WO2019107510A1 - 次亜塩素酸を含む抗微生物剤 - Google Patents

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慶且 池本
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株式会社フリーキラ製薬
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Definitions

  • the present invention relates to an anti-microbial agent comprising an aqueous solution of hypochlorous acid having excellent bactericidal effect and safety as an active ingredient.
  • Hypochlorous acid has conventionally been used in the form of hypochlorite for disinfecting hands, disinfecting tap water, disinfecting food, etc.
  • sodium hypochlorite NaClO
  • NaClO sodium hypochlorite
  • the effective chlorine concentration contained in such commercial products is generally around 5%, 6%, 10% and 12%.
  • Sodium hypochlorite is a sodium salt of hypochlorous acid, and when it is made into an aqueous solution, it has an oxidizing action, a bleaching action and a bactericidal action.
  • a simple aqueous solution of sodium hypochlorite (containing neither water nor sodium hypochlorite) is relatively stable in the alkaline region, but undergoes a very rapid decomposition reaction in the acidic region, resulting in chlorine gas It is dangerous because it occurs. Specifically, decomposition reaction occurs at pH 7 or less, and chlorine gas is rapidly generated at pH 5 or less. For this reason, it is strongly alkaline at pH 12 or higher at the time of production. In order to prevent such danger, an apparatus for preventing the generation of chlorine gas has been developed (see Patent Document 1 and Patent Document 2).
  • Glutaral and phthalal are difficult to degrade, but the time required for sterilization is long: 6 hours for glutaral and 96 hours for phthalal.
  • glutaral has a problem that the pungent smell is strong.
  • phthalal binds strongly to proteins, it is known that it is difficult to rinse when dirt remains.
  • an antimicrobial agent exerts an effect not only on bacteria but also on viruses or fungi (molds), and a plurality of antibacterial, antiviral and antifungal effects are required. There has been a strong social need for effective antimicrobial agents.
  • the present invention is an antimicrobial agent which comprises hypochlorous acid aqueous solution which is stable even in the neutral region and which has been completed under the above conditions and which has excellent bactericidal effect and safety.
  • infectious agent agents having a plurality of effects such as bactericidal, antiviral and antifungal effects may be collectively referred to as “antimicrobial agents”, and the antimicrobial agents may be referred to as “disinfectants”. .
  • One embodiment of the present invention is a hypochlorous acid aqueous solution having a residual chlorine concentration of 50 to 260 ppm in an antimicrobial agent, a pH of 3.0 to 6.7, and a killing time of the microorganism of 1 minute or less. It is an antimicrobial agent.
  • the residual chlorine concentration in the antimicrobial agent is preferably 100 ppm to 210 ppm, or more preferably 150 to 260 ppm, and the pH value is preferably 3.0 to 6.5, depending on the type of microorganism to be killed.
  • the aqueous solution of hypochlorous acid is preferably one containing sodium hypochlorite for food additives, purified water according to the Japanese Pharmacopoeia, and dilute hydrochloric acid according to the Japanese Pharmacopoeia. It is preferable to suppress the growth of any microorganism selected from the group consisting of yeast, fungi and viruses.
  • the bacteria is preferably any bacteria selected from the group consisting of Staphylococcus aureus, Serratia liquefaciensei, Bacillus subtilis and Listeria monocytogenes, and the yeast belongs to the genus Rhodorrhula. It is preferable that it is any bacteria which are
  • the fungus is selected from the group consisting of cladosporium cladosporoides, penicillium roqueforti, penicillium grubram, Aspergillus niger, eurotium amosterodami, neosultriya fischerii, emery Serratia nidulans, fusarium, and alternatearia. It is preferable to be some fungi.
  • the antimicrobial agent of the present invention also has an antiviral effect, and the virus is preferably norovirus.
  • Another embodiment of the present invention is characterized by immersing any microorganism selected from the group consisting of the bacteria, the yeast, the fungus, and the virus for 10 seconds to 10 minutes in the above-mentioned antimicrobial agent. Method of killing microorganisms.
  • Yet another embodiment of the present invention is an aqueous solution of hypochlorous acid having a residual chlorine concentration of 150 to 260 ppm in an aqueous solution and a hydrogen ion index of pH 3.0 to 6.5, wherein the killing time of the microorganism is 10 seconds
  • the antimicrobial agent which is the following.
  • the anti-microbial agent is for suppressing the growth of any microorganism selected from the group consisting of bacteria and viruses.
  • the bacterium is preferably any bacterium selected from the group consisting of Clostridium butyricum and Clostridium sporogenesis, and the virus is any one selected from the group consisting of canine parvo virus, feline parvo virus, and measles virus Is preferred.
  • Yet another aspect of the present invention is characterized by immersing any microorganism selected from the group consisting of the bacteria, the yeast, the fungus, and the virus for 10 seconds to 60 seconds in an antimicrobial agent. Method of killing microorganisms.
  • the aqueous solution of hypochlorous acid of the present invention According to the aqueous solution of hypochlorous acid of the present invention, the aqueous solution of hypochlorous acid having excellent bactericidal effect and safety, which is also useful as a medical drug, can be obtained.
  • FIG. 1 is a graph summarizing the difference in generation of chlorine in each pH range of the sodium hypochlorite aqueous solution and the hypochlorous acid aqueous solution of the present invention.
  • FIG. 2 is a graph showing the bactericidal effect against Clostridium butyricum NBRC 13949.
  • FIG. 3 is a graph showing the bactericidal effect on Clostridium sprogenes IFO 13950.
  • FIG. 4 is a graph showing an antiviral effect against feline parvovirus (Feline panleukemia virus) ATCC VR-648.
  • FIG. 5 is a graph showing the antiviral effect on Measles virus ATCC VR-24.
  • FIG. 6 is a graph showing the antiviral effect on feline calicivirus, mouse norovirus and coxsackie virus shown in Table 17.
  • FIG. 7 is a graph showing the antiviral effect on influenza virus shown in Table 17.
  • FIG. 8 is a graph showing the antiviral effect on herpes simplex virus shown in Table 17.
  • FIG. 9 is a graph showing the antiviral effect on adenoviruses shown in Table 17.
  • hypochlorous acid aqueous solution according to an embodiment of the present invention will be described.
  • hypochlorous acid aqueous solution is an aqueous solution produced by dissolving sodium hypochlorite in purified water to form an aqueous solution, and adjusting the pH with dilute hydrochloric acid.
  • sodium hypochlorite and dilute hydrochloric acid are approved as food additives, and purified water is also described in the Japanese Pharmacopoeia, the antimicrobial agent of the present invention is extremely safe.
  • the antimicrobial agent of the present invention dissolves sodium hypochlorite in purified water so as to be 0.018 to 0.026 W / V%, preferably 0.026 W / V%.
  • Dilute hydrochloric acid (about 9.5 to 10.5 W / V%) is added to the obtained aqueous solution of sodium hypochlorite and stirred well, and the resulting solution is adjusted to pH 6.0 to 6.5.
  • hypochlorous acid aqueous solution is referred to as "hypochlorous acid aqueous solution”.
  • the effective concentration of chlorine in the aqueous solution of hypochlorous acid is about 50 ppm to about 260 ppm, preferably about 200 ppm to about 210 ppm, depending on the type of microorganism to be killed.
  • the effective chlorine concentration is prepared by mixing an aqueous solution of sodium hypochlorite (effective chlorine 12%) and an aqueous solution of dilute hydrochloric acid (concentration: about 10%) in approximately equal volumes to prepare a mixture, for example, 99.9% purified water, It can be adjusted by mixing the remaining 0.1% as the above mixture.
  • aqueous solution of hypochlorous acid having an effective chlorine concentration adjusted to about 200 to about 780 ppm tap water equivalent to the aqueous solution of hypochlorous acid is added, or three times the aqueous solution of hypochlorous acid Add a quantity of tap water. In this way, it can be diluted to be 1/2 or 1/4 of the available chlorine concentration of the stock solution, and these can be used as an antimicrobial agent.
  • the available chlorine concentration can be adjusted to about 150 ppm to about 260 ppm, and the pH of this aqueous solution of hypochlorous acid can be adjusted to be in the range of 3.0 to 6.5 and used as an antimicrobial agent.
  • hypochlorous acid aqueous solution is manually produced by mixing the respective materials serving as the raw materials, but using a commercially available apparatus for producing the hypochlorous acid aqueous solution, An aqueous solution of hypochlorous acid can also be obtained (see Patent Document 1 and Patent Document 2).
  • the aqueous solution of hypochlorous acid of the present invention is a common aqueous solution of sodium hypochlorite, and the chlorine gas generated when the pH becomes 7 or less. The occurrence can be suppressed (see FIG. 1).
  • hypochlorous acid aqueous solution and its production example Sodium hypochlorite was weighed to 0.026% (W / V), mixed with purified water and diluted.
  • the aqueous solution of sodium hypochlorite prepared by this dilution was adjusted to pH 6.0 to 6.5 by adding dilute hydrochloric acid (about 9.5 to 10.5% (W / V)).
  • the residual chlorine concentration in this solution was 220 ppm.
  • purified water having the following properties was used.
  • Conductivity test Stir an appropriate amount of purified water into a beaker. The liquid temperature is adjusted to 25 ⁇ 1 ° C., and conductivity is measured at regular intervals while stirring vigorously. The conductivity when the change in conductivity per 5 minutes was 0.1 ⁇ S / cm or less was defined as the conductivity (25 ° C.) of purified water.
  • test sample The residual chlorine concentration of the aqueous solution of hypochlorous acid was adjusted to 200 ppm to obtain a test sample.
  • the following samples were prepared using the above-mentioned test sample and used for measurement of antiviral effect.
  • Negative control 500 ⁇ L of norovirus suspension
  • Positive control (5-fold dilution: 100 ⁇ L of norovirus suspension + 400 ⁇ L of purified water)
  • Sample 100 ⁇ L of norovirus suspension + 400 ⁇ L of test sample
  • RNA nucleic acid
  • RNAse was obtained by treating impurities with DNase.
  • the obtained RNA was amplified at room temperature using a PCR kit (Revertra-Plus, manufactured by Toyobo Co., Ltd.) to obtain a final product. 20 ⁇ g of the obtained final product was subjected to 2.5% agarose gel electrophoresis (100 V, 50 minutes) to confirm whether norovirus DNA was amplified or not.
  • Table 3 The results are shown in Table 3 below.
  • Test sample The hypochlorous acid aqueous solution prepared in Example 1 was used. The residual chlorine concentration of the stock solution was 200 ppm. This stock solution was used in 2-fold serial dilution diluted to 100 ppm, 50 ppm, 25 ppm, 12.5 ppm, and 6.3 ppm.
  • Test method 1 Test bacteria Seven kinds of bacteria shown in the following Table 4 were used. A stock solution with a residual chlorine concentration of 200 ppm is serially diluted 2-fold with sterile distilled water to prepare dilutions of 100 ppm, 50 ppm, 25 ppm, 12.5 ppm, 6.3 ppm, and 20 mL test tubes was used in aliquots of 5 mL. The residual chlorine concentration in the sample was measured with a Handy water quality meter AQ-101 (manufactured by Shibata Scientific Co., Ltd.).
  • test bacteria were subjected to static culture at 35 ° C. for 20 to 24 hours, using Tryptic Soy Broth (hereinafter sometimes abbreviated as “TSB”) as a culture medium. (Pre-culture), subjected to the test.
  • TTB Tryptic Soy Broth
  • the number of test bacteria cultured was 1 ⁇ 10 7 to 1 ⁇ 10 8 .
  • Test method 0.1 mL each of a solution containing each of the bacteria shown in Table 4 (hereinafter sometimes referred to as "bacteria solution”) was inoculated into a sample of each concentration and mixed to obtain a sample. After inoculation, when a predetermined time (0.5 minutes, 1 minute, 2 minutes, 5 minutes, and 10 minutes) has passed, 0.1 mL of each sample is withdrawn, and each is inoculated and diluted in 2 mL of TSB and diluted. The solution was prepared. Furthermore, 0.1 mL was taken out from TSB inoculated with each of the above-mentioned bacteria, and smeared on a plate agar medium containing SA medium. The agar medium to which each of the bacteria was smeared was cultured at 35 ° C. for 24 hours, and colonies appearing on the plate were counted.
  • a predetermined time 0.5 minutes, 1 minute, 2 minutes, 5 minutes, and 10 minutes
  • Bacillus subtilis forms only one spore among seven test bacteria. It was considered that spore formation was the reason why B. subtilis did not die unless the concentration of residual chlorine was as high as 100 ppm. Spores are generally said to be resistant to heat, disinfectants, ultraviolet light or dryness, but have also been shown to be resistant to aqueous hypochlorous acid solutions.
  • Test sample A stock solution with a residual chlorine concentration of 200 to 210 ppm is diluted 2 and 4 times with sterile distilled water to obtain a diluted solution with a residual chlorine concentration of 100 to 103 ppm (hereinafter referred to as “X2 dilution liquid”) ) And residual chlorine concentration of 50 to 52 ppm (hereinafter referred to as “X4 dilution”) were prepared, and each 10 mL aliquots were dispensed into 15 mL test tubes for testing. .
  • the residual chlorine concentration in the sample was measured with a Handy water quality meter AQ-101 (manufactured by Shibata Scientific Co., Ltd.). Further, the measurement time was set to 30 seconds, 60 seconds, 5 minutes, and 10 minutes, and the measurement time was extended to 30 minutes only with the X4 dilution solution.
  • Test bacteria Using four types of bacteria, two types of yeasts, and eight types of fungi (filamentous fungi) shown in Table 7 below, plate agar or liquid medium described later is used. The test was done.
  • the above-mentioned bacteria, yeast and fungi may be collectively referred to as "test bacteria”.
  • test bacteria shown in the following Table 7 were precultured under the following conditions and used for the test.
  • Bacteria pre-culture was performed at 37 ° C. for 24 hours using SA medium.
  • Yeast preculture was performed at 25 ° C. for 48 hours using potato dextrose (PDA) medium.
  • PDA potato dextrose
  • the preculture of the fungus (filamentous fungus) was carried out at 25 ° C. for 7 to 10 days using PDA medium.
  • bacteria or yeast should be adjusted to 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 6 CFU / mL using sterile saline. Prepared. In addition, filamentous fungi (fungi) were prepared to be 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 6 CFU / mL using physiological saline containing 0.05% Tween 80.
  • test method The effect of hypochlorous acid aqueous solution on test bacteria shown in the following Table 7 was examined by a method using a plate agar or a liquid medium.
  • (2-4-1) Test using plate agar medium Inoculate 0.1 mL each of the bacterial solution prepared as described above to each sample (10 mL) placed in a test tube volume of 15 mL, and then at room temperature It stood still and was made to contact. When a predetermined time (30 seconds, 60 seconds, 5 minutes, 10 minutes, X4 dilution only 30 minutes) has elapsed, 0.1 mL each is aseptically drawn from the test sample, and the dilution step series is performed with sterile saline. It was prepared and used as a growth confirmation sample.
  • the growth confirmation sample was smeared on SA medium in the case of bacteria and on PDA medium in the case of yeast and fungi.
  • the plate agar medium to which each sample was smeared was cultured at 35 ° C. for 2 days for bacteria, 2 days at 25 ° C. for yeast, and 7 days at 25 ° C. for fungi.
  • test piece was inoculated with the number of initial bacteria shown in Tables 7 to 12 below.
  • the test sample 1 mL each was aseptically withdrawn, further diluted, and inoculated into each of the above-mentioned media.
  • the ACD medium inoculated with bacteria was cultured at 35 ° C. for 2 days
  • the GP medium inoculated with yeast was cultured at 25 ° C. for 2 days
  • the GP medium inoculated with fungi was cultured at 25 ° C. for 7 days.
  • Test Results Tables 7 to 9 show the number of bacteria at each treatment time in the case of the test using plate agar. Further, the number of bacteria at each treatment time when the liquid medium is used is shown in Tables 10-12. In the table, + indicates that the growth of the fungus was observed (a colony was formed), and-indicates that the fungus was killed (a colony formation was not observed).
  • the strain described as Escherichia coli or E. coli is Escherichia coli KEC-B-001
  • the strain described as Staphylococcus aureus or S. aureus is Staphylococcus aureus KEC-B-002.
  • the strain described as Serratia sp. Represents Serratia sp. THMC 56
  • the strain described as Bacillus subtilus or B. subtilus represents Bacillus subtilus KEC-B-007, respectively.
  • the strain described as Candida albicans or C. albicans represents Candida albicans HRC 032, and the strain described as Rhodotorula sp. Represents Rhodotorula sp. HRC 042, respectively.
  • the strain described as Cladosporium cladosporioides or C. cladosporioides is described as Cladosporium cladosporioides HRC 219, and the strain described as Altrnaria alternate or A. alternate is described as Altrnaria alternate HRC 237 as Penicillium glabrum or P. glabrum Strains described as Penicillium glabrum HRC 659, strains described as Aspergillus niger or A.
  • niger as Aspergillus niger HRC 258, strains described as Chaetomium sp. As Chaetomium sp. HRC 280, as Fusarium sp. The strain described is Fusarium sp. HRC 289, the strain described as Emericella nidulans or E. nidulans represents Emericella nidulans HRC 210, and the strain described as Neosartorya sp. Represents Neosartorya sp. HRC 259, respectively.
  • the killing time of 4 bacteria and 2 yeasts was 0.5 minutes or less.
  • the killing time of the fungus was less than 0.5 minutes except for Chaetomium.
  • the following shows the effects of sterilization and the like on each microorganism when a liquid culture medium is used. Even when a liquid medium was used, 0.1 mL was withdrawn from each sample at each treatment time, and smeared on the same agar medium as described above, and the number of viable cells was determined from the colony formation number.
  • hypochlorous acid aqueous solution of the present invention is extremely safe because it is approved as a pharmaceutical product because only purified water is added to the weakly acidic hypochlorous acid aqueous solution as described above. It is also cheaper than pharmaceutical formulations and can be used to improve hygiene in different areas.
  • Test method 1 Test bacteria The following test bacteria were used to confirm the bactericidal effect of hypochlorous acid aqueous solution. Escherichia coli (E. coli) Salmonella Enteritidis (Salmonella) Candida sp. (Candida) Pseudomonas aeruginosa (Pseudomonas aeruginosa)
  • hypochlorous acid aqueous solution was diluted to have an effective chlorine concentration of 200, 20, 5, 2, 1 and 0.5 ppm, respectively, and used as a test sample. These samples were each dispensed in 5 mL aliquots into 20 mL test tubes. In addition, sterile pure water containing no aqueous solution of hypochlorous acid was used as a control.
  • test bacteria were subjected to static culture at 35 ° C. for 20 to 24 hours in TSB (Tryptic Soy Broth), and were subjected to the test.
  • concentration of the test solution was prepared by diluting the culture solution with sterile pure water.
  • the number of bacteria was 1.2 ⁇ 10 6 / mL for E. coli and 1.7 ⁇ 10 6 / mL for salmonella.
  • test bacteria were cultured at 25 ° C. for 44 to 48 hours in PDA (Potato Dextrose Agar) medium. The cultured cells were suspended in sterile pure water to prepare a cell solution. The number of bacteria was 2.7 ⁇ 10 6 / mL.
  • PDA Potato Dextrose Agar
  • stationary culture was carried out at 25 ° C. for 44 to 48 hours in TSB, and the culture solution was diluted with sterile pure water to prepare. The number of bacteria was 2.3 ⁇ 10 6 / mL.
  • Test method 0.2 mL of bacterial solution was inoculated to each concentration sample and mixed. At 0.5 minutes, 5 minutes, and 10 minutes, 0.2 mL was removed from each sample and suspended in 1.8 mL of sterile pure water containing 1 mg / mL sodium thiosulfate. This suspension and a solution diluted 10-fold with sterile pure water containing 1 mg / mL sodium thiosulfate are further added to SA agar medium in the case of bacteria and PDA agar medium in the case of yeast. I smeared each mL. As a control, sterile pure water was used in place of sodium thiosulfate-containing sterile pure water. After culturing the medium, colonies appearing on the plate were counted to determine the number of viable cells.
  • Viral strains include feline calicivirus (FCV / F9), mouse norovirus (MNV CW1), coxsackie virus A7 (CA7) and B5 (CB5), influenza virus (A / PR8 and A / USSR / 92/97), herpes simplex virus Types 1 (HSV-HF) and 2 (HSV-UW), adenovirus types 3 (Ad. 3) and 5 (Ad. 5) and 8 (Ad. 8) were used.
  • CRFK cells for feline calicivirus As susceptible cells, CRFK cells for feline calicivirus, RAW 264.7 cells for mouse norovirus, Vero cells for coxsackie virus and herpes simplex virus, MDCK cells for influenza virus, A549 cells for adenovirus , Each used.
  • the antiviral effect test method was as follows. First, 100 ⁇ L of each stock virus solution was added to and mixed with 900 ⁇ L of the sample solution.
  • a 10-fold dilution series was prepared using a medium containing 0.1 N sodium thiosulfate. 10 ⁇ L was drawn from each dilution series, contacted with sensitive cells, and then 100 ⁇ L of a maintenance medium was added, and cultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator for 3 to 10 days.
  • hypochlorous acid aqueous solution of the present invention exhibited a high antiviral effect against any of the viruses.
  • the residual chlorine concentration in the sample was measured with a Handy water quality meter AQ-101 (manufactured by Shibata Scientific Co., Ltd.). Moreover, measurement time was made into 10 seconds, 1 minute, 5 minutes, and 10 minutes.
  • test bacteria shown in the following Tables 18 and 19 were precultured under the following conditions and used for the test.
  • the preculture of the above bacteria is carried out in 10 mL of CS liquid medium containing 2.0% corn starch, 2.0% amino acid solution and 0.75% calcium carbonate, Clostridium butyricum NBRC13949 (Clostridium butyricum NBRC13949), or Clostridium sporogenes (Clostridium sporogenes IFO 13950)
  • the strain was inoculated and anaerobically cultured at 37 ° C. for 24 hours by carbon dioxide gas-exchanged steel wool method to prepare a preculture liquid.
  • test bacteria precultured as described above were prepared to be 1 ⁇ 10 7 to 1 ⁇ 10 6 CFU / mL using sterile physiological saline.
  • test method The effect of hypochlorous acid aqueous solution on test bacteria shown in the following Tables 17 and 18 was examined by a method using Brain heart infusion plate agar or culture medium. 100 ⁇ L of the test bacterium is added to 900 ⁇ L of the test sample solution prepared as described above and mixed, and after 10 seconds, 1 minute, 5 minutes and 10 minutes, a BHI medium to which 0.1 N sodium thiosulfate is added is added. A 10-fold dilution series was prepared at each time point, and 10 ⁇ L was applied to BHI agar medium, anaerobically cultured at 37 ° C. for 24 hours by carbon dioxide-substituted steel wool method, and the number of bacteria was measured.
  • the killing time of the above two types of clostridial is 10 seconds or less, and regardless of the chlorine concentration and pH of the aqueous solution of hypochlorous acid, the clostridial is killed in a very short time. It was shown to have an effect.
  • Test sample The following samples were prepared using the hypochlorous acid aqueous solution prepared in the above-mentioned Example 7 (1) as a test material, and were used for determination of the bactericidal effect against the following bacteria.
  • Test method 1 Test bacteria Clostridium (Clostridium butyricum NBRC 13949) and Clostridium sporogenes (Clostridium sporogenes IFO 13950) shown in the following Tables 20 and 21 were used.
  • test bacteria Culture before test The test bacteria is used as a culture medium in sheep blood agar medium for CDC anaerobic bacteria (Japan BD Co., Ltd., sometimes abbreviated as "blood agar medium” hereinafter) as a culture medium in an anaerobic chamber. Stationary culture was carried out at 37 ° C. for 24 to 48 hours (pre-culture) and subjected to the test. The number of test bacteria was adjusted to 1 ⁇ 10 7 to 1 ⁇ 10 8 CFU / mL.
  • Test Results The results of the bactericidal effect test at each treatment time are shown in Tables 20 and 21 divided by bacteria.
  • Test strain Parvovirus Feline panleukopenia virus (ATCC (registered trademark) VR-648) belonging to parvoviridae, Canine parvovirus (ATCC VR-2017) and measles virus Measles virus (paramyxoviridae) ATCC VR-24) was used.
  • CRFK cells (JCRB9035) as sensitive cells for proliferation of Feline panleukopenia virus
  • A-72 cells (ATCC CRL-1542) as sensitive cells for proliferation of Canine parvovirus
  • Vero as sensitive cells for proliferation of Measles virus Virus suspensions were prepared using cells (DS Pharma Ltd., Inc. CA Inc.).
  • the control solution and sample solution used for measuring the effect of each virus are as shown in Table 22 below.
  • hypochlorous acid of the present invention From the aqueous solution of hypochlorous acid of the present invention, no generation of gas was observed, and it was confirmed that chlorine gas was not generated even in a pH range as low as pH 3.0 to 5.5.
  • the volume of test material was 1,000 ⁇ L for both control and sample.
  • the negative control was phosphate buffer only
  • the positive control was 100 ⁇ L of virus suspension + 900 ⁇ L of phosphate buffer
  • the sample was 100 ⁇ L of virus suspension + 900 ⁇ L of test sample (hypochlorous acid aqueous solution).
  • each virus was diluted 10-fold as described above, and each sensitive cell was inoculated with the same amount to determine the virus infectivity titer.
  • the viral infectivity titer is observed under the microscope with morphological changes and cytopathic effects caused by the infection of each sensitive cell with each of the above-mentioned viruses, and the cytopathic effect is observed up to how high the degree of dilution It was decided whether it was done.
  • the measurement of the virus infectivity titer was performed in the following procedures. 100 ⁇ L of the virus suspension was added to 900 ⁇ L of the sample and stirred with a vortex mixer for 10 seconds or 60 seconds to prepare a sample (a mixture of the virus suspension and an aqueous solution of hypochlorous acid). This mixture was diluted with the above-described cell maintenance medium to prepare a 10-fold dilution series.
  • each plate was cultured for 7-10 days in a 37 ° C. CO 2 incubator.
  • the cytopathic effect was observed using a microscope and the TCID 50 was determined by the Behrens-Karber method. The results are shown in Tables 23-25 below.
  • hypochlorous acid aqueous solution of the present invention was shown to have virucidal activity against feline parvovirus, canine parvovirus and measles virus in a low pH region.
  • the present invention is particularly useful in the fields of medicine and pharmacy, as it is an antimicrobial agent in a wide range of fields such as cleaning of cooking utensils, etc. in addition to sterilization of fingers.

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Abstract

本発明は、優れた殺菌効果と安全性とを有する、次亜塩素酸水溶液を提供することを目的とする。　ｐＨ３．０～６．７の次亜塩素酸水溶液であって、前記水溶液中の有効塩素濃度が５０～２６０ｐｐｍである抗微生物剤を提供する。また、殺菌処理の対象となる部材を前記抗微生物剤に０．５～１０分間浸漬することを特徴とする、殺菌方法を提供する。前記抗微生物剤は、ノロウイルス、スタフィロコッカス・オウレウスその他の細菌、ロドトルラ属に属する酵母、クラドスポリウム・クラドスオイリオイデスその他の真菌という幅広い抗微生物スペクトラムを有する。

Description

次亜塩素酸を含む抗微生物剤
　本発明は、優れた殺菌効果と安全性とを有する次亜塩素酸水溶液を有効成分とする抗微生物剤に関する。
　近年、内視鏡を初めとする、低侵襲で患部を切除できる小型の医療機器の普及が進んでいる。こうした小型の医療機器による治療には、開胸・開腹手術のような、高度の侵襲を伴う外科手術に比べて、患者への負担が少なく、入院期間も短いという利点がある。一方で、これらの医療機器は、一回治療に使用されると血液、細菌等の付着によって高度に汚染されるため、滅菌を十分に行わないと、感染を広げる可能性がある。
　こうした医療機器の消毒には高度抗微生物剤が必要であり、現在、改良型のホルマリンを含むグルタラール又はフタラール、過酢酸が使用されている。
　従来、次亜塩素酸は、次亜塩素酸塩の形で、手指の消毒、水道水の殺菌、食品の殺菌等のために使用されてきた。例えば、次亜塩素酸塩の１種である次亜塩素酸ナトリウム（sodium hypochlorite：NaClO）は、酸化作用、漂白作用及び殺菌作用を有することが知られており、次亜塩素酸塩を含む除菌剤等は、水溶液又は粉末状の家庭用の製品が市販されている。こうした市販品中に含まれる有効塩素濃度は、一般的に、5％、6％、10％、及び12％程度である。
　次亜塩素酸ナトリウムは次亜塩素酸のナトリウム塩であり、水溶液にすると、酸化作用、漂白作用及び殺菌作用を有する。単なる次亜塩素酸ナトリウムの水溶液（水と次亜塩素酸ナトリウム以外のものを含まない）は、アルカリ性領域では比較的安定であるが、酸性領域では、極めて急激に分解反応を起こし、塩素ガスを発生するため危険である。具体的には、pH 7以下では分解反応が生じ、pH 5以下では急激に塩素ガスが発生する。このため、製造時は、pH 12以上の強アルカリ性となっている。こうした危険を防止するために、塩素ガスの発生を防ぐ装置が開発されている（特許文献１及び特許文献２参照。）。
特許第４７４０８９２号公報 特許第５３０７３５１号公報
http://www.kenei-pharm.com/medical/countermeasure/faq/b07.php
　現在、高度抗微生物剤として主に使用されているのは上記３種類であるが、最も効果の高い過酢酸でも滅菌には10分間を要し、また、過酢酸は、医療機器の材質を劣化させることが知られている。
　グルタラール及びフタラールは材質を劣化させにくいが、滅菌に要する時間が長く、グルタラールで6時間、フタラールでは96時間が必要である。また、グルタラールは刺激臭が強いという問題点がある。さらに、フタラールはタンパク質と強く結合するため、汚れが残留しているとリンスを行ないにくいことが知られている。
　効率よく治療を進めるためには、滅菌を短時間で終えることができるとともに、材質の劣化を起こさず、タンパク質と強く結合しない消毒薬が必要である。このため、短時間で滅菌を終えることができ、かつ、材質の劣化を起こさず、タンパク質と強く結合しない消毒薬に対する強い社会的要請があった。
　また、低ｐＨの薬剤を注射すると痛みが強いことでも知られているように、次亜塩素酸のような強アルカリ性の薬剤を医療機器の殺菌等に使用した場合、そうした薬剤がヒトの皮膚（約pH 4.5～6.0）等に接触すると、強い痛みが出ることがある。このため、より中性領域のｐＨを有する殺菌剤に対する高い社会的要請があった。
　そして、消毒剤として使用する薬剤には、高い殺菌性を有することに加えて、高度な安全性が確保されていることも求められる。このため、これら２つの性質を兼ね備える消毒剤に対する強い社会的な要請があった。
　また、こうした抗微生物剤は、細菌のみならず、ウイルスに又は真菌（カビ）に対しても、効果を発揮するものであることが望まれており、殺菌、抗ウイルス及び抗真菌効果という複数の効果を有する抗微生物剤に対する強い社会的要請があった。
　本発明は、以上のような状況の下で完成されたものであり、優れた殺菌効果と安全性とを有する、中性領域でも安定な次亜塩素酸水溶液を有効成分とする抗微生物剤（以下、「消毒剤」ということがある。）を提供することを目的とする。すなわち、本明細書中では、殺菌、抗ウイルス及び抗真菌効果という複数の効果を有する薬剤を集合的に「抗微生物剤」と称し、また、前記抗微生物剤を「消毒剤」ということがある。
　本発明のある態様は、抗微生物剤中の残留塩素濃度が５０～２６０ｐｐｍであり、ｐＨ３．０～６．７の次亜塩素酸水溶液であって、微生物の死滅時間が１分以下である、抗微生物剤である。前記抗微生物剤中の残留塩素濃度は、死滅対象となる微生物の種類によって、１００ｐｐｍ～２１０ｐｐｍであるか、１５０～２６０ｐｐｍかつ前記水素イオン指数がｐＨ３．０～６．５であることがさらに好ましい。
　ここで、前記次亜塩素酸水溶液は、食品添加物用次亜塩素酸ナトリウムと、日本薬局方精製水と、日本薬局方希塩酸とを含むものであることが好ましく、また、前記抗微生物剤は、細菌、酵母、真菌及びウイルスからなる群から選ばれるいずれかの微生物の増殖を抑制するものであることが好ましい。
　前記細菌は、スタフィロコッカス・オウレウス、セラチア・リケファシエンセイ、バチルス・ズブチリス及びリステリア・モノサイトゲネシスからなる群から選ばれるいずれかの細菌であることが好ましく、前記酵母は、ロドトルラ属に属するものであるいずれかの菌であることが好ましい。
　前記真菌は、クラドスポリウム・クラドスポリオイデス、ペニシリウム・ロケフォルティ、ペニシリウム・グラブラム、アスペルギルス・ニガー、エウロティウム・アモステロダミ、ネオサルトリヤ・フィシェリ、エメリセラチア・ニデュランス、フザリウム、及びアルテナリヤからなる群から選ばれるいずれかの真菌であることが好ましい。また、本発明の抗微生物剤は、抗ウイルス効果をも有し、前記ウイルスは、ノロ・ウイルスであることが好ましい。
　本発明の他の実施態様は、上述した抗微生物剤中に、前記細菌、前記酵母、前記真菌、及び前記ウイルスからなる群から選ばれるいずれかの微生物を１０秒～１０分間浸漬することを特徴とする微生物の死滅方法である。
　本発明のさらに別の態様は、水溶液中の残留塩素濃度が１５０～２６０ｐｐｍであり、水素イオン指数がｐＨ３．０～６．５の次亜塩素酸水溶液であって、微生物の死滅時間が１０秒以下である、上記抗微生物剤である。そして、前記抗微生物剤は、細菌及びウイルスからなる群から選ばれるいずれかの微生物の増殖を抑制するものであることが好ましい。
　前記細菌は、クロストリジウム・ブチリカム及びクロストリジウム・スポロゲネシスからなる群から選ばれるいずれかの細菌であることが好ましく、前記ウイルスは、イヌパルボ・ウイルス、ネコパルボ・ウイルス、及び麻疹ウイルスからなる群から選ばれるいずれかのウイルスであることが好ましい。
　本発明のさらにまた別の態様は、抗微生物剤中に、前記細菌、前記酵母、前記真菌、及び前記ウイルスからなる群から選ばれるいずれかの微生物を１０秒～６０秒間浸漬することを特徴とする微生物の死滅方法である。
　本発明の次亜塩素酸水溶液によれば、医療用医薬品としても有用な、優れた殺菌効果と安全性とを有する次亜塩素酸水溶液とすることができる。
図１は、次亜塩素酸ナトリウム水溶液と本発明の次亜塩素酸水溶液との各ｐＨ領域における塩素の発生の相違をまとめたグラフである。 図２は、クロストリジウム・ブチリカムNBRC13949に対する殺菌効果を示すグラフである。 図３は、クロストリジウム・スプロゲネスIFO13950に対する殺菌効果を示すグラフである。
図４は、ネコパルボウイルス（Feline panleukemia virus）ATCC VR-648に対する抗ウイルス効果を示すグラフである。 図５は、麻疹ウイルス（Measles virus）ATCC VR-24に対する抗ウイルス効果を示すグラフである。 図６は、表１７に示すネコカリシウイルス、マウスノロウイルス、コクサッキーウイルスに対する抗ウイルス効果を示すグラフである。
図７は、表１７に示すインフルエンザウイルスに対する抗ウイルス効果を示すグラフである。 図８は、表１７に示す単純ヘルペスウイルスに対する抗ウイルス効果を示すグラフである。 図９は、表１７に示すアデノウイルスに対する抗ウイルス効果を示すグラフである。
　以下、本発明の一実施形態に係る次亜塩素酸水溶液について説明する。
（次亜塩素酸水溶液及びその製造例）
　本発明の抗微生物剤は、次亜塩素酸水溶液は、次亜塩素酸ナトリウムを精製水に溶解して水溶液とし、希塩酸でｐＨを調整することによって生成される水溶液である。ここで、次亜塩素酸ナトリウム及び希塩酸は、いずれも食品添加物として認可されており、精製水も日本薬局方に記載されているから、本発明の抗微生物剤は、極めて安全性が高い。
　具体的には、本発明の抗微生物剤は、次亜塩素酸ナトリウムを精製水中で、0.018～0.026 W/V％、好ましくは0.026 W/V％となるように溶解させる。得られた次亜塩素酸ナトリウム水溶液に、希塩酸（約9.5～10.5 W/V％）を加えてよく撹拌し、得られた溶液がpH 6.0～6.5となるように調整する。以下、ここで得られた水溶液を、「次亜塩素酸水溶液」という。
　上記次亜塩素酸水溶液中の有効塩素濃度は、死滅させようとする微生物の種類に応じて、約50 ppm～約260 ppm、好ましくは約200 ppm～約210 ppmとすることが、高い死滅効果を確保する上で好ましい。上記有効塩素濃度は、次亜塩素酸ナトリウム水溶液（有効塩素12％）と希塩酸水溶液（濃度約10％）とをほぼ等容で混合して混合液を調製し、例えば、精製水を99.9 ％、残りの0.1 ％を上記混合液として混合することによって、調整することができる。
　例えば、有効塩素濃度を約200～約780 ppmに調整した次亜塩素酸水溶液を原液とした場合、次亜塩素酸水溶液と等量の水道水を加えるか、又は次亜塩素酸水溶液の３倍量の水道水を加える。このようにして原液の有効塩素濃度の１／２又は１／４になるように希釈することができ、これらを抗微生物剤として使用することができる。
　また、有効塩素濃度を約150 ppm～約260 ppmに調製するとともに、この次亜塩素酸水溶液のpHを、3.0～6.5の範囲になるように調節し、抗微生物剤として使用することもできる。
　なお、上記の製造例においては、原料となる各物質を混合して、次亜塩素酸水溶液をマニュアルで製造しているが、市販されている次亜塩素酸水溶液の製造装置を利用して、次亜塩素酸水溶液を得ることもできる（特許文献１及び特許文献２参照）。
　希塩酸を添加してｐＨを中性領域とすることによって、本発明の次亜塩素酸水溶液は、普通の次亜塩素酸ナトリウム水溶液であれば、pH ７以下となったときに発生する塩素ガスの発生を抑えることができる（図１参照）。
（次亜塩素酸水溶液及びその製造例）
　次亜塩素酸ナトリウムを、0.026 ％（W/V）となるように秤量し、精製水と混合して希釈した。この希釈によって調製した次亜塩素酸ナトリウム水溶液を、希塩酸（約9.5～10.5 ％ (W/V）)を加えてpH 6.0～6.5となるように調整した。この溶液中の残留塩素濃度は、220 ppmであった。
（次亜塩素酸水溶液の成分分析）
　以下に次亜塩素酸水溶液の成分分析表を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　また、本実施例では、以下の性質を有する精製水を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  * 導電性試験：適当量の精製水をビーカーにとって撹拌する。液温を25±1℃に調節し、強く撹拌しながら、一定時間ごとに導電率の測定を行う。5分当たりの導電率変化が0.1 μS/cm以下となったときの導電率を精製水の導電率（25℃）とした。
（ノロウイルスに対する殺ウイルス効果の測定）
（１）供試株
　糞便由来のノロウイルス(NV遺伝子２群に属するNorovirus)を使用した。このウイルスについては、厚生労働省の推奨するノロウイルスの検出法(ＰＣＲ法)に従って、定性的に確認した。
（２）被検試料の準備
　次亜塩素酸水溶液の残留塩素濃度が、200 ppmとなるように調整し、被検試料とした。上記被検試料を用いて以下の試料を調整し、抗ウイルス効果の測定に使用した。
　　(a) 陰性対照（500μLのノロウイルス懸濁液)
　　(b) 陽性対照（５倍希釈：ノロウイルス懸濁液100μL＋精製水400μL)
　　(c) 試料(100μLのノロウイルス懸濁液＋400μLの被検試料)
（３）測定方法
　ノロウイルスの増殖は、ＰＣＲ法にて確認した。まず、上記３つの測定用試料をボルテックスミキサーにて撹拌し、15分間室温にて静置し、ＲＴ－ＰＣＲ法に従って核酸(ＲＮＡ)を抽出し、DNaseで不純物を処理してＲＮＡを得た。得られたＲＮＡを、PCRキット（Revertra-Plus、東洋紡（株）製）を用い、室温で増幅させて最終産物を得た。
　得られた最終産物20μgを、2.5％アガロースゲル電気泳動（100 V、50分）に供し、ノロウイルスのＤＮＡが増幅されたか否かを確認した。結果を下記表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　上記表３に示すように、対照区ではいずれもノロウイルスの増殖が見られたが、試験区では、いずれもノロウイルスの増殖は見られなかった。以上より、本発明の次亜塩素酸水溶液は、ノロウイルスに対して殺ウイルス活性を有することが示された。
（細菌に対する殺菌効果の測定）
（１）供試試料
　実施例１で調製した次亜塩素酸水溶液を使用した。原液の残留塩素濃度は200 ppmであった。この原液を、２倍の段階希釈を行なって、100 ppm、50 ppm、25 ppm、12.5 ppm、及び6.3 ppmに希釈して使用した。
（２）試験法
　１）供試菌
　下記表４に示す７種類の細菌を使用した。残留塩素濃度が200 ppmの原液を、滅菌蒸留水を用いて２倍系列希釈して、100 ppm、50 ppm、25 ppm、12.5 ppm、6.3 ppm の各希釈液を調製し、20 mL容試験管に5 mLずつ分注して使用した。試料中の残留塩素濃度測定は、ハンデイ水質計AQ-101（柴田科学（株）製）で測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　２）試験前培養
　供試菌を、トリプチックソイブロス（Tryptic Soy Broth、以下、「ＴＳＢ」と略すことがある。）を培地として用いて、35℃にて、20～24時間静置培養し（前培養）、試験に供した。培養した供試菌の菌数は、１×107～１×108であった。
　３）試験方法
　各濃度の試料に、上記表４に示す各菌を含む溶液（以下、「菌液」ということがある。）を0.1 mLずつ接種して混合し、試料とした。接種後、所定時間（0.5分、1分、2分、5分、及び10分）を経過したときに、各試料から0.1 mLずつを抜き取り、2 mLのＴＳＢにそれぞれ接種して希釈し、希釈液を調製した。さらに、上記の各菌を接種したＴＳＢから0.1 mLを取り出し、ＳＡ培地を含む平板寒天培地に塗抹した。各菌を塗抹した寒天培地を、35℃にて24時間培養し、平板上に出現したコロニーを計測した。
　４）判定
　試料の濃度別に、出現コロニー数を処理時間毎に生残菌数を計測し、殺菌効果を判定した。
（３）試験結果
　各処理時間における最小殺菌濃度を上記表４に示す。表４に示す各細菌が、上述した残留塩素濃度のうちどの濃度で死滅したかを、下記表５～６に示す。表中、＋は菌の生育が見られたもの（コロニーが形成されたもの）、－は菌が死滅したもの（コロニー形成が見られなかったもの）を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表４に示す７種の細菌を用いた最小殺菌濃度試験の結果から、残留塩素濃度が12.5 ppm以上であれば、枯草菌（Bacillus subtilis）を除き、他の６種の細菌は２分間処理でコロニー形成が見られなくなり、死滅したと判定された。
　特に、次亜塩素酸水溶液は、緑膿菌に対する効果が強く、残留塩素濃度が12.5 ppm以上であれば、0.1分以内の処理でコロニー形成が見られなくなり、菌が死滅したと判定された。また、残留塩素濃度が6.3 ppmの場合でも、10分間の処理でコロニー形成が見られなくなり、菌が死滅したものと判定された。
　枯草菌（Bacillus subtilis）は、供試菌７種のうち、唯一芽胞を形成する。枯草菌が残留塩素濃度100 ppmという高濃度でなければ死滅しなかったのは、芽胞形成が原因と考えられた。芽胞は、一般的に、熱、消毒薬剤、紫外線又は乾燥に強いと言われているが、次亜塩素酸水溶液に対しても、抵抗性があることが示された。
（細菌、酵母及び真菌に対する効果の測定）
（１）供試試料
　残留塩素濃度が200～210 ppmの原液を、滅菌蒸留水で2倍及び4倍に希釈し、残留塩素濃度が100～103 ppmの希釈液（以下、「X2希釈液」という。）及び残留塩素濃度が50～52 ppmの希釈液（以下、「X4希釈液」という。）を調製し、15 mL容量の試験管に、それぞれ10 mLずつ分注して試験に供した。試料中の残留塩素濃度測定は、ハンデイ水質計AQ-101（柴田科学（株）製）で測定した。また、測定時間を、30秒、60秒、5分、及び10分とし、X4倍希釈液のみ、測定時間を30分まで延長した。
（２）試験法
（２－１）供試菌
　下記表７に示す４種類の細菌、２種類の酵母、及び８種類の真菌（糸状菌）を使用し、後述する平板寒天又は液体培地を用いた試験を行なった。以下、上記細菌、酵母、及び真菌（糸状菌）を集合的に「供試菌」ということがある。
（２－２）試験前培養
　下記表７に示す供試菌を以下の条件で前培養して試験に供した。細菌の前培養は、ＳＡ培地を用いて、37℃にて24時間行った。酵母の前培養は、ポテトデキストロース（ＰＤＡ）培地を用いて、25℃にて48時間行った。真菌（糸状菌）の前培養は、ＰＤＡ培地を用いて、25℃にて7～10日間行った。
（２－３）菌液の調製
　上記のように前培養した供試菌のうち、細菌又は酵母は滅菌生理食塩水を用いて、１×105～１×106CFU/mLになるように調製した。また、糸状菌（真菌）は、0.05 ％のTween 80を含む生理食塩水を用いて１×105～１×106CFU/mLになるように調製した。
（２－４）試験方法
　次亜塩素酸水溶液の下記表７に示す供試菌に対する効果を平板寒天又培地は液体培地を用いた方法で検討した。
（２－４－１）平板寒天培地を使用した試験
　上記のように調製した菌液を、15 mL容量の試験管に入れた各試料（10 mL）に対して0.1 mLずつ接種し、室温にて静置して接触させた。所定時間（30秒、60秒、5分、10分、X4倍希釈のみ30分）が経過したときに、供試試料から0.1 mLずつ、無菌的に抜き取り、滅菌生理食塩水で希釈段階系列を作成して、増殖確認用試料とした。この増殖確認用試料を、細菌の場合には、ＳＡ培地に、酵母及び真菌の場合にはＰＤＡ培地に、それぞれ塗抹した。各試料を塗抹した平板寒天培地を、細菌の場合には35℃にて２日間、酵母の場合には25℃にて２日間、そして、真菌の場合には25℃にて７日間培養した。
（２－４－２）液体培地を用いた試験
　平板寒天を用いた場合と同様に調製した上記の供試菌液を、上述した10 mLの供試試料に0.1 mLずつ接種し、室温にて静置した。その後、所定時間（30秒、60秒）を経過したときに、各供試試料から0.1 mLずつ抜き取った。試験用の細菌は、10 mLの液体培地（ソイビーン・カゼイン・ダイジェスト培地、以下、「ＳＣＤ液体培地」ということがある。）に、酵母及び真菌はブドウ糖・ペプトン培地（以下、「ＧＰ培地」ということがある。）に、下記表７～１２に示す初発菌数で接種し、被験試料とした。
　被験試料から、ただちに1 mLずつ、無菌的に抜き取ってさらに希釈し、上記の各培地に接種した。細菌を接種したACD培地は、35℃にて２日間、酵母を接種したＧＰ培地は25℃にて２日間、真菌を接種したＧＰ培地は25℃にて７日間培養した。
（２－５）判定
　平板寒天を用いた試験では、各試料の濃度別に、出現コロニー数を処理時間毎に計数して生残菌数を求め、殺菌効果を判定した。液体培地を用いた試験では、コロニー形成に加えて、目視でも菌の発育を観察して判定した。
（３）試験結果
　平板寒天を用いた試験の場合の各処理時間における細菌数を表７～９に示す。また、液体培地を用いた場合の各処理時間における細菌数を表１０～１２に示す。表中、＋は菌の生育が見られたもの（コロニーが形成されたもの）、－は菌が死滅したもの（コロニー形成が見られなかったもの）を示す。
　また、表７～１２中、Escherichia coli又はE. coliと記載されている株はEscherichia coli KEC-B-001を、Staphylococcus aureus又はS. aureusと記載されている菌株はStaphylococcus aureus KEC-B-002を、Serratia sp.と記載されている菌株はSerratia sp.THMC 56を、Bacillus subtilus又はB. subtilusと記載されている菌株はBacillus subtilus KEC-B-007を、それぞれ表す。
　Candida albicans又はC. albicansと記載されている株はCandida albicans HRC 032を、 Rhodotorula sp. と記載されている株はRhodotorula sp. HRC 042を、それぞれ表す。
　Cladosporium cladosporioides又はC. cladosporioidesと記載されている株は、Cladosporium cladosporioides HRC 219を、Altrnaria alternate又はA. alternateと記載されている株はAltrnaria alternate HRC 237を、Penicillium glabrum又はP. glabrumと記載されている株はPenicillium glabrum HRC 659を、Aspergillus niger又はA. nigerと記載されている株はAspergillus niger HRC 258を、Chaetomium sp.と記載されている株はChaetomium sp. HRC 280を、Fusarium sp.と記載されている株はFusarium sp. HRC 289を、Emericella nidulans又はE. nidulansと記載されている株はEmericella nidulans HRC 210を、Neosartorya sp.と記載されている株はNeosartorya sp. HRC 259をそれぞれ表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
 　*：死滅時間
　　単位：CFU/mL
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
 　*：死滅時間
　　単位：CFU/mL
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
 　*：死滅時間
　　単位：CFU/mL
　いずれの濃度においても、細菌4種及び酵母2種の死滅時間は、0.5分以下であった。また、真菌の自滅時間は、Chaetomiumを除いて0.5分以下であった。
　以下に、液体培地を用いた場合の各微生物に対する殺菌等の効果を示す。液体培地を用いた場合でも、各処理時間において、各試料から0.1 mLを抜き取り、上記と同じ寒天培地に塗抹してコロニー形成数から生菌数を求めた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
 　　単位：CFU/mL
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
 　　単位：CFU/mL
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
 　　単位：CFU/mL
　液体培地を用いた試験では、真菌の死滅時間に残留塩素濃度によって若干の相違がみられた。それ以外は、いずれの希釈倍率の次亜塩素酸水溶液を用いた場合でも、速やかに微生物は死滅し、短時間で微生物を死滅させる効果を有することが示された。
　本発明の次亜塩素酸水溶液は、上述した通り、弱酸性の次亜塩素酸水溶液中に精製水のみを添加しており、医薬品として承認を受けているため、極めて安全性が高い。また、医薬製剤に比べて低コストであり、様々な地域で衛生状態を改善するために使用することができる。
（医療用内視鏡汚染消化器系微生物等に対する殺菌効果試験）
（１）試験方法
　１）供試菌
　次亜塩素酸水溶液の殺菌効果の確認を以下の供試菌を用いて行った。
　　Escherichia coli（大腸菌）
　　Salmonella Enteritidis（サルモネラ）
　　Candida sp．（カンジダ）
　　Pseudomonas aeruginosa(緑膿菌)
　２）試料の準備
　次亜塩素酸水溶液を、それぞれ有効塩素濃度が、200、20、5、2、1、0.5 ppmとなるように希釈し、試験の試料とした。これらの試料を、それぞれ20 mL容試験管に5 mLずつ分注した。また、次亜塩素酸水溶液を含まない滅菌純水を対照とした。
　３）試験前培養
　大腸菌及びサルモネラについては、供試菌をＴＳＢ（Tryptic Soy Broth）で35℃、20～24時間静置培養し、試験に供した。供試した菌液濃度は、培養液を滅菌純水で希釈して調製した。菌数は、大腸菌が1.2×10６/mL、サルモネラが1.7×10６/mLであった。
　カンジダについては、供試菌をＰＤＡ（Potato Dextrose Agar）培地にて25℃で44～48時間培養した。培養した菌体を滅菌純水に懸濁して、菌液を調製した。菌数は、2.7×10６/mLであった。
　緑膿菌については、ＴＳＢで25℃、44～48時間静置培養し、培養液を滅菌純水で希釈して調製した。菌数は2.3×10６/mLであった。
　４）試験方法
　各濃度の試料に菌液を0.2 mL接種し、混合した。0.5分、5分、及び10分経過後のそれぞれにおいて、各試料から0.2 mLを取り出し、1.8 mLの1 mg/mLチオ硫酸ナトリウム含有滅菌純水に懸濁した。この懸濁液と、さらに1 mg/mLのチオ硫酸ナトリウム含有滅菌純水を用いて10倍希釈した液とを、細菌の場合はSA寒天培地に、酵母の場合はＰＤＡ寒天培地に、それぞれ0.1 mLずつ塗抹した。対照として、チオ硫酸ナトリウム含有滅菌純水の替わりに滅菌純水を用いた。培地を培養した後、平板上に出現したコロニーを計測し、生菌数を求めた。
　５）判定
　試料の濃度別に、各処理時間で出現したコロニー数を計測し、生菌数を求めて殺菌効果を判定した。
（２）試験結果
　以下の表１３～表１６に示すように、本試験に使用したすべての微生物は、次亜塩素酸水溶液の有効塩素濃度5 ppmにおいて、0.5分間作用させることにより死滅した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
（抗ウイルス効果の確認）
　供試サンプルとして、2018年6月27日作製し、6月28日に受領した次亜塩素酸水溶液（商品名：ドクターウォーター（登録商標））を使用した。有効塩素量は、50ppmに調整した。
　ウイルス株として、ネコカリシウイルス(FCV/F9)、マウスノロウイルス(MNV CW1)、コクサッキーウイルスA7(CA7)及びB5(CB5)、インフルエンザウイルス(A/PR8及びA/USSR/92/97)、単純ヘルペスウイルス１型(HSV-HF)及び2型(HSV-UW)、アデノウイルス3型(Ad.3)及び5型(Ad.5)並びに8型(Ad.8)を使用した。
　感受性細胞として、ネコカリシウイルス用にはCRFK細胞、マウスノロウイルス用にはRAW264.7細胞、コクサッキーウイルス及び単純ヘルペスウイルス用にはVero細胞、インフルエンザウイルス用にはMDCK細胞、アデノウイルス用にはA549細胞を、それぞれ使用した。
　抗ウイルス効果試験方法は下記の通りとした。まず、サンプル溶液900μLに、各保存ウイルス液100μLを添加して混合した。
　混合後、10秒、1分、5分、10分経過（各処理時間経過）後に、0.1Nチオ硫酸ナトリウム入りの培地を用いて、それぞれ10倍希釈系列を作成した。各希釈系列から10μLを抜き取り、感受性細胞に接触させ、その後、維持用の培地100μLを添加して、37℃にて５％CO2インキュベータ中にて、3日～10日培養した。
　上記の各ウイルスが各感受性細胞に感染することで生じる形態変化及び細胞変性効果(cytopathic effect)を光学顕微鏡下で肉眼にて観察し、どのくらい高い希釈度まで、細胞変性効果が見られるかを観察し、TCID50（50% tissue culture infectious dose）を求めた。結果を下記表１７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　表１７に示すように、いずれのウイルスに対しても、本発明の次亜塩素酸水溶液は、高い抗ウイルス効果を示した。
（次亜塩素酸水溶液のpHを変化させたときの効果の測定）
（１）供試試料
　残留塩素濃度が150～260 ppmの原液を、希塩酸でpH 3.0～6.5となるように調整し、供試試料とした。試料中の残留塩素濃度測定は、ハンデイ水質計AQ-101（柴田科学（株）製）で測定した。また、測定時間を、10秒、1分、5分、及び10分とした。
（２）試験法
（２－１）供試菌
　下記表18及び19に示す２種類の細菌を使用し、後述する平板寒天又は液体培地を用いた試験を行なった。
（２－２）試験前培養
　下記表18及び19に示す供試菌を以下の条件で前培養して試験に供した。上記細菌の前培養は、コーンスターチ2.0％、アミノ酸液2.0％及び炭酸カルシウム0.75％を含む、10mLのCS液体培地に、クロストリジウム・ブチリカム・NBRC13949(Clostridium butyricum NBRC13949)、又はクロストリジウム・スポロゲネシス(Clostridium sporogenes IFO13950) 株を接種し、37℃で24時間、炭酸ガス置換スチールウール法により嫌気培養し、前培養液を調製した。
（２－３）菌液の調製
　上記のように前培養した供試菌を、滅菌生理食塩水を用いて、１×107～１×106CFU/mLになるように調製した。
（２－４）試験方法
　次亜塩素酸水溶液の下記表17及び18に示す供試菌に対する効果を、ブレインハートインフュージョン平板寒天又培地を用いた方法で検討した。
　上記のように調製した供試試料溶液900μLに供試菌100μLを加えてj混合し、10秒後、1分後、5分後、10分後に、0.1 N チオ硫酸ナトリウムを添加したBHI培地を用いて、各時点の10倍希釈系列を作成し、10μLをBHI寒天培地に塗布して、37℃で24時間、炭酸ガス置換スチールウール法により嫌気培養し、菌数を測定した。
（２－５）判定方法及び結果
　各試料の濃度別に、出現コロニー数を処理時間毎に計数して生残菌数を求め、殺菌効果を判定した。結果を表18及び19に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　いずれの濃度及びpHにおいても、上記2種類のクロストリジウムの死滅時間は、10秒以下であり、いずれの塩素濃度及びpHの次亜塩素酸水溶液を用いた場合でも、極めて短時間でクロストリジウムを死滅させる効果を有することが示された。
（細菌に対する殺菌効果の測定）
（１）供試試料
　上記実施例７（１）で調製した次亜塩素酸水溶液を被検資料として使用して以下の試料を調製し、下記の細菌に対する殺菌効果の判定に使用した。
（２）試験法
　１）供試菌
　下記表20及び21に示すクロストリジウム（クロストリジウム・ブチリカム (Clostridium butyricum NBRC13949)及びクロストリジウム・スポロゲネス(Clostridium sporogenes IFO 13950)）を使用した。
　２）試験前培養
　供試菌を、CDC嫌気性菌用羊血液寒天培地（日本BD(株)、以下「血液寒天培地」と略すことがある。）を培地として用いて、嫌気チャンバー内にて37℃にて、24～48時間静置培養し（前培養）、試験に供した。供試菌数は、１×107～１×108CFU/mLに調整した。
　３）試験方法
　各濃度の試料0.9 mLに、上記の各細菌を含む溶液（以下、「菌液」ということがある。）を0.1 mLずつ接種して混合し、試料溶液とした。上記細菌の接種後、所定時間（10秒、1分、5分、及び10分）を経過したときに、各試料から20μLを抜き取り、細菌の維持培地180μLに接種して10倍希釈系列を作成した。
　各細菌の10倍希釈系列より、それぞれ10μLを抜き取って血液寒天培地にコンラージ棒にて塗抹した。各試料を塗抹した血液寒天培地を、37℃にて24時間嫌気チャンバー内にて培養し、平板上に出現したコロニーを計数した。
（３）試験結果
　各処理時間における殺菌効果試験の結果を、細菌ごとに分けて表20及び表21に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
　表20及び21に示す各クロストリジウムを用いた殺菌効果試験の結果から、残留塩素濃度が150 ppm以上であれば、10秒以内の処理でコロニー形成が見られなくなり、死滅したものと判定された。以上から、本発明の次亜塩素酸水溶液は、低pH領域で、嫌気性菌であるクロストリジウムに対して高い殺菌効果を有することが示された。
（ウイルスに対する殺ウイルス効果の測定）
（１）供試株
　パルボウイルス科に属するパルボウイルスであるFeline panleukopenia virus (ATCC（登録商標） VR-648)、Canine parvovirus (ATCC VR-2017)と、パラミクソウイルス科に属する麻疹ウイルスMeasles virus(ATCC VR-24)を使用した。
　Feline panleukopenia virusの増殖には、感受性細胞としてCRFK細胞(JCRB9035)を、Canine parvovirusの増殖には、感受性細胞としてA-72細胞(ATCC CRL-1542)を、Measles virusの増殖には感受性細胞としてVero細胞(DSファーマ(株)、現(株)ケー・エー・シー)を用い、ウイルス懸濁液をそれぞれ作成した。各ウイルスの効果測定に使用した対照溶液及び試料溶液は下記表22に示す通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
（２）被検試料の準備
　上記表22に示す次亜塩素酸水溶液の有効塩素濃度を、150 ppm、200 ppm、及び260 ppm、pHを3.0、4.5、5.5、6.5になるようにそれぞれ調製し、被検試料とした（下記表４～６参照）。有効塩素濃度は、高濃度有効塩素計RC-2Z(笠原理化工業株式会社製)を用いて測定した。pHは、パーソナルpHメータMODEL PH82(横河電機株式会社製)を用いて測定した。上記被検試料を用いて以下の試料を調製し、抗ウイルス効果を測定した。なお、本発明の次亜塩素酸水溶液からは、ガスの発生は見られず、pH 3.0～5.5という低いpH領域でも塩素ガスを発生させることはないことが確認された。
　被験資料の液量は、対照及び試料共に1,000μLとした。陰性対照はリン酸緩衝液のみ、陽性対照はウイルス懸濁液100μL＋リン酸緩衝液900μL、試料は100μLのウイルス懸濁液＋900μLの被検試料（次亜塩素酸水溶液）とした。
（３）測定方法
　上記各ウイルスの定量は、上述したように試料を10倍希釈し、上記の各感受性細胞にそれぞれ同量を接種してウイルス感染価を求めた。ウイルス感染価は、上記の各ウイルスが各感受性細胞に感染することで生じる形態変化及び細胞変性効果(cytopathic effect)を顕微鏡下で肉眼にて観察し、どのくらい高い希釈度まで、細胞変性効果が観察されるかで決定した。
　ウイルス感染価の測定は、以下の手順で行った。
　ウイルス懸濁液100μLを試料900μLに添加しボルテックスミキサーにて10秒又は60秒撹拌し、試料（ウイルス懸濁液と次亜塩素酸水溶液との混合液）を調製した。この混合液を、上記細胞の維持用培地で希釈して10倍希釈系列を作成した。
　麻疹ウイルスでは、作成した希釈系列の10μLを、あらかじめ上記感受性細胞を培養した96 ウェルプレートの所定のウェルに接種した。ネコパルボウイルス及びイヌパルボウイルスでは、作成した希釈系列の50μLを、あらかじめ上記感受性細胞を培養した24ウェルプレートの所定のウェルに接種した。
　各ウイルスの10倍希釈系列を所定のウェルに加えた後、各プレートを37℃のCO2インキュベーター中にて7～10日培養した。顕微鏡を用いて細胞変性効果を観察し、TCID50をBehrens-Karber法で求めた。結果を下記表23～25に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
　上記表23～25に示すように、陽性対照区ではいずれのウイルスでも増殖が見られたが、試験区では、いずれのウイルスでも増殖は見られなかった。以上より、本発明の次亜塩素酸水溶液は、低pH領域で、ネコパルボウイルス、イヌパルボウイルス、及び麻疹ウイルスに対して殺ウイルス活性を有することが示された。
　本発明は、手指の殺菌以外に、調理器具等の洗浄など、幅広い分野における抗微生物剤となるため、医薬、薬学の分野で特に有用である。

Claims (14)

  1. 　水溶液中の残留塩素濃度が５０～２６０ｐｐｍであり、ｐＨ３．０～６．７の次亜塩素酸水溶液であって、微生物の死滅時間が１分以下である、抗微生物剤。
  2. 　前記次亜塩素酸水溶液は、食品添加物用次亜塩素酸ナトリウムと、日本薬局方精製水と、日本薬局方希塩酸とを含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗微生物剤。
  3. 　前記水溶液中の残留塩素濃度が５０～２１０ｐｐｍであり、ｐＨ６．３～６．７であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の抗微生物剤。
  4. 　前記抗微生物剤は、細菌、酵母、真菌及びウイルスからなる群から選ばれるいずれかの微生物の増殖を抑制するものであることを特徴とする、請求項３に記載の抗微生物剤。
  5. 　前記細菌は、スタフィロコッカス・オウレウス、セラチア・リケファシエンセイ、バチルス・ズブチリス及びリステリア・モノサイトゲネシスからなる群から選ばれるいずれかの細菌であることを特徴とする、請求項４に記載の抗微生物剤。
  6. 　前記酵母は、ロドトルラ属に属するものであるいずれかの菌であることを特徴とする、請求項４に記載の抗微生物剤。
  7. 　前記真菌は、クラドスポリウム・クラドスオイリオイデス、ペニシリウム・ロケフォルティ、ペニシリウム・グラブラム、アスペルギルス・ニガー、エウロティウム・アモステロダミ、ネオサルトリヤ・フィシェリ、エメリセラチア・ニデュランス、フザリウム、及びアルテナリヤからなる群から選ばれるいずれかの真菌であることを特徴とする、請求項４に記載の抗微生物剤。
  8. 　前記ウイルスは、ノロ・ウイルスであることを特徴とする、請求項４に記載の抗微生物剤。
  9. 　前記水溶液中の残留塩素濃度が１５０～２６０ｐｐｍであり、Ｈ３．０～６．５であり、微生物の死滅時間が１０秒以下であることを特徴とする請求項１又は２に記載の抗微生物剤。
  10. 　前記抗微生物剤は、細菌及びウイルスからなる群から選ばれるいずれかの微生物の増殖を抑制するものであることを特徴とする、請求項９に記載の抗微生物剤。
  11. 　前記細菌は、クロストリジウム・ブチリカム及びクロストリジウム・スポロゲネシスからなる群から選ばれるいずれかの細菌であることを特徴とする、請求項１０に記載の抗微生物剤。
  12. 　前記ウイルスは、イヌパルボ・ウイルス、ネコパルボ・ウイルス、及び麻疹ウイルスからなる群から選ばれるいずれかのウイルスであることを特徴とする、請求項１０に記載の抗微生物剤。
  13. 　請求項４～８のいずれかに記載の抗微生物剤中に、前記細菌、前記酵母、前記真菌、及び前記ウイルスからなる群から選ばれるいずれかの微生物を０．５～１０分間浸漬することを特徴とする、微生物の死滅方法。
  14. 　請求項１０～１２のいずれかに記載の抗微生物剤中に、前記細菌及び前記ウイルスからなる群から選ばれるいずれかの微生物を１０秒～６０秒間浸漬することを特徴とする、微生物の死滅方法。
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