 수 있게 된다.
셋째, 경제적으로 합성된 S1P 유사체를 면역 진단 키트에 보다 더 용이하게 적용할 수 있게 됨으로써, S1P 관련 병리생리학적 병태의 면역 진단에 기여할 수 있다.
도 1은 일 실시예에 따른 스핑고신-1-포스페이트(Sphingosine-1-Phosphate; S1P) 유사체를 나타낸다.
도 2는 일 실시예에 따른 특정 화학 구조의 S1P 유사체를 나타낸다.
도 3은 일 실시예에 따른 S1P 유사체의 합성 방법의 a) 공정을 나타낸다.
도 4는 일 실시예에 따른 S1P 유사체의 합성 방법의 b) 공정을 나타낸다.
도 5는 일 실시예에 따른 S1P 유사체의 합성 방법의 c) 공정을 나타낸다.
도 6은 일 실시예에 따른 S1P 유사체의 합성 방법의 d) 공정을 나타낸다.
도 7은 일 실시예에 따른 S1P 유사체의 합성 방법의 e) 공정을 나타낸다.
도 8은 일 실시예에 따른 S1P 유사체의 합성 방법의 f) 공정을 나타낸다.
도 9는 일 실시예에 따른 S1P 유사체의 합성 방법의 g) 공정을 나타낸다.
도 10은 일 실시예에 따른 S1P 유사체의 합성 방법의 h) 공정을 나타낸다.
도 11은 일 실시예에 따른 S1P 유사체의 합성 방법의 i) 공정을 나타낸다.
도 12는 일 실시예에 따른 S1P 유사체의 합성 방법의 j) 공정을 나타낸다.
도 13은 일 실시예에 따른 S1P 유사체의 합성 방법의 k) 공정을 나타낸다.
도 14는 일 실시예에 따른 특정 화학 구조의 S1P 유사체의 전체 합성 공정을 나타낸다.
도 15 및 도 16은 일 실시예에 따른 S1P 유사체를 포함하는 면역 진단 키트를 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 대표적인 용어에 대한 정의는 이하와 같다.
용어 "유사체(analogue)"는 특정 유기화합물과 화학적 구조가 유사한 화합물을 지칭하는 것으로, 예를 들어, 분자를 구성하는 원자의 일부가 다른 원소로 치환, 부가 또는 삭제된 것이다.
용어 "바이오마커"는 질환의 진행 또는 치료의 효과의 측정을 유용하게 하는, 특정 분자적 특성을 가진 체내 특이적 생화학물질이다. 예를 들어, S1P는 암, 염증, 혈관신생, 심장 질환, 천식, 자가면역, 또는 골다공증에 대한 바이오마커이다.
용어 "면역 진단(immunodiagnosis)"은 면역학적 기법으로 얻어낸 검사 성적에 따라 진단하는 것으로, 생물학적 시료에서 항원의 존재 여부와 정도를 확인하는 것을 의미한다. 면역 진단을 위하여는 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들어, 엘라이자(enzyme-linked immunosorbent assay, enzyme-linked immunospecific assay; ELISA), 현장현시검사(point-of-care testing; POCT)등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 침강법(precipitation), 응집법(agglutination), 면역형광염색법(immunofluorescence stain), 효소면역측정법(enzyme immunoassay), 방사면역측정법(radioimmunoassay), 화학발광면역측정법(chemiluminescence immunoassay) 등이 이용될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
용어 "항원결정기"는 항체, B세포, T세포등의 면역계가 항원을 식별하게 해 주는 항원의 특정한 부분을 의미한다.
용어 "분리" 또는 "정제"는 유효 화합물로부터 하나 이상의 다른 화합물을 제거하거나, 희석하는 것을 의미한다. 분리 또는 정제 단계 동안 제거 또는 희석될 수 있는 화합물 성분에는 화학적 반응 생성물, 미반응 화학물질, 단백질, 탄수화물, 지질 및 미결합 분자가 포함된다.
용어 '약'이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
이러한 용어들에 더하여, 필요한 경우 기타 용어들이 명세서 내의 다른 곳에서 정의된다. 본원에서 달리 명확하게 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 업계 용어들은 업계에서 인식하는 의미를 가질 것이다.
이하, 본 명세서에 의해 개시되는 내용을 상세히 설명한다.
생물활성 신호전달 지질
지질 및 그의 유도체는 세포막 내의 단순한 구조적 요소로서 또는 β-산화, 해당 작용 또는 그 밖의 대사 공정을 위한 에너지 공급원으로서가 아니라, 의학 연구를 위한 중요한 표적으로서 현재 인식되고 있다. 특히, 특정 생물 활성 지질은 동물 및 인간의 질환에서 중요한 신호전달 매개물로서 기능한다. 원형질 막의 대부분의 지질이 단지 구조적인 역할을 수행할 뿐이지만, 그들 중 아주 극소수는 세포 외 자극을 세포 내로 전달하는 역할을 수행한다. 지질 신호전달 경로는 성장 인자, 염증성 시토카인을 포함하는 다양한 세포 외 자극 인자에 의해 활성화되며, 세포자멸, 분화 및 증식과 같은 세포 운명 결정을 조절한다.
리소지질
리소지질은 극성 헤드 및 단일 탄화수소 골격을 함유하는 저분자량 지질이다. sn-3에서의 극성 헤드와 관련하여, 탄화수소쇄는 sn-2 및/또는 sn-1 위치(들)에 위치할 수 있다. 이들 지질은 신호전달 생물 활성 지질을 대표하며, 이들의 생물학적 및 의학적 중요성은 치유, 진단/예방 또는 연구 목적으로 지질 신호전달 분자를 표적화하는 것에 의해 달성될 수 있다는 점에서 강조된다. 의학적으로 중요한 리소지질의 특정 예는 S1P (스핑고이드 골격)이다. 그 밖의 리소지질에는 LPA (글리세롤 골격), 스핑고신, 리소포스파티딜콜린 (LPC), 스핑고실포스포릴콜린 (리소스핑고미엘린), 세라미드, 세라미드-1-포스페이트, 스핑가닌 (디히드로스핑고신), 디히드로스핑고신-1-포스페이트 및 N-아세틸-세라미드-1-포스페이트가 포함된다.
스핑고지질
스핑고지질은 스핑고이드염기의 백본(backbone)을 포함하며, 지방족 아미노알코올의 집합체를 함유하는 지질군이다. 스핑고지질은 세포 신호전달 및 조절 분자로서 또한 작용하는 세포막의 1차적인 구조적 성분이다. S1P, 디히드로-S1P(DHS1P) 및 스핑고실포스포릴콜린(SPC)의 구조적 골격은 스핑고미엘린으로부터 유래된 스핑고신을 기반으로 한다. 스핑고지질 신호전달 매개물인 세라미드(CER), 스핑고신(SPH) 및 스핑고신-1-포스페이트(S1P)가 가장 광범위하게 연구되었고, 최근에는 심혈관계, 혈관신생 및 종양 생물학에서의 이의 역할이 인정되었다.
스핑고신-1-포스페이트 (Sphingosine-1-Phosphate; S1P)
세포 표면 S1P 수용체의 광범위한 발현은 S1P가 증식, 부착, 수축, 운동성, 형태 발생, 분화, 및 생존을 비롯한 다양한 스펙트럼의 세포 반응에 영향을 미치도록 한다. 이러한 반응 스펙트럼은 세포 및 조직 시스템 내의 S1P 수용체의 중첩된 또는 독특한 발현 패턴에 좌우된다. S1P를 수반하는 다양한 세포 프로세스의 조절은 특히 뉴런 신호전달, 혈관 긴장도, 상처 치유, 면역 세포 트래피킹(trafficking), 생식, 및 심혈관 기능에 대한 특별한 영향이 있다. 이러한 시스템 내의 S1P의 내인성 수준의 변경은 암, 염증, 혈관신생, 심장 질환, 천식, 및 자가면역 질환을 비롯하여 여러 병리생리학적 병태를 유도하는 악영향이 있을 수 있다. 따라서, S1P는 여러 병리생태학적 병태, 특히 암, 염증, 혈관신생, 심장 질환, 천식, 자가면역, 또는 골 관련 질환 발생 위험을 진단할 수 있는 바이오마커가 될 수 있다.
바이오마커로써 활용가능성이 높은 S1P를 이용하여 면역 진단 키트를 제조하기 위해서는, 키트를 구성하는 플레이트 또는 플레이트에 부착된 지지 부재에 S1P를 고정(fix, attach)시킬 필요가 있다. 상기 플레이트는 면역 진단 키트를 구성하는 일 요소로써, 바이오 마커와 완충액 등이 담기는 공간을 제공해 주는 것일 수 있다. 상기 플레이트는 폴리스티렌, 폴리프로피렌, 폴리카보네이트, 또는 나일론과 같은 고분자 물질로 구성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 플레이트는 나이트로 셀룰로우즈, 셀룰로우즈, 셀룰로우즈 아세테이트, 폴리에틸렌 등의 각종 합성 중합체로 구성될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 지지 부재는 면역 진단 키트를 구성하는 다른 요소일 수 있다. 상기 지지 부재는 플레이트와 직접적 또는 간접적으로 접촉하여 바이오 마커인 S1P가 고정될 수 있도록 지지체의 역할을 제공해 주는 것일 수 있다. 상기 지지 부재는 유리, 다당류, 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐 알코올, 실리콘 또는 단백질 분자로 구성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
S1P는 sn-1에 탄화수소쇄, sn-3에 극성 헤드를 가지는 화학 구조이다. S1P를 이용한 면역 진단을 수행하기 위해서, S1P 항원결정기의 주요 부분인 극성 헤드는 노출시켜야 한다. 따라서, S1P 면역 진단 키트는 S1P 유사체의 극성 헤드 부위를 제외한 sn-2 또는 sn-1 부분을 이용하여 플레이트에 고정할 것이 요구된다. S1P의 sn-2 또는 sn-1 부분의 탄화수소쇄를 이용하여 플레이트에 고정시키는 것은 반응성의 측면에서 용이하지 않다. 따라서, S1P를 바이오마커로 사용하기 위해서 플레이트에 고정시키는 것이 용이한 S1P 유사체를 별도로 합성하여, 해당 유사체를 면역 진단용 키트의 플레이트에 고정시키는 방법을 사용하여야 한다.
알콕시아민은 특정 기능기와 화학 반응을 통해 화학 결합을 형성할 수 있다. 예를 들어, 상기 알콕시아민은 에폭시기와 반응성이 높아, 화학 결합을 형성할 수 있다. 예를 들어, 상기 알콕시아민은 카보닐기를 가진 분자와 반응성이 높아, 화학 결합을 형성하여 매우 안정한 옥심 화합물을 형성할 수 있다. 상기 카보닐기를 가진 분자는 알데하이드, 케톤, 카복실산과 그 유도체인 에스터와 아마이드, 및 케텐 등을 포함하는 분자일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 따라서, S1P-알콕시아민 화합물은 면역 진단용 키트의 제조에 제공될 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 일 양태에 따르면, 새로운 S1P 유사체의 합성 방법이 제공된다.
본 명세서에 의해 개시되는 일 실시예에 따르면 1-알카인-n-올(HCC(CH2)n-OH)로부터 S1P 유사체, 구체적으로는 S1P-알콕시아민을 합성하는 방법이 제공된다.
예를 들어, 1-알카인-n-올(HCC(CH2)n-OH)로부터 S1P 유사체, 구체적으로는 S1P-알콕시아민을 합성하는 방법은 1-알카인-n-올(HCC(CH2)n-OH)인 하기 화학식 3의 화합물로부터 S1P 유사체인 하기 화학식 1의 S1P-알콕시아민을 합성하는 방법으로써,
a) 하기 화학식 3의 화합물에 포함된 하이드록실기를 상기 하이드록실기보다 반응성이 작은 다른 기능기로 변경하여 하기 화학식 4의 화합물을 제조하고;
b) 하기 화학식 4의 화합물로부터 아미노알코올 전구 물질을 이용하여 하기 화학식 5의 화합물을 제조하고;
c) 하기 화학식 5의 화합물로부터 환원제를 이용하여 하기 화학식 6의 화합물을 제조하고;
d) 하기 화학식 6의 화합물로부터 무수화물을 이용하여 하기 화학식 7의 화합물을 제조하고;
e) 하기 화학식 7의 화합물로부터 상기 a) 공정에서 도입된 기능기를 하이드록실기로 변경하여 하기 화학식 8의 화합물을 제조하고;
f) 하기 화학식 8의 화합물에 포함된 하이드록실기를 상기 하이드록실기보다 좋은 이탈기로 변경하여 하기 화학식 9의 화합물을 제조하고;
g) 하기 화학식 9의 화합물로부터 상기 f) 공정에서 도입된 기능기를 변경하여 하기 화학식 10의 화합물을 제조하고; 및
h) 하기 화학식 10의 화합물로부터 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran; THF) 및 염산으로 반응시켜 하기 화학식 2의 화합물을 제조하는 것을 포함하는
하기 화학식 1의 스핑고신-1-포스페이트 유사체의 제조 방법이다.
상기 공정 a)는 하기 화학식 3의 화합물에 포함된 하이드록실기를 상기 하이드록실기보다 반응성이 작은 다른 기능기로 변경하여 하기 화학식 4의 화합물을 제조하는 공정이다(도 3).
상기 공정 a)에 의해 상기 화학식 3의 화합물에서 하이드록실기의 수소가 제거될 수 있다.
상기 공정 a)에 의해 상기 화학식 3의 화합물에서 하이드록실기의 수소가 상기 하이드록실기보다 반응성이 작은 다른 기능기로 치환되어 상기 화학식 4의 화합물이 제조될 수 있다.
상기 화학식 3의 화합물에서 하이드록실기의 수소는 하이드록실기 보호기로 치환되어 상기 화학식 4의 화합물이 제조될 수 있다.
상기 공정 a)는 후술하는 공정들에 진행되는 도중 상기 탄화수소쇄의 sn-1 위치에 있는 산소 원자를 보호하기 위한 것이다.
상기 하이드록실기 보호기는 후술하는 공정들에 대해서 하이드록실기에 비하여 반응성이 더 낮은 특징을 가질 수 있으며, 아울러, 공정 e)에서 구체적으로 설명하겠지만, 공정 e)에서 사용되는 화합물에 의하여 상기 하이드록실기 보호기는 다시 수소 원자로 치환될 수 있다.
이로써, 상기 화학식 3의 화합물의 탄화수소쇄의 sn-1 위치에 있는 하이드록실기가 공정 b) 내지 공정 d)로부터 보호될 수 있다.
상기 하이드록실기보다 반응성이 작은 다른 기능기는 tert-부틸다이메틸실릴 에테르(tert-Butyldimethylsilyl ether), tert-부틸다이페닐실릴 에테르(tert-Butyldiphenylsilyl ether) 및 트리이소프로필릴실릴 에테르(triisopropylsilyl ether)로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 포함한다. 상기 하이드록실기보다 반응성이 작은 다른 기능기는 1 내지 4 당량 사용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
[화학식 3]
Figure PCTKR2019001159-appb-I000013
[화학식 4]
Figure PCTKR2019001159-appb-I000014
상기 공정 b)는 상기 화학식 4의 화합물로부터 아미노알코올 전구 물질을 이용하여 하기 화학식 5의 화합물을 제조하는 공정이다(도 4).
상기 공정 b)에 의해 상기 화학식 4의 화합물에서 탄소 삼중 결합에 연결된 수소가 제거될 수 있다.
상기 화학식 4의 화합물에서 탄소 삼중 결합에 연결된 수소는 아미노알코올 전구 물질로 치환되어 상기 화학식 5의 화합물이 제조될 수 있다.
상기 공정 b)는 후술하는 공정들에 진행되는 도중 상기 탄화수소쇄의 sn-3 위치에 아미노알코올 전구 물질을 제공하기 위한 것이다.
상기 공정 b)는 후술하는 공정들에 의해 아미노알코올을 제공하기 위한 것으로, 공정 h)에서 구체적으로 설명하겠지만, 공정 h)에서 사용되는 화합물에 의하여 상기 아미노알코올 전구 물질은 아미노알코올로 변경될 수 있다.
이로써, 상기 화학식 4의 화합물의 탄화수소쇄의 sn-3 위치에 있는 탄소 삼중 결합에 연결된 수소가 공정 c) 내지 공정 g)에 아미노알코올 전구 물질을 제공할 수 있다.
상기 아미노알코올 전구 물질은 아미노알코올의 N이 앞쪽으로 나오는 구조 및 하이드록실기가 뒤쪽으로 들어간 구조를 가지는 화합물일 수 있다.
상기 아미노알코올 전구 물질은 하기 화학식 13의 가너스 알데히드(Garner's aldehyde)일 수 있다.
상기 공정 b)에서 상기 아미노알코올 전구 물질과 함께 유기리튬화합물이 사용될 수 있다.
상기 유기리튬화합물은 n-부틸리튬, sec-부틸리튬 및 tert-부틸리튬으로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 포함한다. 상기 유기리튬화합물은 1 내지 4 당량 사용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
[화학식 5]
Figure PCTKR2019001159-appb-I000015
[화학식 13]
Figure PCTKR2019001159-appb-I000016
상기 공정 c)는 상기 화학식 5의 화합물로부터 환원제를 이용하여 하기 화학식 6의 화합물을 제조하는 공정이다(도 5).
상기 공정 c)에 의해 상기 화학식 5의 화합물에서 탄소 삼중 결합이 탄소 이중 결합으로 변경될 수 있다.
상기 공정 c)에 의해 상기 화학식 5의 화합물에서 탄소 삼중 결합에 수소가 도입되어 탄소 이중 결합을 가지는 상기 화학식 6의 화합물이 제조될 수 있다.
상기 화학식 5의 화합물에서 탄소 삼중 결합이 환원되어 탄소 이중 결합을 가지는 상기 화학식 6의 화합물이 제조될 수 있다.
상기 탄소 삼중 결합을 환원시키기 위하여 환원제가 이용될 수 있다.
상기 환원제는 sn-3 위치의 N이 앞쪽으로 나오는 구조 및 하이드록실기가 뒤쪽으로 들어간 구조를 유지하면서 탄소 삼중 결합을 탄소 이중 결합으로 환원하는 시약이 이용될 수 있다.
상기 공정 c)는 후술하는 공정들에 진행되는 도중 탄화수소쇄에 탄소 이중 결합 형태를 제공하기 위한 것이다.
상기 환원제는 하기 화학식 14의 Red-Al (sodium bis(2-methoxyethoxy)aluminumhydride; NaAlH2(OCH2CH2OCH3)2)이 이용될 수 있다.
[화학식 6]
Figure PCTKR2019001159-appb-I000017
[화학식 14]
Figure PCTKR2019001159-appb-I000018
상기 공정 d)는 상기 화학식 6의 화합물로부터 무수화물을 이용하여 하기 화학식 7의 화합물을 제조하는 공정이다(도 6).
상기 공정 d)에 의해 상기 화학식 6의 화합물에서 3번 탄소에 결합된 하이드록실기에서 수소가 제거될 수 있다.
상기 공정 d)에 의해 상기 화학식 6의 화합물에서 3번 탄소에 결합된 하이드록실기의 수소가 아세틸화 될 수 있다.
상기 공정 d)에 의해 상기 화학식 6의 화합물에서 3번 탄소에 결합된 하이드록실기의 수소가 아세틸기로 치환되어 상기 화학식 7의 화합물이 제조될 수 있다.
상기 화학식 6의 화합물에서 하이드록실기의 수소는 피리딘과 함께 제공된 무수화물에 의해 아세틸화 되어 상기 화학식 7의 화합물이 제조될 수 있다.
상기 공정 d)는 후술하는 공정들에 대해서 3번 탄소에 하이드록실기에 비하여 반응성이 더 낮은 특징을 가질 수 있으며, 아울러 공정 h)에서 구체적으로 설명하겠지만, 공정 h)에서 사용되는 화합물에 의하여 상기 아세틸기는 다시 수소원자로 치환될 수 있다.
이로써, 상기 화학식 6의 화합물의 3번 탄소에 연결된 하이드록실기가 공정 e) 내지 g)로부터 보호될 수 있다.
상기 공정 d)에서 상기 무수화물은 아세트산 무수물(acetic anhydride) 및 하기 화학식 15의 아세틸 할라이드(acetyl halide; CH3-CO-X)로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 포함한다. 상기 무수화물 화합물은 10 내지 20 당량 사용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
[화학식 7]
Figure PCTKR2019001159-appb-I000019
[화학식 15]
Figure PCTKR2019001159-appb-I000020
[상기 화학식 15에서, X는 할로겐 원자로부터 선택된다.]
상기 공정 e)는 상기 화학식 7의 화합물로부터 상기 a) 공정에서 도입된 기능기를 하이드록실기로 변경하여 하기 화학식 8의 화합물을 제조하는 공정이다(도 7).
상기 공정 e)에 의해 상기 화학식 7의 화합물에서 하이드록실기 보호기가 제거될 수 있다.
상기 공정 e)에 의해 상기 화학식 7의 화합물에서 하이드록실기 보호기가 수소 원자로 치환되어 상기 화학식 8의 화합물이 제조될 수 있다.
상기 화학식 7의 화합물에서 하이드록실기 보호기는 수소 원자로 치환되어 탄화수소쇄의 sn-1에 하이드록실기를 가지는 상기 화학식 8의 화합물이 제조될 수 있다.
상기 공정 e)는 후술하는 공정 f)에 하이드록실기를 제공하기 위한 것이다.
상기 하이드록실기는 후술하는 공정들에 대해서 상기 하이드록실기 보호기에 비하여 반응성이 더 높은 특징을 가질 수 있으며, 아울러, 공정 f)에서 구체적으로 설명하겠지만, 공정 f)에서 사용되는 화합물에 의하여 상기 하이드록실기는 다시 치환될 수 있다.
이로써, 상기 화학식 7의 화합물의 탄화수소쇄의 sn-1 위치에 있는 하이드록실기 보호기가 상기 화학식 8의 화합물의 sn-1 위치에 있는 하이드록실기로 치환되어 후술하는 공정에 제공된다.
상기 공정 e)는 KF, CsF, HF, 및 n-Bu4NF로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는 화합물이 사용될 수 있다. 상기 화합물은 5 내지 10 당량 사용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
[화학식 8]
Figure PCTKR2019001159-appb-I000021
상기 공정 f)는 상기 화학식 8의 화합물에 포함된 하이드록실기를 상기 하이드록실기보다 좋은 이탈기로 변경하여 하기 화학식 9의 화합물을 제조하는 공정이다(도 8).
상기 공정 f)에 의해 상기 화학식 8의 화합물에서 하이드록실기가 제거될 수 있다.
상기 공정 f)에 의해 상기 화학식 8의 화합물에서 하이드록실기가 보다 이탈기로의 기능을 잘 하는 다른 기능기로 치환되어 상기 화학식 9의 화합물이 제조될 수 있다.
상기 좋은 이탈기는 하이드록실기에 비하여 친핵성 반응을 더 잘 하는 기능기이다.
상기 화학식 8의 화합물에서 하이드록실기는 보다 좋은 이탈기로 치환되어 상기 화학식 9의 화합물이 제조될 수 있다.
상기 공정 f)는 후술하는 공정들에 진행되는 도중 상기 탄화수소쇄의 sn-1 위치에 있는 하이드록실기보다 더욱 친핵성 반응을 더 잘하는 기능기를 공하기 위한 것이다.
상기 좋은 이탈기는 후술하는 공정들에 대해서 하이드록실기에 비하여 더 좋은 이탈기로서의 특징을 가질 수 있으며, 아울러 공정 g) 에서 구체적으로 설명하겠지만, 공정 g) 사용되는 화합물에 의하여 상기 좋은 이탈기는 제거될 수 있다.
이로써, 상기 화학식 8의 화합물의 탄화수소쇄의 sn-1 위치에 있는 하이드록실기가 상기 화학식 9의 화합물의 sn-1 위치에 있는 좋은 이탈기로 치환되어 후술하는 공정에 제공된다.
상기 공정 f)의 하이드록실기보다 좋은 이탈기는 파라-톨루엔설폰산 (p-toluenesulfonate), 메테인설폰산(methanesulfonate), 파라-니트로벤조에이트(p-nitrobenzoate), 파라-니트로벤젠설폰산(p-nitrobenzenesulfonate), 파라-브로모벤젠설폰산(p-bromobenzenesulfonate) 및 트리플루로메테인설폰산(trifluoromethanesulfonate)로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 포함할 수 있다. 상기 기능기는 10 내지 30 당량 사용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
[화학식 9]
Figure PCTKR2019001159-appb-I000022
상기 공정 g)는 상기 화학식 9의 화합물로부터 상기 f) 공정에서 도입된 기능기를 변경하여 하기 화학식 10의 화합물을 제조하는 공정이다(도 9).
상기 공정 g)의 도입된 기능기를 변경하는 화합물은 하기 화학식 16의 N-Boc-하이드록실아민(N-Boc-hydroxylamine) 화합물일 수 있다.
상기 공정 g)에 의해 상기 화학식 9의 화합물에서 좋은 이탈기가 제거될 수 있다.
상기 공정 g)에 의해 상기 화학식 9의 화합물에서 좋은 이탈기가 N-Boc-하이드록실아민(N-Boc-hydroxylamine) 화합물과 친핵반응을 일으킬 수 있다.
상기 N-Boc-하이드록실아민은 DBU(1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene)와 함께 사용될 수 있다.
상기 DBU는 N-Boc-하이드록실아민의 하이드록실기를 활성화시키는 기능을 제공할 수 있다.
상기 화학식 9의 화합물에서 sn-1 위치에 있는 좋은 이탈기는 O-N-Boc으로 치환되어 상기 화학식 10의 화합물이 제조될 수 있다.
상기 공정 g)는 후술하는 공정들에 진행되는 도중 상기 탄화수소쇄의 sn-1 위치에 0-NH-Boc을 제공하기 위한 것이다.
상기 0-NH-Boc은 후술하는 공정들에 대하여 아민의 전구체, 더욱 상세하게는를 알콕시아민의 전구체를 제공하는 역할을 하며, 아울러 공정 k)에서 구체적으로 설명하겠지만, 공정 k)에서 사용되는 화합물에 의하여 상기 0-NH-Boc은 알콕시아민으로 치환될 수 있다.
이로써 상기 화학식 9의 화합물은 탄화수소쇄의 sn-1 위치에 있는 좋은 이탈기가 상기 화학식 10의 sn-1 위치에 있는 0-NH-Boc으로 치환되어 후술하는 공정에 제공된다.
[화학식 10]
Figure PCTKR2019001159-appb-I000023
[화학식 16]
Figure PCTKR2019001159-appb-I000024
상기 공정 h)는 상기 화학식 10의 화합물로부터 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran; THF) 및 염산으로 반응시켜 하기 화학식 2의 화합물을 제조하는 공정이다(도 10).
상기 공정 h)에 의해 상기 화학식 10의 화합물에서 아미노알코올 전구체가 변경될 수 있다.
상기 공정 h)에 의해 상기 화학식 10의 화합물에서 아미노알코올 전구체가 아미노알코올로 변경되어 상기 화학식 11의 화합물이 제조될 수 있다.
상기 공정 h)에 의해 상기 화학식 10의 화합물에서 아세토나이드가 아미노알코올로 변경되어 상기 화학식 11의 화합물이 제조될 수 있다.
상기 공정 h)에 의해 상기 화학식 10의 화합물에서 Boc가 제거될 수 있다.
상기 공정 h)에 의해 상기 화학식 10의 화합물에서 Boc가 수소 원자로 치환 되어 상기 화학식 11의 화합물이 제조될 수 있다.
상기 화학식 10의 화합물에서 아미노알코올 전구체가 환원되어 sn-3 위치에 아미노알코올을 가지는 상기 화학식 11의 화합물이 제조될 수 있다.
상기 공정 h)는 후술하는 공정들에 진행되는 도중 상기 sn-3 위치에 아미노알코올을 제공할 수 있으며, 아울러 공정 i)에서 구체적으로 설명하겠지만, 공정 i)에서 아미노알코올의 수소 원자 일부는 Boc로 치환될 수 있다.
이로써, 상기 화학식 10의 화합물의 탄화수소쇄의 sn-3 위치에 있는 아미노알코올 전구체가 상기 화학식 11의 sn-3 위치에 있는 아미노알코올로 치환되어 후술하는 공정에 제공된다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2019001159-appb-I000025
[상기 화학식 2 내지 화학식 10에서, n은 2 내지 13의 정수로부터 선택된다.]
본 명세서에 의해 개시되는 다른 실시예에 따르면 S1P 유사체, 구체적으로는 S1P-알콕시아민을 합성하는 다른 방법이 더 제공된다.
예를 들어, S1P 유사체인 상기 화학식 1의 S1P-알콕시아민을 합성하는 방법으로써, 전술한 공정 a) 내지 공정 h) 에
i) 하기 화학식 2의 화합물에 포함된 아민기를 상기 아민기보다 반응성이 작은 다른 기능기로 변경하여 하기 화학식 11의 화합물을 제조하는 것을 더 포함하는 스핑고신-1-포스페이트 (sphingosine-1-phosphate) 유사체의 제조 방법이 추가적으로 제공된다.
상기 공정 i)는 하기 화학식 2의 화합물에 포함된 아민기를 상기 아민기보다 반응성이 작은 다른 기능기로 변경하여 하기 화학식 11의 화합물을 제조하는 공정이다(도 11).
상기 공정 i)에 의해 상기 화학식 2의 화합물에서 2번 탄소에 연결된 아민기 및 sn-1 위치에 있는 아민기의 일 수소 원자가 제거된다.
상기 공정 i)에 의해 상기 화학식 2의 화합물에서 2번 탄소에 연결된 아민기 및 sn-1 위치에 있는 아민기의 일 수소 원자가 Boc로 치환되어 상기 화학식 11의 화합물이 제조될 수 있다.
상기 아민기에 비해 상기 아민기의 일 수소 원자가 Boc로 치환된 경우, 아민기보다 반응성이 작아질 수 있다.
상기 Boc는 아민기 보호기로 기능할 수 있다.
상기 화학식 2의 화합물에서 2번 탄소에 연결된 아민기 및 sn-1 위치에 있는 아민기의 일 수소 원자는 상기 수소 원자보다 반응성이 작은 다른 기능기로 치환되어 상기 화학식 11의 화합물이 제조될 수 있다.
상기 화학식 2의 화합물에서 2번 탄소에 연결된 아민기 및 sn-1 위치에 있는 아민기의 일 수소 원자는 상기 Boc로 치환되어 상기 화학식 11의 화합물이 제조될 수 있다.
상기 공정 i)는 후술하는 공정들에 진행되는 도중 상기 2번 탄소에 연결된 아민기 및 sn-1 위치에 있는 아민기를 보호하기 위한 것이다.
상기 아민기 보호기는 후술하는 공정들에 대해서 아민기에 비하여 반응성이 더 낮은 특징을 가질 수 있으며, 아울러 공정 k)에서 구체적으로 설명하겠지만, 공정 k)에서 사용되는 화합물에 의하여 상기 아민기 보호기는 다시 수소 원자로 치환될 수 있다.
이로써, 상기 화학식 2의 화합물의 탄화수소쇄의 2번 탄소에 연결된 아민기 및 sn-1 위치에 있는 아민기는 공정 j)로부터 보호될 수 있다.
상기 공정 i)의 아민기보다 반응성이 작은 다른 기능기는 디-tert-부틸 디카보네이트(di-tert-butyl dicarbonate; Boc2O), 9-플루오렌일메틸 카바메이트(9-fluorenylmethyl carbamate), tert-부틸 카바메이트(tert-butyl carbamate), 벤질 카바메이트(benzyl carbamate), 아세트아마이드(acetamide), 트리플루로아세트아마이드(trifluoroacetamide), 프탈이미드(phthalimide), 벤질아민(benzylamine), 트리페닐메틸아민(triphenylmethylamine), 벤질리덴아민(benzylideneamine) 및 파라-톨루엔설폰아미드(p-toluenesulfonamide)로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 포함할 수 있다. 상기 아민기보다 반응성이 작은 다른 기능기는 2 내지 5 당량 사용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2019001159-appb-I000026
[화학식 11]
Figure PCTKR2019001159-appb-I000027
본 명세서에 의해 개시되는 또 다른 실시예에 따르면 S1P 유사체, 구체적으로는 S1P-알콕시아민을 합성하는 또 다른 방법이 더 제공된다.
예를 들어, S1P 유사체인 상기 화학식 1의 S1P-알콕시아민을 합성하는 방법으로써, 전술한 공정 a) 내지 공정 i) 에
j) 상기 화학식 11의 화합물로부터 포스폰산 에스테르(phosphonate ester)를 이용하여 하기 화학식 12의 화합물을 제조하는 것을 더 포함하는 스핑고신-1-포스페이트 (sphingosine-1-phosphate) 유사체의 제조 방법이 추가적으로 제공된다.
상기 공정 j)는 상기 화학식 11의 화합물로부터 포스폰산 에스테르(phosphonate ester)를 이용하여 하기 화학식 12의 화합물을 제조하는 공정이다(도 12).
상기 공정 j)에 의해 상기 화학식 11의 화합물에서 sn-3 위치에 있는 하이드록실기의 수소가 제거될 수 있다.
상기 공정 j)에 의해 상기 화학식 11의 화합물에서 1번 탄소에 연결된 하이드록실기의 수소가 제거될 수 있다.
상기 공정 j)에 의해 상기 화학식 11의 화합물에서 sn-3 위치에 있는 하이드록실기의 수소가 PO(OR1,2)2로 치환되어 상기 화학식 12의 화합물이 제조될 수 있다.
상기 화학식 11의 화합물에서 sn-3 위치에 있는 하이드록실기의 수소는 PO(OR1,2)2로 치환되어 상기 화학식 12의 화합물이 제조될 수 있다.
상기 공정 j)는 후술하는 공정들에 진행되는 도중 상기 탄화수소쇄의 sn-3 위치에 포스폰산 에스테르를 제공하기 위한 것이다.
상기 포스폰산 에스테르는 후술하는 공정들에 대해서 포스페이트를 제공할 수 있으며, 아울러, 공정 k)에서 구체적으로 설명하겠지만, 공정 k)에서 사용되는 화합물에 의하여 상기 포스폰산 에스테르의 잔기는 수소원자로 치환될 수 있다.
상기 공정 j)에서 포스폰산 에스테르와 함께 하기 화학식 17의 N-메틸이미다졸(N-methylimidazole; NMI)이 사용될 수 있다.
상기 NMI는 염기로서, 1번 탄소에 연결된 하이드록실기를 활성화 시키는데 이용될 수 있다.
상기 포스폰산 에스테르는 하기 화학식 18의 포스폰산 에스테르(phosphonate ester; R3PO(OR1,2)2)로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 포함할 수 있다. 상기 포스폰산 에스테르 화합물은 2 내지 20 당량 사용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
[화학식 12]
Figure PCTKR2019001159-appb-I000028
[화학식 17]
Figure PCTKR2019001159-appb-I000029
[화학식 18]
Figure PCTKR2019001159-appb-I000030
[상기 화학식 12 및 18에서,
R3은 플루오르를 제외한 할로겐 원자, HSO4, 또는 파라-톨루엔설폰산(p-toluenesulfonate)으로부터 선택되고;
R1,2는 H 또는 탄소수 1 내지 7의 알킬기로부터 선택된다.]
본 명세서에 의해 개시되는 또 다른 실시예에 따르면 S1P 유사체, 구체적으로는 S1P-알콕시아민을 합성하는 또 다른 방법이 더 제공된다.
예를 들어, S1P 유사체인 상기 화학식 1의 S1P-알콕시아민을 합성하는 방법으로써, 전술한 공정 a) 내지 공정 j) 에
k) 상기 화학식 12의 화합물에 포함된 O-아실기를 수소 원자로 변경하여 하기 화학식 1의 화합물을 제조하는 것을 더 포함하는 스핑고신-1-포스페이트 (sphingosine-1-phosphate) 유사체의 제조 방법이 추가적으로 제공된다.
상기 공정 k)는 상기 화학식 12의 화합물에 포함된 O-아실기를 수소 원자로 변경하여 하기 화학식 1의 화합물을 제조하는 공정이다(도 13).
상기 공정 k)에 의해 상기 화학식 12의 화합물에 포함된 O-아실기가 제거될 수 있다.
상기 공정 k)에 의해 상기 화학식 12의 화합물에 포함된 포스폰산 에스테르의 OR1, OR2, 2번 탄소에 연결된 N과 결합하고있는 Boc 및 sn-1 위치의 Boc가 수소 원자로 치환되어 상기 화학식 13의 화합물이 제조될 수 있다.
상기 화학식 12의 화합물에서 O-아실기는 수소 원자로 치환되어 상기 화학식 13의 화합물이 제조될 수 있다.
상기 O-아실기는 포스폰산 에스테르의 OR1, OR2, 2번 탄소에 연결된 N과 결합하고있는 Boc 및 sn-1 위치의 Boc이다.
상기 포스폰산 에스테르의 OR1 및 OR2가 수소 원자로 치환되어, 상기 화합물 13의 sn-3 위치에 포스페이트가 제공된다.
상기 2번 탄소에 연결된 N과 결합하고있는 Boc 및 sn-1 위치의 Boc가 수소 원자로 치환되어, 상기 화합물 13의 2번 탄소에 아민 및 sn-1 위치에 알콕시아민기가 제공된다.
이로써, 상기 화학식 12의 O-아실기는 상기 화합물 13의 sn-3 위치에 포스페이트, 2번 탄소에 아민기 및 sn-1 위치에 알콕시아민기를 제공한다.
상기 O-아실기를 수소 원자로 변경하는 반응는 트리메틸실릴 브로마이드(trimethylsilyl bromide; Me3SiBr), 트리브로모보레인(tribromoborane; BBr3), 하이드로브롬산(hydrobromate; HBr) 및 다이메틸폼아미드(dimethylformamide) 로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는 화합물이 사용될 수 있다. 상기 O-아실기를 수소 원자로 변경하는 화합물은 5 내지 15 당량 사용될 수 있다. 상기 O-아실기를 수소 원자로 변경하는 화합물은 물과 함께 사용될 수 있다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2019001159-appb-I000031
[상기 화학식 1, 화학식 2, 화학식 11 및 화학식 12에서, n은 2 내지 13의 정수로부터 선택된다.]
각 공정에 관한 통상적 기술 내용은 당업계에 공지되어 있는 종래의 유기 합성 방법을 참조하여 이해할 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 또 다른 실시예에 따르면 1-알카인-n-올(HCC(CH2)n-OH)로부터 스핑고신 유사체, 구체적으로는 스핑고신-알콕시아민을 합성하는 방법이 제공된다.
예를 들어, 1-알카인-n-올(HCC(CH2)n-OH)로부터 스핑고신 유사체, 구체적으로는 스핑고신-알콕시아민을 합성하는 방법은 1-알카인-n-올(HCC(CH2)n-OH)인 상기 화학식 3의 화합물로부터 스핑고신 유사체인 상기 화학식 2의 스핑고신 -알콕시아민을 합성하는 방법으로써,
a) 상기 화학식 3의 화합물에 포함된 하이드록실기를 상기 하이드록실기보다 반응성이 작은 다른 기능기로 변경하여 상기 화학식 4의 화합물을 제조하고;
b) 상기 화학식 4의 화합물로부터 아미노알코올 전구물질을 이용하여 상기 화학식 5의 화합물을 제조하고;
c) 상기 화학식 5의 화합물로부터 환원제를 이용하여 상기 화학식 6의 화합물을 제조하고;
d) 상기 화학식 6의 화합물로부터 무수화물을 이용하여 상기 화학식 7의 화합물을 제조하고;
e) 상기 화학식 7의 화합물로부터 상기 a) 공정에서 도입된 기능기를 하이드록실기로 변경하여 상기 화학식 8의 화합물을 제조하고;
f) 상기 화학식 8의 화합물에 포함된 하이드록실기를 상기 하이드록실기보다 좋은 이탈기로 변경하여 상기 화학식 9의 화합물을 제조하고;
g) 상기 화학식 9의 화합물로부터 상기 f) 공정에서 도입된 기능기를 변경하여 상기 화학식 10의 화합물을 제조하고; 및
h) 상기 화학식 10의 화합물로부터 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran; THF) 및 염산으로 반응시켜 상기 화학식 2의 화합물을 제조하는 것을 포함하는
상기 화학식 2의 스핑고신 유사체의 제조 방법이다.
상기 공정 a) 내지 공정 h) 의 구체적인 사항은 전술한 각 공정에 대한 설명과 같다.
본 명세서에 의해 개시되는 다른 양태에 따르면, 새로운 스핑고신-1-포스페이트(sphingosine-1-phosphate; S1P) 유사체 화합물이 제공된다.
본 명세서에 의해 개시되는 일 실시예에 따르면, 스핑고신-1-포스페이트(sphingosine-1-phosphate; S1P) 유사체, 구체적으로는 하기 화학식 1의 S1P-알콕시아민이 제공된다.
본 명세서에 의해 개시되는 다른 실시예에 따르면, 스핑고신 유사체, 구체적으로는 하기 화학식 2의 스핑고신-알콕시아민이 제공된다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2019001159-appb-I000032
[화학식 2]
Figure PCTKR2019001159-appb-I000033
[상기 화학식 1 및 화학식 2에서, n은 2 내지 13의 정수로부터 선택된다.]
본 명세서에 개시된 새로운 S1P 유사체는 sn-1에 알콕시아민기를 가지는 것을 특징으로 한다. 상기 알콕시아민기는 친수성이며, 산화도가 높은 기능기인 화학적 특성이 있다. 이에 따라, 본 명세서에서 개시된 새로운 S1P 유사체인 S1P-알콕시아민은 수용성이며, 공기중에서 추가적인 산화가 거의 없어 공기중에서의 산화에 대한 안정성이 높다. 또한, 상기 알콕시아민기는 이와 특이적 또는 선택적으로 화학 반응을 수행하는 특정 기능기와 결합을 형성할 수 있다. 상기 특정 기능기는 에폭시기, 카보닐기 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 카보닐기는 알데하이드, 케톤, 카복실산과 그 유도체인 에스터와 아마이드, 및 케텐 등에 포함될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이에 따라, 본 명세서에서 개시된 새로운 S1P 유사체인 S1P-알콕시아민은 이와 특이적 또는 선택적으로 화학 반응을 수행하는 특정 기능기와 결합을 형성할 수 있다.
따라서 본 명세서에 의하면, 수용성 및 공기중에서의 산화에 대한 안정성이 향상된 S1P 유사체가 제공된다. 또한, 알콕시아민과 특이적 또는 선택적으로 화학 반응을 수행하는 특정 기능기와 결합을 형성할 수 있는 S1P 유사체가 제공된다.
본 명세서에 의해 개시되는 또 다른 양태에 따르면, 새로운 S1P 유사체 화합물 및/또는 이들의 합성 방법의 용도로서, S1P 유사체를 포함하는 면역 진단 키트가 제공된다.
본 명세서에 의해 개시되는 일 실시예에 따르면 S1P 유사체, 구체적으로는 S1P-알콕시아민을 포함하는 면역 진단 키트가 제공된다.
예를 들어, 플레이트; 및
상기 플레이트에 고정되는 하기 화학식 1의 화합물로부터 선택되는 스핑고신-1-포스페이트(sphingosine-1-phosphate) 유사체를 포함하는 면역 진단 키트가 제공된다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2019001159-appb-I000034
[상기 화학식 1에서, n은 2 내지 13의 정수로부터 선택된다.]
상기 플레이트는 S1P가 도포 되는 것일 수 있다. 상기 플레이트는 폴리스티렌, 폴리프로피렌, 폴리카보네이트, 또는 나일론의 고분자 물질로 구성될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 플레이트는 나이트로 셀룰로우즈, 셀룰로우즈, 셀룰로우즈 아세테이트, 폴리에틸렌 등의 각종 합성 중합체로 구성될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 플레이트는 상기 S1P 유사체의 알콕시아민기와 반응할 수 있는 기능기를 가질 수 있다. 상기 기능기는 에폭시기, 카보닐기 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 카보닐기는 알데하이드, 케톤, 카복실산과 그 유도체인 에스터와 아마이드, 및 케텐 등에 포함될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 플레이트는 S1P 유사체를 직접적 및/또는 간접적으로 고정시킬 수 있다. 상기 플레이트는 기능기를 포함하며, 상기 기능기와 S1P 유사체의 알콕시아민기는 화학 반응을 통해 결합을 형성할 수 있다. 따라서 기능기를 포함하는 플레이트에 S1P 유사체를 직접적 및/또는 간접적으로 고정시킬 수 있다. 예를 들어, S1P-알콕시아민 화합물은 에폭시화 된 플레이트에 직접적 및/또는 간접적으로 고정될 수 있다. 또는, 예를 들어, S1P-알콕시아민 화합물은 카보닐기를 포함하는 플레이트에 직접적 및/또는 간접적으로 고정시킬 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 다른 실시예에 따르면 S1P 유사체, 구체적으로는 S1P-알콕시아민을 이용한 다른 면역 진단 키트가 더 제공된다.
예를 들어, 플레이트; 및
상기 플레이트에 고정되는 상기 화학식 1의 화합물로부터 선택되는 스핑고신-1-포스페이트(sphingosine-1-phosphate) 유사체를 포함하는 면역 진단 키트에 있어서,
지지 부재를 더 포함하는 면역 진단 키트가 제공된다.
상기 지지 부재는 플레이트와 S1P 유사체를 매개하는 역할을 제공할 수 있다. 상기 지지 부재는 플레이트에 접촉된 구조일 수 있다. 상기 지지 부재는 S1P 유사체와 접촉된 구조일 수 있다. 상기 지지 부재는 플레이트에 직접적 및/또는 간접적으로 접촉된 구조일 수 있다. 상기 지지 부재는 S1P 유사체에 직접적 및/또는 간접적으로 접촉된 구조일 수 있다.
상기 지지 부재는 유리, 다당류, 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐 알코올, 실리콘 또는 단백질 분자로 구성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 지지 부재는 바람직하게는 폴리아크릴아미드 또는 단백질 분자일 수 있다. 상기 지지 부재는 더욱 바람직하게는 단백질 분자일 수 있다.
상기 지지 부재는 상기 스핑고신-1-포스페이트 유사체의 알콕시아민기와 반응할 수 있는 기능기를 가질 수 있다. 상기 기능기는 에폭시기, 카보닐기 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 카보닐기는 알데하이드, 케톤, 카복실산과 그 유도체인 에스터와 아마이드, 및 케텐 등에 포함될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 지지 부재는 상기 플레이트와 물리적 또는 화학적으로 접촉될 수 있다.
상기 지지 부재는 S1P 유사체를 직접적 및/또는 간접적으로 고정시킬 수 있다. 상기 지지 부재는 기능기를 포함하며, 상기 기능기와 S1P 유사체의 알콕시아민기는 화학 반응을 통해 결합을 형성할 수 있다. 따라서 기능기를 포함하는 지지 부재에 S1P 유사체를 직접적 및/또는 간접적으로 고정시킬 수 있다. 예를 들어, S1P-알콕시아민 화합물은 에폭시화 된 지지 부재에 직접적으로 고정될 수 있다. 또는, 예를 들어, S1P-알콕시아민 화합물은 카보닐기를 포함하는 지지 부재에 직접적 및/또는 간접적으로 고정될 수 있다.
상기 지지 부재는 플레이트와 접촉할 수 있다. 상기 지지 부재는 플레이트와 접촉을 통하여 S1P 유사체를 플레이트에 간접적으로 고정시킬 수 있다.
상기 플레이트 또는 상기 지지 부재에 S1P 유사체가 직접적으로 고정되는 경우, 별도의 링커가 필수적으로 요구되지 않는다. 즉, 링커의 유무에 구애 받지 않는다. 따라서, S1P 유사체를 이용한 면역 진단 키트 제작 공정에서, 종래의 제작 공정에 비하여 제작 단계를 합리적으로 간소화시킬 수 있다.
상기 면역 진단 키트는 엘라이자(enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA) 키트 또는 현장현시검사(point-of-care testing; POCT) 키트일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 엘라이자는 직접 엘라이자(direct ELISA), 간접 엘라이자(indirect ELISA), 샌드위치 엘라이자(sandwich ELISA) 및 경쟁적 엘라이자(Competitive ELISA)를 포함한다.
이하, 실시예를 통하여 본 명세서를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 명세서에 의해 개시되는 내용을 예시하기 위한 것으로서, 본 명세서에 의해 개시되는 내용의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 실시예를 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "함유하다" 및 "포함하다"란 말은 제시된 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.
아래 설명하는 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있다. 아래 설명하는 실시예들은 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 이들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 실시예에서 기술된 합성 접근법은 주로 종래의 유기 화학을 사용하는 구조적 요소의 연속 첨가에 의하여 S1P 유사체의 제조를 초래한다. 이 예에서 설명된 합성 방식의 각 공정은 도 3 내지 도 13에서 제공되며, 전체 공정은 도 14에서 제공된다. 아래의 합성 설명에서의 화합물 번호는 도 3 내지 도 13에서 번호가 매겨진 구조를 나타낸다.
[실시예 1] 화합물 3으로부터 화합물 4로의 합성
Ar 대기하에서 화합물 3 (1 g, 29.7124 mmol)을 다이메틸포름아미드 (dimethyl form amide; DMF) (40 mL)에 녹이고 이미다졸(3.03 g, 44.5686 mmol)을 넣어 주었다. 반응 혼합물을 0 ℃로 낮춘 후, TBDPSCl(tert-Butyldiphenylsilyl chloride) (9.27 mL, 35.6549 mmol)를 천천히 적가하고, 실온으로 올려서 4 시간 동안 교반한다. 반응 완료 후 감압 농축하여 다이메틸포름아미드를 제거한 후, 잔여물을 다이클로로메테인(dichloromethane; DCM; methylene chloride; MC)에 녹인 후, NaHCO3 수용액 그리고 염수(brine)로 세척 후 Na2SO4로 건조하여 여과 및 농축하였다. 농축물은 컬럼 크로마토그래피법으로 분리 정제하여 화합물 4 (12 g, 98%)를 수득했다(도 3).
[실시예 2] 화합물 4로부터 화합물 5로의 합성
Ar 대기하에서 화합물 4 (12.2 g, 29.99 mmol)를 건조 상태의 테트라하이드로퓨란 (dry tetrahydrofuran; THF) (300 ml)에 녹이고 -70 ℃에서 n-부틸리튬 (22.5 ml, 44.9 mmol; 2M in hexane)을 천천히 적가한다. 같은 온도에서 30분 동안 교반하고 cooling bath를 제거하고 60분 동안 교반한다. 다시 -70 ℃ 이하로 하고 가너스 알데히드(Garner's aldehyde) (6.88 g, 29.9 mmol)를 dry THF (20 ml)에 녹여 적가한다. 30분 동안 같은 온도에서 교반하고 cooling bath를 제거한다. 2.5시간 후에 NH4Cl 포화 수용액을 가하여 반응을 종결한다. DCM (200 ml X 2)로 추출한다. 유기층을 Na2SO4로 건조하여 여과 및 농축하였다. 농축물은 컬럼 크로마토그래피법으로 분리 정제하여 화합물 5 (9.9 g, 52 %)를 수득했다(도 4).
[실시예 3] 화합물 5로부터 화합물 6으로의 합성
Ar 대기하에서 화합물 5 (9.9g, 15.6 mmol)를 dry THF (100 ml)에 녹이고 -70 ℃ 에서 Red-Al 70% in toluene (13.22 ml, 66.7 mmol, 60% in toluene)를 천천히 적가한다. 1 시간 후 cooling bath를 제거하고 상온에서 하룻밤 동안 반응시킨다. Ice-water bath에서 NH4Cl 포화 수용액 (200 ml)을 가하여 반응을 종결한다. 아세트산에틸 (Ethyl acetate; EtOAc) (300 ml X 3)로 추출한다. 유기층을 Na2SO4로 건조하여 여과 및 농축하였다. 농축물은 컬럼 크로마토그래피법으로 분리 정제하여 화합물 6 (4.5 g, 45.3 %)을 수득했다(도 5).
[실시예 4] 화합물 6으로부터 화합물 7로의 합성
화합물 6 (1.9g, 2.98 mmol)을 피리딘(6 ml)에 녹이고 아세트산 무수물(Acetic anhydride) (3 mL)를 적가하였다. 박층크로마토그래피(Thin Layer Chromatography; TLC)로 모니터링하여 반응 완료 확인 후 1M 염산(HCl) 2회, 염수로 1회 세척한 후 Na2SO4로 건조 후 여과 및 농축하여 화합물 7 (2.02 g, 100%) 을 수득했다. 추가적인 정제없이 다음 반응에 사용한다(도 6).
[실시예 5] 화합물 7로부터 화합물 8로의 합성
화합물 7 (crude 2.02 g, 2.98 mmol)을 dry THF (50 ml)에 녹이고 0 ℃에서 n-Bu4NF(13.97 ml, 13.97 mmol; 1 M in THF)를 천천히 적가한다. TLC 모니터링하여 반응 완료 확인 후 NH4Cl 포화 수용액 (200 ml)을 가하여 반응을 종결한다. EtOAc (300 ml X 3)로 추출한다. 추출한 유기층을 Na2SO4로 건조 후 여과 및 농축하여 화합물 8 (1.32 g, 100%)을 수득했다. 추가적인 정제없이 다음 반응에 사용한다(도 7).
[실시예 6] 화합물 8로부터 화합물 9로의 합성
화합물 8 (crude 1.32 g, 2.98 mmol)을 피리딘(20 ml)에 녹이고 0 ℃에서 파라-톨루엔설포닐 클로라이드(p-Toluenesulfonyl chloride; p-TsCl) (9.93 g, 52.1 mmol)를 천천히 적가한다. TLC 모니터링하여 반응 완료 확인 후 1M HCl 2회, 염수로 1회 세척한 후 Na2SO4로 건조 후 여과 및 농축하였다. 농축물은 컬럼 크로마토그래피법으로 분리 정제하여 화합물 9 (1.57 g, 88.4 %)를 수득했다(도 8).
[실시예 7] 화합물 9로부터 화합물 10으로의 합성
화합물 9 (1.57 g, 2.64 mmol)를 다이에틸에테르(diethyl ether) (15 mL)에 녹이고 DBU(1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene) (1.967 mL, 13.17 mmol)를 적가 후, N-Boc-하이드록실아민 (N-Boc-hydroxylamine) (1.754 g, 13.17 mmol)을 가한다. 15분 후 반응 혼합물을 감압 농축하여 diethyl ether를 제거한 후, 상온에서 하루밤 동안 반응 시킨다. TLC 모니터링하여 반응 완료 확인 후 반응물을 EtOAc(100 mL)와 0.1M KHSO4, 0.1M NaOH, 염수로 세척한 후 유기층을 Na2SO4로 건조 후 여과 및 농축하여 화합물 10 (1.45 g, 99.1%)을 수득했다. 추가적인 정제없이 다음 반응에 사용한다(도 9).
[실시예 8] 화합물 10으로부터 화합물 2로의 합성
화합물 10 (1.45 g, 2.61 mmol)을 THF(6 mL)에 녹이고 2N-HCl(6 mL)를 적가 후 75 ℃ 에서 가온하여 환류 반응시킨다. 반응 2 시간 후 감압하여 용매를 완전히 제거하였다. 잔사를 THF에 녹인 후 감압 농축 과정을 수 차례 반복하자 하얀색 고체인 화합물 2가 생성되었다. 추가적인 정제 없이 다음 반응에 사용한다(도 10).
[실시예 9] 화합물 2로부터 화합물 11로의 합성
화합물 2를 다시 DCM(5 mL), 메탄올(methanol; MeOH)(5 mL)에 녹이고, 테트라-에틸암모늄 (tetra-ethylammonium; TEA) (7.3 ml, 52.3 mmol)과 Boc2O (1.71 g, 7.84 mmol)를 가한다. TLC 모니터링하여 반응 완료 확인 후, 1M HCl 2회, 염수로 2회 세척한 후 Na2SO4로 건조 후 여과 및 농축하였다. 농축물은 컬럼 크로마토그래피법으로 분리 정제하여 화합물 11 (0.880 g, 71.0 %)을 수득했다(도 11).
[실시예 10] 화합물 11로부터 화합물 12로의 합성
화합물 11 (0.110 g, 0.232 mmol)을 Dry DCM(10 ml)에 녹이고 0 ℃에서 N-메틸이미다졸(N-methylimidazole; NMI) (0.056 mL, 0.697 mmol)을 천천히 적가한다. 이어서 0 ℃에서 PO(OMe)2Cl을 천천히 적가한다. TLC 모니터링하여 반응 완료 확인 후, 1M HCl 2회, 염수로 2회 세척한 후 Na2SO4로 건조 후 여과 및 농축하였다. 농축물은 컬럼 크로마토그래피법으로 분리 정제하여 화합물 12 (0.110 g, 84.3.0 %)를 수득했다(도 12).
[실시예 11] 화합물 12로부터 화합물 1로의 합성
화합물 12 (0.110 g, 0.196 mmol)를 Dry 아세토니트릴(Dry Acetonitrile; MeCN)(10 ml)에 녹이고 0 ℃에서 Me3SiBr (0.26 mL, 1.958 mmol)를 천천히 적가한다. 40분 후에 MeCN (10 ml)로 flask를 씻어 내린다. Ice-water bath를 제거하고 상온에서 교반한다. 90분 후에 sample를 취하여 NMR로 반응 종결 여부를 확인한다. 반응 종결 확인 후 water (3 ml)를 가하고 감압 농축한다. 잔류물을 ether(100 ml)에 녹이고 water(50 mlX3)로 추출한다. 수층을 감압 농축 후, 잔류물을 역상 컬럼(reverse column)으로 정제한다. RP-18 (40~63㎛) LiChroprep® Merck를 사용하였다(eluent, 50% H2O in MeOH to 100 % MeOH). 그 결과 ivory solid (68.5%)의 화합물 1을 50 mg 수득했다(도 13).
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기의 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다. 그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 특허청구범위의 범위에 속한다.

Claims (27)

  1. a) 하기 화학식 3의 화합물에 포함된 하이드록실기를 tert-부틸다이페닐실릴 에테르(tert-Butyldiphenylsilyl ether)기로 변경하여 하기 화학식 4의 화합물을 제조하고;
    b) 하기 화학식 4의 화합물로부터 하기 화학식 13의 가너스 알데히드(Garner's aldehyde)를 이용하여 하기 화학식 5의 화합물을 제조하고;
    c) 하기 화학식 5의 화합물로부터 환원제를 이용하여 하기 화학식 6의 화합물을 제조하고;
    d) 하기 화학식 6의 화합물로부터 무수화물을 이용하여 하기 화학식 7의 화합물을 제조하고;
    e) 하기 화학식 7의 화합물로부터 상기 a) 공정에서 도입된 tert-부틸다이페닐실릴 에테르(tert-Butyldiphenylsilyl ether)기를 하이드록실기로 변경하여 하기 화학식 8의 화합물을 제조하고;
    f) 하기 화학식 8의 화합물에 포함된 하이드록실기를 파라-톨루엔설폰산(p-toluenesulfonate)기로 변경하여 하기 화학식 9의 화합물을 제조하고;
    g) 하기 화학식 9의 화합물로부터 하기 화학식 16의 N-Boc-하이드록실아민(N-Boc-hydroxylamine)을 이용하여 하기 화학식 10의 화합물을 제조하고; 및
    h) 하기 화학식 10의 화합물로부터 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran; THF) 및 염산으로 반응시켜 하기 화학식 2의 화합물을 제조하는 것을 포함하는
    하기 화학식 1의 스핑고신-1-포스페이트(sphingosine-1-phosphate) 유사체의 제조 방법
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2019001159-appb-I000035
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2019001159-appb-I000036
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2019001159-appb-I000037
    [화학식 4]
    Figure PCTKR2019001159-appb-I000038
    [화학식 5]
    Figure PCTKR2019001159-appb-I000039
    [화학식 6]
    Figure PCTKR2019001159-appb-I000040
    [화학식 7]
    Figure PCTKR2019001159-appb-I000041
    [화학식 8]
    Figure PCTKR2019001159-appb-I000042
    [화학식 9]
    Figure PCTKR2019001159-appb-I000043
    [화학식 10]
    Figure PCTKR2019001159-appb-I000044
    [화학식 13]
    Figure PCTKR2019001159-appb-I000045
    [화학식 16]
    Figure PCTKR2019001159-appb-I000046
    .
    이때, 상기 화학식 1 내지 화학식 10에서, n은 2 내지 13의 정수로부터 선택됨
  2. 제1항에 있어서
    상기 b) 공정의 가너스 알데히드(Garner's aldehyde)와 함께 유기리튬화합물이 사용되는 스핑고신-1-포스페이트 (sphingosine-1-phosphate) 유사체의 제조 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 유기리튬화합물은 n-부틸리튬, sec-부틸리튬 및 tert-부틸리튬으로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는 스핑고신-1-포스페이트 (sphingosine-1-phosphate) 유사체의 제조 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 c) 공정의 환원제는 하기 화학식 14의 Red-Al (sodium bis(2-methoxyethoxy)aluminumhydride; NaAlH2(OCH2CH2OCH3)2)인 스핑고신-1-포스페이트 (sphingosine-1-phosphate) 유사체의 제조 방법
    [화학식 14]
    Figure PCTKR2019001159-appb-I000047
    .
  5. 제1항에 있어서,
    상기 d) 공정에서 상기 무수화물은 아세트산 무수물(acetic anhydride)인 스핑고신-1-포스페이트 (sphingosine-1-phosphate) 유사체의 제조 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 e) 공정은 KF, CsF, HF 및 n-Bu4NF로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는 화합물이 사용되는 스핑고신-1-포스페이트 (sphingosine-1-phosphate) 유사체의 제조 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    i) 하기 화학식 2의 화합물로부터 디-tert-부틸 디카보네이트(di-tert-butyl dicarbonate; Boc2O)를 이용하여 하기 화학식 11의 화합물을 제조하는 것을 더 포함하는
    스핑고신-1-포스페이트(sphingosine-1-phosphate) 유사체의 제조 방법
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2019001159-appb-I000048
    [화학식 11]
    Figure PCTKR2019001159-appb-I000049
    .
    이때, 상기 화학식 2 및 화학식 11에서, n은 2 내지 13의 정수로부터 선택됨
  8. 제7항에 있어서,
    j) 하기 화학식 11의 화합물로부터 포스폰산 에스테르(phosphonate ester)를 이용하여 하기 화학식 12의 화합물을 제조하는 것을 더 포함하는
    스핑고신-1-포스페이트(sphingosine-1-phosphate) 유사체의 제조 방법
    [화학식 11]
    Figure PCTKR2019001159-appb-I000050
    [화학식 12]
    Figure PCTKR2019001159-appb-I000051
    .
    이때, 상기 화학식 11 및 화학식 12에서, n은 2 내지 13의 정수로부터 선택됨
    이때, 상기 화학식 12에서, R1 및 R2는 H 또는 탄소수 1 내지 7의 알킬기로부터 선택됨
  9. 제8항에 있어서,
    상기 포스폰산 에스테르와 함께 하기 화학식 17의 N-메틸이미다졸(N-methylimidazole; NMI)이 사용되는 스핑고신-1-포스페이트 (sphingosine-1-phosphate) 유사체의 제조 방법
    [화학식 17]
    Figure PCTKR2019001159-appb-I000052
    .
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    상기 포스폰산 에스테르(phosphonate ester)는 하기 화학식 18의 포스폰산 에스테르(phosphonate ester)로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는 스핑고신-1-포스페이트 (sphingosine-1-phosphate) 유사체의 제조 방법
    [화학식 18]
    Figure PCTKR2019001159-appb-I000053
    .
    이때, 상기 화학식 18에서, R3은 플루오르를 제외한 할로겐 원자, HSO4, 또는 파라-톨루엔설폰산(p-toluenesulfonate)으로부터 선택되고;
    R1 및 R2는 H 또는 탄소수 1 내지 7의 알킬기로부터 선택됨
  11. 제8항에 있어서,
    k) 하기 화학식 12의 화합물에 포함된 R1 및 R2를 수소 원자로 변경하여 하기 화학식 1의 화합물을 제조하는 것을 더 포함하는
    스핑고신-1-포스페이트(sphingosine-1-phosphate) 유사체의 제조 방법
    [화학식 12]
    Figure PCTKR2019001159-appb-I000054
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2019001159-appb-I000055
    .
    이때, 상기 화학식 1 및 화학식 12에서, n은 2 내지 13의 정수로부터 선택됨
  12. 제11항에 있어서,
    상기 R1 및 R2를 수소 원자로 변경하기 위하여 트리메틸실릴 브로마이드(trimethylsilyl bromide; Me3SiBr), 트리브로모보레인(tribromoborane; BBr3), 하이드로브롬산(hydrobromate; HBr) 및 다이메틸폼아미드(dimethylformamide) 부틸리튬으로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는 화합물이 사용되는 스핑고신-1-포스페이트 (sphingosine-1-phosphate) 유사체의 제조 방법.
  13. a) 하기 화학식 3의 화합물에 포함된 하이드록실기를 tert-부틸다이페닐실릴 에테르(tert-Butyldiphenylsilyl ether)기로 변경하여 하기 화학식 4의 화합물을 제조하고;
    b) 하기 화학식 4의 화합물로부터 하기 화학식 13의 가너스 알데히드(Garner's aldehyde)를 이용하여 하기 화학식 5의 화합물을 제조하고;
    c) 하기 화학식 5의 화합물로부터 환원제를 이용하여 하기 화학식 6의 화합물을 제조하고;
    d) 하기 화학식 6의 화합물로부터 무수화물을 이용하여 하기 화학식 7의 화합물을 제조하고;
    e) 하기 화학식 7의 화합물로부터 상기 a) 공정에서 도입된 tert-부틸다이페닐실릴 에테르(tert-Butyldiphenylsilyl ether)기를 하이드록실기로 변경하여 하기 화학식 8의 화합물을 제조하고;
    f) 하기 화학식 8의 화합물에 포함된 하이드록실기를 파라-톨루엔설폰산(p-toluenesulfonate)기로 변경하여 하기 화학식 9의 화합물을 제조하고;
    g) 하기 화학식 9의 화합물로부터 하기 화학식 16의 N-Boc-하이드록실아민(N-Boc-hydroxylamine)을 이용하여 하기 화학식 10의 화합물을 제조하고; 및
    h) 하기 화학식 10의 화합물로부터 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran; THF) 및 염산으로 반응시켜 하기 화학식 2의 화합물을 제조하는 것을 포함하는
    하기 화학식 2의 스핑고신 (sphingosine) 유사체의 제조 방법
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2019001159-appb-I000056
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2019001159-appb-I000057
    [화학식 4]
    Figure PCTKR2019001159-appb-I000058
    [화학식 5]
    Figure PCTKR2019001159-appb-I000059
    [화학식 6]
    Figure PCTKR2019001159-appb-I000060
    [화학식 7]
    Figure PCTKR2019001159-appb-I000061
    [화학식 8]
    Figure PCTKR2019001159-appb-I000062
    [화학식 9]
    Figure PCTKR2019001159-appb-I000063
    [화학식 10]
    Figure PCTKR2019001159-appb-I000064
    [화학식 13]
    Figure PCTKR2019001159-appb-I000065
    [화학식 16]
    Figure PCTKR2019001159-appb-I000066
    .
    이때, 상기 화학식 2 내지 화학식 10에서, n은 2 내지 13의 정수로부터 선택됨
  14. 하기 화학식 1의 화합물로부터 선택되는 스핑고신-1-포스페이트(sphingosine-1-phosphate) 유사체
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2019001159-appb-I000067
    .
    이때, 상기 화학식 1에서, n은 2 내지 13의 정수로부터 선택됨
  15. 플레이트; 및
    상기 플레이트에 고정되는 하기 화학식 1의 화합물로부터 선택되는 스핑고신-1-포스페이트(sphingosine-1-phosphate) 유사체를 포함하는 면역 진단 키트
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2019001159-appb-I000068
    .
    이때, 상기 화학식 1에서, n은 2 내지 13의 정수로부터 선택됨
  16. 제15항에 있어서,
    상기 플레이트는 상기 스핑고신-1-포스페이트 유사체의 알콕시아민기와 반응할 수 있는 기능기를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 진단 키트.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 기능기는 에폭시기인 것을 특징으로 하는 면역 진단 키트.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 기능기는 카보닐기인 것을 특징으로 하는 면역 진단 키트.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 스핑고신-1-포스페이트 유사체는 상기 플레이트에 직접적으로 연결되는 면역 진단 키트.
  20. 제15항에 있어서,
    상기 면역 진단 키트는 지지 부재를 더 포함하는 면역 진단 키트.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 지지 부재는 단백질 분자인 것을 특징으로 하는 면역 진단 키트.
  22. 제20항에 있어서,
    상기 지지 부재는 상기 스핑고신-1-포스페이트 유사체의 알콕시아민기와 반응할 수 있는 기능기를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 진단 키트.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 기능기는 에폭시기인 것을 특징으로 하는 면역 진단 키트.
  24. 제22항에 있어서,
    상기 기능기는 카보닐기인 것을 특징으로 하는 면역 진단 키트.
  25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 스핑고신-1-포스페이트 유사체는 상기 지지 부재에 직접적으로 연결되는 면역 진단 키트.
  26. 제19항에 있어서,
    상기 면역 진단 키트는 엘라이자(enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA) 키트 또는 현장현시검사(point-of-care testing; POCT) 키트인 것을 특징으로 하는 면역 진단 키트.
  27. 제25항에 있어서,
    상기 면역 진단 키트는 엘라이자(enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA) 키트 또는 현장현시검사(point-of-care testing; POCT) 키트인 것을 특징으로 하는 면역 진단 키트.
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