JP2015071581A

JP2015071581A - 亜塩素酸水含有ウイルス殺傷剤

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Publication number: JP2015071581A
Application number: JP2013232958A
Authority: JP
Inventors: 学剛合田; Satotake Aida
Original assignee: HONBU SANKEI KK
Current assignee: HONBU SANKEI KK
Priority date: 2013-05-20
Filing date: 2013-11-11
Publication date: 2015-04-16
Also published as: CN105246332A; WO2014188311A1; JP6144413B2; US20160113282A1; JP2016526036A; EP2999335A1

Abstract

【課題】安全なウイルス殺傷剤を提供すること。
【解決手段】ポリオウイルス、インフルエンザウイルス、ヘルペスウイルスおよびネコカリシウイルスからなる群より選択される少なくとも１種のウイルス等のウイルスを不活化する亜塩素酸水を含むウイルス殺傷剤が提供される。本発明の亜塩素酸水を含むウイルス殺傷剤は、食品添加物、消毒薬、医薬部外品、医薬品等として利用することができる。次亜塩素酸ナトリウムは人体に対して安全ではない(細胞傷害性が高い）という点が問題で
あったがこれが解決された。食品加工の前処理殺菌剤およびウイルス殺傷剤として人体に安全でかつ取扱い易く、しかも二酸化塩素の発生の少ない亜塩素酸を生成し、殺菌剤およびウイルス殺傷剤として使用する。
【選択図】なし

Description

本発明は、亜塩素酸水を含むウイルス殺傷剤に関する。

ウイルス感染症の問題は、古くて新しい課題である。ウイルス感染症のひとつの問題には不顕性感染（感染した時に発病しないこと）が多いことがある。別の言葉で言えば、不顕性感染している個体も感染源となることから、防疫の難しさがある。

本発明者は、亜塩素酸水およびその製法を見出し、大腸菌に対する殺菌剤を確認して出願している（特許文献１）。

国際公開2008/026607

本発明は、予想外に顕著にウイルスを広範に殺傷することができるウイルス殺傷剤を提供する。本発明は以下をも提供する。
（１）亜塩素酸水を含むウイルス殺傷剤。
（２）前記ウイルス殺傷剤は、ポリオウイルス、インフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、ノロウイルスおよびネコカリシウイルスからなる群より選択される少なくとも１種のウイルスを不活化するものである、（１）に記載のウイルス殺傷剤。
（３）前記ウイルス殺傷剤はインフルエンザウイルスを対象とする、（１）または（２）に記載のウイルス殺傷剤。
（４）前記ウイルス殺傷剤はｐＨが６．５以下である、（１）〜（３）のいずれか１項に記載のウイルス殺傷剤。
（５）前記ウイルス殺傷剤は２００ｐｐｍ以上の亜塩素酸を含む、（１）〜（４）のいずれか１項に記載のウイルス殺傷剤。
（６）前記ウイルス殺傷剤はインフルエンザウイルスを対象とする、（１）〜（５）のいずれか１項に記載のウイルス殺傷剤。
（７）前記ウイルス殺傷剤はヘルペスウイルスを不活化するものであり、ｐＨ５．５以下であり、その濃度は５０ｐｐｍ以上である、（１）〜（６）のいずれか１項に記載のウイルス殺傷剤。
（８）前記ウイルス殺傷剤はポリオウイルスを不活化するものであり、ｐＨ７．５以下であり、その濃度は５００ｐｐｍ以上である、（１）〜（７）のいずれか１項に記載のウイルス殺傷剤。
（９）前記ウイルス殺傷剤はノロウイルスまたはネコカリシウイルスを不活化するものであり、その濃度は４００ｐｐｍ以上である、（１）〜（９）のいずれか１項に記載のウイルス殺傷剤。
（１０）前記亜塩素酸水は、次亜塩素酸ナトリウムのウイルス殺傷効果と同等のウイルス殺傷効果を持つ濃度で比較した場合であっても、細胞傷害作用が著しく低い、（１）〜（９）のいずれか１項に記載のウイルス殺傷剤。
（１１）有機物存在下でウイルス殺傷を行うための、（１）〜（１０）のいずれか１項に記載のウイルス殺傷剤。
（１２）亜塩素酸水を含浸させたウイルス殺傷のための物品。
（１３）前記物品はシート、フィルム、パッチ、ブラシ、不織布、ペーパー、布、脱脂綿およびスポンジから選択されるものである、（１２）に記載の物品。

本発明のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。

本発明によれば、高いウイルス殺傷能力をもつウイルス殺傷剤が提供される。また、二酸化塩素の発生が抑制された、人体にも安全で、安心して使用することができるウイルス殺傷剤が提供され、医療現場等で広く使用できるウイルス殺傷剤として利用可能である。

ウイルス殺傷力を示す次亜塩素酸ナトリウム、アルコールに関して存在していた問題が解決された。すなわち、次亜塩素酸ナトリウムは人体に対して安全ではない(細胞傷害性が高い）という点が問題であったがこれが解決された。また、アルコールはアルコール濃度が６０％以上になると危険物となり、取り扱いが不便であり、また、６０％未満では、ウイルス殺傷効果を得にくいという問題があったが、これらと同等あるいはより安全でかつ強力なウイルス殺傷剤が提供される。

亜塩素酸水はインフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、ノロウイルス（ネコカリシウイルス）等、社会上問題となっているウイルス（平成19年度ノロウイルスの不活化条件に関する調査報告書、国立医薬品食品衛生研究所食品衛生管理部山本茂貴および野田衛、厚生労働省を参照）に対して優れたウイルス殺傷効果を有する。

図１は、亜塩素酸水によるインフルエンザウイルスの不活化を示す図である。右側にプロトコールを示し、左側に感染性ウイルス量の相対値を亜塩素酸濃度に対してプロットしたグラフを示す。白丸はｐＨ５．５、白三角はｐＨ６．５、白四角はｐＨ７．５、黒丸はｐＨ８．５を示す。図１Ｂは、ｐＨ５．５の緩衝液における高度サラシ粉製剤水溶液および亜塩素酸ナトリウム水溶液による不活化濃度曲線の結果を示す図である。図中横軸は濃度（ｐｐｍ）を示し、縦軸は相対完成度（２５℃）を示す。白丸は亜塩素酸ナトリウム水溶液を示し、白三角は、高度サラシ粉製剤水溶液を示す。図２Ａは、各ｐＨ域の緩衝液に対するヘルペスウイルス（Herpes simplexvirus type I VR−539）の実験例を示す。左側にプロトコールを示し、右側のグラフに緩衝液中での生残率を示す（緩衝液のみのコントロール）。図２Ｂは、亜塩素酸水によるヘルペスウイルス（Herpes simplex virus type I VR−539）の実験例（図２Ａの続き）を示す。左上に亜塩素酸水、右上に次亜塩素酸ナトリウム、左下に亜塩素酸ナトリウムを示す。図３は、亜塩素酸水によるポリオウイルスの不活化（インフルエンザウイルス不活化との比較）を示す。右側にプロトコールを示し、左側に感染性ウイルス量の相対値を亜塩素酸濃度に対してプロットしたグラフを示す。白丸はインフルエンザウイルスについてｐＨ５．５、白三角はインフルエンザウイルスについてｐＨ７．５、黒丸はポリオウイルスについてｐＨ５．５、黒三角はポリオウイルスについてｐＨ７．５を示す。図３Ｂは、亜塩素酸水によるポリオウイルス不活化作用の定量的解析を示す。横軸は濃度（ｐｐｍ）を示す。白丸は、インフルエンザウイルス（pH 5.5）を示し、黒丸はポリオウイルス（pH5.5）を示し、白三角はインフルエンザウイルス（pH7.5）を示し、黒三角はポリオウイルス（pH 7.5）を示す。図４は、亜塩素酸水によるインフルエンザウイルスの不活化速度を示す。右側にプロトコールを示し、左側に感染性ウイルス量の相対値を時間（分）に対してプロットしたグラフを示す。図５は、亜塩素酸水と次亜塩素酸ナトリウムの細胞傷害作用の比較を示す。右にプロトコールを示し左に結果を示す。左グラフは、死細胞の割合を亜塩素酸水または次亜塩素酸ナトリウムの濃度に対してプロットしたものを示す。図６は、亜塩素酸水と次亜塩素酸ナトリウムの細胞傷害作用の比較を別の観点で示したものを示す。右にプロトコールを示し左に結果を示す。左グラフは、死細胞の割合を亜塩素酸水または次亜塩素酸ナトリウムの濃度に対してプロットしたものを示す。図７は、亜塩素酸水と次亜塩素酸ナトリウムの細胞傷害作用の比較をさらに別の観点として、Vero, HEp−2, MDCKの各細胞のコロニー形成能への障害で示したものを示す。グラフは、リン酸緩衝液での影響を示す。図８は、ネコカリシウイルスに対する「亜塩素酸水」希釈液中の不活化濃度を示す。図中亜塩素酸濃度：亜塩素酸水希釈液の亜塩素酸濃度（ppm）を示す。図９は、亜塩素酸水によるネコカリシウイルスの不活化作用を示す。白丸はｐＨ５．５、白三角はｐＨ６．５、白四角はｐＨ７．５、黒丸はｐＨ８．５を示す。図１０は、亜塩素酸水製剤によるネコカリシウイルスの不活化作用を示す。白丸は亜塩素酸水ｐＨ４．５を示し、白三角は亜塩素酸水ｐＨ７．５を示す。黒丸は次亜塩素酸ナトリウムｐＨ４．５を示し、黒三角は次亜塩素酸ナトリウムｐＨ７．５を示す。図１１は、亜塩素酸水製剤による１０％味噌中のウイルス不活化を示す。白丸はネコカリシウイルスを示し、白三角はインフルエンザウイルスを示す。図１２は、亜塩素酸水製剤による１０％味噌中のネコカリシウイルス不活化の時間経過の変化を示す。白丸は５分間処理を示し、白三角は２０分間処理を示す。図１３は、実施例１０および１１のプラック写真を示す。図１４は、表２における確認試験（２）の吸光度・波長のグラフを示す。図１５は、表４における確認試験（２）の吸光度・波長のグラフを示す。図１６は、表１３に基づいて、実施例１２の結果をネコカリシウイルスの残存感染価（ｙ軸）と亜塩素酸の濃度（ｐｐｍ）（ｘ軸）とでプロットすることによって有機物（１０％味噌）中におけるネコカリシウイルスに対する不活化濃度曲線を作成した結果を示す。図１７は、表１４に基づいて、実施例１２の結果をインフルエンザウイルスの残存感染価（ｙ軸）と亜塩素酸の濃度（ｐｐｍ）（ｘ軸）とでプロットすることによって有機物（１０％味噌）中におけるインフルエンザウイルスに対する不活化濃度曲線を作成した結果を示す。

以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。従って、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。

本明細書において「抗ウイルス（作用）」とはウイルス増殖を抑制することをいう。抗ウイルス作用を有するものを抗ウイルス剤という。

本明細書において「殺ウイルス（作用）」とはウイルス粒子の感染性を不活化することをいう。ウイルス不活化は、核酸タンパク質、脂質などウイルス粒子構成成分の立体構造変化、または、それらの間の相互作用の変調によると考えられる。殺ウイルス作用を有するものを殺ウイルス剤という。

本明細書において「ウイルス殺傷（作用）」とは、抗ウイルス作用および殺ウイルス作用をまとめた広義の概念をいう。「ウイルス殺傷剤」とは、抗ウイルス作用および殺ウイルス作用を有する任意の薬剤をいう。ウイルス殺傷剤は、医薬品、医薬部外品、食品添加物、消毒薬等として使用することができる。

抗ウイルス剤が原則的に特定のウイルスに対して作用するのに対し、殺ウイルス剤は広範な種類のウイルスに対して有効である。殺ウイルス剤の使用は常に薬剤耐性ウイルス変異株を生じるが、殺ウイルス剤では原理的に薬剤耐性ウイルス株を生じることはない。殺ウイルス剤の標的分子が複数あるためである。したがって、耐性が生じないという点で好ましい。殺ウイルス剤作用の測定法としては、代表的に以下の試験を用いる。
１）２ｍｌプラスチックチューブ（アシストチューブ）に１８０μｌの指定ｐＨの緩衝液を加える。
２）１０μｌの指定濃度の亜塩素酸水溶液を加える。
３）１０μｌのウイルス液を加え、充分撹拌した後、指定温度の恒温水槽内で保温する。
４）保温後直ちに氷水で冷却しタンパク質を含むウイルス希釈液で１００倍希釈する。
５）残存感染ウイルス量をプラック法にて測定する。

本発明が対象とするウイルスは、任意のウイルスを挙げることができる。たとえば、ウイルスとしては、インフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、ノロウイルス、ネコカリシウイルスを挙げることができる。

本発明が対象とするインフルエンザウイルスは、ＲＮＡウイルスでエンベロープを持つウイルスであり、Ａ型、Ｂ型等があるが、本発明では任意の型が対象とされうる。試験株としては、代表的にインフルエンザウイルスＡ型アイチ株を使用することができるがこれに限定されない。

ノロウイルスは、非細菌性急性胃腸炎を引き起こすウイルスの一属である。カキなどの貝類の摂食による食中毒の原因になるほか、感染したヒトの糞便や吐瀉物、あるいはそれらが乾燥したものから出る塵埃を介して経口感染する。ノロウイルスを試験する際は近縁種であるネコカリシウイルスが使用される。この近縁種での試験は当該分野で認定されたものである。ノロウイルスについては、ノロウィルス不活化有効性評価試験に於ける代替ウィルス、ネコカリシウィルス使用による試験法 EPA、平成19年度ノロウイルスの不活化条件に関する調査報告書、国立医薬品食品衛生研究所食品衛生管理部山本茂貴および野田衛、厚生労働省を参照。ノロウイルスの殺ウイルス効果については、近縁菌であるネコカリシウイルス（FCV)による調査で代替されうるとされており（この文献のほか、Gehrke, C et al: Inactivation of feline calicivirus, a surrogate of norovirus (formerly Norwalk−like viruses), by different types of alcohol in virtro and in vivo, J Hosp Infect (2004)46:49−55； Doultree, JC et al: Inactivation of feline calicivirus, a norwalk virus surrogate, J Hosp Infect (1999)41:51−57);Jennifer, L et al: Surrogates for the study of norovirus stability and inactivation in the environment: A comparison of murine norovirus and feline calicivirus, J Food Protect (2006)11:2761−2765；高木弘隆他:ネコカリシウイルス(FCV)を代替としたノロウイルス(NV)不活化効果の検討−アリカリ剤、過酸化水素および過炭酸ナトリウムによる不活性化効果−、医学と薬学(2007)57:311−312）、本明細書でもこれを援用する。

ヘルペスウイルスとは、ＤＮＡウイルスの一種であり、ＨＳＶ−１（Herpes simplex virus type １）、ＨＳＶ−２（Herpes simplex virus type ２）等が挙げられるがそれらに限定されない。代表的なヘルペスウイルスの株としては、Herpes simplex virus type ＩＶＲ−５３９が挙げられるがそれに限定されない。

ヘルペスウイルスの生残試験では、代表的に、25℃, 30分で嫌気培養し、生残ウイルスをVero細胞に感染（1時間）させ、プラック数を測定して、生残率を判断する。

亜塩素酸水はヘルペスウイルスＩ型に対する殺滅効果を有し、その効果は、好ましくはｐＨ５．５以下の酸性条件下で顕著であることが示されている。好ましくは、十分な殺滅効果を得るには５０ｐｐｍ以上の濃度が必要と考えられる。

次亜塩素酸ナトリウムにおいてはｐＨ５．５以下の酸性条件下においてヘルペスウイルスＩ型に対する殺滅効果が減弱しているため、酸性条件での殺滅効果が亜塩素酸水で向上していることは予想外の効果であるといえる（例えば、図２Ｂ）。

ポリオウイルスとは、ピコルナウイルス科、エンテロウイルス属のウイルスであり、ポリオと呼ばれる急性灰白髄炎の原因ウイルスである。本発明では、ポリオウイルスも亜塩素酸水で不活化できることが見出されている（例えば、図３）。

本発明の亜塩素酸水によるウイルス（たとえば、インフルエンザウイルス）の不活化速度の測定は、通常の実験（混合等）を行い、残留した感染性ウイルスの量を測定することによって判定することができ、亜塩素酸濃度として５ｐｐｍの亜塩素酸水を、ｐＨ６．５の条件で、1分以内の接触により、完全にインフルエンザウイルスを不活化することが出来る（例えば、図４）。

亜塩素酸水および次亜塩素酸ナトリウムの細胞障害作用の比較において、次亜塩素酸ナトリウムでは、たとえば、ＨＥｐ−２細胞の場合において、０．５ｐｐｍ程度でも死細胞が生じているが、本発明の亜塩素酸水では、５０ｐｐｍにおいて、次亜塩素酸ナトリウム０．５ｐｐｍと同等の死細胞程度しか確認されておらず、次亜塩素酸ナトリウムの１００分の１程度であり、事実上影響がなかった。また、亜塩素酸水のヘルペスウイルス殺傷効果は、亜塩素酸水の酸性側で、５０ｐｐｍの濃度で、次亜塩素酸ナトリウムのアルカリ性側で５０ｐｐｍの濃度とウイルス殺傷効果が同等であるということを図２Ｂにおいて見出されているが、同等のウイルス殺傷効果であっても、亜塩素酸水の細胞障害作用は、次亜塩素酸ナトリウムの約１００分の１であった（図５）。このことから、亜塩素酸水は、細胞に対する安全性（傷害性の低さ）から、安全な消毒、ウイルス殺傷剤を提供することができると理解される。また、亜塩素酸水は、ウイルスまたは細胞中に残存しないことから、耐性ウイルスが生じることは原則的にないため、耐性を生じさせない究極的なウイルス殺傷という意味でも有効である。

（亜塩素酸水およびその製造例）
本発明で使用される亜塩素酸水は、本発明者らが見出した特徴を有するものである。特許文献１に記載されるような既知の製法等の任意の方法により製造された亜塩素酸水を用いることができる。代表的な組成として、たとえば、亜塩素酸水61.40％、リン酸二水素カリウム1.00％、水酸化カリウム0.10％および精製水37.50％のものを配合し、使用することができる（出願人より「オウトゥロックスーパー」との名称で販売予定である。）が、これに限定されず、亜塩素酸水は0.25％〜75％、リン酸二水素カリウムは、0.70％〜17.42％、水酸化カリウムは、0.10％〜5.60％であっても良い。リン酸二水素カリウムの代わりにリン酸二水素ナトリウムを、水酸化カリウムの代わりに水酸化ナトリウムを使用しても良い。この薬剤は、酸性条件下で、有機物との接触による亜塩素酸の減衰を低減させているが、細菌殺傷効果は維持している。また、ウイルス殺傷効果も維持されることが本発明により示された。かつ、塩素ガスの発生が軽微であり、塩素と有機物が混合した臭いの増幅をおさえるという特徴をも有する。

１つの実施形態では、本発明の亜塩素酸水は、塩素酸ナトリウム水溶液に、該水溶液のｐＨ値を３．４以下に維持させることができる量および濃度の硫酸またはその水溶液を加えて反応させることにより、塩素酸を発生させ、次いで該塩素酸の還元反応に必要とされる量と同等、もしくはそれ以上の量の過酸化水素を加えることにより、生成することができる。

また、別の実施形態では、本発明の亜塩素酸水は、塩素酸ナトリウム水溶液に、該水溶液のｐＨ値を３．４以下に維持させることができる量および濃度の硫酸またはその水溶液を加えて反応させることにより、塩素酸を発生させ、次いで該塩素酸の還元反応に必要とされる量と同等、もしくはそれ以上の量の過酸化水素を加えることにより亜塩素酸を生成させた水溶液に、無機酸または無機酸塩のうちのいずれか単体、または２種類以上の単体もしくはこれらを併用したものを加え、ｐＨ値を３．２から８．５までの範囲内に調整することにより、生成することができる。

さらに、別の実施形態では、本発明の亜塩素酸水は、塩素酸ナトリウム水溶液に、該水溶液のｐＨ値を３．４以下に維持させることができる量および濃度の硫酸またはその水溶液を加えて反応させることにより、塩素酸を発生させ、次いで該塩素酸の還元反応に必要とされる量と同等、もしくはそれ以上の量の過酸化水素を加えることにより亜塩素酸を生成させた水溶液に、無機酸または無機酸塩もしくは有機酸または有機酸塩のうちのいずれか単体または２種類以上の単体もしくはこれらを併用したものを加え、ｐＨ値を３．２から８．５の範囲内に調整することにより、生成することができる。

さらにまた、別の実施形態では、本発明の亜塩素酸水は、塩素酸ナトリウム水溶液に、該水溶液のｐＨ値を３．４以下に維持させることができる量および濃度の硫酸またはその水溶液を加えて反応させることにより、塩素酸を発生させ、次いで該塩素酸の還元反応に必要とされる量と同等、もしくはそれ以上の量の過酸化水素を加えることにより亜塩素酸を生成させた水溶液に、無機酸または無機酸塩のうちのいずれか単体または２種類以上の単体もしくはこれらを併用したものを加えた後、無機酸または無機酸塩もしくは有機酸または有機酸塩のうちのいずれか単体または２種類以上の単体もしくはこれらを併用したものを加え、ｐＨ値を３．２から８．５の範囲内に調整することにより、生成することができる。

また、別の実施形態では、上記方法において無機酸は、炭酸、リン酸、ほう酸または硫酸を用いることができる。

さらにまた、別の実施形態では、無機酸塩が、炭酸塩、水酸化塩、リン酸塩またはホウ酸塩を用いることができる。

また、別の実施形態では、炭酸塩としては、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウムまたは炭酸水素カリウムを用いることができる。

さらに、別の実施形態では、水酸化塩としては、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウムを用いることができる。

さらにまた、別の実施形態では、リン酸塩としては、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸三カリウム、リン酸水素二カリウムまたはリン酸二水素カリウムを用いることができる。

また、別の実施形態では、ホウ酸塩としては、ホウ酸ナトリウムまたはホウ酸カリウムを用いることができる。

さらに、別の実施形態では、有機酸としては、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、酢酸または乳酸を用いることができる。

さらにまた、別の実施形態では、有機酸塩としては、コハク酸ナトリウム、コハク酸カリウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、リンゴ酸ナトリウム、リンゴ酸カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、乳酸ナトリウム、乳酸カリウムまたは乳酸カルシウムを用いることができる。

殺菌剤およびウイルス殺傷剤として使用されうる亜塩素酸（ＨＣｌＯ_２）を含む水溶液（亜塩素酸水）の製造方法では、塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ_３）の水溶液に、硫酸（Ｈ_２ＳＯ_４）またはその水溶液を加えて酸性条件にすることで得られた塩素酸（ＨＣｌＯ_３）を、還元反応により亜塩素酸とするために必要な量の過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）を加えることにより、亜塩素酸（ＨＣｌＯ_２）を生成する。この製造方法の基本的な化学反応は、下記のA式、B式で表わされる。

［化１］
２NaClO₃＋H₂SO₄→２HClO₃＋Na₂SO₄ （A式）
HClO₃＋H₂O₂→HClO₂＋H₂O＋O₂↑ （B式）
Ａ式では塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ_３）水溶液のｐＨ値が酸性内に維持できる量および濃度の硫酸（Ｈ_２ＳＯ_４）またはその水溶液を加えることで塩素酸を得ることを示している。次いで、Ｂ式では、塩素酸（ＨＣｌＯ_３）は、過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）で還元され、亜塩素酸（ＨＣｌＯ_２）が生成されることを示している。

その際に、二酸化塩素ガス（ＣｌＯ_２）が発生するが（Ｃ式）、過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）と共存させることにより、Ｄ〜Ｆ式の反応を経て、亜塩素酸（ＨＣｌＯ_２）を生成する。

ところで、生成された亜塩素酸（ＨＣｌＯ_２）は、複数の亜塩素酸分子同士が互いに分解反応を起したり、塩化物イオン（Ｃｌ⁻）や次亜塩素酸（ＨＣｌＯ）およびその他の還元物の存在により、早期に二酸化塩素ガスや塩素ガスへと分解してしまうという性質を有している。そのため、殺菌剤およびウイルス殺傷剤として有用なものにするためには、亜塩素酸（ＨＣｌＯ_２）の状態を長く維持できるように調製する必要がある。

そこで、上記方法により得られた亜塩素酸（ＨＣｌＯ_２）や二酸化塩素ガス（ＣｌＯ_２）もしくはこれらを含む水溶液に無機酸、無機酸塩、有機酸または有機酸塩をいずれか単体、または２種類以上の単体もしくはこれらを併用したものを加えることによって、遷移状態を作り出し、分解反応を遅らせることで長時間にわたって亜塩素酸（ＨＣｌＯ_２）を安定的に維持することができる。

１つの実施形態では、上記方法により得られた亜塩素酸（ＨＣｌＯ_２）や二酸化塩素ガス（ＣｌＯ_２）もしくはこれらを含む水溶液に無機酸または無機酸塩、具体的には炭酸塩や水酸化塩を単体もしくは、２種類以上の単体もしくはこれらを併用して加えたものを利用することができる。

別の実施形態では、無機酸または無機酸塩、具体的には炭酸塩や水酸化塩を単体もしくは、２種類以上の単体もしくはこれらを併用して加えた水溶液に、無機酸、無機酸塩、有機酸または有機酸塩を単体または２種類以上の単体で、またはそれらを併用して加えるものを利用することができる。

加えて、さらに別の実施形態では、上記方法によって製造された水溶液に、無機酸または無機酸塩もしくは有機酸または有機酸塩を単体または２種類以上の単体で、またはそれらを併用して加えたものを利用することができる。

上記無機酸としては、炭酸、リン酸、ホウ酸または硫酸が挙げられる。また、無機酸塩としては、炭酸塩、水酸化塩のほか、リン酸塩またはホウ酸塩が挙げられ、更に具体的にいえば、炭酸塩は、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、水酸化塩は、水酸化ナトリウムや水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウム、リン酸塩は、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸三カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、ホウ酸塩は、ホウ酸ナトリウム、ホウ酸カリウムを用いるとよい。さらに、上記有機酸としては、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、酢酸または乳酸が挙げられる。また、有機酸塩では、コハク酸ナトリウム、コハク酸カリウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、リンゴ酸ナトリウム、リンゴ酸カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、乳酸ナトリウム、乳酸カリウムまたは乳酸カルシウムが適している。

酸および／またはその塩を加えた場合においては、一時的にＮａ^＋＋ＣｌＯ_２ ⁻⇔ Ｎａ−ＣｌＯ_２やＫ^＋＋ＣｌＯ_２ ⁻⇔ Ｋ−ＣｌＯ_２やＨ^＋＋ＣｌＯ_２ ⁻⇔ Ｈ−ＣｌＯ_２といった遷移の状態が作り出され、亜塩素酸（ＨＣｌＯ_２）の二酸化塩素（ＣｌＯ_２）への進行を遅らせることができる。これにより、亜塩素酸（ＨＣｌＯ_２）を長時間維持し、二酸化塩素（ＣｌＯ_２）の発生が少ない亜塩素酸（ＨＣｌＯ_２）を含む水溶液を製造することが可能となる。

以下に、上記化学式２は亜塩素酸塩の酸性溶液中の分解を表わす。

この式で表されるように、亜塩素酸塩水溶液のｐＨにおける分解率は、そのｐＨが低くなるほど、すなわち酸が強くなるほど、亜塩素酸塩水溶液の分解率が大きくなる。すなわち、上記式中の反応（ａ）（ｂ）（ｃ）の絶対速度が増大することになる。例えば、反応（ａ）の占める割合はｐＨが低くなるほど小さくなるが、全分解率は大きく変動し、すなわち大となるため、二酸化塩素（ＣｌＯ_２）の発生量もｐＨの低下とともに増大する。このため、ｐＨ値が低ければ低いほどウイルス殺傷効果は早まるが、刺激性の有害な二酸化塩素ガス（ＣｌＯ_２）によって作業が困難になったり、人の健康に対しても悪い影響を与えることになる。また、亜塩素酸の二酸化塩素への反応が早く進行し、亜塩素酸は不安定な状態になり、ウイルス殺傷効果を維持できる時間も極めて短い。

１つの局面において、本発明は、亜塩素酸水を含むウイルス殺傷剤を提供する。本発明では、亜塩素酸（ＨＣｌＯ_２）を含む水溶液に上記無機酸、無機酸塩、有機酸もしくは有機酸塩を加える場合には、二酸化塩素の発生の抑制やウイルス殺傷効果とのバランスの観点から、ｐＨ値を３．２〜８．５の範囲内で調整する。そして、ウイルス殺傷の点から、たとえば、好ましい実施形態では、インフルエンザウイルスでは、ｐＨが６．５以下でありうる。また、ヘルペスウイルスの場合の最適なｐＨは５．５以下であった。いずれにしても、本発明は、ウイルスの種類を問わない亜塩素酸水を含むウイルス殺傷剤を提供する。理論に束縛されることを望まないが、本明細書において各種のウイルスに対する効果を試験したところ、どのウイルスについても同様に殺傷することができたことから、本発明のウイルス殺傷剤は、その殺傷の原理から、ウイルスの種類を問わずに殺傷することがができると理解されるからである。すなわち、ウイルス殺傷効果は、亜塩素酸による不活性化の効果であり、その効果は、ウイルスの種類を問わないと考えられることから、耐性を生じないウイルス殺傷剤を提供することができる。また、本発明の亜塩素酸水は細胞等に残留しないことから、この点でも原理的に耐性を生じないということができ、理想的なウイルス殺傷剤といえる。本発明は、社会上問題となっている、ポリオウイルス、インフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、ノロウイルスおよびネコカリシウイルスを少なくとも殺傷することができるため、その点でも有効性は高い。好ましくは、ｐＨが６．５以下であることが有利であるがこれに限定されない。また、２００ｐｐｍ以上の亜塩素酸を含むことが好ましいがこれにも限定されない。これらの条件は特にインフルエンザウイルスに対して有効であるものであるがそれに限定されない。

１つの実施形態では、ヘルペスウイルスを不活化するものであり、ｐＨ５．５以下であり、その濃度は５０ｐｐｍ以上であることが好ましいがこれに限定されない。

別の実施形態では、ポリオウイルスを不活化するものであり、ｐＨ７．５以下であり、その濃度は５００ｐｐｍ以上であることが好ましいがこれに限定されない。

さらに別の実施形態では、ノロウイルスまたはネコカリシウイルスを不活化するものであり、その濃度は４００ｐｐｍ以上であることが好ましいがこれに限定されない。

さらに別の実施形態では、本発明のウイルス殺傷剤は、亜塩素酸水は、次亜塩素酸ナトリウムのウイルス殺傷効果と同等のウイルス殺傷効果を持つ濃度で比較した場合であっても、細胞傷害作用が著しく低いことが特徴のひとつでありうる。

１つの局面では、本発明は、有機物存在下でウイルス殺傷を行うための、亜塩素酸水を含むウイルス殺傷剤を提供する。

本発明のウイルス殺傷剤は、亜塩素酸水を含浸させてウイルス殺傷等の目的に使用されうる任意の形態であり得、医薬品、医薬部外品、食品添加物、医療デバイス等も含まれ、スプレー、液剤、ゲル剤等を挙げることができるがこれに限定されない。

別の局面において、本発明は、亜塩素酸水を含浸させたウイルス殺傷のための物品を提供する。ウイルス殺傷を行うことができるような殺菌剤はあまり多くなく、しかも、臭いが残らないことから、環境保持が必要な床面等での処理において好ましく使用される。また、耐性を発生させにくい原理であるため、好ましいウイルス殺傷剤または物品として使用される。

本発明のウイルス殺傷用の物品として使用されうる物品は、亜塩素酸水を含浸させてウイルス殺傷等の目的に使用されうる任意の物品であり、医療デバイス等も含まれ、シート、フィルム、パッチ、ブラシ、不織布、ペーパー、布、脱脂綿、スポンジ等をあげることができるがそれらに限定されない。好ましい実施形態では、亜塩素酸が１０００ｐｐｍ以上、好ましくは３０００ｐｐｍ、より好ましくは４０００ｐｐｍの濃度で含浸されるがこれに限定されない。ウイルス殺傷用においては、１０００ｐｐｍでも十分に殺傷効果が見られており、長期の効果を期待する場合は、３０００ｐｐｍまたは４０００ｐｐｍあれば、より効果が高いため好ましい。物品の材料は限定されるものではなく、亜塩素酸水を吸収し、保持することでき、塗布させることができるものであればどのようなものであってもよい。１つの実施形態では、本発明のシートは、綿でできたものである。

なお、本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。

以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。

必要な場合、以下の実施例で用いる動物の取り扱いは、ヘルシンキ宣言に基づいて行った。試薬類は具体的には実施例中に記載した製品を使用したが、他メーカー（Ｓｉｇｍａ，和光純薬、ナカライ、等）の同等品でも代用可能である。

（代表的な使用細胞およびウイルス）
本実施例では、代表的に以下のウイルスおよび細胞を用いた。

（ウイルス）
インフルエンザウイルス（RNAウイルスでエンベロープを持つ）：インフルエンザウイルスA型アイチ株は徳島大学医学部ウイルス学教室由来である。

ヘルペスウイルス（DNAウイルスでエンベロープを持つ）：ヘルペスウイルス１型（HSV−1）はAmerican Type Culture Collection（ATCC）から購入した。

ポリオウイルス（RNAウイルスでタンパク質からなる殻を持つ）：ポリオウイルス１型生ワクチン株は徳島大学医学部ウイルス学教室由来である。

ネコカリシウイルス（ノロウイルスの試験用）：ネコカリシウイルスF4株は国立感染症研究所ウイルス第2部から分与されたものである。

（細胞）
MDCK細胞（イヌ腎臓由来の株化細胞）：インフルエンザウイルスの増殖と定量に用いた細胞であり、徳島大学医学部ウイルス学教室由来である。

HEp−2細胞（ヒト子宮頸がん由来）：HSV−1とポリオウイルスの増殖に用いた細胞であり、徳島大学医学部ウイルス学教室由来である。

Vero細胞（アフリカミドリザル腎臓由来）：HSV−1とポリオウイルスの定量に用いた細胞であり、American Type Culture Collection（ATCC）から購入したものである。

CRFK細胞：ネコカリシウイルスの培養用ならびに定量に用いた細胞であり、国立感染症研究所ウイルス第2部から分与されたものである。

（亜塩素酸水の定量法）
本品約5 gを精密に量り,水を加えて正確に100 mlとする。この試料液20 mlを正確に量り、ヨウ素ビンに入れ、硫酸（1→10）10mlを加えた後、ヨウ化カリウム1gを加え、直ちに密栓をしてよくふり混ぜる。ヨウ素瓶の上部にヨウ化カリウム試液を流し込み、暗所に15分間放置する。次に栓を緩めてヨウ化カリウム試液を流し込み、直ちに密栓してよくふり混ぜた後、遊離したヨウ素を0.1mol/Lチオ硫酸ナトリウムで滴定する（指示薬デンプン試液）。指示薬は液の色が淡黄色に変化した後に加える。別に空試験を行い補正する。0.1mol/Lチオ硫酸ナトリウム溶液1ml＝1.711 mg HClO₂）。

（実施例１：亜塩素酸水の生産）
以下の実施例で使用される亜塩素酸水製剤は、以下のように生産した。本明細書では、亜塩素酸水は「亜水」と略称することがあるが、同義である。
亜塩素酸水の成分分析表

この亜塩素酸水を用いて、以下の配合に基づき、亜塩素酸水製剤を製造した。最終のｐＨは６．５であった。

（実施例２：亜塩素酸水によるインフルエンザウイルスの不活化）
本実施例では、上記の配合で製造した「亜塩素酸水製剤」を用いて、ウイルスの不活性化の例としてインフルエンザウイルスの不活性化実験を行った。以下にその手法および結果を示す。

（条件）
亜塩素酸水のｐＨを適宜水酸化カリウムまたは水酸化ナトリウム、あるいはリン酸二水素ナトリウムまたはリン酸二水素カリウムを用いて、ｐＨ５．５、ｐＨ６．５、ｐＨ７．５およびｐＨ８．５に調整して、亜塩素酸水によるインフルエンザウイルスの不活化実験を行った。使用したインフルエンザウイルスはインフルエンザウイルスＡ型Ａｉｃｈｉ株であった。また、使用したウイルスの力価は10⁸cfuであった。以下により詳細な条件を示す。

（緩衝液）
（１）ｐＨ４．５緩衝液、（２）ｐＨ５．５緩衝液、（３）ｐＨ６．５緩衝液、（４）ｐＨ７．５緩衝液、（５）ｐＨ８．５緩衝液、（６）未処理対照用の検査液〔リン酸緩衝塩類溶液（ダルベッコのＰＢＳ；ｐＨ７．４）〕
１）ｐＨ４．５緩衝液の調製方法
０．１ｍｏｌ／Ｌクエン酸溶液を調製し、その１０９．１５ｍｌに、０．２ｍｏｌ／Ｌりん酸水素二ナトリウム溶液９０．８５ｍｌを加え、ｐＨ４．５調製した。
２）ｐＨ５．５緩衝液の調製方法
０．１ｍｏｌ／Ｌクエン酸溶液を調製し、その８．６３ｍｌに、０．２ｍｏｌ／Ｌりん酸水素二ナトリウム溶液１１．３８ｍｌを加え、ｐＨ５．５調製した。
３）ｐＨ６．５緩衝液の調製方法
０．１ｍｏｌ／Ｌクエン酸溶液を調製し、その５．８０ｍｌに、０．２ｍｏｌ／Ｌりん酸水素二ナトリウム溶液１４．２０ｍｌを加え、ｐＨ６．５に］調製した。
４）ｐＨ７．５緩衝液の調製方法
０．１ｍｏｌ／Ｌクエン酸溶液を調製し、その１．５５ｍｌに、０．２ｍｏｌ／Ｌりん酸水素二ナトリウム溶液１８．４５ｍｌを加え、ｐＨ７．５に調製した。
５）ｐＨ８．５緩衝液の調製方法
０．１ｍｏｌ／Ｌクエン酸溶液を調製し、その１．００ｍＬに、０．２ｍｏｌ／Ｌリン酸水素二ナトリウム溶液２０．００ｍＬ加え、ｐＨ８．５に調製した。

（検査試料液等の保存）
各試料液並びに緩衝液は、アルミホイルで包んだ状態で4℃（冷蔵庫）で保存した。

（ウイルスおよび細胞）
ウイルスとしては上述のようにインフルエンザウイルスA型アイチ株 A/Aichi/68 (H₃N₂)を用いた。ウイルス培養用ならびにウイルス定量用の細胞にはMDCK細胞（イヌ腎臓由来の樹立株化細胞）を用いた。細胞の培養には5％ウシ胎児血清を加えたイーグル最小必須培地（Eagle's minimum essential medium；MEM）を用い、5％炭酸ガス存在下37℃で培養した。

（殺ウイルス剤作用の測定法）
１）２ｍｌプラスチックチューブ（アシストチューブ）に１８０μｌの指定ｐＨの緩衝液を加えた。
２）１０μｌの指定濃度の亜塩素酸水溶液を加えた。
３）１０μｌのウイルス液を加え、充分撹拌した後、指定温度の恒温水槽内で保温した。代表的には、２５℃で３０分保温した。
４）保温後直ちに氷水で冷却しタンパク質を含むウイルス希釈液で１００倍希釈した。
５）残存感染ウイルス量をプラック法にて測定した。プラック法は以下のとおりである。各種試験液で処理したウイルスは０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むダルベッコのリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）を用いて適当なウイルス濃度にまで希釈し、その０．５ｍｌをＭＤＣＫ細胞の単層培養（５ｃｍシャ−レ）に接種し、室温で６０分間ロッカープラットフォーム上で機械的にロッキングしながらウイルス吸着を行った。未吸着ウイルスを吸引で除去したのち、ＭＤＣＫ細胞上にプラックを形成させて残存感染性ウイルス量を測定した。プラック形成は、ウイルス吸着後のＭＤＣＫ細胞を０．８％軟寒天とアセチル化トリプシン（４μｇ／ｍｌ）を含有するＭＥＭ中で２日間３７℃で培養した。生じたプラックを確認後、シャーレの細胞を１０％ホルマリンを含む０．５％（ｗ／ｖ）結晶ムラサキ染色液で単染色したのち、目視によりプラック数を数えた。

（試料液によるウイルス不活化）
特に記載した操作以外は全操作を氷上で行った。冷蔵状態の宅配便で送付された（１）亜塩素酸水、（２）次亜塩素酸ナトリウム水溶液、（３）高度サラシ粉製剤水溶液、（４）亜塩素酸ナトリウム水溶液アルミホイルで包んだまま冷蔵庫に保存した。

ウイルス不活化検査は各試料液ごとに行い、使用直前に蒸留水で塩素濃度が１００００ｐｐｍとなるように希釈したものを調製し、さらに２．２ｍｌ容のスクリューキャップ付きプラスチックチューブ（アシストチューブ）内で一連の必要濃度にまで蒸留水で希釈した。別に用意したプラスチックチューブに各ｐＨの緩衝液１８０μｌを分注し、これに希釈試料液の１０μｌを加えたのちボルテックスミキサーで軽く攪拌し均一化した。

そこにインフルエンザウイルス液（１０^８感染単位）１０μｌを加え、さらに攪拌して均一な被検ウイルス液を調製した。被検液は２５℃で３０分間保温したのち、直ちに氷水中で冷却すると同時に冷０．１％ＢＳＡ加ＰＢＳで１００倍に希釈し不活化作用を止めた。その後、残存ウイルス感染価の測定のために冷０．１％ＢＳＡ加ＰＢＳで適宜希釈し、希釈液中の感染性ウイルス数を定量した。

各不活化実験のいずれにおいても、検査試料液の替わりにＰＢＳ（リン酸緩衝塩類溶液）中で同じ温度と時間保持した後の感染性ウイルス量を測定し、それを不活化前のウイルス負荷量とみなし、検査試料液中で不活化した後の残存感染性ウイルス量との比率を算出した。

（結果）
結果を図１に示す。用いたリン酸緩衝液（ｐＨ４．５、ｐＨ５．５、ｐＨ６．５、ｐＨ７．５、ｐＨ８．５）のうち、ｐＨ４．５ではリン酸緩衝液単独でインフルエンザウイルスを検出限界以下にまで不活化した（データ省略）。これはインフルエンザウイルスの酸不活化として知られている現象と一致する。そこでｐＨ４．５を用いた解析は省き、ｐＨ５．５、ｐＨ６．５、ｐＨ７．５、ｐＨ８．５のデータを図１に示している。図１に示されるように、インフルエンザウイルスの不活化はｐＨが低くなると顕著で、ｐＨ６．５以下であれば、５０ｐｐmでも１％程度にまで感染性ウイルスが減少した。また、２００ｐ
ｐｍの濃度では、ｐＨ８．５でも効果があることが判明した。

次に、亜塩素酸水のほか、次亜塩素酸ナトリウム、高度サラシ粉製剤、および亜塩素酸ナトリウムを比較対象として用い、コントロールとしてリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を用い同様の実験をした結果を以下の表４Ｂに示す。
（図４Ｂ濃度10 ppmで、各pHにおけるインフルエンザウイルスの不活化）

表４Ｂからも明らかなように、もっとも強いウイルス不活化作用を示したのは（２）次亜塩素酸ナトリウム液で、ｐＨ５．５からｐＨ８．５に至るどのｐＨにおいても濃度１０ｐｐｍで検出限界（１０^−５）以下にまでウイルスを不活化した。

（１）亜塩素酸水は（２）次亜塩素酸ナトリウム水溶液に次ぐ強力なウイルス不活化作用を示した。その作用はｐＨにやや依存し、ｐＨ５．５やｐＨ６．５では１００ｐｐｍ以下で検出限界以下にまでインフルエンザウイルスを不活化したが、ｐＨ７．５やｐＨ８．５といった中性・アルカリ性ではｐＨ値が高くなるほどウイルス不活作用が減弱していた（この場合も２００ｐｐｍでは検出限界程度にまで不活化した）。（３）高度サラシ粉製剤水溶液や（４）亜塩素酸ナトリウム水溶液ではウイルス不活化活性は弱く、かつ、ｐＨに依存した。不活化活性が検出できたのはｐＨ５．５においてのみであり、その場合も２００ｐｐｍにおいても十分の一までは不活化できていなかった（図１Ｂ）。

以上から、本発明の亜塩素酸水を含むウイルス殺傷剤は、インフルエンザウイルスに対する良好な殺傷剤であることが判明した。

（実施例３：亜塩素酸水によるヘルペスウイルスの不活化）
本実施例では、ウイルスの不活化の例としてヘルペスウイルスの不活化実験を行った。以下にその手法および結果を示す。

殺ウイルス剤作用の測定法としては実施例２に記載される方法において、加えるウイルスを変更し、使用するｐＨを４．５、５．５、６．５、７．５および８．５に増加させたほかは、同様の条件で行った。使用したヘルペスウイルスはHerpes simplex virus type I VR−539であった。また、使用したウイルスの力価は10⁴cfuであった。以下により詳細な条件を示す。

（材料）
（検査試料液等）
（試料液）
（１）亜塩素酸水
（２）次亜塩素酸ナトリウム水溶液
（３）高度さらし粉製剤水溶液
（４）亜塩素酸ナトリウム水溶液
の4種類の水溶液を試験液として用いた。各薬剤につき２００ｐｐｍ、１５０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ、５０ｐｐｍおよび１０ｐｐｍの５種類の濃度の水溶液を蒸留水にて調整した。希釈後の各試験液は０．２２μｍのフィルターを用いて濾過滅菌し、亜塩素酸水の殺菌力に及ぼすpHの影響を調べた。

（緩衝液）
（１）ｐＨ４．５緩衝液、（２）ｐＨ５．５緩衝液、（３）ｐＨ６．５緩衝液、（４）ｐＨ７．５緩衝液、（５）ｐＨ８．５緩衝液
１）ｐＨ４．５緩衝液の調製方法
０．１ｍｏｌ／Ｌクエン酸溶液を調製し、その１０９．１５ｍｌに、０．２ｍｏｌ／Ｌりん酸水素二ナトリウム溶液９０．８５ｍｌを加え、ｐＨ４．５に調整した。
２）ｐＨ５．５緩衝液の調製方法
０．１ｍｏｌ／Ｌクエン酸溶液を調製し、その８．６３ｍｌに、０．２ｍｏｌ／Ｌりん酸水素二ナトリウム溶液１１．３８ｍｌを加え、ｐＨ５．５に調整した。
３）ｐＨ６．５緩衝液の調製方法
０．１ｍｏｌ／Ｌクエン酸溶液を調製し、その５．８０ｍｌに、０．２ｍｏｌ／Ｌりん酸水素二ナトリウム溶液１４．２０ｍｌを加え、ｐＨ６．５に調整した。
４）ｐＨ７．５緩衝液の調製方法
０．１ｍｏｌ／Ｌクエン酸溶液を調製し、その１．５５ｍｌに、０．２ｍｏｌ／Ｌりん酸水素二ナトリウム溶液１８．４５ｍｌを加え、ｐＨ７．５に調整した。
５）ｐＨ８．５緩衝液の調製方法
０．１ｍｏｌ／Ｌクエン酸溶液を調製し、その１．００ｍＬに、０．２ｍｏｌ／Ｌリン酸水素二ナトリウム溶液２０．００ｍＬ加え、ｐＨ８．５に調整した。

（検査試料液等の保存）
各試料液並びに緩衝液は、アルミホイルで包んだ状態で４℃（冷蔵庫）で保存した。

(2) ウイルス
ウイルスとしてはHerpes simplex virus I VR-539株（本明細書においてHSV-Iと表示することがある。）を用いた。

（方法）
（試料液によるウイルス不活化）
試験液にＨＳＶ−Ｉを１．１〜１．８×１０^４ｐｆｕ（ｐｌａｑｕｅ−ｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔ）接種し、攪拌後、２５℃で３０分静置した。反応液を全量（０．２ｍｌ）、コンフルエントにまで増殖させたＶｅｒｏ細胞上に拡げ、２５℃で１時間静かに振盪して生残するＨＳＶ−Ｉを感染させた。細胞を更に３日間培養した後、プラークの形成数を計測し、生残するＨＳＶ−Ｉ数を算出した。また、ｐＨ単独の影響を補正するため、ｐＨ調整用緩衝液中（ｐＨ８．５、７．５、６．５、５．５および４．５）におけるＨＳＶ−Ｉの生残数も計測した。ｐＨ調整用緩衝液中の生残ＨＳＶ−Ｉ数に対する各試験液作用後の生残ＨＳＶ−Ｉ数の割合を比較した。

（結果）
結果を図２Ｂに示す。図２Ｂに示されるように、亜塩素酸水のほか、次亜塩素酸ナトリウム、亜塩素酸ナトリウムをクエン酸/リン酸緩衝液（０．０８ｍｌ）でｐＨを８．５、７．５、６．５、５．５、４．５に調整したもので、生残ウイルスをＶｅｒｏ細胞に１時間感染させて計測したプラック計測実験を行った。結果を図２Ｂに示す。亜塩素酸水は、５０ｐｐｍ以上の濃度で十分な殺滅効果が得られ、その効果はｐＨ５．５以下の酸性条件下で顕著であり、２００ｐｐｍ以上であれば、ｐＨ６．５以下でも、十分に効果があることが理解される。これは、次亜塩素酸ナトリウム、亜塩素酸ナトリウムとは対照的である。

他方、次亜塩素酸ナトリウムにおいてはｐＨ５．５以下の酸性条件下においてヘルペスウイルスＩ型に対する殺滅効果が減弱した。

別のラウンドの実験結果を以下に示す。

試験液のＨＳＶ−Ｉに対する殺滅効果を表４Ｃに示す。ｐＨ調整用緩衝液中（ｐＨ８．５、７．５、６．５、５．５および４．５）でのＨＳＶ−Ｉの生残数は接種ウイルス数の８５．６−９４．４％であり、ＨＳＶ−Ｉの生残に対するｐＨ単独の影響はなかった（表４Ｄ）。（２）次亜塩素酸ナトリウム水溶液はｐＨ６．５−８．５の条件において濃度５０ｐｐｍ以上でＨＳＶ−Ｉに対する優れた作用を示し、検出限界以下にまでＨＳＶ−Ｉを減少させた。（２）次亜塩素酸ナトリウム水溶液以外の試験薬剤についてはｐＨ６．５−８．５の条件において２００ｐｐｍの濃度を用いてもＨＳＶ−Ｉを１％以下に減少させるものはなかった。他方、ｐＨ５．５においてＨＳＶ−Ｉを検出限界以下にまで減少させた薬剤は１５０ｐｐｍおよび２００ｐｐｍの（１）亜塩素酸水と（２）次亜塩素酸ナトリウム水溶液のみであった。また、ｐＨ４．５においてＨＳＶ−Ｉを検出限界以下にまで減少させた薬剤は１００ｐｐｍ、１５０ｐｐｍ、２００ｐｐｍの（１）亜塩素酸水と２００ｐｐｍの（２）亜塩素酸ナトリウム水溶液のみであった。（２）次亜塩素酸ナトリウム水溶液のＨＳＶ−Ｉに対する殺滅効果は酸性条件下（ｐＨ４．５−５．５）で著しく減弱するが、１００ｐｐｍ以上の（１）亜塩素酸水はこの条件下（ｐＨ４．５−５．５）においてＨＳＶ−Ｉに対する優れた殺滅効果を示す。（１）亜塩素酸水のＨＳＶ−Ｉに対する殺滅効果について検討した。ＨＳＶ−Ｉに対してはアルカリ条件下では効果が低かったが、酸性条件下（ｐＨ４．５−５．５）においては（２）次亜塩素酸ナトリウム水溶液よりも優れた殺滅効果を示した。以上の結果から、（１）亜塩素酸水は使用条件を至適化することにより幅広い微生物に対する殺滅効果が期待できる。

（表４Ｃ試験薬剤のHSV-Iに対する殺滅効果（プラークアッセイによる効果判定））

（表 2. HSV-Iに対する pHの影響（プラークアッセイによる効果判定））

（実施例４：亜塩素酸水によるポリオウイルスの不活化（インフルエンザウイルス不活化との比較））
次に、本実施例では、ポリオウイルスの不活化について実証した。本実施例では、インフルエンザウイルスとの比較を行った。以下にその手法および結果を示す。

殺ウイルス剤作用の測定法としては実施例２に記載される方法において、インフルエンザウイルスまたはポリオウイルスを使用してｐＨを５．５または７．５に変更して行った。使用したインフルエンザウイルスはインフルエンザウイルスＡ型Ａｉｃｈｉ株であった。また、使用したポリオウイルスは、ポリオウイルス１型生ワクチン株であった。また、使用したウイルスの力価は10⁴cfuであった。

（結果）
結果を図３に示す。図３に示されるように、ポリオウイルスは、インフルエンザウイルスよりも高濃度の亜塩素酸水が必要であった。ｐＨの傾向はインフルエンザウイルスと同様であり、酸性側で殺傷力が強かった。いずれにしても５００ｐｐｍにて、ポリオウイルスもほぼ殺傷することができた。２００ｐｐｍでは、ｐＨ５．５で殺傷が見られる程度であった。

（ポリオの追試）
さらに、別のラウンドの実験系を用いて、亜塩素酸水によるポリオウイルス不活化作用の定量的解析を行った。

（材料）
（１）検査試料液等
（試料液）
亜塩素酸水(HClO₂)
（緩衝液）
（１）pH5.5緩衝液および（２）pH7.5緩衝液
1)pH5.5緩衝液の調製方法
0.1mol/Lクエン酸溶液を調製し、その8.63mlに、0.2mol/Lりん酸水素二ナトリウム溶液11.38mlを加え、pH5.5調製した。
2)pH 7.5緩衝液の調製方法
0.1mol/Lクエン酸溶液を調製し、その1.55mlに、0.2mol/Lりん酸水素二ナトリウム溶液18.45mlを加え、pH7.5に調製した。

（検査試料液等の保存）
各試料液並びに緩衝液は、アルミホイルで包んだ状態で4℃（冷蔵庫）で保存した。
（２）ウイルスと細胞
ウイルスとしてはワクチン由来ポリオウイルス1型（PV1）を用いた。ウイルス培養用ならびにウイルス定量用の細胞にははアフリカミドリザルの腎臓上皮細胞（Verocell）を用いた。亜塩素酸水の殺菌効果を確認する為に細胞の培養には、5％ウシ胎児血清を加えたイーグル最小必須培地（Eagle's minimumessential medium；MEM）を用いて、5％炭酸ガス存在下の30℃で培養した。

（方法）
（１）感染性ウイルス数の定量方法
プラック法を用いて定量した。各種試験液で処理したウイルスは0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）を含むダルベッコのリン酸緩衝塩類溶液（PBS）を用いて適当なウイルス濃度にまで希釈し、その0.5mlをCRFK細胞の単層培養（5 cmシャ−レ）に接種し、室温で60分間、ロッカープラットフォーム上で、機械的にロッキングしながらウイルスの吸着処理を実施した。

プラックの形成は、ウイルス吸着後のVero細胞を0.8％軟寒天とアセチル化トリプシン（5μg/ml）を含有するMEM中で、2日間、30℃で培養した。

生じたプラックを確認後、シャーレの細胞を10％ホルマリンを含む0.5％(w/v)結晶ムラサキ染色液で単染色したのち、目視によりプラック数を数えた。

（２）試料液によるウイルス不活化効果確認方法
特に記載した操作以外は全操作を氷上で行い、各試料液はアルミホイルで包んだまま冷蔵庫に保存した。

ウイルス不活化検査は各試料液ごとに行い、（ｉ）亜塩素酸水は、使用直前に蒸留水で亜塩素酸濃度が 10000 ppm になるように、指示に従って希釈したものから、さらにアシストチューブ内で蒸留水で必要濃度にまで希釈し、その10μｌを、各pHのリン酸緩衝液180μｌに加えたのち、ボルテックスミキサーで軽く攪拌し均一化した。そこにポリオウイルス液（約10⁷感染単位）10μｌを加え、さらに攪拌して均一な被検ウイルス液を調製した。

被検液は25℃で30分間保温したのち、直ちに氷水中で冷却すると同時に冷0.1％BSA加PBSで100倍に希釈し中和処理をした。その後、残存ウイルス感染価の測定のために冷0.1％BSA加PBSで適宜希釈し、その感染性ウイルス数を定量した。

（結果）
結果を図３Ｂに示す。亜塩素酸水によるポリオウイルス不活化作用の定量的解析を確認したところ、白丸のインフルエンザ（ｐＨ７．５）では５０ｐｐｍでも顕著にウイルス殺傷効果が見られたため定量性については確認できなかったが、それ以外については、白三角のインフルエンザウイルス（ｐＨ５．５）と同様、ポリオウイルス（黒丸ｐＨ５．５、黒三角ｐＨ７．５）に対しても、定量性が確認された。

（実施例５：亜塩素酸水によるインフルエンザウイルスの不活化速度の測定）
次に、本実施例では、亜塩素酸水によるインフルエンザウイルスの不活化速度を測定した。以下にその手法および結果を示す。

殺ウイルス剤作用の測定法としては実施例２に記載される方法において、ｐＨは６．５を用い、亜塩素酸水としては１００ｐｐｍのものを用い、インフルエンザウイルスと接触する際の亜塩素酸濃度は、５ｐｐｍであり、０分後、０．５分後、１分後、および４分後の試料を採取して不活化されたかどうかを確認した。

（結果）
結果を図４に示す。図４に示されるように、亜塩素酸水は、３０秒経過時点でインフルエンザウイルスの殺傷能力をほぼ完遂していることがわかる。

（実施例６亜塩素酸水と次亜塩素酸ナトリウムの細胞傷害作用の比較（1））
本実施例では、亜塩素酸水と次亜塩素酸ナトリウムの細胞傷害作用の比較を行うために、ＨＥｐ−２細胞を用いて実験を行った。その方法および結果を示す。

ＨＥｐ−２細胞を単層培養し生理食塩水で４回洗い、種々の濃度の試薬を含む（たとえば、ｐＨ５．５）緩衝塩類溶液中で氷温に２０分間保温した。処理細胞から試薬を除去し培養液中で３７℃で６０分間保存した。トリプシンを用いて細胞をはがし、細胞懸濁液を用いて、トリパンブルーによる色素排除して、生細胞数と死細胞数を計測して算出した。

（結果）
結果を図５に示す。図５に示されるように、亜塩素酸水と次亜塩素酸ナトリウムの細胞障害作用の比較において、次亜塩素酸ナトリウムでは、０．５ｐｐｍ程度でも死細胞が生じているが、本発明の亜塩素酸水では、５０ｐｐｍにおいて、次亜塩素酸ナトリウムの０．５ｐｐｍと同等の死細胞程度しか確認されておらず、事実上影響がなかった。このことから、亜塩素酸水は、細胞に対する安全性（傷害性の低さ）から、安全な消毒、ウイルス殺傷剤を提供することができると理解される。

（実施例７：亜塩素酸水と次亜塩素酸ナトリウムの細胞傷害作用の比較（2））
次に、本実施例では、亜塩素酸水と次亜塩素酸ナトリウムの細胞傷害作用の比較として、ｐＨを種々使用した場合の細胞傷害性を確認した。その方法および結果を示す。

ＨＥｐ−２細胞を単層培養し生理食塩水で４回洗い、種々のｐＨ緩衝液および種々の濃度の試薬を含む緩衝塩類溶液中で氷温に２０分間保温した。処理細胞から試薬を除去し培養液中で３７℃で６０分間保存した。トリプシンを用いて細胞をはがし、細胞懸濁液を用いて、トリパンブルーによる色素排除して、生細胞数と死細胞数を計測して算出した。

（結果）
結果を図６に示す。図６に示されるように、ｐＨによる違いはあまり見られなかったが、次亜塩素酸ナトリウムでは、僅かな濃度で細胞が死滅してしまったが、亜塩素酸水で同様の死細胞の割合になったのは、１００ｐｐｍ以上であり、細胞障害作用は、100倍の開きがあった。

（実施例８：亜塩素酸水と次亜塩素酸ナトリウムの細胞傷害作用の比較（3））
次に、本実施例では、Vero（American Type Culture Collection（ATCC）から購入した）, HEp−2（徳島大学医学部ウイルス学教室に由来する）,MDCK（徳島大学医学部ウイルス学教室に由来する）の各細胞のコロニー形成能への傷害性を確認した。

手法は、実施例６に準じたが、使用する細胞をＶｅｒｏ、ＨＥｐ−２およびＭＤＣＫに変更して行い、溶液中の緩衝液はリン酸緩衝液を用いた。

各緩衝液の作製は以下のとおりである。

（リン酸緩衝液の作成方法）
≪使用試薬≫
クエン酸（QINDAO FUSO REFINING & PROCESSING CO. LTD.製）
リン酸水素ニナトリウム（燐化学工業株式会社製）
≪調製方法≫
pH3.5緩衝液 0.1mol/Lクエン酸溶液13.93mLに、0.2mol/Lリン酸水素二ナトリウム溶液6.07mL加える。
pH4.0緩衝液 0.1mol/Lクエン酸溶液12.29mLに、0.2mol/Lリン酸水素二ナトリウム溶液 7.71mL加える。
pH4.5緩衝液 0.1mol/Lクエン酸溶液10.92mLに、0.2mol/Lリン酸水素二ナトリウム溶液 9.09mL加える。
pH5.0緩衝液 0.1mol/Lクエン酸溶液 9.70mLに、0.2mol/Lリン酸水素二ナトリウム溶液 10.30mL加える。
pH5.5緩衝液 0.1mol/Lクエン酸溶液 8.63mLに、0.2mol/Lリン酸水素二ナトリウム溶液 11.38mL加える。
pH6.0緩衝液 0.1mol/Lクエン酸溶液7.33mLに、0.2mol/Lリン酸水素二ナトリウム溶液 12.63mL加える。
pH6.5緩衝液 0.1mol/Lクエン酸溶液 5.80mLに、0.2mol/Lリン酸水素二ナトリウム溶液 14.20mL加える。
pH7.0緩衝液 0.1mol/Lクエン酸溶液 3.53mLに、0.2mol/Lリン酸水素二ナトリウム溶液 16.47mL加える。
pH7.5緩衝液 0.1mol/Lクエン酸溶液 1.55mLに、0.2mol/Lリン酸水素二ナトリウム溶液 18.45mL加える。

（グッド酸緩衝液の作製方法）
≪使用試薬≫
NaCl（和光 191−01665）
KCｌ（和光 163−03545）
MES〔2−morpholinoethanesulfonic acid〕（和光 349−01623）
HEPES〔2−[4−(2−hydroxyethyl)−l−piperazinyl]ethanesulfonic acid〕（和光 346−01373）
TAPS〔N−tris−hydroxymethyl−3−aminopropanesulfonic acid〕（和光 344−02572）
1N NaOH
1N HCl
≪調製方法≫
塩類溶液原液 NaCl10.24gと KCl 0.25g を約600mlの蒸留水に溶解させた後、蒸留水を加え1,000mlにする。
ｐH5.5 緩衝液800mlの塩類溶液原液に、MES 4265mgを溶解し、ｐHメーターで確認しながら、1N NaOH または 1N HClを滴下し、ｐH5.5に調整した後、蒸留水を加え、1,000mlにする。
ｐH6.5 緩衝液800mlの塩類溶液原液に、MES 4265mgを溶解し、ｐHメーターで確認しながら、1N NaOH または 1N HClを滴下し、ｐH6.5に調整した後、蒸留水を加え、1,000mlにする。
ｐH7.5 緩衝液800mlの塩類溶液原液に、HEPES 4765mgを溶解し、ｐHメーターで確認しながら、1N NaOH または 1N HClを滴下し、ｐH7.5に調整した後、蒸留水を加え、1,000mlにする。
ｐH8.5 緩衝液800mlの塩類溶液原液に、TAPS 4865mgを溶解し、ｐHメーターで確認しながら、1N NaOH または 1N HClを滴下し、ｐH8.5に調整した後、蒸留水を加え、1,000mlにする。

（結果）
結果を図７に示す。図７に示されるように、次亜塩素酸ナトリウムでは、５ｐｐｍ以下で各細胞のコロニー形成への障害が見られたが、亜塩素酸水では、２０ｐｐｍであっても、Hep−2細胞とVero細胞のコロニー形成への障害は見られなかった。ただし、MDCK細胞では、コロニー形成への障害が確認されたが、次亜塩素酸ナトリウムの障害作用と比較して、4分の1程度であった。

（実施例９：ノロウイルスの効果確認のためのネコカリシウイルスに対する不活化効果確認（１））
本実施例では、ノロウイルスの効果確認のため代替実験として当該分野において認められているネコカリシウイルスを用いて不活化効果を確認した。ノロウイルスについては、ノロウィルス不活化有効性評価試験に於ける代替ウィルス、ネコカリシウィルス使用による試験法 EPA、平成19年度ノロウイルスの不活化条件に関する調査報告書、国立医薬品食品衛生研究所食品衛生管理部山本茂貴および野田衛、厚生労働省を参照。ノロウイルスのウイルス殺傷効果についてが近縁菌であるネコカリシウイルス（FCV)による調査で代替されうるとされている点については、この文献のほか、Gehrke, C et al: Inactivation of feline calicivirus, a surrogate of norovirus (formerly Norwalk−like viruses), by different types of alcohol in virtro and in vivo, J Hosp Infect (2004)46:49−55； Doultree, JC et al: Inactivation of feline calicivirus, a norwalk virus surrogate, J Hosp Infect (1999)41:51−57);Jennifer, L et al: Surrogates for the study of norovirus stability and inactivation in the environment: A comparison of murine norovirus and feline calicivirus, J Food Protect (2006)11:2761−2765；高木弘隆他: ネコカリシウイルス(FCV)を代替としたノロウイルス(NV)不活化効果の検討−アリカリ剤、過酸化水素および過炭酸ナトリウムによる不活性化効果−、医学と薬学(2007)57:311−312を参照する（本明細書でもこれを援用する）。以下に方法および結果を示す。

（材料）
使用試薬として、実施例１で調製した「亜塩素酸水」、10 w/w%ヨウ化カリウム、10%硫酸、0.1 Mチオ硫酸ナトリウムを用いた。

（ウイルスおよび細胞）
ウイルスとしてはネコカリシウイルスＦ４株を、ウイルス培養用ならびにウイルス定量用の細胞にはＣＲＦＫ細胞を用いた（国立感染症研究所ウイルス第2部から分与された）。

細胞の培養には、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を加えたイーグル最小必須培地（Ｅａｇｌｅ’ｓｍｉｎｉｍｕｍｅｓｓｅｎｔｉａｌｍｅｄｉｕｍ；ＭＥＭ）を用い、５％炭酸ガス存在下３７℃で３日間培養し、シャーレ上に単層培養層を形成したものを用いた。

（方法）
（１感染性ウイルス数の定量）
プラック法を用いて定量した。各種試験液で処理したウイルスは０．５％ＦＢＳを含むダルベッコのリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）を用いて適当なウイルス濃度にまで希釈し、その０．５ｍＬをＣＲＦＫ細胞の単層培養（５ｃｍシャーレ）に接種し、室温で６０分間ロッカープラットフォーム上で機械的にロッキングしながらウイルス吸着を行った。

プラックの形成は、ウイルス吸着後のＣＲＦＫ細胞を０．６８％メチルセルロースと０．５％ＦＢＳを含有するＭＥＭ中で一夜３７℃で培養する。生じたプラックを確認後、シャーレの細胞を１０％ホルマリンを含む０．５％（ｗ／ｖ）結晶ムラサキ染色液で単染色したのち、目視によりプラック数を数えた。

（２ウイルス不活化）
各試料液はアルミホイルで包んだ状態で冷蔵庫に保存し、特に記載した操作以外は全操作を氷上で行った。「亜塩素酸水」についてのウイルス不活化検査は、2.2 ml容のスクリューキャップ付きプラスチックチューブ（アシストチューブ）内で一連の必要濃度〔亜塩素酸（HCｌO₂）濃度7,200ppm，1,200ppm，400 ppm，200 ppm，100 ppm〕になるように蒸留水を用いて調製したのちボルテックスミキサーで軽く攪拌し均一化した。そこにネコカリシウイルス液(約10⁷感染単位/ml)10 μl加え、総量を180 μlとしたのち、さらに攪拌して均一な被験ウイルス液を調整した。被検液は25℃で5分間保湿したのちに、直ちに氷水中で冷却すると同時に冷した0.5%FBSをPBSに加えて適宜希釈し、感染性ウイルス数を定量した。

不活化実験において、検査試料液の替わりにPBS（リン酸緩衝塩類溶液）中で同じ温度と時間保持した後の感染性ウイルス量を測定し、それを不活化前のウイルス負荷量とみなし、検査試料液中で不活化した後の残存感染性ウイルス量との比率を算出した。

（結果）
ウイルスに対する不活化効果確認結果を以下の表１に示す。

表中「N.D.」は検出限界以下であり、完全な不活化効果を確認した。
亜塩素酸濃度：亜塩素酸水希釈液の亜塩素酸濃度（ppm）
数値は残存感染性ウイルス量の割合である。
※検査試料液の替わりにPBS（リン酸緩衝塩類溶液）中で同じ温度と時間保持した後の感染性ウイルス量を測定した結果を「1.00」として、検査試料液中で不活化した後の残存感染性ウイルス量との比率を算出した。

また、その結果をプロットしたものを図８に示す。図８に示されるように、ネコカリシウイルスについても４００ｐｐｍで殺傷能力があることが示された。すなわち、ノロウイルスと同じ活性化機構を持つネコカリシウイルスでも４００ｐｐｍで不活化効果が期待でき、図３から、ノロウイルスと同じ構造を持つポリオウイルスに対しても５００ｐｐｍあれば、十分に不活化することが確認出来ている事から、ノロウイルスに対して４００ｐｐｍから５００ｐｐｍの濃度であれば、十分な不活化効果を期待する事が出来る。

（実施例１０：ノロウイルスの効果確認のためのネコカリシウイルスに対する不活化効果確認（２））
本実施例では、上記実施例に引き続き、ネコカリシウイルスを標準株としてノロウイルスの効果を確認した。

（材料）
（検査試料液等）
（試料液）
（１）亜塩素酸水(HClO₂)
（２）実施例１にて製造した亜塩素酸水製剤
（３）次亜塩素酸ナトリウム水溶液（南海化学株式会社製）
（緩衝液）
（１）pH4.5緩衝液、（２）pH5.5緩衝液、（３）pH6.5緩衝液、（４）pH7.5緩衝液、（５）pH8.5緩衝液、（６）未処理対照用の検査液〔リン酸緩衝塩類溶液（ダルベッコのPBS;pH7.4）〕
１) pH4.5緩衝液の調製方法
0.1mol/Lクエン酸溶液を調製し、その109.15mlに、0.2mol/Lりん酸水素二ナトリウム溶液90.85mlを加え、pH4.5調製した。
２) pH5.5緩衝液の調製方法
0.1mol/Lクエン酸溶液を調製し、その8.63mlに、0.2mol/Lりん酸水素二ナトリウム溶液11.38mlを加え、pH5.5調製した。
３) pH6.5緩衝液の調製方法
0.1mol/Lクエン酸溶液を調製し、その5.80mlに、0.2mol/Lりん酸水素二ナトリウム溶液14.20mlを加え、pH6.5に]調製した。
４) pH 7.5緩衝液の調製方法
0.1mol/Lクエン酸溶液を調製し、その1.55mlに、0.2mol/Lりん酸水素二ナトリウム溶液18.45mlを加え、pH7.5に調製した。
５) pH 8.5緩衝液の調製方法
0.1mol/Lクエン酸溶液を調製し、その1.00mLに、0.2mol/Lリン酸水素二ナトリウム溶液20.00mL加え、pH8.5に調製した。

（２）ウイルスと細胞
ウイルスとしては国立感染研究所由来のネコカリシウイルスF4株を用いる。ウイルス培養用ならびにウイルス定量用の細胞には国立感染研究所由来のCRFK細胞を用いた。細胞の培養には5％ウシ胎児血清（FBS）を加えたイーグル最小必須培地（Eagle's minimum essential medium；MEM）を用い、5％炭酸ガス存在下37℃で3日間培養し、シャーレ上に単層培養層を形成したものを用いた。

（方法）
(１) 感染性ウイルス数の定量
プラック法を用いて定量した。各種試験液で処理したウイルスは0.5％FBSを含むダルベッコのリン酸緩衝塩類溶液（PBS）を用いて適当なウイルス濃度にまで希釈し、その0.5mlをCRFK細胞の単層培養（5cmシャ−レ）に接種し、室温で60分間ロッカープラットフォーム上で機械的にロッキングしながらウイルス吸着を行った。

プラックの形成は、ウイルス吸着後のCRFK細胞を0.68％メチルセルロースと0.5％FBSを含有するMEM中で一夜37℃で培養した。生じたプラックを確認後、シャーレの細胞を10％ホルマリンを含む0.5％(w/v)結晶ムラサキ染色液で単染色したのち、目視によりプラック数を数えた。

(２) 試料液によるウイルス不活化
各試料液はアルミホイルで包んだ状態で冷蔵庫に保存し、特に記載した操作以外は全操作を氷上で行った。ウイルス不活化検査は各試料液ごとに行い、（ｉ）亜塩素酸水と（ｉｉi）次亜塩素酸ナトリウム溶液は、使用直前に蒸留水で塩素濃度が10000 ppm となるように希釈したものから、さらにアシストチューブ内で蒸留水を用いて必要濃度にまで希釈し、その10μｌを各pHのリン酸緩衝液180μｌに加えたのちボルテックスミキサーで軽く攪拌し均一化した。また、本発明の実施例で製造した亜塩素酸水製剤については、終濃度が6倍希釈、12倍希釈、それ以下になるように蒸留水を用いて調製したのちボルテックスミキサーで軽く攪拌し均一化した。そこにネコカリシウイルス液（約10⁷感染単位/ｍｌ）10μｌを加え、さらに攪拌して均一な被検ウイルス液を調整した。被検液は25℃で一定時間保温したのち、直ちに氷水中で冷却すると同時に冷0.5％FBS加PBSで100倍に希釈し不活化作用を止めた。その後、残存ウイルス感染価の測定のために冷0.5％FBS加PBSで適宜希釈し、感染性ウイルス数を定量した。

（結果）
結果を図９−１２に示す。
（１）亜塩素酸水によるネコカリシウイルスの不活化作用
0.1Mクエン酸/リン酸ナトリウム緩衝液（pH5.5,pH6.5,pH7.5,pH8.5）の4種のpHで、25℃30分処理した時の種々の濃度の（ｉ）亜塩素酸水によるネコカリシウイルス不活化を調べた。その結果、ネコカリシウイルスは、（ｉ）亜塩素酸水によって不活化を受けた。不活化は緩衝液のpHが酸性でより顕著であった。しかし、200ppm以上の活性塩素濃度では、調べたいずれのpHでも検出限界以下にまで不活化した（図９）。
（２）亜塩素酸水製剤によるウイルスの不活化作用
亜塩素酸水製剤は、25℃、5分間の保温で、インフルエンザウイルスまたはネコカリシウイルスを不活化した。36倍希釈しても、いずれのウイルスも0.005%（この時の検出限界）以下にまで感染性ウイルス量を低下させている。

（ｉ）亜塩素酸水と（iii）次亜塩素酸ナトリウムとのネコカリシウイルス不活化活性の比較
0.1Mクエン酸/リン酸ナトリウム緩衝液（pH4.5,pH7.5）の2種のpHで、25℃、30分処理した時の種々の濃度の（ｉ）亜塩素酸水と（iii）次亜塩素酸ナトリウムによるネコカリシウイルス不活化を調べた。

その結果、（ｉ）亜塩素酸水は、pHによる影響をほとんど受けずにネコカリシウイルスを不活化したが、（iii）次亜塩素酸ナトリウムは強くpHの影響を受け、pH4.5ではネコカリシウイルス不活化能を喪失した。中性pHでは（ｉｉi）次亜塩素酸ナトリウムの不活化作用は（ｉ）亜塩素酸水より強かった（図１０）。
（３）（ii）亜塩素酸水製剤による10%味噌中のウイルス不活化亜塩素酸水製剤は、25℃5分間の保温で、10%味噌/PBS液中に均質に混ざっているＡ型インフルエンザウイルスまたはネコカリシウイルスを不活化した。インフルエンザウイルスはネコカリシウイルスより顕著な不活化を受けたが、不活化の程度はそれほど強くなく、4倍希釈液でもインフルエンザウイルスの１割の感染性ウイルスが残っていた（図１１）。
（４）（ii）亜塩素酸水製剤による10%味噌中のウイルス不活化
（ii）亜塩素酸水製剤は、10%味噌/PBS液中に均質に混ざっているネコカリシウイルスを不活化した。25℃5分間の保温でも不活化作用を示すが、保温時間を20分間まで延ばすと、かなり強い不活化を示し、4倍希釈液でも1/1000以下にまで感染性ウイルス量を減じた。10%味噌/PBS液中に混ざっているネコカリシウイルスを不活化できるということは、多量の有機物存在下でも（ii）亜塩素酸水製剤がウイルスを不活化出来ることを示し、かつ、処理時間の延長により不活化効果を上げたことは（ii）亜塩素酸水製剤中の活性塩素分子種が夾雑有機物で一気に消失されてしまうことはないことを示している（図１２）。

（実施例１１：ノロウイルスの効果確認のためのネコカリシウイルスに対する不活化効果確認（３））
本実施例では、ノロウイルスの効果確認のためのネコカリシウイルスに対する不活化効果を別の例で確認した。

（材料）
（１）検査試料液等
（試料液）
（ｉ）亜塩素酸水(HClO₂)
（ii）亜塩素酸水製剤（オウトゥロックスーパー）
（iii）次亜塩素酸ナトリウム水溶液（南海化学株式会社製）
（緩衝液）
（ｉ）pH4.5緩衝液、（ii）pH5.5緩衝液、（iii）pH6.5緩衝液、（iv）pH7.5緩衝液、（ｖ）pH8.5緩衝液
（ｉ） pH4.5緩衝液の調製方法
0.1mol/Lクエン酸溶液を調製し、その109.15mlに、0.2mol/Lりん酸水素二ナトリウム溶液90.85mlを加え、pH4.5調製した。

（ii）pH5.5緩衝液の調製方法
0.1mol/Lクエン酸溶液を調製し、その8.63mlに、0.2mol/Lりん酸水素二ナトリウム溶液11.38mlを加え、pH5.5調製した。

（iii） pH6.5緩衝液の調製方法
0.1mol/Lクエン酸溶液を調製し、その5.80mlに、0.2mol/Lりん酸水素二ナトリウム溶液14.20mlを加え、pH6.5に調製した。

（iv）pH 7.5緩衝液の調製方法
0.1mol/Lクエン酸溶液を調製し、その1.55mlに、0.2mol/Lりん酸水素二ナトリウム溶液18.45mlを加え、pH7.5に調製した。

（ｖ） pH 8.5緩衝液の調製方法
0.1mol/Lクエン酸溶液を調製し、その1.00mLに、0.2mol/Lリン酸水素二ナトリウム溶液20.00mL加え、pH8.5に調製した。

（２）ウイルスおよび細胞
ウイルスとしては国立感染研究所由来のネコカリシウイルスF4株を用いた。ウイルス培養用ならびにウイルス定量用の細胞には国立感染研究所由来のCRFK細胞を用いた。

細胞の培養には5％ウシ胎児血清（FBS）を加えたイーグル最小必須培地（Eagle's minimum essential medium；MEM）を用い、5％炭酸ガス存在下37℃で3日間培養し、シャーレ上に単層培養層を形成したものを用いた。

（方法）
(１) 感染性ウイルス数の定量方法
プラック法を用いて定量した。各種試験液で処理したウイルスは0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）を含むダルベッコのリン酸緩衝塩類溶液（PBS）を用いて適当なウイルス濃度にまで希釈し、その0.5mlをCRFK細胞の単層培養（5cmシャ−レ）に接種し、室温で60分間、ロッカープラットフォーム上で、機械的にロッキングしながらウイルスの吸着処理を実施した。

プラックの形成は、ウイルス吸着後のCRFK細胞を0.8％軟寒天とアセチル化トリプシン（5μg/ml）を含有するMEM中で、2日間、37℃で培養した。

(２) 試料液によるウイルス不活化効果確認方法
特に記載した操作以外は全操作を氷上で行い、各試料液はアルミホイルで包んだまま冷蔵庫に保存した。

ウイルス不活化検査は各試料液ごとに行い、（ｉ）亜塩素酸水と（iii）次亜塩素酸ナトリウム溶液は、使用直前に蒸留水で亜塩素酸濃度が 10000 ppm になるように、指示に従って希釈したものから、さらにアシストチューブ内で蒸留水で必要濃度にまで希釈し、その10μｌを、各pHのリン酸緩衝液180μｌに加えたのち、ボルテックスミキサーで軽く攪拌し均一化した。

また、（ii）亜塩素酸水製剤（オウトゥロックスーパー）については、最終濃度が6倍希釈、12倍希釈、それ以下になるように調整したのちボルテックスミキサーで軽く攪拌し均一化した。

そこにネコカリシウイルス液（約10⁷感染単位）10μｌを加え、さらに攪拌して均一な被検ウイルス液を調整した。

（結果）
本実施例では、上記実施例とは異なり、以下の試薬・器具及び、試験方法に変更し、その上で、CRFK細胞の培養と、ネコカリシウイルスの培養と、プラックアッセイを行った。

図１３に、プラック写真（実施例１０および１１）を示す。理論に束縛されることを望まないが、実施例１１の手法がより実施可能な施設が多いようである。

（試験管内でのIn vitro試験）
結果1として、ｐH無調整時の各種殺菌剤ネコカリシウイルスに対する不活化効果を示す。

結果2として、ｐH無調整時の各種殺菌剤のネコカリシウイルスに対する不活化効果を示す。

（殺菌剤を不織布に含浸させたウェットシートから絞り回収した殺菌液）
次に、結果3として、ウェットシートに含浸させた殺菌液のネコカリシウイルスに対する不活化効果を示す。

次に、結果4として、常温(30℃前後)保管したウェットシートから絞り回収した殺菌液のネコカリシウイルスに対する不活化効果を示す。示されるように、20日目においても4000ｐｐｍあれば、接触時間1分でウイルスを殺傷しうることが理解される。

以上のように、ノロウイルスに対して、本発明の亜塩素酸水製剤が、殺ウイルス（作用）を示すことが理解される。

（実施例１２：有機物存在下におけるウイルスに対する不活化効果）
本実施例では、嘔吐物処理を想定した有機物存在下における感染性ウイルスに対する不活性化効果確認試験を行った。有機物（10%味噌溶液）中のウイルスに対して各濃度のオウトゥロックスーパーによる不活化効果を確認することを目的に各実験を実施した。

（材料および方法）
＜試験方法＞
（材料）
1) 使用試薬
「オウトゥロックスーパー」、10 w/w%ヨウ化カリウム、10%硫酸、0.1 Mチオ硫酸ナトリウム、塩酸
2）緩衝液の調製方法
リン酸緩衝塩類溶液（ダルベッコのPBS; pH7.4）を用いた。溶液は４℃（冷蔵庫）で保存した。
3） 10%味噌の調製方法
市販味噌を乳鉢を用いて均一にペースト状にし、塩酸をもちいてｐH４に調整した。その味噌液にウイルスを均一に懸濁したPBSを加え、10%味噌溶液を作成し、試験に用いた。
4) ウイルスと細胞
ネコカリシウイルスF4株を用い、ウイルス培養用ならびにウイルス定量用の細胞にはCRFK細胞を用いた。

インフルエンザウイルスA型アイチ株 A/Aichi/68 (H3N2)を用い、ウイルス培養用ならびにウイルス定量用の細胞にはMDCK細胞を用いた。
細胞の培養には、5%ウシ胎児血清(FBS)を加えたイーグル最小必須培地(Eagle’s minimum essential medium;MEM)を用い、5%炭酸ガス存在下37℃で3日間培養し、シャーレ上に単層培養層を形成したものを用いた。

（方法）
１）感染性ウイルス数の定量
ネコカリシウイルス
プラック法を用いて定量した。各種試験液で処理したウイルスは0.5%FBSを含むダルベッコのリン酸緩衝塩類溶液(PBS)を用いて適当なウイルス濃度にまで希釈し、その0.5 mLをCRFK細胞の単層培養( 5 cm シャーレ)に接種し、室温で60分間ロッカープラットフォーム上で機械的にロッキングしながらウイルス吸着を行った。

プラックの形成は、ウイルス吸着後のCRFK細胞を0.68%メチルセルロースと0.5%FBSを含有するMEM中で一夜37度で培養する。生じたプラックを確認後、シャーレの細胞を10%ホルマリンを含む0.5%(w/v)結晶ムラサキ染色液で単染色した後、目視によりプラック数を数えた。

インフルエンザウイルス
プラック法を用いて定量した。各種試験液で処理したウイルスは0.1%ウシ血清アルブミン（BSA）を含むダルベッコのリン酸緩衝塩類溶液（PBS）を用いて適当なウイルス濃度にまで希釈し、その0.5 mlをMDCK細胞の単層培養（ 5 cmシャ−レ）に接種し、室温で60分間ロッカープラットフォーム上で機械的にロッキングしながらウイルス吸着を行った。

プラックの形成は、ウイルス吸着後のMDCK細胞を0.8％軟寒天とアセチル化トリプシン（5μg/ml）を含有するMEM中で2日間37度で培養した。生じたプラックを確認後、シャーレの細胞を10％ホルマリンを含む0.5％(w/v)結晶ムラサキ染色液で単染色した後、目視によりプラック数を数えた。
2) ウイルス不活化
ネコカリシウイルス
各試料液はアルミホイルで包んだ状態で冷蔵庫に保存し、特に記載した操作以外は全操作を氷上で行った。

「オウトゥロックスーパー」についてのウイルス不活化検査は、接触時に亜塩素酸（HCｌO₂）濃度10800 ppm、8640 ppm、7200 ppm、6005 ppm、4795 ppm、3600 ppm、2419 ppm、1209 ppmになるように蒸留水を用いて調製したのちボルテックスミキサーで軽く攪拌し均一化した。

これらの液10 μlを、ネコカリシウイルス混入10%味噌液(約10⁷感染単位/ml) 190 μlに加え、総量を200 μlとした後、さらに攪拌して均一な被験ウイルス液を調製した。被検液は25℃で20分間保湿した後に、直ちに氷水中で冷却すると同時に冷0.5%FBS加PBSで適宜希釈し、感染性ウイルス数を定量した。

インフルエンザウイルス
各試料液はアルミホイルで包んだ状態で冷蔵庫に保存し、特に記載した操作以外は全操作を氷上で行った。

「オウトゥロックスーパー」についてのウイルス不活化検査は、接触時に亜塩素酸（HCｌO₂）濃度16000 ppm、14000 ppm、11000 ppm、10300 ppm、8600 ppm、6400 ppm、4300 ppm、2100 ppmになるように蒸留水を用いて調製した後ボルテックスミキサーで軽く攪拌し均一化する。これらの液10 μlを、インフルエンザウイルス混入10%味噌液(約10⁷感染単位/ml) 190 μlに加え、総量を200μlとした後、さらに攪拌して均一な被験ウイルス液を調製した。被検液は25℃で5分間保湿した後に、直ちに氷水中で冷却すると同時に冷0.1％BSA加PBSで適宜希釈し、感染性ウイルス数を定量した。

（結果）
有機物存在下におけるネコカリシウイルスに対する不活化効果を以下の表に示す。

本発明の亜塩素酸水製剤「オウトゥロックスーパー」は有機物（10%味噌）中においても、ウイルス不活化作用を示した。その作用は濃度に依存し、10800 ppmにおいて1/1000未満にまでネコカリシウイルスを不活化した。有機物（10%味噌）中におけるネコカリシウイルスに対する不活化濃度曲線を図１６に示す。

有機物存在下におけるインフルエンザウイルスに対する不活化効果を以下の表に示す。

本発明の亜塩素酸水製剤「オウトゥロックスーパー」は有機物（10%味噌）中においても、ウイルス不活化作用を示した。その作用は濃度に依存してインフルエンザウイルスを不活化した。有機物（10%味噌）中におけるインフルエンザウイルスに対する不活化濃度曲線を図１７に示す。

以上のように、本発明の好ましい実施形態および実施例を用いて本発明を例示してきたが、本発明はこれに限定されず、特許請求の範囲に記載した構成の範囲内において様々な態様で実施することができ、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。

本発明の亜塩素酸水を含むウイルス殺傷剤は、食品添加物、消毒薬、医薬部外品、医薬品等として利用することができる。

Claims

亜塩素酸水を含むウイルス殺傷剤。
前記ウイルス殺傷剤は、ポリオウイルス、インフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、ノロウイルスおよびネコカリシウイルスからなる群より選択される少なくとも１種のウイルスを不活化するものである、請求項１に記載のウイルス殺傷剤。
前記ウイルス殺傷剤はインフルエンザウイルスを対象とする、請求項１に記載のウイルス殺傷剤。
前記ウイルス殺傷剤はｐＨが６．５以下である、請求項１に記載のウイルス殺傷剤。
前記ウイルス殺傷剤は２００ｐｐｍ以上の亜塩素酸を含む、請求項１に記載のウイルス殺傷剤。
前記ウイルス殺傷剤はインフルエンザウイルスを対象とする、請求項４または５に記載のウイルス殺傷剤。
前記ウイルス殺傷剤はヘルペスウイルスを不活化するものであり、ｐＨ５．５以下であり、その濃度は５０ｐｐｍ以上である、請求項１に記載のウイルス殺傷剤。
前記ウイルス殺傷剤はポリオウイルスを不活化するものであり、ｐＨ７．５以下であり、その濃度は５００ｐｐｍ以上である、請求項１に記載のウイルス殺傷剤。
前記ウイルス殺傷剤はノロウイルスまたはネコカリシウイルスを不活化するものであり、その濃度は４００ｐｐｍ以上である、請求項１に記載のウイルス殺傷剤。
前記亜塩素酸水は、次亜塩素酸ナトリウムのウイルス殺傷効果と同等のウイルス殺傷効果を持つ濃度で比較した場合であっても、細胞傷害作用が著しく低い、請求項１に記載のウイルス殺傷剤。
有機物存在下でウイルス殺傷を行うための、請求項１に記載のウイルス殺傷剤。
亜塩素酸水を含浸させたウイルス殺傷のための物品。
前記物品はシート、フィルム、パッチ、ブラシ、不織布、ペーパー、布、脱脂綿およびスポンジから選択されるものである、請求項１２に記載の物品。